JP4942030B2

JP4942030B2 - 麹菌分生子形成を増大させる遺伝子、タンパク質、組換えベクター

Info

Publication number: JP4942030B2
Application number: JP2006350758A
Authority: JP
Inventors: 健一朗松島; 修畑本; 玄龍海附
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 2006-12-27
Filing date: 2006-12-27
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2026-12-27
Also published as: JP2008161064A

Description

本発明は、麹菌分生子形成を増大する機能を有する組換えベクター、該ベクターによって形質転換された麹菌により麹菌分生子形成が増大した麹菌、及び、形質転換された麹菌による麹菌分生子の生産方法等に関する。

アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）及びアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）等の麹菌は様々な酵素類（蛋白質加水分解酵素、アミラーゼ類等）を産生・分泌し、その優れた澱粉糖化能力及び蛋白質分解力等により、醤油、酒、味噌などの醸造食品の製造に工業的に用いられている。
さらに、近年、他の生物種同様アスペルギルス・オリゼのゲノム配列が明らかとなり（例えば、特許文献１参照）、遺伝子の機能的解析の重要性がますます高まってきている。

従来、特許文献１〜４に記載されているような、麹菌の遺伝子発現を制御する様々な転写因子の解析が行われてきた（例えば、特許文献１〜４参照）。
特開２００５−１７６６０２号公報特開２００３−２４０号公報特開２００３−７０４８４号公報特開２００３−２３５５８４号公報

本発明は、新たに麹菌分生子形成を増大させる遺伝子、該遺伝子にコードされるタンパク質、及び該遺伝子を含む組換えベクターを提供すること、並びに、該組換えベクターを用いるなどの方法によって、該遺伝子又は該タンパク質の発現量を増大することによって固体培地培養及び液体培地培養での麹菌分生子形成が増大した麹菌を提供すること等を目的とする。

即ち、本発明は、以下の各態様の発明に係るものである。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、麹菌分生子形成を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、麹菌分生子形成を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるアミノ酸配列、例えば、配列番号３に表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、麹菌分生子形成を増大する機能を有する活性を有する蛋白質。
（３）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の組換えベクター：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクター、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、麹菌分生子形成を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター、
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、麹菌分生子形成を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター。
（４）上記（１）記載の遺伝子又は（２）記載のタンパク質の発現量が増大することによって麹菌分生子形成が増大されていることを特徴とする麹菌。
（５）上記（３）組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して麹菌分生子形成が増大されていることを特徴とする麹菌。

本発明の遺伝子、蛋白質又は組換えベクターを用いることによって、麹菌分生子形成を増大させることができる。

麹菌とは、アスペルギルス属に属する微生物（菌類）の総称であり、その代表的な例として、既に記載したアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）及びアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）に加えて、特に食品・醸造分野で使用される菌としてアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）等を挙げることができる。

本発明の組換えベクターに含まれる配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡは麹菌のゲノム由来の転写調節遺伝子ｐｃｅＡであり、以下の実施例に具体的に記載されるように、アスペルギルス・オリゼの全ゲノム情報（特開２００５−１７６６０２号公報）に基づき、当業者に公知の適当な相同性検索、モチーフ検索、及び既知遺伝子のアノテーションや文献情報、モチーフの種類などの情報をもとに、転写調節遺伝子をコードするＤＮＡと推定されたものであり、実施例に示すような、適当なプライマーを用いるＰＣＲにより麹菌のゲノムＤＮＡ等から取得することができる。尚、配列番号１中の１番目が開始コドンの先頭塩基、２２０５番目が終止コドンの最終塩基を示す。途中１４９番目から２１５番目及び４１６番目から４８４番目の２ヶ所にイントロンを持つ。

更に、本発明における「配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ」には、アミノ酸をコードする領域のみから成る塩基配列（すなわち、エクソン部分のみが結合された塩基配列）からなるｃＤＮＡ（例えば、本明細書における配列番号２で表される配列）も含まれる。このようなｃＤＮＡは、当業者に公知の任意の方法によって、本明細書に開示の塩基配列情報に基づき調製した適当なプライマーを用いて、麹菌のｍＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等により取得することが可能である。また、本発明のＤＮＡは当業者に公知の任意の方法によって化学合成することも可能である。

さらに、本発明のＤＮＡには、上記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、及び上記ＤＮＡと約８０％以上、好ましくは約９５％以上である配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、麹菌分生子形成を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡが含まれる。

ここで、ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｎｇｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）、又は、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄｂｙＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８７）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。

本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５〜９００ｍＭ、好ましくは１５〜６００ｍＭ、さらに好ましくは１５〜１５０ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることができる。

従って、配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約８０％以上、好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。

本発明の蛋白質は、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質（例えば、本絵明細書の配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質）に加えて、このようなアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列（上記アミノ酸配列と配列相同性を有するアミノ酸配列）からなり、麹菌分生子形成を増大する機能を有する活性を有する蛋白質も含まれる。

２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。

上記の原理に従い、２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８、１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７、１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。

上記のような塩基配列の配列相同性又はコードするアミノ酸配列の配列相同性を示すようなＤＮＡは、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもでき、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群又は公共データベースの中から、当業者が通常用いている方法により、例えば、前述のＢＬＡＳＴソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。さらに、本発明遺伝子は種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。

本発明の組換えベクターは、当業者に公知の適当な遺伝子工学的な手段を用いて、上記のＤＮＡを適当なベクター内に連結することにより調製することができる。ベクターとしては、形質導入又は形質転換する宿主微生物のゲノム上の適当な位置に上記のＤＮＡが挿入され、その緒果、親株と比較して、その宿主微生物の麹菌分生子形成を増大することができるものであれば、その構造及び種類等に特に制限はない。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、又は人工染色体等のベクターを用いることかできる。

上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするための当業者に公知の任意のマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ｎｉａＤのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子又はアンピシリン、カナマイシンあるいはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター及びその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）、さらに、目的とするＤＮＡを挿入するためのマルチクローニングを含むことが望ましい。これらの組換えベクターに含まれる各要素は当業者に公知であり、例えば、具体的には、実施例に示されるように、アスペルギルス・オリゼのアミラーゼ遺伝手プロモーター、アスペルギルス・ニーデュランスのアミラーゼターミネーター、マーカー遺伝子としてのアスペルキルス・オリゼのｎｉａＤ遺伝子を挙げることができる。尚、麹菌分生子形成を増大させる、という本発明の効果を有利に奏功する為には、麹菌用のプロモーターとしては、上記のアスペルギルス・オリゼのアミラーゼ遺伝手プロモーターのような、制御下にある本発明の遺伝子を強制発現（構成的発現）させることができるようなものを使用することが好ましい。

形質導入又は形質転換は、公知の適当な方法で行うことができる。例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４（１９８９））を用いることかできる。

本発明の組換えベクターを形質導入又は形質転換された麹薗は、本発明の遺伝子又は蛋白質の発現量が増大し、その結果、親株と比較して麹菌分生子形成が増大されたものとなる。

本明細書において、「麹菌分生子形成」とは、上記に示したような麹菌が、分生子柄上に外生的に無性胞子すなわち分生子を形成するということを意味する。

また、「麹菌分生子形成を増大する機能」とは、上記の麹菌分生子形成を実質的に増大させるような機能を意味し、例えば、固体培地又は液体培地における培養にて、野生株（親株）と比較して、「麹菌分生子形成が増大されている」状態、即ち、形成される麹菌分生子の数が、１０倍以上、好ましくは１００倍以上、例えば、１０〜１００倍になるような機能を意味する。またその結果として、目標とする分生子数例えば１０^７個／ｇに達する時間が、２４時間以上早くなることを意味する。なお、麹菌分生子の数は、例えば、本明細書の実施例に記載されているように、麹菌分生子から再生したコロニーを計数したり、又は、溶液中に分離した後の分生子濃度を測定することにより求めることができる。

従って、該ベクターに含まれる各配列にコードされる蛋白質は、上記の機能を有するものである限り、その構造及び作用機序などに特に制限はない。その一例として、以下の実施例に記載されるように、転写調節因子をあげることができるが、必ずしも転写調節エレメントに結合し、発現を促進させる機能を有するものに限られず、本発明の組換えベクターにより形質導入又は形質転換された麹薗において、麹菌分生子形成を促進させる機能を有するものであれば良い。

なお、本発明の組換えベクターによる形質導入または形質転換の対象となる微生物として、麹菌以外の食品・醸造・化学・医療分野で使用される産業上有用な糸状菌等を用いても実質的に同様の効果を得ることができる。これらの菌は、市販品として、又は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）等の様々な公的寄託機関から入手することも可能である。

本発明の麹菌を当業者に公知の任意の方法で培養することにより、より多量の麹菌分生子を効率的に取得することができる。例えば、本発明の麹菌を、固体培地若しくは液体培地で培養して麹菌分生子を取得することが可能である。このような生産方法における、培養系・培地の選択、培養温度・時間等の培養条件は、以下の実施例等を参考に、当業者が適宜設定することができる。

なお、組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、本発明の遺伝子又は蛋白質の発現量が増大し、その結果、親株と比較して麹菌分生子形成が増大されていることを特徴とする本発明の麹菌の具体例である、ＲＩＢ３２６−ＫＮ１６−１０株は平成１８年１１月２４日付で、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０７３８が付与されている。

以下、実施例に則して本発明をさらに説明するが、本発明の技術的範囲は、これらに限定されるものでない。

（転写調節因子遺伝子の推定と抽出）
麹菌アスペルギルス・オリゼの全ゲノム情報（特開２００５−１７６６０２号公報参照）から、次のような方法により、転写調節因子遺伝子をコードすると推定される配列を抽出した。このステップにおいては、詳細な吟味は行わず、転写調節因子遺伝子である可能性のあるものは基本的にリストアップの対象とした。
（１）相同性検索による転写調節因子遺伝子と推定される配列の抽出
ゲノムコンソーシアムにより公知文献記載（Machida et al., 2005, nature, 438: 1157-1161）の方法で予測された配列を自動予測遺伝子配列として用いた。
各々の自動予測遺伝子配列から予測されるその遺伝子産物配列（（以下、「自動予測遺伝子産物配列」という）を基礎配列として、既知蛋白質の公共データベース（ＮＣＢＩによる非重複蛋白質データベースｎｒ）に対して、相同性検索ソフトＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行った。相同性検索の結果得られた配列の機能に関する情報を整理し、その配列に関わる遺伝子機能情報に対してキーワード検索を行い、転写調節因子に関わるキーワードを含む「自動予測遺伝子配列」を選択した。

（２）転写調節因子の構造に関わるモチーフと推定されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の検索
「自動予測遺伝子産物配列」について、モチーフ検索ソフト（ＨＭＭＥＲ）を用いてモチーフ（Ｐｆａｍ）検索を行い、転写調節因子に関わるモチーフを含むと推定されるアミノ酸配列をコードする「自動予測遺伝子配列」を選択した。

（３）既知転写調節因子配列と相同性を有するＤＮＡ配列の検索
麹菌や麹菌以外の糸状菌に関する既知の転写調節因子のアミノ酸配列を問い合わせ配列として、今回得られた「自動予測遺伝子産物配列」に対して、相同性検索ソフトＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行った。同様な問い合わせ配列を用いて、麹菌のゲノムコンティグ配列に対してＢＬＡＳＴ（ｔｂｌａｓｔ）を用いて相同性検索を行うことにより、自動予測で予測されていなかった遺伝子や、自動予測でＤＮＡ結合領域などの保存性の高い領域を欠損した形で予測されてしまっていた遺伝子についても検索可能とした。

これらの方法により、「自動予測遺伝子配列」から合計６６７個の候補遺伝子（以下、「候補遺伝子」という）を抽出した。

（候補遺伝子の絞込みと遺伝子領域のｉｎｓｉｌｉｃｏ推定）
前項で抽出した転写調節因子遺伝子と思われる候補遺伝子について、順次遺伝子領域の推定を行った。また、推定に先立ち、相同な既知遺伝子のアノテーションや文献情報、モチーフの種類などの情報をもとに、強制発現による解析対象として相応しいか否かを検討し、ヘテロ複合体で機能するものなど、相応しくないものは除外した。

遺伝子領域の推定は、主に相同な既知遺伝子との比較により行われた。相同な既知遺伝子との比較は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＡＬＮ（Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ２０００１６：１９０−２０２）を用いて行った。既知遺伝子との相同性が限定的で５’端が推定できなかった場合は、５’ＲＡＣＥを行うために、相同部分のアラインメント情報を準備した。３’末端の予測が本来の遺伝子領域より短すぎた場合は、転写調節因子のＣ末側がトランケートされてしまうが、予測が長すぎた場合は、本来のＣ末端で翻訳は終止すると考えられる。そこで、３’末端が予測できなかった場合は、相同部分からの距離や、隣の遺伝子との位置関係などから、本来の３’末端より十分に下流部分までを強制発現ベクターに組み込む領域とすることにした。

このような方法で、前項の抽出の際に既知の遺伝子との相同性が高かったものから順次遺伝子領域の推定を行った。全長がｉｎｓｉｌｉｃｏで推定できたものと５’ＲＡＣＥにより５’末端が明らかにされたもの一部の合計３００遺伝子について強制発現株作成ための予測配列を得た。

（発現用プラスミドの作製）
転写調節因子遺伝子を麹菌内で発現させるために用いる発現プラスミドとして、発現ユニットとしてアスペルギルス・オリゼアミラーゼ遺伝子プロモーター及びアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーター、転写調節因子遺伝子挿入用マルチクローニングサイト、マーカー遺伝子としてアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ遺伝子を含むプラスミドｐＡＰＴＬＮを構築した。

寒天プレート培地上で生育させた、アスペルギルス・ニドランスＩＡＭ２１３０株の胞子５×１０^５個を掻き取り、滅菌したマイクロチューブに入れた３００μlのＮｕｃｌｅｉＬｙｓｉｓＳｏｌｕｔｉｏｎバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に懸濁した。胞子を懸濁したマイクロチューブに１ｇのガラスビーズＢＺ−０６（アズワン株式会社製）を加え、ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、２５回／秒、３分間処理を２回繰り返した。６５℃で１５分間加温した後、室温で５分間放置した。1.5μｌのＲｎａｓｅＳｏｌｕｔｉｏｎ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１時間加温した。１００μlのＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎを加え２０秒間激しく振とうした後、１３，５００ｒｐｍで５分間遠心処理した。遠心後の上清を別のマイクロチューブに移し、３５０μlのイソプロパノールを加え転倒混和した後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心処理した。得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄及び乾燥処理した後、１００μlのＴＥバッファー〔１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤＴＡ〕に懸濁しゲノムＤＮＡ溶液を得た。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行いアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーター領域の増幅を行った。
５’−ＧＧＧＴＡＧＴＣＧＴＡＣＣＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＡＣ−３’（配列番号４）
５’−ＡＧＣＣＴＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧ−３’（配列番号５）
ＰＣＲ反応は、ＴａＫａＲａＬＡＴａｑ（タカラバイオ社製）を使用し、遺伝子増幅装置としてＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。反応液の組成は以下のとおりである。

（試薬：使用量：終濃度）
ＴａＫａＲａＬＡＴａｑ：０．５μｌ
１０×ＬＡＰＣＲＢｕｆｆｅｒII：５μｌ：１×
２５ｍＭＭｇＣｌ_２：５μl：２．５ｍＭ
ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ：８μｌ：それぞれ０．４ｍＭ
鋳型ＤＮＡ（０．５μｇ）：１μｌ
プライマー：１μｌ×２種類：それぞれ０．２μＭ
滅菌水：２８．５μｌ
合計液量：５０μｌ
上記の反応液５０μｌを０．２ｍｌ反応チューブ中で混合してＰＴＣ−２００にセットし、以下の温度設定によりＰＣＲを行った。
９５℃、２分：１サイクル
９５℃、３０秒５８℃、３０秒７２℃、２分：３０サイクル
７２℃、３分：１サイクル。

反応液をエタノール沈澱処理後、沈殿を２０μlのＴＥバッファーに懸濁した。さらに、ＰｓｔＩで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、目的の増幅産物を切り出した。切り出した増幅産物はゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、アスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーターを得た。プラスミドｐＵＣ１９をＳｍａＩ及びＰｓｔＩで処理した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片とアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーターをライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト内にあるＳｍａＩ−ＰｓｔＩ部位にアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーターが挿入されたプラスミドｐＡＴを得た。

ｐＡＴをＳｍａＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ断片を回収した。
プラスミドｐＭＡＲ５（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６（１０），１６７４−１６７５，１９９２）をＳｍａＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてａｒｇＢ遺伝子及びアスペルギルス・オリゼアミラーゼ遺伝子ターミネーターを除去したＤＮＡ断片を回収した。ｐＡＴ及びｐＭＡＲ５由来の両ＤＮＡ断片をライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アスペルギルス・オリゼアミラーゼ遺伝子プロモーター及びアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーターを含むプラスミドｐＡＰＴを得た。

下記の２種類の合成ＤＮＡを含む（各１００μＭ）ＴＥバッファー１００μｌを５分間煮沸後、室温まで徐冷しマルチクローニングサイトリンカーとした。ｐＡＰＴをＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてマルチクローニングサイトを除去したＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片にマルチクローニングサイトリンカーをライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換しプラスミドｐＡＰＴＬを得た。プラスミドｐＳＴ１４〔（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ（１９８９）２１８：９９−１０４）をＨｉｎｄIIIで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。回収したｎｉａＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＡＰＴＬのＨｉｎｄIII部位に挿入し、転写調節因子遺伝子発現用プラスミドｐＡＰＴＬＮを得た。

（転写調節因子遺伝子発現用組換えベクターの作製）
転写調節因子遺伝子と予測されたＤＮＡ配列を基にＰＣＲにより各転写調節因子遺伝子を取得した。まず、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のゲノムＤＮＡを調製した。次に調製したゲノムＤＮＡを鋳型に、予測遺伝子の開始コドン上流１００ｂｐのＤＮＡ配列及び終始コドン近傍のＤＮＡ配列を参考に作製した２種類のプライマーを用いて、ＰＣＲにより各転写調節因子遺伝子を取得した。開始コドン上流のＤＮＡ配列を参考にプライマーを作製する際には、ｐＡＰＴＬＮのマルチクローニングサイト上にある制限酵素認識配列であり、かつ、増幅する転写調節因子遺伝子配列内に認識配列が存在しない制限酵素認識配列を導入した。増幅した転写調節因子遺伝子は作製したプライマーに認識配列を導入した制限酵素で処理した後、ｐＡＰＴＬＮのマルチクローニングサイトに挿入し（導入した制限酵素部位とＳｍａＩ部位の間）、各転写調節因子遺伝子発現用組換えプラスミドベクターとした。

以下、転写調節因子遺伝子発現用プラスミドベクターの作製の一例を示す。

前記の方法を用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株より調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行い、転写調節因子遺伝子ｐｃｅＡ（配列番号１）を得た。
５’−GTC ACT CGC ATC GAT GCC GTT GAC ATC GAG−３’（配列番号６）
５’− TTA AAT CAG AAG GTA GTT CCA CCC ATT TTG−３’ （配列番号７）
ＰＣＲ反応は、ＴＯＹＯＢＯＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。反応液の組成は以下のとおりである。

（試薬：使用量：終濃度）
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ：１μｌ
１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒｆｏｒＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−：５μｌ：１×
２５ｍＭＭｇＣｌ_２：２μｌ：１ｍＭ
２ｍＭｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ：５μｌ：それぞれ０．２ｍＭ
鋳型ＤＮＡ（０．２μｇ）：１μｌ
プライマー：１μｌ×２種類：それぞれ０．３μＭ
滅菌水：３４μｌ
合計液量：５０μｌ
上記の反応液５０μｌを０．２ｍｌ反応チューブ中で混合してＰＴＣ−２００にセットし、以下のような温度設定によりＰＣＲを行った。
９４℃、２分：１サイクル
９４℃、１５秒５８℃、３０秒６８℃、４分：３０サイクル
６８℃、３分：１サイクル。

反応液をエタノール沈澱処理後、沈殿を２０μｌのＴＥバッファー〔１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤＴＡ〕に懸濁した。更に、ＣｌａＩで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、目的の増幅産物を切り出した。切り出した増幅産物はゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した後、ｐＡＰＴＬＮのマルチクローニングサイト上のＣｌａＩ−Ｓｍａい部位に挿入し、転写調節因子遺伝子ｐｃｅＡ発現用プラスミドｐＫＮ１６ＡＰＴＬＮを得た。

（転写調節因子遺伝子強制発現麹菌の取得）
野生株アスペルギルス・オリゼＲＩＢ３２６株からＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ（１９８９）２１８：９９−１０４記載の方法で取得したｎｉａＤ欠損株を転写調節因子遺伝子発現用プラスミドｐＫＮ１６ＡＰＴＬＮで形質転換した。形質転換法は、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ（１９８９）２１８：９９−１０４）によって行った。各プラスミド５μｇを用いて形質転換し、最小培地で形質転換体を選択したところ、それぞれ約２００個のコロニーが得られた。このうち各プラスミドにつき１５コロニーについて最小培地で単分生子分離を繰り返し、形質の安定化を行った。次に、各転写調節因子遺伝子の成熟領域をプローブとしてサザン解析を実施し、それぞれの形質転換体の中から、形質転換に用いたプラスミドが形質転換体のゲノム上のｎｉａＤ遺伝子領域に挿入されている株を選択し、それぞれの選択株をＲＩＢ３２６−ＫＮ１６−１０株と命名した。サザン解析の結果を図１に示した。

（麹菌の培養方法及び麹菌分生子の測定）
（１）麹菌の培養方法（固体培地）と麹菌分生子数の測定
形質転換体分生子１０^７個を脱脂ミール、小麦、水を含む醤油麹用培地（脱脂ミール：小麦：水＝３０７：３３５：４６０）７ｇ、または小麦フスマ培地（小麦フスマ：水＝１００：８０）５ｇに植菌し、１５０ｍｌ三角フラスコ中、３０℃にて３日間静置培養した。菌の増殖に伴う発熱で、菌が死滅するのを防ぐ目的で、培養２１時間目にフラスコを激しく振とうして培養物を攪拌した（手入れ）。培養開始から一定時間後に０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液５０ｍｌを添加し激しく振とうして分生子を溶液中に分離させた。血球計数板を用いて顕微鏡下で分生子濃度を測定し、その濃度の比較によって分生子形成を確認した（図２）。

（２）麹菌の培養方法（液体培地）と麹菌分生子数の測定
麹菌分生子形成は、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地の炭素源をすべてフルクトースにした培地（Ｃｚ−Ｆ）若しくはＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地の炭素源をすべてマルトースにした培地（Ｃｚ−Ｍ）を用いた。まず１５０ｍｌ三角フラスコ中に４０ｍｌのＣｚ−Ｆ培地をいれ、野生株、ｐｃｅＡ導入株の分生子を１０^７個接種し、３０℃で振盪培養した。２４時間後菌体を回収し、新しいＣｚ−Ｆ培地若しくはＣｚ−Ｍ培地に移植し、さらに２４時間振盪培養した。セルストレイナーで菌体を取り除き、得られた培地上清を２０，０００×ｇで３０分間遠心した。得られた沈殿を１００μlの０．０８％Ｔｗｅｅｎ８０に懸濁し１ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ上に静かに重層した。４，４００×ｇで５分間遠心し上清を取り除いた。沈殿をさらに１ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ、及び１ｍｌの０．０８％Ｔｗｅｅｎ８０で洗浄し、最終的に１００μｌの０．０８％Ｔｗｅｅｎ８０に懸濁した。マルツプレート（８％ＭａｌｚＥｘｔｒａｃｔ、２．０ｍｇ／ｌＣｕＳＯ_４、０．０４ｍｇ／ｌＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７、０．８７ｍｇ／ｌＦｅＰＯ_４、０．９５ｍｇ／ｌＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．８０ｍｇ／ｌＮａ_２ＭｏＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、８．０ｍｇ／ｌＺｎＳＯ_４、２％Ａｇａｒ）に撒き、２〜３日後再生してきたコロニーを数えて麹菌分生子形成数とした（図３）。

野生株（アスペルギルス・オリゼＲＩＢ３２６株）と強制発現株（ＲＩＢ３２６−ＫＮ１６−１０株）の麹菌分生子形成数を比較した結果、強制発現株が野生株アスペルギルス・オリゼＲＩＢ３２６株の約１０〜１００倍の麹菌分生子形成数を示すことが確認された（図２及び図３）。

以上の結果から、配列番号１のＤＮＡ配列を含む本発明の組換えベクターで形質転換された麹菌ＲＩＢ３２６−ＫＮ１６−１０株は麹菌親株（野生株）に対して著しく麹菌分生子形成数が増大していることが判明した。

なお、ｐｃｅＡは、ＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ（ＩＩ）２Ｃｙｓ６型のＺｉｎｃｆｉｎｇｅｒモチーフを持ち、アスペルギルス・ニドランスのＮｏｓＡ遺伝子とアミノ酸レベルで７０．９％同一の相同性を示した。ＮｏｓＡ遺伝子は、アスペルギルス・ニドランスにおいて、有性生殖に必要とされる遺伝子として報告されているが、麹菌分生子形成を増大させることを何等示唆するものではない（Ｋ．ＶｉｅｎｋｅｎａｎｄＲ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，２００６，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６１，５４４−５５４）。

本発明で得られる麹菌からは多くの分生子が効率的に回収できるので、産業上有用な麹菌の増殖に利用できる。

本発明の形質転換体（形質転換菌）において、形質転換に用いたプラスミドが形質転換体のゲノム上のｎｉａＤ遺伝子領域に挿入されていることを示すサザン解析の結果により得られた電気泳動の写真である。ＲＩＢ３２６ｎｉａＤ欠損株をｐＫＮ１６ＡＰＴＬＮで形質転換し、ツァペック‐ドックス最小培地プレート上で再生した株からＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｐａＩで処理後、サザン解析した。レーンＭ；ＤＮＡ分子量マーカー、１；親株、２〜５；形質転換株。親株では２０ｋｂ近辺にゲノムＤＮＡ由来ＫＮ１６遺伝子のバンドが１本のみ検出されたが、形質転換株ではそれに加えて１０ｋｂ近傍に導入遺伝子由来のバンドが検出された。フスマ培地における、野生株と本発明の形質転換体の分生子形成数を比較した結果を示す。しょうゆ麹７ｇもしくは、フスマ麹５ｇに５０ｍｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を添加後、振とうして分離してきた分生子の濃度を比較した。 Cｚ−F培地における、野生株と本発明の形質転換体の分生子形成数を比較した結果を示す。培養後の培地を洗浄後、分生子を回収し、マルツ完全培地プレートに撒いた。再生したコロニー数を分生子数とした。実験は２回行いその平均を取った。エラーバーは標準偏差を表す。

Claims

以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡを含み、宿主である麹菌への形質導入又は形質転換によって、該麹菌の分生子形成を増大させる機能を有する組換えベクター：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、麹菌分生子形成を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと９５％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、麹菌分生子形成を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、又は
（ｅ）（ｄ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、麹菌分生子形成を増大する機能を有する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
請求項１記載の組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して麹菌分生子形成が増大されていることを特徴とする麹菌。
請求項１記載の組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して麹菌分生子形成数が１０〜１００倍であることを特徴とする麹菌。
ＲＩＢ３２６−ＫＮ１６−１０株（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０７３８）である、請求項２又は３に記載の麹菌。
麹菌に請求項１記載の組換えベクターを形質導入又は形質転換させ、親株と比較して麹菌分生子形成が増大されている麹菌を作製する方法。
麹菌に請求項１記載の組換えベクターを形質導入又は形質転換させ、親株と比較して麹菌分生子形成数が１０〜１００倍である麹菌を作製する方法。