JP2014039559A - シクロピアゾン酸非生産形質転換体及びその作製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】醤油、味噌、日本酒などの製造に用いられるアスペルギルス・オリゼや、チーズの製造に用いられるペニシリウム・カマンベルティなどにおいて、それらの一部の株が神経毒であるシクロピアゾン酸を生産することが知られている。遺伝的な迅速かつ高精度にアスペルギルス属又はペニシリウム属等に属する菌株におけるマイコトキシンの一種であるシクロピアゾン酸生産能の検出方法、及び、シクロピアゾン酸及びその前駆体であるサイクロアセトアセチルＬ−トリプトファン（ＣＡＴ）を生産しない形質転換体（株）等の提供。
【解決手段】遺伝子操作により、アスペルギルス属又はペニシリウム属に属する微生物であって、ＣＡＴ非生産菌又はポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼを発現しない菌等のシクロピアゾン酸非生産形質転換体を作製する方法、及び、該製造方法により得られたシクロピアゾン酸非生産形質転換体。
【選択図】図４

Description

本発明は、新規なポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子、遺伝子組み換えによるシクロピアゾン酸非生産菌形質転換体の作製方法、及び、該遺伝子３’領域及びその３’下流領域に含まれる塩基配列の存在を検出することによるアスペルギルス菌又はペニシリウム菌のシクロピアゾン酸生産能の検出方法等に関する。

アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）等の麹菌（アスペルギルス）は、醤油、酒、味噌などの伝統的な食品の醸造や酵素の生産等のために工業的に広く用いられている、また近年の麹菌（アスペルギルス・オリゼ）の全ゲノム配列の決定やマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析などの進展に伴い、遺伝子工学的な改変、特に染色体レベルの改変により酵素等の生産性や増殖速度の改良などの効果が期待される糸状菌である。

このように、アスペルギルスは食品製造や酵素の製造などの、タンパク質生産の宿主微生物として利用されている他に、その二次代謝物質は、医薬品やその前駆体として利用されている。しかし、このような二次代謝産物質には、マイコトキシンとして知られるカビ毒が含まれる。

このようなマイコトキシンの一種であるシクロピアゾン酸は、ペニシリウム・シクロピウムにおいて初めに見つかった、ＡＴＰ依存性のカルシウムトランスポーターを阻害する神経毒である。その毒性はＬＤ５０＝３６ｍｇ／ｋｇ（ラット経口投与）であることが知られており、１９６０年にイギリスにおいて七面鳥１０万匹以上が飼料中のカビ毒で死んだ、七面鳥Ｘ病事件の原因毒素の一つであると考えられている。シクロピアゾン酸を生産するカビとしては、上記ペニシリウム・シクロピウムの他にペニシリウム・カマンベルティ、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・タマリ等の菌において、一部の株が知られている。

醤油、味噌、日本酒などの製造に用いられるアスペルギルス・オリゼや、チーズの製造に用いられるペニシリウム・カマンベルティなどにおいて、それらの一部の株がシクロピアゾン酸を生産することが知られている。そのため、醸造食品の安全性を確保するために、シクロピアゾン酸生産菌を判別し排除する必要がある。一方、これらの伝統的な醸造・発酵食品は様々な規模で生産されているのが現状であり、技術力や設備の異なる製造業者が、それぞれの判断で使用する菌株を選んでいる実情がある。そのため、できるだけ簡便かつ正確なシクロピアゾン酸生産菌の判別方法が望まれている。

従来知られた、最も簡単な判別方法としては、シクロピアゾン酸が存在するとコロニーが赤くなる寒天培地で被検株を培養することで判別する方法であるが（特許文献１）、この方法では、寒天培地という培養条件での生産性を判断するため、実際の醸造過程でシクロピアゾン酸が生産されるかは不明である。一方、より正確な方法として、ペニシリウム属とクラビセプス属においては、シクロピアゾン酸生合成を触媒する酵素の一つである、４−ジメチルアリルトリプトファンシンターゼの遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」とも標記する）を用いて検出することで、シクロピアゾン酸生産菌を判別する方法として有効であることを報告している（非特許文献１）。しかし、アスペルギルス属に関しては、非生産菌の中にもこの遺伝子の相同遺伝子である、ジメチルアリル‐シクロアセトアセチル‐Ｌ‐トリプトファンシンターゼを保持している株が存在することが我々の研究から明らかとなったため、同様の方法はアスペルギルス属においては必ずしも利用できない。

また、シクロピアゾン酸のようなマイコトキシンが生産されない物質生産宿主を得るために、突然変異や遺伝子操作技術による遺伝子の破壊などによる、マイコトキシンの非生産株の造成方法が報告されている（特許文献２，３）。しかしながら、これらの方法における作製された株の評価では、最終産物である分子にのみ注目しているため、その前駆体が合成されているような株であっても、マイコトキシン非生産株として認識してしまう場合がある。しかし、たとえばマイコトキシンの一種であるアフラトキシンの前駆体であるステリグマトシスチンはアフラトキシンよりは弱いものの、強い毒性物質である。従って、物質生産や食品製造に用いられるカビとしては、最終産物であるマイコトキシンのみならず、その前駆体、望ましくは合成における、より初期の段階を不活性化した、マイコトキシン生産性を失った株を使用することで、より安全性を高めることが期待される。

従来、麹菌は相同組換え頻度が低く、従来の方法では染色体の任意の領域に対する大領域欠失株を作製することは極めて困難であった。例えば一つのベクターを染色体上の任意の領域に組込む場合においても相同組換えの頻度が１〜２％と低いために形質転換体を数十から百株程度取得し、その中から目的の株を取得する必要があった。本発明者らは最近の研究により、非相同組換えに関与する遺伝子を破壊することで遺伝子ターゲッティング頻度（相同組換え頻度）が非常に向上することを明らかにした（特許文献４）。

特開平０５−０３０９９４号公報 ＷＯ２０００／０３９３２２号 特許公表２００２−５３３１３３ 特開平２００７−２２２０５５号公報 Ｕｓｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ｅｒｇｏｔ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ａｍｏｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｆｕｎｇｉ， Ｂｏｉｃｈｅｎｋｏ ＬＶ， Ｂｏｉｃｈｅｎｋｏ ＤＭ， Ｖｉｎｏｋｕｒｏｖａ ＮＧ， Ｒｅｓｈｅｔｉｌｏｖａ ＴＡ， Ａｒｉｎｂａｓａｒｏｖ ＭＵ． Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｉａ． ２００１ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；７０（３）：３６０−４．

本発明の主な目的は、アスペルギルス菌又はペニシリウム菌において遺伝的にシクロピアゾン酸生産能をもつ株の迅速かつ高精度な検出方法を提供することにある。また本発明は、シクロピアゾン酸生産菌の正確かつ容易な検出を可能にする、ＰＣＲ用プライマーを提供することである。本発明の主な目的は更に、アスペルギルス菌又はペニシリウム菌において、シクロピアゾン酸生合成経路の初発反応過程を触媒する酵素の遺伝子を破壊した形質転換菌を作製することで、シクロピアゾン酸及びその前駆体であるサイクロアセトアセチル‐Ｌ‐トリプトファン（ＣＡＴ）を生産しない形質転換体（株）を提供することにある。

本発明者は上記課題を解決すべく研究を行った結果、シクロピアゾン酸生合成経路の初発段階を触媒する酵素である、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子を同定し、シクロピアゾン酸生産株とシクロピアゾン酸非生産株との間で、該遺伝子及びその３’下流領域の塩基配列を比較検討することによって、シクロピアゾン酸生合成における該遺伝子の役割を明らかにして本発明を完成した。

即ち、本発明は、以下の各態様に関するものである。
［態様１］以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（２）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
（３）配列番号２に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、９０％以上の相同性（同一性）を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。
［態様２］以下のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド：
（１）配列番号１で示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［態様３］アスペルギルス・オリゼのゲノムに含まれるゲノムＤＮＡである、態様１又は２記載のポリヌクレオチド。
［態様４］ｃＤＮＡである、態様１又は２記載のポリヌクレオチド。
［態様５］以下のポリペプチドから成るポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ：
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（２）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
（３）配列番号２に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、９０％以上の相同性（同一性）を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。
［態様６］遺伝子操作によりアスペルギルス属又はペニシリウム属に属する微生物のシクロピアゾン酸非生産形質転換体を作製する方法。
［態様７］シクロピアゾン酸非生産形質転換体がサイクロアセトアセチルＬ−トリプトファン非生産菌である、態様６記載の方法。
［態様８］シクロピアゾン酸非生産形質転換体がポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼを発現しない菌である、態様６又は７記載の方法。
［態様９］遺伝子操作が態様１又は２記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドを破壊するものである、態様６〜８のいずれか一項に記載の方法。
［態様１０］遺伝子操作を非相同組換えに関わるＫｕ遺伝子が破壊された菌株に対して行う、態様９記載の方法。
［態様１１］微生物がアスペルギルス・オリゼ株である、態様６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
［態様１２］相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌であるアスペルギルス・オリゼ株を使用する、態様１１記載の方法。
［態様１３］相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ａ４１７７Ｋ株である、態様１２記載の方法。
［態様１４］態様６〜１３のいずれか一項記載の製造方法により得られた、シクロピアゾン酸非生産形質転換体。
［態様１５］アスペルギルス・オリゼ株である、態様１４記載のシクロピアゾン酸非生産形質転換体。
［態様１６］態様１又は２記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの３’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸生産能を判別することを特徴とする、シクロピアゾン酸生産能の判別方法。
［態様１７］態様１又は２記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの３’側領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸非生産菌を識別することを特徴とする、シクロピアゾン酸非生産株の識別方法。
［態様１８］アスペルギルス菌株がアスペルギルス・オリゼである、態様１６又は１７記載の方法。
［態様１９］ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの３’領域が配列番号１で示される塩基配列における４，２１７番目〜１１７２１番目である、態様１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
［態様２０］ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとその３’下流領域にあるテロメア配列との間に含まれるポリヌクレオチド領域が配列番号３で示される塩基配列を有する、態様１６記載の方法。
［態様２１］ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をＰＣＲによって検出する、態様１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
［態様２２］ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をサザン解析によって検出する、態様１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。

本発明によって、アスペルギルス菌において、シクロピアゾン酸生合成経路の初発段階を触媒する酵素である、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ（ＰＫＳ−ＮＲＰＳ）遺伝子が初めて同定された。更にシクロピアゾン酸非生産菌においては、該ＰＫＳ−ＮＲＰＳ遺伝子の４，２１７番目の塩基以降の３’末端側は欠失しており、また終止コドンも含まれておらず、該塩基の３’側にテロメアリピート配列が付加していることが判明した。

その結果、判定対象となる菌株において、本発明のＰＫＳ−ＮＲＰＳをコードするポリヌクレオチドの３’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸生産能を判別し、シクロピアゾン酸非生産菌を識別することが可能となる。

アスペルギルス菌株のサザン解析による配列の比較を示す電気泳動の写真を含む。 ＮＢＲＣ４１７７株のゲノムＤＮＡ（第３染色体末端）のＰＣＲによる解析結果を示す電気泳動の写真を含む。 アスペルギルス菌株のサザン解析による、制限酵素断片（約２ｋｂ）の存在の有無を示す電気泳動の写真を含む。 アスペルギルス菌株の第３染色体上のシクロピアゾン酸生合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子とその位置関係を示す。 ＰＣＲ法によりシクロピアゾン酸生合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子破壊の結果を示す電気泳動の写真を含む。「Ｗｔ」は野生株、並びに、「ＴＦ１」及び「ＴＦ２」は各遺伝子破壊株の具体例を示す。 推定されているシクロピアゾン酸合成経路の中間体を示す。 各遺伝子破壊株におけるシクロピアゾン酸合成経路の中間体の蓄積量の相対値を示したグラフである。 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ １によるＤＮＡ断片の増幅の結果を示す電気泳動の写真を含む。 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ２，３によるＤＮＡ断片の増幅の結果を示す電気泳動の写真を含む。 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ４，５，６によるＤＮＡ断片の増幅の結果を示す電気泳動の写真を含む。 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ７によるＤＮＡ断片の増幅の結果を示す電気泳動の写真を含む。 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ １〜７により増幅されるＤＮＡ断片（塩基配列）の推定領域を示す。 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ Ｐ−１，２，３，４によるＤＮＡ断片の増幅の結果を示す電気泳動の写真を含む。

本明細書の実施例に記載されているように、本発明者は、アスペルギルス・オリゼのシクロピアゾン酸生産株においては、第３染色体のシクロピアゾン酸生合成に関与するＤＡＣＴ−Ｓ遺伝子とテロメア配列の間にシクロピアゾン酸生産に関与する新規な遺伝子（ポリヌクレオチド）があることを初めて発見し、アスペルギルス・フラバスの配列を参考にして設計したＰＣＲプライマーにより増幅される配列の塩基配列の解読と、抽出したＲＮＡを逆転写することで作製したｃＤＮＡを鋳型とした３’−ＲＡＣＥの増幅産物の塩基配列を解読することにより、その塩基配列を決定した。更に、該塩基配列に基づき、該遺伝子がポリケタイドシンターゼ（ＰＫＳ）及びノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）の触媒活性ドメインを有するポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ（ＰＫＳ−ＮＲＰＳ）であることを明らかした。一方、シクロピアゾン酸非生産株においては、ＰＫＳ−ＮＲＰＳをコードするポリヌクレオチドの３’側領域が途中からテロメアリピート配列が付加することにより、６０％以上も欠けていることを見出した。

［ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子及び蛋白質］
従って、本発明により見出された新規なポリヌクレオチドは、以下のポリペプチドをコードするものである。
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（２）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
（３）配列番号２に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性（同一性）を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。

尚、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルシンテターゼは一般的に複数のドメインを含む多機能タンパク質であることが知られており、発明者らが見出した配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼは、本明細書の表１で示されるような複数の機能ドメインを含むと予想され、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するためには機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。従って、上記（２）で示されるポリペプチドの具体例としては、配列番号２で示されるアミノ酸のうち、このようなドメインを構成するアミノ酸以外の領域のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていることが好ましい。更に、このような欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸としては、同族アミノ酸（極性β非極性アミノ酸、疎水性β親水性アミノ酸、陽性β陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が好ましい。

更に、該ポリヌクレオチドの好適例として、以下のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。
（１）配列番号１で示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

ここで、ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。

ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。

本明細書において、ポリヌクレオチド間のハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。従って、「ストリンジェントな条件下」とは、具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることが出来る。

このような配列番号１に示されたコード領域を含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上である塩基配列を含有するポリヌクレオチド等を挙げることができる。

本発明のポリヌクレオチドは、シクロピアゾン酸を生産するアスペルギルス属又はペニシリウム属に属する菌株を出発原料として用いて、本明細書に記載されて配列情報等に基づき作製可能な適当なプローブ又はプライマーＰＣＲを用いて、コロニーハイブリダイズにより取得したり、プライマーＰＣＲにより増幅して調製することも出来る。当業者に公知の任意の方法で容易に調製することができる。アスペルギルス属に属する菌の例としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・フラバス、及びアスペルギルス・タマリ等を挙げることができる。また、ペニシリウム属に属する菌の例としてペニシリウム・カマンベルティ等を挙げることが出来る。

尚、ＰＣＲは、例えば、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製９６００など一般のサーマルサイクラー、及び、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）などの一般の市販品を用いて当業者に公知の適当な反応条件を適宜選択して実施することができる。

従って、このような菌株から調製されたポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ又はそのｍＲＮＡからの逆転写によって調製されたｃＤＮＡである。更に、当業者に周知の化学合成によって、本発明の各遺伝子を調製することも出来る。

本発明の蛋白質としては、以下のポリペプチドを挙げることができる。
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（２）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
（３）配列番号２に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性（同一性）を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。

配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であるこのような蛋白質は、当業者に公知の任意の方法、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。

尚、塩基配列間及びアミノ酸配列間の同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０及びＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。

［シクロピアゾン酸非生産形質転換体の作製］
本明細書中で示されるように、更に、該遺伝子破壊株（ノックアウト株）を相同組換えによって作製したところ、シクロピアゾン酸生合成経路における初発段階で生成される中間物質であるサイクロアセトアセチルＬ−トリプトファン（ＣＡＴ）が合成されなくなり、その結果、シクロピアゾン酸も生産されなくなることを確認した。

従って、本発明は、遺伝子操作によりアスペルギルス属又はペニシリウム属に属する微生物のシクロピアゾン酸非生産形質転換体を作製する方法にも係る。このような形質転換体の好適具体例として、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ（ＰＫＳ−ＮＲＰＳ）を発現・生産しない菌を挙げることが出来る。

このようなＰＫＳ−ＮＲＰＳを生産しない形質転換体は、当業者に公知の任意の遺伝子操作の手段で作製することができる。

例えば、当業者に公知の相同組換え等を用いてＰＫＳ−ＮＲＰＳをコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）を破壊することによりＰＫＳ−ＮＲＰＳを発現させなくすることが可能である。しかしながら、既に記載したように、アスペルギルス菌は相同組換え頻度が低い。従って、このような方法で本発明の形質転換体を作製する場合には、非相同組換えに関与するＫｕ７０及び Ｋｕ８０等のＫｕ遺伝子が抑制された形質転換菌を使用することが好ましい。このようなＫｕ遺伝子の抑制は当業者に公知の任意の方法で実施することが出来る。例えば、本発明者等により開発された方法（特許文献４）によりＫｕ遺伝子破壊ベクターを使用してＫｕ遺伝子を破壊したり、又は、Ｋｕ遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスＲＮＡ法によって、Ｋｕ遺伝子を不活化することが可能である。こうして得られる形質転換菌は、このようなＫｕ遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元の菌と比較して、相同組み換え頻度が顕著に上昇している。具体的には、少なくとも１０倍、好ましくは、少なくとも約６０倍上昇している。

このような相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌の例として、特許文献４に記載されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ ＡＳＫＵＰＴＲ８株（ｗｈ， ΔｐｙｒＧ， ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ）、及び、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株を上げることが出来る。尚、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ ＡＳＫＵＰＴＲ８株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１６年１２月２日付で寄託され、受領番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３１１が付されている。その後、平成１７年１１月１７日付で特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基く国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４５３が付与されている。

更に、本明細書の実施例で使用している、Ｋｕ７０遺伝子破壊株であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ａ４１７７Ｋ株を挙げることが出来る。この株は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８に所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターに平成１９年１０月１６日付で寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−４３４が付されている。

［シクロピアゾン酸生産能の判別方法］
本明細書中で具体的に示されるように、アスペルギルス・オリゼ等のシクロピアゾン酸非生産菌においては、配列番号１で示される、シクロピアゾン酸生合成の初発段階を触媒する酵素、ポリケチドシンテターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ（ＰＫＳ−ＮＲＰＳ）をコードする遺伝子の４，２１７番目の塩基以降の配列は欠失しており、また終止コドンも含まれていない。その代わりに、該塩基の３’側にテロメアリピート配列が付加している。ＰＫＳ−ＮＲＰＳには重要な活性ドメインが複数存在し、欠失した４，２１７番目の塩基以降の領域にも、活性に必要なドメインが含まれているため、このような３’末端側を欠失した遺伝子の発現産物はＰＫＳ−ＮＲＰＳとしての機能できないものと推定される。

一方で、シクロピアゾン酸生産菌における解析結果から、この遺伝子の終止コドンからテロメアまでの領域は１７〜１８ｋｂであるが、シクロピアゾン酸非生産菌ではこの領域も失われている。又、ＰＫＳ−ＮＲＰＳ遺伝子が破壊されることによって、シクロピアゾン酸生合成経路における初発段階で生成される中間物質であるサイクロアセトアセチルＬ−トリプトファン（ＣＡＴ）が合成されなくなり、その結果、シクロピアゾン酸も生産されなくなる。

尚、ペニシリウム・カマンベルティ等のペニシリウム属に属する菌についても、シクロピアゾン酸生産に関して、アスペルギルス・オリゼと類似の遺伝子群（クラスター）を有しているものと考えられる。

以上のことから、このようなクロピアゾン酸生産菌にのみ特異的に存在する配列、即ち、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの３’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無はシクロピアゾン酸生産菌と非生産菌を判別するための指標（標的配列）として有用である。

従って、判定対象となる菌株において、本発明のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの３’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸生産能の判別をすることができる。

特に、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの３’側領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列が検出されない場合には、該菌株においてはポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドが発現されないので、このような菌株をシクロピアゾン酸非生産菌として識別することが可能となる。

判定対象となる菌株は、アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・フラバス等の任意のアスペルギルス菌株、並びに、ペニシリウム・カマンベルティ等のペニシリウム属を挙げることができる。

ここで、「ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの３’領域」の一具体例として、配列番号１で示される塩基配列における４，２１７番目〜１１，７２１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド領域を挙げることが出来る。又、「ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域」の一例として、配列番号３で示される塩基配列のような、シクロピアゾン酸生産菌のＰＫＳ−ＮＲＰＳ遺伝子の３’下流領域にあるテロメアに隣接した配列をあげることができる。

上記の領域に含まれており当業者に公知の方法で検出可能である限り、検出の対象となる部分塩基配列の場所及び長さに特に制限はなく、その測定方法等に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅によって部分塩基配列を検出するような場合には、通常、該部分塩基配列は１００〜１０，０００の塩基対を有するものである。

本発明方法において、部分塩基配列は当業者に公知の任意の測定方法で検出することができる。例えば、該塩基配列に基づき適宜設計したプライマー又はプローブを使用したＲＴ−ＰＣＲ法及びリアルタイムＰＣＲ法等の各種ＰＣＲ法等、サザンブロット（解析）法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法、並びにマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ）法等の当業者に公知の方法で行うことが出来る。

検出対象である上記塩基配列をターゲットとした、増幅用プライマー及びハイブリダイゼーション用のプローブは、本明細書に記載された各配列の塩基情報又は公的データベースから入手可能な塩基配列情報等に基づき当業者が適宜設計できる。これらは、その用途に応じて、適当な長さ、例えば、増幅用プライマーであれば、通常、１０〜１００個、好ましくは２０〜４０個程度の連続した塩基配列から成る。又、ハイブリダイゼーション用のプローブであれば、通常、２００〜３，０００個、好ましくは５００〜１，０００個程度の連続した塩基配列から成る。

従って、本発明のアスペルギルス菌株におけるシクロピアゾン酸生産能の判別方法において、シクロピアゾン酸生産菌と非生産菌を判別するための指標（標的配列）として有用な部分塩基配列の代表例として、本明細書の実施例に記載されているプライマーセット１〜７、及びプライマーセットＰ−１〜Ｐ−３を用いたＰＣＲにより増幅される塩基配列を挙げることができる。尚、図１２に示されるように、プライマーセット１〜７により増幅される部分塩基配列は、全体又はその一部が配列番号１で示されるポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列における４，２１７番目からテロメアまでの領域に含まれ、又、プライマーセットＰ−１〜Ｐ−３により増幅される部分塩基配列は、図１３に示されるように、配列番号１で示されるポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列における４，２１７番目〜１１，７２１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド領域に含まれる。

本発明の方法は、上記のプライマー又はプローブを含む、適当な測定キットを用いて行うことができる。このようなプライマー又はプローブは当業者に公知の任意の放射性物質、蛍光物質、色素等の適当な標識物質によって標識されていても良い。このような測定キットは利用する測定原理等に応じて、適当な構成をとることが出来、更に、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。

以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。尚、以下の実施例における各遺伝子操作の手段・条件等は、特に断わりがない限り、例えば、特開平８−８０１９６号公報、又はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ， １９９５等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示、及び、内容の一部を構成するものである。

［被検株のシクロピアゾン酸生産性の解析］
アスペルギルス・オリゼの標準株として、ゲノム情報が解読されたＲＩＢ４０株がシクロピアゾン酸生産性株であるかを調べるために、既知のシクロピアゾン酸生産株であるアスペルギルス・オリゼＮＢＲＣ４１７７株をポジティブコントロールとして、ＣＹＡ寒天培地（３ ．０ｇ ＮａＮＯ_３， １．０ｇ Ｋ_２ＨＰＯ_４， ０．５ｇ ＫＣｌ， ０．５ｇ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ， ０．０１ｇ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ， ５．０ｇ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ， ３０．０ｇ Ｓｕｃｒｏｓｅ， １５．０ｇ Ａｇａｒ， １０００ｍｌ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）にて一週間培養時に蓄積するシクロピアゾン酸量を調べた。検出は、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析装置）（アジレント社製１１００シリーズ高速液体クロマトグラフィー、及びアプライドバイオシステム社製ＱＳＴＡＲ Ｅｌｉｔｅ質量分析装置）を用いて行った。抽出は培地と菌体を直径６ｍｍのスポットとして３サンプル回収し、１％のギ酸を含む酢酸エチル、ジクロロメタン、メタノールを３：２：１で混合した溶液８００μｌで抽出した。１２，０００ｒｐｍ ５分間の遠心操作を２回行うことにより固形物を除き、サンプルとした。分離カラムはＯＤＳカラム（財団法人 化学物質評価研究機構 Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ 粒子径 ５μｍ、内径 ２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ）を用い、溶離液は、０．１ｖｏｌ％ 蟻酸水をＡ液、０．１ｖｏｌ％ 蟻酸−アセトニトリルをＢ液とし、０分から５分までをＡ液９５％、Ｂ液５％で流し、２５分までにＡ液５％、Ｂ液９５％に達するように濃度勾配をかけ、その後３５分から３６分でＡ液９５％、Ｂ液５％とする方法でサンプル１０μｌを分離した。流速は毎分０．２ｍｌで行った。質量分析は、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）をイオン化法として用い、イオンスプレー電圧は５５００ Ｖ、ヒーターガス温度は４５０℃、ネブライザーガス（ＧＳ１）は５０ｐｓｉ、ターボガス（ＧＳ２）は５０ｐｓｉ、カーテンガス（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ）は３０ｐｓｉとし、正イオン検出モードより検出した。

その結果、シクロピアゾン酸生産菌であるＮＢＲＣ４１７７株において強いピークとして検出されたｍ／ｚ＝３３７．１のピークは、ＲＩＢ４０株では検出されなかった。従って、ＲＩＢ４０株はシクロピアゾン酸非生産株であることが分かった。

［ゲノムＤＮＡの調製］
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株、ＮＢＲＣ４１７７株及びＮＩＳＬ３０１０株を２４時間ＣＹＡ液体培養し、ろ過により回収した菌体を液体窒素により凍結後、乳鉢と乳棒を用いて破砕した。破砕した菌体より、２％ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ緩衝液を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出し、リボヌクレアーゼＡによりＲＮＡを分解した後、フェノール・クロロホルム処理により精製した。

［サザン解析］
麹菌ゲノム情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ？ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）は、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株についてのゲノム解読情報であり、この情報を参考に、ＤＣＡＴ−Ｓ遺伝子の上流側の塩基配列を調べ、プローブ領域として、フォワードプライマー、5’-AGG GCT TGG TTA TGA AAA GTG TCC C-3’（配列番号４）とリバースプライマー 5’-CGC CTG ACG ATA CTG CAA ATG TC-3’（配列番号５）にはさまれた領域を選んだ。また、ゲノムＤＮＡを切断する酵素として、プライマー領域よりもセントロメア側に切断配列が存在するＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩＩ（タカラ社製）を選択し、ゲノムの切断を行った。サザン解析はジゴキシゲニン（ロシュ社）を用いた方法を用い、製造者により推奨される方法に従い、行った。その結果、ＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩＩで切断したゲノムでの解析では、ＲＩＢ４０株ではテロメアが存在するために、３．３ｋｂと２．７ｋｂのバンドしか得られないが、ＮＢＲＣ４１７７株とＮＩＳＬ３０１０株においては、約１５ｋｂと５ｋｂのバンドが得られた（図１）。従って、これら２株はＲＩＢ４０よりも、下流の領域でテロメアが付加していると考えられた。そこで、アスペルギルス・オリゼの近縁種として知られる、アスペルギルス・フラバスのゲノム情報を参考に、この下流の領域を標的配列とするPCRプライマーとして、フォワードプライマー１２５３９：5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'（配列番号６）に対して、リバースプライマー１３４５２：5'-GCACAAACCGTGAAATGATCCTTTTCACTG-3'（配列番号７）、リバースプライマー１４４３３：5'-CTCCACGAGTGCGGGGAGTGGGCCAATAG-3'（配列番号８）、リバースプライマー１５４６３：5'-GGCCGCACGTGACTTCAGTCATGTGATC-3'（配列番号９）、リバースプライマー１６６１２：5'-CGGATTGTCCCACGCTCATAGTGTTTTGC-3'（配列番号１０）、リバースプライマー１７８５０：5'-GTCGACCGTTTCCTGTCTTTACCACAC-3'（配列番号１１）、を用いて、ＮＢＲＣ４１７７株のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行ったところ、リバースプライマー１７８５０以外において、ＤＮＡの増幅が観察された（図２）。また、ＲＩＢ４０株、ＮＩＳＬ３０１０株、ＮＢＲＣ４１７７株のゲノムＤＮＡをＳａｌＩとＢｇｌＩＩにより切断し、プローブとしてフォワードプライマー, 5'-CGGGTCTGCAGGCACGCATAAAGACTG-3'（配列番号１２）と、リバースプライマー, 5'-ATCGCATGTGCTGTATGGATCCGACTATCC-3'（配列番号１３）で増幅される領域の断片を用いたサザン解析を行ったところ、両方の制限酵素において、約２ ｋｂの断片がＮＩＳＬ３０１０株とＮＢＲＣ４１７７株においてのみ検出された（図３）。そこで、この結果を参考に、テロメア付加部位を予想し、インバースＰＣＲによるテロメア付加領域をクローニングすることを試みた。その結果、ＮＢＲＣ４１７７株においてはＲＩＢ４０株よりも、約１７〜１８ｋｂ 下流において、テロメアが付加していることが明らかとなった。テロメア付加部位周辺の塩基配列は配列番号２に示したとおりである。

また、ノーザン解析から、ＲＩＢ４０株においてテロメアが付加しているＰＫＳ遺伝子は、ＮＢＲＣ４１７７株においては発現しており、その転写産物は約１０ｋｂであることが示唆された。そこで、これまでに得られた結果からコーディング領域を１１．７ｋｂと推定し、３’−ＲＡＣＥ解析を行った。逆転写はＧｅｎｅｒａｃｅｒ ｋｉｔ （インビトロジェン）を用い、ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲには、プライマー 5’-CAGATCAAGGTCGGGATTTCAGC-3’（配列番号１４）と、キット附属のプライマーを用いた。得られた産物をＴＡ−クローニングキット（インビトロジェン）によりクローニングし塩基配列を解読した。この配列をもとに、さらにＰＣＲプライマーを合成し、塩基配列の決定を行うことを繰り返し、配列番号１に示される全長の塩基配列を解読した。この遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列をＰｆａｍ プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／）で解析したところ、ＰＫＳとＮＲＰＳの触媒ドメインを持つ、ＰＫＳ−ＮＲＰＳハイブリッド型酵素をコードすることが明らかとなった。尚、Ｐｆａｍ プログラムによる上記アミノ酸配列の解析により明らかとなった各ドメイン及びその位置（開始・終止アミノ酸及び塩基の番号）を以下の表１に示す。

［アスペルギルス株のシクロピアゾン酸非生産形質転換体の作製］
第３染色体上のシクロピアゾン酸生合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子として、ＤＣＡＴ−Ｓ遺伝子（ｃｐａＢ：ＡＯ０９００２６０００００２）の周辺に位置する他の遺伝子であるｃｐａＣ（ＡＯ０９００２６０００００３）及びｃｐａＤ（ＡＯ０９００２６０００００４）が予想される（図４）。従って、本発明で同定されたＰＫＳ−ＮＲＰＳ遺伝子（ｃｐａＡ：ＡＯ０９００２６０００００１）、及びそれら遺伝子の系統的な破壊を行った。

各遺伝子破壊に先立ち、シクロピアゾン酸生産株における、遺伝子破壊効率を上げるために、上記特許文献４に記載の方法と発明者らの以前の報告（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． （２００６） ２７５： ４６１−４７０）に準じて、アスペルギルス・オリゼ ＮＢＲＣ４１７７株における非相同組換えに関わるタンパク質Ｋｕ７０の遺伝子を破壊した株、Ａ４１７７Ｋ株を作製し、さらに形質転換用選択マーカーとしてオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードするＰｙｒＧ遺伝子を用いるために、ＰｙｒＧ遺伝子の一部が欠損したＤＮＡ断片配列を用いて、５’−ホスホオロチジン酸耐性を指標とし、プロトプラストＰＥＧ法を用いる当業者に公知の手段で形質転換を行い、一部欠損したＰｙｒＧ配列を保持する株、Ａ４１７７ＫＰ株を取得した。これらＫｕ７０およびＰｙｒＧ遺伝子の破壊に用いたＤＮＡ断片は、前述のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株のゲノム配列よりＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を用いた。また、遺伝子破壊のためのＤＮＡフラグメントは、玉野らの報告（Ｔａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， （２００７） ７１： ９２６−９３４）に準じて行った。

以下、ｃｐａＡ遺伝子の遺伝子破壊断片を作製した方法を具体的に挙げる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ４１７７株のゲノムを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ ｃｐａＡのＬＵおよびＬＬを用いて、ｃｐａＡ遺伝子の上流側配列を含む断片をＰＣＲにより増幅した。同様に、ｃｐａＡ遺伝子の下流側配列を含む断片をＰｒｉｍｅｒ ｃｐａＡのＲＵおよびＲＬを用いて増幅した。さらに、選択マーカーｐｙｒＧ遺伝子の断片をＰｒｉｍｅｒ ｃｐａＡのＰＵおよびＰＬで増幅した。Ｐｒｉｍｅｒ ｃｐａＡのＰＵおよびＰＬは、上記で増幅したｃｐａＡ遺伝子の上流側配列断片と下流側配列断片に相補的な配列を有しているため、これら３つの断片を相互にプライマーとしたＰＣＲ反応を行うことにより、３つの断片が融合した１つの断片を得た。この断片は、ｃｐａＡ遺伝子の上流及び下流の部分配列がｐｙｒＧ遺伝子の両端に存在する構造をしているため、置換破壊を行う遺伝子破壊断片となる。同様の手順で、上記のシクロピアゾン酸生合成遺伝子クラスターに含まれる各遺伝子の破壊断片を、以下のプライマー配列を用いて作製した。

Ｐｒｉｍｅｒ ｃｐａＡ
ＬＵ: 5'-TGCTCGCCGTTAGCCTTTCGTTTCAC-3'（配列番号１５）
ＬＬ: 5'-AGCGGCAGAACTGGCAGCAGATAATAGAG-3'（配列番号１６）
ＰＵ: 5'-TGCTGCCAGTTCTGCCGCTACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'（配列番号１７）
ＰＬ: 5'-TTAACACGCTTTCGTCGCTAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'（配列番号１８）
ＲＵ: 5'-AGCGACGAAAGCGTGTTAACCAAGGTATG-3'（配列番号１９）
ＲＬ: 5'-TTTGAGCGCAATCGGGATGAGTAATGTAG-3'（配列番号２０）

Ｐｒｉｍｅｒ ｃｐａＢ
ＬＵ: 5'-CTGCCAAAGCCCTTCTACGTGCTGAGTC-3'（配列番号２１）
ＬＬ: 5'-GTACGTCTGTTGT GGCAGCCTTGATTGCGTCAAACATGAG-3'（配列番号２２）
ＰＵ: 5'-TGACGCAATCAAGGCTGCCACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'（配列番号２３）
ＰＬ: 5'-GGATTGCCAGTGGAGTGGCAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'（配列番号２４）
ＲＵ: 5'-CTGAGGTGCAGTT GCCACTCCACTGGCAATCCTCGAGGAG-3'（配列番号２５）
ＲＬ： 5'-GCAGCAGCACTGAACGCTTCGAAGGTATG-3'（配列番号２６）

Ｐｒｉｍｅｒ ｃｐａＣ
ＬＵ: 5'-TCTTTCCACCGTCGCCTATCTTGCTTTG-3'（配列番号２７）
ＬＬ: 5'-GTACGTCTGTTGTTTCCAGGACATCGCCAGATGTGTGAG-3'（配列番号２８）
ＰＵ: 5'-ATCTGGCGATGTCCTGGAAACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'（配列番号２９）
ＰＬ: 5'-CCCTCATTCAAGGCAGCGGAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'（配列番号３０）
ＲＵ: 5'-CTGAGGTGCAGTTCCGCTGCCTTGAATGAGGGCTACGTC-3'（配列番号３１）
ＲＬ: 5'-CCCCCACAGCAAGGTCGAGTAATCTGAC-3'（配列番号３２）

Ｐｒｉｍｅｒ ｃｐａＤ
ＬＵ: 5'-CGGTTGCTTGCGAAGGGATTTTCAGATG-3'（配列番号３３）
ＬＬ: 5'-GTACGTCTGTTGTTGGCGCTAAGAGCTGTTGCTGTCGTCTC-3'（配列番号３４）
ＰＵ: 5'-GCAACAGCTCTTAGCGCCAACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'（配列番号３５）
ＰＬ: 5'-GCGCTTGGCATTTTCGTTCAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'（配列番号３６）
ＲＵ: 5'-CTGAGGTGCAGTTGAACGAAAATGCCAAGCGCAAAGTCATC-3'（配列番号３７）
ＲＬ: 5'-CTCTGATCCAGGGGCTAGCTCCCAATC-3'（配列番号３８）

こうして得られた遺伝子破壊断片を用いて、アスペルギルス・オリゼ４１７７Ｋ株を宿主とした形質転換をおこない、遺伝子破壊株を取得した。遺伝子破壊の確認は、用いた遺伝子破壊断片よりも外側の配列から増幅するプライマーを用いたＰＣＲにより、選択マーカーの遺伝子に相当する増幅断片長の変化を指標に行った。ＰＣＲによる遺伝子破壊の確認についての模式図と各遺伝子破壊株について確認を行った結果を図５に示した。確認に用いたプライマーの配列は、以下の通りである。

Ｐｒｉｍｅｒ ｃｐａＡ
ＣＵ: 5'-CGGCGAGATAGTGGCTGCCTATGCTC-3'（配列番号３９）
ＣＬ: 5'-CAGGGTCAAGCCCCAGAACATTCATG-3'（配列番号４０）
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｐａＢ
ＣＵ: 5'-GGCACCCGAAAGCTGAGCAATGGAG-3'（配列番号４１）
ＣＬ: 5'-TGGCGCGTGGCAACAAGGTCTATG-3'（配列番号４２）
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｐａＣ
ＣＵ: 5'-AGGCCCGAGATGAGCAATCTTGGGAATC-3'（配列番号４３）
ＣＬ: 5'-ACCGCGTTTGTGCGAGACCGTACTTGAC-3'（配列番号４４）
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｐａＤ
ＣＵ: 5'-GCGTCTCTGGCATTCGTACCATCTATG-3'（配列番号４５）
ＣＬ: 5'-ATACTGGAGACACAGCGCACACGATAC-3'（配列番号４６）
である。

更に、取得した各遺伝子破壊株の代謝物解析をＬＣ／ＭＳにより行った。ペニシリウム・カマンベルティにおいて推定されているシクロピアゾン酸合成経路の中間体は、サイクロ‐アセトアセチル‐Ｌ‐トリプトファン、ベータ・シクロピアゾン酸、アルファ・シクロピアゾン酸であり（図６）、それぞれの精密分子量は２７０．１００４、３３８．１６３０、３３６．１４７４である。ＬＣ／ＭＳ解析では、プロトン付加した分子を検出するため、各分子量に１．００７８を加えた値のピークについて調べ、各遺伝子破壊株における蓄積量の相対値を示したものが、図７のグラフである。グラフから明らかなように、ＰＫＳ−ＮＲＰＳ遺伝子を破壊した株（DｃｐａＡ）においては、一切のシクロピアゾン酸生合成中間体は蓄積していない。これに対して、それ以外の遺伝子を破壊した株では、シクロピアゾン酸生合成中間体が蓄積していることが確認された。従って、ＰＫＳ−ＮＲＰＳ遺伝子を破壊することで、シクロピアゾン酸の中間体も生産されないより安全な株が得られることが分かった。

［シクロピアゾン酸生産能の判別方法］
実施例１の結果から、アスペルギルス・オリゼにおいては、シクロピアゾン酸生産菌と非生産菌の間では、第３染色体末端領域の塩基配列が異なり、シクロピアゾン酸生産菌は、非生産菌においては欠失が生じているＰＫＳ−ＮＲＰＳ遺伝子を完全長保持していること、さらにテロメアまでに、約１７〜１８ｋｂの配列が存在することがわかった。そこで、このようなシクロピアゾン酸生産菌のみが有している領域を増幅標的配列としたＰＣＲプライマーを実施例１と同様に、アスペルギルス・フラバスのゲノム情報より作製し、複数のアスペルギルス・オリゼ株（シクロピアゾン酸生産菌としてＮＩＳＬ３０１０株及びＮＢＲＣ４１７７株、並びに、シクロピアゾン酸非生産菌としてＲＩＢ４０株）について、ＰＣＲによる増幅試験を行った。

まず、アスペルギルス・オリゼ株をＣＹＡ培地で２４時間液体培養し、ろ過により回収した菌体を液体窒素により凍結後、乳鉢と乳棒を用いて破砕した。破砕した菌体より、２％ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ緩衝液を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出し、リボヌクレアーゼＡによりＲＮＡを分解した後、フェノール・クロロホルム処理により精製した。各株よりゲノムＤＮＡを抽出し、それらを鋳型としてＰＣＲ解析を行った。尚、反応溶液は、ゲノムＤＮＡ １μｌ、プライマーセット ２μｌ、Ｅｘ ｔａｑ バッファー ５μｌ、２５ｍＭ ｄＮＴＰ ５μｌ、Ｅｘ−Ｔａｑ ０．８μｌ 蒸留滅菌水 ３６．２μｌで行った。ＰＣＲ反応は、バイオラッド社製ＰＴＣ２２０を用い、９４℃２分の後、９４℃２０秒、６０℃２０秒、７２℃２０秒を３０サイクル繰り返した。反応産物は、０．８％アガロースゲルなどで電気泳動したのち、エチジウムブロマイドで染色することで、紫外線照射により増幅産物をバンドとして可視化した。尚、使用したＰＣＲプライマー配列は以下の通りである。

Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ １
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-GTCGCCACTTCTGCTCCCATCAAC-3'（配列番号４７）
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-GGGCACAAGACTGCGATTGTGTCTC-3'（配列番号４８）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ２
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'（配列番号４９）
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-GCACAAACCGTGAAATGATCCTTTTCACTG-3'（配列番号５０）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ３
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-CCGGTGAAGAGCTTCAAGGAATATATG-3'（配列番号５１）
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-CAGTACGCAAATCGGAATCAAGTTGCAGAG-3'（配列番号５２）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ４
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'（配列番号５３）
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-CTCCACGAGTGCGGGGAGTGGGCCAATAG-3'（配列番号５４）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ５
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'（配列番号５５）
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-GGCCGCACGTGACTTCAGTCATGTGATC-3'（配列番号５６）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ６
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'（配列番号５７）
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-CGGATTGTCCCACGCTCATAGTGTTTTGC-3'（配列番号５８）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ７
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-ACTCATGATGCGGCGATGTTCTCTCA-3'（配列番号５９）
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-GGGCACAAGACTGCGATTGTGTCTC-3'（配列番号６０）

上記の各プライマーセットにより増幅させたＤＮＡ断片は、０．８％のアガロースゲルにより分離し、エチジウムブロマイドによる染色後、紫外線照射によりバンドとして可視化した。その結果を図８〜１１に示した。これらの結果から、シクロピアゾン酸生産菌であるＮＩＳＬ３０１０株及びＮＢＲＣ４１７７株では上記の各プライマーセットによって塩基配列が増幅されたものの、シクロピアゾン酸非生産菌であるＲＩＢ４０株では全く増幅されないことが確認された。又、上記の各プライマーセットによって増幅される塩基配列の推定領域を図１２に示した。但し、アスペルギルス・フラバスの配列情報をもとにしているため、アスペルギルス・オリゼにおける増幅領域の位置は０〜１，０００塩基程ずれる可能性がある。図１２に示されるように、プライマーセット１〜７により増幅される部分塩基配列は、その全体又はその一部が配列番号１で示されるポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列における４，２１７番目からテロメアまでの領域に含まれていることが判る。

更に、アスペルギルス・オリゼ株のシクロピアゾン酸生産菌としてＮＩＳＬ３０１０株及びＮＢＲＣ４１７７株、並びに、シクロピアゾン酸非生産菌としてＲＩＢ４０株、さらに、実施例１に記述の方法でシクロピアゾン酸非生産菌であることを確認した、ＲＩＢ８３株及びＲＩＢ４３０株を用いて、同様の実験を行った。反応溶液は、ゲノムＤＮＡ １μｌ（２００ｎｇ）、プライマーセット ２μｌ、Ｅｘ ｔａｑ バッファー ５μｌ、２５ｍＭ ｄＮＴＰ ５μｌ、 Ｅｘ−Ｔａｑ ０．２μｌ 蒸留滅菌水 ３６．５μｌで行った。ＰＣＲ反応は、バイオラッド社製ＰＴＣ２２０を用い、９４℃２分の後、９４℃２０秒、６０℃２０秒、７２℃４分を３０サイクル繰り返した。反応産物は、０．８％アガロースゲルなどで電気泳動したのち、エチジウムブロマイドで染色することで、紫外線照射により増幅産物をバンドとして可視化した。尚、使用したＰＣＲプライマー配列は以下の通りである。その結果を図１３に示した。これらの結果から、シクロピアゾン酸生産菌であるＮＩＳＬ３０１０株及びＮＢＲＣ４１７７株では上記の各プライマーセットによって塩基配列が増幅されたものの、シクロピアゾン酸非生産菌であるＲＩＢ４０、ＲＩＢ８３株及びＲＩＢ４３０株産菌株では全く増幅されないことが確認された。又、図１３に示されるように、プライマーセットＰ−１〜Ｐ−３により増幅される部分塩基配列は、配列番号１で示されるポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列における４，２１７番目〜１１，７２１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド領域に含まれていることが判る。

Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ Ｐ−１
＋４９８５ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-TTTCCCTGGTGGAGCTTGACGAGCC-3' （配列番号６１）
＋７６５９ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-CTCATGCATAGAGACAGCGTGTTCC-3' （配列番号６２）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ Ｐ−２
＋５７０４ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-GAGCCCGATGAGTTACTTGCTGCTG-3' （配列番号６３）
＋９４８５ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-CCTCCGTTCATGATGGCATTGAGAGTCTG-3' （配列番号６４）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ Ｐ−３
＋８９３９ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-GCTATTTGCAGCTCCAAGCGCAAAG-3' （配列番号６５）
＋１１１０３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-TTGCGACTGGAGGGCAAATTCGGCG-3' （配列番号６６）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ Ｐ−４
（コントロールプライマー： Ｔｏｍｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （２００６） ７２： ４８４-４９０． 参照）
ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-CCAAGAACATGATGGCTGCT-3' （配列番号６７）
ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ: 5'-CTTGAAGAGCTCCTGGATGG-3' （配列番号６８）

以上の結果から、上記の各ＰＣＲプライマーセットを用いてシクロピアゾン酸生産菌において検出されたバンドはシクロピアゾン酸非生産菌においては検出されず、本発明方法によりアスペルギルス菌株におけるシクロピアゾン酸生産能を判別することが可能であり、それによって、シクロピアゾン酸生産菌と非生産菌が判別できることが示された。

本発明によって、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ（ＰＫＳ−ＮＲＰＳ）を発現しないアスペルギルス菌等の形質転換体（株）を作製することが可能となった。その結果、マイコトキシンの一種であるシクロピアゾン酸及びその前駆体であるサイクロアセトアセチルＬ−トリプトファン（ＣＡＴ）を生産する恐れのない安全なアスペルギルス菌等を産業上利用することが可能となった。

Claims (10)

1. 遺伝子操作によりアスペルギルス属又はペニシリウム属に属する微生物のシクロピアゾン酸非生産形質転換体を作製する方法。
2. シクロピアゾン酸非生産形質転換体がサイクロアセトアセチルＬ−トリプトファン非生産菌である、請求項１記載の方法。
3. シクロピアゾン酸非生産形質転換体がポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼを発現しない菌である、請求項１又は２記載の方法。
4. 遺伝子操作が以下のポリヌクレオチド：
   （Ａ）以下のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
   （１）配列番号２に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
   （２）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、若しくは、
   （３）配列番号２に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、９０％以上の同一性を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド；又は、
   （Ｂ）以下のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド：
   （１）配列番号１で示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、若しくは
   （２）配列番号１で示される塩基配列と全体の平均で、９０％以上の同一性を有する塩基配列から成り、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
   を破壊するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 遺伝子操作を非相同組換えに関わるＫｕ遺伝子が破壊された菌株に対して行う、請求項４記載の方法。
6. 微生物がアスペルギルス・オリゼ株である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌であるアスペルギルス・オリゼ株を使用する、請求項６記載の方法。
8. 相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ａ４１７７Ｋ株である、請求項７記載の方法。
9. 請求項１〜８のいずれか一項記載の製造方法により得られた、シクロピアゾン酸非生産形質転換体。
10. アスペルギルス・オリゼ株である、請求項９記載のシクロピアゾン酸非生産形質転換体。