JPWO2009051152A1 - ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子 - Google Patents
ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2009051152A1 JPWO2009051152A1 JP2009538119A JP2009538119A JPWO2009051152A1 JP WO2009051152 A1 JPWO2009051152 A1 JP WO2009051152A1 JP 2009538119 A JP2009538119 A JP 2009538119A JP 2009538119 A JP2009538119 A JP 2009538119A JP WO2009051152 A1 JPWO2009051152 A1 JP WO2009051152A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- strain
- polynucleotide
- polyketide synthase
- peptide synthetase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010019477 S-adenosyl-L-methionine-dependent N-methyltransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 108010000785 non-ribosomal peptide synthase Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 108010030975 Polyketide Synthases Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- CNZIQHGDUXRUJS-UHFFFAOYSA-N Cyclopiazonic acid Natural products CC(=C/1C(=O)C2C3C(Cc4cccc5[nH]cc3c45)C(C)(C)N2C1=O)O CNZIQHGDUXRUJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 101
- CNZIQHGDUXRUJS-DQYPLSBCSA-N alpha-cyclopiazonic acid Natural products CC(O)=C1C(=O)[C@@H]2[C@@H]3[C@@H](Cc4cccc5[nH]cc3c45)C(C)(C)N2C1=O CNZIQHGDUXRUJS-DQYPLSBCSA-N 0.000 claims abstract description 101
- ZKSIPEYIAHUPNM-ZEQRLZLVSA-N butobendine Chemical compound C([C@H](CC)N(C)CCN(C)[C@@H](CC)COC(=O)C=1C=C(OC)C(OC)=C(OC)C=1)OC(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 ZKSIPEYIAHUPNM-ZEQRLZLVSA-N 0.000 claims abstract description 100
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 74
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 50
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims abstract description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 28
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 52
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims description 35
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 claims description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 25
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 23
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 claims description 23
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 claims description 23
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 18
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 17
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 9
- 101150058482 ku gene Proteins 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 59
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 7
- 101100168421 Aspergillus oryzae cpaA gene Proteins 0.000 description 7
- 101100059135 Bacillus subtilis (strain 168) carA gene Proteins 0.000 description 7
- 101100408089 Synechocystis sp. (strain PCC 6701) cpeA gene Proteins 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 101150101229 cpaA gene Proteins 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101710124907 X-ray repair cross-complementing protein 6 Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101100168412 Aspergillus oryzae cpaD gene Proteins 0.000 description 3
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 description 3
- 101100059139 Bacillus subtilis (strain 168) carB gene Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100352023 Synechocystis sp. (strain PCC 6701) cpeB gene Proteins 0.000 description 3
- 102100036976 X-ray repair cross-complementing protein 6 Human genes 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- LFERELMXERXKKQ-NYTQINMXSA-N cpad Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC([C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=[NH+]1 LFERELMXERXKKQ-NYTQINMXSA-N 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 2
- XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N Aflatoxin G Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1C1C=COC1O2 XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000001009 Aspergillus oryzae RIB40 Species 0.000 description 2
- 235000013023 Aspergillus oryzae RIB40 Nutrition 0.000 description 2
- 241000134719 Aspergillus tamarii Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 244000294411 Mirabilis expansa Species 0.000 description 2
- 235000015429 Mirabilis expansa Nutrition 0.000 description 2
- 101710163698 Norsolorinic acid synthase Proteins 0.000 description 2
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 241001507683 Penicillium aurantiogriseum Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 235000013536 miso Nutrition 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 235000019992 sake Nutrition 0.000 description 2
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- MVUXMIXDFMUPLL-INIZCTEOSA-N (5S)-3-acetyl-4-hydroxy-5-{[4-(3-methylbut-2-en-1-yl)-1H-indol-3-yl]methyl}-1,5-dihydro-2H-pyrrol-2-one Chemical compound C1=2C(CC=C(C)C)=CC=CC=2NC=C1C[C@@H]1NC(=O)C(C(C)=O)=C1O MVUXMIXDFMUPLL-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100425074 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) thiA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101150109417 NRPS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100342585 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) mus-51 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 101710120290 Polyketide synthase-nonribosomal peptide synthetase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101100342589 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) pku70 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- KYGRCGGBECLWMH-UHFFFAOYSA-N Sterigmatocystin Natural products COc1cc2OC3C=COC3c2c4Oc5cccc(O)c5C(=O)c14 KYGRCGGBECLWMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTSVPXMQSFGQTM-UHFFFAOYSA-N Sterigmatrocystin Natural products O1C2=CC=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(C1C=COC1O1)=C1C=C2OC UTSVPXMQSFGQTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036973 X-ray repair cross-complementing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710124921 X-ray repair cross-complementing protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;formic acid Chemical compound CC#N.OC=O XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- CNZIQHGDUXRUJS-PTNHGACKSA-N alpha-cyclopiazonic acid Chemical compound C([C@@H]1[C@H]2[C@H]3C(=O)\C(C(N3C1(C)C)=O)=C(O)/C)C1=CC=CC3=C1C2=CN3 CNZIQHGDUXRUJS-PTNHGACKSA-N 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 1
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013124 brewing process Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- RHGQIWVTIHZRLI-UHFFFAOYSA-N dihydrosterigmatocystin Natural products O1C2=CC=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(C1CCOC1O1)=C1C=C2OC RHGQIWVTIHZRLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 1
- 101150085005 ku70 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 101150060364 ptrA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- UTSVPXMQSFGQTM-DCXZOGHSSA-N sterigmatocystin Chemical compound O1C2=CC=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C([C@@H]1C=CO[C@@H]1O1)=C1C=C2OC UTSVPXMQSFGQTM-DCXZOGHSSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 235000021404 traditional food Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 108020002120 tryptophan dimethylallyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
[態様1]以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
(2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
(3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。
[態様2]以下のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド:
(1)配列番号1で示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、
(2)配列番号1で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[態様3]アスペルギルス・オリゼのゲノムに含まれるゲノムDNAである、態様1又は2記載のポリヌクレオチド。
[態様4]cDNAである、態様1又は2記載のポリヌクレオチド。
[態様5]以下のポリペプチドから成るポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ:
(1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
(2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
(3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。
[態様6]遺伝子操作によりアスペルギルス属又はペニシリウム属に属する微生物のシクロピアゾン酸非生産形質転換体を作製する方法。
[態様7]シクロピアゾン酸非生産形質転換体がサイクロアセトアセチルL−トリプトファン非生産菌である、態様6記載の方法。
[態様8]シクロピアゾン酸非生産形質転換体がポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼを発現しない菌である、態様6又は7記載の方法。
[態様9]遺伝子操作が態様1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドを破壊するものである、態様6〜8のいずれか一項に記載の方法。
[態様10]遺伝子操作を非相同組換えに関わるKu遺伝子が破壊された菌株に対して行う、態様9記載の方法。
[態様11]微生物がアスペルギルス・オリゼ株である、態様6〜10のいずれか一項に記載の方法。
[態様12]相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌であるアスペルギルス・オリゼ株を使用する、態様11記載の方法。
[態様13]相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌が、Aspergillus oryzae A4177K株である、態様12記載の方法。
[態様14]態様6〜13のいずれか一項記載の製造方法により得られた、シクロピアゾン酸非生産形質転換体。
[態様15]アスペルギルス・オリゼ株である、態様14記載のシクロピアゾン酸非生産形質転換体。
[態様16]態様1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸生産能を判別することを特徴とする、シクロピアゾン酸生産能の判別方法。
[態様17]態様1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’側領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸非生産菌を識別することを特徴とする、シクロピアゾン酸非生産株の識別方法。
[態様18]アスペルギルス菌株がアスペルギルス・オリゼである、態様16又は17記載の方法。
[態様19]ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域が配列番号1で示される塩基配列における4,217番目〜11721番目である、態様16〜18のいずれか一項に記載の方法。
[態様20]ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとその3’下流領域にあるテロメア配列との間に含まれるポリヌクレオチド領域が配列番号3で示される塩基配列を有する、態様16記載の方法。
[態様21]ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をPCRによって検出する、態様16〜20のいずれか一項に記載の方法。
[態様22]ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をサザン解析によって検出する、態様16〜20のいずれか一項に記載の方法。
従って、本発明により見出された新規なポリヌクレオチドは、以下のポリペプチドをコードするものである。
(1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
(2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
(3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上、好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。
(1)配列番号1で示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、
(2)配列番号1で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
(2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
(3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上、好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。
本明細書中で示されるように、更に、該遺伝子破壊株(ノックアウト株)を相同組換えによって作製したところ、シクロピアゾン酸生合成経路における初発段階で生成される中間物質であるサイクロアセトアセチルL−トリプトファン(CAT)が合成されなくなり、その結果、シクロピアゾン酸も生産されなくなることを確認した。
本明細書中で具体的に示されるように、アスペルギルス・オリゼ等のシクロピアゾン酸非生産菌においては、配列番号1で示される、シクロピアゾン酸生合成の初発段階を触媒する酵素、ポリケチドシンテターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ(PKS−NRPS)をコードする遺伝子の4,217番目の塩基以降の配列は欠失しており、また終止コドンも含まれていない。その代わりに、該塩基の3’側にテロメアリピート配列が付加している。PKS−NRPSには重要な活性ドメインが複数存在し、欠失した4,217番目の塩基以降の領域にも、活性に必要なドメインが含まれているため、このような3’末端側を欠失した遺伝子の発現産物はPKS−NRPSとしての機能できないものと推定される。
アスペルギルス・オリゼの標準株として、ゲノム情報が解読されたRIB40株がシクロピアゾン酸生産性株であるかを調べるために、既知のシクロピアゾン酸生産株であるアスペルギルス・オリゼNBRC4177株をポジティブコントロールとして、CYA寒天培地(3 .0g NaNO3, 1.0g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4・7H2O, 0.01g FeSO4・7H2O, 5.0g Yeast Extract, 30.0g Sucrose, 15.0g Agar, 1000ml Distilled water)にて一週間培養時に蓄積するシクロピアゾン酸量を調べた。検出は、LC/MS(液体クロマトグラフィー/質量分析装置)(アジレント社製1100シリーズ高速液体クロマトグラフィー、及びアプライドバイオシステム社製QSTAR Elite質量分析装置)を用いて行った。抽出は培地と菌体を直径6mmのスポットとして3サンプル回収し、1%のギ酸を含む酢酸エチル、ジクロロメタン、メタノールを3:2:1で混合した溶液800μlで抽出した。12,000rpm 5分間の遠心操作を2回行うことにより固形物を除き、サンプルとした。分離カラムはODSカラム(財団法人 化学物質評価研究機構 L−column 粒子径 5μm、内径 2.1mm、長さ100mm)を用い、溶離液は、0.1vol% 蟻酸水をA液、0.1vol% 蟻酸−アセトニトリルをB液とし、0分から5分までをA液95%、B液5%で流し、25分までにA液5%、B液95%に達するように濃度勾配をかけ、その後35分から36分でA液95%、B液5%とする方法でサンプル10μlを分離した。流速は毎分0.2mlで行った。質量分析は、Electrospray ionization(ESI)をイオン化法として用い、イオンスプレー電圧は5500 V、ヒーターガス温度は450℃、ネブライザーガス(GS1)は50psi、ターボガス(GS2)は50psi、カーテンガス(Nitrogen)は30psiとし、正イオン検出モードより検出した。
アスペルギルス・オリゼRIB40株、NBRC4177株及びNISL3010株を24時間CYA液体培養し、ろ過により回収した菌体を液体窒素により凍結後、乳鉢と乳棒を用いて破砕した。破砕した菌体より、2%SDS、0.1M NaCl、10mM EDTAを含む50mMトリス‐HCl緩衝液を用いて、ゲノムDNAを抽出し、リボヌクレアーゼAによりRNAを分解した後、フェノール・クロロホルム処理により精製した。
麹菌ゲノム情報(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/MicroTop?GENOME_ID=ao)は、アスペルギルス・オリゼRIB40株についてのゲノム解読情報であり、この情報を参考に、DCAT−S遺伝子の上流側の塩基配列を調べ、プローブ領域として、フォワードプライマー、5’-AGG GCT TGG TTA TGA AAA GTG TCC C-3’(配列番号4)とリバースプライマー 5’-CGC CTG ACG ATA CTG CAA ATG TC-3’(配列番号5)にはさまれた領域を選んだ。また、ゲノムDNAを切断する酵素として、プライマー領域よりもセントロメア側に切断配列が存在するBamHI,BglII(タカラ社製)を選択し、ゲノムの切断を行った。サザン解析はジゴキシゲニン(ロシュ社)を用いた方法を用い、製造者により推奨される方法に従い、行った。その結果、BamHI,BglIIで切断したゲノムでの解析では、RIB40株ではテロメアが存在するために、3.3kbと2.7kbのバンドしか得られないが、NBRC4177株とNISL3010株においては、約15kbと5kbのバンドが得られた(図1)。従って、これら2株はRIB40よりも、下流の領域でテロメアが付加していると考えられた。そこで、アスペルギルス・オリゼの近縁種として知られる、アスペルギルス・フラバスのゲノム情報を参考に、この下流の領域を標的配列とするPCRプライマーとして、フォワードプライマー12539:5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'(配列番号6)に対して、リバースプライマー13452:5'-GCACAAACCGTGAAATGATCCTTTTCACTG-3'(配列番号7)、リバースプライマー14433:5'-CTCCACGAGTGCGGGGAGTGGGCCAATAG-3'(配列番号8)、リバースプライマー15463:5'-GGCCGCACGTGACTTCAGTCATGTGATC-3'(配列番号9)、リバースプライマー16612:5'-CGGATTGTCCCACGCTCATAGTGTTTTGC-3'(配列番号10)、リバースプライマー17850:5'-GTCGACCGTTTCCTGTCTTTACCACAC-3'(配列番号11)、を用いて、NBRC4177株のゲノムDNAを鋳型にPCRを行ったところ、リバースプライマー17850以外において、DNAの増幅が観察された(図2)。また、RIB40株、NISL3010株、NBRC4177株のゲノムDNAをSalIとBglIIにより切断し、プローブとしてフォワードプライマー, 5'-CGGGTCTGCAGGCACGCATAAAGACTG-3'(配列番号12)と、リバースプライマー, 5'-ATCGCATGTGCTGTATGGATCCGACTATCC-3'(配列番号13)で増幅される領域の断片を用いたサザン解析を行ったところ、両方の制限酵素において、約2 kbの断片がNISL3010株とNBRC4177株においてのみ検出された(図3)。そこで、この結果を参考に、テロメア付加部位を予想し、インバースPCRによるテロメア付加領域をクローニングすることを試みた。その結果、NBRC4177株においてはRIB40株よりも、約17〜18kb 下流において、テロメアが付加していることが明らかとなった。テロメア付加部位周辺の塩基配列は配列番号2に示したとおりである。
第3染色体上のシクロピアゾン酸生合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子として、DCAT−S遺伝子(cpaB:AO090026000002)の周辺に位置する他の遺伝子であるcpaC(AO090026000003)及びcpaD(AO090026000004)が予想される(図4)。従って、本発明で同定されたPKS−NRPS遺伝子(cpaA:AO090026000001)、及びそれら遺伝子の系統的な破壊を行った。
LU: 5'-TGCTCGCCGTTAGCCTTTCGTTTCAC-3'(配列番号15)
LL: 5'-AGCGGCAGAACTGGCAGCAGATAATAGAG-3'(配列番号16)
PU: 5'-TGCTGCCAGTTCTGCCGCTACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'(配列番号17)
PL: 5'-TTAACACGCTTTCGTCGCTAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'(配列番号18)
RU: 5'-AGCGACGAAAGCGTGTTAACCAAGGTATG-3'(配列番号19)
RL: 5'-TTTGAGCGCAATCGGGATGAGTAATGTAG-3'(配列番号20)
LU: 5'-CTGCCAAAGCCCTTCTACGTGCTGAGTC-3'(配列番号21)
LL: 5'-GTACGTCTGTTGT GGCAGCCTTGATTGCGTCAAACATGAG-3'(配列番号22)
PU: 5'-TGACGCAATCAAGGCTGCCACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'(配列番号23)
PL: 5'-GGATTGCCAGTGGAGTGGCAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'(配列番号24)
RU: 5'-CTGAGGTGCAGTT GCCACTCCACTGGCAATCCTCGAGGAG-3'(配列番号25)
RL: 5'-GCAGCAGCACTGAACGCTTCGAAGGTATG-3'(配列番号26)
LU: 5'-TCTTTCCACCGTCGCCTATCTTGCTTTG-3'(配列番号27)
LL: 5'-GTACGTCTGTTGTTTCCAGGACATCGCCAGATGTGTGAG-3'(配列番号28)
PU: 5'-ATCTGGCGATGTCCTGGAAACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'(配列番号29)
PL: 5'-CCCTCATTCAAGGCAGCGGAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'(配列番号30)
RU: 5'-CTGAGGTGCAGTTCCGCTGCCTTGAATGAGGGCTACGTC-3'(配列番号31)
RL: 5'-CCCCCACAGCAAGGTCGAGTAATCTGAC-3'(配列番号32)
LU: 5'-CGGTTGCTTGCGAAGGGATTTTCAGATG-3'(配列番号33)
LL: 5'-GTACGTCTGTTGTTGGCGCTAAGAGCTGTTGCTGTCGTCTC-3'(配列番号34)
PU: 5'-GCAACAGCTCTTAGCGCCAACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'(配列番号35)
PL: 5'-GCGCTTGGCATTTTCGTTCAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'(配列番号36)
RU: 5'-CTGAGGTGCAGTTGAACGAAAATGCCAAGCGCAAAGTCATC-3'(配列番号37)
RL: 5'-CTCTGATCCAGGGGCTAGCTCCCAATC-3'(配列番号38)
CU: 5'-CGGCGAGATAGTGGCTGCCTATGCTC-3'(配列番号39)
CL: 5'-CAGGGTCAAGCCCCAGAACATTCATG-3'(配列番号40)
Primer cpaB
CU: 5'-GGCACCCGAAAGCTGAGCAATGGAG-3'(配列番号41)
CL: 5'-TGGCGCGTGGCAACAAGGTCTATG-3'(配列番号42)
Primer cpaC
CU: 5'-AGGCCCGAGATGAGCAATCTTGGGAATC-3'(配列番号43)
CL: 5'-ACCGCGTTTGTGCGAGACCGTACTTGAC-3'(配列番号44)
Primer cpaD
CU: 5'-GCGTCTCTGGCATTCGTACCATCTATG-3'(配列番号45)
CL: 5'-ATACTGGAGACACAGCGCACACGATAC-3'(配列番号46)
である。
実施例1の結果から、アスペルギルス・オリゼにおいては、シクロピアゾン酸生産菌と非生産菌の間では、第3染色体末端領域の塩基配列が異なり、シクロピアゾン酸生産菌は、非生産菌においては欠失が生じているPKS−NRPS遺伝子を完全長保持していること、さらにテロメアまでに、約17〜18kbの配列が存在することがわかった。そこで、このようなシクロピアゾン酸生産菌のみが有している領域を増幅標的配列としたPCRプライマーを実施例1と同様に、アスペルギルス・フラバスのゲノム情報より作製し、複数のアスペルギルス・オリゼ株(シクロピアゾン酸生産菌としてNISL3010株及びNBRC4177株、並びに、シクロピアゾン酸非生産菌としてRIB40株)について、PCRによる増幅試験を行った。
forward primer: 5'-GTCGCCACTTCTGCTCCCATCAAC-3'(配列番号47)
reverse primer: 5'-GGGCACAAGACTGCGATTGTGTCTC-3'(配列番号48)
Primer set 2
forward primer: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'(配列番号49)
reverse primer: 5'-GCACAAACCGTGAAATGATCCTTTTCACTG-3'(配列番号50)
Primer set 3
forward primer: 5'-CCGGTGAAGAGCTTCAAGGAATATATG-3'(配列番号51)
reverse primer: 5'-CAGTACGCAAATCGGAATCAAGTTGCAGAG-3'(配列番号52)
Primer set 4
forward primer: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'(配列番号53)
reverse primer: 5'-CTCCACGAGTGCGGGGAGTGGGCCAATAG-3'(配列番号54)
Primer set 5
forward primer: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'(配列番号55)
reverse primer: 5'-GGCCGCACGTGACTTCAGTCATGTGATC-3'(配列番号56)
Primer set 6
forward primer: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'(配列番号57)
reverse primer: 5'-CGGATTGTCCCACGCTCATAGTGTTTTGC-3'(配列番号58)
Primer set 7
forward primer: 5'-ACTCATGATGCGGCGATGTTCTCTCA-3'(配列番号59)
reverse primer: 5'-GGGCACAAGACTGCGATTGTGTCTC-3'(配列番号60)
+4985 forward primer: 5'-TTTCCCTGGTGGAGCTTGACGAGCC-3' (配列番号61)
+7659 reverse primer: 5'-CTCATGCATAGAGACAGCGTGTTCC-3' (配列番号62)
Primer set P−2
+5704 forward primer: 5'-GAGCCCGATGAGTTACTTGCTGCTG-3' (配列番号63)
+9485 reverse primer: 5'-CCTCCGTTCATGATGGCATTGAGAGTCTG-3' (配列番号64)
Primer set P−3
+8939 forward primer: 5'-GCTATTTGCAGCTCCAAGCGCAAAG-3' (配列番号65)
+11103 reverse primer: 5'-TTGCGACTGGAGGGCAAATTCGGCG-3' (配列番号66)
Primer set P−4
(コントロールプライマー: Tominaga et al., Appl. Environ. Microbiol. (2006) 72: 484-490. 参照)
control forward primer: 5'-CCAAGAACATGATGGCTGCT-3' (配列番号67)
control reverse primer: 5'-CTTGAAGAGCTCCTGGATGG-3' (配列番号68)
Claims (22)
- 以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
(2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
(3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。 - 以下のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド:
(1)配列番号1で示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、
(2)配列番号1で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - アスペルギルス・オリゼのゲノムに含まれるゲノムDNAである、請求項1又は2記載のポリヌクレオチド。
- cDNAである、請求項1又は2記載のポリヌクレオチド。
- 以下のポリペプチドから成るポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ:
(1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
(2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
(3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。 - 遺伝子操作によりアスペルギルス属又はペニシリウム属に属する微生物のシクロピアゾン酸非生産形質転換体を作製する方法。
- シクロピアゾン酸非生産形質転換体がサイクロアセトアセチルL−トリプトファン非生産菌である、請求項6記載の方法。
- シクロピアゾン酸非生産形質転換体がポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼを発現しない菌である、請求項6又は7記載の方法。
- 遺伝子操作が請求項1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドを破壊するものである、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子操作を非相同組換えに関わるKu遺伝子が破壊された菌株に対して行う、請求項9記載の方法。
- 微生物がアスペルギルス・オリゼ株である、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌であるアスペルギルス・オリゼ株を使用する、請求項11記載の方法。
- 相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌が、Aspergillus oryzae A4177K株である、請求項12記載の方法。
- 請求項6〜13のいずれか一項記載の製造方法により得られた、シクロピアゾン酸非生産形質転換体。
- アスペルギルス・オリゼ株である、請求項14記載のシクロピアゾン酸非生産形質転換体。
- 請求項1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸生産能を判別することを特徴とする、シクロピアゾン酸生産能の判別方法。
- 請求項1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’側領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸非生産菌を識別することを特徴とする、シクロピアゾン酸非生産株の識別方法。
- アスペルギルス菌株がアスペルギルス・オリゼである、請求項16又は17記載の方法。
- ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域が配列番号1で示される塩基配列における4,217番目〜11721番目である、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
- ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとその3’下流領域にあるテロメア配列との間に含まれるポリヌクレオチド領域が配列番号3で示される塩基配列を有する、請求項16記載の方法。
- ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をポリメラーゼ連鎖反応によって検出する、請求項16〜20のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をサザン解析によって検出する、請求項16〜20のいずれか一項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009538119A JP5410981B2 (ja) | 2007-10-19 | 2008-10-16 | ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007272465 | 2007-10-19 | ||
JP2007272465 | 2007-10-19 | ||
JP2009538119A JP5410981B2 (ja) | 2007-10-19 | 2008-10-16 | ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子 |
PCT/JP2008/068698 WO2009051152A1 (ja) | 2007-10-19 | 2008-10-16 | ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013213095A Division JP5813073B2 (ja) | 2007-10-19 | 2013-10-10 | シクロピアゾン酸非生産形質転換体及びその作製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2009051152A1 true JPWO2009051152A1 (ja) | 2011-03-03 |
JP5410981B2 JP5410981B2 (ja) | 2014-02-05 |
Family
ID=40567415
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009538119A Expired - Fee Related JP5410981B2 (ja) | 2007-10-19 | 2008-10-16 | ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子 |
JP2013213095A Active JP5813073B2 (ja) | 2007-10-19 | 2013-10-10 | シクロピアゾン酸非生産形質転換体及びその作製方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013213095A Active JP5813073B2 (ja) | 2007-10-19 | 2013-10-10 | シクロピアゾン酸非生産形質転換体及びその作製方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110070579A1 (ja) |
JP (2) | JP5410981B2 (ja) |
WO (1) | WO2009051152A1 (ja) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0530994A (ja) * | 1991-08-01 | 1993-02-09 | Kikkoman Corp | シクロピアゾン酸非生産性麹菌の検出用培地 |
WO1995012661A1 (en) * | 1993-11-02 | 1995-05-11 | Merck & Co., Inc. | Dna encoding triol polyketide synthase |
AU1774000A (en) * | 1998-12-23 | 2000-07-31 | Novozymes A/S | Methods for producing polypeptides in aspergillus mutant cells |
JP2008048681A (ja) * | 2006-08-25 | 2008-03-06 | Osaka Univ | RNAi法を用いた紅麹菌におけるカビ毒シトリニン生産抑制方法 |
-
2008
- 2008-10-16 US US12/672,243 patent/US20110070579A1/en not_active Abandoned
- 2008-10-16 WO PCT/JP2008/068698 patent/WO2009051152A1/ja active Application Filing
- 2008-10-16 JP JP2009538119A patent/JP5410981B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-10-10 JP JP2013213095A patent/JP5813073B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20110070579A1 (en) | 2011-03-24 |
JP2014039559A (ja) | 2014-03-06 |
JP5410981B2 (ja) | 2014-02-05 |
JP5813073B2 (ja) | 2015-11-17 |
WO2009051152A1 (ja) | 2009-04-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Huser et al. | Discovery of pathogenicity genes in the crucifer anthracnose fungus Colletotrichum higginsianum, using random insertional mutagenesis | |
KR20170087521A (ko) | 진균 게놈 변형 시스템 및 사용 방법 | |
KR20190027843A (ko) | Rna 데그라도솜 단백질 복합체의 유전자 교란 | |
JP2010193913A (ja) | 糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼを組換え体で高発現するための方法 | |
TW202214841A (zh) | 用於藉由醱酵生產4-胺基苯乙胺之工程化生物合成途徑 | |
EP2617824B1 (en) | Novel extracellularly secreted nuclease | |
Zhang et al. | Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation as a tool for insertional mutagenesis in the fungus Penicillium marneffei | |
CN108473972B (zh) | 补身醇合酶iii | |
JP7252536B2 (ja) | ポリリジン生産菌及びそれを用いるポリリジン製造方法 | |
JP5813073B2 (ja) | シクロピアゾン酸非生産形質転換体及びその作製方法 | |
JP2019071834A (ja) | 糸状菌における二次代謝産物の生産 | |
US20050181509A1 (en) | Dual selection based, targeted gene disruption method for fungi and fungus-like organisms | |
JP6392534B2 (ja) | ロイシン酸生産活性を有するタンパク質及びその利用 | |
CN112410353B (zh) | 一种fkbS基因、含其的基因工程菌及其制备方法和用途 | |
JP5367300B2 (ja) | 麹菌の分生子形成に関与する遺伝子、及び、麹菌の分生子形成能を増大させる方法 | |
JP5993229B2 (ja) | コレステロールエステラーゼを可溶化発現させる方法 | |
KR20170002658A (ko) | 코르넥시스틴 및 히드록시코르넥시스틴의 생합성을 위한 유전자 클러스터 | |
JP2015063522A (ja) | Ebd及びhkd含有融合ペプチド及び当該ペプチドを発現する形質転換体 | |
WO2024004983A1 (ja) | エリスリトール資化能欠損変異トリコデルマ属菌、及びこれを用いた目的物質の製造方法 | |
US20080044878A1 (en) | Novel Promoters | |
US11873523B2 (en) | Aconitic acid exporter (aexA) increases organic acid production in Aspergillus | |
WO2017103739A1 (en) | Gene cluster for biosynthesis of austinoids | |
KR100665798B1 (ko) | 신규한 베타-글루코시데이즈 유전자 | |
CN109689871B (zh) | 突变丝状菌和使用其制造c4二羧酸的方法 | |
WO2003083109A1 (fr) | Gene marqueur de selection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20111004 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130528 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130716 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131001 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131107 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |