WO2013015326A1 - 改善された発現特性を示す改変型ペルオキシダーゼ酵素遺伝子、及びそれを使用したペルオキシダーゼの生産方法 - Google Patents

改善された発現特性を示す改変型ペルオキシダーゼ酵素遺伝子、及びそれを使用したペルオキシダーゼの生産方法 Download PDF

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peroxidase
seq
cryptococcus
dna
amino acid
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PCT/JP2012/068862
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悠 歌島
柳谷　周作
家藤　治幸
正木　和夫
Original Assignee
東洋紡株式会社
独立行政法人酒類総合研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)

Definitions

  • the present invention relates to a modified peroxidase enzyme gene that exhibits improved expression characteristics by optimizing the codon usage of the gene for expression in a particular host.
  • the present invention also relates to a method for efficiently recombinantly producing a stable quality peroxidase using such an enzyme gene.
  • Peroxidase has been widely used in fields such as analysis, clinical laboratory tests, immunochemistry, histochemistry, and cytochemistry, but in recent years, its demand is increasing due to its usefulness in the food field, wastewater treatment, and environmental purification. It is coming.
  • peroxidase Although peroxidase is widely present in the plant kingdom, it has been mainly extracted from horseradish radish because it is contained in a large amount in horseradish radish (Armorcia rusticana). However, when peroxidase is extracted from a plant, it is extremely difficult to obtain a peroxidase having a stable quality because the peroxidase content and the isozyme composition ratio vary greatly depending on various factors such as cultivar and cultivation conditions. In addition, there is a problem that the production area and the production time are limited depending on the restriction of the suitable cultivation area and the harvesting period.
  • Non-Patent Document 1 the amino acid sequence of C1a, which is one of the isozymes of the horseradish peroxidase gene, has been clarified.
  • Patent Document 1 a cDNA library is constructed and sequence analysis is performed. Its DNA sequence has been revealed.
  • Patent Document 2 a small amount of active peroxidase has been successfully expressed in E. coli by adding a pelB signal to the peroxidase gene and further not inducing expression.
  • inclusion bodies are formed when the peroxidase gene is highly expressed, resulting in an inactive form, which is problematic in terms of the quality of the enzyme protein.
  • Patent Document 2 it is also attempted to use Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastris as a host instead of E. coli.
  • the present invention was devised in view of the current state of the prior art, and an object thereof is a modified peroxidase enzyme gene capable of efficiently recombinantly producing a stable peroxidase and a peroxidase using the same. It is to provide a production method.
  • basidiomycete yeast having the ability to secrete and produce various enzymes was used as a host.
  • This strain was described in Patent Document 1.
  • the isozyme C1a gene of horseradish-derived peroxidase was cloned to try to express recombinant peroxidase.
  • no peroxidase activity was detected in the culture supernatant, and it was found that peroxidase cannot be produced simply by recombining the wild-type peroxidase enzyme gene into this strain.
  • peroxidase maintained the enzyme activity without forming inclusion bodies. It was found that it was secreted and produced at a high level in the culture medium. Moreover, it discovered that productivity was further improved by optimizing the secretory signal peptide sequence. Furthermore, it has been found that the enzyme properties of the obtained peroxidase are equivalent to those of horseradish-derived wild-type peroxidase.
  • DNA comprising the following base sequence (A) or (B): (A) the base sequence represented by SEQ ID NO: 10; (B) A nucleotide sequence that is 90% or more homologous to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 and encodes a protein having peroxidase enzyme activity.
  • the transformant according to (4), wherein the microorganism into which the recombinant expression vector is introduced is a microorganism classified as a basidiomycete.
  • the transformant according to (5), wherein the microorganism into which the recombinant expression vector has been introduced is a microorganism classified into the genus Cryptococcus.
  • the microorganism into which the recombinant expression vector has been introduced is Cryptococcus sp.
  • a method for producing peroxidase comprising a step of culturing the transformant according to any one of (4) to (7) and collecting a protein having peroxidase enzyme activity from the obtained culture. .
  • a peroxidase enzyme protein obtained by expressing the DNA of (1) or (2), wherein the protein includes a sugar chain and has a molecular weight of 52 kDa to 65 kDa.
  • the modified peroxidase enzyme gene of the present invention produces a stable level of peroxidase at a high level because the codon usage of the gene is optimized for expression in a specific host typified by basidiomycetous yeast. be able to.
  • the production efficiency of peroxidase can be dramatically increased.
  • FIG. 1 shows a cryptococcus sp.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of an expression vector pCsUX for S-2.
  • FIG. 2 shows peroxidase productivity of each peroxidase gene expression contract-introduced transformant.
  • FIG. 3 shows the results of a heat resistance test of the recombinant peroxidase.
  • FIG. 4 shows the results of a pH stability test of the recombinant peroxidase.
  • FIG. 5 shows the results of a molecular weight test of recombinant peroxidase.
  • FIG. 6 shows the results of a glycolysis test of recombinant peroxidase.
  • the present invention provides a modified peroxidase enzyme gene capable of producing a stable level of peroxidase at a high level by optimizing the codon usage of the gene for expression in a specific host.
  • a DNA comprising the following base sequence (A) or (B) is provided: (A) the base sequence represented by SEQ ID NO: 10; (B) A nucleotide sequence that is 90% or more homologous to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 and encodes a protein having peroxidase enzyme activity.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 in (A) is the sequence of C1a, which is one of the isozymes of mature horseradish peroxidase, and the codon usage thereof is Cryptococcus sp. Optimized to be suitable for expression in S-2.
  • the host microorganism used for expression of this sequence is Cryptococcus sp.
  • the microorganism is not particularly limited as long as it is a microorganism having a codon usage similar to S-2, but is a eukaryote, preferably a basidiomycete, more preferably a microorganism of the genus Cryptococcus, most preferably a cryptococcus sp. S-2.
  • DNA consisting of a base sequence optimized for the host as described above, removal of rare codons, optimization of the GC content, and improvement of RNA higher-order structure are brought about, thereby improving transcription and translation efficiency. Increases and increases peroxidase productivity.
  • a base sequence that is 90% or more homologous to the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 in (B) and encodes a protein having peroxidase enzyme activity is equivalent to the base sequence in (A) It is the base sequence of the range.
  • This is a functionally equivalent enzyme protein even if a part of the base sequence of the gene encoding the enzyme protein is mutated and as a result part of the amino acid sequence of the enzyme protein is mutated. This is because there are many cases.
  • the base sequence of (B) is, for example, Transformer Mutagenesis Kit; manufactured by Clonetech, EXOIII / Mung Bean Deletion Kit; manufactured by Stratagene, QuickChange SiteDirected Mitsnesit Kits; It can be obtained by modifying the base sequence described in SEQ ID NO: 10 using the method. The activity of the protein encoded by the obtained gene can be confirmed by the method described in Examples below.
  • an amino acid sequence selected from the group consisting of the following (C) to (G) is encoded upstream of the DNA consisting of the base sequence (A) or (B): A fusion DNA is formed by binding the DNA to be bound.
  • C the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11;
  • D Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12:
  • E the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13;
  • F the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14;
  • G The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
  • a secretory signal peptide is present at the N-terminus of a secreted protein. It has been reported that the expression efficiency and expression success rate of these secreted proteins can be increased by replacing the existing secretory signal peptide with a highly efficient secretory signal peptide. Therefore, high efficiency of the secretory signal peptide is an important factor.
  • cryptococcus sp. which is a microorganism used in the present invention.
  • S-2 has been confirmed to secrete and produce various types of hardly degradable enzymes, and secretes and produces enzymes such as raw starch degradable ⁇ -amylase, acid xylanase, and cutinase that degrades biodegradable plastics.
  • secretory signal peptides possessed by these secreted proteins have heretofore been found in secreted proteins, and it has been unclear whether they are the most efficient secretory signal peptides.
  • a computer program for predicting the sequence of a secretory signal peptide is provided.
  • these computer programs include SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), PSORT (http://psort.nibb.ac.jp/), and the like.
  • S-2 is a secretory signal peptide sequence derived from an acid xylanase produced by S-2.
  • SEQ ID NO: 11 is a sequence (Xs1) having the secretory signal peptide sequence from the start codon to the 37th amino acid
  • SEQ ID NO: 12 is a secretion signal
  • the peptide sequence is the sequence (Xs2) from the start codon to the 23rd amino acid
  • SEQ ID NO: 13 is the sequence (Xs3) from the secretory signal peptide sequence to the 17th amino acid from the start codon.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 of (F) is Cryptococcus sp. It is a secretory signal peptide sequence (As) derived from ⁇ -amylase produced by S-2.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 of (G) is Cryptococcus sp. It is a secretory signal peptide sequence (Cs) derived from cutinase produced by S-2.
  • the modification of the codon usage or signal peptide sequence portion of the above DNA of the present invention can be performed using Cryptococcus sp.
  • Other microorganisms belonging to the genus Cryptococcus (Cryptococcus lifacfaciens, Cryptococcus flavus, Cryptococcus flavus, Cryptococcus curvatus, etc.), and the genus citrus of the genus a , Filobasidium floriforme, Kurtzmanomyces sp., Malassezia furfur, Malassezia sympodialis, Pseudozyma tsutsuburodisis, Pseudozomudis loides, Rhodosporidium paludigenum, Rhodotorula sp., Rhodotorula graminis, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula a
  • Trichosporon mucoides Trichosporon mucoides
  • eukaryotes Gaeumannomyces graminis, Pleurotus sp., Pleurotus eringii, Pleurotus sapidus, rametes pubescens, Trametes sp. C30, Trametes sp. 420, Trametes sp. AH28-2, Trametes villosa, Trametes sp. I-62, Trametes versicolor, Trametes hirsute, it can be applied to Trametes etc. ochracea).
  • Codon Usage Database http://www.kazusa.or.jp/codon/). By using this information, it is possible to predict the codon usage of the host microorganism.
  • the codon usage of the above-mentioned DNA of the present invention is Cryptococcus sp.
  • the ratio of the amino acid sequence of the third letter of the codon of the DNA sequence to G or C is 92%.
  • the ratios in which the amino acid sequence of the third letter of the codons of the ⁇ -amylase, cutinase, and xylanase DNA sequences whose expression has been confirmed in S-2 are G or C are 81.5%, 81.3%, and 80%, respectively.
  • the ratio in which the amino acid sequence of the third letter of the codon is G or C tends to be very high.
  • the above DNA of the present invention is Cryptococcus sp. S-2 and other Cryptococcus microorganism having similar codon usage (Cryptococcus liquefaciens, Cryptococcus flavus, Cryptococcus flavus, etc. Cryptococcus curvatus), yet another genus Basidiomycetes (Cystofilobasidium capitatum, Filobasidium floriforme, Kurtzmanomyces sp.
  • Trichosporon mucoides Trichosporon mucoides
  • eukaryotes Gaeumannomyces graminis, Pleurotus sp., Pleurotus eryngii , Pleurotus sapidus, Trametes Ubescens, Trametes sp. C30, Trametes sp. 420, Trameses sp. AH28-2, Tramets villosa, Trameses sp. I-62, Trametes versaticor, Trametes can also be used. .
  • a recombinant expression vector obtained by inserting the above DNA into an expression vector, and a transformant obtained by introducing the recombinant expression vector into a microorganism Is also provided.
  • the expression vector into which the above DNA is inserted is not particularly limited, and conventionally known vectors such as E. coli vectors can be mentioned.
  • E. coli vectors include pBR322, pUC19, pGEM-T, pCR-Blunt, pTA2, and pET.
  • the vector DNA comprises an auxotrophic marker, a drug resistance marker, an expression promoter DNA sequence, an expression terminator DNA sequence, and more preferably a cryptococcus sp.
  • S-2-derived orotate phosphoribosyl transfer gene, xylanase promoter, and xylanase terminator are included.
  • the host microorganism into which the above-mentioned DNA is incorporated is not particularly limited, and examples include microorganisms classified as basidiomycetes.
  • examples include microorganisms classified as basidiomycetes.
  • Cryptococcus sp. S-2 (Cryptococcus sp. S-2) (Accession number FERM BP-10961: 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan 9th National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, September 1995 (Deposited in Japan as FERM P-15155 on May 5 and transferred to international deposit on April 25, 2008).
  • the combination of the expression vector and the host microorganism used in the present invention is not particularly limited, but an auxotrophic marker gene or drug resistance marker gene derived from the host into which the gene is incorporated and an expression promoter DNA sequence from the host into which the gene is incorporated And an expression vector containing a terminator DNA sequence derived from a host into which the gene is incorporated, and an auxotrophic mutant host or a drug-sensitive host, and most preferably a cryptococcus sp.
  • DNA consisting of a base sequence optimized for a host is introduced into a high expression vector derived from a host microorganism and transformed into the host microorganism, so that transcription and translation efficiency can be expected to increase. Improvement is expected.
  • the method of transferring the recombinant expression vector into the cells of the host microorganism is not particularly limited, and examples thereof include electroporation.
  • a method for producing peroxidase comprising a step of culturing the above transformant and collecting a protein having peroxidase enzyme activity from the obtained culture.
  • the culture form of the transformant may be appropriately selected in consideration of the nutritional physiological properties of the host. Usually, liquid culture is used in many cases, but industrially, aeration and agitation culture is advantageous. It is advantageous to select a high peroxidase-producing cell line in advance prior to culturing.
  • the nitrogen source used for the culture may be any nitrogen compound that can be used by the host microorganism except for a special N source such as a deletion of a specific amino acid component.
  • a special N source such as a deletion of a specific amino acid component.
  • These are mainly organic nitrogen sources, and for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean cake alkaline decomposition product and the like are used.
  • yeast extract and soybean protein are preferable, but the present invention is not limited to this, and the transformant can also be cultured by using casein polypeptone, fermented koji extract, malt extract, or the like.
  • nutrient sources commonly used for culturing microorganisms are widely used.
  • the carbon source any carbon compound that can be assimilated may be used.
  • glucose, sucrose, lactose, maltose, xylose, molasses, pyruvic acid and the like are used.
  • phosphates, carbonates, sulfates, salts such as magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, and the like are used as necessary.
  • the culture temperature can be appropriately changed within the range in which the bacteria grow and produce peroxidase, but cryptococcus sp. In the case of S-2, it is usually about 20 to 25 ° C.
  • the culture time varies slightly depending on conditions, the culture may be terminated at an appropriate time in consideration of the time when the peroxidase reaches the maximum yield, and is usually about 60 to 120 hours.
  • the medium pH can be appropriately changed within the range in which the bacteria grow and produce peroxidase, but is usually about pH 3.0 to 9.0.
  • the peroxidase of the present invention can be used by directly collecting and using a culture solution containing cells obtained by culturing the above transformant, but generally, peroxidase by filtration, centrifugation or the like in advance according to a conventional method. It can also be used after separating the contained solution and the bacterial cells.
  • peroxidase may be purified and used from the peroxidase-containing solution thus obtained.
  • Purification methods include, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting out treatment such as ammonium sulfate and sodium sulfate, fractional precipitation with a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc., heating treatment or isoelectric point treatment, adsorbent
  • treatments such as gel filtration with a gel filtration agent, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography and the like.
  • the peroxidase obtained by the method of the present invention has the following properties (i) to (iv) and is a peroxidase of higher quality than the conventional one.
  • Action shows peroxidase enzyme activity in the presence of mediator and hydrogen peroxide.
  • Molecular weight about 55 kDa (52 kDa to 65 kDa) including sugar chains.
  • Stable pH range pH 4.5 to 11.0.
  • Thermal stability It has a residual activity of 90% or more after heat treatment at 55 ° C. for 10 minutes.
  • the peroxidase having the enzyme chemical characteristics as described above may be suitably used for applications such as analysis, clinical examination, immunochemistry, histochemistry, cytochemistry, and further for food applications, wastewater treatment, environmental purification, etc. it can.
  • the various enzyme chemical properties described above can be examined by using known methods for specifying various enzyme properties, for example, the methods described in the following examples.
  • Various properties of the enzyme can be examined to some extent in the culture medium of the transformant producing the peroxidase of the present invention or in the middle of the purification process, and more specifically, using the purified enzyme.
  • the purified enzyme refers to an enzyme that has been separated to a state that does not substantially contain components other than the enzyme, particularly proteins other than the enzyme (contaminating protein). Specifically, for example, it refers to an enzyme having a content of contaminating protein of less than about 20%, preferably less than about 10%, more preferably less than about 5%, and even more preferably less than about 1% based on weight. .
  • peroxidase activity is measured under the following conditions.
  • Peroxidase activity measurement method Prepare a mixed solution of 1.5 ml of 1 mM ABTS / 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.5) and 1.5 ml of 5.8 mM H 2 O 2 aqueous solution in a test tube, and preheat at 25 ° C. for about 5 minutes. To this reaction solution, 0.1 ml of a peroxidase enzyme solution appropriately diluted with (50 mM phosphate buffer (pH 6.0) /0.1% Triton-X100) was added and mixed gently, and then controlled at 25 ° C. for water.
  • the absorbance change at 405 nm is recorded for 5 minutes, and the absorbance change per minute ( ⁇ OD test ) is measured from the straight line portion.
  • ⁇ OD test absorbance change per minute
  • a solution for dissolving and diluting peroxidase instead of the POD solution is added to the reagent mixture, and the change in absorbance per minute ( ⁇ OD blank ) is similarly measured. From these values, the peroxidase activity is determined according to the following formula.
  • 1 unit (U) in peroxidase activity is defined as the amount of enzyme that oxidizes 1 micromole of ABTS per minute under the conditions of pH 4.5 and 25 ° C.
  • U / ml ( ⁇ OD test ⁇ OD blank ) ⁇ dilution factor ⁇ 3.1 / (34.7 ⁇ 0.1 ⁇ 1.0)
  • 3.1 is the amount of reaction reagent + enzyme solution (ml)
  • 34.7 is the millimolar extinction coefficient (cm 2 / micromole) under the conditions of this activity measurement
  • 0.1 is the amount of enzyme solution.
  • Ml indicates the optical path length (cm) of the cell.
  • the pCsUX plasmid (5.9 kbp) containing the Xyl promoter, Xyl terminator, and URA5 gene was treated with MluI and cleaved at one position immediately downstream of the Xyl promoter, followed by dephosphorylation.
  • a HRP (opt) -CTP peroxidase gene fragment was ligated to the treated plasmid to construct a recombinant plasmid (pCsUXHRP (opt) -CTP).
  • pCsUX plasmid shown in FIG. Recombinant DNA was prepared by ligating the acidic xylanase promoter (Xyl-pro) derived from S-2, the acidic xylanase terminator (Xyl-ter), and the orthophosphate phosphoryltransferase gene (URA5) to a commercially available pUC19 vector by a conventional method. And E. coli using this recombinant DNA. It can be obtained by transforming E. coli DH5 ⁇ according to a conventional method. Transformants can be selected by ampicillin resistance.
  • Xyl-pro acidic xylanase promoter
  • Xyl-ter acidic xylanase terminator
  • UUA5 orthophosphate phosphoryltransferase gene
  • PCsUX2AsHRP (opt) -CTP plasmid pCsUXHRP (opt) -CTP, HRP (opt) F (-sp) of SEQ ID NO: 4 and Cutinase (ss) -Xyl2- of SEQ ID NO: 9
  • the secretory signal peptide sequence was replaced with the “Cutinase secretory signal peptide sequence” shown in SEQ ID NO: 15 (pCsUX2CsHRP (opt) -CTP).
  • Cryptococcus sp. Transformation into S-2 The recombinant host is Cryptococcus sp. S-2. U-5 strain was used. This strain is used to select Cryptococcus sp. S-2 was made uracil auxotrophic by natural mutation, and was obtained at the National Institute of Liquor Research with the pCsUX2 plasmid.
  • Cryptococcus sp. Acquisition of a uracil-requiring strain from S-2 was obtained from Cryptococcus sp. This can be easily performed by irradiating S-2 with UV, culturing in a medium containing 5-fluoroorotic acid, and selecting the surviving strain.
  • Electroporation buffer (270 mM sucrose, 1 mM magnesium chloride, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6) was added to the solution after energization and spread on the selection plate.
  • the selection plate used was YNB-ura agar medium (0.67% Yeast Nitrogen Base W / O amino acid, 0.078% -ura DO supplement, 2% glucose, 1% agar powder).
  • the inoculated plate was statically cultured at 25 ° C. for 1 week, and growing colonies were selected.
  • HRP (opt) R (-ctpp) of SEQ ID NO: 3 and HRP (opt) F (-sp) of SEQ ID NO: 4, or HRP (wt) R of SEQ ID NO: 19 The introduction of the gene was confirmed by performing colony PCR with KOD-Fx (Toyobo Co., Ltd.) using (-cpppp) and HRP (wt) F (-sp) of SEQ ID NO: 20 as primers. 2. related strains was cultured.
  • the obtained transformant is cultured in 3 ml liquid medium (0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1.0% glucose) at 25 ° C., 230 rpm, for 48 hours. And used as a preculture. 0.03 ml of the preculture was transferred to a 3 ml liquid medium (yeast extract 2%, xylose 5%) and cultured at 25 ° C., 230 rpm for 72 hours to confirm peroxidase activity.
  • FIG. 2 shows the measured peroxidase activity of the strain with the highest productivity among the several transformants obtained.
  • a peroxidase activity of about 2190 U / L was detected in the strain (UXHRP (opt) -CTP in FIG. 2) into which a gene with optimized codon usage was introduced. Furthermore, the secretory signal peptide sequence is designated as Cryptococcus sp.
  • S-2 modified to Xylanase secretion signal peptide sequence 1 UXXsHRP (opt) -CTP in FIG. 2
  • a peroxidase activity of up to about 22,500 U / L was detected, and the secretion signal peptide sequence was converted to Cryptococcus sp.
  • S-2 modified to Xylanase secretion signal peptide sequence 2 UX2Xs2HRP (opt) -CTP in FIG. 2
  • a peroxidase activity of about 39500 U / L at maximum was detected, and the secretory signal peptide sequence was converted to Cryptococcus sp.
  • S-2 Xylanase secretion signal peptide sequence 3 UX2Xs3HRP (opt) -CTP in FIG. 2
  • a peroxidase activity of up to about 59,700 U / L was detected, and the secretory signal peptide sequence was converted to Cryptococcus sp.
  • the signal peptide sequence is Cryptococcus sp.
  • a modified Xylanase secretion signal peptide sequence 1 of S-2 (UXXsHRP (wt) -CTP in FIG. 2), and the secretory signal peptide sequence of Cryptococcus sp.
  • the S-2 Xylanase secretory signal peptide sequence 2 (UX2Xs2HRP (wt) -CTP in FIG.
  • Basidiomycetous Yeast Recombinant Peroxidase 25 The culture was carried out at 68 ° C. for 68 hours. After filtering the cultured cells, the culture supernatant was collected and used as a crude enzyme solution in the following experiments.
  • the molecular weight of the peroxidase of the present invention was about 55 KDa (52 kDa to 65 kDa). Further, as can be seen from FIG. 6, the molecular weight after removing the sugar chain using deglycosylase (Roche, endoglycosidase H) was about 37 kDa. From these results, it is predicted that the sugar chain of the peroxidase of the present invention is about 18 kDa, and the sugar content per protein is estimated to be about 33%.
  • the basidiomycetous recombinant peroxidase obtained in this example has almost the same characteristics as wild-type peroxidase derived from horseradish.
  • peroxidase having the same characteristics and stable quality as wild-type peroxidase derived from horseradish can be efficiently recombinantly produced by microorganisms. Therefore, the present invention is extremely useful for producing peroxidase used for analysis, clinical examination, immunochemistry, histochemistry, cytochemistry, food field, wastewater treatment, environmental purification and the like.

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Abstract

　本発明によれば、安定な品質のペルオキシダーゼを効率的に組換え生産することができる改変型ペルオキシダーゼ酵素遺伝子、及びそれを使用したペルオキシダーゼの生産方法が提供される。本発明は、（Ａ）配列番号１０で示される塩基配列；または（Ｂ）配列番号１０で示される塩基配列に対して９０％以上相同な塩基配列であって、ペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡを開示する。また、本発明は、かかるＤＮＡを含む組換え発現ベクター及び形質転換体、並びにかかる形質転換体を使用したペルオキシダーゼの生産方法も開示する。

Description

改善された発現特性を示す改変型ペルオキシダーゼ酵素遺伝子、及びそれを使用したペルオキシダーゼの生産方法
　本発明は、特定の宿主での発現のために遺伝子のコドンユーセージを最適化することにより改善された発現特性を示す改変型ペルオキシダーゼ酵素遺伝子に関する。また、本発明は、かかる酵素遺伝子を使用して、安定な品質のペルオキシダーゼを効率的に組換え生産する方法に関する。
　ペルオキシダーゼは、従来、分析、臨床検査、免疫化学、組織化学、細胞化学などの分野で広く用いられているが、近年、食品分野、廃水処理、環境浄化における有用性から、その需要はますます高まってきている。
　ペルオキシダーゼは広く植物界に存在しているが、特にワサビ大根（Ａｒｍｏｒａｃｉａ　ｒｕｓｔｉｃａｎａ）に多く含まれるため、主としてワサビ大根から抽出されてきた。しかしながら、ペルオキシダーゼを植物から抽出する場合、品種、栽培条件などの様々な要因によってペルオキシダーゼ含量やアイソザイム組成比に著しい変動があるため、安定した品質のペルオキシダーゼを得ることが極めて困難であった。さらに、栽培適地の制限と収穫期に依存して生産地及び生産時期が限定される問題もあった。
　このような問題を解決し、安定した品質のペルオキシダーゼを効率的に生産するため、遺伝子組換え技術によるペルオキシダーゼの生産が提案されている。例えば、非特許文献１では、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子のアイソザイムの一つであるＣ１ａのアミノ酸配列が明らかにされており、さらに特許文献１では、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、シーケンス解析をすることにより、そのＤＮＡ配列が明らかにされている。
　また、特許文献２では、ペルオキシダーゼ遺伝子にｐｅｌＢシグナルを付加し、さらに発現誘導を加えないことにより、微量の活性型ペルオキシダーゼを大腸菌で発現させることに成功している。しかし、ペルオキシダーゼ遺伝子を高発現させると封入体が形成され、不活性型となることが示されており、酵素タンパク質の品質の点で問題があった。特許文献２では、大腸菌の代わりにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｒｉｓを宿主として使用することも試みられている。この場合は、変異の導入によりある程度生産性は向上するが、ハイパーマンノース構造と呼ばれる過剰な糖鎖結合による分子量の増大及びそれに伴う活性阻害及び比活性の低下や、変異導入による酵素特性の変化が見られ、酵素タンパク質の品質の点でやはり問題があった。このように、従来の方法では、安定な品質のペルオキシダーゼを効率的に組換え生産することは不可能であった。
特開昭６３－２０７３８６号公報 特表２００３－５０３００５号公報
ＦＥＢＳ　ｌｅｔｔｅｒ　７２巻１９頁、１９７６
　本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、安定な品質のペルオキシダーゼを効率的に組換え生産することができる改変型ペルオキシダーゼ酵素遺伝子、及びそれを使用したペルオキシダーゼの生産方法を提供することにある。
　本発明者らは、まず、様々な酵素を分泌生産する能力を有する担子菌酵母（クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２）を宿主として使用することを想起し、この菌株に、特許文献１に記載されている西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼのアイソザイムＣ１ａ遺伝子をクローニングし、組換えペルオキシダーゼの発現を試みた。しかしながら、培養液上清にはペルオキシダーゼ活性は検出されず、野生型のペルオキシダーゼ酵素遺伝子を単にこの菌株に組換え導入しただけでは、ペルオキシダーゼを生産させることができないことがわかった。
　そこで本発明者らは、野生型遺伝子の改変についてさらに検討したところ、遺伝子のコドンユーセージをこの菌株に合わせて最適化することにより、ペルオキシダーゼが、封入体を形成せずに酵素活性を維持したまま培養液中に高レベルで分泌生産されることを見出した。また、分泌シグナルペプチド配列を最適化することにより、生産性がさらに飛躍的に向上されることを見出した。さらに、得られたペルオキシダーゼの酵素特性が西洋ワサビ由来野生型ペルオキシダーゼと同等であることを見出した。
　本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下の（１）～（９）から構成されるものである。
（１）以下の（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１０で示される塩基配列；
（Ｂ）配列番号１０で示される塩基配列に対して９０％以上相同な塩基配列であって、ペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列。
（２）以下の（Ｃ）～（Ｇ）からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡに続いて、（１）に記載のＤＮＡを結合させて得られることを特徴とする融合ＤＮＡ：
（Ｃ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列；
（Ｄ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
（Ｅ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列；
（Ｆ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列；
（Ｇ）配列番号１５で示されるアミノ酸配列。
（３）（１）または（２）に記載のＤＮＡを発現ベクターに挿入して得られることを特徴とする組換え発現ベクター。
（４）（３）に記載の組換え発現ベクターを微生物に導入して得られることを特徴とする形質転換体。
（５）組換え発現ベクターを導入した微生物が、担子菌門に分類される微生物であることを特徴とする（４）に記載の形質転換体。
（６）組換え発現ベクターを導入した微生物が、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に分類される微生物であることを特徴とする（５）に記載の形質転換体。
（７）組換え発現ベクターを導入した微生物が、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２）（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６１）であることを特徴とする（６）に記載の形質転換体。
（８）（４）～（７）のいずれかに記載の形質転換体を培養し、得られた培養物からペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質を採取する工程を含むことを特徴とするペルオキシダーゼの生産方法。
（９）（１）または（２）のＤＮＡが発現して得られるペルオキシダーゼ酵素タンパク質であって、糖鎖を含んで５２ｋＤａ～６５ｋＤａの分子量を有することを特徴とするタンパク質。
　本発明の改変型ペルオキシダーゼ酵素遺伝子は、担子菌酵母に代表される特定の宿主での発現のために遺伝子のコドンユーセージが最適化されているため、安定な品質のペルオキシダーゼを高レベルで生産することができる。また、本発明の改変型ペルオキシダーゼ酵素遺伝子に分泌シグナルペプチド配列を付加することにより、ペルオキシダーゼの生産効率をさらに飛躍的に増大させることができる。
図１は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２用の発現ベクターｐＣｓＵＸの模式図である。 図２は、各ペルオキシダーゼ遺伝子発現コントラクト導入形質転換体のペルオキシダーゼ生産性を示す。 図３は、組換えペルオキシダーゼの耐熱性試験の結果を示す。 図４は、組換えペルオキシダーゼのｐＨ安定性試験の結果を示す。 図５は、組換えペルオキシダーゼの分子量試験の結果を示す。 図６は、組換えペルオキシダーゼの糖鎖分解試験の結果を示す。
　本発明は、特定の宿主での発現のために遺伝子のコドンユーセージを最適化することにより、安定な品質のペルオキシダーゼを高レベルで生産することができる改変型ペルオキシダーゼ酵素遺伝子を提供するものである。即ち、本発明によれば、以下の（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡが提供される：
（Ａ）配列番号１０で示される塩基配列；
（Ｂ）配列番号１０で示される塩基配列に対して９０％以上相同な塩基配列であって、ペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列。
　（Ａ）の配列番号１０で示される塩基配列は、成熟型の西洋ワサビペルオキシダーゼのアイソザイムの一つであるＣ１ａの配列であり、そのコドンユーセージは、野生型と比較してクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２での発現に適するように最適化されている。この配列の発現に用いる宿主微生物は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２と類似のコドンユーセージを有する微生物である限り特に限定されないが、真核生物、好ましくは担子菌、さらに好ましくはクリプトコッカス属の微生物、最も好ましくはクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２であることができる。
　上記のように宿主に最適化された塩基配列からなるＤＮＡを用いることにより、レアコドンの除去や、ＧＣ含量の最適化、ＲＮＡ高次構造の改善がもたらされ、それにより、転写及び翻訳効率の増大、及びペルオキシダーゼ生産性の向上がもたらされる。
　また、（Ｂ）の配列番号１０で示される塩基配列に対して９０％以上相同な塩基配列であって、ペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列は、（Ａ）の塩基配列との均等の範囲の塩基配列である。これは、酵素タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果として酵素タンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等の酵素タンパク質であることが多いからである。（Ｂ）の塩基配列は、例えばＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；東洋紡製などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して配列番号１０に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、後述の実施例に記載の方法によって確認することができる。
　本発明の好ましい実施態様では、上記の（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡの上流に、以下の（Ｃ）～（Ｇ）からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを結合させた融合ＤＮＡが形成される。
（Ｃ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列；
（Ｄ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列：
（Ｅ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列；
（Ｆ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列；
（Ｇ）配列番号１５で示されるアミノ酸配列。
　一般的に、分泌タンパク質のＮ末端には、分泌シグナルペプチドが存在している。この既存の分泌シグナルペプチドを高効率な分泌シグナルペプチドと置換することで、これら分泌タンパク質の発現効率及び発現成功率を上げることができることが報告されている。従って、分泌シグナルペプチドの高効率化は重要な要素である。
　一方、本発明において用いられる微生物であるクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２は、各種難分解性酵素を分泌生産することが確認されており、生でんぷん分解性のα―アミラーゼや酸性キシラナーゼ、生分解性プラスチックを分解するクチナーゼなどの酵素を分泌生産する。
　しかしながら、これらの分泌タンパク質の有する分泌シグナルペプチドは、従来から分泌タンパク質に見出されており、最も高効率な分泌シグナルペプチドかどうかは不明であった。
　一方、分泌シグナルペプチドの配列を予測するコンピュータプログラムが提供されている。これらのコンピュータプログラムとしては、例えば、ＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）、ＰＳＯＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ／）等が挙げられる。これらのコンピュータプログラムを用いることで、アミノ酸配列情報から分泌タンパク質に含まれる分泌シグナルペプチドの配列の存在を予測することが可能である。
　しかしながら、これらコンピュータプログラムにより、各分泌シグナルペプチドの能力を推測することは現在のところ困難である。すなわち、予測された分泌シグナルペプチドが、実際に、分泌タンパク質等のタンパク質の発現に利用可能であるか否か、さらにこれらタンパク質の大量生産に利用できる、より高効率なものであるか否かは予測することができない。さらに、予測される分泌シグナルペプチドの種類によっては、切断部位が数箇所に及ぶ場合もあり、分泌シグナル配列の最適な長さに関しても、予測することは困難である。
　（Ｃ）～（Ｅ）の配列番号１１～１３で示されるアミノ酸配列は、いずれもクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２が生産する酸性キシラナーゼに由来する分泌シグナルペプチド配列であり、配列番号１１は分泌シグナルペプチド配列を開始コドンから３７番目のアミノ酸までとした配列（Ｘｓ１）であり、配列番号１２は分泌シグナルペプチド配列を開始コドンから２３番目のアミノ酸までとした配列（Ｘｓ２）であり、配列番号１３は分泌シグナルペプチド配列を開始コドンから１７アミノ酸までとした配列（Ｘｓ３）である。
　（Ｆ）の配列番号１４で示されるアミノ酸配列は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２が生産するα―アミラーゼに由来する分泌シグナルペプチド配列（Ａｓ）である。
　（Ｇ）の配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２が生産するクチナーゼに由来する分泌シグナルペプチド配列（Ｃｓ）である。
　これらの分泌シグナルペプチド配列は、極めて高効率であり、これらを用いることにより、ペルオキシダーゼの生産効率を飛躍的に増大させることができる。
　本発明の上記ＤＮＡのコドンユーセージまたはシグナルペプチド配列部分の改変は、クリプトコッカス　ｓｐ．Ｓ－２による発現に適するように最適化されたものであるが、他のクリプトコッカス属の微生物（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｌａｖｕｓ，　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｌａｖｕｓ，　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｕｒｖａｔｕｓなど）、さらには他の属の担子菌（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ，　Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｆｌｏｒｉｆｏｒｍｅ，　Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．　，Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ　ｆｕｒｆｕｒ，　Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ　ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ，　Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ　ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ，　Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ　ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ，　Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ，　Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｐａｌｕｄｉｇｅｎｕｍ，　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｓｐ．，　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｒａｍｉｎｉｓ，　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｌｕｔｉｎｉｓ，　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ，　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ａｒａｕｃａｒｉａｅ，　Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ，　Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｃｕｔａｎｅｕｍ，　Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ａｓａｈｉｉ，　Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｍｕｃｏｉｄｅｓなど）、さらには他の真核生物（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｍｉｎｉｓ，　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｓｐ．，　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ，　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｓａｐｉｄｕｓ，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｓｐ．　Ｃ３０，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｓｐ．　４２０，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｓｐ．　ＡＨ２８－２，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｖｉｌｌｏｓａ，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｓｐ．　Ｉ－６２，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｈｉｒｓｕｔｅ，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｏｃｈｒａｃｅａなど）にも適用することができる。
　微生物のコドンユーセージを集計した情報は、Ｃｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）から提供されている。これらの情報を用いることで、宿主微生物のコドンユーセージを予測することが可能である。
　本発明の上記ＤＮＡのコドンユーセージは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２の発現に最適化されたものであるが、そのＤＮＡ配列のコドンの３文字目のアミノ酸配列がＧもしくはＣである比率は９２％である。これに比べて、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２で発現が確認されている、αアミラーゼ、クチナーゼ、キシラナーゼのＤＮＡ配列のコドンの３文字目のアミノ酸配列がＧもしくはＣである比率はそれぞれ、８１．５％、８１．３％、８０．０％であり、コドンの３文字目のアミノ酸配列がＧもしくはＣである比率は非常に高い傾向がある。
　これらのことから、本発明の上記ＤＮＡはクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２と類似のコドンユーセージを有する他のクリプトコッカス属の微生物（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｌａｖｕｓ，　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｌａｖｕｓ，　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｕｒｖａｔｕｓなど）、さらには他の属の担子菌（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ，　Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｆｌｏｒｉｆｏｒｍｅ，　Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．　，Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ　ｆｕｒｆｕｒ，　Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ　ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ，　Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ　ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ，　Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ　ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ，　Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ，　Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｐａｌｕｄｉｇｅｎｕｍ，　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｓｐ．，　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｒａｍｉｎｉｓ，　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｌｕｔｉｎｉｓ，　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ，　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ａｒａｕｃａｒｉａｅ，　Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ，　Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｃｕｔａｎｅｕｍ，　Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ａｓａｈｉｉ，　Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｍｕｃｏｉｄｅｓなど）、さらには他の真核生物（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｍｉｎｉｓ，　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｓｐ．，　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ，　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｓａｐｉｄｕｓ，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｓｐ．　Ｃ３０，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｓｐ．　４２０，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｓｐ．　ＡＨ２８－２，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｖｉｌｌｏｓａ，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｓｐ．　Ｉ－６２，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｈｉｒｓｕｔｅ，　Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｏｃｈｒａｃｅａなど）においても適用することができると予測される。
　本発明によれば、上記のＤＮＡを発現ベクターに挿入して得られることを特徴とする組換え発現ベクター、及びこの組換え発現ベクターを微生物に導入して得られることを特徴とする形質転換体も提供される。
　上記のＤＮＡを挿入する発現ベクターとしては、特に限定するものではないが、従来公知のベクター、例えば大腸菌のベクターが挙げられる。大腸菌のベクターとしては、具体的にはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＧＥＭ－Ｔ、ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ、ｐＴＡ２、ｐＥＴなどが挙げられる。好ましくは、ベクターＤＮＡは、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、発現プロモーターＤＮＡ配列、発現ターミネーターＤＮＡ配列を含み、より好ましくは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２由来のｏｒｏｔａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子、キシラナーゼプロモーター、キシラナーゼターミネーターを含む。
　上記のＤＮＡを組み込む宿主微生物としては、特に限定するものではないが、担子菌門に分類される微生物を挙げることができる。例えば、Ｂａｎｎｏａ属，　Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ属，　Ｂｕｌｌｅｒａ属，　Ｂｕｌｌｅｒｏｍｕｃｅｓ属，　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属，　Ｃｕｒｖｉｂａｓｉｄｉｕｍ属，　Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，　Ｄｉｏｓｚｅｇｉａ属，　Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，　Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ属，　Ｆｉｂｕｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，　Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，　Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ属，　Ｇｕｅｈｏｍｙｃｅｓ属，　Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ属，　Ｋｏｎｄｏａ属，　Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ属，　Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属，　Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属，　Ｍａｓｔｉｇｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，　Ｍｒａｋｉａ属，　Ｏｃｃｕｌｔｉｆｕｒ属，　Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ属，　Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属，　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属，　Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ属，　Ｓｉｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ属，　Ｓｐｏｒｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属，　Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属，　Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ属，　Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属，　Ｓｙｍｐｏｄｉｍｙｃｏｐｓｉｓ属，　Ｔａｕｓｏｎｉａ属，　Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ属，　Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ属，　Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属，　Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ属，　Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ属，　Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｕｃｅｓ属などに属するものが適しており、さらに好ましくはクリプトコッカス属の微生物が適する。最も適するのはクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２）（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６１：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに１９９５年９月５日にＦＥＲＭ　Ｐ－１５１５５として国内寄託し、２００８年４月２５日に国際寄託に移管済）である。
　本発明に用いる発現ベクターと宿主微生物の組み合わせとしては、特に限定するものではないが、遺伝子を組み込む宿主由来の栄養要求性マーカー遺伝子または薬剤耐性マーカー遺伝子と、遺伝子を組み込む宿主由来の発現プロモーターＤＮＡ配列と、遺伝子を組み込む宿主由来のターミネーターＤＮＡ配列とを含む発現ベクターと、栄養要求性変異宿主または薬剤感受性宿主との組み合わせが挙げられ、最も好ましくは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２由来のｏｒｏｔａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子と、キシラナーゼプロモーターＤＮＡ配列と、キシラナーゼターミネーターＤＮＡ配列とを含む発現ベクターと、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２との組み合わせが挙げられる。
　上記のように宿主に最適化された塩基配列からなるＤＮＡを、宿主微生物由来の高発現ベクターに導入し、宿主微生物に形質転換することにより、転写及び翻訳効率の増大が期待され、ペルオキシダーゼ生産性の向上が期待される。
　宿主微生物の細胞に組換え発現ベクターを移入する方法としては、特に限定するものではないが、エレクトロポレーションなどの方法が挙げられる。
　本発明によれば、上記の形質転換体を培養し、得られた培養物よりペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質を採取する工程を含むことを特徴とするペルオキシダーゼの生産方法も提供される。
　形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。なお、培養に先立って、高ペルオキシダーゼ生産細胞株を予め選抜しておくことが有利である。
　培養に用いる窒素源は、特定のアミノ酸成分に欠失があるなど特殊なＮ源を除いて、宿主微生物が利用可能な窒素化合物であればどんなものでも良い。これらは主として有機窒素源であり、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。特に、酵母エキスや大豆蛋白質が好ましいが、これに限定されるものではなく、カゼインポリペプトン、発酵麹エキス、麦芽抽出物などを用いることによっても、形質転換体を培養することができる。
　その他の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、キシロース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
　培養温度は、菌が発育してペルオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更しうるが、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２の場合、通常は２０～２５℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なるが、ペルオキシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は６０～１２０時間程度である。培地ｐＨは、菌が発育しペルオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更しうるが、通常はｐＨ３．０～９．０程度である。
　本発明のペルオキシダーゼは、上記形質転換体を培養して得られる菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には、常法に従って、予め、濾過、遠心分離などにより、ペルオキシダーゼ含有溶液と菌体とを分離した後に利用することもできる。
　あるいは、このようにして得られたペルオキシダーゼ含有溶液からペルオキシダーゼを精製して利用してもよい。精製方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿、加温処理や等電点処理、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等の処理を挙げることができる。
　本発明の方法により得られるペルオキシダーゼは、以下の（ｉ）～（ｉｖ）の性質を備えるものであり、従来のものより高品質のペルオキシダーゼである。
（ｉ）作用：メディエーター、過酸化水素存在下でペルオキシダーゼ酵素活性を示す。
（ｉｉ）分子量：糖鎖を含んで約５５ｋＤａ（５２ｋＤａ～６５ｋＤａ）である。
（ｉｉｉ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ４．５～１１．０である。
（ｉｖ）熱安定性：５５℃１０分間の熱処理後に９０％以上の残存活性を有する。
　上記のような酵素化学的特徴を有するペルオキシダーゼは、分析、臨床検査、免疫化学、組織化学、細胞化学等の用途に、更に食品分野、廃水処理、環境浄化等の用途に好適に使用することができる。
　さらに、植物からのペルオキシダーゼ抽出法において問題となる、ペルオキシダーゼ含量やアイソザイム組成比の著しい変動、及び生産地や生産時期の限定の問題を解決することができ、安定な品質のペルオキシダーゼを効率的に得ることが可能となる。
　上記の各種の酵素化学的性質は、酵素の諸性質を特定するための公知の手法、例えば、以下の実施例に記載の方法を用いて調べることができる。酵素の諸性質は、本発明のペルオキシダーゼを生産する形質転換体の培養液や、精製工程の途中段階において、ある程度調べることもでき、より詳細には、精製酵素を用いて調べることができる。
　精製酵素とは、当該酵素以外の成分、特に当該酵素以外のタンパク質（夾雑タンパク質）を実質的に含まない状態に分離された酵素を指す。具体的には、例えば、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満の酵素を指す。
　本発明において、ペルオキシダーゼの活性測定は以下の条件で行う。
［ペルオキシダーゼ活性測定法］
　試験管に１．５ｍｌの１ｍＭ　ＡＢＴＳ／１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）と１．５ｍｌの５．８ｍＭ　Ｈ２Ｏ２水溶液の混合溶液を調製し、２５℃で約５分間予備加温する。この反応液に（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）で適宜希釈したペルオキシダーゼ酵素溶液０．１ｍｌを添加し緩やかに混和後、水を対象に２５℃に制御された分光光度計で、４０５ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤｔｅｓｔ）を測定する。盲検はＰＯＤ溶液の代わりにペルオキシダーゼを溶解、希釈する溶液を試薬混液に加えて、同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤｂｌａｎｋ）を測定する。これらの値から以下の式に従ってペルオキシダーゼ活性を求める。ここで、ペルオキシダーゼ活性における１単位（Ｕ）は、ｐＨ４．５、２５℃条件下で１分間に１マイクロモルのＡＢＴＳを酸化する酵素量として定義している。
 
Ｕ／ｍｌ＝（ΔＯＤｔｅｓｔ－ΔＯＤｂｌａｎｋ）×希釈倍率×３．１／（３４．７×０．１×１．０）
 
　なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、３４．７は本活性測定条件におけるミリモル吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
１．ペルオキシダーゼ遺伝子の発現
　ペルオキシダーゼ遺伝子のコドンユーセージの最適化は、クリプトコッカスｓｐ－Ｓ－２．の既知の遺伝子であるαアミラーゼ遺伝子、クチナーゼ遺伝子、キシラナーゼ遺伝子のコドンユーセージを参考に行った。最適化された遺伝子配列を配列番号１に示す。
　次に、配列番号２のＨＲＰ（ｏｐｔ）Ｆ（ｓｐ）及び配列番号３のＨＲＰ（ｏｐｔ）Ｒ（－ｃｔｐｐ）をプライマーとして用いて、配列番号１のペルオキシダーゼ遺伝子全長から、液胞滞留シグナルペプチドと予測される部位を欠失した配列をＰＣＲにより増幅し、増幅された配列（ＨＲＰ（ｏｐｔ）―ＣＴＰ）をＭｌｕＩ処理した。なお、ここで増幅された配列は、配列番号１０の配列の５´側に、配列番号２１に示す分泌シグナル配列が付与されたものに相当する。
　一方、Ｘｙｌプロモーター、Ｘｙｌターミネーター、及びＵＲＡ５遺伝子を含むｐＣｓＵＸプラスミド（５．９ｋｂｐ）をＭｌｕＩ処理し、Ｘｙｌプロモーターの直ぐ下流を一箇所切断したのち、脱リン酸化処理した。処理後のプラスミドにＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰのペルオキシダーゼ遺伝子断片を連結し、組換えプラスミド（ｐＣｓＵＸＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）を構築した。
　さらに対照として、配列番号１８のＨＲＰ（ｗｔ）Ｆ（ｓｐ）及び配列番号１９のＨＲＰ（ｗｔ）Ｒ（－ｃｔｐｐ）をプライマーとして用いて、配列番号１７の西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼＣ１ａ遺伝子全長から、液胞滞留シグナルペプチドと予測される部位を欠失した配列をＰＣＲにより増幅し、増幅された配列（ＨＲＰ（ｗｔ）―ＣＴＰ）をｐＣｓＵＸプラスミドに導入し、組換えプラスミド（ｐＣｓＵＸＨＲＰ（ｗｔ）－ＣＴＰ）を構築した。
　なお、図１に示すｐＣｓＵＸプラスミドはクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２に由来する酸性キシラナーゼプロモーター（Ｘｙｌ－ｐｒｏ）、酸性キシラナーゼターミネーター（Ｘｙｌ－ｔｅｒ）、及びｏｒｏｔａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子（ＵＲＡ５）を市販のｐＵＣ１９ベクターに常法により連結して組換え体ＤＮＡを作製し、この組換え体ＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを常法に従い形質転換することで取得することができる。形質転換体はアンピシリン耐性により選択できる。
　次に、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いて、ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行い、分泌シグナル配列を置換した。具体的には、組換えプラスミドｐＣｓＵＸＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰにおいて、配列番号４のＨＲＰ（ｏｐｔ）Ｆ（－ｓｐ）及び配列番号５のＸｙｌａｎａｓｅ（ｓｓ）－Ｘｙｌ－ｐｒｏ－ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１１に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列１」に置換したもの（ｐＣｓＵＸＸｓＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）；組換えプラスミドｐＣｓＵＸＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰにおいて、配列番号４のＨＲＰ（ｏｐｔ）Ｆ（－ｓｐ）及び配列番号６のＸｙｌａｎａｓｅ２（ｓｓ）－Ｘｙｌ２－ｐｒｏ－ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１２に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列２」に置換したもの（ｐＣｓＵＸ２Ｘｓ２ＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）；組換えプラスミドｐＣｓＵＸＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰにおいて、配列番号４のＨＲＰ（ｏｐｔ）Ｆ（－ｓｐ）及び配列番号７のＸｙｌａｎａｓｅ２（ｓｓ）－Ｘｙｌ３－ｐｒｏ－ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１３に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列３」に置換したもの（ｐＣｓＵＸ２Ｘｓ３ＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）；組換えプラスミドｐＣｓＵＸＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰにおいて、配列番号４のＨＲＰ（ｏｐｔ）Ｆ（－ｓｐ）及び配列番号８のＡｍｙｌａｓｅ（ｓｓ）－Ｘｙｌ２－ｐｒｏ－ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１４に示す「Ａｍｙｌａｓｅ分泌シグナルペプチド配列」に置換したもの（ｐＣｓＵＸ２ＡｓＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）；及び組換えプラスミドｐＣｓＵＸＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰにおいて、配列番号４のＨＲＰ（ｏｐｔ）Ｆ（－ｓｐ）及び配列番号９のＣｕｔｉｎａｓｅ（ｓｓ）－Ｘｙｌ２－ｐｒｏ－ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１５に示す「Ｃｕｔｉｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列」に置換したもの（ｐＣｓＵＸ２ＣｓＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）を作製した。
　さらに、対照として、組換えプラスミドｐＣｓＵＸＨＲＰ（ｗｔ）－ＣＴＰにおいて、配列番号２０のＨＲＰ（ｗｔ）Ｆ（－ｓｐ）及び配列番号５のＸｙｌａｎａｓｅ（ｓｓ）－Ｘｙｌ－ｐｒｏ－ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１１に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列１」に置換したもの（ｐＣｓＵＸＸｓＨＲＰ（ｗｔ）－ＣＴＰ）；組換えプラスミドｐＣｓＵＸＨＲＰ（ｗｔ）－ＣＴＰにおいて、配列番号２０のＨＲＰ（ｗｔ）Ｆ（－ｓｐ）及び配列番号６のＸｙｌａｎａｓｅ２（ｓｓ）－Ｘｙｌ２－ｐｒｏ－ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１２に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列２」に置換したもの（ｐＣｓＵＸ２Ｘｓ２ＨＲＰ（ｗｔ）－ＣＴＰ）；及び組換えプラスミドｐＣｓＵＸＨＲＰ（ｗｔ）－ＣＴＰにおいて、配列番号２０のＨＲＰ（ｗｔ）Ｆ（－ｓｐ）及び配列番号７のＸｙｌａｎａｓｅ２（ｓｓ）－Ｘｙｌ３－ｐｒｏ－ｃｏｍｐをプライマーとして用いて、分泌シグナルペプチド配列を、配列番号１３に示す「Ｘｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列３」に置換したもの（ｐＣｓＵＸ２Ｘｓ３ＨＲＰ（ｗｔ）－ＣＴＰ）を作製した。
２．クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２への形質転換
　組換え宿主にはクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２．　Ｕ－５株を使用した。本菌株は、形質転換体の選択のために、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２を自然変異によりウラシル要求性にしたものであり、ｐＣｓＵＸ２プラスミドと共に独立行政法人酒類総合研究所において取得されたものである。なお、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２からのウラシル要求性株の取得は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２にＵＶを照射し、５－フルオロオロト酸を含む培地で培養し、生き残った株を選抜することにより容易に行うことができる。
　形質転換は、Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ．　１９９２　Ｍａｒ；６０（３）：１１０１－８．（Ｖａｒｍａら）に記載の方法で実施した。クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２．　Ｕ－５株を２０ｍｌＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）で２５℃、４８時間培養し、得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定したところ、２．９６Ａｂｓであった。次に、この培養液６．７５ｍｌを２００ｍｌ液体培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）に植菌し、２５℃、１８時間培養し得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定したところ、０．９４Ａｂｓであった。次に、この培養液を遠心分離して菌体を回収し、Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｕｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．６）で菌体を２回洗浄し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．６）に吸光度ＯＤ６６０＝５０Ａｂｓとなるように懸濁した。得られた懸濁液１００μｌに、予めＳｂｆＩによって制限酵素処理し、直鎖化したプラスミド１０μｇ（～５μｌ）を添加し、エレクトロポレーション用のキュベットに移した後、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｘｃｅｌｌ　（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を用いて通電した。通電条件は、Ｃ＝２５μＦ；　Ｖ＝０．４７ｋＶで行った。通電後の液中に６００μｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．６）を加え、選択プレート上に塗り広げた。選択プレートはＹＮＢ－ｕｒａ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　Ｗ／Ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ、０．０７８％　－ｕｒａ　ＤＯ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％グルコース、１％寒天粉末）を用いた。植菌したプレートを２５℃で１週間静置培養し、生育コロニーを選抜した。
　形質転換で得られた形質転換体については、配列番号３のＨＲＰ（ｏｐｔ）Ｒ（－ｃｔｐｐ）及び配列番号４のＨＲＰ（ｏｐｔ）Ｆ（－ｓｐ）、または配列番号１９のＨＲＰ（ｗｔ）Ｒ（－ｃｔｐｐ）及び配列番号２０のＨＲＰ（ｗｔ）Ｆ（－ｓｐ）をプライマーとして用いてＫＯＤ－Ｆｘ（東洋紡績社製）によるコロニーＰＣＲを行うことにより遺伝子の導入を確認し、遺伝子が導入された菌株に関して、３．で培養を行った。
３．ペルオキシダーゼ活性の確認
　取得した形質転換体を、３ｍｌ液体培地（０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．５％ペプトン、１．０％グルコース）で２５℃、２３０ｒｐｍ、４８時間培養し、前培養液とした。前培養液０．０３ｍｌを３ｍｌ液体培地（酵母エキス２％、キシロース５％）に植え継ぎ、２５℃、２３０ｒｐｍ、７２時間培養し、ペルオキシダーゼ活性を確認した。
　数個の菌株に関して培養液上清中のペルオキシダーゼ活性を測定した結果を、図２に示す。図２には、得られた数個の形質転換体のうち、最も生産性の高かった菌株のペルオキシダーゼ活性測定値を示している。
　図２に示すとおり、コドンユーセージを最適化した遺伝子を導入した菌株（図２のＵＸＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）では、約２１９０Ｕ／Ｌのペルオキシダーゼ活性が検出された。さらに、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列１に変更したもの（図２のＵＸＸｓＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）では、最大約２２５００Ｕ／Ｌのペルオキシダーゼ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列２に変更したもの（図２のＵＸ２Ｘｓ２ＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）では、最大約３９５００Ｕ／Ｌのペルオキシダーゼ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列３に変更したもの（図２のＵＸ２Ｘｓ３ＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）では、最大約５９７００Ｕ／Ｌのペルオキシダーゼ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２のＡｍｙｌａｓｅ分泌シグナルペプチド配列に変更したもの（図２のＵＸ２ＡｓＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）では、最大約１９１００Ｕ／Ｌのペルオキシダーゼ活性が検出され、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２のＣｕｔｉｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列に変更したもの（図２のＵＸ２ＣｓＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ）では、最大約２２０００Ｕ／Ｌのペルオキシダーゼ活性が検出された。
　これに対し、導入遺伝子のコドンユーセージを最適化せず、分泌シグナルペプチド配列の改変も行わなかった菌株（図２のＵＸＨＲＰ（ｗｔ）－ＣＴＰ）では、ペルオキシダーゼ活性が検出限界未満であり、分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列１に変更したもの（図２のＵＸＸｓＨＲＰ（ｗｔ）－ＣＴＰ）、及び分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列２に変更したもの（図２のＵＸ２Ｘｓ２ＨＲＰ（ｗｔ）－ＣＴＰ）、及び分泌シグナルペプチド配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２のＸｙｌａｎａｓｅ分泌シグナルペプチド配列３に変更したもの（図２のＵＸ２Ｘｓ３ＨＲＰ（ｗｔ）－ＣＴＰ）についても、ペルオキシダーゼ活性は検出限界以下であった。
４．担子菌酵母組換えペルオキシダーゼの取得
　ＵＸＸｓＨＲＰ（ｏｐｔ）－ＣＴＰ株形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、培地（５％酵母エキス、２％ポリペプトン、５％キシロース、０．１ｍＭヘミン）で２５℃、６８時間培養した。培養菌体をろ過した後、培養上清を採取し、以下の実験で粗酵素溶液として用いた。
５．酵素の精製
　上記の粗酵素溶液から、以下のステップ（１）～（４）により、組換えペルオキシダーゼを単離精製した。
（１）濃縮・脱塩
　粗酵素溶液を分画分子量１０００００の限界濾過膜を透過させ、さらに、分画分子量３００００の限界濾過膜で濃縮し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に置換して、粗酵素濃縮液を得た。
（２）ＳＰセファロース（ＧＥヘルスケア社製）による精製
　１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化させたＳＰ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦａｓｔＦｌｏｗカラムに粗酵素濃縮液を通液して、酵素を吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄したのち、同緩衝液から１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。
（３）Ｏｃｔｙｌ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）による精製
　活性画分を、６０％硫酸アンモニウム飽和（ｐＨ４．５）になるように調整後、遠心分離し、上清を得た。６０％飽和硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で予め平衡化させたＯｃｔｙｌ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦａｓｔＦｌｏｗカラムにこの上清を通液して、酵素を吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄したのち、同緩衝液から１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。
（４）濃縮・脱塩
　活性画分を分画分子量１００００の限界濾過膜で濃縮し、イオン交換水に置換した。粗酵素液から得られた精製酵素の比活性は、約３４５０Ｕ／ｍｇであり、酵素の精製倍率は、粗精製酵素の約４６０倍であった。
６．ペルオキシダーゼの特性評価
　上記５．で単離した精製酵素の特性を評価した。また、対照として、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼの精製酵素（東洋紡績社製ＰＥＯ３０２）についても同様に特性を評価した。
（１）熱安定性
　各精製酵素を、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で２０Ｕ／ｍｌ濃度に調製し、３７℃～６５℃の温度で１０分間処理し、残存活性を算出した。その結果、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼの精製酵素は６０℃まで９０％以上の活性を維持しているのに対して、担子菌組換えペルオキシダーゼ精製酵素は５５℃まで９０％以上の活性を維持していた。結果を図３に示す。
（２）ｐＨ安定性
　各精製酵素を、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５～５．５）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５～７．５）、１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０～９．０）、または１００ｍＭグリシン－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５～１１．０）、で１４０Ｕ／ｍｌ濃度に調製し、２５℃で２０分間処理し、残存活性を算出した。その結果、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼの精製酵素はｐＨ３．５～１１．０の範囲で９０％以上の活性を維持しているのに対して、担子菌組換えペルオキシダーゼ精製酵素はｐＨ４．５～１１．０の範囲で９０％以上の活性を維持していた。結果を図４に示す。
（３）分子量
　Ｎｕ－ＰＡＧＥ　４－１２％　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、各精製酵素の分子量を求めた。また、脱糖鎖酵素（Ｒｏｃｈｅ社製、ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ　Ｈ）を用いて本発明のペルオキシダーゼを脱糖鎖処理し、同様に電気泳動により、糖鎖除去後の分子量を求めた。結果を図５及び図６に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
　レーン１：分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｍａｒｋ１２）
　レーン２：クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２組換えペルオキシダーゼ精製酵素
　レーン３：西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼ精製酵素（東洋紡績社製）
　レーン４：クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２組換えペルオキシダーゼ精製酵素
　レーン５：脱糖鎖処理後のクリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２組換えペルオキシダーゼ精製酵素
　レーン６：分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｍａｒｋ１２）
　図５からわかるように、本発明のペルオキシダーゼの分子量は約５５ＫＤａ（５２ｋＤａ～６５ｋＤａ）であった。また、図６からわかるように、脱糖鎖酵素（Ｒｏｃｈｅ社製、ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ　Ｈ）を用いて糖鎖を除去した後の分子量は約３７ｋＤａであった。これらの結果から、本発明のペルオキシダーゼの糖鎖は約１８ｋＤａであることが予測され、タンパク質あたりの糖含量は３３％程度であると推定される。
　以上の結果から、本実施例により得られた担子菌組換えペルオキシダーゼは、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとほぼ同等の特性を有していることが判明した。
　本発明によれば、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼと同等の特性及び安定な品質を有するペルオキシダーゼを微生物により効率的に組換え生産することができる。従って、本発明は、分析、臨床検査、免疫化学、組織化学、細胞化学、食品分野、廃水処理、環境浄化などに用いられるペルオキシダーゼを生産するために極めて有用である。

Claims (9)

  1. 　以下の（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ：
    （Ａ）配列番号１０で示される塩基配列；
    （Ｂ）配列番号１０で示される塩基配列に対して９０％以上相同な塩基配列であって、ペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列。
  2. 　以下の（Ｃ）～（Ｇ）からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡに続いて、請求項１に記載のＤＮＡを結合させて得られることを特徴とする融合ＤＮＡ：
    （Ｃ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列；
    （Ｄ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
    （Ｅ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列；
    （Ｆ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列；
    （Ｇ）配列番号１５で示されるアミノ酸配列。
  3. 　請求項１または２に記載のＤＮＡを発現ベクターに挿入して得られることを特徴とする組換え発現ベクター。
  4. 　請求項３に記載の組換え発現ベクターを微生物に導入して得られることを特徴とする形質転換体。
  5. 　組換え発現ベクターを導入した微生物が、担子菌門に分類される微生物であることを特徴とする請求項４に記載の形質転換体。
  6. 　組換え発現ベクターを導入した微生物が、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に分類される微生物であることを特徴とする請求項５に記載の形質転換体。
  7. 　組換え発現ベクターを導入した微生物が、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ－２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ－２）（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６１）であることを特徴とする請求項６に記載の形質転換体。
  8. 　請求項４～７のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物からペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質を採取する工程を含むことを特徴とするペルオキシダーゼの生産方法。
  9. 　請求項１または２のＤＮＡが発現して得られるペルオキシダーゼ酵素タンパク質であって、糖鎖を含んで５２ｋＤａ～６５ｋＤａの分子量を有することを特徴とするタンパク質。
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