JP6952296B2 - エンハンサー - Google Patents
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Description
(a)配列番号1の塩基配列と少なくとも90%の同一性を有する領域、及び/又は、配列番号2の塩基配列と少なくとも90%以上の同一性を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA、或いは
(b)配列番号1の塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び/又は付加された塩基配列を有する領域、及び/又は配列番号2塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び/又は付加された塩基配列を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
からなるエンハンサー。
項2.
クリプトコッカス属由来のプロモーター用である、項1に記載のエンハンサー。
項3.
項1又は2に記載のエンハンサーが組み込まれた、プロモーター。
項4.
項1又は2に記載のエンハンサーが複数個組み込まれた、プロモーター。
項5.
クリプトコッカス属由来である、項3に記載のプロモーター。
項6.
項3〜5のいずれかに記載のプロモーターを含む発現ベクター。
項7.
項6に記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
項8.
クリプトコッカス属に属する、項7に記載の微生物。
項9.
項7又は8に記載の微生物を用いたタンパク質の製造方法。
一実施形態において、下記のエンハンサーが提供される:
(a)配列番号1の塩基配列と少なくとも90%の同一性を有する領域、及び/又は、配列番号2の塩基配列と少なくとも90%以上の同一性を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA、或いは
(b)配列番号1の塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び/又は付加された塩基配列を有する領域、及び/又は配列番号2塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び/又は付加された塩基配列を有する領域を有し、且つ、遺伝子の発現効率を高める機能を有するDNA
からなるエンハンサー。
エンハンサーは、プロモーターと組み合わせることによって、それが発現を制御する遺伝子の発現効率を向上させることができる。エンハンサーと組み合わせるプロモーターの種類及び組み合わせ方は、遺伝子の発現効率を向上させることができる限り、特に制限されない。例えば、プロモーターが存在する発現ベクター上の任意の場所にエンハンサーを導入することができる。一実施形態において、エンハンサーは、プロモーター内に導入されていることが好ましい。
一実施形態において、エンハンサーは発現ベクターにおいて、プロモーターと組み合わせられる。そのような発現ベクターとしては、所望の宿主細胞において、目的の遺伝子の発現効率を向上させることができる限り、特に限定されず、従来公知の発現ベクターから適宜選択することができる。一実施形態において、発現ベクターは、プラスミドベクターであることが好ましい。また、発現ベクターの由来は、後述する宿主内で機能する限り特に制限されないが、例えば大腸菌のベクターであることが好ましい。大腸菌のベクターとしては、具体的にはpBR322、pUC19、pGEM−T、pCR−Blunt、pTA2、pETなどが挙げられる。一実施形態において、発現ベクターは、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、発現プロモーターDNA配列、及び発現ターミネーターDNA配列を含む。好適な一実施形態において、発現ベクターは、クリプトコッカスsp.S−2由来のorotate phosphoribosyl transferase遺伝子、及びクリプトコッカスsp.S−2由来のターミネーターを含む。
上記発現ベクターを導入する宿主は、目的の遺伝子の発現効率を向上させることができる微生物であれば特に制限されない。例えば、担子菌門に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、Bannoa属,Bensingtonia属,Bullera属,Bulleromuces属,Cryptococcus属,Curvibasidium属,Cystofilobasidium属,Dioszegia属,Erythrobasidium属,Fellomyces属,Fibulobasidium属,Filobasidium属,Filobasidiella属,Guehomyces属,Kockovaella属,Kondoa属,Kurtzmanomyces属,Leucosporidium属,Malassezia属,Mastigobasidium属,Mrakia属,Occultifur属,Pseudozyma属,Rhodosporidium属,Rhodotorula属,Sakaguchia属,Sirobasidium属,Spororidiobolus属,Sporobolomyces属,Sterigmatomyces属,Sterigmatosporidium属,Sympodimycopsis属,Tausonia属,Tilletiopsis属,Trichosporiella属,Trichosporon属,Tsuchiyaea属,Udeniomyces属,Xanthophyllomuces属などに属する微生物を挙げることができる。一実施形態において好ましい宿主は、Cryptococcus属の微生物であり、例えば、Cryptococcus liquefaciens,Cryptococcus flavus,Cryptococcus laurentii,Cryptococcus curvatusなどが挙げられ、最も適するのはクリプトコッカス sp.S−2である。他の実施形態において好ましい宿主としては、Cystofilobasidium capitatum,Filobasidium floriforme,Kurtzmanomyces sp.,Malassezia furfur,Malassezia sympodialis,Pseudozyma tsukubaensis,Pseudozyma flocculosa,Rhodosporidium toruloides,Rhodosporidium paludigenum,Rhodotorula sp.,Rhodotorula graminis,Rhodotorula glutinis,Rhodotorula mucilaginosa,Rhodotorula araucariae,Sporobolomyces singularis,Trichosporon cutaneum,Trichosporon asahii,Trichosporon mucoidesなどの担子菌門に属する微生物を挙げることができる。他の実施形態においては、例えば、Gaeumannomyces graminis,Pleurotus sp.,Pleurotus eryngii,Pleurotus sapidus,Trametes pubescens,Trametes sp.C30,Trametes sp. 420,Trametes sp. AH28−2,Trametes villosa,Trametes sp.I−62,Trametes versicolor,Trametes hirsute,及びTrametes ochraceaなどの真核微生物を挙げることができる。
クリプトコッカス sp. S2株由来クチナーゼ様酵素(CLE)プロモーターのデリーション解析
非特許文献3記載のクリプトコッカスsp.S−2由来クチナーゼ様酵素(CLE)プロモーターの機能をデリーションにより解析した。pUC18プラスミドに非特許文献3記載のクリプトコッカスsp.S−2由来のorotate phosphoribosyl transferase遺伝子を含有するDNA配列、クチナーゼ様酵素プロモーターのDNA配列(配列番号3)、クチナーゼ様酵素に由来する分泌シグナルをコードするDNA配列(配列番号4)、特許文献3に配列番号1として記載される麹菌由来FAD‐GLDをコードするDNA配列、非特許文献3に記載のキシラナーゼターミネーターのDNA配列を図1に記載の構成で導入したプラスミドを作成した。以下、本プラスミドをpCsUC‐CsAoGLDと呼ぶ。なお、クリプトコッカス sp. S2株のクチナーゼ様酵素に由来する分泌シグナルは、公知のクリプトコッカス sp. S2株クチナーゼ様酵素のアミノ酸配列より、SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)を用いて予測した。
<試薬>
1.300mM D−グルコースを含む100mM リン酸緩衝液pH6.5(0.1% TritonX−100を含む)
2.1.6mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)溶液
上記D−グルコースを含むリン酸緩衝液20mL、DCPIP溶液10mL、を混合して反応試薬とする。
反応試薬3mLを37℃で5分間予備加温する。GDH溶液0.1mLを添加しゆるやかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で、600nmの吸光度変化を5分記録する。反応時間をX軸、吸光度をY軸として測定結果をプロットし、直線部分から(即ち、反応速度が一定になってから)1分間あたりの吸光度変化(ΔODTEST)を測定する。盲検はGDH溶液の代わりにGDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODBLANK)を測定する。これらの値から次の式に従ってGDH活性を求める。ここでGDH活性における1単位(U)とは、濃度1MのD−グルコース存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量である。
{−(ΔODTEST−ΔODBLANK)×3.1×希釈倍率}/{0.85×0.1×1.0}
プロモーター機能に強く寄与する領域の絞り込み
転写開始点より上流300〜500bpの領域から、プロモーター機能に強く寄与する領域の絞り込みを行った。
該文献に報告のある、Fusarium solani由来のクチナーゼプロモーターのモチーフ配列であるGCGAGCCGAGGCTCGAを配列番号3記載のクリプトコッカスsp.S−2由来クチナーゼ様酵素プロモーターに対しBLAST検索したところ、完全に一致するものは見つからなかったものの、10〜15bp程度の長さで類似性が期待できる領域が、転写開始点より上流971〜981bpの領域、404〜413bpの領域、368〜380bpの領域、160〜174bpの領域の4か所見つかった。
比較例として、実施例1で取得したpCsUC‐CsAoGLDを実施例2と同条件で同時に培養したものを用意し、上清中のGDH活性を測定した。結果を図4に示す。
エンハンサー配列を連結導入したベクターの構築
配列番号1及び2は25bpの領域を含んで隣接し、配列番号3記載のプロモーター内に含まれる。さらに、配列番号3において配列番号1記載の配列の上流近傍に制限酵素SpeIの認識サイトがあることに着目し、配列番号1及び2を含むDNA断片のプロモーター内への追加導入を行った。
その後、反応液を用いてCompetent high DH5α(東洋紡社)を形質転換した。取得した形質転換体よりプラスミドを抽出し、ABI3730(Applied Byosystem社)を用いて配列の確認を行い、エンハンサー配列が追加で導入されたプラスミドを取得した。以下、本プラスミドをpCsUC(+EHC1)‐CsAoFAD−GLDと呼ぶ。
エンハンサー配列導入効果の確認
構築したpCsUC(+EHC4)‐CsAoGLD、pCsUC(+EHC9)‐CsAoGLDを用いてクリプトコッカスsp.DA25株を形質転換し形質転換体を取得した。形質転換は、実施例1記載の方法で実施した。得られた形質転換体については、実施例1記載の方法で遺伝子の導入を確認した。
比較例として、実施例1で取得したpCsUC‐CsAoGLDによる形質転換体を実施例4と同条件で同時に培養したものを用意し、上清中のGDH活性を比較した。結果を図6に示す。
Claims (8)
- 3個以上30個以下のエンハンサーが組み込まれたプロモーターを有する発現ベクターであり、
前記プロモーターは、クリプトコッカスsp.S2株由来のクチナーゼ様酵素(CLE)プロモーターであり、
前記エンハンサーは、配列番号3の塩基配列を有するDNAを鋳型とし、配列番号26の塩基配列を有するプライマー及び配列番号27の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRで増幅される領域の塩基配列を有するDNAである、
発現ベクター。 - 前記3個以上30個以下が、4個以上30個以下である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 3個以上30個以下のエンハンサーが連続して存在する、請求項1又は2に記載の発現ベクター。
- プラスミドベクターである、請求項1〜3のいずれかに記載の発現ベクター。
- クチナーゼ様酵素(CLE)、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、及びグルコースデヒドロゲナーゼから成る群より選択される一種以上をコードする遺伝子の発現が前記プロモーターによって制御されている、請求項1〜4のいずれかに記載の発現ベクター。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
- クリプトコッカス属に属する、請求項6に記載の微生物。
- 請求項6又は7に記載の微生物を用いたタンパク質の製造方法。
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