JP2003289867A - 酢酸菌のアコニターゼ遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 酢酸耐性に関与する新規なアコニターゼ遺伝
子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物並びに
該微生物を用いて高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する
方法を提供すること。 【解決手段】 アセトバクター由来の特定のアミノ酸配
列を有し、アコニターゼ活性を有するタンパク質、これ
らタンパク質をコードするＤＮＡ、これらＤＮＡを含む
微生物及びこれら微生物を用いた高酢酸濃度の食酢の製
造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物に由来する
アコニターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子、該遺伝子を含む微生物、特にアセトバクター属（Ac
etobacter）及びグルコンアセトバクター属（Gluconace
tobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用い
て高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造する方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】酢酸菌は食酢製造に広く利用されている
微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセ
トバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用
されている。酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸
菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸
が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっ
ても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢
酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力
は次第に低下する。

【０００３】そのため、酢酸発酵においては、より高い
酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、す
なわち酢酸耐性の強い酢酸菌を開発することが求められ
ており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子
（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺
伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられて
いる。

【０００４】これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関す
る知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性
を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させ
ることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成す
る３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がク
ローニングされていた（ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー（J. Bacteriol.），１７２巻，２０９６頁，１
９９０年）。この内、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵
素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢
酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推
定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であ
った（ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アン
ド・バイオエンジニアリング（J. Ferment. Bioen
g.），７６巻，２７０頁，１９９３年）。

【０００５】これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝
子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、ア
セトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩ
ＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO
3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐
性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵
での能力の向上の有無については不明であった（特開平
３−２１９８７８号公報）。

【０００６】一方、酢酸菌からクローニングされた膜結
合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺
伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵におい
て最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が特開平２−
２３６４号公報に開示されている。しかし、ＡＬＤＨは
アルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐
性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコ
ードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定で
きないものであった。

【０００７】このような実情から、酢酸耐性を実用レベ
ルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする
新規な酢酸耐性能を有するタンパク質の遺伝子を取得
し、また取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、より強い酢
酸耐性を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。

【０００８】

【発明が解決するための課題】本発明は、酢酸菌に属す
る微生物由来の酢酸耐性に関与する新規なアコニターゼ
遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物の
酢酸耐性を向上させる方法、特に酢酸菌に属する微生物
の酢酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が向上し
た酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製
造する方法を提供することを目的とするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、酢酸存在
下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の
微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する遺伝
子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子を用いれ
ば、従来以上に微生物の酢酸耐性を向上させることがで
き、さらには高濃度の酢酸を含有する食酢の効率的な製
造法を開発することが可能になると考えた。

【００１０】従来の酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸
菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニン
グする方法などが一般的であった。しかし、このような
方法では産業上有用な酢酸耐性遺伝子を見出すことは困
難であると考え、鋭意検討した結果、本発明者らは、酢
酸菌から酢酸耐性遺伝子を見出す方法として、酢酸の存
在下で特異的に発現しているタンパク質を検索し、その
タンパク質をコードする遺伝子を取得するといった、従
来全く行われていなかった方法を開発した。

【００１１】この方法によって、実際に食酢製造に用い
られているアセトバクター属とグルコンアセトバクター
属に属する酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで向上さ
せる機能を有する新規な酢酸耐性能を有するタンパク質
の遺伝子をクローニングすることに成功した。

【００１２】得られたこの遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢ
Ｌ／Ｇｅｎｂａｎｋの検索の結果、大腸菌などで見出さ
れている、アコニターゼaconitase（アコニット酸ヒド
ラターゼaconitate hydratase）と称される一群のタン
パク質のアミノ酸配列と相同性を示す部分があるところ
から、酢酸菌のアコニターゼ（アコニット酸ヒドラター
ゼ）をコードする遺伝子（アコニターゼ遺伝子）である
と推定された。

【００１３】しかし、取得された酢酸菌のアコニターゼ
遺伝子は、大腸菌などの他の微生物で見出されている既
知のアコニターゼ遺伝子とは相同性がきわめて低くかっ
たことから、他のアコニターゼ遺伝子と似ているものの
該アコニターゼ遺伝子は酢酸菌に特異的な新規タンパク
質をコードする新規遺伝子であることが判った。一方、
今回取得したアセトバクター属に属する酢酸菌とグルコ
ンアセトバクター属に属する酢酸菌のアコニターゼ遺伝
子について相同性を比較したところ、両者の相同性は約
７０％であり、酢酸菌間での相同性は高かった。

【００１４】また、該遺伝子をプラスミドベクターに連
結して酢酸菌に形質転換し、コピー数を増幅させた形質
転換株においては、アコニット酸ヒドラターゼ活性が約
２倍増大し、該遺伝子が酢酸菌のアコニターゼ活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子であることが確認さ
れると同時に、顕著に酢酸耐性が向上することが確認さ
れた。さらに、エタノール存在下で該形質転換株を通気
培養した場合には、増殖速度が向上する上に、生酸速度
が向上し、さらに最終到達酢酸濃度が顕著に向上するこ
となども見出し、本発明を完成するに至った。

【００１５】すなわち本発明は、以下の（１）〜（９）
からなるものである。 （１） 以下の(a)又は(b)のタンパク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活
性を有するタンパク質。 （２） 以下の(a)又は(b)のタンパク質。 (a) 配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活
性を有するタンパク質。 （３） 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活
性を有するタンパク質。 （４） 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。 (a)配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活
性を有するタンパク質。 （５） 以下の(a)又は(b)の塩基配列からなるＤＮＡ。 (a)配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５
４〜３０６５からなるＤＮＡ。 (b)配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５
４〜３０６５からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該Ｄ
ＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アコニ
ターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （６） 以下の(a)又は(b)の塩基配列からなるＤＮＡ。
Ｌ (a)配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８
９〜３１７９からなるＤＮＡ。 (b)配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８
９〜３１７９からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該Ｄ
ＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アコニ
ターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （７） （３），（４），（５）又は（６）に記載のＤ
ＮＡを細胞内に含むアコニターゼ活性を有する微生物又
は前記アコニターゼ活性を有しかつ酢酸耐性が増強され
た微生物。 （８） 微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセ
トバクター属に属する酢酸菌であることを特徴とする
（７）に記載の微生物。 （９） （７）又は（８）に記載の微生物をアルコール
を含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せ
しめることを特徴とする食酢の製造方法。

【００１６】本発明によれば、微生物に対して、酢酸に
対する耐性を付与し、増強することができる。そして、
アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌において
は、酢酸に対する耐性が顕著に向上し、培地中に高濃度
の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができ
る。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）本発明のＤＮＡ 本発明のＤＮＡは、アコニターゼ（アコニット酸ヒドラ
ターゼ）活性を有し、且つ酢酸耐性を向上させる機能を
有する配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質をコードする塩基配列を包含し、該塩基配列の
調整要素、及び該遺伝子の構造部分を含むものである。
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列表配列番号１
の塩基番号３５４〜３０６５又は配列表配列番号３の４
８９〜３１７９からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げ
られる。

【００１８】配列番号1又は３に示す塩基配列は、ＤＤ
ＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲ
ＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、アミ
ノ酸配列レベルで大腸菌（Escherichia coli）のＡｃｎ
Ａ遺伝子と５５．１％、レジオネラ・ニューモフィラ
（Legionella pneumophila）のＡｃｎ遺伝子とも５６．
１％の相同性を示すことが分かったが、いずれも５０％
台の低い相同性であり、これらのタンパク質をコードす
る遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であっ
た。なお、上記のＡｃｎＡ遺伝子やＡｃｎ遺伝子などの
アコニターゼ遺伝子が酢酸耐性と関係していることは全
く知られていない。

【００１９】本発明のＤＮＡはその塩基配列が明らかと
なったので、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌク
レオチドをプライマー１（配列番号５）及びプライマー
２（配列番号６）を用い、酢酸菌、例えばアセトバクタ
ー・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.102
3;FERM BP-2287)のゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ・
チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）（トレンズ・オ
ブ・ジェネティックス（Trends Genet. ）５巻，１８５
頁，１９８９年）によって、または該塩基配列に基づい
て合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、
ゲノムＤＮＡライブラリーを用いるハイブリダイゼーシ
ョンによっても得ることができる。オリゴヌクレオチド
の合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機
を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応
は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosyste
ms）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ２４００な
どを用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）や
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用して、定法
に従って行なうことができる。

【００２０】本発明のアコニターゼ活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の
アコニターゼ活性が損なわれない限り、１又は複数の位
置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された
タンパク質をコードするものであっても良い。

【００２１】このようなアコニターゼ活性を有するタン
パク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ
は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のア
ミノ酸が欠失、置換又は付加されるように塩基配列を改
変することによっても取得され得る。また、上記のよう
な改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理
によっても取得することができる。

【００２２】また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列
およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異
体、変種間でわずかに異なることが知られているので、
実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸
菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバク
ター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能であ
る。

【００２３】具体的には、アセトバクター属やグルコン
アセトバクター属に属するの酢酸菌、又は変異処理した
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する
酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば
配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基配列番号３５
４〜３０６５からなる塩基配列を有するＤＮＡと相補的
な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、かつアコニターゼ（アコニット酸
ヒドラターゼ）活性を有し、酢酸耐性を増強する機能を
有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することに
よっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質を
コードするＤＮＡが得られる。

【００２４】ここでいうストリンジェントな条件とは、
いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的な
ハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明
確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相
同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有す
るＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低
い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常
のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳ
Ｃで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が
行われる条件などが挙げられる。

【００２５】（２）本発明の酢酸菌 本発明の酢酸菌はアセトバクター属及びグルコンアセト
バクター属の細菌をさし、酢酸耐性が増強されたアセト
バクター属細菌及びグルコンアセトバクター属、または
酢酸耐性が低下したアセトバクター属細菌及びグルコン
アセトバクター属である。

【００２６】アセトバクター属細菌として具体的には、
アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げ
られ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetob
acteraceti No.1023）株（特許生物寄託センターにＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）が例示される。

【００２７】また、グルコンアセトバクター属細菌とし
ては、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconac
etobacter entanii）が挙げられ、アセトバクター属よ
りグルコンアセトバクター属へ変更になった、アセトバ
クター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter
altoacetigenes MH-24）株（特許生物寄託センターにＦ
ＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託）が例示される。酢酸
耐性の増強は、例えばアコニターゼ遺伝子の細胞内のコ
ピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を
含むＤＮＡ断片をアセトバクター属細菌中で効率よく機
能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮ
Ａを用いて、アセトバクター属細菌を形質転換すること
によって増強することができる。

【００２８】また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモ
ーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバク
ター属の細菌中で効率よく機能する他のプロモーター配
列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社
製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２
８９（宝酒造社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラス
ミドｐＨＳＧ３９６（宝酒造社製）のクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各
遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来の
プロモーター配列に置き換えることによっても、酢酸耐
性を増強することができる。

【００２９】該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺
伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター
属細菌の細胞に導入することによって行なうことができ
る。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トラン
スポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクタ
ー属の細菌の細胞に導入することによって行なうことが
できる。

【００３０】マルチコピーベクターとしては、ｐＭＶ２
４（アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイ
クロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５
巻，１７１頁，１９８９年）やｐＴＡ５００１(a)、ｐ
ＴＡ５００１(b)（特開昭６０−９４８８号公報）など
が挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ
１（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Agric. Biol. Chem.）５２巻，３１２５
頁，１９８８年）も挙げられる。また、トランスポゾン
としては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。

【００３１】アセトバクター属やグルコンアセトバクタ
ー属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法
（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Agric. Biol. Chem.）４９巻，p.２０９１，
１９８５年）やエレクトロポレーション法（バイオサイ
エンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミス
トリー（Biosci. Biotech. Biochem.）、５８巻、９７
４頁、１９９４年）等によって行なうことができる。ア
ルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンア
セトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてそ
の酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増
大させることができる。

【００３２】（３）食酢製造法 上記のようにして、アコニターゼ遺伝子のコピー数が増
幅されたことにより酢酸耐性が選択的に増強されたアセ
トバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌であっ
て、アルコール酸化能を有するものをアルコール含有培
地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることに
より、食酢を効率よく製造することができる。

【００３３】本発明の製造法における酢酸発酵は、従来
の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行な
えば良い。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、
窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使
用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するもので
あれば、合成培地でも天然培地でも良い。炭素源として
は、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭
水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペ
プトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いること
ができる。

【００３４】また、培養は、静置培養法、振盪培養法、
通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は
通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範
囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、
各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通
常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸
が蓄積する。以下に、本発明を実施例により具体的に説
明する。

【００３５】

【実施例】（実施例１）アセトバクター・アセチのアコ
ニターゼ遺伝子のクローニングと該遺伝子の塩基配列及
びアミノ酸配列の決定 （１）アコニターゼ遺伝子のクローニング アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter
aceti No.1023）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）を１
％の酢酸を含むＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％
酵母エキス、０．２％ポリペプトン）を用いて、３０℃
で２４時間振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離
（７，５００×ｇ、１０分）して菌体を得た。また、酢
酸を含まないＹＰＧ培地でも、同様にして培養して、菌
体を得た。得られたこれらの菌体を、それぞれソニケー
ションにより破砕し、その菌体破砕液を遠心分離（１
２，０００×g、１０分間）して得られた上澄み液を、
さらに超遠心分離（４００，０００×ｇ、１時間）を行
なうことによって上澄み液（可溶性蛋白質）を得た。

【００３６】この上澄み液を２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動
緩衝液（０．１２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．
８）、１０％２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、４
％ＳＤＳ、１０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．００４％Ｂｒｏ
ｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ）に１：１の比率で混合し、
沸騰水浴中で３分間加熱処理した。このサンプルをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ電気泳動した後、ＣＢＢ染色し、１％の酢
酸を含むＹＰＧ培地で生育したものと、酢酸を含まない
ＹＰＧ培地で生育したものとを比較しところ、分子量約
９０ｋＤａのバンドが１％酢酸を含む培地で生育したも
ので発現が増幅しているのが確認された。

【００３７】このように発現が増幅していたバンドをＰ
ＶＤＦ膜に転写し、アミノ末端のアミノ酸配列をプロテ
インシークエンサーにて決定した。決定したアミノ酸配
列はＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ
−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇであった。

【００３８】上記のアミノ酸配列を基にしてオリゴヌク
レオチドを合成し、これをアセトバクター・アセチＮ
ｏ．１０２３株から定法により染色体ＤＮＡを抽出し制
限酵素ＳｐｈＩ（宝酒造社製）で完全分解したものに対
して、サザンハイブリダイゼーションを行なった。

【００３９】その結果、約４．６ｋｂｐの位置にポジテ
ィブなバンドを確認した。このバンドをアガロースゲル
より抽出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１９の制限酵素Ｓｐ
ｈＩ切断部位にライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株
に形質転換し、１００μg／ｍｌのアンピシリンを含む
ＬＢ寒天培地で選択した。出現したコロニーをサザンハ
イブリダイゼーションで用いたものと同じオリゴヌクレ
オチドをプローブとし、コロニーハイブリダイゼーショ
ンを行ない、ポジティブな形質転換体を単離した。その
後、プラスミドＤＮＡをこれらのポジティブな形質転換
体より分離し、挿入断片の構造を制限酵素マッピングに
より解析し、その結果、図1に示した約３．６ｋｂｐの
ＳｐｈＩ−ＸｂａＩ断片を確認した。

【００４０】（２）クローン化された遺伝子断片の塩基
配列の決定 上記挿入断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・
チェーン・ターミネーション法によって決定した。塩基
配列の決定は、両方のＤＮＡ鎖の全領域について行な
い、切断点は全てオーバーラップする様にして行なっ
た。その内、決定した３０７３塩基の塩基配列を、配列
番号1に示した。

【００４１】配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番
号３５４から塩基番号３０６５にかけて、配列番号２に
記載したような９０４個のアミノ酸をコードするオープ
ンリーディング・フレームの存在が確認された。配列番
号２に記載されたタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列
はＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇであり、先に決定した該タンパク質のＮ末端側のア
ミノ酸配列と完全に一致することが確認された。

【００４２】（実施例２）グルコンアセトバクター・エ
ンタニイからのアコニターゼ遺伝子のクローニングと塩
基配列及びアミノ酸配列の決定 （１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製 グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobac
ter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトア
セトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes M
H-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を６％酢酸、４％
エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、
０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃
にて振盪培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離
（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた
菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方
法により、染色体ＤＮＡを調製した。

【００４３】上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを
制限酵素ＳｐｈＩで切断し、その後ｋｌｅｎｏｗ ｆｒ
ａｇｍｅｎｔ（宝酒造社製）処理を行なった。また、大
腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＭＶ２４を、制限酵素
ＳｍａＩで切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合
し、ライゲーションキット（TaKaRa DNA Ligation KitV
er.2，宝酒造社製）を用いて連結してグルコンアセトバ
クター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築
した。

【００４４】（２）アコニターゼ遺伝子のクローニング 上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エ
ンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は酢酸濃
度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセ
チＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイ
オサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケ
ミストリー(Biosci. Biotech. Biochem.),58巻、９７４
頁，１９９４年）で形質転換し、２％酢酸、１００μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地にて、３０
℃で４日間培養した。

【００４５】生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリン含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌
体からプラスミドを回収したところ、約５ｋｂｐのＳｐ
ｈＩ断片がクローン化されており、このプラスミドをｐ
Ｓ１と命名した。クローン化されたＤＮＡ断片のうち、
アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸を
含むＹＰＧ培地で生育可能にする断片は、図２に示した
約３．５ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＸｂａＩ断片であった。こ
のようにして通常は酢酸濃度１％程度までしか増殖出来
ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢
酸含有培地でも増殖可能にする酢酸耐性遺伝子断片を取
得した。

【００４６】（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基
配列の決定 実施例１と同様に、アコニターゼ遺伝子を含有する断片
について、塩基配列をサンガーのダイデオキシ・チェー
ン・ターミネーション法よって決定した。その結果、配
列番号３に記載した塩基配列が決定された。アセトバク
ター・アセチＮｏ．１０２３株の場合と同様に、配列決
定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は
全てオーバーラップする様にして行なった。このうち、
決定した３３４８塩基の塩基配列について、配列番号３
に記載した。配列番号３記載の塩基配列中には、塩基番
号４８９から塩基番号３１７９にかけて、配列番号４に
記載したような８９７個のアミノ酸をコードするオープ
ンリーディング・フレームの存在が確認された。

【００４７】（実施例３）アセトバクター・アセチ由来
のアコニターゼ遺伝子で形質転換した形質転換株での酢
酸耐性の増強 （１）アセトバクター・アセチへの形質転換 アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株由来のアコニ
ターゼ遺伝子を含む断片（配列表の配列番号１の塩基番
号１〜３０７３）をＰＣＲ法により増幅し、この増幅断
片を、酢酸菌―大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（ア
プライド・オブ・エンバイロメント・アンド・マイクロ
バイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻，
１７１頁，１９８９年）の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に
挿入し、プラスミドｐＡＣＯ１を作製した。なお、作製
したプラスミドｐＡＣＯ１の挿入断片の塩基配列に変異
がないことはシークエンスすることで確認した。

【００４８】このｐＡＣＯ１をアセトバクター・アセチ
Ｎｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオ
サイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケ
ミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.）、５８巻、
９７４頁、１９９４年）によって形質転換した。形質転
換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸
を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。選択培地上で生
育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプ
ラスミドを抽出して解析し、アコニターゼ遺伝子を保有
するプラスミドを保持していることを確認した。

【００４９】（２）形質転換株の酢酸耐性 上記のようにして得られたプラスミドｐＡＣＯ１を有す
るアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加
したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２
４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１
０２３株と比較した。

【００５０】具体的には、酢酸０％あるいは３％、エタ
ノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１０
０ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒ
ｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での
生育を５５０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較
した。

【００５１】その結果、図３に示すように、３％エタノ
ールのみを添加した培地では、形質転換株、元株アセト
バクター・アセチＮｏ．１０２３株で生育に差は見られ
なかったが、３％酢酸と３％エタノールを添加した培地
では形質転換株は増殖が可能であったのに対して、元株
アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株では増殖でき
なかったことが確認でき、酢酸菌のアコニターゼ遺伝子
の酢酸耐性増強機能が確認できた。

【００５２】（３）形質転換株と元株の各種酵素活性 プラスミドｐＡＣＯ１を有するアンピシリン耐性の形質
転換株と、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した
元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株でアコニ
ット酸ヒドラターゼ活性（アコニターゼ活性）をメソッ
ド・オブ・エンザイモロジー（（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ.），１３巻，２６頁，１９６９年）の方法
に、アルコール脱水素酵素を酢酸菌の方法（メソッド・
オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ.），８９巻，４５０頁，１９８２年）、アルデヒ
ド脱水素酵素活性を酢酸菌の方法（メソッド・オブ・エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.）８
９巻，４９１頁，１９８２年）にそれぞれ準じて測定し
た。その結果を表1に示した。

【００５３】

【表１】

【００５４】表１の結果より、形質転換株はアルコール
脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素の活性は元株アセト
バクター・アセチＮｏ．１０２３株と同レベルであった
が、アコニット酸ヒドラターゼ活性については形質転換
株が約２倍高く、クローニングされた遺伝子はアコニッ
ト酸ヒドラターゼ（アコニターゼ）をコードしているこ
とが確認された。

【００５５】（実施例４）アセトバクター・アセチ由来
のアコニターゼ遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸
発酵試験 実施例３で得られたプラスミドｐＡＣＯ１を有するアン
ピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクター
ｐＭＶ２４のみを有する元株アセトバクター・アセチＮ
ｏ．１０２３株と酢酸醗酵能を比較した。

【００５６】具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理
化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、酢酸１％、エ
タノール３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む
２．５ＬのＹＰＧ培地にて、３０℃、４００ｒｐｍ、
０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度３％
まで発酵させた。この培養液７００ｍＬにエタノール４
％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１．８ＬのＹ
ＰＧ培地を添加し、培地中のエタノール濃度を１％に制
御し、同じ条件下で通気攪拌培養を行ない、形質転換株
と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表２にまと
めた。

【００５７】

【表２】

【００５８】表２の結果から、形質転換株の方が、最終
到達酢酸濃度、比増殖速度、生酸速度の何れにおいて
も、顕著に優れていることが確認できた。

【００５９】（実施例５）グルコンアセトバクター・エ
ンタニイ由来のアコニターゼ遺伝子で形質転換した形質
転換株での酢酸耐性の増強 （１）アセトバクター・アセチへの形質転換 グルコンアセトバクター・エンタニイの1菌株であるア
セトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株由来の
アコニターゼ遺伝子を含む断片（配列表の配列番号１の
塩基番号３０７〜３２３９）をＰＣＲ法により増幅し、
その結果得られた増幅断片をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで
切断し、この断片を酢酸菌―大腸菌シャトルベクターｐ
ＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメント・アン
ド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbio
l.）５５巻，１７１頁，１９８９年）の制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ−ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＡＣ
Ｏ１１を作製した。

【００６０】このｐＡＣＯ１１をアセトバクター・アセ
チＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイ
オサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケ
ミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.），５８巻，
９７４頁，１９９４年）によって形質転換した。形質転
換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸
を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。選択培地上で生
育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプ
ラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有する
プラスミドを保持していることを確認した。

【００６１】（２）形質転換株の酢酸耐性 上記のようにして得られたプラスミドｐＡＣＯ１１を有
するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添
加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ
２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．
１０２３株と比較した。

【００６２】具体的には、酢酸３％、エタノール３％、
アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰ
Ｇ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行な
い、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０
ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。

【００６３】その結果、図４に示すように、３％酢酸と
３％エタノールを添加した培地では形質転換株は増殖が
可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチ
Ｎｏ．１０２３株では増殖できなかったことが確認で
き、酢酸菌のアコニターゼ遺伝子の酢酸耐性増強機能が
確認できた。

【００６４】

【発明の効果】本発明により、酢酸耐性に関与する新規
なアコニターゼ遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用
いてより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株
を取得することができ、該育種株を用いたより高酢酸濃
度の食酢を高効率で製造する方法が提供できた。

【００６５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsukan Group Corporation <120> Structral gene of aconitase from acetic acid bacteria, and acetic acid bacteria transformed with said gene, and acetic acid fermentation using said transformants <130> P02-0084 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 3073 <212> DNA <213> Acetobacter aceti <220> <221> CDS <222> (354)..(3065) <400> 1 tgctgatacc gtccagaacc agcctttctc cacggaagac acagagatcc tcggcataaa 60 gtgctggaaa tgcaccagct tctggcccaa gggcggcttg cccagcaggg aaaggactgt 120 cagcgataac acttctcctt attgttaccg tgcaaggccg caaaagccgg ggtgcttgcg 180 ttctcgtggt cgctccccgc cttgtgcctt ttccaactgc cggtatgttc taggcccaac 240 gggatatcaa gccggttgcc cggcagatct ggcaggcact tggcgccgaa tggtatttta 300 cggtgtcctg aacgcatcac cagccatcgg ctgtgatcgg ggagagagcg att atg 356 Met 1 aaa acg gtt ggg cac gat aag cta aaa aca ggc cgc acc ctt gag gtg 404 Lys Thr Val Gly His Asp Lys Leu Lys Thr Gly Arg Thr Leu Glu Val 5 10 15 gat ggc aag acc tac cac tat ttt tcc att ccc gaa gcg gca aag acc 452 Asp Gly Lys Thr Tyr His Tyr Phe Ser Ile Pro Glu Ala Ala Lys Thr 20 25 30 att ggc gac gta agc cgc ctt ccg gtt tcg ctg aag gtt ctt ttg gaa 500 Ile Gly Asp Val Ser Arg Leu Pro Val Ser Leu Lys Val Leu Leu Glu 35 40 45 aac att ctg cgg ttt gaa gat ggg cgc tcc tac aat gtg gat gac gcc 548 Asn Ile Leu Arg Phe Glu Asp Gly Arg Ser Tyr Asn Val Asp Asp Ala 50 55 60 65 aag gcc att gca ggc tgg ttg cca aag ggt agc agc agt aag gaa gtg 596 Lys Ala Ile Ala Gly Trp Leu Pro Lys Gly Ser Ser Ser Lys Glu Val 70 75 80 cct ttc aaa cct tca cgt att cta atg cag gac ttc gcc ggt gtt ccg 644 Pro Phe Lys Pro Ser Arg Ile Leu Met Gln Asp Phe Ala Gly Val Pro 85 90 95 ggt gtg gtg gat ctt gca gcc atg cgt gac ggg att gtg agc ctg aag 692 Gly Val Val Asp Leu Ala Ala Met Arg Asp Gly Ile Val Ser Leu Lys 100 105 110 ggt gac ccc cag aag gtg aac cca atg gtt ccg gtc aat ctg gtg atc 740 Gly Asp Pro Gln Lys Val Asn Pro Met Val Pro Val Asn Leu Val Ile 115 120 125 gac cat tcc gtg acg gtg gac cat gca ggc aca aaa gat gcg ctg cag 788 Asp His Ser Val Thr Val Asp His Ala Gly Thr Lys Asp Ala Leu Gln 130 135 140 145 gaa aac att acg ctg gaa ttt gaa cgc aac gca gaa cgt tat gcc ttc 836 Glu Asn Ile Thr Leu Glu Phe Glu Arg Asn Ala Glu Arg Tyr Ala Phe 150 155 160 ctg cgc tgg ggc cag gtg gcg ttt gaa aac ttc tcc gtt gtg ccg cca 884 Leu Arg Trp Gly Gln Val Ala Phe Glu Asn Phe Ser Val Val Pro Pro 165 170 175 gat aca ggc atc tgc cat cag gtg aac ctg gaa tac att gcc cag gtg 932 Asp Thr Gly Ile Cys His Gln Val Asn Leu Glu Tyr Ile Ala Gln Val 180 185 190 gca tgg acc gcc aat gtg ggc ggc aag gaa tac gtt tac ccg gat tcc 980 Ala Trp Thr Ala Asn Val Gly Gly Lys Glu Tyr Val Tyr Pro Asp Ser 195 200 205 ctg tac ggc aca gac agc cac acc acc atg atc aac ggt ctg ggc gtg 1028 Leu Tyr Gly Thr Asp Ser His Thr Thr Met Ile Asn Gly Leu Gly Val 210 215 220 225 ttg ggc tgg ggt gtg ggt ggt att gag gct gag gcc gca atg ctg ggc 1076 Leu Gly Trp Gly Val Gly Gly Ile Glu Ala Glu Ala Ala Met Leu Gly 230 235 240 cag ccc att gcc atg ctt att ccc gat gtg atc ggc ttt aag ctg aca 1124 Gln Pro Ile Ala Met Leu Ile Pro Asp Val Ile Gly Phe Lys Leu Thr 245 250 255 ggc aag ctg cca gaa ggc gca aca gcc acc gat ctg gtg ctg aca gtg 1172 Gly Lys Leu Pro Glu Gly Ala Thr Ala Thr Asp Leu Val Leu Thr Val 260 265 270 acc cag atg ctg cgc aga aaa ggc gtg gtg ggc aag ttt gtt gaa ttc 1220 Thr Gln Met Leu Arg Arg Lys Gly Val Val Gly Lys Phe Val Glu Phe 275 280 285 ttt ggc ccg gca ctt gat cat ctg ccc gtg gcg gac cgt gca acc att 1268 Phe Gly Pro Ala Leu Asp His Leu Pro Val Ala Asp Arg Ala Thr Ile 290 295 300 305 gcc aac atg gct ccg gaa tat ggt gca act tgc ggg ttc ttc ccg gtt 1316 Ala Asn Met Ala Pro Glu Tyr Gly Ala Thr Cys Gly Phe Phe Pro Val 310 315 320 gat gcg ctt acg ctg gac ttc ctg cgc cag acc ggt cgt gat gaa cat 1364 Asp Ala Leu Thr Leu Asp Phe Leu Arg Gln Thr Gly Arg Asp Glu His 325 330 335 cgc atc aag ctg gtt gaa gaa tat ctg cgc gcg cag ggc atg ttc cgc 1412 Arg Ile Lys Leu Val Glu Glu Tyr Leu Arg Ala Gln Gly Met Phe Arg 340 345 350 acg cac gaa acg cca gaa cct gtc ttt aca gat gtt ctg gaa ctg gat 1460 Thr His Glu Thr Pro Glu Pro Val Phe Thr Asp Val Leu Glu Leu Asp 355 360 365 ctc agc acg gtt gtg cct tct ctg gca ggg ccc aag cgt ccg cag gat 1508 Leu Ser Thr Val Val Pro Ser Leu Ala Gly Pro Lys Arg Pro Gln Asp 370 375 380 385 cgc gtg gag ctg aaa agc gcc aaa acc gcg ttt gaa aaa gaa ctc atc 1556 Arg Val Glu Leu Lys Ser Ala Lys Thr Ala Phe Glu Lys Glu Leu Ile 390 395 400 agc tct ttg ggt gtg gcc gct aac gat gcc gat aaa aag gtg ccg gtt 1604 Ser Ser Leu Gly Val Ala Ala Asn Asp Ala Asp Lys Lys Val Pro Val 405 410 415 gcc gga acc aac tat gat ctg ggg cag ggc gat att gtt att gcc gct 1652 Ala Gly Thr Asn Tyr Asp Leu Gly Gln Gly Asp Ile Val Ile Ala Ala 420 425 430 att acc tcc tgc acc aac aca tcc aac ccg gct gtg ctg att gcg gct 1700 Ile Thr Ser Cys Thr Asn Thr Ser Asn Pro Ala Val Leu Ile Ala Ala 435 440 445 ggt ctg gtt gcc cgc aag gca cgt gct cta ggc ctt acg cct aag ccg 1748 Gly Leu Val Ala Arg Lys Ala Arg Ala Leu Gly Leu Thr Pro Lys Pro 450 455 460 465 tgg gtg aaa acc tct ctg gct ccg ggg tct cag gtt gtt acg gat tac 1796 Trp Val Lys Thr Ser Leu Ala Pro Gly Ser Gln Val Val Thr Asp Tyr 470 475 480 ctg aac cgc tct ggc ctg acg acg gat ctg gat gcc atg ggc ttc aat 1844 Leu Asn Arg Ser Gly Leu Thr Thr Asp Leu Asp Ala Met Gly Phe Asn 485 490 495 acc gtt ggg tat ggt tgc acc acc tgt atc ggt aac tcc ggt ccg ctg 1892 Thr Val Gly Tyr Gly Cys Thr Thr Cys Ile Gly Asn Ser Gly Pro Leu 500 505 510 cct tct cac att gta gac gcg att gaa aac aac gac ctg gtt gct gtt 1940 Pro Ser His Ile Val Asp Ala Ile Glu Asn Asn Asp Leu Val Ala Val 515 520 525 tct gtc ctg tct ggc aac cgt aac ttt gaa ggc cgt att tcc ccc aac 1988 Ser Val Leu Ser Gly Asn Arg Asn Phe Glu Gly Arg Ile Ser Pro Asn 530 535 540 545 gtt cgg gcc gac tat ctg gca agc ccg ccg ctg gtg gtg gca tgt tcc 2036 Val Arg Ala Asp Tyr Leu Ala Ser Pro Pro Leu Val Val Ala Cys Ser 550 555 560 ctt ctt ggc acc atg cgt aag gat att acg acg gaa ccg ctg ggc aca 2084 Leu Leu Gly Thr Met Arg Lys Asp Ile Thr Thr Glu Pro Leu Gly Thr 565 570 575 tcc aag gat ggc aag ccg gtt tac ctg aag gat atc tgg ccg acc aac 2132 Ser Lys Asp Gly Lys Pro Val Tyr Leu Lys Asp Ile Trp Pro Thr Asn 580 585 590 aag gaa att gct gac ctt att gct tct gcc atc agc cgt gac gag ttt 2180 Lys Glu Ile Ala Asp Leu Ile Ala Ser Ala Ile Ser Arg Asp Glu Phe 595 600 605 atc aac cgt tac aag aac gcg tcc aaa ggc acg aag gaa tgg cag ggt 2228 Ile Asn Arg Tyr Lys Asn Ala Ser Lys Gly Thr Lys Glu Trp Gln Gly 610 615 620 625 ctg aag gtt gct acg ggt tct gaa acc tat ggg tgg gat ccg ccg tac 2276 Leu Lys Val Ala Thr Gly Ser Glu Thr Tyr Gly Trp Asp Pro Pro Tyr 630 635 640 ttc aag cat atg gat att gaa ccc aag gct ccg ggc aat atc gaa ggt 2324 Phe Lys His Met Asp Ile Glu Pro Lys Ala Pro Gly Asn Ile Glu Gly 645 650 655 gcg cgt att ctg gcc ctg ctg ggt gac aac atc acg acc gac cat atc 2372 Ala Arg Ile Leu Ala Leu Leu Gly Asp Asn Ile Thr Thr Asp His Ile 660 665 670 tct ccg gca ggc tcc atc aag aag gat tcc ccg gct ggt cgt tac ctg 2420 Ser Pro Ala Gly Ser Ile Lys Lys Asp Ser Pro Ala Gly Arg Tyr Leu 675 680 685 atg gaa cac ggg gtt gaa ccc aaa gac ttc aac tct tgt ggc tcc cgc 2468 Met Glu His Gly Val Glu Pro Lys Asp Phe Asn Ser Cys Gly Ser Arg 690 695 700 705 cgt ggg aat gac cgc gtg atg gtg cgt ggt act ttt gcc aac atc cgt 2516 Arg Gly Asn Asp Arg Val Met Val Arg Gly Thr Phe Ala Asn Ile Arg 710 715 720 atc aaa aac gaa atg ctg cct ggt acg gaa ggt ggg tat tcc aag cac 2564 Ile Lys Asn Glu Met Leu Pro Gly Thr Glu Gly Gly Tyr Ser Lys His 725 730 735 ttc ccg gat ggg aag gaa ggc gcc att tac gat gtg gcc atg gaa tat 2612 Phe Pro Asp Gly Lys Glu Gly Ala Ile Tyr Asp Val Ala Met Glu Tyr 740 745 750 aaa aag gac cat gtg ccg ctg gtt gtg att ggt ggc aaa gaa tac ggc 2660 Lys Lys Asp His Val Pro Leu Val Val Ile Gly Gly Lys Glu Tyr Gly 755 760 765 atg ggc tct tcc cgt gac tgg gct gca aaa ggc acc ctg ttg ctg ggc 2708 Met Gly Ser Ser Arg Asp Trp Ala Ala Lys Gly Thr Leu Leu Leu Gly 770 775 780 785 gta aag gcc gtt att gct gaa agc ttt ccg ccg cgc tgc cgc act ggc 2756 Val Lys 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Pro Cys Cys 900 <210> 2 <211> 904 <212> PRT <213> Acetobacter aceti <400> 2 Met Lys Thr Val Gly His Asp Lys Leu Lys Thr Gly Arg Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Asp Gly Lys Thr Tyr His Tyr Phe Ser Ile Pro Glu Ala Ala Lys 20 25 30 Thr Ile Gly Asp Val Ser Arg Leu Pro Val Ser Leu Lys Val Leu Leu 35 40 45 Glu Asn Ile Leu Arg Phe Glu Asp Gly Arg Ser Tyr Asn Val Asp Asp 50 55 60 Ala Lys Ala Ile Ala Gly Trp Leu Pro Lys Gly Ser Ser Ser Lys Glu 65 70 75 80 Val Pro Phe Lys Pro Ser Arg Ile Leu Met Gln Asp Phe Ala Gly Val 85 90 95 Pro Gly Val Val Asp Leu Ala Ala Met Arg Asp Gly Ile Val Ser Leu 100 105 110 Lys Gly Asp Pro Gln Lys Val Asn Pro Met Val Pro Val Asn Leu Val 115 120 125 Ile Asp His Ser Val Thr Val Asp His Ala Gly Thr Lys Asp Ala Leu 130 135 140 Gln Glu Asn Ile Thr Leu Glu Phe Glu Arg Asn Ala Glu Arg Tyr Ala 145 150 155 160 Phe Leu Arg Trp Gly Gln Val Ala Phe Glu Asn Phe Ser Val Val Pro 165 170 175 Pro Asp Thr Gly Ile Cys His Gln Val Asn Leu Glu Tyr Ile Ala Gln 180 185 190 Val Ala Trp Thr Ala Asn Val Gly Gly Lys Glu Tyr Val Tyr Pro Asp 195 200 205 Ser Leu Tyr Gly Thr Asp Ser His Thr Thr Met Ile Asn Gly Leu Gly 210 215 220 Val Leu Gly Trp Gly Val Gly Gly Ile Glu Ala Glu Ala Ala Met Leu 225 230 235 240 Gly Gln Pro Ile Ala Met Leu Ile Pro Asp Val Ile Gly Phe Lys Leu 245 250 255 Thr Gly Lys Leu Pro Glu Gly Ala Thr Ala Thr Asp Leu Val Leu Thr 260 265 270 Val Thr Gln Met Leu Arg Arg Lys Gly Val Val Gly Lys Phe Val Glu 275 280 285 Phe Phe Gly Pro Ala Leu Asp His Leu Pro Val Ala Asp Arg Ala Thr 290 295 300 Ile Ala Asn Met Ala Pro Glu Tyr Gly Ala Thr Cys Gly Phe Phe Pro 305 310 315 320 Val Asp Ala Leu Thr Leu Asp Phe Leu Arg Gln Thr Gly Arg Asp Glu 325 330 335 His Arg Ile Lys Leu Val Glu Glu Tyr Leu Arg Ala Gln Gly Met Phe 340 345 350 Arg Thr His Glu Thr Pro Glu Pro Val Phe Thr Asp Val Leu Glu Leu 355 360 365 Asp Leu Ser Thr Val Val Pro Ser Leu Ala Gly Pro Lys Arg Pro Gln 370 375 380 Asp Arg Val Glu Leu Lys Ser Ala Lys Thr Ala Phe Glu Lys Glu Leu 385 390 395 400 Ile Ser Ser Leu Gly Val Ala Ala Asn Asp Ala Asp Lys Lys Val Pro 405 410 415 Val Ala Gly Thr Asn Tyr Asp Leu Gly Gln Gly Asp Ile Val Ile Ala 420 425 430 Ala Ile Thr Ser Cys Thr Asn Thr Ser Asn Pro Ala Val Leu Ile Ala 435 440 445 Ala Gly Leu Val Ala Arg Lys Ala Arg Ala Leu Gly Leu Thr Pro Lys 450 455 460 Pro Trp Val Lys Thr Ser Leu Ala Pro Gly Ser Gln Val Val Thr Asp 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Arg Ser Gly Leu Thr Thr Asp Leu Asp Ala Met Gly Phe 485 490 495 Asn Thr Val Gly Tyr Gly Cys Thr Thr Cys Ile Gly Asn Ser Gly Pro 500 505 510 Leu Pro Ser His Ile Val Asp Ala Ile Glu Asn Asn Asp Leu Val Ala 515 520 525 Val Ser Val Leu Ser Gly Asn Arg Asn Phe Glu Gly Arg Ile Ser Pro 530 535 540 Asn Val Arg Ala Asp Tyr Leu Ala Ser Pro Pro Leu Val Val Ala Cys 545 550 555 560 Ser Leu Leu Gly Thr Met Arg Lys Asp Ile Thr Thr Glu Pro Leu Gly 565 570 575 Thr Ser Lys Asp Gly Lys Pro Val Tyr Leu Lys Asp Ile Trp Pro Thr 580 585 590 Asn Lys Glu Ile Ala Asp Leu Ile Ala Ser Ala Ile Ser Arg Asp Glu 595 600 605 Phe Ile Asn Arg Tyr Lys Asn Ala Ser Lys Gly Thr Lys Glu Trp Gln 610 615 620 Gly Leu Lys Val Ala Thr Gly Ser Glu Thr Tyr Gly Trp Asp Pro Pro 625 630 635 640 Tyr Phe Lys His Met Asp Ile Glu Pro Lys Ala Pro Gly Asn Ile Glu 645 650 655 Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Leu Gly Asp Asn Ile Thr Thr Asp His 660 665 670 Ile Ser Pro Ala Gly Ser Ile Lys Lys Asp Ser Pro Ala Gly Arg Tyr 675 680 685 Leu Met Glu His Gly Val Glu Pro Lys Asp Phe Asn Ser Cys Gly Ser 690 695 700 Arg Arg Gly Asn Asp Arg Val Met Val Arg Gly Thr Phe Ala Asn Ile 705 710 715 720 Arg Ile Lys Asn Glu Met Leu Pro Gly Thr Glu Gly Gly Tyr Ser Lys 725 730 735 His Phe Pro Asp Gly Lys Glu Gly Ala Ile Tyr Asp Val Ala Met Glu 740 745 750 Tyr Lys Lys Asp His Val Pro Leu Val Val Ile Gly Gly Lys Glu Tyr 755 760 765 Gly Met Gly Ser Ser Arg Asp Trp Ala Ala Lys Gly Thr Leu Leu Leu 770 775 780 Gly Val Lys Ala Val Ile Ala Glu Ser Phe Pro Pro Arg Cys Arg Thr 785 790 795 800 Gly Thr Cys Ser Arg Ala Gln Ser Cys Ser Phe Pro Phe Arg Pro Ile 805 810 815 Leu Arg Trp Ala Pro Pro Ser Ala Phe Leu Asp Leu Val Lys Gly His 820 825 830 Val Asp Ile Leu Phe Ala Asn Glu Asp Glu Ile Cys Ala Leu Tyr Glu 835 840 845 Thr Glu Asn Phe Asp Val Ala Ala Arg His Thr Ala Gln Asp Thr Thr 850 855 860 Phe Ala Ala Leu Thr Arg Ser Gly Leu Gly Ser Val Val Leu His Asp 865 870 875 880 Gly Gln Met Thr Lys Val Ala Thr Val Pro Thr Gln Val Val Asp Thr 885 890 895 Gln Ala Leu Glu Met Pro Cys Cys 900 <210> 3 <211> 3348 <212> DNA <213> Gluconacetobacter entanii <220> <221> CDS <222> (489)..(3179) <400> 3 gcatgctggc tgcgatcggc cagcgcatcg accccggccc acaggacatg gccgccttca 60 ggtttgcgca aacccgcgag cacgcgcagc aaggtggact tgcccgcgcc attcggcccg 120 gtcagaagca gggcgtcgcc cgcatccagc gtaaagccga cacggtccag aaccagccgt 180 tcaccgcgga aaaccgatat attttccact tccagcaggg gacggccggg gggagtaaag 240 gcaggaatga cggaaatcct ccgatcggtg ggtgaagggg cgggcgggtg aaaaaaacgc 300 ctgctcccgc tttcttgtta ccgggtccag cttgtgtcgc aaccgcgtcc gggtatgttc 360 tacccccgtt gggagatcaa gcaggttgtc cccgacaagg tcgcaaatcc cgcacctatg 420 gaagtggggc gggggaaagt ggtcatacgg gacgatccgt tgctgatgcc tcggaggaaa 480 caaagcca atg aag acg gtt ggg cac gac tca atg aaa acg gtc cgc aca 530 Met Lys Thr Val Gly His Asp Ser Met Lys Thr Val Arg Thr 1 5 10 ctc aat gtg gac ggc aag acc tat cat tat ttc tca atc ccg gaa gct 578 Leu Asn Val Asp Gly Lys Thr Tyr His Tyr Phe Ser Ile Pro Glu Ala 15 20 25 30 gaa aag acg atc ggt tcc gtc agc cgc ctg ccg gtc agc ctg aaa gtg 626 Glu Lys Thr Ile Gly Ser Val Ser Arg Leu Pro Val Ser Leu Lys Val 35 40 45 ctg ctg gaa aac gta ctg cgg ttc gag gac ggg cat tcc tat tcg gtt 674 Leu Leu Glu Asn Val Leu Arg Phe Glu Asp Gly His Ser Tyr Ser Val 50 55 60 gag gat gcc aag gcc att gcg gaa tgg ctg aag gaa ggg cgc agc acg 722 Glu Asp Ala Lys Ala Ile Ala Glu Trp Leu Lys Glu Gly Arg Ser Thr 65 70 75 aag gaa gtt ccc ttc aag ccc gcg cgt atc ctg atg cag gat ttc acc 770 Lys Glu Val Pro Phe Lys Pro Ala Arg Ile Leu Met Gln Asp Phe Thr 80 85 90 ggc gtt ccc gcc gtg gtt gat ctg gcc gcg atg cgc gac ggc atc ctg 818 Gly Val Pro Ala Val Val Asp Leu Ala Ala Met Arg Asp Gly Ile Leu 95 100 105 110 aag ctg aag ggc gac ccg cag aag gtg aac ccg ctg gtt ccc gtc aac 866 Lys Leu Lys Gly Asp Pro Gln Lys Val Asn Pro Leu Val Pro Val Asn 115 120 125 ctg gtg atc gac cat tcg gtc atg gtg gac gtg gcc ggt tcg ccc gaa 914 Leu Val Ile Asp His Ser Val Met Val Asp Val Ala Gly Ser Pro Glu 130 135 140 gcg ctg cag gac aac gta acc atc gag ttc gag cgc aat ggc gaa cgc 962 Ala Leu Gln Asp Asn Val Thr Ile Glu Phe Glu Arg Asn Gly Glu Arg 145 150 155 tac gcc ttc ctg cgc tgg ggc cag gaa gcg ttt gaa aac ttc tcc gtc 1010 Tyr Ala Phe Leu Arg Trp Gly Gln Glu Ala Phe Glu Asn Phe Ser Val 160 165 170 gtg ccg ccg ggc acc gga atc tgc cac cag gtg aac ctg gaa tac atc 1058 Val Pro Pro Gly Thr Gly Ile Cys His Gln Val Asn Leu Glu Tyr Ile 175 180 185 190 gcg cag gcg gtg tgg acg gcg aat gtg gat ggc aag gac tac gcc tat 1106 Ala Gln Ala Val Trp Thr Ala Asn Val Asp Gly Lys Asp Tyr Ala Tyr 195 200 205 ccc gac acc ctg ttc ggc acg gac agc cat acc acc atg gtc aac ggc 1154 Pro Asp Thr Leu Phe Gly Thr Asp Ser His Thr Thr Met Val Asn Gly 210 215 220 atg ggc gtt ctg ggc tgg ggc gtt ggc ggg atc gag gcg gaa gcc gcg 1202 Met Gly Val Leu Gly Trp Gly Val Gly Gly Ile Glu Ala Glu Ala Ala 225 230 235 atg ctg ggc cag ccg atc gcc atg ctc atc ccc gac gtg atc ggc ttc 1250 Met Leu Gly Gln Pro Ile Ala Met Leu Ile Pro Asp Val Ile Gly Phe 240 245 250 aag ctg gtt ggc aag ctg ccc gag ggg gcg acc gcc acc gac ctg gtg 1298 Lys Leu Val Gly Lys Leu Pro Glu Gly Ala Thr Ala Thr Asp Leu Val 255 260 265 270 ctg acg gtc acg cag atg ctg cgc aag aag ggc gtt gtc ggc aag ttt 1346 Leu Thr Val Thr Gln Met Leu Arg Lys Lys Gly Val Val Gly Lys Phe 275 280 285 gtc gaa ttc ttc ggt cct gcc ctt gac cac ctg ccg gtt gcc gac cgt 1394 Val Glu Phe Phe Gly Pro Ala Leu Asp His Leu Pro Val Ala Asp Arg 290 295 300 gcg acc atc gcc aac atg gcc ccg gaa tat ggc gcg acc tgc ggc ttc 1442 Ala Thr Ile Ala Asn Met Ala Pro Glu Tyr Gly Ala Thr Cys Gly Phe 305 310 315 ttc ccg gtt gat gac ctg acg ctg gat tac ctg cgc cag acc ggc cgt 1490 Phe Pro Val Asp Asp Leu Thr Leu Asp Tyr Leu Arg Gln Thr Gly Arg 320 325 330 gag gaa cac cgc atc aag ctg acg gcg gaa tac ctg aag gca cag ggc 1538 Glu Glu His Arg Ile Lys Leu Thr Ala Glu Tyr Leu Lys Ala Gln Gly 335 340 345 350 atg ttc cgt cat gcc gaa tcg gcg cac ccc gtg ttc acc gat acg ctg 1586 Met Phe Arg His Ala Glu Ser Ala His Pro Val Phe Thr Asp Thr Leu 355 360 365 gaa ctc aac ctt gag acc atc gtg ccg tcc atc gcc ggc ccc aag cgc 1634 Glu Leu Asn Leu Glu Thr Ile Val Pro Ser Ile Ala Gly Pro Lys Arg 370 375 380 ccg cag gac cgc gtc gtg ctg aag ggt gcg gac aag gcg ttc gag aag 1682 Pro Gln Asp Arg Val Val Leu Lys Gly Ala Asp Lys Ala Phe Glu Lys 385 390 395 gaa ctg acc ggc agc ctg ggc gtg ccc gaa gcc gac aag gac aag aag 1730 Glu Leu Thr Gly Ser Leu Gly Val Pro Glu Ala Asp Lys Asp Lys Lys 400 405 410 gcc aag gtg gct ggc acc aat tac gag atc ggt cac ggc gac gtg gtg 1778 Ala Lys Val Ala Gly Thr Asn Tyr Glu Ile Gly His Gly Asp Val Val 415 420 425 430 atc gcg gcc atc acc tca tgc acc aac acc tcc aac ccc gcc gtg ctg 1826 Ile Ala Ala Ile Thr Ser Cys Thr Asn Thr Ser Asn Pro Ala Val Leu 435 440 445 atc gcg gca ggc ctg gtg gcg aaa aag gca cgt gcg ctg ggc ctg aag 1874 Ile Ala Ala Gly Leu Val Ala Lys Lys Ala Arg Ala Leu Gly Leu Lys 450 455 460 ccc aag ccg tgg gtg aag acc tcg ctc gca ccg gga tcg cag gtt gtg 1922 Pro Lys Pro Trp Val Lys Thr Ser Leu Ala Pro Gly Ser Gln Val Val 465 470 475 acc gac tac ctc aac cgc gcg ggc ctg cag gcc gaa ctg gac gcg atg 1970 Thr Asp Tyr Leu Asn Arg Ala Gly Leu Gln Ala Glu Leu Asp Ala Met 480 485 490 ggc ttc aac acc gtg ggc tat ggc tgc acg acc tgt atc ggc aac tcc 2018 Gly Phe Asn Thr Val Gly Tyr Gly Cys Thr Thr Cys Ile Gly Asn Ser 495 500 505 510 ggc ccg ctg gaa gat cac atc gtc gat gcg atc gaa ggc aac aag ctg 2066 Gly Pro Leu Glu Asp His Ile Val Asp Ala Ile Glu Gly Asn Lys Leu 515 520 525 gtt gcg gtg tcg gtc ctg tcg ggc aac cgt aac ttc gaa ggc cgt att 2114 Val Ala Val Ser Val Leu Ser Gly Asn Arg Asn Phe Glu Gly Arg Ile 530 535 540 tcg ccg aac gtg cgc gcc aac tac ctg gcc agc ccg ccg ctg gtc gtg 2162 Ser Pro Asn Val Arg Ala Asn Tyr Leu Ala Ser Pro Pro Leu Val Val 545 550 555 gcg tat tcc ctg ctg ggc acc atg cgt gag gac atc acc acc acg ccg 2210 Ala Tyr Ser Leu Leu Gly Thr Met Arg Glu Asp Ile Thr Thr Thr Pro 560 565 570 ctg ggc acc tcc aag gat ggc aag ccg gtg tac ctg aag gac atc tgg 2258 Leu Gly Thr Ser Lys Asp Gly Lys Pro Val Tyr Leu Lys Asp Ile Trp 575 580 585 590 ccg acc aac cat gaa atc gcc gcc ctg atg ggt tcc gcc atc acg cgt 2306 Pro Thr Asn His Glu Ile Ala Ala Leu Met Gly Ser Ala Ile Thr Arg 595 600 605 gag gag ttc atc aac cgc tac aag cac gta agc cag ggc acg aag gaa 2354 Glu Glu Phe Ile Asn Arg Tyr Lys His Val Ser Gln Gly Thr Lys Glu 610 615 620 tgg cag gcg ctg aag gtc gcc acc ggt tcc gag acg tac aag tgg gat 2402 Trp Gln Ala Leu Lys Val Ala Thr Gly Ser Glu Thr Tyr Lys Trp Asp 625 630 635 gca tca tcc acc tac gtg cag gat ccg ccg tac ttc cag gac atc acg 2450 Ala Ser Ser Thr Tyr Val Gln Asp Pro Pro Tyr Phe Gln Asp Ile Thr 640 645 650 ccc gaa ccc aag ccg cgt ggc gac atc atc ggt gcg cgc ctg ctg gcg 2498 Pro Glu Pro Lys Pro Arg Gly Asp Ile Ile Gly Ala Arg Leu Leu Ala 655 660 665 670 ctg ctg ggt gac aac atc acg acc gac cat atc tcg cct gct ggc gcg 2546 Leu Leu Gly Asp Asn Ile Thr Thr Asp His Ile Ser Pro Ala Gly Ala 675 680 685 atc aag gaa agc tcg cct gcc ggc aag tac ctt gaa gag cat ggc gtc 2594 Ile Lys Glu Ser Ser Pro Ala Gly Lys Tyr Leu Glu Glu His Gly Val 690 695 700 gcg aag aaa gga ctt cac tcc tac ggt tcg cgt cgt ggc aat gac cgc 2642 Ala Lys Lys Gly Leu His Ser Tyr Gly Ser Arg Arg Gly Asn Asp Arg 705 710 715 gtg atg gtg cgt ggc acg ttt gcc aac atc cgc atc aag aac gag atg 2690 Val Met Val Arg Gly Thr Phe Ala Asn Ile Arg Ile Lys Asn Glu Met 720 725 730 ctg ccc ggc acc gaa ggg ggc gtg tcc aag cac ttc ccg gac ggc aag 2738 Leu Pro Gly Thr Glu Gly Gly Val Ser Lys His Phe Pro Asp Gly Lys 735 740 745 750 gaa ggc tcc atc tat gat gtc gcg atg gaa tac aag aag gag ggc gtg 2786 Glu Gly Ser Ile Tyr Asp Val Ala Met Glu Tyr Lys Lys Glu Gly Val 755 760 765 ccc ctg gtc gtg atc ggc ggc aag gaa tac ggc atg ggc tcc tca cgc 2834 Pro Leu Val Val Ile Gly Gly Lys Glu Tyr Gly Met Gly Ser Ser Arg 770 775 780 gac tgg gcg gcc aag ggc acc ctg ctg ctg ggc gtg cgt gcg gtg att 2882 Asp Trp Ala Ala Lys Gly Thr Leu Leu Leu Gly Val Arg Ala Val Ile 785 790 795 gcc gaa agc ttc gag cgt atc cac cgt tcc aac ctg gtg ggc atg ggc 2930 Ala Glu Ser Phe Glu Arg Ile His Arg Ser Asn Leu Val Gly Met Gly 800 805 810 gtg ctg ccg ctg ctg ttt gaa gaa ggc acg acg cgc aag acg ctg ggc 2978 Val Leu Pro Leu Leu Phe Glu Glu Gly Thr Thr Arg Lys Thr Leu Gly 815 820 825 830 ctg aag ggt gac gag acc ttc gaa atc cgc ggt ctg gac aag atc acg 3026 Leu Lys Gly Asp Glu Thr Phe Glu Ile Arg Gly Leu Asp Lys Ile Thr 835 840 845 ccg cgt atg acg atg acg atg aca atc acc cgc gcc gat ggc tcc aag 3074 Pro Arg Met Thr Met Thr Met Thr Ile Thr Arg Ala Asp Gly Ser Lys 850 855 860 cag gac gtt ccg ctg ctg tgc cgt gtc gat acg ctg gac gag gtg gag 3122 Gln Asp Val Pro Leu Leu Cys Arg Val Asp Thr Leu Asp Glu Val Glu 865 870 875 tat ttc cgc aat ggc ggc att ctc cag acc gtg ctg cgt ggc atg acc 3170 Tyr Phe Arg Asn Gly Gly Ile Leu Gln Thr Val Leu Arg Gly Met Thr 880 885 890 aag gcc gcg taatcacatg atccgccccg gttccggtcg ggatggatga 3219 Lys Ala Ala 895 taaagacggc ggtccgtatc acacgggccg ccgttttttt atgggcagat catatatgca 3279 tattcagcat aggttaccgg tgttaccgtt gcattttaca catatcggtg gtgtcttttc 3339 tctgtattg 3348 <210> 4 <211> 897 <212> PRT <213> Gluconacetobacter entanii <400> 4 Met Lys Thr Val Gly His Asp Ser Met Lys Thr Val Arg Thr Leu Asn 1 5 10 15 Val Asp Gly Lys Thr Tyr His Tyr Phe Ser Ile Pro Glu Ala Glu Lys 20 25 30 Thr Ile Gly Ser Val Ser Arg Leu Pro Val Ser Leu Lys Val Leu Leu 35 40 45 Glu Asn Val Leu Arg Phe Glu Asp Gly His Ser Tyr Ser Val Glu Asp 50 55 60 Ala Lys Ala Ile Ala Glu Trp Leu Lys Glu Gly Arg Ser Thr Lys Glu 65 70 75 80 Val Pro Phe Lys Pro Ala Arg Ile Leu Met Gln Asp Phe Thr Gly Val 85 90 95 Pro Ala Val Val Asp Leu Ala Ala Met Arg Asp Gly Ile Leu Lys Leu 100 105 110 Lys Gly Asp Pro Gln Lys Val Asn Pro Leu Val Pro Val Asn Leu Val 115 120 125 Ile Asp His Ser Val Met Val Asp Val Ala Gly Ser Pro Glu Ala Leu 130 135 140 Gln Asp Asn Val Thr Ile Glu Phe Glu Arg Asn Gly Glu Arg Tyr Ala 145 150 155 160 Phe Leu Arg Trp Gly Gln Glu Ala Phe Glu Asn Phe Ser Val Val Pro 165 170 175 Pro Gly Thr Gly Ile Cys His Gln Val Asn Leu Glu Tyr Ile Ala Gln 180 185 190 Ala Val Trp Thr Ala Asn Val Asp Gly Lys Asp Tyr Ala Tyr Pro Asp 195 200 205 Thr Leu Phe Gly Thr Asp Ser His Thr Thr Met Val Asn Gly Met Gly 210 215 220 Val Leu Gly Trp Gly Val Gly Gly Ile Glu Ala Glu Ala Ala Met Leu 225 230 235 240 Gly Gln Pro Ile Ala Met Leu Ile Pro Asp Val Ile Gly Phe Lys Leu 245 250 255 Val Gly Lys Leu Pro Glu Gly Ala Thr Ala Thr Asp Leu Val Leu Thr 260 265 270 Val Thr Gln Met Leu Arg Lys Lys Gly Val Val Gly Lys Phe Val Glu 275 280 285 Phe Phe Gly Pro Ala Leu Asp His Leu Pro Val Ala Asp Arg Ala Thr 290 295 300 Ile Ala Asn Met Ala Pro Glu Tyr Gly Ala Thr Cys Gly Phe Phe Pro 305 310 315 320 Val Asp Asp Leu Thr Leu Asp Tyr Leu Arg Gln Thr Gly Arg Glu Glu 325 330 335 His Arg Ile Lys Leu Thr Ala Glu Tyr Leu Lys Ala Gln Gly Met Phe 340 345 350 Arg His Ala Glu Ser Ala His Pro Val Phe Thr Asp Thr Leu Glu Leu 355 360 365 Asn Leu Glu Thr Ile Val Pro Ser Ile Ala Gly Pro Lys Arg Pro Gln 370 375 380 Asp Arg Val Val Leu Lys Gly Ala Asp Lys Ala Phe Glu Lys Glu Leu 385 390 395 400 Thr Gly Ser Leu Gly Val Pro Glu Ala Asp Lys Asp Lys Lys Ala Lys 405 410 415 Val Ala Gly Thr Asn Tyr Glu Ile Gly His Gly Asp Val Val Ile Ala 420 425 430 Ala Ile Thr Ser Cys Thr Asn Thr Ser Asn Pro Ala Val Leu Ile Ala 435 440 445 Ala Gly Leu Val Ala Lys Lys Ala Arg Ala Leu Gly Leu Lys Pro Lys 450 455 460 Pro Trp Val Lys Thr Ser Leu Ala Pro Gly Ser Gln Val Val Thr Asp 465 470 475 480 Tyr Leu Asn Arg Ala Gly Leu Gln Ala Glu Leu Asp Ala Met Gly Phe 485 490 495 Asn Thr Val Gly Tyr Gly Cys Thr Thr Cys Ile Gly Asn Ser Gly Pro 500 505 510 Leu Glu Asp His Ile Val Asp Ala Ile Glu Gly Asn Lys Leu Val Ala 515 520 525 Val Ser Val Leu Ser Gly Asn Arg Asn Phe Glu Gly Arg Ile Ser Pro 530 535 540 Asn Val Arg Ala Asn Tyr Leu Ala Ser Pro Pro Leu Val Val Ala Tyr 545 550 555 560 Ser Leu Leu Gly Thr Met Arg Glu Asp Ile Thr Thr Thr Pro Leu Gly 565 570 575 Thr Ser Lys Asp Gly Lys Pro Val Tyr Leu Lys Asp Ile Trp Pro Thr 580 585 590 Asn His Glu Ile Ala Ala Leu Met Gly Ser Ala Ile Thr Arg Glu Glu 595 600 605 Phe Ile Asn Arg Tyr Lys His Val Ser Gln Gly Thr Lys Glu Trp Gln 610 615 620 Ala Leu Lys Val Ala Thr Gly Ser Glu Thr Tyr Lys Trp Asp Ala Ser 625 630 635 640 Ser Thr Tyr Val Gln Asp Pro Pro Tyr Phe Gln Asp Ile Thr Pro Glu 645 650 655 Pro Lys Pro Arg Gly Asp Ile Ile Gly Ala Arg Leu Leu Ala Leu Leu 660 665 670 Gly Asp Asn Ile Thr Thr Asp His Ile Ser Pro Ala Gly Ala Ile Lys 675 680 685 Glu Ser Ser Pro Ala Gly Lys Tyr Leu Glu Glu His Gly Val Ala Lys 690 695 700 Lys Gly Leu His Ser Tyr Gly Ser Arg Arg Gly Asn Asp Arg Val Met 705 710 715 720 Val Arg Gly Thr Phe Ala Asn Ile Arg Ile Lys Asn Glu Met Leu Pro 725 730 735 Gly Thr Glu Gly Gly Val Ser Lys His Phe Pro Asp Gly Lys Glu Gly 740 745 750 Ser Ile Tyr Asp Val Ala Met Glu Tyr Lys Lys Glu Gly Val Pro Leu 755 760 765 Val Val Ile Gly Gly Lys Glu Tyr Gly Met Gly Ser Ser Arg Asp Trp 770 775 780 Ala Ala Lys Gly Thr Leu Leu Leu Gly Val Arg Ala Val Ile Ala Glu 785 790 795 800 Ser Phe Glu Arg Ile His Arg Ser Asn Leu Val Gly Met Gly Val Leu 805 810 815 Pro Leu Leu Phe Glu Glu Gly Thr Thr Arg Lys Thr Leu Gly Leu Lys 820 825 830 Gly Asp Glu Thr Phe Glu Ile Arg Gly Leu Asp Lys Ile Thr Pro Arg 835 840 845 Met Thr Met Thr Met Thr Ile Thr Arg Ala Asp Gly Ser Lys Gln Asp 850 855 860 Val Pro Leu Leu Cys Arg Val Asp Thr Leu Asp Glu Val Glu Tyr Phe 865 870 875 880 Arg Asn Gly Gly Ile Leu Gln Thr Val Leu Arg Gly Met Thr Lys Ala 885 890 895 Ala <210> ５ <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Discription of Artificial sequence:primer <400> 5 gagagcgatt atgaaaacgg ttgggcaccg ataag 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Discription of Artificial sequence:primer <400> 6 tccagtcagc agcatggcat ctccagcgcc tgtgt 35

【００６６】

【配列表のフリーテキスト】配列番号５：プライマー 配列番号６：プライマー

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳｐｈＩを用いてクローニングされたアセトバ
クター・アセチ由来の遺伝子断片の制限酵素地図とアコ
ニターゼ遺伝子の位置、及びｐＡＣＯ１への挿入断片の
概略図。

【図２】ＳｐｈＩを用いてクローニングされたグルコン
アセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片の制限酵
素地図とアコニターゼ遺伝子の位置、及びｐＡＣＯ１１
への挿入断片の概略図。

【図３】アセトバクター・アセチ由来のアコニターゼ遺
伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す
図面。

【図４】グルコンアセトバクター・アンタニイ由来のア
コニターゼ遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の酢
酸含有培地での培養経過を示す図面。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:02）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の(a)又は(b)のタンパク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
   タンパク質。 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
   て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活
   性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 下記の(a)又は(b)のタンパク質。 (a)配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するタ
   ンパク質。 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
   て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活
   性を有するタンパク質。
3. 【請求項３】 下記の(a)又は(b)のタンパク質をコード
   するＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
   タンパク質。 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
   て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活
   性を有するタンパク質。
4. 【請求項４】 下記の(a)又は(b)のタンパク質をコード
   するＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するタ
   ンパク質。 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
   て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アコニターゼ活
   性を有するタンパク質。
5. 【請求項５】 下記の(a)又は(b)の塩基配列からなるＤ
   ＮＡ。 (a)列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５４
   〜３０６５からなるＤＮＡ。 (b)配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５
   ４〜３０６５からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該Ｄ
   ＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリ
   ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アコニ
   ターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
6. 【請求項６】 下記の(a)又は(b)の塩基配列からなるＤ
   ＮＡ。 (a)配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８
   ９〜３１７９からなるＤＮＡ。 (b)配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８
   ９〜３１７９からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該Ｄ
   ＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリ
   ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アコニ
   ターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項３，４，５又は６に記載のＤＮＡ
   を細胞内に含むアコニターゼ活性を有する微生物又は前
   記アコニターゼ活性を有しかつ酢酸耐性が増強された微
   生物。
8. 【請求項８】 微生物がアセトバクター属、又はグルコ
   ンアセトバクター属に属する酢酸菌であることを特徴と
   する請求項７に記載の微生物。
9. 【請求項９】 請求項７又は８に記載の微生物をアルコ
   ールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄
   積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。