HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA,
die die AatII Restriktionsendonuclease und
Modifikationsmethylase kodiert, sowie die Herstellung
dieser Enzyme von der rekombinanten DNA.
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Restriktionsendonucleasen des Typs II sind eine Klasse
von Enzymen, die in Bakterien natürlich vorkommen. Werden
sie aus anderen kontaminierenden Bakterienkomponenten
herausgereinigt, dann können Restriktionsendonucleasen im
Labor dazu verwendet werden, DNA-Moleküle in präzise
Fragmente für die molekulare Klonierung und
Gencharakterisierung zu spalten.
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Die Wirkungsweise von Restriktionsendonucleasen
besteht darin, daß sie bestimmte Nucleotidsequenzen (die
"Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül erkennen und
sich daran binden. Nach dem Anbinden spalten sie das
Molekül innerhalb oder an einer Seite der
Erkennungssequenz. Unterschiedliche
Restriktionsendonucleasen haben eine Affinität für
unterschiedliche Erkennungssequenzen. Mehr als
einhundertundfünfzig Restriktionsendonucleasen mit
einmaligen Spezifitäten wurden unter vielen hundert bisher
untersuchten Bakterienspezies identifiziert.
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Bakterien besitzen pro Spezies gewöhnlich höchstens
eine geringe Zahl von Restriktionsendonucleasen. Die
Endonucleasen werden typischerweise nach den Bakterien
benannt, von denen sie abstammen. Somit synthetisiert die
Deinococcus radiophilus Spezies zum Beispiel drei
verschiedene Restriktionsendonucleasen, die mit DraI, DraII
und DraIII bezeichnet werden. Diese Enzyme erkennen jeweils
die Sequenzen TTTAAA, PuGGNCCPy und CACNNNGTG und spalten
sie. Escherichia coli RY13, andererseits, synthetisiert nur
ein Enzym, EcoRI, das die Sequenz GAATTC erkennt.
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Ohne uns durch die Theorie zu binden, vermuten wir,
daß Restriktionsendonucleasen in der Natur eine
Schutzfunktion zugunsten der Bakterienzelle haben. Sie
ermöglichen es, daß Bakterien einer Infektion durch Fremd-
DNA-Moleküle wie Viren und Plasmide widerstehen können, die
sie ansonsten zerstören oder befallen würden. Sie verleihen
Widerstandsfähigkeit, indem sie sich an eindringende Fremd-
DNA-Moleküle binden und sie stets dann spalten, wenn die
Erkennungssequenz erfolgt. Durch die stattfindende Spaltung
werden viele der infizierenden Gene deaktiviert und die DNA
wird für eine weitere Zerlegung durch unspezifische
Endonucleasen anfällig.
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Eine zweite Komponente des bakteriellen Schutzsystems
sind die Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme ergänzen
Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, mit dem
Bakterien ihre eigene DNA schützen und sie von
infizierender Fremd-DNA unterscheiden können.
Modifikationsmethylasen erkennen die gleiche Nucleotid-
Erkennungssequenz wie die entsprechende
Restriktionsendonuclease und binden sich daran an; anstatt
jedoch die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch das
eine oder andere Nucleotid in der Sequenz durch Hinzufügen
einer Methylgruppe. Nach der Methylierung wird die
Erkennungssequenz nicht mehr durch die
Restriktionsendonuclease gebunden oder gespalten. Die DNA
einer Bakterienzelle wird aufgrund der Aktivität ihrer
Modifikationsmethylase stets völlig modifiziert. Sie ist
daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen
Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Nur
unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA ist
gegenüber Restriktionsendonucleasenerkennung und -spaltung
empfindlich.
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Mit der Ankunft der Gentechnologie ist es nun möglich,
Gene zu klonen und die von ihnen kodierten Proteine und
Enzyme in größeren Mengen zu produzieren, als durch
konventionelle Reinigungsmethoden gewonnen werden können.
Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von
Restriktionsendonucleasegenen besteht darin, ein einfaches
und zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung solcher
Klone innerhalb komplexer "Bibliotheken", d. h. Populationen
von durch "Shotgun"-Verfahren abstammenden Klonen, zu
entwickeln, wenn sie in geringen Frequenzen wie zwischen 10&supmin;
³ und 10&supmin;&sup4; vorkommen. Das Verfahren sollte vorzugsweise
selektiv sein, so daß die unerwünschte Mehrzahl von Klonen
zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone
überleben.
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Restriktions-Modifikationssysteme des Typs II werden
mit zunehmender Häufigkeit kloniert. Die ersten klonierten
Systeme nutzten Bakteriophageninfektivn, um
Restriktionsendonucleaseklone zu identifizieren oder zu
selektieren (EcoRII: Kosykh et al., Molec. gen. Genet 178:
717-719, (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97-112,
(1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78 1503-
1507, (1981)). Da durch die Anwesenheit von Restriktions-
Modifikationssystemen in Bakterien diese einer Infektion
durch Bakteriophagen widerstehen können, können Zellen, die
klonierte Restriktions-Modifikationsgene tragen, im Prinzip
als Überlebende selektiv von Bibliotheken isoliert werden,
die einem Phage ausgesetzt wurden. Es wurde jedoch
gefunden, daß diese Methode nur von begrenztem Nutzen ist.
Insbesondere wurde gefunden, daß klonierte Restriktions-
Modifikationsgene nicht immer eine ausreichende Phagen-
Beständigkeit aufweisen, um selektiven Fortbestand zu
gewähren.
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Ein anderes Klonierungsverfahren beinhaltet das
Übertragen von Systemen, die anfänglich als plasmidgetragen
charakterisiert sind, in E. coli Klonierungsplasmide (EcoRV:
Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12: 3659-3676 (1984);
PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:
402-406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355-359 (1982);
PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509
(1985)).
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Ein dritter Ansatz, der zum Klonen einer wachsenden
Zahl von Systemen benutzt wird, werden jetzt durch
Selektion nach einem aktiven Methylasegen geklont (siehe
unsere EPO Nr. 193,413, veröffentlicht am 3. September 1986
und BsuRI: Kiss et al., Nuc. Acid. Res. 13: 6403-6421
(1985)). Da Restriktions- und Modifikationsgene häufig eng
verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert
werden. Bei dieser Selektion wird jedöch nicht immer ein
komplettes Restriktionssystem erhalten, sondern stattdessen
nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10:
219-225 (1980); Bcn I: Janulaitis et al., Gene 20: 197-204
(1982); Bsu RI: Kiss und Baldauf, Gene 21: 111-119 (1983);
und Msp I: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235-1241
(1983)).
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In einigen Systemen besteht ein mögliches
Klonierungsproblem in dem Versuch, das Endonucleasegen in
einen Wirt einzubringen, der noch nicht durch Modifikation
geschützt wurde. Werden das Methylasegen und das
Endonucleasegen auf ein gemeinsames DNA-Fragment
eingeführt, so muß das Methylasegen den Wirt modifizieren
oder schützen, bevor das Endonucleasegen das Genom des
Wirts spaltet.
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Ein weiteres Hindernis für das Klonen dieser Systeme
in E. coli wurde im Klonierungsprozeß verschiedener
Methylasen entdeckt. Viele E. coli Stämme (einschließlich
der normalerweise beim Klonen verwendeten) haben Systeme,
die der Einführung von Cytosinmethylierung enthaltender DNA
standhalten (Raleigh und Wilson, Ptoc. Natl. Acad. Sci.,
USA 83: 9070-9074, (1986)). Es muß daher auch sorgfältig
abgewägt werden, welche(r) E. coli Stamm/Stämme für die
Klonierung eingesetzt wird/werden.
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Wenn fremde Restriktions-Modifikationssysteme kloniert
und in E. coli eingeführt werden, dann ist der
Endonucleasenertrag im Vergleich zum nativen
endonucleaseproduzierenden Stamm manchmal sehr gering, was
wahrscheinlich in einer ineffizienten Transkription oder
Translation des Gens in E. coli begründet ist. In einigen
Fällen wachsen E. coli Zellen, die ein klöniertes
Restriktions-Modifikationssystem tragen, schlecht, was
wahrscheinlich die Folge eines unzureichenden
Methylierungsschutzes und einer unregulierten konstitutiven
Expression des Restriktionsendonucleasegens ist. Ein straff
reguliertes Expressionssystem wäre daher wünschenswert, um
in E. coli toxische Gene wie Restriktionsendonucleasegene
auszuprägen.
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Es wäre ein Expressionssystem wünschenswert, das ein
Mindestmaß an Endonuclease unter nichtinduzierten
Bedingungen und große Mengen der gewünschten Endonuclease
auf eine Induktion hin produzieren würde. Auf diese Weise
können fremde Restriktions-Modifikationssysteme im E. coli
Wirt beständig aufrechterhalten werden.
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Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und, in
geringerem Umfang, Modifikationsmethylasen nützliche
Werkzeuge für die Charakterisierung von Genen im Labor
sind, gibt es einen kommerziellen Anreiz für die Erzeugung
von Bakterienstämmen durch rekombinante DNA-Techniken, die
diese Enzyme im Überfluß synthetisieren. Solche Stämme
wären nützlich, da sie die Aufgabe der Reinigung
erleichtern und das Mittel zur Produktion in kommerziell
nützlichen Mengen bereitstellen würden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA,
die die Gene für die AatII Restriktionsendonuclease und
Modifikationsmethylase, erhältlich von Acetobacter aceti,
kodiert, sowie verwandte Verfahren für die Herstellung des
AatII Restriktionsenzyms von der rekombinanten DNA. Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen
transformierten Wirt, der die Restriktionsendonuclease
AatII ausprägt, ein Enzym, das die DNA-Sequenz 5'-GACGTC-3'
erkennt und zwischen T und C auf beiden DNA-Strängen
spaltet, um einen 4 Basen 3 Überhang zu hinterlassen
(Sugisaki, H. et al. Nucl. Acids Res. 10: 5747-5752). AatII
Endonuclease, die gemäß der vorliegenden Erfindung
produziert wird, ist im wesentlichen rein und frei von
Kontaminanten, die normalerweise in
Restriktionsendonucleasepräparaten zu finden sind, die
durch konventionelle Techniken wie im 1. Beispiel
beschrieben hergestellt werden.
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Ein bevorzugtes Verfahren zum Klonen des AatII
Restriktions-Modifikationssystems umfaßt die folgenden
Schritte: Auswählen eines geeigneten Vektors, Bilden
verschiedener Bibliotheken, die DNA von Acetobacter aceti
enthalten, Isolieren solcher Klone, die DNA-Kodierung für
die AatII Modifikationsmethylase enthalten, Klonen
zusätzlicher chromosomaler DNA neben dem Methylasegen mit
einem Vektor, Screenen nach solchen Klonen, die AatII
Endonuclease produzieren, Kartieren der aatIIR und aatIIM
Gene auf dem Klon (aatIIR und aatIIM, jeweilige
Genkodierung für AatII Endonuclease und AatII Methylase),
Bestimmen der DNA-Sequenzen der aatIIR und aatIIM Gene und
Überexpression der aatIIR und aatIIM Gene in E. coli.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Fig. 1 zeigt ein Schema zum Klonen und Produzieren der
AatII Restriktionsendonuclease.
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Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz des aatIIM Gens (SEQ ID
Nr.: 11) und seine kodierte Proteinsequenz (SEQ ID Nr.:
12).
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Fig. 3 zeigt die DNA-Sequenz des aatIIR Gens (SEQ ID
Nr.: 13) und seine kodierte Proteinsequenz (SEQ ID Nr.:
14).
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Fig. 4 zeigt IPTG-induzierte und nichtinduzierte
Zellextrakte und gereinigtes AatII Endonucleaseprotein. Die
Pfeile A und B weisen jeweils auf das AatII
Endonucleaseprotein und Rinderserumalbumin (BSA) hin.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA,
die die AatII Restriktionsendonuclease und
Modifikationsmethylase kodiert, sowie ein Verfahren zur
Herstellung von AatII Restriktionsendonuclease von einer
solchen rekombinanten DNA.
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Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem das AatII
Restriktionsgen und Methylasegen vorzugsweise kloniert und
ausgeprägt werden, ist in Fig. 1 illustriert und umfaßt die
folgenden Schritte:
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1. Die genomische DNA von Acetobacter aceti wird
gereinigt.
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2. Die DNA wird teilweise mit einer
Restriktionsendonuclease wie HindIII oder einem ihrer
Isoschizomere abgebaut, wodurch (ein) DNA-Fragment(e)
erzeugt wird/werden, das/die das gesamte AatII Methylasegen
enthält/enthalten. Alternativ könnte eine Bibliothek
aufgebaut werden, die das gesamte Restriktions-
Modifikationssystem enthält, wie die NdeI-Genombank (zu
Schritt 7 übergehen). Das/die Fragment(e) sollte(n) auch
eine klonierbare Größe zwischen 1,5 und 14 kb haben.
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3. Die HindIII-abgebaute genomische DNA wird mit dem
Klonierungsvektor pUCIS ligiert. Die resultierenden
Gemische werden dazu verwendet, einen geeigneten Wirt, d. h.
einen hsdR&supmin;, mcrBC&supmin; mrr&supmin; Stamm, wie zum Beispiel E. coli
Stamm RR1 zu transformieren. Die DNA-/Zellgemische werden
auf ampicillin-selektives Medium für transformierte
Zellen aufgebracht. Nach der Inkubation werden die
transformierten Zellkolonien geerntet, um die
Primärzellbibliotheken zu bilden. Wie oben beschrieben,
wurden insgesamt 10 solcher Primärzellbibliotheken mit
einem kompletten oder teilweisen Abbau der Acetobacter
aceti DNA durch die jeweilige Klonierungsendonuclease und
Wirtsstämme konstruiert.
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4. Die rekombinanten Plasmide werden in toto von den
Primärzellbibliotheken gereinigt, um
Primärplasmidbibliotheken herzustellen. Die gereinigten
Plasmidbibliotheken werden dann in vitro komplett mit AatII
Endonuclease, die von Acetobacter aceti Zellen präpariert
wird, oder mit irgendeinem AatII Isoschizomer abgebaut. Der
AatII Endonucleasenabbau verursacht die selektive
Zerstörung von unmodifizierten Klonen, die keine Methylase
enthalten, was in einer Zunahme der relativen Frequenz von
Klonen resultiert, die AatII Methylase tragen.
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5. Identifizierung von AatII Methylaseklonen: Die
abgebaute Plasmidbibliothek-DNA wird zurück in einen Wirt
wie E. coli Stamm RR1 transformiert, und transformierte
Kolonien werden wieder durch Aufbringen auf Ampicillin-
Platten erhalten. Die Kolonien werden aufgenommen, und ihre
DNA wird auf Anwesenheit des AatII Methylasegens hin
analysiert, indem gereinigte Plasmid-DNA in vitro mit AatII
Endonuclease inkubiert wird, um zu bestimmen, ob sie gegen
AatII Abbau resistent ist.
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6. Sobald festgestellt wird, daß das Methylasegen
kloniert wurde, wird der Klon auf AatII
Endonucleasenaktivität hin untersucht. Wird Aktivität
nachgewiesen, dann ist das AatII Restriktionsgen mit dem
Methylasegen gekoppelt und in dem Klon anwesend. In diesem
Fall könnte man zu Schritt 10 unten übergehen. Gemäß der
vorliegenden Erfindung wurde jedoch keine
Restriktionsaktivität festgestellt. Das Fehlen von
Restriktionsaktivität weist darauf hin, daß das
Restriktionsgen entweder nicht mit dem Methylasegen
gekoppelt ist, oder daß es mit dem Methylasegen gekoppelt,
aber nicht intakt kloniert ist, oder daß es intakt
kloniert, aber nicht ausgeprägt ist, oder daß das gesamte
System kloniert wurde, aber die Expression des
Methylasegens nicht ausreicht, um einen vollständigen
Schutz vor Restriktionsendonuclease zu bieten, so daß die
einzigen Klone, die die Selektion überleben, eine spontane
Mutation oder Deletion in dem Endonucleasegen erfahren
haben. Um zu bestimmen, welche der obigen Möglichkeiten
vorliegt, wird das klonierte Fragment restriktionskartiert
und es werden Deletionen vorgenommen, um die relative
Position des Methylasegens in dem klonierten Fragment zu
bestimmen. Mit dieser Information wird dann bestimmt, ob
genügend DNA auf beiden Seiten des Methylasegens vorhanden
ist, um ein Restriktionsgen zu kodieren, wenn sie gekoppelt
sind. Wenn genügend DNA vorhanden ist, dann wird davon
ausgegangen, daß das Restriktionsgen nicht gekoppelt ist,
oder in dem Klon vorhanden, aber nicht ausgeprägt ist (zu
Schritt 10 übergehen). Ist nicht genügend DNA auf beiden
Seiten des Methylasegens in der klonierten DNA vorhanden,
um ein gekoppeltes Restriktionsgen zu kodieren, wie beim
HindIII Klon p(UC)AatIIM18 der vorliegenden Erfindung
festgestellt wurde, dann wird ein Teil des Methylasegens
dazu verwendet, Abbauprodukte des Acetobacter aceti
Chromosoms zu sondieren, um durch Southern-Hybridisierung
eine genomische Karte der Region zu erzeugen, die über die
Grenzen der existierenden klonierten DNA hinausgeht. Diese
Daten sind bei der Identifizierung bestimmter Endonucleasen
wie NdeI behilflich, die die Restriktions-
Modifikationsregion in individuelle Fragmente spalten, die
das Methylasegen sowie größere Mengen an benachbarter DNA
tragen. Die exakten Größen der von solchen Endonucleasen
erzeugten Fragmente werden ebenfalls anhand der Daten
errechnet. Wird festgestellt, daß die Restriktions- und
Modifikationsgene gekoppelt sind, dann würden solche
Fragmente vermutlich ebenfalls das Restriktionsgen
kodieren.
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7. Angereicherte Bibliotheken werden dadurch
konstruiert, daß Acetobacter aceti DNA mit NdeI abgebaut
wird und die erzeugten Fragmente mit einem geeigneten
Vektor wie pUC19 ligiert werden. Klone, die DNA, das
Methylasegen sowie die angrenzenden Regionen tragen, können
durch Methylaseselektion isoliert werden (EPO Nr.: 193,413,
veröffentlicht am 3. September 1986 und BsuRI. Kiss et al.,
Nucl. Acid. Res. 13: 6403-6421 (1985)).
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8. Identifizierung von Restriktionsgenklonen: Nach der
Methylaseselektion und -transformation werden die
ampicillinresistenten Transformanten nach DNA-Inserts
gescreent, die über die Grenzen des existierenden
Methylaseklons hinausgehen. Sobald solche Klone
identifiziert sind, werden Rohzellextrakte von diesen
Klonen präpariert, die Zellextrakte werden durch serielle
Dilutierung verdünnt und auf AatII Endonucleasenaktivität
hin untersucht. Klone, die aatIIM und aatIIR Gene tragen,
werden durch eine AatII Endonucleasenaktivitätsprüfung
ihrer Zellextrakte und ihre Fähigkeit, Vektor-Backbone-
Resistenz gegenüber AatII Endonucleasespaltung zu
übertragen, identifiziert.
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9. Die Region, die aatIIR und aatIIM Gene enthält,
wird durch Deletionskartierung und Subklonierung kartiert,
und die DNA-Sequenz wird anhand des
Didesoxynucleotidterminationsverfahrens bestimmmt (Sanger,
F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1977, 74: 5463-5467).
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10. Überexpression: Ein bevorzugter Ansatz für die
Überexpression von AatII Restriktionsendonuclease und/oder
anderen Restriktionsendonucleasen umfaßt die folgenden
Schritte: 1) Konstruieren eines Mutantenplasmids mit
erhöhter Kopienzahl, das zum Beispiel den pSC101
Replikationsstartpunkt enthält, und Klonen des aatIIM Gens
oder eines anderen Methylasegens in das oben hergestellte
Plasmid mit mittlerer Kopienzahl, um einen E. coli Wirt zu
prämodifizieren und zu schützen. Das aatIIM Gen (oder
andere Methylasegene) wird vom lac-Promoter ausgeprägt. 2)
Für aatIIR kann das Restriktionsendonucleasegen hinter
einem T7lac-Promoter auf einem Expressionsvektor eingefügt
werden, wie pSYX22 (die Konstruktion von pSYX22 wird im 1.
Beispiel ausführlich beschrieben). Dies kann dadurch
erreicht werden, daß Restriktionsorte in Primer eingebaut
werden, um das Endonucleasegen durch Polymerase-
Kettenreaktion zu verstärken (Saiki, R. K. et al. Science
230: 1350-1354), oder daß Restriktionsorte am Anfang und am
Ende des Endonucleasegens durch ortsgerichtete Mutagenese
eingeführt werden (Kunkel, T. A. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 82: 488-492. (1985)). Darüber hinaus kann eine starke
Ribosomen-Bindungsstelle (Shine & Dalgarno, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 71, 1342-1346 (1974)) vor das Gen gesetzt
werden, um die Translationseffizienz zu erhöhen. Andere
Promoter, die für die Endonucleasenexpression eingesetzt
werden können, sind Plac, PlacUVS, Ptac, PR, T3 und λPL auf pUC19
und pBR322 Derivaten. Diese Promoter werden unter
nichtinduzierten Bedingungen jedoch nicht fest reprimiert
und erbringen daher ein geringes Induktionsverhältnis.
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Die DNA-Sequenz der aatIIR und aatIIM Gene kann durch
konventionelle Phosphoramidit- oder Phosphotriester-Chemie
unter Verwendung von Codonen synthetisiert werden, die in
E. coli wirksamer genutzt werden. (Applied Biosystems
Benutzer-Mitteilungen Nr. 13, 1988; Usman, N. et al., J.
Am. Chem. Soc. 109: 7845-7854, 1987).
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11. AatII Produktion und Reinigung: Die AatII
Methylase oder Endonuclease kann von Klonen produziert
werden, die das AatII Methylasegen (oder eine heterologe
Methylase) und das überexpressionierte
Restriktionsendonucleasegen tragen, durch Vermehrung in
einem Fermenter in einem reichhaltigen Medium mit.
Antibiotika, wie zum Beispiel Ampicillin, Chloramphenicol
und Kanamycin. Anschließend werden die Zellen durch
Zentrifugation geerntet und durch Beschallung gesprengt, um
einen Rohzellextrakt herzustellen, der AatII Methylasen-
und Restriktionsendonucleasenaktivität enthält. Der
Rohzellextrakt mit AatII Methylase und Endonuclease wird
durch standardmäßige Proteinreinigungstechniken wie
Affinitätschromatographie, Gelfiltration oder
Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
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Anhand des folgenden Beispiels werden die
Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung illustriert, die
in der Praxis derzeit bevorzugt werden. Es ist zu
verstehen, daß dieses Beispiel illustrativ ist und daß die
Erfindung nicht als darauf beschränkt anzusehen ist,
ausgenommen durch die Angaben in den anhängigen Ansprüchen.
1. BEISPIEL
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1. Klonen des AatII Restriktions- und
Modifikationssystems: Das aatIIM Gen wurde zunächst durch
Methylaseselektion in ein Hindlil Fragment kloniert, indem
eine Plasmidbibliothek einer AatII Endonuclease ausgesetzt
und nach der Transformation nach Überlebenden gesucht
wurde. Später wurde entdeckt, daß nur ein Teil des aatIIR
Gens in diesem HindIII Insert präsent war. Die
Restriktionskartierung der genomischen Acetobacter aceti
DNA wies darauf hin, daß ein NdeI Fragment an einem Ende
der DNA neben dem aatIIM Gen verlaufen sollte. Das AatII
Restriktions-Modifikationssystem, aatIIR und aatIIM Gene,
wurde in ein Ndel Restriktionsfragment im pUC19 Vektor
durch das Methylasenselektionsverfahren kloniert. Dieser
Klon erhielt die Bezeichnung p(UC)AatIIR&spplus;M&spplus;18 und erbringt
2000 Einheiten von AatII Endonuclease pro Gramm nasser
E. coli Zellen. p (UC) AatIIR&spplus;M&spplus;21 enthält das gleiche NdeI
Insert, allerdings in entgegengesetzter Ausrichtung.
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2. Restriktionskartierung der aatIIM und aatIIR Gene:
Die aatIIM und aatIIR Gene wurden wie folgt kartiert: Es
sind zwei XbaI Orte (etwa 300 bp auseinander) im 5500-bp
NdeI Fragment-Insert und ein XbaI Ort in der
Mehrfachklonierungsstelle von pUC19 vorhanden. Es wurde ein
XbaI Fragment-Deletionssubklon (eine Deletion von etwa 1000
bp) konstruiert, der die beiden XbaI Restriktionsfragmente
herausdeletierte. Zwei ug von p(UC)AatIIR&spplus;M&spplus;18 wurden mit 20
Einheiten von XbaI in einem 1X Restriktionspuffer (50 mM
Nacl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol) in
50 ul bei 37ºC über einen Zeitraum von 1 Stunde abgebaut.
Die abgebaute DNA wurde mit einem gleichen Volumen von
Phenol-CHCl&sub3; und CHCl&sub3; extrahiert und mit Ethanol
präzipitiert und getrocknet. 0,2 ug der resultierenden DNA
wurden mit T4 DNA Ligase einem 50 ul in einem 1x
Ligationspuffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM
Dithiothreitol, 1 mM ATP 25 ug/ml Rinderserumalbumin) bei
16ºC über Nacht ligiert. Die ligierte DNA wurde durch Zugabe
eines gleichen Volumens von steril-destilliertem Wasser
verdünnt. 10 ul der verdünnten DNA wurden mit 0,1 ml ER1821
Δ(hsd-mrr-mcrBC) kompetenten Zellen vermischt und bei 4ºC 30
Minuten lang, bei 42ºC 3 Minuten lang inkubiert. Nach der
Zugabe von 0,1 ml LB-Medium und einer Inkubation bei 37ºC
über einen Zeitraum von 1 Stunde wurde das Zell/DNA-Gemisch
auf eine LB-Agarplatte plus 50 ug/ml Ampicillin (Ap)
aufgebracht und über Nacht bei 37ºC inkubiert. 12
individuelle ampicillinresistente (APr) Transformanten
wurden aufgenommen und in 2 ml LB plus Ap inokuliert und
über Nacht bei 37ºC geschüttelt. 1,5 ml Zellen wurden
jeweils in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen zentrifugiert,
um Plasmid-DNA durch ein Mini-Reinigungsverfahren
herzustellen, adaptiert vom Verfahren von Birnboim und Doly
(Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523 (1979)).
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Plasmid-Mini-Präparationsverfahren: 1,5 ml Übernacht-
Kultur wurden bei 6.000 xg 3 Minuten lang pelletiert. Das
Supernatant wurde abgegossen und das Zellpellet in 0,2 ml
25 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, 20
ug/ml RNaseA resuspendiert. Nach fünf Minuten bei
Raumtemperatur wurden 0,2 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zugegeben,
und das Röhrchen wurde zum Auflösen der Zellen umgedreht.
Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur wurden 0,15 ml 3 M
Natriumacetat, pH-Wert 4,8, zugegeben und für eine gute
Durchmischung umgedreht. Das sich ausbildende Präzipitat
wurde bei 12.000 xg und 4ºC 10 Minuten lang zentrifugiert.
Das Supernatant wurde entfernt und mit einem gleichen
Volumen Phenol/Chloroform (1 : 1) extrahiert. Die Schichten
wurden durch Zentrifugieren bei 12.000 xg über einen
Zeitraum von fünf Minuten getrennt. Die obere Phase wurde
in ein neues Zentrifugenröhrchen gegeben und mit einem
gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die DNA wurde mit
0,9 ml 95%igem Ethanol vermischt. Das Röhrchen wurde bei
12.000 xg 10 Minuten lang geschleudert, um die
präzipitierten Nucleinsäuren zu pelletieren. Das
Supernatant wurde entsorgt, und das Pellet wurde wieder mit
1 ml 70%igem Ethanol gewaschen, erneut pelletiert und 15
Minuten lang unter Vakuum getrocknet. Sobald es trocken
war, wurde das Pellet in 100 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl,
1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) resuspendiert.
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Zwölf Plasmid-DNAs wurden durch XbaI
Endonucleasenabbau und Agarose-Gelelektrophorese
analysiert, um die XbaI Deletion zu überprüfen. Alle
enthielten eine Deletion mit korrekter Größe. Der XbaI
Deletionsklon, p(UC)AatIIM&spplus;(XbaIΔ), enthielt immer noch das
intakte aatIIM Gen, da die Plasmid-DNA, wenn sie der AatII
Endonuclease ausgesetzt wird, gegen AatII Spaltung
resistent ist. Um die Größe des aatIIM Gens weiter zu
beschränken, wurde ein Eco0109I Fragment zwischen dem
Eco0109I Ort auf dem Vektor und einem EcoOlOSI Ort auf dem
verbleibenden Insert deletiert. Diese Deletion war auf die
gleiche Weise wie die XbaI Deletion konstruiert, mit der
Ausnahme, daß Eco0109I Enden zuerst mit Klenow-Fragment von
E. Coli DNA-Polymerase I aufgefüllt und dann selbst-ligiert
würden. Der resultierende Eco0109I Deletionsklon war
teilweise resistent gegen AatII Endonucleasenabbau, was
darauf hinwies, daß das aatIIM Gen noch immer im Klon
enthalten war. Der XbaI Deletionsklon und der Eco0109I
Deletionsklon definierten aatIIM innerhalb eines DNA
Fragmentes von etwa 1800 bp. Der XbaI Deletionsklon wurde
auch auf AatII Endonucleasenaktivität hin untersucht, um zu
sehen, ob er das intakte aatIIR Gen enthielt.
Rohzellextrakt wurde wie folgt präpariert: 200 ml LB plus
Ap wurden mit 2 ml Zellen, die über Nacht vermehrt wurden,
inokuliert und bei 37ºC über Nacht geschüttelt. Die Zellen
wurden zentrifugiert und das Zellpellet in 20 ml
Beschallungspuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM β-Mercaptoethanol)
resuspendiert, zehn Mal in 30-Sekunden-Schüben beschallt,
bei 15.000 xg 30 Minuten lang zentrifugiert, um Zellreste
zu entfernen. 1 ul, 2 ul, 4 ul und 8 ul Zellextrakt wurden
mit 1 ug λ-DNA bei 37ºC eine Stunde lang in 30 ul in einem
1x AatII Restriktionspuffer (50 mM Kaliumacetat, 20 mM
Tris-Acetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol)
inkubiert. Es wurden drei ul Stopplösung zugegeben, und die
DNA wurde per Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Es
wurde keine AatII Endonucleasenaktivität im XbaI
Deletionsklon festgestellt, was darauf hinwies, daß ein
Teil des Endonucleasegens deletiert war.
-
Um die Grenzen des aatIIR Gens zu kartieren, wurde das
aatIIM Gen zunächst in einen Vektor pR976 kloniert, ein
pACYC184 Derivat, das Ptac und Mehrfachklonierungsstellen
enthielt (konstruiert von Paul Riggs, New England Biolabs,
Beverly, MA). Ein 3000 bp PstI Fragment, das das aatIIM Gen
enthielt, wurde in den PstI Ort von pR976 eingefügt. Das
resultierende Plasmid, pR976AatIIM&spplus;, wurde in den E. coli
Stamm ER1821 Δ(hsd-mrr-mcrBC) transformiert.
Deletionssubklone wurden in den vormodifizierten ER1821
[p(R976)AatIIM&spplus;] transformiert, um zu sehen, ob sie intaktes
aatIIR Gen enthalten.
-
Es gibt zwei HincII Orte in p(UC)AatIIR&spplus;M&spplus;18, einen in
den Mehrfachklonierungsstellen des Vektors und einen im
Insert. Eine HincII Deletion, eine Deletion von etwa 4500
bp, war auf die gleiche Weise wie der XbaI Deletionsklon
konstruiert. Als dieses Plasmid in ER1821 [p(R976)AatIIM&spplus;]
Zellen transformiert wurde und Zellextrakte von den
Transformanten präpariert wurden, wurde keine AatII
Endonucleasenaktivität festgestellt. Ein weiteres
Deletionsklon enthielt eine EcoRV/SmaI Fragmentdeletion,
die etwa 4200 bp DNA deletierte. Dieser Deletionsklon
zeigte AatII Endonucleasenaktivität im Rohzellextrakt.
Diese Ergebnisse zeigten, daß sich das aatIIR Gen innerhalb
eines DNA Fragmentes von etwa 1300 bp befand.
-
3. DNA-Sequenzanalyse der aatllM und aatIIR Gene: Um
die DNA-Region zu sequenzieren, die die aatIIM und aatIIR
Gene enthielt, wurden vier weitere Deletionssubklone (BamHI
Fragmentdeletion, EcoRI Fragmentdeletion, HindIII
Fragmentdeletion und PstI Fragmentdeletion) auf die gleiche
Weise wie für die ThaI Fragmentdeletion durch die jeweilige
Endonucleasespaltung und Selbst-Ligation konstruiert.
Insgesamt 3365 bp DNA wurden auf beiden Strängen mit der
Sanger-Didesoxy-Terminationssequenzierungsmethode
sequenziert (Sanger, F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74: 5463-5467). Zwei große offene Leseraster, jeweils 996
bp und 1038 bp, wurden in der Region entdeckt, in der die
aatIIM und aatIIR Gene kartiert waren. Das Subklonen des
offenen 996 bp Leserasters in einem Plasmid erbrachte eine
AatII Ortsmodifikation, so daß dieses offene Leseraster dem
aatIIM Gen zugeordnet wurde (Fig. 2 und SEQ ID Nr.: 11).
Die vorhergesagte Aminosäuresequenz des aatIIM Gens (SEQ ID
Nr.: 12) zeigte, daß sie konservierte Motive für die N-6-
Adenin-Methylasen (Motive DPPY und DPF-GSG-T) enthielt. Das
Subklonen des offenen 1038 bp Leserasters in einem Plasmid
und Transformieren in AatII methylasemodifizierte Zellen
erbrachte AatII Endonucleasenaktivität im Rohzellextrakt.
Dieses offene Leseraster wurde somit dem aatIIR Gen
zugeordnet (Fig. 3 und SEQ ID Nr.: 13, kodiert
Aminisäuresequenz SEQ ID Nr.: 14).
-
4. Überexpression des aatIIR Gens in E. coli:
-
A. Expression des aatIIm und aatIIR Gens unter λPL -
Promoter: Ein BspEI/NdeI DNA-Fragment, das die aatIIM und
aatIIR Gene enthielt, wurde in Expressionsvektor pDNEV5
kloniert, ein Derivat von pUC19, der den λPL-Promoter und
das temperaturempfindliche λ-Repressorgen cI&sub8;&sub5;&sub7;, enthält
(pDNEV5 konstruiert von Donald Nwankwo, New England
Biolabs, Beverly, MA). Das resultierende Plasmid erhielt
die Bezeichnung p (DNEV5)AatIIR&spplus;M&spplus;. ER1821 [p(DNEV5)AatIIR&spplus;M&spplus;]
Zellen ergeben 40.000 Einheiten AatII Endonuclease pro
Gramm nasser Zellen nach einer Induktion bei 43ºC über
Nacht. Der Ertrag liegt 20 mal über dem nativen Acetobacter
aceti Stamm. Dieser Überproduktionsstamm ist jedoch nicht
stabil. Er wuchs nur schlecht in einem 100-Liter-Fermenter,
und einige Zellen wurden in der Kultur aufgelöst. Aus
diesem Grund wurde versucht, stabilere Klone zu
konstruieren.
-
B. Expression des aatIIR Gens unter Ptac-Promoter: Um
den AatII Endonuclease produzierenden Klon zu
stabilisieren, wurde das in einem PstI/NdeI Fragment
enthaltene aatIIM Gen in pUC19 subkloniert. Die vier AatII
Orte in dem resultierenden Plasmid, p(UC)AatIIM&spplus;(PstI/NdeI),
wurden durch die AatII Methylase vollständig modifiziert.
Ein das aatIIR Gen tragende EcoRI Restriktionsfragment
wurde in ein kompatibles Expressionsplasmid pR976 unter Ptac-
Promoter- und Lac-Repressorkontrolle kloniert. Als E. coli
Zellen ER2267 [p(UC)AatIIM&spplus;(PstI/NdeI), p(R976) -
AatIIR&spplus;(EcoRI/EcoRI)] durch die Zugabe von 0,5 mM IPTG in
eine 1-Liter-Zellkultur induziert wurden, lag der AatII
Endonucleasenertrag bei 10.000 Einheiten pro Gramm nasser
Zellen, eine Sfache Überexpression im Vergleich zum nativen
Acetobacter aceti Stamm. Als die Kultur jedoch auf einen
100-Liter-Fermenter übertragen wurde, fiel der Ertrag auf
2000 Einheiten pro Gramm nasser Zellen. Der Grund für die
Minderleistung bei einem Scale-up ist nicht bekannt.
-
C. Expression des aatIIR Gens unter PlacUV5-Promoter auf
Expressionsvektor pRRS: 1) Klonen des aatIIM Gens in
pWSK129. Das Plasmid pWSK129 ist ein Plasmid mit niedriger
Kopienzahl, das das Kanamycin-Resistenz-(Kanr)-Gen und den
pSC101 Replikationsstartpunkt enthält, der mit dem ColEI
Startpunkt kompatibel ist, der auf pUC19- und pBR322-
stämmigen Vektoren getragen wird (Wang R. F. und Kushner,
S. R. Gene, 100: 195-199, 1991). Das Plasmid pWSK129 enthält
außerdem Mehrfachklonierungsstellen, die von T7 und T3 RNA-
Polymerase-Promoter flankiert werden. Das aatIIM Gen wurde
durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) von p (UC) AatIIR&spplus;M&spplus;21
unter Verwendung von zwei Primern verstärkt (Primer 1 hat
einen BamHI Ort in der Nähe des 5' Endes: 5' CGG GAT CCG GAG
GAA TAA AAT GAC CGC TCG TCC 3' SEQ ID Nr.: 1; Primer 2
enthält einen PstI Ort in der Nähe des 5' Endes: 5' CCT TAA
CTG CAG TCA TTT GTT GAT ATC CAG AG 3' SEQ ID Nr. 2). Die
PCR-Produkte wurden gereinigt und mit BamHI und PstI
gespalten und mit BamHi/PstI-abgebautem pWSK129 ligiert.
Die ligierte DNA wurde verwendet, um E. coli ER2206 Zellen
zu transformieren, und die Transformanten wurden nach
Kanamycin-Resistenz ausgewählt. Achtzehn individuelle
Transformanten wurden in bezug auf aatllm Insert in Mini-
Präparations-Plasmid-DNA gescreent. Elf Transformanten
enthielten ein Insert mit der korrekten Größe, und das
resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung
p(WSK129)AatIIM&spplus;. Das Plasmid ist gegen AatII Abbau
resistent, was auf eine vollständige Modifikation durch
AatII Methylase hinweist. 2) Klonen des aatIIR Gens in
Expressionsvektor pRRS2: Der Expressionsvektor pRRS ist ein
pUC19-stämmiger Vektor, der einen lacUV5-Promoter, eine
Mehrfachklonierungssequenz und ein positives
Retroregulator-"Bäumchen"-Element hinter der
Mehrfachklonierungsstelle enthält (Skoglund C. M. et al.
Gene, 88: 1-5, (1990)). Ein pRRS-Derivat, pRRS2, wurde
dadurch konstruiert, daß der EcoRI Ort distal zum lacUV5-
Promoter aufgefüllt und ein neuer EcoRI Linker in den
HindIII Ort proximal zum Promoter eingefügt wurde. Zur
Verstärkung des aatIIR Gens von p(UC)AatIIR&spplus;M&spplus;21 wurden zwei
Primer verwendet. Primer 1 enthielt einen EcoRI Ort und
eine Ribosomen-Bindungsstelle (5' CTG AAT TCG GAG GTT TAA
AAT ATG AAC CCA GAC GAA GTA TTT TCA 3' SEQ ID Nr.: 3). In
Primer 2 war ein SalI Ort eingebaut (5' TCG AGG GTC GAC TTT
AGG ATT CTG ATT GTG GGA 3', SEQ ID Nr.: 4). Das aatIIR Gen
wurde durch Polymerase-Kettenreaktion mit Vent® DNA-
Polymerase verstärkt (95ºC 1 Minute lang, 50ºC 2 Minuten
lang, 72ºC 1 Minute lang, 20 Zyklen). Die DNA-Produkte
wurden zweimal mit Phenol-CHCl&sub3; und zweimal mit CHCl&sub3;
extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Nach dem
Restriktionsabbau mit EcoRI und SalI über einen Zeitraum
von 1 Stunde bei 37ºC wurde die DNA wieder mit Phenol-CHCl&sub3;
und CHCl&sub3; extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, getrocknet
und in 100 ul TE-Puffer resuspendiert. Das aatIIR Gen wurde
mit EcoRI/SalI-gespaltenem pRRS2 ligiert und in ER2206
[p(WSK129)AatIIM&spplus;]/F' lacIq, Tn10 (Tcr) transformiert. Es
wurden zwei Arten von Koloniemorphologie unter den
Transformanten beobachtet, eine normale Kolonie und eine
flache, transluzente Kolonie. Letztere enthielt ein aatIIR
Insert in pRRS2 und produzierte AatII Endonuclease in einer
10 ml Kleinkultur. Sie konnte keine AatII Endonuclease in
einer 200 ml Subkultur herstellen, was darauf hinwies, daß
der Klon nicht stabil war. Die Instabilität wird
wahrscheinlich durch Untermethylierung verursacht, da die
Kopienzahl des pUC19-stämmigen Vektors 400 pro Zelle
erreichen kann, die Kopienzahl des methylasehaltigen
Plasmids jedoch nur bei etwa 6-8 Kopien pro Zelle liegt.
Ein anderer Grund könnte sein, daß nicht genügend Lac-
Repressor in der Zelle produziert wird, um die aatIIR
Genexpression unter nichtinduzierten Bedingungen zu
reprimieren, da das lac1q Gen auf dem F' Plasmid mit
niedriger Kopienzahl getragen wird. Es wird ein streng
reguliertes Expressionssystem für die AatII Expression
benötigt.
-
D. Konstruktion eines Vektors mit mittlerer Kopienzahl
zur Expression des aatllM Gens in E. coli: Um die AatII
Endonuclease beständig zu überexpressionieren, wurde ein
Mutantenplasmid mit erhöhter Kopienzahl von pWSK129 wie
folgt isoliert: XL1-Blauzellen, die pWSK129 trugen, wurden
zu 2 · 10&sup8; Zellen/ml in LB plus 50 ug/ml Kanamycin (Kan)
vermehrt und 10fach konzentriert, indem die Zellen
zentrifugiert und in einem Zehntel Volumen 10 mM Tris-HCl,
10 mM MgSO&sub4;, pH-Wert 7,8 resuspendiert wurden. Die Zellen
wurden durch eine UV-Behandlung über einen Zeitraum von 15
Sekunden (6 J pro Sekunde) mutagenisiert. Die
mutagenisierten Zellen wurden auf eine 2 mg/ml Kan-Platte
aufgebracht (40fache Kan-Menge gegenüber der regulären Kan-
Platte) und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Es wurden 35
Kann-Kolonien gefunden und zusammengefaßt und in 10 ml LB
plus 2 mg/ml Kan inokuliert. Zur Beseitigung von Klonen,
die in der Lage sind, aufgrund von Wirtsmutationen in 2
mg/Kan zu wachsen, wurde Plasmid-DNA von 1,5 ml Übernacht-
Kultur präpariert und in einen neuen Wirt ER1821
umtransformiert und auf eine 2 mg Kan/ml Platte
aufgebracht. Zum Einschätzen der Plasmid-Kopienzahl wurden
Kanr-Transformanten in LB plus Kan vermehrt, und Plasmid-DNA
wurde von einer gleichen Zellanzahl durch ein Mini-
Präparationsverfahren parallel zu pWSK129 und pBR322
Plasmiden präpariert. Fünf ml pWSK129, der
Kopienzahlmutant, und pBR322 wurden per Agarose-
Gelelektrophorese analysiert. Es wurde eine Bildaufnahme
von der Ethidiumbromid-gefärbten DNA in dem Gel gemacht.
Das Negativ des Bildes wurde durch Densitometrie gescannt,
um die relative Menge von DNA in jeder Spur einzuschätzen.
Es wurde gefunden, daß ein Mutant (Nr. 3) die Plasmid-
Kopienzahl um das Dreifache erhöhte (18-24 Kopien pro
Zelle). Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pSYX19. Zum
Klonen des aatIIM Gens in pSYXIS wurden zwei Primer zur
Verstärkung des aatIIM Gen so ausgestaltet, daß der erste
Primer am Anfang des aatIIM Gens auf dem oberen Strang
(Watson-Strang) reassoziierte und der zweite Primeram Ende
des aatIIM Gens auf dem unteren Strang (Crick-Strang)
reassoziierte. Primer 1 (5' CGG GAT CCG GAG GAA TAA AAT GAC
CGC TCG TCC 3', SEQ ID Nr.: 1) enthielt einen BamHI Ort und
eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle 6 Basen vor dem
ATG Startcodon. Primer 2 (5' CCT TAA CTG CAG TCA TTT GTT
GAT ATC CAG AG 3', SEQ ID Nr. 2) enthielt einen PstI Ort in
der Nähe des 5' Endes. Das aatIIM Gen wurde mit Vent® DNA-
Polymerase (New England Biolabs, Inc.) durch Polymerase-
Kettenreaktion verstärkt (95ºC 1 Minute lang, 50ºC 2 Minuten
lang, 72ºC 1 Minute lang, 20 Zyklen). Die DNA-Produkte
wurden zweimal mit Phenol-CHCl&sub3; und zweimal mit CHCl&sub3;
extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Nach dem
Restriktionsabbau mit BamHI und PstI über einen Zeitraum
von 1 Stunde bei 37ºC wurde die DNA wieder mit Phenol-CHCl&sub3;
und CHCl&sub3; extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, getrocknet
und in 100 ul TE-Puffer resuspendiert. Fünf ug pSYX19
Vektor-DNA wurden ebenfalls mit BamHI und PstI gespalten,
mit Phenol-CHCL&sub3; und CHCl&sub3; extrahiert, mit Ethanol
präzipitiert und in 100 ul TE-Puffer resuspendiert. Zehn ul
aatIIM DNA und zehn ul pSYX19 Vektor-DNA wurden über Nacht
bei 16ºC mit einem 1X Ligationspuffer in 30 ul Gesamtvolumen
ligiert. Die ligierte DNA wurde durch Zugabe von 70 ul
steril-destilliertem Wasser verdünnt, und 10 ul DNA wurden
zum Transformieren von ER1821 Zellen verwendet und auf eine
Kan-Platte (50 ug/ml) aufgebracht. Achtzehn Kanr
Transformanten wurden über Nacht in 1,5 ml LB plus
Kanamycin vermehrt, und Plasmid-DNA wurde von diesen
Übernacht-Kulturen präpariert. Elf von achtzehn enthielten
ein Insert mit korrekter Größe durch BamHI und PstI
Restriktionsabbau. Als fünf von ihnen mit AatII
Endonuclease abgebaut wurden, waren alle fünf Plasmide
gegen AatII Abbau resistent. Ein Plasmid erhielt die
Bezeichnung p(SYX19)AatIIM&spplus; und wurde für die Co-Expression
der AatII Endonuclease verwendet.
-
Expression des aatIIR Gens in einem Plasmid mit
mittlerer Kopienzahl unter T7lac-Promoter: pET-11a ist ein
T7-Expressionsvektor, der von pBR322 abstammt und einen
lac-Operator 4 bp hinter dem T7-Promoter (dieser T7-
Promoter plus lac-Operator heißt T7lac-Promoter), das lacIq
Gen und zwei Restriktionsorte, NdeI und BamHI, zum Klonen
enthält (Dubendorff, J. W. und Studier, F. W., J. Mol. Biol.
219: 45-59, 1991). Es wurde ein pET-11a Derivat, pAII17,
konstruiert, das vier Kopien des rmB
Transkriptionsterminators (pAII17 konstruiert von William
Jack in New England Biolabs, Beverly, MA) vor dem T7-
Promoter enthielt. Der Transkriptionsterminator vor dem T7-
Promoter verringert weiter das Grundniveau der Expression
des Zielgens. Da im aatIIR Gen ein BamHI Ort vorkommt,
wurde der BamHI Ort auf dem Vektor mit Klenow-Fragment der
E. coli DNA-Polyermase I aufgefüllt und ein SaII Linker
wurde eingefügt, um den BamHI Ort zu ersetzen. Dieses
Plasmid erhielt die Bezeichnung pSYX22. Zwei Primer wurden
so ausgestaltet, daß der erste Primer einen NdeI Ort
enthielt, der am Anfang des aatIIR Gens reassoziierte, und
in den zweiten Primer ein SalI Ort eingebaut wart, der
komplementär zum Ende des aatIIR Gens war (Primer 1 : 5' CAA
CAT ATG AAT CCA GAC GAA GTA TTT TCA 3', SEQ ID Nr.: 5;
Primer 2 : 5' TCG AGG GTC GAC TTT AGG ATT CTG ATT GTG GGA
3', SEQ ID Nr.: 6). Das aatIIR Gen wurde durch PCR mit Vent®
DNA-Polymerase verstärkt (95ºC 1 Minute lang, 50ºC 2 Minuten
lang, 72ºC 1 Minute lang, 20 Zyklen). Die PCR-Produkte
wurden durch Phenol-CHCl&sub3;- und CHCl&sub3;-Extraktionen und
Ethanol-Präzipitation gereinigt und mit NdeI und SalI
gespalten. Die DNA wurde noch einmal durch Phenol-CHCl&sub3;- und
CHCl&sub3;-Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt und in
100 ul TE-Puffer resuspendiert. 10 ul der aatIIR DNA wurden
mit 0,5 ug NdeI/SalI-behandeltem pSYX22 bei 16ºC über Nacht
ligiert. Die ligierte DNA wurde durch Zugabe von 70 ul
steril-destilliertem Wasser verdünnt, und 10 ul davon
wurden zum Transformieren von BL21 (λDE3) Δ(hsd-mrr-mcrBC)
[p(SYX19)AatIIM&spplus;, Kanr; pLysS, Cmr] verwendet und auf LB-Agar
plus Ap (50 ug/ml), Cm (30 ug/ml), Kan (50 ug/ml)
aufgebracht. Das Plasmid pLysS kodiert Phage T7 Lysozym,
das T7 RNA-Polymerase hemmt, um die Basisniveau-
Zielgenexpression vom T7lac-Promoter zu reduzieren
(Studier, F. W., J. Mol. Biol. 219: 37-44, 1991). Plasmid-
DNA wurde von 1,5 ml Kultur von 12 individuellen
Transformanten präpariert und in bezug auf aatIIR DNA-
Insert analysiert. Vier Plasmide enthielten ein Insert der
korrekten Größe. Ein Klon, p(SYX22)AatIIR&spplus; wurde in bezug
auf AatII Endonucleasenaktivität wie folgt untersucht: 200
ml reichhaltiges Nährmedium plus Ap (50 ug/ml), Cm (30
ug/ml), Kan (50 ug/ml) wurden mit 2 ml über Nacht
vermehrter Zellen inokuliert und bei 37ºC auf eine
Zelldichte von Klett 100 (Mitte der log-Phase) geschüttelt.
-
IPTG-Induktor wurde in die Kultur auf eine Endkonzentration
von 0,5 mM gegeben. Die Zellen wurden zwei Stunden lang
induziert und bei Klett 175 geerntet. Die Zellen wurden
durch Zentrifugieren bei 4ºC, 5000 xg über einen Zeitraum
von 15 Minuten pelletiert, in 20 ml Beschallungspuffer (10
mM Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 10 mM β-Mercaptoethanol)
resuspendiert und auf Eis zehn Mal in 30-Sekunden-Schüben
beschallt. Zellreste wurden durch Zentrifugieren bei 4ºC,
15.000 xg über einen Zeitraum von 30 Minuten entfernt. Das
Supernatant wurde in ein neues Röhrchen übertragen und in
Beschallungspuffer 10¹-, 10²-, 10³- und 10&sup4;fach verdünnt, und
2 ul des verdünnten Extrakts wurden zum Spalten von 1 ug
HindIII-linearisiertem pUC19 in 1x AatII Restriktionspuffer
in einem Gesamtvolumen von 30 ul verwendet. In pUC19 gibt
es einen einzigen AatII Ort. Als der HindIII-linearisierte
pUC19 mit AatII Endonuclease gespalten wurde, wurden zwei
Fragmente mit einer Größe von 516 bp und 2170 bp erzeugt.
Nach einer Stunde bei 37ºC wurde die Reaktion durch Zugabe
von 3 ul Stopplösung unterbrochen und die DNA per Agarose-
Gelelektrophorese analysiert. Es wurde gefunden, daß ein
kompletter Abbau mit nur einem 100fach verdünnten
Zellextrakt erreicht wird. Man schätzte, daß dieser Klon 106
Einheiten AatII Endonuclease pro Gramm nasser Zellen
erbringt. Eine AatII-Einheit ist die Menge Enzym, die ein
ug λ-DNA in einer Stunde bei 37ºC in einer 50 ul Reaktion
vollständig abbaut.
-
Stabilitätstest: BL21 (λDE3) Δ(hsd-mrr-mcrBC)
[p(SYX22)AatIIR&spplus;, p(SYX19)AatIIM&spplus;, pLysS] Zellen wurden in
25% Glycerol bei -70ºC über Nacht eingefroren. Die Zellen
wurden von dem gefrorenen Material auf LB-Agar plus Ap, Cm
und Kan ausgestrichen, um eine einzelne Kolonie zu
erhalten. 500 ml reichhaltige Nährlösung plus Antibiotika
wurden mit einer einzelnen Kolonie inokuliert und über
Nacht geschüttelt. Koloniebildende Einheiten wurden von der
über Nacht auf einer reichhaltigen Agar-Platte oder
reichhaltigen Agar-Platte plus Ap, Cm und Kan vermehrten
Kultur bestimmt. Es wurde gefunden, daß der
Überproduktionsstamm die gleiche Ausstreicheffizienz auf
beiden Platten hatte (1,5 · 10&sup9; koloniebildende
Einheiten/ml). Fünf ml der Übernacht-Kultur wurden in 500
ml frischer, reichhaltiger Nährlösung plus Antibiotika
inokuliert und auf Klett-Einheiten 100 vermehrt. Die Kultur
wurde durch Zugabe von IPTG auf 0,5 mM induziert, und die
Inkubation wurde bei 37ºC fortgesetzt. Zellen wurden durch
Zentrifugation wiedergewonnen. Zellextrakt wurde präpariert
und die AatII Endonucleasenaktivität auf linearer pUC19 DNA
bestimmt. Es wurden mindestens 10&sup6; Einheiten AatII
Endonuclease/Gramm nasser Zellen nachgewiesen.
-
6. Reinigung der AatII Restriktionsendonuclease von
AatII Überproduktionsstamm (NEB Nr. 725), wovon eine Probe
am 7. Juli 1992 in der Amerikanischen Typus-Kultursammlung
hinterlegt wurde und die Beitritts-Nr. 69028 erhielt: Zwei
Liter reichhaltiges Nährmedium plus 50 ug/ml Ap, 30 ug
Cm/ml, 50 ug/ml Kan wurden mit 20 ml über Nacht vermehrten
BL21 Zellen inokuliert, die das AatII
Überproduktionsplasmid p(SYX22)AatIIR&spplus;, p(SXY19)AatIIM&spplus; und
pLysS trugen. Zellen wurden bei 37ºC zur Mitte der log-Phase
(Klett-Einheiten 100) vermehrt. IPTG-Induktor wurde der
Kultur bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben,
und die Inkubation wurde 2 Stunden lang fortgesetzt. Zellen
wurden bei 5000 xg und 4ºC über einen Zeitraum von 20
Minuten zentrifugiert, und das Zellpellet wurde in 80 ml
Beschallungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 10 mM β-
Mercaptoethanol) resuspendiert und beschallt. Das folgende
Reinigungsverfahren lief bei 4ºC ab. Das Extrakt wurde bei
15.000 xg 30 Minuten lang zentrifugiert und das Supernatant
auf eine DEAE-Sepharosesäule (1,5 · 15 cm) aufgebracht. Es
wurde ein Salzgradient von Null bis 1 M NaCl angewendet,
Fraktionen wurden aufgefangen und in bezug auf AatII
Endonucleasenaktivität untersucht. Die Fraktionen, die
AatII Endonuclease enthielten, wurden zusammengefaßt und
mit einem Puffer aus 75 mM NaCl, 10 mM KPO&sub4;, pH-Wert 7, 1
mM DTT, 1 mM EDTA dialysiert. Das Enzymgemisch wurde auf
eine Heparin-Sepharosesäule (1,5 · 15 cm) aufgebracht, und
Proteine wurden mit einem Gradienten von Null bis 1 M NaCl
eluiert. Die Fraktionen, die AatII Endonuclease enthielten,
wurden wie zuvor zusammengefaßt und mit einem 0,15 M NaCl
Puffer dialysiert. Die Lösung wurde auf eine 1,5 · 15 cm
Phosphocellulosesäule aufgebracht, und es wurde ein
Gradient von 0,15 M bis 1 M NaCl angewendet. Die Fraktionen
mit AatII Endonuclease wurden zusammengefaßt und mit einem
Speicherpuffer (50% Glycerol, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl,
pH-Wert 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT und 200 ug/ml BSA)
dialysiert. Der Endertrag lag bei 10&sup6; Einheiten AatII
Endonuclease von 9 Gramm Zellen (240.000 Einheiten
AatII/ml). Das Enzym wurde um das Zehnfache auf 24.000
Einheiten/ml verdünnt, und 2 ul bis 10 ul des verdünnten
Enzyms wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
analysiert. IPTG-induzierte und nichtinduzierte
Zellextrakte wurden auch auf das gleiche Gel geladen. Das
in Fig. 4 gezeigte Ergebnis weist darauf hin, daß das
gereinigte AatII Endonucleaseprotein zu mindestens 90% rein
war. (Hinweis: das 68.000 Dalton Rinderserumalbumin war
kein kontaminierendes Protein. Es wurde in das AatII
Enzympräparat gegeben, um die AatII Endonuclease zu
stabilisieren).
-
Die von dieser Reinigung erhaltene AatII
Restriktionsendonuclease war im wesentlichen rein und frei
von unspezifischer Endonuclease und Exonuclease. Die
Reinheit des AatII Restriktionsendonucleasepräparates wurde
anhand der folgenden Kriterien untersucht: 1) Ligation:
Nach einem 10fachen Überabbau von λ-DNA wurden mehr als 90%
der produzierten DNA-Fragmente mit T4 DNA-Ligase ligiert.
95% der ligierten Fragmente konnten mit AatII erneut
zerschnitten werden. 2) Verlängerter Abbau: Nach dem
Inkubieren einer 50 ul Reaktion, die 1 ug λ-DNA und 72
Einheiten Enzym enthielt, über einen Zeitraum von 16
Stunden, wurde das gleiche Muster von DNA-Banden wie bei
einer Reaktion erzeugt, die in einer Stunde mit einer
Enzymeinheit abläuft. 3) Exonucleasenaktivität: Nach dem
Inkubieren von 72 Einheiten Enzym über einen Zeitraum von
4 Stunden bei 37ºC in einer 50 ul Reaktion, die 1 ug
beschallte ³H DNA (10&sup5; cpm/ug) enthielt, wurden weniger als
0,01% Radioaktivität freigesetzt. Alle Tests wurden im
folgenden Reaktionspuffer durchgeführt: 50 mM Kaliumacetat,
20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM
Dithiothreitol.
2. BEISPIEL
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Überexpression von Nialil Endonuclease in E. coli: Das
Nialil Methylasegen (nlaIIIM) und Nialil Endonucleasegen
(nlaIIIR) wurden kloniert (siehe EPO-Veröffentlichung Nr.
477,532, veröffentlicht am 1. April 1992) und sequenziert.
Die Patentanmeldung in Zusammenhang mit den Verfahren zur
Nialil Klonierung und Produktion von Nialil Endonuclease
von dem Klon wurde registriert (Patentanmeldungsnummer
07/575,285). Hierin wird ein Verfahren zur Überexpression
von Nialil Endonuclease in E. coli unter Verwendung des
erfindungsgemäßen Expressionssystems beschrieben.
-
Für die Konstruktion eines konstitutiven
Expressionsvektors wurde ein BssHII Restriktionsfragment,
das das lacZa Gen enthielt, von pSYX19 deletiert, und ein
SspI/PvuII Restriktionsfragment, das das
Tetracyclinresistenz-(Tcr)-Gen trug, wurde mit der
restlichen DNA ligiert. Das resultierende Plasmid pSYX20
enthielt sowohl das Kanr-Gen als auch das Tcr-Gen, wovon
eine Probe am 7. Juli 1992 bei der Amerikanischen Typus-
Kultursammlung hinterlegt wurde und die Beitritts-Nr. 75260
erhielt. Durch Klonen von DNA in das Tcr-Gen wird dieses
inaktiviert, wodurch eine einfache Screening-Methode für
den Insert-Nachweis bereitgestellt wird. Die einmaligen
EcoRV, BamHI, Sah und SphI Restriktionsorte sind günstige
Orte zum Klonen in das Tcr-Gen. Ein eingefügtes Fremdgen
kann konstitutiv vom Tc-Promoter ausgeprägt werden.
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1. Klonen des nlaIIIM Gens in den pSYX20 Vektor: Das
Plasmid pSYX20 ist ein Plasmid mit mittlerer Kopienzahl,
das Kanr- und Tct-Gene und einen pSC101
Replikationsstartpunkt trägt. Das in das Tcr-Gen eingefügte
nialliM Gen kann vom Tc-Promoter konstitutiv ausgeprägt
werden. Zwei Primer wurden zum Verstärken des nlaIIIM Gens
von p(UC)NIaIIIR&spplus;M&spplus; verwendet. Primer 1 enthielt einen BarnEI
Ort in der Nähe des 5' Endes und eine effiziente Ribosomen-
Bindungsstelle 7 bp vor dem ATG-Startcodon (5 CGG GAT CCG
GAG GTT AAT TAA ATG AAC TAC ATC GGC TCC AAA CTA 3', SEQ ID
Nr.: 7). Primer 2 hatte einen SalI Ort in der Nähe des 5'
Endes (5' CAA GTC GAC TTA AAA GGT CTT TTC TAA AAT ATG 3',
SEQ ID Nr.: 8). Das nlaIIIM Gen wurde mit Vent® DNA-
Polymerase durch Polymerase-Kettenreaktion verstärkt (95ºC
1 Minute lang, 50ºC 2 Minuten lang, 72ºC 1 Minute lang, 20
Zyklen). Die PCR-Produkte wurden zweimal mit Phenol-CHCl&sub3;
und zweimal mit CHCl&sub3; extrahiert, mit Ethanol präzipitiert
und in 100 ul TE-Puffer resuspendiert. Nach dem
Restriktionsabbau mit BamHI und SalI über einen Zeitraum
von 1 Stunde bei 37ºC, wurde die DNA wieder mit Phenol-CHCl&sub3;
und CHCl&sub3; extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, getrocknet
und in 100 ul TE-Puffer resuspendiert. Fünf ug pSYX20
Vektor-DNA wurden ebenfalls mit BamHI und SalI gespalten,
mit Phenol-CHCl&sub3; und CHCl&sub3; extrahiert, mit Ethanol
präzipitiert und in 100 ul TE-Puffer resuspendiert. Zehn ul
nlaIIIM DNA und zehn ul pSYX20 Vektor-DNA wurden über Nacht
bei 16ºC mit einem 1X Ligationspuffer in 30 ul Gesamtvolumen
ligiert. Die ligierte DNA wurde durch Zugabe von 70 ul
steril-destilliertem Wasser verdünnt, und 10 ul DNA wurden
zum Transformieren von ER1821 Zellen verwendet und auf eine
Kan-Platte (50 ug/ml) aufgebracht. Achtzehn Kanr
Transformanten wurden über Nacht in 1,5 ml LB plus Kanr
vermehrt, und Plasmid-DNA wurde präpariert und durch BamHI
und SalI Restriktionsabbau analysiert. Vier Klone
enthielten ein Insert der korrekten Größe. Als sie NlaIII
Endonuclease ausgesetzt wurden, waren alle vier Plasmide
gegen NlaIII Abbau resistent, was auf eine vollständige
Modifikation durch Nialil Methylase hinwies. Ein Plasmid
erhielt die Bezeichnung p(SYX20)NlaIIIM&spplus; und wurde zum
Transformieren von BL21 (λDE3) Δ(hsd-mrr-mcrBG) [pLysS]
Zellen verwendet und auf eine LB-Agarplatte plus 30 ug/ml
cm, 50 ug/ml Kan aufgebracht. Es wurden Cmr- und Kanr-
Transformanten erzeugt, die später als Wirt für die
Expression der Nialil Endonuclease verwendet wurden.
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2. Klonen des nlaIIIR Gens in den Expressionsvektor
pSYX22. Der Expressionsvektor pSYX22 enthält den T7lac-
Promoter, das lacIq-Gen, zwei Restriktionsorte, NdeI und
SaII, für eine Translationsfusionsklonierung. Die
Konstruktion von pSYX22 wurde im 1. Beispiel beschrieben.
-
Zwei Primer wurden so ausgestaltet, daß der erste Primer
einen NdeI-Ort enthielt, der am Anfang des nlaIIIR Gens
reassoziierte, und in den zweiten Primer ein SalI Ort
eingebaut war, der komplementär zum Ende des nlaIIIR Gens
war (Primer 1: 5' TTG CAT ATG AAA ATC ACA AAA ACA GAA CTA
3', SEQ ID Nr.: 9; Primer 2: 5' CGA GTC GAC TCA TCC GTT ATC
TTC TTC ATA TAA 3', SEQ ID Nr.: 10). Das nlaIIIR Gen wurde
von p(UC)NlaIIIR&spplus;M&spplus; durch PCR mit Vent® DNA-Polymerase
verstärkt (95ºC 1 Minute lang, 50ºC 2 Minuten lang, 72ºC 1
Minute lang, 20 Zyklen). Die PCR-Produkte wurden mit
Phenol-CHCl&sub3;- und CHCl&sub3;-Extraktionen und Bthanol-
Präzipitation gereinigt und mit NdeI und SalI gespalten.
Die DNA wurde wieder mit Phenol-CHCl&sub3;- und CHCl&sub3;-Extraktion
und Ethanol-Präzipitation gereinigt und in 100 ul TE-Puffer
resuspendiert. 10 ul der nlaIIIR DNA wurden mit 0,5 ug
NdeI/SalI-behandeltem pSYX22 über Nacht bei 16ºC ligiert.
Die ligierte DNA wurde durch Zugabe von 70 ml
sterildestilliertem Wasser verdünnt, und 10 ul davon wurden zum
Transformieren von E. coli Stamm ER2267 recAl
Δ(hsd-mrrmcrBC) verwendet und auf Ap-Platten aufgebracht.
Achtundvierzig individuelle Transformanten wurden in 2 ml
LB plus Ap inokuliert und über Nacht bei 37ºC geschüttelt.
Plasmid-DNA wurde präpariert und durch NdeI und SaII
Restriktionsabbau analysiert. Zehn Plasmide enthielten ein
Insert der korrekten Größe. Ein Klon p(SYX22)NlaIIIR&spplus; (Nr. 4)
wurde zum Transformieren von BL21 (λDE3) Δ(hsd-mrr-mcrBC)
[p(SYX20)NlaIIIM&spplus;, pLysS] verwendet und die Selektion nach
Transformanten erfolgte auf LB-Agar plus Ap (50 ug/ml), Cm
(30 ug/ml), Kan (50 ug/ml). Das Plasmid pLysS kodiert Phage
T7 Lysozym, das T7 RNA-Polymerase hemmt, um die
Grundniveau-Zielgenexpression vom T7lac-Promoter zu
reduzieren (Studier, F. W., J. Mol. Biol. 219: 37-44, 1991).
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E. coli Stamm BL21 (λDE3) Δ(hsd-mrr-mcrBC) [p(SYX22)NlaIIIR&spplus;,
p(SYX20)NlaIIIM&spplus;, pLysS] wurde wie folgt in bezug auf eine
NlaIII Endonucleaseproduktion getestet: 200 ml
reichhaltiges Nährmedium plus Ap (50 ug/ml), Cm (30 ug/ml),
Kan (50 ug/ml) wurden mit 2 ml über Nacht vermehrter Zellen
inokuliert und bei 37ºC auf eine Zelldichte von Klett 75
geschüttelt. IPTG-Induktor wurde der Kultur bis zu einer
Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben. Die Zellen wurden
zwei Stunden lang induziert und bei Klett 175 geerntet.
Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 4ºC, 5000 xg über
einen Zeitraum von 15 Minuten pelletiert und in 20 ml
Beschallungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 10 mM β-
Mercaptoethanol) resuspendiert und auf Eis zehn Mal in 30-
Sekunden-Schüben beschallt. Zellreste wurden durch
Zentrifugieren bei 4ºC, 15.000 xg über einen Zeitraum von 30
Minuten entfernt. Das Supernatant wurde in ein neues
Röhrchen übergeben und 10&supmin;¹-, 10&supmin;²-, 10&supmin;³- und 10&supmin;&sup4;fach im
Beschallungspuffer verdünnt, und 5 ul des verdünnten
Extrakts wurden zum Spalten von 1 ug X-DNA in 1x NlaIII
Restriktionspuffer in einem Gesamtvolumen von 30 ul
verwendet. Nach einem einstündigen Abbau bei 37ºC wurde die
Reaktion durch Zugabe von 3 ul Stopplösung unterbrochen und
die DNA per Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Es wurde
gefunden, daß ein kompletter Abbau bei einer 10&supmin;³fachen
Verdünnung von Zellextrakt erreicht wurde. Man schätzte,
daß dieser Klon 2 · 10&sup6; Einheiten NlaIII Endonuclease pro
Gramm nasser Zellen erbringt. Als der NlaIII
Überproduktionsstamm in bezug auf eine NlaIII
Endonucleaseproduktion unter nichtinduzierenden
Wachstumsbedingungen untersucht wurde, enthielt das
Zellextrakt nur 1000 Einheiten pro Gramm nasser
nichtinduzierter Zellen. Das Induktionsverhältnis ist somit
2000fach. Mit einem hohen Induktionsniveau und einer
Expression mit geringem Grundniveau ist das
Expressionssystem der vorliegenden Erfindung für die
Expression toxischer Gene wie Restriktionsendonucleasegene
in E. coli sehr von Nutzen.
-
3. Reinigung der Nialil Endonuclease: Etwa 5 Gramm
Zellen einer 1-Liter-Kultur wurden in 75 ml
Beschallungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 10 mM β-
Mercaptoethanol) resuspendiert und beschallt. Die Zellreste
wurden durch Zentrifugieren bei 15.000 xg über einen
Zeitraum von 30 Minuten entfernt, und 10% Glycerol wurde
zugegeben und das Supernatant bei -70ºC eingefroren. Beim
Auftauen wurde KCl bis zu einer Endkonzentration von 0,2 M
zugegeben, und das Zellextrakt wurde auf eine
Phosphocellulosesäule (2,5 · 7 cm) aufgebracht.
Anschließend wurde ein Salzgradient von 0,2 M bis 2 M KCl
angewendet und Fraktionen aufgefangen und in bezug auf
Nialil Endonucleasenaktivität analysiert. Fraktionen mit
Nialil Aktivität wurden zusammengefaßt. Nach der Zugabe von
200 ug/ml BSA wurden sie auf eine Hydroxylapatitsäule
geladen, mit einem Puffer (10 mM KPO4, pH-Wert 7, 10 mM β-
Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA, 0,3 M NaCl, 10% Glycerol)
äquilibriert. Das Enzym wurde mit einem Phosphatgradienten
von 10 mM bis 0,7 M KPO4 eluiert. Fraktionen, die Nialil
Endonuclease enthielten, wurden zusammengefaßt und mit
einem Puffer aus 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6, 10 mM β-
Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaCl und 10% Glycerol
dialysiert. 200 ug/ml BSA wurden wieder zum Enzympool
gegeben, der auf eine DEAE-Sepharosesäule (2,5 · 4,5 cm)
aufgebracht wurde. Das Enzym floß durch und wurde schnell
auf eine andere Hydroxylapatitsäule aufgebracht. Das Enzym
wurde in einem Phosphatgradienten mit 10 mM bis 0,7 M KPO4
eluiert. Die Fraktionen mit NlaIII Endonuclease wurden
zusammengefaßt und mit einem Speicherpuffer (10 mM Tris-
HCl, pH-Wert 7,5, 0,1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 0,2 M
KCl, 50% Glycerol) dialysiert und bei -70ºC gelagert. Mit
dem obigen Reinigungsverfahren wurde ein Gesamtertrag von
400.000 Einheiten NlaIII erhalten. Die gereinigte NlaIII
Endonuclease wurde per SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
analysiert. Es wurde gefunden, daß das Nialil
Endonucleaseprotein mit einer scheinbaren relativen
Molekülmasse von 27.000 Dalton wenigstens zu 90% rein ist
(Fig. 5. Hinweis: Das 68.000 Dalton BSA-Protein ist kein
kontaminierendes Protein. Es wurde dem Nialil Präparat
zugegeben, um die Endonuclease zu stabilisieren).
-
Die von dieser Reinigung erhaltene NlaIII
Restriktionsendonuclease war im wesentlichen rein und frei
von unspezifischer Endonuclease und Exonuclease. Die
Reinheit des NlaIII Restriktionsendonucleasepräparates
wurde anhand der folgenden Kriterien überprüft: 1)
Ligation: Nach einem 20fachen Überabbau von φx-DNA mit dem
gereinigten Enzym wurden mehr als 95% der produzierten DNA-
Fragmente mit T4 DNA-Ligase ligiert. Von diesen ligierten
Fragmenten konnten 95% mit NlaIII erneut zerschnitten
werden. 2) Verlängerter Abbau: Nach dem Inkubieren einer 50
ul Reaktion, die 1 ug φx174 DNA und 200 Einheiten Enzym
enthielt, über einen Zeitraum von 16 Stunden, wurde das
gleiche Muster von DNA-Banden wie bei einer Reaktion
erzeugt, die in einer Stunde mit einer Enzymeinheit
abläuft. 3) Exonucleasenaktivität: Nach dem Inkubieren von
200 Einheiten Enzym über einen Zeitraum von 4 Stunden bei
37ºC in einer 50 ul Reaktion [*4], die 1 ug beschallte ³H
DNA (10&sup5; cpm/ug) enthielt, wurden 0,21% Radioaktivität
freigesetzt. Alle Tests wurden im folgenden Reaktionspuffer
durchgeführt: 50 mM Kaliumacetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM
Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol.
3. BEISPIEL
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1. Klonen eines Methylasegens in den pSYX20 Vektor:
Das Plasmid pSYX20 ist ein Plasmid mit mittlerer
Kopienzahl, das die Kanr-und Tcr-Gene und einen pSC101
Replikationsstartpunkt trägt. Ein in das Tcr-Gen eingefügtes
Methylasegen kann vom Tc-Promoter konstitutiv ausgeprägt
werden. Die Konstruktion von pSYX20 wurde ausführlich im 2.
Beispiel beschrieben. Alternativ kann jeder Plasmidvektor,
vorzugsweise mit mittlerer Kopienzahl, der mit ColEI und
p15A kompatibel ist, zum Klonen des Methylasegens verwendet
werden; Bakteriophagen-Vektoren können ebenfalls zum Klonen
des Methylasegens verwendet und in E. coli Wirtschromosom
für Wirts-DNA-Modifikation integriert werden. Zwei Primer
mit gewünschten Restriktionsorten können zum Verstärken des
Methylasegens von einem Plasmid oder von genomischer DNA
durch Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden. Eine
effiziente Ribosomen-Bindungsstelle wie zum Beispiel GGAGGT
kann in den Primer 7-10 bp vor dem ATG-Startcodon eingebaut
werden. Die Bedingungen für die Polymerase-Kettenreaktion
sind typischerweise wie folgt: 95ºC 1 Minute lang, 50ºC 2
Minuten lang, 72ºC 1-2 Minuten lang, 20-30 Zyklen. Die PCR-
Produkte können zweimal mit Phenol-CHCl&sub3; und zweimal mit
CHCl&sub3; extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer
resuspendiert werden. Nach dem Restriktionsabbau kann die
DNA wieder mit Phenol-CHCl&sub3; und CHCl&sub3; extrahiert, mit
Ethanol präzipitiert, getrocknet und in TE-Puffer
resuspendiert werden. Die Vektor-DNA pSYX20 wird
anschließend mit der gleichen Restriktionsendonuclease
gespalten, mit Phenol-CHCl&sub3; und CHCl&sub3; extrahiert, mit
Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer resuspendiert. Die
das Methylasegen enthaltende DNA und die pSYX20 Vektor-DNA
können über Nacht bei 16ºC mit einem 1X Ligationspuffer
ligiert werden. Die ligierte DNA kann bei Bedarf durch die
Zugabe von steril-destilliertem Wasser verdünnt werden, und
eine Fraktion der DNA kann zum Transformieren von E. coli
Zellen (mcrA&supmin;, mcrBC&supmin;, hsd&supmin;, mrr&supmin;) verwendet und auf eine
Kan-Platte (50 ug/ml) aufgebracht werden.
Kanr-Transformanten können in bezug auf ein Insert der korrekten
Größe durch Mini-Präparation von Plasmid-DNA und
Restriktionsabbau gescreent werden. Das Plasmid mit einem
Insert der korrekten Größe kann der kognatischen
Endonuclease ausgesetzt werden, um vollständige
Modifikation zu überprüfen. Das Methylasegen enthaltende
Plasmid kann zum Transformieren von beispielsweise BL21
(λDE3) Δ(hsd-mrr-mcrBC) [pLysS] Zellen verwendet und auf
eine LB-Agarplatte plus 30 ug/ml Cm, 50 ug/ml Kan
aufgebracht werden. Cmr- und Kanr-Transformanten können
erzeugt und später als Wirt für die Expression der
entsprechenden Endonuclease verwendet werden. Alternativ
kann ein Restriktionsfragment, das das intakte Methylasegen
enthält, direkt in pSYX20 kloniert werden, unter Verwendung
der Restriktionsorte AatII, EcoRI, ClaI/BspDI, EcoRV,
BamHI, SphI, SalI, PshAI, EagI, NruI, BspMT, SmaI oder
XhoI.
-
2. Klonen des Restriktionsendonucleasegens in den
Expressionsvektor pSYX22. Der Expressionsvektor pSYX22
enthält den T7lac-Promoter, rrmB Transkriptionsterminatoren
vor dem T7lac-Promotor, das lacIq Gen, zwei
Restriktionsorte, NdeI und Saill, zum
Translationsfusionsklonen. Die Konstruktion von pSYX22
wurde im 1. Beispiel beschrieben. Alternativ kann das
Derivat von pSYX22 so konstruiert sein, daß es NcoI, SphI,
BspHI oder AflIII Restriktionsorte zum Insert-Klonen
enthält. Zwei Primer können so ausgestaltet sein, daß der
erste Primer einen NdeI Ort enthält, der am Anfang des
Endonucleasegens reassoziiert ist, und in den zweiten
Primer ein SalI Ort eingebaut ist, der komplementär zum
Ende des Endonucleasegens ist. Das Endonucleasegen kann vom
Plasmidklon oder von genomischer DNA durch PCR mit
hitzebeständiger DNA-Polymerase verstärkt werden, zum
Beispiel Vent® (95ºC 1 Minute lang, 50ºC 2 Minuten lang, 72ºC
1-2 Minuten lang, 20-30 Zyklen). Die PCR-Produkta können
durch Phenol-CHCl&sub3;- und CHCl&sub3;-Extraktionen und Ethanol-
Präzipitation gereinigt und mit NdeI und SalI gespalten
werden. Die DNA kann wieder durch Phenol-CHCl&sub3;- und CHCL&sub3;-
Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt und in TE-
Puffer resuspendiert werden. DNA, die das Endonucleasegen
enthält, kann mit NdeI/SalI-behandeltem pSYX22 bei 16ºC über
Nacht ligiert werden. Die ligierte DNA kann durch Zugabe
von steril-destilliertem Wasser verdünnt werden, und ein
Teil davon kann zum Transformieren von E. coli Zellen
verwendet und auf Ap-Platten aufgebracht werden.
Individuelle Transformanten können in 2 ml LB plus Ap
inokuliert und über Nacht bei 37ºC geschüttelt werden.
Plasmid-DNA kann präpariert und durch NdeI und SalI
Restriktionsabbau analysiert werden. Alternativ kann ein
Restriktionsfragment, das das gewünschte Endonucleasegen
enthält, direkt hinter T7lac-Promoter im pSYX22
Expressionsvektor kloniert werden. Plasmide, die ein Insert
der korrekten Größe enthalten, können zum Transformieren
von beispielsweise BL21 (λDE3) Δ(hsd-mrr-mcrBC)
[p(SYX20) Methylase&spplus;, pLysS] verwendet und auf LB-Agar plus
Ap (50 ug/ml), Cm (30 ug/ml), Kan (50 ug/ml) auf gebracht
werden. E. coli Stamm BL21 (λDE3) Δ(hsd-mrr-mcrBC)
[p(SYX22)R&spplus;, p(SYX20)M&spplus;, pLysS] kann wie folgt in bezug auf
Endonucleaseproduktion getestet werden: 200-1000 ml
reichhaltiges Nährmedium plus Ap (50 ug/ml), Cm (30 ug/ml),
Kan (50 ug/ml) können mit 2 ml über Nacht vermehrter Zellen
inokuliert und bei 37ºC auf eine Zelldichte von Klett 75-100
geschüttelt werden. IPTG-Induktor kann in die Kultur bis zu
einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben werden. Die
Zellen können 2-14 Stunden lang induziert und geerntet
werden. Zellen können durch Zentrifugieren bei 4ºC, 5000 xg
über einen Zeitraum von 15 Minuten pelletiert, in
Beschallungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 10 mM β-
Mercaptoethanol) resuspendiert und auf Eis bis zur
kompletten Zellauf lösung beschallt werden. Zellreste können
durch Zentrifugieren bei 4ºC, 15.000 xg über einen Zeitraum
von 30 Minuten entfernt werden. Das Supernatant kann in ein
neues Röhrchen übertragen und im Beschallungspuffer
verdünnt werden, und 1-10 ul desverdünnten Extrakts können
zum Spalten von 1 ug λ-DNA oder einer beliebigen Substrat-
DNA in 1x Restriktionspuffer verwendet werden. Nach einem
einstündigen Abbau bei 37ºC kann die Reaktion durch die
Zugabe von Stopplösung unterbrochen und die DNA per
Agarose-Gelelektrophorese analysiert werden. Der
Endonucleasenertrag kann durch die Gramm-Menge nasser
induzierter Zellen eingeschätzt werden. Die gewünschte
Restriktionsendonuclease kann mit Ionenaustauschersäulen,
Gelfiltration oder Affinitätssäulen gereinigt werden. Die
gereinigte Restriktionsendonuclease kann per SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert werden.
SEQUENZAUFLISTUNG
-
(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
-
(i) ANMELDERIN: NEW ENGLAND BIOLABS, INC.
-
(A) STRASSE: 32 Tozer Road
-
(B) STADT: Beverly
-
(C) STAAT: MASSACHUSETTS
-
(D) LAND: USA
-
(E) POSTLEITZAHL: 01915
-
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: VERFAHREN ZUM KLONEN UND
PRODUZIEREN DER AatII RESTRIKTIONSENDONUCLEASE UND
METHYLASE UND VERWANDTES VERFAHREN ZUM ÜBEREXPRESSIONIEREN
VON RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN
-
(iii)ANZAHL SEQUENZEN: 14
-
(iv) MASCHINENLESBARES FORMULAR:
-
(A) MEDIENTYP: Diskette
-
(B) COMPUTER: IBM-kompatibler PC
-
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
-
(D) SOFTWARE: Patent in Release Nr. 1.0, Version
Nr. 1.25
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 1:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 1:
-
CGGGATCCGG AGGAATAAAA TGACCGCTCG TCC 33
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 2:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LANGE: 32 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 2.
-
CCTTAACTGC AGTCATTTGT TGATATCCAG AG 32
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 3:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRANGIGKEIT: unbekannt
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 3:
-
CTGAATTCGG AGGTTTAAAA TATGAACCCA GACGAAGTAT TTTCA 45
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 4:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 4:
-
TCGAGGGTCG ACTTTAGGAT TCTGATTGTG GGA 33
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 5:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 5:
-
CAACATATGA ATCCAGACGA AGTATTTTCA 30
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 6:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 6:
-
TCGAGGGTCG ACTTTAGGAT TCTGATTGTG GGA 33
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 7:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 7:
-
CGGGATCCGG AGGTTAATTA AATGAACTAC ATCGGCTCCA AACTA 45
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 8:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 8:
-
CAAGTCGACT TAAAAGGTCT TTTCTAAAAT ATG 33
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 9:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGTGKEIT; unbekannt
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 9:
-
TTGCATATGA AAATCACAAA AACAGAACTA 30
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 10:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 33 Hasenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 20:
-
CGAGTCGACT CATCCGTTAT CTTCTTCATA TAA 33
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 11:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 996 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
-
(B) ORT: 1..996
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 11:
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 12:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 331 Aminosäuren
-
(B) TYP: Aminosäure
-
(D) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 12:
-
(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 13:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
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(A) LÄNGE: 1038 Basenpaare
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(B) TYP: Nucleinsäure
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(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
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(D) TOPOLOGIE: unbekannt
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(ix) MERKMAL:
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(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
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(B) ORT: 1..1038
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(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 13:
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(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 14
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(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
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(A) LÄNGE: 345 Aminosäuren
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(B) TYP: Aminosäure
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(D) TOPOLOGIE: linear
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(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
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(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 14:
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(2) INFORMATIONEN ÜBER SEQ ID Nr.: 14
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(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 345 Aminosäuren
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(B) TYP: Aminosäure
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(D) TOPOLOGIE: linear
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(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
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(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 14: