DE69332450T2 - Für SphI Restriktionsendonuklease kodierende DNS und Verfahren zur Herstellung - Google Patents

Für SphI Restriktionsendonuklease kodierende DNS und Verfahren zur Herstellung

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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die SphI-Restriktionsendonuclease kodiert, sowie die Herstellung dieser Enzyme von der rekombinanten DNA.
  • Restriktionsendonucleasen sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von anderen kontaminierenden Bakterienkomponenten weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen im Labor zum Zerschneiden von DNA-Molekülen in präzise Fragmente verwendet, werden. Durch diese Eigenschaft können DNA-Moleküle eindeutig identifiziert und in ihre Genbestandteile fraktioniert werden. Restriktionsendonucleasen haben sich als unverzichtbare Werkzeuge in der modernen Genforschung erwiesen. Sie sind die biochemischen "Scheren" zur Umsetzung von Gentechnik und -analyse.
  • Restriktionsendonucleäsen agieren, indem sie spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül erkennen und sich an sie binden. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Fast einhundert verschiedene Restriktionsendonuclasen wurden unter den vielen Hunderten von Bakterienspezies identifiziert, die bisher untersucht worden sind.
  • Bakterien besitzen gewöhnlich höchstens nur eine geringe Zahl von Restriktionsendonucleasen pro Spezies. Die Endonucleasen werden typischerweise entsprechend den Bakterien benannt, von denen sie abstammen. Die Spezies Haemophilus aegyptius synthetfsiert beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen mit dem Namen HaeI, HäeII und HaeIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy und GGCC. Escherichia coli RY13 synthetisiert hingegen nur ein Enzym., nämlich EcoRI, das die Sequenz GAATTC erkennt.
  • Ohne uns durch die Theorie zu binden, gehen wir davon aus, dass Restriktionsendonucleasen in der Natur eine schützende Rolle zum Wohle der Bakterienzelle spielen. Sie machen Bakterien widerstandsfähig gegen Infektionen durch Fremd-DNA- Moleküle wie Viren und Plasmide, die sie sonst zerstören oder befallen würden. Sie übertragen Widerstandsfähigkeit, indem sie die Länge des infizierenden DNA-Moleküls scannen und sie immer dann spalten, wenn die Erkennungssequenz auftritt. Durch die stattfindende Spaltung werden viele der infizierenden Gene deaktiviert, und die DNA wird für einen weiteren Abbau durch unspezifische Endonucleasen empfänglich gemacht.
  • Eine zweite Komponente von bakteriellen Schutzsystemen sind Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Nucleotiderkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch das ein oder andere Nucleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe. Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die Restriktionsendonuclease gebunden oder gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird aufgrund der Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets völlig modifiziert. Sie ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Sie ist lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd- DNA, die auf eine Erkennung und einen Angriff durch Restriktionsendonuclease empfindlich reagiert.
  • Seit dem Beginn der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, die sie kodieren, in größeren Mengen zu produzieren, als es mit konventionellen Reiniguhgstechniken möglich ist. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb komplexer "Bibliotheken", d. h. Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup4; auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschte Mehrheit von Klonen zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
  • Immer öfter werden Restriktionsmodifikationssysteme des Typs II kloniert. Die ersten klonierten Systeme benutzten eine Bakteriophage-Infektion als ein Mittel zur Identifizierung oder Selektierung von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Molec. gen. Genet 178 : 717-719, (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97-112, (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78 1503-1507, (1981)). Da die Anwesenheit von Restriktionsmodifikationssystemen in Bakterien - diese befähigen, Infektionen durch Bakteriophagen standzuhalten, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von Bibliotheken selektiv isoliert werden, die dem Phage ausgesetzt waren. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfähren nur von begrenztem Nutzen ist. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte Restriktionsmodifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand zeigen, um selektives Überleben zu gewähren.
  • Ein weiterer Klonierungsansatz beinhaltet das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsplasmide (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12: 3659-3676, (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 402-406, (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355-359 (1982); PtruII: Blumenthal et al.; J. Bacteriol. 164: 501-509, (1985)).
  • Ein dritter Ansatz, der zum Klonieren einer steigenden Zahl von Systemen angewendet wird, werden jetzt durch Selektion nach einem aktiven Methylasegen kloniert (siehe z. B. EPO Nr.: 193,413, veröffentlicht am 3. September 1986, und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13: 6403-6421, (1985)). Da Restriktions- und Modifikationsgene oft eng miteinander gekoppelt sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10 : 19-225, (1980); BcnI: Janulaitis et al. Gene 20 : 197-204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21 : 111-119, (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258 : 1235-1241, (1983)).
  • In einigen Systemen besteht die Klonierungsschwierigkeit möglicherweise darin, dass versucht wird, das Endonucleasegen in einen Wirt einzubringen, der noch nicht durch Modifikation geschützt wurde. Wenn das Methylasegen und das Endonucleasegen auf einem gemeinsamen DNA-Fragment eingeführt werden, dann muss das Methylasegen den Wirt modifizieren oder schützen, bevor das Endonucleasegen das Genom des Wirts spaltet.
  • Die EP-A-0 477 532 stellt ein Verfahren zum Klonieren rekombinanter DNA bereit, die die NlaIII Restriktionsendonuclease und Modifikationsmethylase kodiert, wobei sich das rekonstruierte NlaIII Endonucleasegen und das entsprechende Methylasegen auf dem gleichen Transformationsplasmid befinden. Sie offenbart, dass sich das Endonucleasegen stromaufwärts vom Methylasegen befindet, und lehrt die Verwendung von Methylaseklonen und Oligonucleotiden, die komplementär zum Carboxy-Terminus des Endonucleasegens sind, um das Gen auf den Methylaseklonen zu lokalisieren.
  • Ein weiteres Hindernis für das Klonieren dieser Systeme in E. coli wurde im Verfahren zur Klonierung diverser Methylasen entdeckt. Viele E. coli Stämme (einschließlich solcher, die normalerweise zum Klonieren benutzt werden) haben Systeme, die der Einführung von DNA widerstehen, die Cytosin-Methylierung beinhaltet. (Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 9070-9074, (1986)). Es ist daher auch eine sorgfältige Überlegung erforderlich, welche(r) E. coli Stamme/Stämme zum Klonieren verwendet werden.
  • Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und, in geringerem Maße, Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zum Charakterisieren und Umordnen von DNA im Labor sind, gibt es einen kommerziellen Anreiz, Stämme von Bakterien durch DNA- Rekombinationstechniken zu gewinnen, die diese Enzyme im Überfluss synthetisieren. Solche Stämme wären von Nutzen, da sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen und auch das Mittel zur Herstellung kommerziell nützlicher Mengen bereitstellen würden.
  • In Chemical Abstracts, 1991, 115(11): 109054q: S. 375 wird die Anwendung von sequenzspezifischer DNA- Affinitätschromatographie zur Reinigung nativer SphI Endonuclease auf nahezu Homogenität offenbart. Das SphI Endonuclease kodierende Gen wurde nicht kloniert.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die das Gen für die SphI Restriktionsendonuclease kodiert, erhältlich vom Plasmid pEGsph50-2 (ATTC Nr. 69045), sowie verwandte Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms von der rekombinanten DNA. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen transformierten Wirt, der die Restriktionsendonuclease SphI exprimiert, ein Enzym, das die DNA-Sequenz 5'-GCATGC-3' erkennt und in der Erkennungssequenz zwischen dem zweiten GC- Paar spaltet und einen vierbasigen 3' Überhang hinterlässt, (Fuchs, L. Y., L. Corvarrubias, 1. Escalante, S. Sanchez und F. Bolivar, Gene 10: 39-46, (1980)). SphI Restriktionsendonuclease, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ist im Wesentlichen rein und frei von den Kontaminanten, die normalerweise in Restriktionsendonuclase- Präparaten zu finden sind, die durch konventionelle Techniken, wie in Schritt 13 des 1. Beispiels beschrieben, hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Klonieren des SphI Restriktionsmodifikationssystems umfasst die folgenden Schritte: Selektieren eines geeigneten Vektors, Bilden mehrerer Bibliotheken, die DNA von Streptomyces phaeochromogenes enthalten, Isolieren von Klonen, die DNA enthalten, die die SphI Modifikationsmethylase kodiert, Bestimmen, ob das Endonucleasegen anwesend ist oder nicht, indem nach Endonucleaseaktivität in Stämmen von E. coli und Streptomyces lividans geprüft wird, die den Methylaseklon enthalten, Sequenzieren der klonierten DNA und des Amino-Terminus der SphI Restriktionsendonuclease, wenn die Restriktionsendonuclease in der angegebenen Prüfung nicht nachgewiesen wurde, Lokalisieren des Endonucleasegens auf dem klonierten DNA-Fragment durch Vergleichen dieser Sequenzen, Klonieren der chromosomalen DNA, die den Rest des Endonucleasegens enthält, unter Anwendung einer Southern-Analyse, um Bibliotheken auf den Klon hin zu screenen, Verwenden einer PCR zum Amplifizieren des Restes des Endonucleasegens von diesen Bibliotheken, Rekonstruieren des intakten Endonucleasegens, Klonieren des intakten Endonucleasegens hinter einem regulierten Promotor und Transformieren von diesem in einen Wirt, der zuvor mit NlaIII Methylasegen auf einem Plasmid mittlerer Kopiezahl geschützt wurde.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Fig. 1 stellt das bevorzugte Verfahren zum Klonieren und Produzieren der SphI Restriktionsendonuclease dar. Zu Beginn des Klonierungsprojekts war weder bekannt, welche Endonucleasen oder Bedingungen beim Klonieren des SphI Restriktionsmodifikationssystems erfolgreich sein würden, noch der Ort, an dem sich die Restriktions- und Modifikationsgene innerhalb solcher Klone befanden. Die Klonierungsergebnisse und nachfolgende DNA-Sequenzierung, Kartierung und Charakterisierung der Klone, die in Fig. 1 und im 1. Beispiel beschrieben werden, decken den bisher unbekannten direkten Weg zum Klonieren und Exprimieren des SphI- Restriktionsmodifikationssystems auf.
  • Fig. 2 ist eine Karte des PstI Teilklons pSphM6.0, der von der Methylaseselektion der PstI Bibliothek erhalten wird.
  • Fig. 3 ist ein schematisches Diagramm der Isolierung des SphI Restriktionsendonucleasegenrestes von einer KasI Bibliothek, präpariert von genomischer S. phaeochromogenes-DNA. Der große gepunktete Kasten im oberen Teil der Figur stellt die KasI Bibliothek dar. Die beide Kreise in dem Kasten sind die beiden Plasmide, unter vielen verschiedenen Klonen, die den Rest des SphI Restriktionsendonucleasegens enthalten (wie durch den langen Pfeil in dem Kreis angedeutet). Die Pfeilspitzen geben den Ort an, an dem sich die zum Amplifizieren des gewünschten Fragments aus der KsasI Bibliothek verwendeten Primer befinden würden. Der kleine Kasten auf den Plasmiden gibt den Standort der multiplen Klonierungsstelle auf dem Vektor an.
  • Fig. 4 ist ein schematisches Diagramm von pEGsph42-1.4 und der Rekonstruktion des Restriktionsendonucleasegens und der PCR zur Gewinnung von pEGsphR50-2. pSphM0.9 ist das 0.9 kb PstI Fragment von pSphM6.0, in pUC19 kloniert. Der auf der Karte von pSphM0.9 angegebene XbaI Ort ist ein Ort innerhalb des Vektors und kein Bestandteil der DNA, die das SphI Restriktionsmodifikationssystem kodiert. Die gestrichelte Linie in pEGsph42-1.4 deutet an, dass diese Region auf der Karte vom Vektor pUC19 ist (einschließlich des notierten Hindlil Ortes) Die fett umrandeten Pfeile unterhalb des rekonstruierten Endonucleasegens geben den Ort und die Richtung der zur PCR des Endonucleasegens verwendeten Primer an, um pEGsphR50-1 zut Überexpression zu konstruieren.
  • Fig. 5 ist ein Foto eines Agarosegels, das den Titer von SphI Restriktionsendonucleaseaktivität illustriert, die von Zellextrakten der NEB Nr. 808 gewonnen wird. Die Nummerierung der Bahnen auf dem Gel erfolgt von links nach rechts, wobei sich Bahn 1 auf der linken Seite des Gels und Bahn 25 auf der rechten Seite befindet. Es wurde ein DNA-Gemisch hergestellt, indem 16 ul pBR322 (16 ug), 80 ul 10K NEBuffer 2, 10 ul PstI (200 U) mit sterilem Wasser auf 800 ul gebracht wurden. 1 ul des von NEB Nr. 808 präparierten Rohextraktes wurde zu 49 ul des DNA-Gemischs gegeben (Fig. 5, Bahn 1). Nach dem Vermischen wurden 5 ul aus diesem Röhrchen genommen und in ein zweites Röhrchen mit 45 ul des DNA-Gemischs gegeben (Fig. 5, Bahn 2). 5 ul wurden aus dem zweiten Röhrchen genommen und in ein drittes Röhrchen mit 45 ul des DNA-Gemischs gegeben (Fig. 5, Bahn 3). 25 ul wurden aus dem dritten Röhrchen genommen und in ein viertes Röhrchen mit 25 ul des DNA-Gemischs gegeben (Fig. 5, Bahn 4). Es fanden 6 weitere 1 : 1-Verdünnungen statt (Fig. 5, Bahnen 5 bis 16). Ähnliche 1 : 1-Verdünnungen fanden bei 1 ul von S. phaeochromogenes gereinigter SphI statt (Fig. 5, Bahnen 18 bis 25), um den Titer des Enzyms im Rohextrakt einzuschätzen. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37ºC wurden 25 ul von jeder Verdünnung auf ein 0,7%iges Agarosegel geladen, das 2 Stunden lang gefahren wurde.
    • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine rekombinante DNA, die die SphI Restriktionsendonuclease kodiert, sowie das Enzym, das von einer solchen rekombinanten DNA produziert wird, wie in den Ansprüchen 1-6 definiert ist.
  • Das Klonieren des SphI Restriktionsendonucleasegens von Streptomyces phaeochromogenes erwies sich als ungewöhnlich schwierig. Keiner der Methylaseklone, die durch das übliche Methylaseselektionsverfahren gewonnen würden, enthielt das gesamte Restriktionsendonucleasegen. Zum Lokalisieren der Restriktionsendonuclease war es erforderlich, die Sequenzen der DNA von den Methylaseklonen und die von gereinigter SphI Restriktionsendonuclease gewonnene aminoterminale Sequenz zu vergleichen. Anhand dieser Ergebnisse wurde geschätzt, dass etwa 200-400 bp kloniert werden müssten, um das gesamte Restriktionsmodifikationssystem zu erhalten. Alle Versuche, die intakte Restriktionsendonuclease durch konventionelle Verfahren zu klonieren, scheiterten jedoch, möglicherweise aufgrund der Letalität des Endonucleasegens und der relativ geringen Expression des SphI Methylasegens. Es wurden die folgenden Verfahren ausprobiert: Klonieren des intakten Restriktionsmodifikationssystems in E. coli sowie in Streptomyces lividans und Klonieren des Restriktionsendonucleasegens in E. coli oder S. lividans, vorgeschützt mit der SphI Methylase. Der 3' Abschnitt des Restriktionsendonucleasegens wurde schließlich durch Konstruieren einer KasI Bibliothek von genomischer S. phaeochromogenes-DNA kloniert (KasI spaltet innerhalb des Restriktionsendonucleasegens und stromabwärts des 3' Endes des Gens). Das korrekte Fragment, das von der Bibliothek durch Amplifizieren des Fragmentes mit PCR isoliert wurde, wurde in pUC19 kloniert. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Primer enthielten eine Sequenz innerhalb des Restriktionsendonucleasegens und innerhalb des zur Konstruktion der Bibliothek verwendeten Vektors. Nach dem Klonieren waren alle Versuche zur Rekonstruktion des Restriktionsendonucleasegens in S. lividans, der mit SphI Methylase unter der Kontrolle des eigenen endogenen Promotors auf einem Plasmid geringer Kopiezahl vorgeschützt wurde, erfolglos. Das intakte Restriktionsendonucleasegen wurde schließlich in E. coli kloniert und exprimiert, indem das Restriktionsendonucleasegen unter der Kontrolle des Ptac Promotors rekonstruiert wurde. Als Wirtsstamm wurde E. coli verwendet, der zuvor mit der NlaIII Methylase auf einem Plasmid pSYX20 mittlerer Kopiezahl geschützt worden war.
  • Frühere Berichte von Bernan et al., ASM Abstracts 89: 206 (1989) und Brooks et al., J. Cell. Biochem. Supplemental 14A: 106 (1990) wiesen darauf hin, dass das Restriktionsendonucleasegen möglicherweise auf dem Methylaseklon enthalten ist, isoliert von einer PstI Teilbibliothek, obwohl im E. coli Wirt keine Expression vorhanden war. Dies war der Fall bei einem anderen Restriktionsmodifikationssystem, isoliert von Streptomyces, SalI (Rodicio und Chater, Mol. Gen. Genet. 213: 349-353 (1988), Slatko et al., unveröffentlichte Ergebnisse). Auf eine DNA- Sequenzierung und aminoterminale Sequenzierung der SphI Restriktionsendonuclease hin wurde allerdings festgestellt, dass das intakte Restriktionsendonucleasegen nicht auf dem Methylaseklon enthalten war.
  • Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem das SphI Restriktionsgen vorzugsweise kloniert und exprimiert wird, ist in Fig. 1 illustriert und umfasst die folgenden Schritte:
  • 1. Die DNA von Streptomyces phaeochromogenes wird gereinigt.
  • 2. Die DNA wird vollständig und/oder teilweise mit einer Restriktionsendonuclease wie PstI oder einem ihrer Isoschizomere verdaut, die das gesamte SphI Methylasegen in (ein) Fragment(e) spaltet. Das/die Fragment(e) sollte(n) auch eine klonierbare Größe haben, d. h. etwa 1,5-13 kb. Es wurde gefunden, dass andere getestete Endonucleasen nicht die oben beschriebenen Bedingungen erfüllten; dazu gehören ClaI, EcoRI, HindII, NdeI, NheI, NsiI und XbaI.
  • 3. pBR322 (oder irgendein ariderer Vektor, der wenigstens einen SphI Ort vorzugsweise in einem Antibiotika-Resistenzgen hat) wird als Klonierungsvektor bevorzugt, da er einen SphI Ort innerhalb des Tetracyclin-Resistenzgens enthält.
  • 4. Die verdauten DNAs werden mit dem Klonierungsvektor ligiert. Die resultierenden Gemische werden zum Transformieren eines geeigneten Wirts verwendet, d. h. ein hsdr, mcrBC&supmin; Stamm, wie E. coli Stamm RR1 oder K802 (jeweils ATCC 31343 und ATCC 33526).
  • 5. Die DNA/Zellgemische werden vorzugsweise auf reichhaltiges Medium plattiert, das ein Antibiotikum wie Tetracyclin enthält, das für transformierte Zellen selektiv ist. Nach der Inkubation werden die transformierten Zellkolonien zusammen geerntet, um die Primärzellbibliotheken zu bilden. Wie zuvor beschrieben wurden letztendlich insgesamt 10 solcher Primärzellbibliotheken unter Verwendung verschiedener Kombinationen von Klonierungsendonucleasen und einer kompletten oder teilweisen Verdauung der genomischen Streptomyces phaeochromogenes-DNA durch die jeweilige Klonierungsendonuclease konstruiert.
  • 6. Die rekombinanten Plasmide werden in toto von den Primärzellbibliotheken gereinigt, um die Primärplasmidbibliotheken herzustellen.
  • 7. Die gereinigten Plasmidbibliotheken werden dann in vitro vollständig mit der SphI Restriktionsendonuclease verdaut, die von Streptomyces phaeochromogenes Zellen präpariert wird, oder mit irgendeinem SphI Isoschizomer wie BbvI oder PaeI. Eine SphI Restriktionsendonucleaseverdauung führt zur selektiven Zerstörung unmodifizierter Klone, die keine Methylase enthalten, was in einer Zunahme der relativen Frequenz von SphI Methylase enthaltenen Klonen resultiert. Exonuclease und/oder Phosphatase kann ebenfalls zur Verdauung gegeben werden, um die Zerstörung von Klonen ohne Methylase zu verbessern.
  • 8. Identifikation von SphI Methylaseklonen: Die verdauten Plasmidbibliothek-DNAs werden zurück in einen geeigneten Wirt wie E. coli Stamm RR1 oder K802 transformiert, und transformierte Kolonien werden wieder durch eine Plattierung auf Antibiotikaplatten gewonnen. Die Kolonien werden aufgenommen und ihre DNA wird auf die Anwesenheit des SphI- Modifikationsgens hin in der folgenden Weise analysiert: die Plasmid-DNA wird gereinigt und in vitro mit SphI Restriktionsendonuclease inkubiert, um zu bestimmen, ob sie gegenüber einer Verdauung durch SphI resistent ist.
  • 9. Nachdem der Nachweis erbracht wurde, dass das Methylasegen kloniert wurde, wird der Klon auf SphI Restriktionsendonucleaseaktivität hin geprüft. Wird eine Aktivität nachgewiesen, dann ist das SphI Restriktionsgen mit dem Methylasegen gekoppelt und im Klon anwesendl. In diesem Fall könnte zu Schritt 12 unten übergegangen werden. Wird keine Restriktionsaktivität nachgewiesen, dann bedeutet dies, dass das Restriktionsgen nicht mit dem Methylasegen gekoppelt ist, oder dass es gekoppelt aber nicht mit dem Methylasegen intakt kloniert ist, oder dass es intakt kloniert aber nicht exprimiert ist. Um zu bestimmen, welche der oben genannten drei Möglichkeiten vorliegt, wird das klonierte Fragment restriktionskartiert und es werden Deletionen gemacht, um zu ermitteln, wo die relative Position des Methylasegens in dem klonierten Fragment ist. Anhand dieser Informationen wird dann bestimmt, ob genügend DNA auf beiden Seiten des Methylasegens zur Kodierung eines Restriktionsgens vorhanden ist, wenn es gekoppelt wäre. Ist genügend DNA vorhanden, dann wird davon ausgegangen, dass das Restriktionsgen nicht gekoppelt ist oder in dem Klon vorhanden aber nicht exprimiert ist (zu Schritt 10 übergehen). Ist nicht genügend Platz auf beiden Seiten des Methylasegens in der klonierten DNA vorhanden, um ein gekoppeltes Restriktionsgen zu kodieren, wie für den PstI Klon der vorliegenden Erfindung, pSphM6.0, festgestellt wurde, dann wird ein Teil des Methylasegens verwendet, um Verdaus des Streptomyces phaeochromogenes Chromosoms zu sondieren, um durch Southern-Hybridisierung eine genomische Karte der Region zu erzeugen, die sich über die Grenzen der existierenden klonierten DNA erstreckt. Diese Daten helfen bei der Identifikation bestimmter Endonucleasen, die die Restriktionsmodifikationsregion in individuelle Fragmente spalten, die das Methylasegen sowie größere Mengen von benachbarter DNA beinhalten. Die exakten Größen der durch solche Endonucleasen erzeugten Fragmente werden ebenfalls anhand der Daten berechnet. Wird festgestellt, dass die Restriktions- und Modifikationsgene gekoppelt sind, dann würden solche Fragmente vermutlich auch das Restriktionsgen kodieren.
  • 10. Frühere Erfahrungen mit Restriktionsmodifikationssystemen, die von Streptomyces oder Nocardia isoliert sind, haben gezeigt, dass Klone, die das Restriktionsendonucleasegen enthalten, aufgrund der geringen Expression des Gens in E. coli nicht mit dem üblichen Rohzellextrakttest identifiziert werden können. Allerdings können Gene von Nocardia und Streptomyces oft auf nachweisbarem Niveau exprimiert werden, wenn sie in Streptomyces lividans kloniert werden. Ein Fragment vom Klon pSphM6.0 mit dem Methylasegen und möglicherweise dem Endonucleasegen wird auf einen Streptomyces-Vektor wie pIJ486 subkloniert (beschrieben in der Veröffentlichung von Ward, J. M. et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478) und in S. lividans transformiert. Die resultierenden Klone in S. lividans werden in Bezug auf Methylase- und Endonucleasegenexpression untersucht. Wird Endonuclease von dem Klon in S. lividans exprimiert, dann ist das Endonucleasegen kloniert, aber nicht in E. coli exprimiert (zu Schritt 12 übergehen). Ist keine Expression wie in der vorliegenden Erfindung vorhanden, dann wird die SphI Endonuclease möglichst nahe an Homogenität von Streptomyces phaeochromogenes gereinigt und die aminoterminale Sequenz der ersten 10 bis 20 Aminosäuren bestimmt. Diese Proteinsequenzinformation wird mit der translatierten DNA- Sequenz des Methylaseklons verglichen, um zu bestimmen, ob sich das Endonucleasegen auf diesem klonierten Fragment befindet, und, wenn dies der Fall ist, wo sich der Anfang des Endonucleasegens auf diesem Fragment befindet. Gleichzeitig wird die Größe des Restriktionsendonucleaseproteins mit Proteingelen auf etwa 27 kD festgelegt. Dies bedeutet, dass die Menge an DNA, die notwendig ist, um das Endonucleasegen zu kodieren, bei etwa 0,8 kb liegt. Klone, die die SphI Restriktionsendonuclease beinhalten, werden als solche identifiziert, die die Sequenz in Verbindung mit dem Amino- Terminus der Endonuclease enthalten und wenigstens 0,8 kb DNA stromabwärts von dieser Sequenz beinhalten. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde jedoch gefunden, dass keiner der isolierten Methylaseklone genügend DNA stromabwärts vom Endonucleaseanfang enthielt, um das Endonucleasegen vollständig zu kodieren.
  • 11. Klonieren des Rests des SphI Restriktionsendonucleasegens: Alle Versuche, das intakte Restriktionsendonucleasegen mit oder ohne Methylasegen in einen E. coli oder S. lividans Wirt zu klonieren, der ungeschützt oder mit der SphI Methylase vorgeschützt war, scheiterten. Zur Gewinnung des SphI Restriktionsendonucleasegens Ist es notwendig, zunächst nur den 3' Abschnitt des Restriktionsendonucleasegens zu klonieren. Eine Bibliothek von genomischer S. phaeochromogenes-DNA wird mit einer Restriktionsendonuclease konstruiert, die innerhalb und stromabwärts vom 3' Ende des Restriktionsendonucleasegens wie durch Southern-Blot-Analyse bestimmt zerschneidet. Nachdem die Bibliothek präpariert wurde, kann der korrekte Klon, der den 3' Abschnitt des Restriktionsendonucleasegens enthält, entweder durch Grunstein-Kolonie- oder Southern-Hybridisierung identifiziert und anschließend isoliert oder amplifiziert werden von der Bibliothek unter Anwendung einer PCR- Amplifizierung. Mit dem isolierten Klon des Fragmentes, das das 3' Ende des Restriktionsendonucleasegens enthält, kann das Restriktionsendonucleasegen rekonstruiert werden, um das intakte Gen zu erhalten.
  • 12. Überexpression: Es gibt viele Möglichkeiten zum Überexprimieren des Klons, der das Restriktionsgen enthält. DNA-Sequenz-, detaillierte Kartierungs- und Deletionsdaten helfen bei der Bestimmung des besten Ansatzes zur Überexpression des Restriktionsendonucleasegeris. Ein Ansatz zur Überexpression umfasst das Einsetzen eines Promotors, der von E. coli gut erkannt wird, wie Ptac auf pAGR3 (von W. Jac k, New England Biolabs) direkt vor den Anfang des Restriktionsendonucleasegens. Dies kann dadurch erreicht werden, dass geeignete Restriktionsorte in der Nähe des Anfangs und Endes des Restriktionsendonucleasegens und kompatible Restriktionsorte in der Nähe des Promotors von pAGR3 gefunden werden und das Restriktionsgen in pAGR3 in Übereinstimmung mit dem Ptac Promotor übertragen wird. Alternativ können Primer entwickelt werden, die direkt vor dem Restriktionsendonucleasegen und irgendwo stromabwärts des Restriktionsendonucleasegens hybridisieren, um die Polymerasekettenreaktion zum Amplifizieren des gesamten Restriktionsendonucleasegens zu verwenden. Das resultierende DNA-Fragment kann in einen Expressionsvektor wie pAGR3 direkt stromabwärts von einem induzierbaren Promotor (Ptac) eingesetzt werden. Andere verwendbare regulierte Promotoren sind PlacUV5 (Fuller, Gene 19: 43-54, (1982)) und 1PL (Shimatake und Rosenberg, Nature 254: 28, (1981)) auf pUC19 und pBR322 Derivaten, und ein T7 Promotor auf dem pET3A Vektor (von William Studier, Brookhaven National Lab., Upton, NY). Darüber hinaus kann eine starke Ribosomenbindungsstelle (Shine & Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 1342-1346, (1974)) vor das Gen gesetzt werden, um die Expression zu erhöhen. Gemäß der vorliegenden Erfindung muss der Wirt vor Restriktionsendonucleaseverdauung vorgeschützt werden, damit ein stabiler Klon erhalten wird, der die Restriktionsendonuclease überexprimiert. Dies wird durch Klonieren in der SphI Methylase oder einer heterologen Methylase wie NlaIII erzielt, die vor SphI Verdauung schützt, indem Orte modifiziert werden, die SphI Restriktionsorte überlappen, auf einem separaten Plasmid. Das verwendete Plasmid muss mit dem Expressionsvektor kompatibel sein. Die Methylase muss außerdem auf einem Niveau produziert werden, das das Genom des Wirts vör Verdauung durch das überexprimierte Restriktionsendonucleasegen schützt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass das auf einem Plasmid geringer Kopiezahl, wie pACYC184, klonierte SphI Methylasegen keinen vollständigen Schutz erbrachte. Unter Verwendung des auf einem Plasmid mittlerer Kopiezahl klonierten NlaIII Methylasegens wurde ein voller Schutz des Wirtsgenoms vor SphI Verdauung beobachtet.
  • Die DNA-Sequenz des Gens kann durch ortsspezifische Mutagenese oder durch Resynthetisierung des Gens selbst verändert werden, um Codone zu verwenden, die in E. coli effizienter genutzt werden (Ikemura, J. Mol. Biol. 151: 389-409, (1981)).
  • 13. Produktion: Die SphI Methylase oder Endonuclease kann von Klonen, die das SphI Methylasegen (oder eine heterologe Methylase) und das überexprimierte Restriktionsendonucleasegen beinhalten, durch Propagierung in einem Fermenter in einem reichhaltigen Medium mit der geeigneten Antibiotikaauswahl erzeugt werden. Die Zellen werden anschließend durch Zentrifugation geerntet und durch Beschallung gesprengt, um einen Rohzellextrakt zu erzeugen, der SphI Methylase- und Restriktionsendonucleaseaktivität enthält.
  • 14. Reinigung: Der Rohzellextrakt mit der SphI Methylase und Endonuclease wird durch standardmäßige Proteinreinigungstechniken wie Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
  • Obwohl die oben beschriebenen Schritte die bevorzugte Methode zur Umsetzung der vorliegenden Erfindung darstellen, wird es für die fachkundige Person offensichtlich sein, dass der oben beschriebene Ansatz gemäß in der Technik bekannten Verfahren variieren kann.
  • Das folgende Beispiel soll Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung illustrieren, die derzeit bevorzugt werden. Es ist zu verstehen, dass dieses Beispiel der Veranschaulichung dient und dass die Erfindung mit Ausnahme der Angaben in den beiliegenden Ansprüchen nicht als darauf beschränkt anzusehen ist.
    • 1. BEISPIEL Klonierung von SphI Modifikationsmethylase und Restriktionsenduncleasegenen
  • 1. DNA-Reinigung: Zum Präparieren der DNA von Streptomyces phaeochromogenes wurde 1 g Zellpaste durch sanftes 30-minütiges Schütteln in 5 ml 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M EDTA, pH 7,6, resuspendiert. Die Suspension wurde in zwei 3,0-ml-Portionen aufgeteilt. 3,5 ml von 1, 7 mg/ml Lysozym in 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M EDTA, pH 7,6, wurden zu jeder Portion gegeben und jeweils 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. SDS wurde zu 1% und Proteinase K zu 0,13 mg/ml zugegeben; anschließend wurden die Portionen 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Zu jeder wurden 0,4 ml einer Lösung aus 10% SDS und 8% Sarcosyl gegeben und 2 Stunden lang bei 55ºC inkubiert. Die beiden Portionen wurden dann miteinander kombiniert und mit vier DNA-Puffer-Wechsel 24 Stunden lang dialysiert (10 mM Tris-HCl, 1 mM-EDTA, pH 8,0). Die dialysierte DNA-Lösung wurde dann für eine Caesiumchlorid-, Ethidiumbromid-Gleichgewichtsdichtezentrifugation präpariert, indem das Gesamtvolumen mit DNA-Puffer auf 40 rnl erhöht und die DNA-Lösung dann in zwei 20-ml-Portionen aufgeteilt wurde, in die jeweils 20 Gramm Caesiumchlorid und 0,2 ml an 5 mg/ml Ethidiumbromid gegeben wurden. Die DNA-Lösung wurde bei 44.000 UPM 48 Stunden lang zentrifugiert, und die resultierende DNA- Bände wurde mit einer Spritze und einer Nadel Größe 18 entfernt. Ethidiumbromid wurde durch viermaliges Extrahieren mit einem gleichen Volumen an eiskaltem, wassergesättigtem N- Butanol entfernt. Caesiumchlorid wurde per Dialyse beseitigt. Die DNA wurde dann durch Zugeben von NaCl zu 0,5 M und Überschichten eines 0,55 Volumens an Isopropylalkohol darauf präzipitiert. Die präzipitierte DNA wurde auf einen Glasstab gespult. Die DNA wurde in 2 ml 10 mM Tris, 1 rnM EDTA, pH 8,0, auf eine Endkonzentration von etwa 385 gg/ml gelöst.
    • ANMERKUNG ZU DEN SCHRITTEN 2-10
  • Wie oben erwähnt, wurden jeweils insgesamt 5 verschiedene Restriktiorisendonucleasen zum Verdauen des S. phaeochromogenes-Chromosoms verwende, um 10 Bibliotheken zu konstruieren und zu screenen. Da nur die PstI Teilbibliothek Methylaseklone hervorbrachte, werden lediglich die Einzelheiten zur PstI Teilbibliothek aufgeführt. Die übrigen 9 Bibliotheken wurden mit Verfahren präpariert, die den nachfolgend beschriebenen ähnlich sind.
  • 2. Teilverdauung: Die gereinigte DNA wurde mit PstI gespalten, um die folgende Teilverdauung zu erreichen: 100 ul DNA zu 500 ug/ml in 10 mM Tris, pH 7, 5, 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanolpuffer wurden in ein 100-ul- Aliquot und sieben 50-ul-Aliquote aufgeteilt. Zum 100-ul- Röhrchen wurden 40 Einheiten PstI gegeben, um 4 Einheiten Enzym pro ug DNA zu ethalten. 50 ul wurden von dem ersten Röhrchen entnommen und zum zweiten Röhrchen übertragen, um 2 Einheiten PstI/ug zu erhalten, und so weiter, wobei jedes folgende Röhrchen die Hälfte der vorherigen PstI-Menge erhielt. Die Röhrchen wurden 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert und anschließend 15 Minuten lang bei 72ºC wärmebehandelt; 15 ul von jedem wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Röhrchen, die eine moderate, aber unvollständige Verdauung aufwiesen, wurden als Quelle von teilverdauten. Fragmenten zum Klonieren ausgewählt. (Als Teilverdauungsröhrchen wurden die 0,25 U/ug, 0,12 U/ug, 0,06 U/ug und 0,03 U/ug Röhrchen verwendet). Die separaten Reaktionsprodukte wurden miteinander vermischt und wie im folgenden Schritt 3 beschrieben verwendet).
  • 3. Ligation: Die fragmentierte DNA wurde mit pBR322 wie folgt ligiert: 6 ug von mit PstI teilweise verdauter Streptomyces phaeochromogenes-DNA (60 ul) wurden mit 3, 0 ug PstI-gespaltenem und dephosphoryliertem pBR322 (30 ul) vermischt. 20 ul eines 10X Ligationsgemischs (500 mM Tris, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT, 5 mM ATP) wurden zugegeben, plus 110,5 ul steriles destilliertes Wässer, um ein Endvolumen von 198 ul zu erreichen. 7,5 ul konzentrierter T4 DNA-Ligase (2 · 106 U/ml) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei 17ºC 4 Stunden lang inkubiert und dann durch Zugeben von 10 ul Chloroform sterilisiert. Etwa 62,5 ul der ligierten DNA wurden verwendet, um E. coli Stamm K802 wie folgt zu transformieren: die DNA wurde mit 0,5 ml SSC/CaCl&sub2; (50 mM NaCl; 5 mM Na3 Citrat, 67!!rr'YI CaCl&sub2;) auf Eis vermischt und es würde 1,0 ml an eiskalten kompetenten E. coli K802-(hsdR&supmin;M&spplus;, mcrA&supmin;, mcrBC&supmin; ATCC Nr. 33526)-Zellen zugegeben. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei 42ºC wurden die Zellen durch Zugeben von 10 ml Luria-Bouillon (L-Bouillon) verdünnt und dann 4 Stunden lang bei 37ºC inkubiert.
  • 4. Primärzellbibliothek: Die transformierte Zellkultur wurde kurz zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in 1,0 ml L-Bouillon resuspendiert. 200-ul- Portionen wurden auf Luria-Agar-(L-Agar)-Platten mit 25 ug/ml Tetracyclin plattiert. Nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht wurden die jeweiligen Platten mit 2,5 ml 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; geflutet, und die transformierten Kolonien wurden zusammengekratzt und gepoolt, um die Primärzellbibliothek zu bilden.
  • 5. Prirmärplasmidbibliothek: Die Primärplasmidbibliothek wurde wie folgt präpariert: 2,5 ml der Primärzellbibliothek wurden in 500 ml L-Bouillon inokuliert, die 10 ug/ml Tetracyclin enthielt. Die Kultur wurde über Nacht bei 37ºC geschüttelt und anschließend bei 4000 UPM 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entsorgt und das Zellpellet in 10 ml 25%iger Saccharose, 50 mM Tris, pH 8,0, bei Raumtemperatur resuspendiert. Es wurden 5 ml an 0,25 M EDTA, pH 8,0, zugegeben, gefolgt von 3 ml an 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris, pH 8,0. Die Lösung wurde 3 Stunden lang auf Eis gelassen; anschließend wurden 12 ml eines lytischen Gemischs (1% Triton X-100, 50 tuE Tris, pH 8,0, 67 mM EDTA) zwangsweise einpipettiert, und die Zellsuspension wurde zum Erreichen einer Lyse sanft gewirbelt. Nach der Lyse wurde das Gemisch in eine 50-ml-Kunststoffzentrifuge gegeben und bei 17.000 UPM und 4ºC 45 Minuten lang geschleudert. Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. 20,0 g festes CsCl wurden in ein 50-ml- Plastikröhrchen mit Schraubverschluss abgewogen, und 22,0 g des Überstands wurden in das Röhrchen pipettiert und vermischt. 1,0 ml Ethidiumbromidlösung (5 mg/ml Ethidiumbromid in 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) wurde zum Gemisch gegeben. Die Lösung wurde in zwei 5/8 Zoll · 3 Zoll Polyallomer- Zentrifugenröhrchen gegeben, die verschlossen wurden. Diese Röhrchen wurden dann in einem Beckman Ti70 Rotor 42 Stunden lang bei 44000 UPM und 17ºC geschleudert. Zum Auffangen der Plasmide wurde die Oberseite der Röhrchen mit einem Skalpell durchstochen und die untere der beiden fluoreszierenden DNA- Banden mit einer Spritze unter UV-Licht entnommen. Die unteren Banden von beiden Röhrchen wurden in einem Glasröhrchen mit Schraubverschluss kombiniert, und das Ethidiumbromid wurde durch viermaliges Extrahieren mit einem gleichen Volumen an wassergesättigtem, eiskaltem N-Butanol entfernt.
  • Die extrahierte Lösung wurde in einen. Dialyseschlauch gegeben und 24 Stunden lang dialysiert, wobei der DNA-Puffer viermal gewechselt wurde. Die dialysierte DNA-Lösung wurde dann in ein zuvor gewogenes steriles 50-ml-Zentrifugenröhrcheh übertragen und ihr Volumen gemessen. 5 M NaCl wurden auf eine Endkonzentration von 0,4 M zugegeben, anschließend wurden 2 Volumen Isopropanol zugegeben und vermischt. Die Lösung wurde über Nacht bei -20ºC-gelagert, um die DNA zu präzipitieren. Nach dem Präzipitieren wurde die Lösung bei 15000 UPM und 0ºC. 15 Minuten lang geschleudert und der Überstand wurde entsorgt. Das Röhrchen wurde auf der Bank gelassen und 15 Minuten lang an der Luft getrocknet; anschließend wurde das DNA-Pellet in 500 ul DNA-Puffer gelöst und bei -20ºC aufbewahrt. Die DNA- Konzentration von Plasmiden, die in dieser Weise präpariert wurden, lag bei 100 bis 200 ug/ml.
  • 6. Verdauung des Plasmid-Pools: Der gelgereinigte Primärplasmidpool wurde verdaut, um Klone ohne SphI-Methylase wie folgt zu zerstören: die Plasmid-DNA wurde auf 30 ug/ml in SphI-Puffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM β-Mercaptoethanol) verdünnt. Es wurde eine Gesamtmenge von 900 ul präpariert. 16 U/ug SphI wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC 2 Stunden lang inkubiert. Das Enzym in dem Reaktionsprodukt wurde durch 12-minütiges Erwärmen bei 72ºC abgetötet. ExoIII-Nuclease wurde in einer Konzentration von 50 U/ug DNA zum Verdau gegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37ºC wurden 10 ul Chloroform zum Röhrchen gegeben. Das Chloroform wurde durch Zentrifugation beseitigt.
  • 7. Transformation: Eine 12,5-ul-Probe von jedem Röhrchen wurde zum Transformieren von E. coli RR1 verwendet. Nach einer dreiminütigen Inkubation bei 42ºC und einer Wachstumszeit von 45 Minuten in L-Böuillon bei 37ºC wurden die Zell-/DNA-Gemische auf L-Agarplatten mit 25 ug/ml Tetracyclin plattiert. Nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht wurden die Platten untersucht. Es wurde gefunden, dass die Verdauung der Plasmidbibliothek mit SphI die Transformantenzahl um einen Faktor von etwa 103 reduziert hatte.
  • 8. Analyse überlebender Individuen: 28 der überlebenden Kolonien, die im Abschnitt 7 gewonnen wurden, wurden in 10-ml- Kulturen von L-Bouillon mit Tetracyclin heranreifen gelassen, und die in ihnen enthaltenen Plasmide wurden durch das folgende Miniprep-Plasmidreinigungsverfahren präpariert, das vom Verfahren von Birnboin und Doly adaptiert war (Nucleic Acids Res. 7: 1513 (1979)).
  • Miniprep-Verfahren: Jede Kultur wurde bei 8000 UPM 5 Minuten lang zentrifugiert; der Überstand wurde entsorgt und das Zellpellet in 1,0 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, pH 8,0, mit 1 mg/ml Lysozym resuspendiert. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden 2,0 ml an 0,2 M NaOH, 1% SDS in jedes Röhrchen gegeben, und die Röhrchen wurden zur Zelllyse geschüttelt und dann auf Eis gelegt. Nachdem sich die. Lösungen geklärt hatten, wurden 1,5 ml an 3 M Natriumacetat, pH 4,8, zu jeder Lösung gegeben und geschüttelt. Die sich ausbildenden Präzipitate wurden bei 15000 UPM und 4ºC 10 Minuten. lang zentrifugiert. Die jeweiligen Überstände wurden in ein Zentrifugenröhrchen mit 3 ml Isopropanol gegeben und vermischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen bei 15000 UPM 10 Minuten lang geschleudert, um die präzipitierten Nucleinsäuren zu pelletieren. Die Überstände wurden entsorgt und die Pellets bei Raumtemperatur 30 Minuten lang luftgetrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Pellets in 850 ül 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, resuspendiert. 75 ul 5 M NaCl wurden jeweils zugegeben, und die Lösungen wurden in Eppendorf- Röhrchen mit 575 ul Isopropanol gegeben und noch einmal 10 Minuten lang bei Raumtemperatur präzipitiert. Die Röhrchen wurden dann 45 Sekunden lang in einer Mikrofuge geschleudert, die Überstände wurden entsorgt und die Pellets an der Luft getrocknet. Die Pellets wurden dann in 500 ul 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA mit 100 ug/ml RNase gelöst und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, um die RNA zu verdauen. Die DNA wurde noch einmal durch Zugeben von 50 ul an 5 M NaCl präzipitiert, gefolgt von 350 ul Isopropanol. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die DNA 45 Sekunden lang durch Zentrifugieren geschleudert, die Überstände wurden entsorgt und die Pellets in einer endgültigen Lösung aus 150 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, wieder aufgelöst. Die Plasmid-Minipreps wurden anschließend durch Verdauung mit SphI analysiert.
  • 9. Methylasegenklone: Es wurde ein Plasmid entdeckt, das gegen SphI beständig war und zwei PstI Fragmente enthielt (Fig. 2). An dem vom E. coli Klon präparierten Extrakt wurde die folgende In-vitro-Restriktionsprüfung durchgeführt:
  • Eine 50-ml-Kultur des hinsichtlich Endonucleaseaktivität zu testenden Klons wurde über Nacht in L-Bouillon plus 25 ug/ml Tetracyclin bei 37ºC heranreifen gelassen. Die Zellen wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 5000 UPM pelletiert. Der Überstand wurde entsorgt und das Pellet in 3 ml Beschallungspuffer (20 mM KPO&sub4;, pH 7,4, 10 mM β- Mercaptoethanol) resuspendiert. Lysozym wurde zur Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 200 ug/ml zugegeben. Dieses Gemisch wurde 3 Stunden lang auf Eis belassen und anschließend bei -20ºC eingefroren. Das Gemisch wurde auf Eis aufgetaut, und 2 ml dieser Suspension wurden mit 2 ml Beschallungspuffer vermischt. 0,4 ul einer 25%igen Lösung von Triton X-100 wurden zur Suspension gegeben und durch Auf- und Abpipettieren vermischt. Die gesprengten Zellen wurden 10 Minuten lang bei 5000 UPM geschleudert. Der Überstand wurde hinsichtlich Restriktionsendonucleaseaktivität untersucht, indem 7,5 ul des Zellextrakts mit 120 ul an 1X SphI-Puffer und 50 ug/ml pBR322 DNA (vorverdaut mit PstI) 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert wurden. Eine durch Elektrophorese geprüfte 15- ul-Probe wies keine Anzeichen für eine Restriktionsendonucleaseaktivität auf.
  • 10. Standort des Methylasegens innerhalb der 4, 5 und 0,9 kb PstI-Inserts: Der SphI-Methylaseklon wurde mit zahlreichen Restriktionsendonucleasen verdaut, um eine Restriktionskarte der klonierten DNA zu erzeugen. Unter Verwendung der Karte wurden verschiedene Regionen innerhalb des Inserts deletiert, um den resultierenden Einfluss auf die Methylierung zu bestimmen. Anschließend wurde der genaue Standort des ~1 kb Methylasegens ermittelt, das den PstI Ort überspannt, und die Länge von klonierter DNA auf beiden Seiten des Gens betrug 3,5 und 0,4 kb. Der Methylaseklon hätte nicht genügend DNA (0,4 kb) auf der rechten Seite des Methylasegens, um ein gekoppeltes Restriktionsendonucleasegen zu kodieren, hätte jedoch genügend Platz auf der linken Seite des Methylasegens. Da jedoch der Abstand zwischen den beiden Genen, die exakte Größe der Gene und ob sie gekoppelt wären oder nicht, nicht bekannt waren, war das Fehlen von SphI Endonucleaseaktivität im Klon ein Hinweis darauf, dass das Restriktionsgen entweder nicht im Klon anwesend war, oder dass es anwesend aber nicht exprimiert war. In dem Fall, dass das Restriktionsgen anwesend war und nicht exprimierte, wurde das klonierte Methylasegen mit benachbarter DNA in einen Streptomyces-Vektor subkloniert, der zum Transformieren von Streptomyces lividans verwendet wurde (Schritt 11, 12). Darüber hinaus fand eine DNA-Sequenzierung und Proteinsequenzierung der Methylaseklone statt, um zu bestimmen, ob das Restriktionsgen teilweise, komplett oder überhaupt nicht in den Klonen anwesend war (Schritte 13-14). In dem Fall, dass das gesamte Restriktionsgen nicht vorlag, wurde die Klonierung größerer Regionen von DNA neben dem Methylasegen erreicht (Schritte 15-17).
  • 11. Klonierung der SphI Methylasesubklone in S. lividans: Bei dem Methylaseklon war genügend DNA auf einer Seite des Methylasegens kloniert, um ein Restriktionsendonucleasegen zu kodieren, wenn es gekoppelt wäre, und je nach dem exakten Standort des Methylasegens. Da der Klon jedoch keinerlei Restriktionsendonucleaseaktivität exprimierte und da weiterhin kein Beweis dafür vorlag, dass die beiden SphI Restriktionsmodifikationsgene gekoppelt waren, wurde beschlossen zu versuchen, die Methylasesubklone in S. lividans zu klonieren, eine Spezies, die enger mit S. phaeochromogenes als mit E. coli verwandt ist. [Nachfolgend wird das Klonieren des 3,6 kb ApaI-BglII Fragments von pSphM3.6 beschrieben; ein ähnliches Subklonierungsexperiment wurde mit einem 2,6 kb ApaI- SnaßI Fragment durchgeführt, das von pSphM2.6 isoliert war (Standort der Orte s. Fig. 2). Die Ergebnisse waren gleich; der Kürze halber wird hierin daher nur die ApaI-BglII Subklonierung ausführlich beschrieben.] 15 ul (1,0 ug) pSphM3.6 wurden in 50 ul 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 100 ug/ml Rinderserumalbumin, 50 mM NaCl mit 20 U EcoRI, 20 U ScaI und 20 U Hindill bei 37ºC 2 Stunden lang verdaut. Das gesamte Volumen wurde in einem 0,7%igen Agarosegel 2 Stunden lang einer Elektrophorese unterzogen. Das 3,6 kb EcoRI-HindIII Restriktionsfragment wurde durch Elektrophorese in DEAE- Anionenaustauschpapier über einen Zeitraum von 2 Stunden aufgefangen. Das Papier wurde zweimal in 150 ul eines Puffers gewaschen, der 0,1 M NaCl; 10 mM Tris, pH 8,0, und 1 mM EDTA enthielt. Anschließend wurde die DNA von dem Papier eluiert, indem das Papier viermal mit 75 ul eines Puffers gewaschen wurde, der 1,0 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, und 1 mM EDTA enthielt. Die resultierende Lösung, die das DNA-Fragment enthielt, wurde mit 300 ul Phenol/Chloroform und anschließend mit 300 ul Chloroform extrahiert und mit 1 ml absolutem Ethanol präzipitiert, indem sie 15 Minuten lang in ein Trockeneis/Ethanol-Bad gegeben wurde. Die DNA wurde 5 Min. lang bei 14. 000 UPM pelletiert. Das Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gespült, an der Luft getrocknet und in einem Endvolumen von 10 ul 10 mM Tris, pH 8, und 1 mM EDTA resuspendiert: 10 ul (0,5 ug) des EcoRI-HindIII-gereinigten DNA-Fragments wurden mit 2 ul (0,2 ug) EcoRI-HindIII-gespaltenem und dephosphoryliertem pIJ486 (pIJ486 wurde von Hopwood, D. A. aus Norwich, England erhalten) in einem Endvolumen von 50 u1 in 1 · Ligationspuffer mit 1 ul T4 DNA-Ligase (400 U) bei 12ºC über Nacht ligiert. 10 ul des Ligationsgemischs wurden zu etwa 4 · 109 5. lividans TK24 (erhalten von Hopwood, D. A.. TK24 wird in Hopwood, D. A., et al. Genetic Manipulation of Streptomyces, a Laboratory Manual beschrieben) Protoplasten, die wie in Hopwood D. A., et al., ibid, beschrieben präpariert waren, in 2 Puffer gegeben [103 g Saccharose, 0,25 g K&sub2;SO&sub4;, 2,02 g MgCl&sub2;·6H&sub2;O, 2 ml Spurenelementlösung und destilliertes Wässer zu 800 ml. 80 ml Aliquoten wurden ausgegeben und autoklaviert. Vor der Verwendung erfolgte die folgende Zugabe je 80 ml: 1 ml 0,5% KH&sub2;PO&sub4;, 10 ml 3,68% CaCl&sub2;·2H&sub2;O und 10 ml 5,73%' TES Puffer, pH 7,2. Spurenelementlösung je Liter: 40 mg ZnCl&sub2;, 200 mg FeCl&sub3;·6H&sub2;O, 10 mg CuCl&sub2;·4H&sub2;O, 10 mg MnCl&sub2;·4H&sub2;O, 10 mg Na&sub2;B&sub4;O&sub7;·10H&sub2;O und 10 mg (NH&sub4;)6Mo&sub7;O&sub2;&sub4;·4H&sub2;O]. 0,5 ml an 25%igem Polyethylenglykol 1000 wurden zum Protoplasten/DNA-Gemisch gegeben. Dieses wurde dreimal in einer 1-ml-Pipette auf - und abgezogen. 0, 1 ml des Transformationsgemischs wurden jeweils auf sechs R2YE-Platten plattiert [103 g Saccharose, 0,25 g K&sub2;SO&sub4;, 10,12 g MgCl&sub2;·6H&sub2;O, 10 g Glucose, 0,1 g Difco Casaminosäurenhydrolysat und 800 ml H&sub2;O. 80 ml dieser Lösung wurden mit 2,2 g Difco-Agar vermischt und autoklaviert. Zum Präparieren der Platten wurde die Basisagarlösung geschmolzen und die folgenden sterilen Lösungen wurden zugegeben: 1 ml 0,5% KH&sub2;PO&sub4;, 8 ml 3,68% CaCl&sub2;·2H&sub2;O, 1,5 ml 20% L-Prolin, 10 ml 5,73% TES-Puffer, pH 7,2, 0,2 ml Spurenelementlösung und 0,5 ml IN NaOH. Die Platten würden abgegossen und in einer Laminarbox über einen Zeitraum von mindestens 1 Stunde getrocknet]. Die Platten wurden nach einer Inkubation bei 30ºC über Nacht mit 1,0 ml einer wässrigen Lösung aus Thiostrepton (0,5 mg/ml) überschichtet. Die Platten wurden 3 bis 4 Tage lang wieder bei 30ºC gehalten, bis die Kolonien herangereift waren.
  • 12. Analyse von Transformanten: Die von der Thiostrepton- Selektion gewonnenen Kolonien wurden auf R2YE-Platten mit 5 ug/ml Thiostrepton für isolierte Kolonien ausgestrichen. Nach dem Heranreifen wurden diese zum Inokulieren von 5 ml TSB, Oxoid Tryptone Soya Broth, mit 5 ug/ml Thiostrepton verwendet. Diese Kulturen wurden bei 30ºC mit Belüftung 24 Stunden lang inkubiert. Minipreps wurden an 1 ml der Kulturen durchgeführt. Dieses Verfahren ist identisch mit dem von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Res. 7 : 1513 (1979)) beschriebenen Verfahren, mit der Ausnahme, dass eine 30-minütige Inkubation in 4 mg/ml Lysozym, 50 mM Glucose, 25 mM Tris, pH 8,0, und 10 mM EDTA bei 37ºC erforderlich ist, bevor die NaOH-SDS-Lösung zugegeben wird. 10 ul der Miniprep-DNA wurden durch Fahren auf einem 0,7%igen Agarosegel analysiert. Bei 2 der 6 Klone schien das Fragment mit korrekter Größe in pIJ486 eingesetzt zu sein. Sporen von diesen beiden Isolaten wurden geerntet und zum Inokulieren von 500 ml TSB mit 5 ug/ml Thiostrepton verwendet. CsCl-Plasmid-Preps wurden auf den Kulturen gemäß einer maßstäblich vergrößerten (20fach) Version des Verfahrens 3 präpariert, S. 93 in Hopwood et al. ibid. Das resultierende Pellet wurde in 17 ml 10 ml Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 18,7 g CsCl und 0,44 ml Ethidiumbromid (5 mg/ml) resuspendiert. Die Lösung wurde in zwei 5/8 Zoll · 3 Zoll Polyallomer- Zentrifugenröhrchen übertragen, die verschlossen wurden. Diese Röhrchen wurden in einem Beckman Ti70 Rotor bei 44.000 UPM und 17ºC 48 Stunden lang zentrifugiert. Zum Auffangen der Plasmide wurde der Deckel der Röhrchen mit einem Skalpell durchstochen und die untere der beiden fluoreszierenden DNA-Banden mit einer Spritze unter UV-Licht aufgenommen. Die unteren Banden von beiden Röhrchen wurden in einem 15-ml-Corexröhrchen kombiniert, und das Ethidiumbromid wurde durch Zugeben eines gleichen Volumens an Wasser und drei Volumen Ethanol beseitigt. Nach 2 Stunden bei -20ºC wurde die DNA durch 20-minütiges Schleudern bei 12.000 UPM pelletiert. Das Pellet wurde in 2 ml 10 mM Tris, pH 8,0, d mM EDTA resuspendiert. 50 ul an 8 M LiCl wurden zugegeben, und die DNA wurde zuerst mit Phenol/Chloroform und dann mit Chloroform extrahiert. Die DNA wurde durch Zugeben von 3 Volumen Ethanol zur wässrigen Lösung wie oben beschrieben präzipitiert. Das Pellet wurde in 500 u1 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA resuspendiert. Das gereinigte Plasmid würde mit EcoRI und HindIII verdaut, um die Anwesenheit des Inserts zu bestätigen, sowie mit SphI, um zu ermitteln, ob der Subklon Th S. lividans irgendeine SphI-Methylaseaktivität aufwies. Beide Subklone waren anscheinend identisch, hatten den korrekten Aufbau und hätten Methylaseaktivität, d. h. sie konnten mit der SphI Restriktionsendonuclease nicht verdaut werden. Für einen Test hinsichtlich SphI Restriktionsendonucleaseaktivität wurden 50 ml einer Kultur, die in der gleichen Weise wie die für die Plasmid-Präparation verwendete heranreifen gelassen wurde, pelletiert. Das Pellet wurde mit 10,3% Saccharose gewaschen und bei -70ºC eingefroren. Nach dem Auftauen wurde das Pellet in 3 ml/g Nasszellengewicht mit einer Lösung aus 50 mM Tris, pH 8,0, 7 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM PMSF, 1 mM Na Azid und 200 mM NaCl resuspendiert. Nach einer Beschallung auf Eis wurden Bruchstücke durch Zentrifugation bei 16.000 UPM über einen Zeitraum von 45 Minuten entfernt. Der Überstand wurde auf SphI Restriktionsendonucleaseaktivität hin untersucht. Diese Subklone mit der Bezeichnung pEGsphM2-4 und pEGsphM2-6 hatten keine nachweisbare SphI Endonucleaseaktivität in S. lividans. Dies war ein Hinweis darauf, dass entweder das SphI Restriktionsendonucleasegen nicht mit dem SphI Methylasegen gekoppelt oder das Restriktionsendonucleasegen auf dem SphI Methylaseklon nicht intakt war.
  • 13. Zum Bestimmen, ob das Endonucleasegen auf den klonierten Fragmenten vorhanden war, und wenn ja wo, wurde die SphI Restriktionsendonuclease wie folgt möglichst nahe an Homogenität gereinigt:
  • 1,1 Liter Rohzellextrakt von 413 g Streptomyces phaeochromogenes wurden über die folgenden Säulen in der folgenden Reihenfolge gegeben: Phosphocellulose, Heparin- Sepharose, Q-Sepharose, MonoQ HPLC und Mono-S HPLC, woraus sich ~50% an reinem SphI Restriktionsendonucleasepräparat ergaben.
  • 25 bis 30 pM der gereinigten SphI Restriktionsendonuclease wurden zur aminoterminalen Proteinsequenzierung auf einem Gasphasen-Proteinsequenzierungsautomaten von Applied Biosystems Modell 470 A verwendet. Die ersten 13 Aminosäurereste der Restriktionsendonuclease wurden wie folgt bestimmt: Thr Ser Lys Asp Pro Ile Val Leu Ser Ala Asp Gln Ile (SEQ ID Nr. 1).
  • 14. Mit einer DNA-Sequenzierung der Region wurde bestätigt, dass die 5' Region des Restriktionsendonucleasegens auf dem PstI Teilklon pSphM6.0 vorhanden war, dass aber nicht das gesamte Restriktionsendonucleasegen auf dem Klon anwesend war, dass sich das Restriktionsgen stromabwärts des Methylasegens befand und dass es in der gleichen Richtung wie das Methylasegen transkribiert wurde (SEQ ID Nr. 2). Die Sequenz stellte außerdem Daten als Grundlage für nachfolgende Manipulationen bereit, um den Rest des Restriktionsendonucleasegens zu klonieren und dann die Expression des klonierten Gens in E. coli zu induzieren.
  • 15. Eine genomische Karte der benachbarten Regionen wurde mit der Southern-Blot-Technik bestimmt (Southern, E. 1975, J. Mol. Bio., 98 : 503), um zu ermitteln, welche Enzyme zum Klonieren des Rests des Restriktionsendonucleasegens am geeignetesten sind. Es wurden mehrere Klone, die das Methylasegen entweder teilweise oder ganz enthielten, zum Sondieren der Southerns verwendet, insbesondere das 0,9 kb PstI Fragment oder das 1,4 kb SmaI-ApaI Fragment (Fig. 2), das in pUCl9 kloniert ist. Diese Plasmide wurden wie folgt einer Nick-Translation unterzogen: 1 ul (0,5 ug) DNA, 10 ul Puffer (500 mM Tris, pH 7,8, 100 mM β-Mercaptoethanol, 50 mM MgCl&sub2;), 4 ul dNTPs (jeweils 0,1 mmol), 5 ul alpha-32p-dCTP (100 pMole, 800 Curies/Millimol), 1 ul DNA-Polymerase I (20 Einheiten), 1 ul DNAse I (1 ug/ml) und 78 ul H&sub2;O wurden miteinander vermischt und 3 Stunden lang bei 15ºC inkubiert. Das Gemisch wurde anschließend 5 Minuten lang gekocht und sofort auf Eis gelegt.
  • Der Southern-Blot wurde wie folgt präpariert: S. phaeochromogenes-DNA wurde separat mit den Restriktionsendonucleasen ApaI, BamHI, BcII, BgIII, BstYI, EcoRI, KasI, MluI, MscI, PvuII, PmlI, SacI, SaII, SacII, SfiI, SmaI, SnaßI und StuI verdaut. Die Verdaus wurden auf einem 1,0%igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde 10 Minuten lang in 0,25 M HCl eingeweicht; zweimal jeweils 30 Minuten lang in 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl; und dann zweimal jeweils 30 Minuten lang in 0,5 M Tris, pH 7,,5, 1,5 M NaCl. Ein Nitrocellulosebogen wurde kurz in Wasser eingeweicht und anschließend in 10 X SSC (1,5 M NaCl, 150 mM Na&sub3;Citrat). Es wurde ein Sandwich aus eitern Papiertuchstapel von 2 Zoll, 2 Bögen Whatman 3MM Papier (eingeweicht in 10 X SSC), einem Bogen der befeuchteten Nitrocellulosemembran, dem behandelten Agarosegel, einem weiteren Bogen Nitrocellulosemembran, zwei weiteren Bögen 3 MM Papier und 2 Zoll Papiertüchern hergestellt. Das Sandwich wurde beschwert, und man ließ die DNA über Nacht bei Raumtemperatur zu den Nitrocellulosebögen übergehen. Die Nitrocellulosebögen wurden dann in 0,9 M NaCl, 90 mM Na&sub3;Citrat 10 Minuten lang abgespült und in einem Vakuumtrockner bei 80ºC 1,5 Stunden lang wärmebehandelt, um die transferierten DNA- Fragmente an der Nitrocellulose zu fixieren. Der Bogen wurde in einen Plastikbeutel gegeben, der 15 ml einer Lösung aus 4 ml 20 g/l Ficoll, 20 g/l Polyvinylpyrrolidon, 20 g/l Rinderserumalbumin, 15 ml an 20 X SSC (4,5 ml 3 M NaCl, 0,3 M Na&sub3;Citrat), 1 ml an 100 mg/ml denaturierter und beschallter Lachssperma-DNA und 80 ml H&sub2;O enthielt. Der Bogen wurde im Rahmen einer zweistündigen Inkubation bei 65ºC unter Schütteln vorhybridisiert. 100 ul der radioaktiven Sonde wurden in den Beutel gegeben und die Inkubation über Nacht bei 65ºC unter Schütteln fortgesetzt. Der Nitrocellulosebogen wurde dann zweimal jeweils 30 Minuten lang bei 65ºC mit 2 X SSC und 0,1% SDS und 30 Minuten lang bei 65ºC in 0,2 · SSC und 0,1% SDS gewaschen. Anschließend wurde der Bogen an der Luft getrocknet und über Nacht einer Autoradiographie unterzogen.
  • Anhand der Southern-Blot-Daten waren die annähernden Größen von 10 Endonuclease kodierenden Fragmenten bekannt. ApaI, BamHI, BstYI, KasI, MluI, PvuII, SacI, SmaI und StuI Fragmente tragen DNA rechts vom Methylasegen; (Fig. 2). Die Sonde hybridisierte mit einer 1, 2 kb Bande im ApaI Verdau, einer 7,5 kb Bande im BanHI Verdau, einer 4,9 kb Bande im BstYI Verdau, einer 0,9 kb Bande im KasI Verdau, einer 3,6 kb Bande im MluI Verdau, einer 1,8 kb Bande im PvuII Verdau, einer 4,5 kb Bande im SacI Verdau, einer 2,4 kb Bande im Smal Verdau und einer 7,5 kb Bande im StuI Verdau. Die anderen Banden wurden zum Klonieren als zu groß bewertet.
  • 16. Isolierung eines Klons, der die Region stromabwärts des SphI Methylasegens beinhaltet: Da alle Versuche zum Klonieren des intakten SphI Restriktionsendonucleasegens mit oder ohne Methylase iri einen E. coli oder S. lividans Wirt, der durch die SphI Methylase zuvor geschützt wurde oder nicht, scheiterten, wurde der Versuch unternommen, nur das 3' Ende des Restriktionsendonucleasegens zu klonieren. Anhand der DNA- Sequenz und der Southern-Analyse wurde bestimmt, dass KasI (oder NarI) innerhalb des Restriktionsendonucleasegens zerschneidet und dass der nächste Ort, etwa 0,9 kb stromabwärts, die DNA stromabwärts des 3' Endes des Restriktionsendonucleasegens spalten müsste. Eine Klonierung des 0,9 kb KasI Fragments müsste den Rest des Restriktionsendonucleasegens erbringen. Eine KasI Bibliothek wurde von genomischer S. phaeochromogenes-DNA mit 100 ul (9 ug) genomischer DNA hergestellt, die in 120 ul 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,9, 100 ug/ml BSA und 20 U KasI 2 Stunden lang bei 37ºC verdaut wurde. Das gesamte Volumen wurde in einem 0,7%igen Agarosegel 2 Stunden lang der Elektrophorese unterzogen. DNA-Fragmente mit einer Größe von 0,7 bis 1,0 kb wurden durch Elektrophorese in DEAE- Anionenaustauschpapier. 2 Stunden lang aufgefangen. Die DNA wurde von dem DEAE-Papier wie in Schritt 11 beschrieben eluiert. Die pelletierte DNA wurde in 20 ul 10 mMTris, pH 8,0, und 1 mM EDTA resuspendiert. 20 ul (~0,5 ug) der gereinigten KasI-verdauten Fragmente wurden mit 5 ul (0,2 ug) an KasI- gespaltenem und dephosphoryliertem pUC19 in einem Endvolumen von 50 ul in 1 · Ligationspuffer mit 1 ul T4 DNA-Ligase (400 U) bei 4ºC 48 Stunden lang ligiert. 10 ul der Ligation wurden durch Tropfendialyse mit einem Millipore VS 0,025 uM Filter deionisiert. Die DNA wurde dann in E. coli ED8767 elektroporiert. E. coli wurde für die Elektroporation durch Heranreifenlassen von 1 L Zellen auf Klett 50-80 in L-Bouillon präpariert. Die Zellen wurden 15 bis 30 Minuten lang auf Eis gekühlt und dann unter Kälte bei 4000 UPM 15 Minuten lang pelletiert. Das Pellet wurde zweimal in eiskaltem sterilem Wasser und einmal in 10%igem Glycerol gewaschen. Das gewaschene Pellet wurde in 1 bis 2 ml 10%igem Glycerol auf eine endgültige Zellkonzentration von 3 · 101º Zellen pro ml resuspendiert. Die Zellen wurde bis zu ihrer Verwendung in 100-ul-Aliquoten bei - 70ºC eingefroren. Zum Elektroporieren der DNA in die präparierten Zellen wurden die Zellen vorsichtig aufgetaut und auf Eis gelegt. 40 ul der Zellen wurden mit 10 ul der ligierten und dialysierten DNA vermischt. Das Gemisch wurde in eine kalte Elektroporationsküvette von 0,2 cm gegeben. Ein Stromstoß von 12,5 kV/cm mit einer Zeitkonstante von 4-5 msec wurde an das DNA-Zellgemisch angelegt. E. coli wurde sofort mit 2 ml L- Bouillon verdünnt, bei 37ºC 1 Stunde lang heranreifen gelassen und dann auf 8 150 mm L-Agar mit Ampicillin plattiert. Nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht wurden die Platten mit 10 ml L-Bouillon geflutet und die Kolonien wurden zusammengekratzt. Die einzelnen Platten wurden separat gepoolt, um Unterbibliotheken zu bilden, die jeweils zwischen 5000 und 6000 Kolonien enthielten. 0,2 ml Glycerol wurden zu 0,8 ml jeder Unterbibliothek gegeben und bei -70ºC als gefrorener Vorrat aufbewahrt. Plasmide wurden von den Zellen in den restlichen 9 ml jeder Unterbibliothek mit dem von D. Ish-Horowicz beschriebenen Miniprep-Verfahren (in: Molecular Cloning, a Laboratory Manual von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982, S. 368-369) isoliert, mit der Ausnahme, dass das gesamte Verfahren um das Fünffache maßstabsvergrößert war. Das endgültige DNA-Pellet wurde in 8,5 ml 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 9,35 g CsCl und 0,25 ml Ethidiumbromid (5 mg/ml) resuspendiert. Gradienten wurden gebildet und die DNA wurde wie im Schritt 12 beschrieben gereinigt. Nach dem Reinigen wurden die Plasmide von den Unterbibliotheken mit KasI verdaut, auf einem Agarosegel gefahren, geblottet und mit pSph0.9 wie im Schritt 15 beschrieben sondiert. 3 der 8 Unterbibliotheken hatten das gewünschte 0,9 kb KasI Fragment, das mit dem als Sonde verwendeten 0,9 kb PstI Fragment hybridisierte. Zum Amplifizieren dieses Fragments von diesen Unterbibliotheken wurden zwei Oligonucleotidprimer präpariert. Primer 1 enthielt einen Teil der pUC19 Sequenz am 5' Ende des KasI Ortes und eine Region des Restriktionseridonucleasegens, das kloniert und sequenziert worden war, am 3' Ende des KasI Ortes: 5' CGC ATC AGG CGC CGT CAC CAC GGG C3', SEQ ID Nr. 3. Primer 2 ist der M13/pUC Umkehrsequenzierungsprimer, der von New England Biolabs produziert wird, Produkt Nr. 1233. Das 3' Segment des SphI Restriktionsendonucleasegens mit einem Teil des Klonierungsvektors pUC19 wurde von den Unterbibliotheken durch eine PCR-Reaktion mit 1 U Vent® DNA-Polymerase in 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 2 mM MgSO&sub4;, 0,1% Triton X-100, 200 uM von jedem dNTP, 100 ug/ml BSA, 5% DMSO bei 95ºC 1,5 Minuten lang, bei 60ºC 1,5 Minuten lang und bei 72ºC 2 Minuten lang für 20 Zyklen amplifiziert. Die Reaktionsprodukte wurden in einem 0,7%igen Agarosegel der Elektrophorese unterzogen. Fragmente mit einer Größe von etwa 1,0 bis 1,2 kb wurden mit DEAE-Papier wie in Schritt 11 beschrieben gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden mit KasI verdaut und mit KasI- verdautem, dephosporyliertem pUC19 ligiert. Die Ligation wurde in E. coli ED8767 elektroporiert und auf L-Agar mit Ampicillin plattiert. Plasmid-DNA-Minipreps wurden auf 36 isolierten Kolonien unter Anwendung des von Ish-Horowicz (in: Maniatis et al. Ibid) beschriebenen Verfahren präpariert. Eine der 36 Kolonien enthielt ein Plasmid, das den Insert mit der korrekten Größe von 0,9 kb enthielt. Eine Restriktionskartierung deutete an, dass es die korrekten Restriktionsenzymorte enthielt. Eine Southern-Analyse ergab, dass der neu isolierte Klon mit pSph0.9 hybridisierte, ein Anzeichen dafür, dass das klonierte Fragment wahrscheinlich das gewünschte Fragment war. Da das 0,9 kb KasI Fragment nur den 3' Teil des SphI Restriktionsendonucleasegens enthielt, war eine Prüfung in Bezug auf Endonucleaseaktivität nicht möglich, solange das Gen nicht rekonstruiert war. Der Klon wurde pEGspH42-1.4 genannt (Fig. 3).
  • 17. Rekonstruktion und Überexpression von SphI Restriktionsendonuclease: Das Restriktionsendonucleasegen wurde rekonstruiert, indem 10 ul (5 ug) pEGsph42-1.4 genommen und 3 ul (5 ug) pSph0.9 separat verdaut wurden mit MscI in 1 X NEBuffer 4 (20 mM Tris-acetat, 10 mM Magnesiumacetat, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM DTT, pH 7,9.) über einen Zeitraum von 2 Stunden bei 37ºC. Nach der Inkubation wurden die Verdaus einmal mit einem 1 : 1-Gemisch aus Phenol und Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert und mit einem 1/10 Volumen von 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumen von 95%igem Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde durch 5-minütiges Zentrifugieren in einer Eppendorff-Zentrifuge bei Raumtemperatur pelletiert und einmal in 70%igem Ethanol gewaschen. Die Pellets wurden in 1 X NEBuffer 2 resuspendiert. MscI-verdauter pSph0.9 wurde weiter unter Zugabe von 20 U XbäI verdaut, und der MscI-verdäute pEGsph42-1.4 wurde weiter unter Zugabe von 20 U HindIII verdaut. Nach 2 Stunden bei 37ºC wurde die DNA auf einem 0,7%igen Agarosegel gefahren. Unter Verwendung des Bio-Rad Prep-A-Gene-Kits wurde nach Herstelleranweisungen eine 0,6 kb Bande vom Verdau von pSph0.9 gereinigt und eine 1 kb Bande vom Verdau von pEGsph42-1.4 gereinigt. Die beiden Fragmente (jeweils ~0,5 ug) wurden in 1X Ligase-Puffer und T4 DNA-Ligase (400 U) bei 120C 18 Stunden lang ligiert (Fig. 4). Da alle Versuche zum Klonieren dieses ligierten Fragments in ein Plasmid mit hoher Kopiezahl in einem S. lividans Wirt, der mit der SphI-Methylase zuvor geschützt worden war, scheiterten, wurde beschlossen zu versuchen, das rekonstruierte Fragment hinter einem regulierten E. coli Promotor direkt zu klonieren. Es wurden zwei Oligonucleotidprimer mit der DNA und den Proteinsequenzdaten hergestellt. Der erste Oligonucleotidprimer enthielt die Sequenz, die das AUG-Codon überlappt, was einer Proteinsequenzierung zufolge den Beginn des Endonucleasegens bedeutet, wobei zwei Basen zur Schaffung eines BspHI Ortes geändert sind: 5' CCT TCG ACT ATA GTG AAG TCA TGA CAA G 3' SEQ ID Nr. 4. Der zweite Oligonucleotidprimer enthielt die Sequenz links vom KasI Ort in pUC19, wobei ein HindIII Ort in dem Primer enthalten war, um die Klonierung des Fragmentes nach der Amplifizierung zu unterstützen: 5' GCG CAG CCT GAA TGA AGC TTG GCG CC 3' SEQ ID Nr. 5. Diese beiden Primer wurden mit den ligierten Fragmenten von pSph0.9 und pEGsph42-1.4 (Beschreibung siehe oben) als Template in der PCR (unter Verwendung der im Schritt 16 beschriebenen Bedingungen) verwendet, um ein 1 kb DNA-Fragment zu amplifizieren. Die Bande wurde mit DEAE-Papier wie in Schritt 11 beschrieben gereinigt. Nach dem Reinigen wurde das PCR-Produkt mit 2 U BspHI in 1 X NEBuffer 4 2 Stunden lang verdaut und dann mit 20 U HindIII in 1 X NEBuffer 2, und von einem Agarosegel mit DEAE-Papier gereinigt (Fig. 4). Das gereinigte Fragment (~0,1 ug) wurde mit dem Ptac Expressionsvektor pAGR3 (von W. Jack, New England Biolabs) ligiert, der mit NcoI und HindIII (~0,05 ug) in einem Gesamtvolumen von 40 ul mit 400 U T4 DNA-Ligase bei 37ºC 2 Stunden lang verdaut worden war. (pAGR3 ist ein Vektor auf pBR322-Basis, der ein Ampicillin-Resistenzgen, eine einzelne Kopie von lacIq, den Ptac Promotor, eine 4fache direkte Wiederholung des rrnb Terminators stromaufwärts des Ptac Promotors, um eine Hindurch-Transkription zu verhindern, und einen NcoI Ort stromabwärts von einer lac- Ribosomenbindungsstelle enthält). 20 ul der Ligation wurden zum Transformieren von kompetentem E. coli ED8767 verwendet, der das NlaIII Methylasegen auf pSYC20 enthielt. [Die NlaIII Methylierungserkennungsstelle CATG überlappt, die SphI Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle und schützt somit den Wirt vor SphI-Verdauung. pSYX20 (ATCC Nr. 75260) ist ein Plasmid mittlerer Kopiezahl, das die Kanr und Tcr Gene auf einem pSClOl Replikationsstartpunkt beinhaltet. Ein in das Tcr Gen eingesetzte Methylasegen kann konstitutiv vom Tc-Promotor exprimiert werden]. Die transformierten Zellen wurden 30 Minuten lang bei 37ºC heranreifen gelassen und auf L-Agar mit Ampicillin (100 ug/ml) und Kanamycin (50 ug/ml) plattiert. 36 Kolonien wurden aufgenommen und auf L-Agar mit Ampicillin und Kanamycin für isolierte Kolonien ausgestrichen. Plasmide wurden von den individuellen Kolonien unter Anwendung des in Schritt 8 beschriebenen Plasmid-Miniprep-Verfahrens isoliert. Hindlil Verdaus von 5 ul von jedem Miniprep wurden mit Hindlil Verdaus von pAGR3 verglichen. 24 der 36 Klone schienen ein Plasmid zu haben, das größer als pAGR3 war. Sechs dieser Klone wurden für eine weitere Charakterisierung ausgewählt. Diese 6 Klone wurden in 200 ml L-Bouillon mit Ampicillin und Kanamycin auf Klett 60 (mittlere log-Phase) heranreifen gelassen und mit 1 mM IPTG induziert. 50 ml der Kultur wurden 2 Stunden nach der Induktion entfernt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet, einmal in kaltem Beschallungspuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM β = Mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 1 mM PMSF und 1 mM Natriumazid) gewaschen, und das Pellet wurde bei -70ºC eingefroren. Nach 30 Minuten wurde das Pellet auf Eis aufgetaut, in 3 ml Beschallungspuffer je Gramm Zellen resuspendiert und auf Eis beschallt. Der beschallte Zellextrakt wurde bei 16.000 UPM 1 Stunde lang zentrifugiert. 1 ul jedes Extraktes wurde mit 49 ul eines DNA-Gemischs vermischt, das 12 ul pBR322 (12 ug), 90 ul lOX NEBuffer 2, 22,5 ul PstI (20 U/ul) enthielt, und das Ganze würde mit Wasser auf 900 ul gebracht. 25 ul von diesem Röhrchen wurden mit 25 ul des DNA-Gemischs vermischt (1 : 1 Verdünnung). Es fanden 3 weitere aufeinander folgende 1 : 1 Verdünnungen statt. Die Reaktionsprodukte wurden 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Das gesamte 25-ul-Reaktionsprodukt wurde auf einem 0,7%igen Agarosegel gefahren. Die Titer von den Rohzellextrakten wurden mit dem bekannten Titer von der gereinigten SphI Restriktionsendonuclease verglichen. Einer der 6 Klone wies wenig oder keine nachweisbare SphI Restriktionsendonucleaseaktivität auf. Fünf Klone hatten jedoch eine zu starke SphI Restriktionsendonucleaseaktivität, um in dieser Untersuchung akkurat titriert zu werden; es wurde allerdings geschätzt, dass der Enzymtiter über 10&sup5; Einheiten/g an Zellen lag. Weitere Titrationen brachten den Titer der SphI Restriktionsendonucleaseaktivität auf etwa 1,5 · 10&sup7; bis 3 · 10&sup7;. Dieses Niveau liegt etwa 1.000 mal über der SphI Restriktionsendonucleaseaktivität je Gramm an Zellen, die in Rohextrakten von Streptomyces phaeochromogenes beobachtet wird. Einer dieser Klone, der für eine weitere Charakterisierung und Optimierung ausgewählt wurde, erhielt die Stammbezeichnung NEB Nr. 808, das Plasmid wurde pEGsph50-2 genannt. Eine Probe von NEB Nr. 808 wurde am 5. August 1992 unter der Beitritts-Nr. 69045 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung in Rockville, Maryland hinterlegt. Eine Titration der von Rohextrakten mit NEB-Nr. 808 erzeugten SphI Restriktionsendonucleaseaktivität ist in Fig. 5 dargestellt.
  • 18. Die SphI Restriktionsendonuclease kann von NEB Nr. 808 durch Propagierung auf mittlere log-Phase in einem Fermenter mit reichhaltigem Medium mit Ampicillin und Kanamycin hergestellt werden. Die Kultur wird dann durch Zugeben von IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM induziert und 1 bis 2 Stunden lang weiter heranreifen gelassen. Die Zellen werden dann durch Zentrifugieren geerntet.
  • 19. Reinigung der SphI Restriktionsendonuclease von NEB Nr. 808: Alle folgenden Verfahren wurden entweder auf Eis oder bei 4ºC durchgeführt. 97 Gramm Zellen wurden in 291 ml Puffer A (20 mM Kaliumphosphat, pH 6,9, 0,1 mM EDTA, 1 mM β-Mercaptoethanol, 5% Glycerol) mit 0,2 M NaCl resuspendiert und durch die einmalige Passage durch eine French-Presse bei 11.500 PSIG aufgespalten. Der Extrakt wurde bei 12.000 UPM und 4ºC 90 Minuten lang zentrifugiert, und der resultierende Überstand wurde durch eine DEAE-Sepharose CL-6B Säule (5 · 10 cm) geleitet, äguilibriert mit Puffer A, der 0,2 M NaCl enthielt. Der Durchfluss wurde aufgefangen, 1 : 1 mit Puffer A verdünnt und auf eine Heparin-Sepharose CL-6B Säule (5 · 8 cm) aufgebracht, äguilibriert mit Puffer A, der 0,1 M NaCl enthielt. Die Säule wurde mit 350 ml Puffer A gewaschen, der 0,1 M NaCl enthielt, gefolgt von einem linearen Gradienten von Natriumchlorid, der mit 800 ml Puffer A mit 0,1 M NaCl und 800 ml Puffer A mit 1 M NaCl gebildet wurde. Fraktionen wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min aufgefangen. Der Peak der Enzymaktivität wurde gepoolt und von der Säule zwischen 0,55 und 0,75 M NaCl eluiert. Nach einer Dialyse mit PufferA mit 50 mM NaCl über Nacht, wurde das gepoolte Enzym auf eine Mono Q® HR 10/10 (8 ml) Säule geladen, äquilibriert mit Puffer A mit 50 mM NaCl. Fraktionen wurden bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min aufgefangen. Der Peak der Enzymaktivität wurde gepoolt und von der Säule zwischen 0,3 und 0,35 M NaCl eluiert. Der Pool wurde mit Puffer A auf eine NaCl-Konzentration von 50 mM verdünnt und auf eine TSK-Heparin TosoHaas 5PW Säule (7,5 cm · 7,5 mm ID) geladen. Fraktionen wurden bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min aufgefangen. Der Peak der Enzymaktivität eluierte von der Säule zwischen 0,42 und 0,5 M NaCl. Aktivität enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und per Dialyse mit Puffer B (10 mM Tris, pH 7,4, 50 mM Natriumchlorid, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol) konzentriert. Dieser Reinigungsablauf brachte 10,8 · 106 Gesamteinheiten an Enzym hervor, eine Ausbeute von 1%.
  • Die von dieser Reinigung gewonnene SphI Restriktionsendonuclease war im Wesentlichen rein und frei von unspezifischer Endonuclease und Exonuclease. Die Reinheit des SphI Restriktionsendonucleasepräparats wurde anhand der folgenden Kriterien überprüft: 1) Ligation: nach einer 20fachen Überverdauung von A DNA wurden mehr als 95% der erzeugten DNA- Fragmente mit T4 DNA-Ligase ligiert (bei einer 5' Termini- Konzentration von 1-2 uM bei 16ºC). Von diesen ligierten Fragmenten konnten 95% erneut zerschnitten werden. 2) Verlängerte Verdauung: nach dem Inkubieren eines 50-ul- Reaktionsproduktes, das 1 ug an λ DNA und 10 Einheiten Enzym enthielt, über einen Zeitraum von 16 Stunden, wurde das gleiche Muster von DNA-Banden erzeugt, wie bei einer Reaktion, die in einer Stunde mit einer Enzymeinheit durchgeführt wurde. 3) Exonucleaseaktivität: nach dem Inkubieren von 3000 Enzymeinheiten über einen Zeitraum von 4 Stunden bei 37ºC in einem 50-ul-Reaktionsprodukt mit 1 ug beschallter ³H DNA (10&sup5; cpm/ug) wurden weniger als 0,01% Radioaktivität freigesetzt.
  • 4) Endonuclease-Kontamination: nach dem Inkubieren von 150 Enzymeinheiten über einen Zeitraum von 4 Stunden bei 37ºC in einem 50-ul-Reaktionsprodukt, das 1 ug φX174 REl DNA enthielt, wurden weniger als 25% in RF II umgewandelt. Alle Tests wurden im folgenden Reaktionspuffer durchgeführt: 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT (pH 7,9 bei 25ºC).
    • SEQUENZAUFLISTUNG (1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN
  • (i) ANMELDERIN:
  • (A) NAME: NEW ENGLAND BIOLABS, INC.
  • (B) STRASSE: 32, TOZER ROAD
  • (C) STADT: BEVERLY
  • (D) STAAT: MASSACHUSETTS
  • (E) LAND: USA
  • (F) POSTLEITZAHL: 01915
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: ISOLIERTE DNA, DIE DIE SphI RESTRIKTIONSENDONUCLEASE KODIERT, UND VERWANDTE VERFAHREN FÜR IHRE HERSTELLUNG.
  • (iii)ANZAHL DER SEQUENZEN: 5
  • (iv) MASCHINENLESBARES FORMULAR:
  • (A) MEDIENTYP: Diskette
  • (B) COMPUTER: IBM-kompatibler PC
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIn Release Nr. 1.0, Version Nr. 1.25 (EPO)
  • (vi) VORHERIGE ANMELDUNGSDATEN:
  • (A) ANMELDUNGSNUMMER: US 07/932454
  • (B) REGISTRIERUNGSDATUM: 20. August 1992
    • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 1
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 235 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 1:
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 3:
  • CGCATCAGGC GCCGTCACCA CGGGC 25
    • 2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 4
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN
  • (A) LANGE: 28 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 4:
  • CCTTCGACTA TAGTGAAGTC ATGACAAG 28
    • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 5
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 26 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STR NGIGKEIT: unbekannt
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 5:
    • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 3
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
    • (2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 2
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
  • (A) LÄNGE 2692 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) ORT: 703..1653
  • (D) WEITERE INFORMATIONEN: /Hinweis = "METHYLASEGEN BEGINNT BEI POSITION 703/ENDET BEI 1653.
  • RESTRIKTIONSENDONUCLEASE BEGINNT BEI POSITION 1703/ENDET BEI 2410"
  • (ix) MERKMAL.
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) ORT: 1703..2410
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 2:

Claims (6)

1. Isoliertes DNA-Segment, das eine SphI- Restriktionsendonuclease kodiert, wobei das isolierte DNA- Segment vom Plasmid pEGsph50-2 (ATCC Nr. 69045) erhältlich ist.
2. Rekombinanter Vektor, umfassend einen Vektor, in den ein isoliertes DNA-Segment nach Anspruch 1 eingefügt wurde.
3. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 2, wobei der Vektor das Plasmid pEGsph50-2 umfasst (ATTC Nr. 69045).
4. Wirtszelle, transformiert mit dem rekombinanten Vektor aus Anspruch 2 oder 3.
5. Verfahren Zur Herstellung einer SphI- Restriktionsendonuclease, umfassend das Kultivieren einer mit dem Vektor aus Anspruch 2 oder 3 transformierten Wirtszelle unter Bedingungen zur Expression der genannt en Endonuclease.
6. Isolierte DNA nach Anspruch 1, wobei die isolierte DNA die SEQ-ID Nr. 2 umfasst.
DE69332450T 1992-08-20 1993-08-10 Für SphI Restriktionsendonuklease kodierende DNS und Verfahren zur Herstellung Expired - Lifetime DE69332450T2 (de)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/932,454 US5262318A (en) 1992-08-20 1992-08-20 Isolated DNA encoding the SPHI restriction endonuclease and related methods for producing the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69332450D1 DE69332450D1 (de) 2002-12-05
DE69332450T2 true DE69332450T2 (de) 2003-06-18

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ID=25462351

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US (1) US5262318A (de)
EP (1) EP0586116B1 (de)
JP (1) JP3578781B2 (de)
DE (1) DE69332450T2 (de)

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EP0586116A2 (de) 1994-03-09
US5262318A (en) 1993-11-16
JP3578781B2 (ja) 2004-10-20
EP0586116A3 (en) 1994-07-06
EP0586116B1 (de) 2002-10-30
DE69332450D1 (de) 2002-12-05
JPH06205683A (ja) 1994-07-26

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