JP3578781B2 - SphI制限エンドヌクレアーゼをコードする単離DNA及び該制限エンドヌクレアーゼを製造するための方法 - Google Patents

SphI制限エンドヌクレアーゼをコードする単離DNA及び該制限エンドヌクレアーゼを製造するための方法 Download PDF

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Description

【0001】
【産業上の利用分野】
本発明は、SphI制限エンドヌクレアーゼと修飾メチラーゼ(modification methylase)とをコードする組換えDNA、並びに該組換えDNAからの前記酵素の製造に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
制限エンドヌクレアーゼは細菌中に天然に存在する酵素の一種である。制限エンドヌクレアーゼは、他の混入細菌成分から精製して、DNAを正確なフラグメントに切断するために実験室で使用できる。この性質を利用すれば、DNA分子を唯一のものとして同定し且つその構成遺伝子に分別することができる。制限エンドヌクレアーゼは現代の遺伝子研究に不可欠の道具であることが判明した。制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工学及び分析を実施するための手段となる生化学的「はさみ」なのである。
【0003】
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子の特定のヌクレオチド配列(「認識配列」)を認識し、該ヌクレオチド配列に結合することによって作用する。このようにして結合した制限エンドヌクレアーゼは認識配列内で、又は認識配列の片側に、DNA分子を開裂する。種々の制限エンドヌクレアーゼが種々の認識配列に対して親和性を示す。これまでに調べられた数百種の細菌の中で、ほぼ百の異なる制限エンドヌクレアーゼが同定された。
【0004】
細菌は種毎に僅かの制限エンドヌクレアーゼしか所有しない性向を有する。エンドヌクレアーゼは通常、その由来源である細菌にちなんで命名される。例えば、Haemophilus aegyptius種は、HaeI、HaeII及びHaeIIIという3種類の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素はそれぞれ配列(AT)GGCC(AT)、PuGCGCPy及びGGCCを認識し開裂する。これに対し、大腸菌(Escherichia coli)RY13は、配列GAATTCを認識する1種類の酵素EcoRIしか合成しない。
【0005】
理論に拘束されたくはないが、自然界では、細菌細胞が安全に生存する上で制限エンドヌクレアーゼが保護的役割を果たしていると考えられる。制限エンドヌクレアーゼは、該酵素がなければ細菌を破壊するか又は細菌に寄生するであろうウイルス及びプラスミドのような外来DNA分子による感染に細菌が耐えられるようにする。制限エンドヌクレアーゼは、感染DNA分子の長さを走査して、認識配列が出現する毎に前記長さを開裂することにより前記耐性を与える。このようにして開裂が行われると、感染遺伝子の多くが失活し、DNAが非特異的エンドヌクレアーゼによって更に分解されるようになる。
【0006】
細菌保護系の第2の成分は修飾メチラーゼである。この種の酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的な関係にあり、細菌が自己のDNAを保護し、該DNAを外来感染DNAから判別できるようにする手段を与える。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同じヌクレオチド認識配列を認識しこれに結合するが、DNAを開裂する代わりに、メチル基の付加によって前記配列内のヌクレオチドのいずれかを化学的に修飾する。メチル化の後は、制限エンドヌクレアーゼが認識配列に結合することも、該認識配列を開裂することもない。細菌細胞のDNAは常に自己の修飾メチラーゼの活性によって完全に修飾される。従って、内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対しては全く感受性を示さない。制限エンドヌクレアーゼの認識及び攻撃に対して感受性を示すのは、修飾されていない、従って識別可能な外来DNAだけである。
【0007】
遺伝子工学技術の誕生により、現在では遺伝子をクローン化し、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質及び酵素を従来の精製技術よりも多量に産生することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離するための鍵は、この種のクローンを、その発生頻度が10−3〜10−4と低いときに、複雑な「ライブラリー」、即ち「ショットガン」法によって誘導されるクローン集団内で同定する簡単で信頼できる方法を開発することにある。この方法は、クローンの大部分を占める望ましくないクローンが破壊され、希少な望ましいクローンが生き残るように、選択的であるのが好ましい。
【0008】
タイプIIの制限−修飾系はより高い頻度でクローン化されている。第1のクローン化系では、バクテリオファージ感染が制限エンドヌクレアーゼクローンの同定又は選択手段として使用された(EcoRII:Kosykhら、Molec.gen.Genet 178:717−719(1980);HhaII:Mannら,Gene 3:97−112(1978);PstI:Walderら、Proc.Nat.Acad.Sci.78 1503−1507(1981))。細菌はその中に制限−修飾系が存在していればバクテリオファージによる感染に耐えることができるため、原則として、クローン化制限−修飾遺伝子を有する細胞が、ファージの作用を受けたライブラリーからの生存者として選択的に単離され得る。しかしながらこの方法の効果には限界があることが判明した。特に、クローン化制限−修飾遺伝子が選択的生存を可能にするのに十分なファージ耐性を常に示すとは限らないことが判明した。
【0009】
別のクローニング方法は、プラスミドによって運ばれる(plasmid−borne)という特徴が初期に付与された系を大腸菌クローニングプラスミド中に移す操作を含む(EcoRV:Bougueleretら、Nucl.Acid.Res.12:3659−3676(1984);PaeR7:Gingeras及びBrooks,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:402−406(1983);Theriault及びRoy,Gene 19:355−359(1982);PvuII:Blumenthalら、J.Bacteriol.164:501−509(1985))。
【0010】
第3の方法として、現在のところ活性メチラーゼ遺伝子の選択によってクローン化されている更に多くの系をクローニングするのに使用されている方法もある(例えば、1986年9月3日公開のEPO No.:193,413、及びBsuRI:Kissら,Nucl Acid Res.13:6403−6421(1985)参照)。制限遺伝子及び修飾遺伝子はしばしば密に関係しているため、これらの遺伝子はしばしば両方が同時にクローン化され得る。しかしながら、この選択によって完全な制限系が得られるとは限らず、メチラーゼ遺伝子のみが得られることもある(BspRI:Szomolanyiら、Gene 10:219−225(1980);BcnI:Janulaitisら、Gene 20:197−204(1982);BsuRI:Kiss及びBaldauf,Gene 21:111−119(1983);並びにMsPI:Walderら、J.Biol.Chem.258:1235−1241(1983))。
【0011】
ある系では、クローニングの問題が、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌクレアーゼ遺伝子を挿入する試みに存在し得る。メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を共通のDNAフラグメント上で挿入する場合は、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主の遺伝子を開裂する前にメチラーゼ遺伝子が宿主を修飾又は保護しなければならない。
【0012】
これらの系を大腸菌中でクローン化する上での別の障害が、種々のメチラーゼのクローニングプロセスで発見された。多くの大腸菌株(クローニングで通常使用されているものを含む)はシトシンメチル化含有DNA(DNA containing cytosine methylation)の導入に耐える系を有する(Raleigh及びWilson、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 83:9070−9074(1986))。従って、どの大腸菌株をクローニングに使用するかを熟慮することも必要である。
【0013】
精製した制限エンドヌクレアーゼは、そして制限エンドヌクレアーゼほどではないが修飾メチラーゼも、実験室でDNAの特徴付け及び再構成を行うための有用な道具であるため、これらの酵素を多量に合成する細菌株を組換えDNA技術によって得ることは商業的に有利なことである。このような株は、精製操作を容易にすると共に商業的に有用な量で酵素を産生する手段を与えるため、有用と思われる。
【0014】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は、Streptomyces phaeochromogenes(NRRL B−3559)から得ることができるSphI制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼの遺伝子をコードする組換えDNAと、該組換えDNAから前記酵素を製造するための方法とに関する。本発明は、制限エンドヌクレアーゼSphI、即ちDNA配列5’−GCATGC−3’を認識し、該認識配列内で4塩基3’オーバーハングを残して第2のGC対の間で開裂を行う酵素(Fuchs,L.Y.,L.Corvarrubias,l.Escalante,S.Sanchez及びF.Bolivar,Gene 10:39−46(1980))を発現する形質転換宿主にも関する。本発明の方法で産生したSphI制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、実施例1のステップ13に記載のように従来技術によって形成した制限エンドヌクレアーゼ調製物に通常見られる混入物を含んでいない。SphI制限−修飾系をクローニングするための好ましい方法の1つは、適当なベクターを選択し、Streptomyces phaeochromogenes由来DNAを含むライブラリーを幾つか形成し、SphI修飾メチラーゼをコードするDNAを含むクローンを単離し、メチラーゼクローンを含む大腸菌及びStreptomyces lividans株におけるエンドヌクレアーゼ活性のアッセイによってエンドヌクレアーゼ遺伝子の存在の有無を確認し、前記アッセイによって制限エンドヌクレアーゼが検出されなかった場合にはクローン化DNAとSphI制限エンドヌクレアーゼのアミノ末端との配列決定を行い、これらの配列の比較によってクローン化DNAフラグメント上のエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を調べ、エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを含む染色体DNAをクローン化し、サザン分析を用いて該クローンのライブラリーをスクリーニングし、PCRを用いて前記ライブラリーからエンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを増幅し、調節されたプロモーターの後方に完全エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローン化し、これを中間コピー数プラスミド(medium copy number plasmid)上のNlaIIIメチラーゼ遺伝子で予め保護した宿主中に形質転換する操作を含む。
【0015】
発明の詳細
本発明は、SphI制限エンドヌクレアーゼをコードする組換えDNA、並びにこのような組換えDNAから製造した酵素に関する。
【0016】
Streptomyces phaeochromogenesからSphI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングすることは極めて困難であった。一般的なメチラーゼ選択法によって得たメチラーゼクローンはいずれも完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含んでいなかった。制限エンドヌクレアーゼの位置を決定するためには、メチラーゼクローンからのDNAの配列と精製SphI制限エンドヌクレアーゼから得たアミノ末端配列とを比較する必要があった。これらの結果から、完全な制限−修飾系を得るためには約200〜400bpをクローニングする必要があると推算された。しかしながら、従来の方法によって完全な制限エンドヌクレアーゼをクローン化する試みは総て失敗に終わった。その原因はおそらく、エンドヌクレアーゼ遺伝子の致死率とSphIメチラーゼ遺伝子の比較的低い発現とにある。試行された方法には、大腸菌及びStreptomyces lividans中で完全な制限修飾系をクローニングする方法、並びにSphIメチラーゼで予め保護した大腸菌又はS.lividans中に制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングする方法がある。制限エンドヌクレアーゼの3’部分は最終的に、S.phaeochromogenesゲノムDNAのKasIライブラリーの構築によってクローン化された(KasIは制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内で該遺伝子の3’末端の下流で開裂する)。PCRを用いてフラグメントを増幅することによりライブラリーから単離された正確なフラグメントはpUC19中にクローニングされた。PCR反応に使用されたプライマーは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内及びライブラリーの構築に使用されたベクター内の配列を含んでいた。クローニング後に、低コピープラスミド上の内因性プロモーターの制御下でSphIメチラーゼで予め保護したS.lividans中で制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築する試みは総て失敗に終わった。完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は最終的に、Ptacプロモーターの制御下で制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築することによって大腸菌中でクローン化され発現された。使用された宿主株は、中位コピー数プラスミドpSYX20上のNlaIIIメチラーゼで予め保護した大腸菌である。
【0017】
Bernanら,ASM Abstracts 89:206(1986)及びBrooksら,J.Cell.Biochem.Supplemental14A:106(1990)の報告は、大腸菌宿主中での発現が見られなくても、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子が部分的PstIライブラリーから単離したメチラーゼクローン上に含まれている可能性があると述べている。これは、Streptomycesから単離された別の制限修飾系SalIについても指摘されたことである(Rodicio及びChater,Mol.Gen.Genet.213:349−353(1988)、Slatkoら,未公開の研究成果)。しかしながら、DNAの配列決定及びSphI制限エンドヌクレアーゼのアミノ末端の配列決定の結果、メチラーゼクローン上には完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は含まれてないことが判明した。
【0018】
SphI制限遺伝子を好ましくはクローン化して発現するための本発明の方法は図1に示す通りであり、下記のステップを含む:
1. Streptomyces phaeochromogenesのDNAを精製する。
【0019】
2. 完全SphIメチラーゼ遺伝子をフラグメントに開裂する制限エンドヌクレアーゼ、例えばPstI又はそのアイソシゾマーのうち任意のもので前記DNAを完全に及び/又は部分的に消化する。前記フラグメントはクローニング可能な大きさ、即ち約1.5〜13kbでなければならない。試用した他のエンドヌクレアーゼは、ClaI、EcoRI、HindII、NdeI、NheI、NsiI及びXbaIを含めて、前述の条件を満たさなかった。
【0020】
3. pBR322(又は好ましくは抗生物質耐性遺伝子中に少なくとも1つのSphI部位を有する任意の別のベクター)は、テトラサイクリン耐性遺伝子中にSphI部位を1つ有するため好ましいクローニングベクターである。
【0021】
4. 消化したDNAをクローニングベクターに連結する。得られた混合物を用いて適当な宿主、即ちhsdR、mcrBC株、例えば大腸菌株RR1又はK802(それぞれATCC 31343及びATCC 33526)を形質転換する。
【0022】
5. DNA/細胞混合物を、好ましくは、形質転換細胞に対して選択的な抗生物質、例えばテトラサイクリンを含む富栄養培地にプレーティングする。インキュベーション後、形質転換細胞コロニーをまとめて回収し、一次細胞ライブラリーを形成する。前述のように、この種の一次細胞ライブラリーは、クローニングエンドヌクレアーゼの様々な組合わせと、それぞれのクローニングエンドヌクレアーゼによるStreptomyces phaeochromogenes DNAの完全な又は部分的な消化とを用いて最終的に合計10個構築した。
【0023】
6. 組換えプラスミドを一次細胞ライブラリーからin totoで精製して一次プラスミドライブラリーを形成する。
【0024】
7. 次いで、精製プラスミドライブラリーを、Streptomyces phaeochromogenes細胞から調製したSphI制限エンドヌクレアーゼ又は任意のSphIアイソシゾマー、例えばBbvIもしくはPaeIでin vitroで完全に消化する。SphI制限エンドヌクレアーゼ消化は、修飾されていないメチラーゼ無含有クローンを選択的に破壊し、その結果SphIメチラーゼ含有クローンの相対頻度が増加する。メチラーゼ無含有クローンの破壊を促進するために、エキソヌクレアーゼ及び/又はホスファターゼを消化に加えてもよい。
【0025】
8. SphIメチラーゼクローンの同定:消化したプラスミドライブラリーDNAを形質転換によって大腸菌株RR1又はK802のような適当な宿主に戻し、形質転換コロニーを抗生物質プレート上でのプレーティングによって再び得る。コロニーを採取し、そのDNAを、SphI修飾遺伝子の存在について下記のの方法で分析する:プラスミドDNAを精製し、in vitroでSphI制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、SphI消化に対して耐性であるかどうかを調べる。
【0026】
9. メチラーゼ遺伝子がクローン化されたことが確認されたら、そのクローンをSphI制限エンドヌクレアーゼ活性についてアッセイする。活性が検出されれば、SphI制限遺伝子はメチラーゼ遺伝子に結合しており、クローン中に存在することになる。その場合は、後述のステップ12まで飛び越すことができる。制限活性が検出されなければ、それは制限遺伝子がメチラーゼ遺伝子に結合していないか、又は結合しているが完全な状態でメチラーゼ遺伝子と共にクローン化されてはいないか、又は完全な状態でクローン化されているが発現はされていないことを意味する。これら3つの可能性のうちのいずれが現実のものであるかを調べるために、クローン化フラグメントの制限地図を作り、欠失を形成して、クローン化フラグメント内のメチラーゼ遺伝子の相対位置を決定する。次いでこの情報を用いて、制限遺伝子が結合しているものと仮定して、その制限遺伝子をコードするのに十分なDNAがメチラーゼ遺伝子のいずれかの側面に存在しているかどうかを調べる。DNAが十分に存在していれば、制限遺伝子は結合していないか、又はクローン中に存在していても発現されてはいないとみなされる(ステップ10に進む)。本発明のPstIクローンpSphM6.0の場合のように、クローン化DNA内でメチラーゼ遺伝子の両側に、結合制限遺伝子をコードするのに十分な余地(room)が存在していなければ、メチラーゼ遺伝子の一部分を用いてStreptomyces phaeochromogenes染色体の消化物をプローブし、サザンハイブリダイゼーションによって、既存のクローン化DNAの境界を超えて延びる領域のゲノム地図を形成する。このデータは、制限−修飾領域をメチラーゼ遺伝子とより多くの隣接DNAとを有する個々のフラグメントに開裂する特定のエンドヌクレアーゼを同定するのに役立つ。このようなエンドヌクレアーゼによって形成されたフラグメントの正確な大きさも前記データから計算される。制限遺伝子と修飾遺伝子とが結合していれば、前述のようなフラグメントは制限遺伝子もコードすると考えられる。
【0027】
10. Streptomyces又はNocardiaから単離した制限−修飾系に関する過去の実験では、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有するクローンは通常の粗細胞抽出物アッセイでは同定できないことが判明した。これは、大腸菌中での前記遺伝子の発現度が低いためである。しかしながら、Nocardia及びStreptomyces由来の遺伝子は、Streptomyces lividans中でクローニングするとしばしば検出可能な度合いまで発現し得る。メチラーゼ遺伝子を含み、場合によってはエンドヌクレアーゼ遺伝子も含むクローンpSphM6.0からのフラグメントを、pIJ486のようなStreptomycesベクター(Ward,J.M.ら,Mol.Gen.Genet.203:468−478に記述されている)上にサブクローニングし、S.lividans中に形質転換する。得られたS.lividans中クローンをメチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子発現について調べる。S.lividans中クローンから発現されたエンドヌクレアーゼが存在すれば、エンドヌクレアーゼ遺伝子はクローン化されてはいるが大腸菌中では発現されないことになる(ステップ12に飛び越す)。本発明の場合のように発現が見られなければ、SphIエンドヌクレアーゼをStreptomyces phaeochromogenesからできるだけ均質に精製し、最初の10〜20のアミノ酸のアミノ末端配列を決定する。このタンパク質配列情報をメチラーゼクローンの翻訳されたDNA配列と比較して、エンドヌクレアーゼ遺伝子がそのクローン化フラグメント上に存在するかどうかを調べ、存在していれば、エンドヌクレアーゼ遺伝子の出発点がフラグメント上のどの位置に当たるかを調べる。これと同時に、タンパク質ゲルによって制限エンドヌクレアーゼタンパク質の大きさは約27kDであると決定される。これは、エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに必要なDNAの量が約0.8kbであることを意味する。SphI制限エンドヌクレアーゼを有するクローンは、エンドヌクレアーゼのアミノ末端に関連した配列を含み、且つ前記配列の下流に少なくとも0.8kbのDNAを有するものであると同定されている。しかしながら本発明では、単離したメチラーゼクローンのいずれも、エンドヌクレアーゼ遺伝子を完全にコードするのに十分なDNAをエンドヌクレアーゼ出発点の下流に含んでいないことが判明した。
【0028】
11. SphI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残部のクローニング:完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をメチラーゼ遺伝子と共に又はメチラーゼ遺伝子なしに、保護してない、又はSphIメチラーゼで予め保護した大腸菌又はS.lividans宿主中にクローニングする試みは総て失敗に終わった。SphI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を得るためには、まず制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の3’部分だけをクローニングする必要がある。サザンブロット分析で決定されるように制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内で3’末端の下流で切断を行う制限エンドヌクレアーゼを用いてS.phaeochromogenesゲノムDNAのライブラリーを構築する。ライブラリーが得られれば、Grunsteinコロニー又はサザンハイブリダイゼーションによって制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の3’部分を含む正確なクローンを同定し、次いでPCR増幅を用いてライブラリーから単離もしくは増幅することができる。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の3’末端を含むフラグメントのクローンが単離されれば、これを用いて制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築して完全な遺伝子を得ることができる。
【0029】
12. 過剰発現:制限遺伝子を含むクローンを過剰発現できる方法は幾つかある。DNA配列決定、詳細な地図の作成及び欠失データは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現させる最良の方法の決定に役立つ。過剰発現させる方法の1つは、大腸菌によって強く認識されるプロモーター、例えばpAGR3上のPtac(New England BiolabsのW.Jackから入手可能)を制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点の前に直接挿入する操作を含む。この操作は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点及び終了点の近傍に適当な制限部位をみつけ、pAGR3のプロモーターの近傍に相容性制限部位をみつけ、制限遺伝子をPtacプロモーターと一直線に並ぶようにpAGR3に移し込むことによって実施し得る。あるいは、完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅のためにポリメラーゼ連鎖反応を使用するために、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の前及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の下流のどこかで直接ハイブリダイズするプライマーを設計することもできる。得られたDNAフラグメントは、pAGR3のような発現ベクター内で誘発性プロモーター(Ptac)の下流に直接挿入できる。使用し得る別の調節されたプロモーターは、pUC19及びpBR322誘導体上のPlacUV5(Fuller,Gene 19:43−54(1982))及び1PL(Shimatake及びRosenberg,Nature 254:128(1981))、並びにpET3Aベクター上のT7プロモーター(Brookhaven National Lab.,Upton,NYのWilliam Studierから入手可能)である。また、強力なリボソーム結合部位(Shine & Dalgarno Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71,1342−1346(1974))を遺伝子の前に配置して発現を増大させることもできる。本発明では、制限エンドヌクレアーゼを過剰発現する安定なクローンを得るために、宿主を制限エンドヌクレアーゼ消化から予め保護しなければならない。この操作は、別個のプラスミド上で、SphI制限部位と重なり合う部位を修飾することによりSphI消化から保護するNlaIIIのような異種メチラーゼ又はSphIメチラーゼ中でクローニングすることによって達成される。使用するプラスミドは発現ベクターに対して相容性のものでなければならない。メチラーゼはまた、過剰発現した制限エンドヌクレアーゼ遺伝子による消化から宿主のゲノムを保護するようなレベルで産生されなければならない。本発明では、pACYC184のような低コピー数プラスミド上にクローニングしたSphIメチラーゼ遺伝子では完全な保護は得られないことが判明した。中位コピー数プラスミド上にクローニングしたNlaIIIメチラーゼ遺伝子を用いると、宿主ゲノムがSphI消化から完全に保護された。
【0030】
前記遺伝子のDNA配列は、大腸菌中で更に効果的に使用されるコドンを使用すべく、部位特異的突然変異誘発又は遺伝子の再合成によって変えることができる(Ikemura,J.Mol.Biol.151:389−409(1981))。
【0031】
13. 産生:SphIメチラーゼ又はエンドヌクレアーゼは、抗生物質を適当に選択して発酵槽内の富栄養培地で増殖させることにより、SphIメチラーゼ遺伝子(又は異種メチラーゼ)及び過剰発現した制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有するクローンから産生し得る。その後細胞を遠心分離によって回収し、音波処理により破壊して、SphIメチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を得る。
【0032】
14. 精製:SphIメチラーゼ及びエンドヌクレアーゼを含む粗細胞抽出物を、アフィニティクロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーのような標準的タンパク質精製方法によって精製する。
【0033】
前述の諸ステップは本発明の好ましい実施態様を構成するものであるが、当業者には明らかなように、前述の方法は当業者に公知の技術に従って変えることができる。
【0034】
【実施例】
以下の実施例は、本発明の現時点で好ましい実施態様を説明するためのものである。尚、この実施例は非限定的なものであり、本発明はこれに限定されることはない。
【0035】
実施例1
SphI修飾メチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
1.DNAの精製: Streptomyces phaeochromogenesのDNAを調製するために、1gの細胞ペーストを5mlの0.1M Tris−HCl,0.1M EDTA pH7.6中に30分間静かに振盪することにより再懸濁させた。該懸濁液を2つの3.0mlアリコートに分けた。0.1M Tris−HCl,0.1M EDTA pH7.6中に1.7mg/mlのリゾチームを溶解した溶液3.5mlを各アリコートに加え、それぞれを37℃で15分間インキュベートした。SDSを1%まで加え、プロテイナーゼKを0.13mg/mlまで加え、これらのアリコートを37℃で1時間インキュベートした。10%SDS及び8%サルコシルの溶液0.4mlを各アリコートに加え、インキュベーションを55℃で2時間続けた。2つのアリコートを合わせ、DNA緩衝液(10mM Tris−HCl,1mM EDTA pH8.0)を4回交換して24時間透析した。透析したDNA溶液を塩化セシウム−エチジウムブロミド平衡密度勾配遠心分離に使用できるようにするために、総量をDNA緩衝液で40mlに増加し、該DNA溶液を2つの20mlアリコートに分け、各々に20gの塩化セシウム及び0.2mlの5mg/mlエチジウムブロミドを加えた。該DNA溶液を44,000rpmで48時間遠心し、得られたDNAバンドをシリンジ及び18ゲージニードルを用いて取り出した。同量の氷冷水飽和N−ブタノールで4回抽出することによりエチジウムブロミドを除去した。塩化セシウムは透析によって除去した。次いで、NaClを0.5Mまで加え、0.55倍容のイソプロピルアルコールを表面に層状に加えて、DNAを沈澱させた。沈澱したDNAをガラス棒上に巻き付けた。該DNAを、最終濃度約385μg/mlで2mlの10mM Tris,1mM EDTA pH8.0中に溶解した。
【0036】
ステップ2〜10の注意事項:前述のように、合計5種の異なる制限エンドヌクレアーゼをそれぞれ使用してS.phaeochromogenes染色体を消化し、10のライブラリーを構築しスクリーニングした。メチラーゼクローンは部分的PstIライブラリーだけでしか得られられなかったため、ここでは部分的PstIライブラリーのみを詳述する。他の9個のライブラリーは、以下に略述する方法と類似の方法で作製した。
【0037】
2.部分消化: 精製DNAを以下のようにPstIで開裂して部分消化を行なった。10mM Tris pH7.5,10mM MgCl,100mMNaCl,10mM β−メルカプトエタノール緩衝液中500ug/mlのDNAの溶液100μlを、1つの100μlアリコートと7つの50μlアリコートとに分けた。100μlの試験管に40単位のPstIを加え、DNA1μg当たり4単位の酵素とした。この第1の試験管から50μlを取り出し、第2の試験管に移して2単位PstI/μgとし、以下同様にして、前の試験管の半分の量のPstIを次の試験管に移した。これらの試験管を37℃で1時間インキュベートし、72℃で15分間熱処理し、各試験管から15μlずつ採取してアガロースゲル電気泳動で分析した。中程度の、但し不完全な消化を示す試験管を、クローニング用部分消化フラグメント源として選択した(使用した部分消化試験管は0.25U/μg、0.12U/μg、0.06U/μg及び0.03U/μg試験管である)。個々の反応液を一緒に混ぜ合わせ、下記のステップ3に記載のように使用した。
【0038】
3.連結反応: フラグメント化したDNAを以下の方法でpBR322に連結した。6μgのPstI部分消化Streptomyces phaeochromogenes DNA(60μl)を、PstIで切断し脱リン酸化した3.0μgのpBR322(30μl)と混合した。20μlの10×連結反応ミックス(500mM Tris pH7.5,100mM MgCl,100mM DTT,5mM ATP)を加え、更に110.5μlの無菌蒸留水を加えて最終量を198μlとした。7.5μlの濃縮T4 DNAリガーゼ(2×10U/ml)を加え、該混合液を17℃で4時間インキュベートし、次いで10μlのクロロホルムを加えて殺菌した。約62.5μlの連結DNAを使用して大腸菌株K802を次のように形質転換した。DNAを0.5mlのSSC/CaCl(50mM NaCl,5mM クエン酸三ナトリウム,67mM CaCl)と氷上で混合し、1.0mlの氷冷コンピテント大腸菌K802(hsdR,mcrA,mcrBC ATCC No.33526)細胞を加えた。42℃で5分間インキュベートした後、10mlのルリアブロス(Lブロス)を加えて細胞を希釈し、37℃で4時間インキュベートした。
【0039】
4.一次細胞ライブラリー: 形質転換細胞培養液を簡単に遠心し、上清を捨て、細胞を1.0mlのLブロス中に再懸濁させた。200μlアリコートを、25μg/mlのテトラサイクリンを含むルリア寒天(L寒天)プレート上にプレーティングした。37℃で一晩インキュベートした後、各プレートに2.5mlの10mM Tris pH7.5,10mM MgClを注入し、形質転換コロニーをまとめて掻き取り、プールし、一次細胞ライブラリーを形成した。
5.一次プラスミドライブラリー: 一次プラスミドライブラリーを以下のように形成した。2.5mlの一次細胞ライブラリーを、10μg/mlのテトラサイクリンを含むLブロス500ml中に接種した。該培養液を37℃で一晩振盪し、次いで4000rpmで5分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを10mlの25%スクロース,50mM Tris pH8.0中に室温で再懸濁させた。5mlの0.25M EDTA pH8.0を加え、次いで0.25MTris pH8.0中10mg/mlのリゾチームの溶液3mlを加えた。得られた溶液を氷上に3時間放置し、次いで12mlの溶解用ミックス(1% Triton X−100、50mM Tris pH8.0、67mM EDTA)をピペットで強く注入し、該細胞懸濁液を静かに撹拌して溶解を完了させた。溶解後、混合液を50mlプラスチック遠心管に移し、17000rpm,4℃で45分間遠心した。上清をピペットで取り出した。20.0gの固体CsClを計量して50mlプラスチック製ねじ蓋付き試験管に入れ、22.0gの上清をピペットで加えて混合した。該混合液に1.0mlのエチジウムブロミド溶液(10mM Tris pH8.0、1mM EDTA、100mM NaCl中5mg/mlのエチジウムブロミド)を加えた。得られた溶液を2つの5/8インチ×3インチのポリアロマー遠心管に移し、密封した。これらの遠心管をBeckman Ti70ローターで、44000rpm、17℃で42時間遠心した。プラスミドを回収すべく遠心管の頂部にメスで孔をあけ、2つの蛍光DNAバンドのうち低い方を紫外光下でシリンジによって回収した。両管から得た低い方のバンドをねじ蓋付きガラス試験管に一緒に入れ、同量の氷冷水飽和N−ブタノールで4回抽出することによりエチジウムブロミドを除去した。 抽出後の溶液を透析チューブに移し、DNA緩衝液を4回交換して24時間透析した。透析後のDNA溶液を予め計量した50ml無菌遠心管に移し、量を測定した。5M NaClを最終濃度0.4Mまで加え、2倍容のイソプロパノールを加えて混合した。該溶液を−20℃で一晩貯蔵してDNAを沈澱させた。沈澱後、溶液を15000rpm、0℃で15分間遠心し、上清を捨てた。試験管を15分間ベンチ上に放置して空気乾燥し、次いでDNAペレットを500μlのDNA緩衝液中に溶解し、−20℃で貯蔵した。このようにして調製したプラスミドのDNA濃度は100〜200μg/mlであった。
【0040】
6.プラスミドプールの消化: ゲル精製した一次プラスミドプールを以下のように消化して非SphIメチラーゼクローンを破壊した。プラスミドDNAをSphI緩衝液(50mM NaCl、10mM Tris pH8.0、10mM MgCl、5mM β−メルカプトエタノール)で30μg/mlに希釈した。調製した量は合計900μlである。16U/μgのSphIを加え、該混合液を37℃で2時間インキュベートした。12分間72℃に加熱して反応液中の酵素を死滅させた。該消化物にEXoIIIヌクレアーゼをDNA1μg当たり50Uの濃度で加えた。37℃で1時間インキュベートした後、試験管にクロロホルムを10μl加えた。遠心分離によってクロロホルムを除去した。
【0041】
7.形質転換: 各試験管から採取した12.5μl試料を用いて大腸菌RR1を形質転換した。42℃で3分間インキュベートし、Lブロス中37℃で45分間増殖させた後、細胞/DNA混合物を、25μg/mlのテトラサイクリンを含むL寒天プレート上にプレーティングした。37℃で一晩インキュベートした後、プレートを調べた。SphIでのプラスミドライブラリーの消化により、形質転換体の数は約10に減少していた。
【0042】
8.生存固体の分析: セクション7で得た生存コロニーのうち28個をテトラサイクリン含有Lブロス培養液10ml中で増殖させ、それらが保有するプラスミドを、Birnboin及びDoly(Nucleic Acids Res.7:1513(1979))の方法を改変した下記のミニプレッププラスミド精製方法によって調製した。
【0043】
ミニプレップ操作:各培養液を8000rpmで5分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを、1mg/mlのリゾチームを含む1.0mlの25mM Tris、10mM EDTA,50mM グルコース、pH8.0中に再懸濁させた。室温で10分後、2.0mlの0.2M NaOH、1%SDSを各試験管に加え、これらの試験管を振盪して細胞を溶解させ、次いで氷上に配置した。溶液が透明になった時点で1.5mlの3M酢酸ナトリウムpH4.8を各試験管に加え、振盪した。形成された沈澱物を15000rpm、4℃で10分間遠心した。各上清を、イソプロパノール3mlを入れた遠心管内に注入し、混合した。室温で10分後、前記遠心管を15000rpmで10分間遠心し、沈澱核酸をペレット化した。上清を捨て、ペレットを室温で30分間空気乾燥した。乾燥したペレットを850μlの10mM Tris、1mM EDTA pH8.0中に再懸濁させた。75μlの5M NaClを各々に加え、該溶液を、575μlのイソプロパノールを入れたエッペンドルフ試験管に移し、再び室温で10分間沈澱させた。これらの試験管をマイクロ遠心機で45秒間遠心し、上清を捨て、ペレットを空気乾燥した。該ペレットを、100μg/mlのRNaseを含む500μlの10mM Tris pH8.0、1mM EDTA中に溶解し、37℃で1時間インキュベートしてRNAを消化した。50μlの5MNaCl及び350μlのイソプロパノールを順次加えてDNAをもう一度沈澱させた。室温で10分後、DNAを45秒間遠心することにより沈降させ、上清を捨て、ペレットを150μlの10mM Tris、1mM EDTA pH8.0からなる最終溶液中に再溶解した。その後、SphIでの消化によりプラスミドミニプレップを分析した。
【0044】
9.メチラーゼ遺伝子クローン: 1つのプラスミドがSphI耐性を示し、2つのPstIフラグメントを保有することが判明した(図2)。大腸菌クローンから調製した抽出物を下記のin vitro制限アッセイにかけた。
【0045】
エンドヌクレアーゼ活性について試験すべきクローンの培養液50mlを、25μg/mlのテトラサイクリンを含むLブロスで37℃で一晩増殖させた。5000rpmで5分間遠心することにより細胞をペレット化した。上清を捨て、ペレットを3mlの音波処理緩衝液(20mM KPO pH7.4、10mM β−メルカプトエタノール)中に再懸濁させた。該細胞懸濁液にリゾチームを最終濃度200μg/mlで加えた。該混合液を氷上に3時間維持し、次いで−20℃で凍結した。該混合物を氷上で解凍し、得られた懸濁液2mlを音波処理緩衝液2mlと混合した。該懸濁液に、Triton X−100の25%溶液を0.4μl加え、ピペットに出し入れすることにより混合した。破壊された細胞を5,000rpmで10分間遠心した。該細胞抽出物7.5μlを120μlの1×SphI緩衝液及び50μg/ml pBR322 DNA(PstIで予め消化したもの)と一緒に37℃で2時間インキュベートすることにより、上清の制限エンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。15μl試料を電気泳動によって調べたところ、制限エンドヌクレアーゼ活性は認められなかった。
【0046】
10. 4.5及び0.9kb PstI挿入物内のメチラーゼ遺伝子の位置: SphIメチラーゼクローンを多数の制限エンドヌクレアーゼで消化して、クローン化DNAの制限マップを作成した。該マップを用いて前記挿入物内の種々の領域を欠失させ、その結果生じるメチル化への影響を調べた。PstI部位にまたがる〜1kbメチラーゼ遺伝子の位置が正確に定められ、該遺伝子の両側のクローン化DNAの長さは3.5及び0.4kbであることが判明した。メチラーゼクローンは、メチラーゼ遺伝子の右側には連結制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分なDNA(0.4kb)をもたないが、メチラーゼ遺伝子の左側には十分な余地を有すると考えられた。しかしながら、2つの遺伝子の間の距離、これら遺伝子の正確なサイズ、及びこれら遺伝子が結合しているか否かは不明であったため、クローンにおけるSphIエンドヌクレアーゼ活性の欠如は、制限遺伝子がクローン中に存在していないか、又は存在していても発現はされていないことを示すものであった。制限遺伝子が存在していても発現はされていないという場合には、隣接DNAを有するクローン化メチラーゼ遺伝子をStreptomycesベクター中にサブクローニングし、これを用いてStreptomyces lividansを形質転換した(ステップ11,12)。更に、メチラーゼクローンのDNA配列決定及びタンパク質配列決定を行って、クローン中に制限遺伝子の一部分もしくは全体が存在しているか、又は全く存在していないかを決定した(ステップ13〜14)。完全な制限遺伝子が存在していない場合には、メチラーゼ遺伝子に隣接するDNAのより大きな領域をクローニングした(ステップ15〜17)。
【0047】
11. S.lividans中へのSphIメチラーゼサブクローンのクローニング: メチラーゼクローンでは、制限エンドヌクレアーゼが連結していたならば、メチラーゼ遺伝子の正確な位置に依存して、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分なDNAがメチラーゼ遺伝子の片側にクローン化された。しかしながら、前記クローンは制限エンドヌクレアーゼ活性を発現しなかったし、2つのSphI制限−修飾遺伝子が結合されているという証拠もなかったため、メチラーゼサブクローンを、大腸菌よりもS.phaeochromogenesに近い関係をもつ種であるS.lividans中にクローニングしてみることにした[以下に記載するのはpSphM3.6由来の3.6kb ApaI−BglIIフラグメントのクローニングである。pSphM2.6から単離した2.6kbのApaI−SnaBIフラグメントについても同様のサブクローニングを行った(部位の位置については図2参照)。結果は同じであったため、ここではApaI−BglIIサブクローニングのみを詳述する]15μl(1.0μg)のpSphM3.6を、20UのEcoRI、20UのScaI及び20UのHindIIIを含む50μlの10mM Tris pH7.5、10mM MgCl、100μg/mlウシ血清アルブミン、50mM NaCl中で37℃で2時間消化した。全体を0.7%アガロースゲル中で2時間電気泳動にかけた。DEAEアニオン交換ペーパー中に2時間電気泳動させることにより、3.6kbのEcoRI−HindIII制限フラグメントを回収した。前記ペーパーを、0.1M NaCl、10mM Tris pH8.0及び1mM EDTAを含む緩衝液150μlで2回洗浄した。次いで、1.0M NaCl、10mM Tris pH8.0及び1mM EDTAを含む緩衝液75μlで前記ペーパーを4回洗浄することより、DNAをペーパーから溶出させた。その結果得られたDNAフラグメント含有溶液を、300μlのフェノール/クロロホルム及び300μlのクロロホルムで順次抽出し、ドライアイス/エタノール浴中に15分間配置して1mlの無水エタノールで沈澱させた。14000rpmで5分間遠心してDNAをペレット化した。得られたペレットを70%エタノールで濯ぎ、空気乾燥し、最終量10μlの10mM Tris pH8及び1mM EDTA中に再懸濁させた。10μl(0.5μg)のEcoRI−HindIII精製DNAフラグメントを、EcoRI−HindIIIで切断し脱リン酸化したpIJ486(pIJ486は Norwich,EnglandのHopwood,D.A.から入手)2μl(0.2μg)に、1μlのT4 DNAリガーゼ(400U)を含む1×連結緩衝液中50μlの最終量で、12℃で一晩連結させた。10μlの連結反応ミックスを、約4×10のS.lividans TK24(Hopwood,D.A.から入手。TK24は、Hopwood,D.A.ら,Genetic Manipulation of Streptomyces,a Laboratory Manualに記載されている)の原形質体(protoplasts)に加えた。該原形質体は前出のHopwood,D.A.らの記述に従い、P緩衝液[103gのスクロース、0.25gのKSO、2.02gのMgCl.6HO、2mlの微量元素溶液及び800mlにするのに必要な量の蒸留水。これを80mlアリコートずつ分配し、オートクレーブ処理する。使用前に各80mlアリコートに下記の成分を加える:1mlの0.5%KHPO、10mlの3.68%CaCl.2HO及び10mlの5.73%TES緩衝液pH7.2。リットル当たりの微量元素溶液:40mgのZnCl、200mgのFeCl.6HO、10mgのCuCl.4HO、10mgのMnCl.4HO、10mgのNa.10HO及び10mgの(NHMo24.4HO]中で調製した。原形質体/DNA混合物に0.5mlの25%ポリエチレングリコール1000を加えた。これを1mlピペットに3回出し入れした。該形質転換用ミックス0.1mlを6つのR2YEプレートの各々にプレーティングした[103gスクロース、0.25g KSO、10.12g MgCl・6HO、10gグルコース,0.1g Difcoカザミノ酸及び800ml HO。この溶液80mlを2.2gのDifco寒天と混合し、オートクレーブ処理する。プレートを調製するために、前記ベース寒天溶液を融解し、以下の無菌溶液を加える:1ml 0.5%KHPO、8ml 3.68%CaCl・2HO、1.5ml 20%L−プロリン,10ml 5.73%TES緩衝液 pH7.2、0.2ml微量元素溶液及び0.5ml 1N NaOH。このプレート材料を層流フード(laminar flow hood)内に入れて1時間以上乾燥する]。30℃で一晩インキュベートした後、前記プレートに1.0mlのチオストレプトン水溶液(0.5mg/ml)を塗布した。コロニーが増殖するまでプレートを3〜4日間30℃に戻した。
【0048】
12. 形質転換体の分析: チオストレプトン選択によって得たコロニーを、独立コロニーの単離のために、5μg/mlのチオストレプトンを入れたR2YEプレートで画線培養した。増殖したコロニーを用いて、5μg/mlのチオストレプトンを含む5mlのTSB、Oxoid Tryptone SoyaBrothに接種した。これらの培養液を通気しながら30℃で24時間インキュベートした。培養液1mlについてミニプレップを実施した。この操作は、Birnboim及びDoly(Nucleic Acids Res.7:1513(1979))によって記述されている操作と同じであるが、相違点として、NaOH−SDS溶液を加える前に、4mg/mlのリゾチーム、50mMグルコース、25mM Tris pH8.0及び10mM EDTA中37℃で30分間インキュベートする必要がある。該ミニプレップDNA10μlを0.7%アガロースゲル上で泳動させることにより分析した。6つのクローンのうち2つが、pIJ486に挿入された正確な大きさのフラグメントを有していると思われた。これら2つの単離体に由来する胞子を回収し、5μg/mlのチオストレプトンを含む500mlのTSBに接種した。CsClプラスミドプレップを、前出のHopwoodらの論文p93に記載の方法3をスケールアップ(20倍)した方法に従って、前記培養液上で調製した。得られたペレットを17mlの10mM Tris pH8.0、1mM EDTA、18.7g CsCl及び0.44ml エチジウムブロミド(5mg/ml)中に再懸濁させた。該溶液を2つの5/8インチ×3インチポリアロマー遠心管に移し、密封した。これらの管をBeckman Ti70ローター内で44,000rpm、17℃で48時間遠心した。プラスミドを回収するために管の頂部にメスで孔をあけ、2つの蛍光DNAバンドのうち低い方を紫外光下でシリンジにより回収した。両管から得た低い方のバンドを15mlのCorex管に一緒に入れ、同量の水と3倍容のエタノールとを加えることによりエチジウムブロミドを除去した。−20℃で2時間後、12,000rpmで20分間遠心することによりDNAをペレット化した。得られたペレットを、2mlの10mM Tris pH8.0、1mM EDTAに再懸濁させた。50μlの8M LiClを加え、DNAをフェノール/クロロホルム及びクロロホルムで順次抽出した。前述のように3倍容のエタノールを該水溶液に加えてDNAを沈澱させた。ペレットを、500μlの10mM Tris pH8.0、1mM EDTAに再懸濁させた。精製したプラスミドをEcoRI及びHindIIIで消化して挿入物の存在を確認し、SphIで消化して、S.lividans中のサブクローンがSphIメチラーゼ活性を有しているかどうかを調べた。両サブクローンは明らかに同じものであり、正しい構造を有すると共にメチラーゼ活性を示した。即ち、SphI制限エンドヌクレアーゼで消化することができなかった。SphI制限エンドヌクレアーゼ活性を調べるために、プラスミドプレップに使用したものと同様に増殖させた培養液50mlをペレット化した。得られたペレットを10.3%スクロースで洗浄し、−70℃で凍結した。解凍後、ペレットを湿潤細胞重量1g当たり3mlで50mM Tris pH8.0、7mM β−メルカプトエタノール、1mM PMSF、1mM アジ化ナトリウム及び200mM NAClの溶液に再懸濁させた。氷上で音波処理した後、16,000rpmで45分間遠心することにより破片を除去した。上清をSphI制限エンドヌクレアーゼ活性についてアッセイした。pEGsphM2−4及びpEGsphM2−6と称するこれらのサブクローンは、S.lividans中で検出可能なSphIエンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。これは、SphI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子がSphIメチラーゼ遺伝子に結合していないか、又は該制限エンドヌクレアーゼ遺伝子がSphIメチラーゼクローン上で完全なものではないことを意味する。
【0049】
13. エンドヌクレアーゼ遺伝子がクローン化フラグメント上に存在するか否かを調べるために、そして存在している場合にはその位置をつきとめるために、SphI制限エンドヌクレアーゼを下記の方法でできるだけ均質に精製した:413gのStreptomyces phaeochromogenesからの粗細胞抽出物1.1リットルを下記のカラム上に下記の順序で配置した:ホスホセルロース、ヘパリン−セファロース、Q−セファロース、MonoQ HPLC及びMono−S HPLC。その結果、〜50%の純度のSphI制限エンドヌクレアーゼ調製物が得られた。
【0050】
前記精製SphI制限エンドヌクレアーゼを25〜30pM用いて、Applied Biosystems モデル470Aの気相タンパク質配列決定器(gas phase protein sequencer)でアミノ末端タンパク質の配列決定を行った。該制限エンドヌクレアーゼの最初の13個のアミノ酸残基は、Thr Ser Lys Asp Pro Ile Val LeuSer Ala Asp Gln Ile(SEQ ID NO:1)と決定された。
【0051】
14. 前記領域のDNA配列決定では、前記制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の5’領域が部分的PstIクローンpSphM6.0上に存在するが、該クローン上には完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は存在せず、前記制限遺伝子はメチラーゼ遺伝子の下流にあり、メチラーゼ遺伝子と同じ方向で転写されることが確認された(SEQ ID NO:2)。該配列からは更に、制限エンドヌクレアーゼの残りをクローニングし次いで大腸菌中でのクローン化遺伝子の発現を誘起するための後続操作のベースとして使用されるデータも得られた。
【0052】
15. 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りをクローニングするのに最も有用な酵素を決定すべく、サザンブロット法(Southern,E.1975,J.Mol.Bio.,98:503)を用いて隣接領域のゲノム地図を決定した。メチラーゼ遺伝子の一部分又は全体を含む幾つかのクローンを使用して、サザン、特定的にはpUC19中にクローニングされた0.9kb PstIフラグメント又は1.4kb SmaI−ApaIフラグメント(図2)をプローブした。これらのプラスミドを下記の方法でニックトランスレーションにかけた:1μl(0.5μg)のDNAと、10μlの緩衝液(500mM Tris pH7.8、100mM β−メルカプトエタノール、50mM MgCl)と、4μlのdNTP(各々0.1mmol)と、5μlのα−32P−dCTP(100pmoles、800キュリー/ミリモル)と、1μlのDNAポリメラーゼI(20単位)と、1μlのDNAseI(1μg/ml)と78μlのHOとを混合し、15℃で3時間インキュベートした。該混合物を5分間沸騰させ、即座に氷上に配置した。
【0053】
サザンブロットは下記のように調製した:S.phaeochromogenes DNAを制限エンドヌクレアーゼApaI、BamHI、BclI、BglII、BstYI、EcoRI,KasI、MluI、MscI、PvuII、PmlI、SacI,SalI,ScaII、SfiI、SmaI,SnaBI及びStuIで別個に消化した。消化物を1.0%アガロースゲル上で電気泳動にかけた。該ゲルを0.25M HClに10分間、0.5M NaOH、1.5M NaClに30分ずつ2回、次いで0.5M Tris pH7.5、1.5M NaClに30分ずつ2回浸漬した。ニトロセルロースシートを水に短時間浸漬し、次いで10×SSC(1.5M NaCl、150mMクエン酸三ナトリウム)に浸漬した。厚さ2インチに積重したペーパータオルと、Whatman 3MMペーパー(10×SSCに浸漬したもの)2枚と、湿潤ニトロセルロースメンブラン1枚と、処理したアガロースゲルと、もう1枚のニトロセルロースメンブランと、もう2枚の3MMペーパーと、厚さ2インチに積重したペーパータオルとを用いてサンドイッチを形成した。該サンドイッチに重みをかけて押さえ付け、ニトロセルロースシートへのDNAの移動を室温で一晩生起させた。該ニトロセルロースシートを0.9M NaCl、90mM クエン酸三ナトリウムで10分間濯ぎ、真空炉で80℃で1.5時間加熱して、移動したDNAフラグメントをニトロセルロースに固定させた。4mlの20g/l Ficoll、20g/lポリビニルピロリドン及び12g/lウシ血清アルブミンと、15mlの20×SSC(4.5mlの3M NaCl、0.3Mのクエン酸三ナトリウム)と、100mg/mlの変性し音波処理したサケ精子DNA 1mlと、80mlのHOとからなる溶液を15ml入れたプラスチック袋の中に前記シートを配置した。該シートを振盪しながら65℃で2時間インキュベートしてプレハイブリダイズした。100μlの放射性プローブを前記袋に加え、インキュベーションを振盪下65℃で一晩続けた。次いで、ニトロセルロースシートを2×SSC及び0.1%SDSで30分ずつ2回65℃で洗浄し、0.2×SSC及び0.1%SDSで30分間65℃で洗浄した。該シートを空気乾燥し、一晩かけてオートラジオグラムを作製した。
【0054】
該サザンブロットデータから、10種のエンドヌクレアーゼコーディングフラグメントの大体の寸法が判明した。ApaI,BamHI,BstYI、KasI、MluI、PvuII,SacI,SmaI及びStuIフラグメントはメチラーゼ遺伝子の右側にDNAを有する(図2)。プローブはApaI消化物中で1.2kbバンドにハイブリダイズし、BamHI消化物中で7.5kbバンドに、BstYI消化物中で4.9kbバンドに、KasI消化物中で0.9kbバンドに、MluI消化物中で3.6kbバンドに、PvuII消化物中で1.8kbバンドに、SacI消化物中で4.5kbバンドに、SmaI消化物中で2.4kbバンドに、そしてStuI消化物中では7.5kbバンドにハイブリダイズした。その他のバンドはクローン化するには大きすぎると判断された。
【0055】
16. SphIメチラーゼ遺伝子の下流の領域を有するクローンの単離:SphIメチラーゼで予め保護した又は保護してない大腸菌又はS.lividans宿主中に完全SphI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をメチラーゼと共に又はメチラーゼ無しにクローニングする試みは総て失敗したため、前記制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の3’末端のみをクローニングする試みを行った。DNA配列及びサザン分析の結果、KasI(又はNarI)は制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内で切断を行い、約0.9kb下流の次の部位が制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の3’末端の下流のDNAを開裂する筈であることが判明した。0.9kbのKasIフラグメントをクローニングすれば、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りが得られる筈である。100μl(9μg)のゲノムDNAを採取し、120μlの10mM Tris−HCl、10mM MgCl、50mM NaCl、1mM DTT pH7.9、100μg/ml BSA及び20UKasI中で37℃で2時間消化することによりS.phaeochromogenesゲノムDNAでKasIライブラリーを形成した。全体を0.7%アガロースゲルで2時間電気泳動にかけた。0.7〜1.0kbの大きさのDNAフラグメントをDEAEアニオン交換ペーパー中に2時間電気泳動させることによって回収した。ステップ11と同様の方法でDNAをDEAEペーパーから溶出した。このペレット化DNAを20μlの10mM トリス pH8.0、1mM EDTAに再懸濁させた。精製KasI消化フラグメント20μl(〜0.5μg)を、KasIで開裂し脱リン酸処理した5μl(0.2μg)のpUC19に、1×連結反応緩衝液(1μlのT4 DNAリガーゼ(400U)含有)中50μlの最終量で4℃で48時間にわたり連結させた。Millipore VS 0.025μMフィルターを用いて滴下透析(drop dialysis)により10μlの連結反応液を脱イオン処理した。次いでDNAを大腸菌ED8767中にエレクトロポレート(electroporate)させた。該大腸菌は、Lブロス中で1リットルの細胞をKlett 50〜80まで増殖させることによりエレクトロポレーション(elctroporation)用に調製した。前記細胞は氷上で15〜30分間冷却し、その後4,000rpmで15分間冷間遠心してペレット化した。該ペレットを氷冷無菌水で2回、10%グリセロールで1回洗浄した。洗浄したペレットを1〜2mlの10%グリセロールに再懸濁させて最終細胞濃度を3×1010細胞/mlとした。細胞は必要時まで100μlアリコート中−70℃で凍結した。調製した細胞中にDNAをエレクトロポレートさせるべく、前記細胞をゆっくり解凍し、氷上に配置した。該細胞40μlを10μlの連結し透析したDNAと混合した。該混合物を、冷却した0.2cmのエレクトロポレーションキュベット内に配置した。該DNA細胞混合物に時定数4〜5msec、12.5kV/cmで電気パルスを印加した。大腸菌を2mlのLブロスで即座に希釈し、37℃で1時間増殖させ、その後150mmのアンピシリン含有L寒天プレート8つにプレーティングした。37℃で一晩インキュベートした後、前記プレートに10mlのLブロスを注入し、コロニーをまとめて掻き取った。各プレートを別個にプールして、それぞれ5,000〜6,000のコロニーを含むサブライブラリーを形成した。各サブライブラリー0.8mlに0.2mlのグリセロールを加え、凍結ストックとして−70℃に維持した。D.Ish−Horowiczのミニプレップ操作(T.Maniatis,E.F.Fritsch及びJ.Sambrook,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1982,pp368−369に記載)を用いて、但し操作全体を5倍にスケールアップして、各サブライブラリーの残り9ml中の細胞からプラスミドを単離した。最終DNAペレットを8.5mlの10mM Tris pH8.0、1mM EDTA、9.35g CsCl及び0.25mlエチジウムブロミド(5mg/ml)に再懸濁させた。ステップ12と同様に勾配を形成してDNAを精製した。サブライブラリーから精製したプラスミドをステップ15と同様にKasIで消化し、アガロースゲル上を泳動させ、ブロットし、pSph0.9でプローブした。8つのサブライブラリーのうち3つが所望の0.9kb KasIフラグメントを有しており、このフラグメントはプローブとして使用した0.9kb PstIフラグメントにハイブリダイズした。これらのサブライブラリーから前記フラグメントを増幅するために、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを調製した。プライマー1はKasI部位の5’側のpUC19配列の一部分と、KasI部位の3’側でクローニングされ且つ配列決定された制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の領域とを含む:5’ CGC ATC AGG CGC CGT CAC CAC GGG C 3’(SEQ ID NO:3)。プライマー2は、New England Biolabs製のM13/pUC逆配列決定プライマー(製品#1233)である。クローニングベクターpUC19の一部分を含むSphI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の3’セグメントを、10mM KCl、10mM (NHSO、20mM Tris−HCl(pH8.8)、2mM MgSO、0.1% Triton X−100、各200μMのdNTP、100μg/ml BSA、5% DMSO中で、1UVent(登録商標)DNAポリメラーゼとのPCR反応を、95℃で1.5分間、60℃で1.5分間及び72℃で2分間で20サイクル行うことによりサブライブラリーから増幅した。該反応混合物を0.7%アガロースゲルで電気泳動させた。約1.0〜1.2kbの大きさのフラグメントをステップ11と同様にDEAEペーパーを用いて精製した。精製フラグメントをKasIで消化し、KasI消化脱リン酸化pUC19中に連結した。得られた連結体を大腸菌ED8767中にエレクトロポレートさせ、アンピシリン含有L寒天にプレーティングした。Ish−Horowiczの方法(Maniatisら、前述の文献)を用いて36の独立コロニー上でプラスミドDNAミニプレップを調製した。36のコロニーのうち1つが、正確な大きさの0.9kb挿入物を有するプラスミドを含んでいた。制限地図を作成したところ、該コロニーは正しい制限酵素部位を有していた。サザン分析の結果、新たに単離された前記コロニーはpSph0.9にハイブリダイズすることが判明した。これは、クローン化したフラグメントがおそらくは所望のフラグメントであることを意味するものである。前記0.9kb KasIフラグメントはSphI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の3’部分しか含んでいなかったため、遺伝子が再構築されるまではエンドヌクレアーゼ活性試験は不可能であった。該クローンをpEGsph42−1.4と命名した(図3)。
【0056】
17. SphI制限エンドヌクレアーゼの再構築及び過剰発現:10μl(5μg)のpEGsph42−1.4を使用して制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築し、3μl(5μg)のpSph0.9を別個に1×NEBuffer4(20mM Tris−アセテート、10mM 酢酸マグネシウム、50mM酢酸カリウム、1mM DTT pH7.9)中37℃で2時間にわたりMscIで消化した。インキュベーション後、消化物をフェノール:クロロホルムの1:1混合物で1回、クロロホルムで1回抽出し、1/10倍容の3M酢酸ナトリウムと2.5倍容の95%エタノールとで沈澱させた。エッペンドルフ遠心器で室温で5分間遠心してDNAをペレット化し、70%エタノールで1回洗浄した。該ペレットを1×NEBuffer2に再懸濁させた。MscIで消化したpSph0.9を、20UのXbaIの添加によって更に消化し、MscIで消化したpEGsph42−1.4を20UのHindIIIの添加によって更に消化した。37°で2時間後、DNAを0.7%アガロースゲル上で泳動させた。Bio−Rad Prep−A−Geneキットを製造業者の指示通りに使用して、pSph0.9消化物から0.6kbバンドを精製し、pEGsph42−1.4消化物から1kbバンドを精製した。これら2つのフラグメント(各々〜0.5μg)を1×リガーゼ緩衝液、T4 DNAリガーゼ(400U)中12℃で18時間連結反応させた(図4)。この連結フラグメントを、SphIメチラーゼで予め保護したS.lividans宿主中で高コピープラスミド中にクローニングする試みは総て失敗に終わったため、再構築フラグメントを、調節した大腸菌プロモーターの後ろに直接クローニングしてみることにした。DNA及びタンパク質の配列データを用いて2つのオリゴヌクレオチドプライマーを形成した。第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、タンパク質の配列決定によりエンドヌクレアーゼ遺伝子の出発点であることが判明したAUGコドンと重複する配列を含んでおり、2つの塩基が変化してBspHI部位を形成していた:5’ CCT TCG ACT ATA GTG AAG TCA TGA CAA G 3’ SEQ ID NO:4。第2のオリゴヌクレオチドプライマーはpUC19中のKasI部位の左側に配列を含んでおり、増幅したフラグメントのクローニングを助けるためにHindIII部位が該プライマー中に含まれている:5’ GCG CAG CCT GAA TGA AGC TTG GCG CC 3’SEQ ID NO:5。これら2つのプライマーを、pSph0.9及びpEGsph42−1.4(既述)由来の連結フラグメントと一緒に、1kb DNAフラグメントを増幅するためのPCR(ステップ16の条件を使用する)で鋳型として使用した。ステップ11と同様にDEAEペーパーを用いてバンドを精製した。精製したPCR生成物を1×NEBuffer4中で2UのBspHIで2時間消化し、次いで1×NEBuffer2中で20UのHindIIIで消化し、DEAEペーパーを用いてアガロースゲルから精製した(図4)。精製フラグメント(〜0.1μg)を、400UのTA DNAリガーゼを用いて37℃で2時間にわたり総量40μlでNcoI及びHindIII(〜0.05μg)で消化したPtac発現ベクターpAGR3(New England Biolabs、W.Jackから入手)中に連結した。(pAGR3は、アンピシリン耐性遺伝子とlacIの単一コピーと、Ptacプロモーターと、リードスルー(read−through)転写を防止するためのPtacプロモーターの上流のrrnターミネーターの4倍直接反復(4 fold direct repeat)と、lacリボソーム結合部位の下流のNcoI部位とを含むpBR322ベースのベクターである。)pSYX20上のNlaIIIメチラーゼ遺伝子を有するコンピテント大腸菌ED8767を形質転換するために前記連結体を20μl使用した。[NlaIIIメチル化認識部位CATGはSphI制限エンドヌクレアーゼ認識部位と重複するため宿主をSphI消化から防護する。pSYX20(ATCC#75260)はpSC101複製開始点上にKan及びTc遺伝子を有する中間コピー数プラスミドである。Tc遺伝子に挿入されたメチラーゼ遺伝子はTcプロモーターから構築的に発現できる。]形質転換細胞を37℃で30分間増殖させ、アンピシリン(100μg/ml)とカナマイシン(50μg/ml)とを含むL寒天にプレーティングした。36のコロニーを採取し、独立したコロニーを単離すべく、アンピシリン及びカナマイシン含有L寒天上で画線培養した。ステップ8のミニプラスミドプレップ操作を用いて個々のコロニーからプラスミドを単離した。各ミニプレップ5μlのHindIII消化物をpAGR3のHindIII消化物と比較した。36のクローンのうち24がpAGR3より大きいプラスミドを有していると思われた。特徴を更に調べるために、これらのクローンから6つを選択した。これら6つのクローンをアンピシリン及びカナマイシン含有Lブロス200ml中でKlett60(中間対数期)まで増殖させ、1mM IPTGで誘導した。誘導後2時間で培養液を50ml採取した。遠心分離によって細胞を回収し、音波処理用冷却緩衝液(50mM Tris pH8.0、10mM β−メルカプトエタノール、50mM NaCl、1mM PMSF及び1mM アジ化ナトリウム)で1回洗浄し、ペレットを−70℃で凍結した。30分後、ペレットを氷上で解凍し、細胞1g当たり3mlの音波処理用緩衝液に再懸濁させ、氷上で音波処理した。音波処理した細胞抽出物を16,000rpmで1時間遠心した。各抽出物1μlを、12μlのpBR322(12μg)と90μlの10×NEBuffer2と22.5μlのPstI(20U/μl)とを含むDNA混合物49μlと混合し、水で900μlにした。該試験管から25μlを採取して25μlのDNA混合物と混合し、1:1の希釈を行った。1:1希釈を更に3回続けて行った。該反応混合物を37℃で1時間インキュベートした。25μlの反応混合物全部を0.7%アガロースゲル上で泳動させた。粗細胞抽出物からの力価を、精製SphI制限エンドヌクレアーゼからの既知の力価と比較した。6つのクローンのうち1つは、検出可能なSphI制限エンドヌクレアーゼ活性を殆ど又は全く示さなかった。これに対し、5つのクローンはSphI制限エンドヌクレアーゼ活性が大きすぎて、該アッセイでは力価を正確に測定することができなかった。しかしながら、該酵素の力価は細胞1g当たり10単位を超えると推定された。更に滴定したところ、SphI制限エンドヌクレアーゼ活性は約1.5×10〜3×10であった。この値は、Streptomyces phaeochromogenesの粗抽出物で観察される細胞1g当たりのSphI制限エンドヌクレアーゼ活性の約1000倍以上である。特徴を更に調べ且つ最適化するために前記クローンから選択した1つのクローンに株名NEB#808を付与し、プラスミドはpGEsph50−2と命名した。NEB#808の試料を、1992年8月5日にMaryland,RockvilleのAmerican Type Culture Collectionに寄託した。受託番号は69045である。NEB#808の粗抽出物から得たSphI制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を図5に示す。
【0057】
18. SphI制限エンドヌクレアーゼは次の方法でNEB#808から産生し得る。まず、アンピシリン及びカナマイシン含有豊栄養培地を入れた発酵槽で中間対数期まで増殖させる。次いでIPTGを最終濃度1mMまで添加することにより前記培地を誘導し、1〜2時間増殖させ続ける。その後、遠心分離によって細胞を回収する。
【0058】
19. NEB#808からのSphI制限エンドヌクレアーゼの精製:以下の操作は総て氷上又は4℃で実施した。0.2M NaClを含む緩衝液A(20mM リン酸カリウム pH6.9、0.1mM EDTA、1mM β−メルカプトエタノール、5%グリセロール)291mlに細胞97gを再懸濁させ、11,500PSIGでフレンチプレスに1回通して破壊した。該抽出物を12,000rpm、4℃で90分間遠心し、得られた上清を、0.2M NaCl含有緩衝液Aで平衡化したDEAEセファロースCL−6Bのカラム(5×10cm)に通した。素通り液(flow−through)を集め、緩衝液Aで1:1で希釈し、0.1M NaCl含有緩衝液Aで平衡化したヘパリンセファロースCL−6Bのカラム(5×8cm)にかけた。該カラムを、0.1M NaCl含有緩衝液A 350mlで洗浄し、0.1M NaCl含有緩衝液A800mlと1M NaCl含有緩衝液A 800mlとで調製した塩化ナトリウム直線勾配にかけた。フラクションを流速5ml/分で回収した。酵素活性ピークをプールし、0.55〜0.75M NaClでカラムから溶離した。50mM NaCl含有緩衝液Aに対して一晩透析した後、プールした酵素を、50mM NaCl含有緩衝液Aで平衡化したMono Q(登録商標)HR 10/10(8ml)に充填した。フラクションを流速1.0ml/分で回収した。酵素活性ピークをプールし、0.3〜0.35M NaClでカラムから溶離した。該プールを緩衝液AでNaCl濃度50mMまで希釈し、TSK−ヘパリンTosoHaas 5PWカラム(7.5cm×7.5mm ID)に充填した。フラクションを流速1.0ml/分で回収した。酵素活性ピークを0.42〜0.5M NaClでカラムから溶離した。活性を含むフラクションをプールし、緩衝液B(10mM Tris pH7.4、50mM 塩化ナトリウム、0.1mM EDTA、1mM DTT、50%グリセロール)に対して透析することにより濃縮した。この精製方法では合計10.8×10単位の酵素が得られた。収率は1%である。
【0059】
前記精製方法によって得たSphI制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含んでいなかった。SphI制限エンドヌクレアーゼ調製物の純度を下記の基準に従って調べた。
【0060】
1)連結反応:λDNAの20倍過剰消化後には、産生したDNAフラグメントの95%以上がT4 DNAリガーゼに連結した(5’末端濃度は16℃で1〜2μM)。これらの連結フラグメントの95%は再切断が可能であった。2)長時間の消化:1μgのλDNAと10単位の酵素とを含む50μlの反応混合物を16時間インキュベートすると、1単位の酵素で1時間反応させた場合と同じパターンのDNAバンドが形成された。3)エキソヌクレアーゼ活性:音波処理した H DNA(10 cpm/μg)1μgを含む50μlの反応液中37℃で4時間にわたり3,000単位の酵素をインキュベートすると、0.01%未満の放射能が放出された。4)エンドヌクレアーゼ汚染:1μgのΦX174RFI DNAを含む50μlの反応液中37℃で4時間にわたり150単位の酵素をインキュベートすると、25%未満がRF IIに転換した。試験は総て次の反応緩衝液中で実施した:50mM NaCl、10mM Tris−HCl、10mM MgCl、1mM DTT(pHは25℃で7.9)。
【0061】
【配列表】
配列番号(SEQ ID NO):1
配列の長さ:235
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列
【0062】
【化1】
Figure 0003578781
配列番号:2
配列の長さ:2692塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:703..1653
他の情報:/note=「メチラーゼ遺伝子は位置703で始まり1653で終わる。制限エンドヌクレアーゼは位置1703で始まり2410で終わる」
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1703..2410
配列
【0063】
【化2】
Figure 0003578781
【0064】
【化3】
Figure 0003578781
【0065】
【化4】
Figure 0003578781
【0066】
【化5】
Figure 0003578781
配列番号:3
配列の長さ:25塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:不明
トポロジー:不明
配列
【0067】
【化6】
Figure 0003578781
配列番号:4
配列の長さ:28塩基対
配列の型:核酸
鎖の数:不明
トポロジー:不明
配列
【0068】
【化7】
Figure 0003578781
配列番号:5
配列の長さ:26塩基対
配列の型:核酸
鎖の長さ:不明
トポロジー:不明
配列
【0069】
【化8】
Figure 0003578781

【図面の簡単な説明】
【図1】SphI制限エンドヌクレアーゼをクローン化し産生するための好ましい方法の説明図である。クローニングプロジェクトに着手した時には、SphI制限−修飾系のクローニングでどのエンドヌクレアーゼ又は条件が有利であるかも、またこれらのクローンにおける制限及び修飾遺伝子の位置も不明であった。図1及び実施例1に記載のクローニングの結果及びDNAの配列決定、マッピング並びにクローンの特徴分析は、当初不明であったSphI制限−修飾系のクローニング及び発現の直接的経路を明らかにするものである。
【図2】PstIライブラリーのメチラーゼ選択によって得たPstIの部分的クローンpSphM6.0の地図である。
【図3】S.phaeochromogenesゲノムDNAから調製したKasIライブラリーからSphI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを単離する方法を簡単に示す説明図である。図面上部に示されている点々模様の大きな四角い枠はKasIライブラリーを表し、該枠内の2つの円は種々のクローンの中の2つのプラスミドであって、(円内に長い矢印で示されているように)SphI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを含んでいる。矢頭は、KasIライブラリーから所望のフラグメントを増幅するのに使用されるプライマーの位置を示している。プラスミド上の小さな四角い枠はベクター上の多重クローニング部位の位置を示す。
【図4】pEGsph42−1.4と、pEGsphR50−2を得るための制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の最構築及びPCRとを簡単に示す説明図である。pSphM0.9はpUC19にクローニングされたpSphM6.0からの0.9kbのPstIフラグメントである。pSphM0.9の地図に示されているXbaI部位はベクター内の部位であり、SphI制限修飾系をコードするDNAの一部分ではない。pEGsph42−1.4内の点線は、地図上の該領域がベクターpUC19に由来するものであることを示している(HindIII部位も含まれる)。再構築エンドヌクレアーゼ遺伝子の下に記されている太枠で囲まれた矢印は、過剰発現用にpEGsphR50−1を構築するためにエンドヌクレアーゼ遺伝子のPCRに使用されるプライマーの位置及び方向を示している。
【図5】NEB#808の細胞抽出物から得たSphI制限エンドヌクレアーゼ活性の力価をアガロースゲルの電気泳動写真で示す説明図である。ゲルのレーンの番号付けは左から右に向かって行われ、ゲルの左側のレーンが1、右側のレーンが25である。16μlのpBR322(16μg)と80μlの10X NEBuffer2と、10μlのPstI(200U)とを混合し無菌水で800μlにしてDNA混合物を形成した。NEB#808から調製した粗抽出物1μlを49μlのDNA混合物に加えた(図5、レーン1)。混合後、該試験管から5μlを採取し、45μlのDNA混合物と一緒に第2の試験管に加えた(図5、レーン2)。第2の試験管から5μlを採取し、45μlのDNA混合物と一緒に第3の試験管に加えた(図5、レーン3)。第3の試験管から25μlを採取し、25μlのDNA混合物と一緒に第4の試験管に加えた(図5、レーン4)。1:1の希釈を更に6回行った(図5、レーン5〜16)。同様の1:1希釈をS.Phaeochromogenesから精製した1μlのSphIについて行い(図5、レーン18〜25)、粗抽出物中の酵素の力価を評価した。37℃で1時間インキュベートした後、各希釈物を25μlずつ0.7%アガロースゲル上に充填し、2時間泳動させた。

Claims (4)

  1. 配列番号2の1703番目〜2407番目の位置に相当する塩基配列からなるDNA、または配列番号2の1703番目〜2407番目の位置に相当する塩基配列に相補する塩基配列を有するDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつSphI制限酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
  2. 請求項1に記載のDNAを含んでなる組換えベクター。
  3. 請求項2に記載の組換えベクターによって形質転換された宿主細胞。
  4. SphI制限酵素の製造法であって、請求項3に記載の宿主細胞を該制限酵素の発現に好適な条件下で宿主細胞を培養することを特徴とする当該方法。
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