DE3853145T2

DE3853145T2 - Verfahren zur Herstellung von xbaI-Restriktionsendonuklease und -methylase.

Info

Publication number: DE3853145T2
Application number: DE3853145T
Authority: DE
Inventors: Cott Elizabeth Van; Geoffrey Wilson
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1987-12-21
Filing date: 1988-12-16
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2008-12-17
Also published as: EP0323081A3; DE3853145D1; EP0323081A2; JP2746964B2; ATE118817T1; JPH0216979A; DE323081T1; US4983542A; EP0323081B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Klone für die Xba I- Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase sowie die Herstellung dieser Enzyme aus den Klonen.
Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von anderen verunreinigenden bakteriellen Bestandteilen gereinigt werden, können Restriktionsendonukleasen im Labor verwendet werden, um DNA-Moleküle in präzise Fragmente zu zertrennen. Diese Eigenschaft ermöglicht, daß DNA-Moleküle eindeutig identifiziert und in ihre aufbauenden (constituent) Gene fraktioniert werden können. Restriktionsendonukleasen haben sich als unentbehrliche Werkzeuge in der modernen genetischen Forschung erwiesen. Sie sind die biochemischen "Scheren", durch welche Gentechnik und Analyse durchgeführt werden.
Restriktionsendonukleasen wirken durch ein Erkennen und Binden an bestimmte Nukleotidsequenzen (die "Erkennungssequenz") entlang des DNA-Moleküls. Wenn sie einmal gebunden sind, schneiden sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite von der Sequenz. Verschiedene Restriktionsendonukleasen haben eine Affinität für verschiedene Erkennungssequenzen. Über einhundert verschiedene Restriktionsendonukleasen sind unter vielen Hunderten von Bakterienarten, die bis heute untersucht wurden, identifiziert worden.
Bakterien besitzen gewöhnlich nur eine kleine Anzahl an Restriktionsendonukleasen pro Art. Die Endonukleasen werden gemäß den Bakterien genannt, aus denen sie erhalten werden. Somit synthetisiert die Art Haemophilus aegyptius beispielsweise 3 verschiedene Restriktionsendonukleasen mit den Namen Hae I, Hae II und Hae III. Diese Enzyme erkennen und spalten die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy bzw. GGCC. Auf der anderen Seite synthetisiert Escherichia coli RY13 nur ein Enzym, EcoR I, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
Unter der Voraussetzung, nicht an die Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß in der Natur Restriktionsendonukleasen für das Wohlergehen der Bakterienzelle eine schützende Rolle spielen. Sie ermöglichen den Bakterien, einer Infektion durch fremde DNA-Moleküle, wie Viren und Plasmide, zu widerstehen, welche sie andernfalls zerstören oder parasitieren würden. Sie verleihen Resistenz, indem sie an infizierende DNA-Moleküle binden und diese an jeder Stelle, wo die Erkennungssequenz vorkommt, spalten. Die resultierende Aufspaltung inaktiviert viele der infizierenden Gene und macht die DNA empfänglich für einen weiteren Abbau durch Exonukleasen.
Ein zweiter Bestandteil von bakteriellen Schutzsystemen sind die modifizierenden Methylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu den Restriktionsendonukleasen und sie liefern das Mittel, durch welches Bakterien in der Lage sind, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifizierende Methylasen erkennen und binden an dieselbe Nukleotiderkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuklease, aber anstatt die DNA zu zertrennen, modifizieren sie chemisch durch Zufügung einer Methylgruppe das eine oder andere der Nukleotide innerhalb der Sequenz. Nach der Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht länger durch die Restriktionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle ist aufgrund der Aktivität ihrer modifizierenden Methylase immer vollständig modifiziert und sie ist daher völlig unempfindlich gegenüber der Gegenwart der endogenen Restriktionsendonuklease. Es ist nur unmodifizierte und daher identifizierbar fremde DNA, welche empfindlich für eine Erkennung und einen Angriff der Restriktionsendonuklease ist.
Mit dem Aufkommen der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, welche sie codieren, in größeren Mengen herzustellen, als sie durch herkömmliche Reinigungstechniken erhältlich sind. Der Schlüssel zum Isolieren von Klonen der Restriktionsendonukleasegene ist, ein einfaches und zuverlässiges Verfahren zu entwickeln, um solche Klone in komplexen "Bibliotheken", d.h. Populationen von Klonen, welche durch "Schrotschuß"- Verfahren ('shotgun' procedures) abgeleitet wurden, zu identifizieren, wenn sie mit Häufigkeiten, die so niedrig sind wie 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup4;, vorkommen. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so daß die unerwünschte Mehrheit an Klonen zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
Typ II-Restriktions-Modifikations-Systeme werden mit wachsender Häufigkeit kloniert. Die ersten klonierten Systeme verwendeten eine Bakteriophageninfektion als ein Mittel zum Identifizieren oder Selektieren von Restriktionsendonukleaseklonen (Hha II: Mann et al., Gene 3, 97-112 (1978); EcoR II: Kosykh et al., Molec. gen. Genet. 178, 717-719 (1980); Pst I: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 1503-1507 (1981)). Da die Gegenwart von Restriktions-Modifikations-Systemen in Bakterien ihnen ermöglicht, einer Infektion durch Bakteriophagen zu widerstehen, können Zellen, welche die klonierten Restriktions-Modif ikations-Gene tragen, im Prinzip selektiv als Überlebende aus Bibliotheken isoliert werden, die einem Phagen ausgesetzt wurden. Es wurde jedoch gefunden, daß dieses Verfahren nur einen beschränkten Wert hat. Insbesondere wurde gefunden, daß die klonierten Restriktions-Modifikations-Gene nicht immer eine ausreichende Phagenresistenz zeigen, um eine selektive Überlebensmöglichkeit zu verleihen.
Ein anderer Klonierungsansatz betrifft Übertragungssysteme, welche ursprünglich als Plasmid-getragen in E. coli-Klonierungsplasmiden charakterisiert wurden (EcoR V: Bougueleret et al., Nucleic Acids Res. 12, 3659-3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 402-406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19, 355-359 (1982); Pvu II: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164, 501-509 (1985)).
Ein dritter Ansatz und einer, welcher verwendet wird, um eine wachsende Anzahl von Systemen zu klonieren, betrifft ein Selektionieren auf ein aktives Methylasegen, mit Bezug auf unsere Patentanmeldung Nr. 707079 (EP-A-193413) und BsuR I (Kiss et al., Nucleic Acids Res. 13, 6403-6421 (1985)). Da Restriktions- und Modifikationsgene dazu neigen, eng verbunden zu sein, können Klone, welche beide Gene enthalten, oft isoliert werden, indem nur auf ein Gen selektioniert wird. Selektion auf eine Methylierungsaktivität führt jedoch nicht immer zu einem vollständigen Restriktions-Modifikations-System, sondern liefert statt dessen manchmal nur das Methylasegen (BspR I: Szomolanyi et al., Gene 10, 219-225 (1980); Bcn I: Janulaitis et al., Gene 20, 197-204 (1982); BsuR I: Kiss und Baldauf, Gene 21, 111-119 (1983); und Msp I: Walder et al., J. Biol. Chem. 258, 1235-1241 (1983)).
Ein potentielles Hindernis beim Klonieren von Restriktions- Modifikations-Genen liegt darin, zu versuchen, das Endonukleasegen in einen Wirt, welcher nicht schon durch Modifikation geschützt ist, einzuführen. Wenn das Methylasegen und Endonukleasegen zusammen als ein einzelner Klon eingeführt werden, muß die Methylase die Wirts-DNA schützend modifizieren, bevor die Endonuklease die Möglichkeit hat, sie zu spalten. Gelegentlich könnte es daher nur möglich sein, die Gene aufeinanderfolgend zu klonieren, zuerst die Methylase und dann die Endonuklease. Ein anderes Hindernis beim Klonieren von Restriktions-Modifikations-Systemen liegt in der Entdeckung, daß manche E. coii-Stämme nachteilig auf eine Cytosinmodifikation reagieren; sie besitzen Systeme, welche eine DNA, die methyliertes Cytosin enthält, zerstören (Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 9070-9074 (1986)). Cytosinspezifische Methylasegene können nicht leicht in diese Stämmen kloniert werden, weder allein noch zusammen mit ihren entsprechenden Endonukleasegenen. Um dieses Problem zu vermeiden, ist es nötig, die Mutantenstämme von E. coli (McrA&supmin; und McrB&supmin;) zu verwenden, in welchen diese Systeme defekt sind.
Da gereinigte Restriktionsendonukleasen und in einem geringeren Ausmaß Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zum Charakterisieren und Umordnen von DNA im Labor sind, besteht ein kommerzieller Anreiz, Bakterienstämme durch rekombinante DNA-Techniken zu erhalten, welche diese Enzyme in großer Menge synthetisieren. Solche Stämme wären nützlich, da sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen würden, wie auch das Mittel für eine Produktion in kommerziell nützlichen Mengen zur Verfügung stellen würden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Klon, welcher die Gene für die Xba I-Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase enthält, welche aus Xanthomonas badrii (ATCC 11672) abgeleitet sind, wie auch entsprechende Verfahren zur Herstellung der Enzyme, zur Verfügung gestellt. Insbesondere betrifft diese Erfindung Klone, welche die Restriktionsendonuklease Xba I exprimieren, ein Enzym, welches die DNA-Sequenz TCTAGA erkennt und zwischen dem T und dem C spaltet. Siehe Zain und Roberts, J. Mol. Biol. 115, 249-255 (1977). Die Xba I-Restriktionsendonuklease, welche gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, ist frei von den Verunreinigungen, welche in Xba I-Präparationen gefunden wurden, die aus Xanthomonas badrii gemacht wurden.
Das bevorzugte Verfahren zum Klonieren dieses Enzyms umfaßt: Bilden einer Bibliothek, welche die DNA aus X. badrii enthält, Isolieren von Klonen, welche das Xba I- Modifikationsinethylasegen enthalten, und Screenen unter diesen, um jene zu identifizieren, welche ebenfalls das Xba I-Restriktionsendonukleasegen enthalten.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 stellt das Schema zum Klonieren und Herstellen der Xba I-Restriktionsendonuklease dar.
Fig. 2 ist eine Restriktionskarte eines 3 Kb-Hind III-Multifragmentes von X. badrii-DNA, welches die Xba I-Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase codiert. Das Multifragment wurde zusammen mit einem zusätzlichen 3 Kb- Einzelfragment in die Hind III-Stelle von pUC19 (ATCC 37254) kloniert, um pEC145RM 102-4 und pEC145RM 102-18 zu erzeugen. Das Multifragment wurde anschließend getrennt subkloniert, um pEC145RM 102-18/39 zu erzeugen.
Fig. 3 ist eine Fotografie eines Agarosegels, welches die Xba I-Restriktionsendonukleaseaktivität in einem Zellextrakt von E. coli RR1 (ATCC 31343) zeigt, welcher pEC145RM 102-18/39 enthält.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Klone der Xba I-Restriktions- und Modifikationsgene, wie auch die Restriktionsendonuklease Xba I, welche aus solchen Klonen hergestellt wird. Die Xba I-Gene werden durch ein Verfahren kloniert, welches einen Vorteil aus der Tatsache zieht, daß gewisse Klone, die auf der Grundlage selektiert werden, daß sie das Xba I-Modifikationsgen enthalten und exprimieren, ebenfalls das Xba I-Restriktionsgen enthalten. Die DNA solcher Klone ist resistent gegenüber einem Verdau durch die Xba I- Restriktionsendonuklease; die Resistenz gegenüber einem Verdau bietet ein Mittel, um selektiv Klone, welche die Xba I-Methylase und -Endonuklease codieren, zu isolieren.
Die hierin beschriebenen Verfahren, durch welche das Xba I- Restriktionsgen und Methylasegen vorzugsweise kloniert und exprimiert werden, sind in Fig. 1 dargestellt und sie umfassen die folgenden Schritte:
1. Die DNA von Xanthomonas badrii wird gereinigt. X. badrii wurde von Zain et al., siehe oben, beschrieben. Proben dieses Bakteriums sind erhältlich von der American Type Culture Collection, Katalog Nr. ATCC 11672.
2. Die DNA wird teilweise mit einer Restriktionsendonuklease, wie z.B. Hind III, verdaut.
3. Die verdaute DNA wird in einen Klonierungsvektor, wie z.B. pUC19 (ATCC 37254) ligiert, welcher eine oder mehrere Xba I-Stellen enthält. Die ligierte DNA wird in einen geeigneten Wirt, wie z.B. Escherichia coli-Stamm RR1 (ATCC 31343) transformiert.
4. Die transformierte Mischung wird bei 30ºC in der Gegenwart eines Mittels, welches selektiv für transformierte Zellen ist, wie z.B. das Antibiotikum Ampicillin, vermehrt. Nach der Inkubation werden die transformierten Kolonien gesammelt, um die Zellbibliothek zu bilden.
5. Die rekombinanten Plasmide werden in toto von der Zellbibliothek gereinigt, um die Plasmidbibliothek zu erzeugen.
6. Die Plasmidbibliothek wird vollständig mit der Xba I- Restriktionsendonuklease, welche aus X. badrii hergestellt wurde, verdaut. Ein Xba I-Verdau zerstört differentiell unmodifizierte Klone, womit die relative Häufigkeit von Xba I-Methylaseklonen vergrößert wird.
7. Die verdaute Plasmidbibliothek wird in einen geeigneten Wirt, wie z.B. E. coli RR1, zurücktransformiert und die Transformanten werden durch Plattieren auf selektiven Medien zurückgewonnen. Die Kolonien werden gepickt und ihre DNA wird auf die Gegenwart des Xba I-Modifikationsgens hin analysiert: Die Plasmide, welche sie enthalten, werden gereinigt und mit der Xba I-Restriktionsendonuklease inkubiert, um zu bestimmen, ob sie gegenüber einem Verdau resistent sind. Die gesamte zelluläre DNA (chromosomale und Plasmid-) wird ebenfalls gereinigt und mit der Xba I-Restriktionsendonuklease inkubiert. Die DNA der Klone, welche das Xba I-Modifikationsgen enthalten, sollte vollständig modifiziert sein und sowohl Plasmid-DNA als auch gesamte DNA sollte im wesentlichen resistent gegenüber einem Verdau sein.
8. Klone, welche die Xba I-Restriktionsendonuklease enthalten, werden identifiziert, indem Zellextrakte der Xba I- Methylaseklone hergestellt werden, welche in Schritt 8 identifiziert werden, und die Extrakte auf eine Xba I-Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet werden.
9. Die Xba I-Restriktionsendonuklease kann aus Klonen erzeugt werden, welche die Xba I-Restriktions- und Modifikationsgene enthalten, indem diese in einem Vollmedium, welches Ampicillin enthält, in einem Fermenter vermehrt werden. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und durch Beschallung aufgebrochen, um einen rohen Zellextrakt herzustellen, welcher die Xba I-Restriktionsendonukleaseaktivität enthält.
10. Der rohe Zellextrakt, welcher die Xba I-Restriktionsendonukleaseaktivität enthält, wird durch Standardproteinreinigungstechniken, wie z.B. Affinitätschromatographie und Ionenaustauschchromatographie, gereinigt.
Obwohl die oben bezeichneten Schritte die bevorzugte Weise zum Praktizieren der vorliegenden Erfindung darstellen, wird es den Fachleuten klar sein, daß der oben beschriebene Ansatz gemäß Techniken, welche im Stand der Technik bekannt sind, variieren kann.
Das folgende Beispiel wird angegeben, um Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen, wie sie derzeit in der Praxis bevorzugt wird. Man wird verstehen, daß dieses Beispiel zur Darstellung dient und daß die Erfindung, außer wie in den angefügten Ansprüchen angegeben, nicht als beschränkt betrachtet werden soll.

BEISPIEL

Klonieren des Xba I-Restriktionsendonukleasegens

1. DNA-Reinigung: 5 g gefrorene Xanthomonas badrii (ATCC 11672)-Zellen wurden 1 Stunde lang auf Eis aufgetaut und dann in 20 ml 25% Sucrose, 50 mM Tris pH 8,0 resuspendiert. 10 ml 0,25 M EDTA pH 8,0 und 6 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris pH 8,0 wurden zugegeben. Die Suspension wurde 2 Stunden lang auf Eis gehalten, dann durch die Zugabe von 24 ml 1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 8,0, 67 mM EDTA und 5 ml 10% SDS lysiert. Die Lösung wurde mit 70 ml Phenol (welches vorher mit 0,5 M Tris pH 8,0 äquilibriert wurde) und 60 ml Chloroform extrahiert. Die Emulsion wurde 30 Minuten lang bei 10 000 Upm zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die viskose obere Phase wurde in eine neue Flasche übertragen und erneut mit Phenol und Chloroform extrahiert. Die Einulsion wurde wieder zentrifugiert, dann wurde die obere Phase gegen vier Wechsel von DNA-Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde dann mit RNase bei einer Endkonzentration von 200 ug/ml 1 Stunde lang bei 37ºC verdaut. Die DNA wurde dann durch die Zugabe von 5 M NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M und 0,55 Volumen Isopropylalkohol gefällt. Die gefällte DNA wurde auf einem Glasstab aufgewickelt, luftgetrocknet, dann in DNA-Puffer gelöst und bei 4ºC gelagert.
2. Teilweiser Verdau von DNA: 60 ug X. badrii-DNA wurden in 600 ul Hind III-Restriktionsendonuklease-Verdaupuffer (10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Mercaptoethanol, 50 mM NaCl) verdünnt. Die Lösung wurde in eine 200 ul-Portion und vier 100 ul-Portionen aufgeteilt. Eine Einheit Hind III-Restriktionsendonuklease wurde zu der ersten, 200 ul-, Portion zugegeben, um 0,05 Einheiten von Hind III pro ug DNA zu erreichen. 100 ul wurden abgenommen und in das zweite Röhrchen gemischt, um 0,02 Einheiten/ug zu erreichen. Reihenübertragungen von 100 ul wurden bei den zurückbleibenden Röhrchen wiederholt, um 0,01 Einheiten/ug, 0,006 Einheiten/ug und 0,003 Einheiten/ug zu erreichen. Die Lösungen wurden 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, dann wurde der Verdau durch Erwärmen für 10 Minuten auf 72ºC beendet. Die fünf Lösungen wurden vereinigt.
3. Ligation und Transformation: 6 ug (60 ul) mit Hind III teilweise verdaute X. badrii-DNA wurden mit 3 ug (30 ul) Hind III-gespaltenem und dephosphoryliertem pUC19 (ATCC 37254) gemischt. 20 ul 10 X Ligationspuffer (500 mM Tris pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT, 5 mM ATP) und 90 ul steriles destilliertes Wasser wurden zugegeben, um das Volumen auf 200 ul zu bringen. 7,5 ul T4-DNA-Ligase wurden zugegeben und die Lösung wurde 4 Stunden lang bei 16ºC inkubiert. Die Lösung wurde durch Extraktion mit 20 ul Chloroform sterilisiert, dann durch eine 15 Sekunden lange Mikrozentrifugation aufgeklart. 62,5 ul der Ligationslösung wurden mit 500 ul SSC/CaCl&sub2; (50 mM NaCl, 5 mM Na&sub3;-Citrat, 67 mM CaCl&sub2;) gemischt und 1 ml von eiskalten kompetenten E. coli RR1 (ATCC 31343)-Zellen wurde zugegeben. Die Lösung wurde 5 Minuten lang bei 42ºC inkubiert, dann wurden 7 ml Luria-Nährmedium (L-Nährmedium) zugegeben und die Inkubation wurde 4 Stunden lang bei 30ºC fortgesetzt.
4. Zellbibliothek: Die transformierte Kultur wurde leicht zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in 1 ml L-Nährmedium resuspendiert. 200 ul-Portionen der resuspendierten Zellen wurden auf Luria-Agar (L-Agar)- Platten, welche 100 ug/ml Ampicillin enthielten, plattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 30ºC inkubiert. Die transformierten Zellen, welche auf den Oberflächen der Platten wuchsen, wurden durch Fluten von jeder der Platten mit 2,5 ml 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, Zusammenkratzen der Kolonien und Poolen der Suspension in ein einzelnes Röhrchen zusammengesammelt.
5. Plasmidbibliothek: 2,5 ml der Zellbibliothek wurden in 500 ml L-Nährmedium, welches 100 ug/ml Ampicillin enthielt, angeimpft. Die Kultur wurde über Nacht bei 30ºC geschüttelt und dann 5 Minuten lang bei 4 K Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 10 ml 25% Sucrose, 50 mM Tris pH 8,0 bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0 und 3 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris pH 8,0 wurden zugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde lang auf Eis gehalten, dann wurden 12 ml 1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 8,0, 67 mM EDTA zugegeben und die Suspension wurde leicht herumgewirbelt, um eine Lyse der Zellen zu induzieren.
Die lysierte Mischung wurde auf ein 50 ml-Röhrchen übertragen und 45 Minuten lang bei 17 K Upm und 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. 20,0 g festes CsCl wurden in ein 50 ml-Plastikröhrchen mit Schraubdeckel eingewogen und 22,0 g des Überstandes wurden in das Röhrchen pipettiert und gemischt. 1,0 ml 5 mg/ml Ethidiumbromid in 10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA wurde zugegeben. Die Lösung wurde auf zwei 5/8 Inch x 3 Inch-Zentrifugenröhrchen übertragen und 42 Stunden lang bei 44 K Upm und 17ºC in einem Beckinan Ti70-Rotor zentrifugiert. Um die Plasmide zu sammeln wurden die Röhrchen geöffnet, mit ultraviolettem Licht beleuchtet und die untere der zwei fluoreszierenden Banden wurde mit einer Spritze gesammelt. Die unteren Banden aus jedem Röhrchen wurden vereinigt und das Ethidiumbromid wurde durch viermaliges Extrahieren mit einem gleichen Volumen an wassergesättigtem eiskaltem N-Butanol entfernt.
Die extrahierte Lösung wurde gegen 4 Wechsel von DNA-Puffer dialysiert, dann wurde die Nukleinsäure durch die Zugabe von 2 Volumen Isopropanol und ausreichend 5 M NaCl, um eine Endkonzentration von 0,4 M zu erreichen, gefällt. Die Lösung wurde über Nacht bei -20ºC gelagert und dann 15 Minuten lang bei 15 K Upm und 0ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet wurde 15 Minuten lang luftgetrocknet, dann in 750 ul 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA gelöst und bei -20ºC gelagert. Es wurde gefunden, daß die Plasmid-DNA-Konzentration ungefähr bei 200 ug/ml liegt.
6. Verdau der Plasmidbibliothek: 10 ug (50 ul) der Plasmidbibliothek wurden in 450 ul Xba I-Restriktionsendonuklease-Verdaupuffer (6 mM Tris pH 8,0, 6 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl) verdünnt. 60 Einheiten (3 ul) Xba I-Restriktionsendonuklease wurden zugegeben und das Röhrchen wurde 2 Stunden und 45 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erwärmen für 12 Minuten auf 72ºC beendet. 0,15 Einheiten (3 ul) bakterielle alkalische Phosphatase wurden in die Lösung gemischt und 100 ul Paraffinöl wurden darüber geschichtet. Die Lösung wurde für weitere 2 Stunden bei 68ºC inkubiert, dann durch Extraktion mit 40 ul Chloroform sterilisiert.
7. Transformation: 12,5 ul (0,25 ug) der verdauten und dephosphorylierten Bibliothek wurden mit 100 ul SSC/CaCl&sub2; (Abschnitt 3) und 200 ul eiskalten kompetenten E. coli RR1 gemischt. Die Mischung wurde 2 Minuten lang auf 42ºC erwärmt, dann auf einer L-Agarplatte, welche 100 ug/ml Afnpicillin enthielt, plattiert. Die Platte wurde über Nacht bei 30ºC inkubiert. Xba I-Verdau und Dephosphorylierung verminderte die Anzahl an Transformanten ungefähr 10³-fach, verglichen mit der Transformation durch unverdaute Plasmide. 28 Kolonien wurden unter den Überlebenden gepickt; jede wurde in 10 ml L-Nährmedium, welches Ampicillin enthielt, angeimpft, um eine Minikultur herzustellen, und auf einer L-Agarplatte, welche Ampicillin enthielt, ausgestrichen, um eine Stammkultur (master stock) herzustellen.
8. Analyse von überlebenden Individuen: 28 der überlebenden Kolonien, welche in Abschnitt 7 beschrieben wurden, wurden in 10 ml-Kulturen kultiviert und die Plasmide, welche sie enthielten, wurden durch das folgende Miniprep-Reinigungsverfahren, welches von Birnboin und Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979), abgeleitet wurde, hergestellt.
Miniprep-Verfahren: Jede Kultur wurde 5 Minuten lang bei 8 K Upm zentrifugiert; die Überstände wurden verworfen und die Zellpellets wurden in 1,0 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, pH 8,0, welcher 1 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur wurden 2,0 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zu jedem Röhrchen zugegeben und die Röhrchen wurden geschüttelt, um die Zellen zu lysieren, und dann auf Eis gestellt. Wenn sich die Lösungen aufgeklart hatten, wurden 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, zu jedem zugegeben und geschüttelt. Die Niederschläge, die sich bildeten, wurden 10 Minuten lang bei 15 K Upm und 4ºC abzentrifugiert. Jeder Überstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen, welches 3 ml Isopropanol enthielt, gegossen und gemischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen 10 Minuten lang bei 15 K Upm abzentrifugiert, um die gefällten Nukleinsäuren zu pelletieren. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang luftgetrocknet. Wenn sie trocken waren, wurden die Pellets in 850 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. 75 ul 5 M NaCl wurden zu jedem zugegeben und die Lösungen wurden auf Eppendorf-Röhrchen übertragen, welche 575 ul Isopropanol enthielten, und wurden wieder 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gefällt. Die Röhrchen wurden dann 45 Sekunden lang in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden luftgetrocknet. Die Pellets wurden dann in 500 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, welche 100 ug/ml RNase enthielten, gelöst und I Stunde lang bei 37ºC inkubiert, um die RNA zu verdauen. Die DNA wurde erneut durch die Zugabe von 50 ul 5 M NaCl, gefolgt von 350 ul Isopropanol, gefällt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die DNA durch eine 45 Sekunden lange Zentrifugation abzentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden erneut in 150 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 gelöst. Die Plasmid- Minipreps wurden nachfolgend durch Verdau mit Hind III und Xba I analysiert.
9. Xba I-Methylasegenklone: Es wurde gefunden, daß elf der 28 analysierten Plasmide verschiedene Strukturen besaßen. Diese Plasmide waren falsch und sie wurden verworfen. Es wurde gefunden, daß die verbleibenden 17 Plasmide resistent gegenüber einem Xba I-Verdau waren und wenigstens zwei Hind III-Fragmente mit 1,3 Kb und 1,1 Kb enthielten. Es wurde gezeigt, daß diese Fragmente die Xba I-Methylase codieren. Die meisten der Plasmide enthielten zusätzlich zu den 1,3 Kb- und 1,1 Kb-Fragmenten andere Hind III-Fragmente. Die zusätzlichen Fragmente hatten 3 Kb, 0,35 Kb und 0,25 Kb in der Länge. Es wurde gezeigt, daß eins der Plasmide, welches alle fünf Fragmente enthielt, pEC145RM 102-4, die Xba I-Endonuklease wie auch die Xba I-Methylase codierte.
10. Xba I-Restriktionsendonukleaseklon: Es wurde gefunden, daß pEC145RM 102-4 die Xba I-Restriktionsendonuklease codiert und exprimiert, indem Extrakte von E. coli RR1, welche das Plasmid enthielten, getestet wurden.

Endonuklease-Test:

Eine 50 ml-Kultur von RRI, welche pEC145RM 102-4 enthielten, wurde über Nacht bei 30ºC in L-Nährmedium, welches 100 ug/ml Ampicillin enthielt, kultiviert. Die Kultur wurde 5 Minuten lang bei 4 K Upm zentrifugiert und das Zellpellet wurde in 3 ml Lysepuffer (20 mM KPO&sub4; pH 7,6, 10 mM Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA) resuspendiert. 0,5 ml 10 mg/ml Lysozym in demselben Puffer wurden zugegeben und die Suspension wurde 3 Stunden lang auf Eis gelassen. Die Suspension wurde über Nacht bei -20ºC eingefroren, dann l Stunde lang auf Eis aufgetaut. 2 ml der Suspension wurden kräftig mit 2 ml Lysepuffer, welcher 0,005% Triton X-100 enthielt, gemischt und 1 ml des resultierenden Lysates wurde 5 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde auf die folgende Weise auf eine Endonukleaseaktivität hin getestet:
17,5 ug (35 ul) unmethylierte, Hind III-verdaute, Lambdaphagen-DNA wurden in 350 ul Xba I-Restriktionsendonuklease- Verdaupuffer (Abschnitt 6) verdünnt. Die Lösung wurde auf 6 Röhrchen verteilt, 75 ul in das erste Röhrchen und 50 ul in jedes der verbleibenden 5 Röhrchen. 3,75 ul des Extraktes wurden zu dem ersten Röhrchen zugegeben, um 1 ul Extrakt pro ug DNA zu erreichen. 25 ul wurden dann aus dem ersten Röhrchen entfernt und auf das zweite Röhrchen übertragen, um 0,3 ul/ug zu erreichen. Reihenübertragungen von 50 ul wurden in die Röhrchen 3 (0,1 ul/ug), 4 (0,03 ul/ug) und 5 (0,01 ul/ug) fortgesetzt. Das sechste Röhrchen erhielt keinen Extrakt und diente als eine negative Kontrolle. Die Röhrchen wurden eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert, dann wurden 15 ul aus jedem durch eine Gelelektrophorese analysiert. Es wurde gefunden, daß der Extrakt ungefähr 10³ Einheiten an Xba I-Restriktionsendonuklease pro ml enthielt, was ca. 10&sup4; Einheiten pro Gramm an Zellen entspricht.
11. Ein zweites Plasmid unter den 14, die isoliert wurden, pEC145RM 102-18, wurde zerlegt, um zu bestimmen, welche der Fragmente, die es enthielt, für die Endonukleasesynthese wichtig waren, und welche nicht dazugehörig waren. pEC145RM 102-18 enthielt fünf Hind III-Fragmente mit 3,0, 1,3, 1,1, 0,35 und 0,25 Kb, und schien dasselbe zu sein wie pEC145RM 102-4.
10 ug CsCl-gereinigte (Abschnitt 5) pEC145RM 102-18-DNA wurden in 200 ul Hind III-Restriktionsendonuklease-Verdaupuffer (Abschnitt 2) verdünnt. 20 Einheiten Hind III-Restriktionsendonuklease wurden zugegeben und die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erwärmen für 10 Minuten auf 72ºC beendet. 16 ul (0,8 ug) des Verdaus wurden mit 2 ul 10 X Ligationspuffer (Abschnitt 3) gemischt und 2 ul T4-DNA-Ligase wurden zugegeben. Die Ligation wurde 4 Stunden lang bei 16ºC inkubiert, dann mit 3 ul Chloroform sterilisiert. 7 ul der ligierten DNA wurden mit 100 ul SSC/CaCl&sub2; (Abschnitt 3) gemischt und in 200 ul eiskalte kompetente E. coli RR1 transformiert. Die Mischung wurde auf L-Agarplatten, welche Ampicillin enthielten, plattiert und bei 30ºC inkubiert. Kolonien wurden gepickt und die Plasmide, die sie enthielten, wurden durch das Miniprep-Verfahren (Abschnitt 8) hergestellt und analysiert.
Es wurde gefunden, daß das 3,0 Kb-Fragment nicht dazugehörig war, es wurde aber gefunden, daß die anderen vier Fragmente für die Methylase- und Endonukleasesynthese notwendig waren (Figur 2). Ein Plasmid, welches nur die vier kleineren Fragmente enthielt, pEC145RM 102-18/39, wurde auf Xba I-Endonukleaseaktivität hin getestet. Es wurde gefunden, daß Extrakte von E. coli RR1, welche dieses Plasmid enthielten, 1 x 10&sup5; Einheiten Xba I-Endonuklease pro ml enthielten, was 1 x 10&sup6; Einheiten pro g an Zellen entspricht.
E. coli RR1, welcher pEC145RM 102-18/39 enthält, ist der bevorzugte Stamm, aus welchem die Xba I-Restriktionsendonuklease gereinigt werden kann. Der Stamm sollte bis zur stationären Phase bei 30ºC in einem Fermenter, in L-Nährmedium, welches Ampicillin enthält, kultiviert werden. Die Zellen sollten dann durch Zentrifugation gesammelt werden und entweder sofort für die Herstellung des Extraktes aufgebrochen werden oder eingefroren bei -70ºC gelagert werden, bis es passend ist, dieses zu tun.

Claims

1. Isoliertes DNA-Segment, welches für die Xba I Restriktionsendonuklease codiert, wobei das isolierte DNA-Segment erhältlich ist aus Xanthamonas badrii ATCC Nr. 11672.

2. Ein rekombinanter DNA-Vektor, welcher einen Vektor umf aßt, in den ein DNA-Segment eingeführt wurde, welches für die Xba I Endonuklease, hergestellt durch Xanthamonas badrii ATCC Nr. 11672.

3. Isoliertes DNA-Segment, welches für die Xba I Restriktionsendonuklease und Methylase codiert, wobei das isolierte DNA-Segment erhältlich ist aus Xanthamonas badrii ATCC Nr. 11672.

4. Ein Klonierungsvektor, welcher das isolierte DNA-Segment gemäß Anspruch 1 umfaßt.

5. Ein Klonierungsvektor, welcher das isolierte DNA-Segment gemäß Anspruch 3 umfaßt.

6. Eine Wirtszelle, welche durch den Vektor gemäß Anspruch 4 oder 5 transformiert wurde.

7. Ein Verfahren zum Klonieren von DNA, welche für eine Xba I Restriktionsendonuklease codiert, welches umfaßt:

a) Reinigen von DNA aus Xanthamonas badrii ATCC Nr. 11672;

b) teilweise Verdauen der gereinigten DNA mit Hind III, um DNA-Fragmente zu bilden;

c) Ligieren der DNA-Fragmente in einen Klonierungsvektor;

d) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Klonierungsvektor aus Schritt (c), um eine Zellbibliothek zu bilden, und Züchten der transformierten Zellen bei 30ºC;

e) Reinigen der rekombinanten Vektoren aus der Zellbibliothek, um eine Plasmidbibliothek zu bilden;

f) In-Kontakt-Bringen der Plasmidbibliothek aus Schritt (e) mit Xba I, um einen Verdauungspool zu bilden, Übertragen des Verdauungspools in eine Wirtszelle und Testen auf das Vorliegen eines oder mehrerer Klonierungsvektoren, welche DNA enthalten, die für eine Xba I Methylase codiert;

g) Testen des Klonierungsvektors aus Schritt (f), welcher DNA enthält, welche für Xba I Methylase codiert, auf das Vorliegen von DNA, welche für eine Xba I Restriktionsendonuklease codiert; und

h) Isolieren des Klonierungsvektors aus Schritt (g), welcher DNA enthält, die für Xba I Restriktionsendonuklease codiert.

8. Ein Verfahren zum Herstellen von Xba I Restriktionsendonuklease, welches das Kulivieren einer Wirtszelle, die mit dem Vektor gemäß den Ansprüchen 4, 5 oder 6 transformiert wurde, unter den Expressionsbedingungen für die Endonuklease bei 30ºC umfaßt.

9. Ein Verfahren zum Herstellen von Xba I Restriktionsendonuklease, welches umfaßt:

a) Reinigen von DNA aus Xanthamonas badrii ATCC Nr. 11672;

b) teilweises Verdauen der gereinigten DNA mit Hind III, um DNA-Fragmente zu bilden;

c) Ligieren der DNA-Fragmente in einen Klonierungsvektor;

e) Reinigen rekombinanter Vektoren aus der Zellbibliothek, um eine Plasmidbibliothek zu bilden;

f) In-Kontakt-Bringen der Plasmidbibliothek aus Schritt (e) mit Xba I, um einen Verdauungspool zu bilden, Übertragen des Verdauungspools in eine Wirtszelle und Testen auf das Vorliegen von einem oder mehreren Klonierungsvektoren, welche DNA enthalten, die für eine Xba I Methylase codiert;

g) Testen des Klonierungsvektors aus Schritt (f), welcher DNA enthält, die für Xba I Methylase codiert, auf das Vorliegen von DNA, welche für eine Xba I Restriktionsendonuklease codiert.

h) Isolieren des Klonierungsvektors aus Schritt (g), welcher DNA enthält, die für Xba I Restriktionsendonuklease codiert; und

i) Kultivieren einer Wirtszelle, welche mit dem Klonierungsvektor aus Schritt (h) transformiert wurde, unter Expressionsbedingungen für die Xba I Restriktionsendonuklease.