DE3853143T2

DE3853143T2 - Verfahren zur Herstellung von AccI-Restriktionsendonuklease und -methylase.

Info

Publication number: DE3853143T2
Application number: DE3853143T
Authority: DE
Inventors: Shu-Zi Chen; Geoffrey Wilson
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1987-12-17
Filing date: 1988-12-16
Publication date: 1995-08-03
Anticipated expiration: 2008-12-17
Also published as: EP0321267B1; EP0321267A3; JPH022366A; US5004691A; EP0321267A2; DE3853143D1; ATE118816T1; JP2703786B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Klone für die Acc I-Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase und die Herstellung dieser Enzyme aus den Klonen.
Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen, welche in Bakterien natürlich vorkommen. Wenn sie von anderen kontaminierenden bakteriellen Komponenten weggereinigt werden, können Restriktionsendonukleasen im Laboratorium verwendet werden, um DNA-Moleküle in genaue Fragmente zu brechen. Diese Eigenschaft führt dazu, daß DNA-Moleküle eindeutig identifiziert und in ihre aufbauenden Gene fraktioniert werden können. Es hat sich erwiesen, daß Restriktionsendonukleasen unverzichtbare Werkzeuge in der modernen genetischen Forschung sind. Sie sind die biochemischen "Scheren", mittels welcher Gentechnik und Genanalyse durchgeführt wird.
Restriktionsendonukleasen wirken durch Erkennen und Binden von besonderen Nukleotidsequenzen (die "Erkennungssequenz") entlang des DNA-Moleküls. Einmal gebunden, spalten sie das Molekül innerhalb oder auf einer Seite der Sequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonukleasen weisen eine Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen auf. Über hundert unterschiedliche Restriktionsendonukleasen sind unter mehreren Hunderten an bakteriellen Spezies identifiziert worden, welche bis heute untersucht wurden.
Bakterien tendieren dazu, meistens nur eine kleine Anzahl an Restriktionsendonukleasen pro Spezies zu haben. Die Endonukleasen werden typischerweise nach den Bakterien, aus welchen sie abgeleitet sind, benannt. Demzufolge synthetisiert beispielsweise die Spezies Haemophilus aegyptius drei unterschiedliche Restriktionsendonukleasen, Hae I, Hae II und Hae III genannt. Diese Enzyme erkennen und spalten die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGPy bzw. GGCC. Escherichia coli RY13 andererseits synthetisiert lediglich ein Enzym EcoR I, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
Unter der Voraussetzung, nicht an die Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß Restriktionsendonukleasen in der Natur eine Schutzrolle im Wohlergehen der bakteriellen Zelle spielen. Sie befähigen Bakterien, Infektionen durch fremde DNA-Moleküle, wie Viren und Plasmide, zu widerstehen, welche sie ansonsten zerstören oder parasitieren würden. Sie verleihen Widerstandsfähigkeit durch Abtasten der Längen des infizierenden DNA-Moleküls und spalten sie jedesmal, wenn die Erkennungssequenz auftritt. Das Aufbrechen, was auftritt, macht viele der infizierenden Gene unbrauchbar, und macht die DNA empfindlich auf weiteren Abbau durch Exonukleasen.
Eine zweite Komponente des bakteriellen Schutzsystems sind die Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu den Restriktionsendonukleasen und sie stellen die Mittel zur Verfügung, durch welche die Bakterien in der Lage sind, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden an dieselbe Nukleotiderkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuklease, jedoch anstelle des Aufbrechens der DNA modifizieren sie das eine oder andere Nukleotid innerhalb der Sequenz durch Addition einer Methylgruppe. Nach dieser Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht länger durch die Restriktionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA einer bakteriellen Zelle ist immer vollständig modifiziert aufgrund der Aktivität ihrer Modifikationsmethylase und sie ist demzufolge vollständig unempfindlich auf das Vorliegen der endogenen Restriktionsendonuklease. Es ist lediglich nicht modifizierte und daher identifizierbar fremde DNA, welche empfindlich ist auf Restriktionsendonukleaseerkennung und -angriff.
Mit dem Aufkommen der Genmanipulationstechnik ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, für welche sie kodieren, in größeren Mengen herzustellen, als sie durch konventionelle Reinigungstechniken erhältlich sind. Der Schlüssel zum Isolieren von Klonen von Restriktionsendonukleasegenen ist es, ein einfaches und zuverlässiges Verfahren zu entwickeln, um solche Klone innerhalb komplexer "Bibliotheken", d.h. Klonpopulationen, abgeleitet durch "Schrotschuß"-Verfahren zu identifizieren, wenn sie mit so niedrigen Häufigkeiten wie 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;³ auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so daß die unerwünschte Mehrheit an Klonen zerstört wird, während die seltenen erwünschten Klone überleben.
Restriktions-Modifikationssysteme vom Typ II werden mit wachsender Häufigkeit kloniert. Die ersten klonierten Systeme verwendeten Bakteriophageninfektion als ein Mittel zur Identifizierung oder Selektierung von Restriktionsendonukleaseklonen (EcoR II: Kosykh et al., Molec. gen. Genet 178: 717-719 (1980); Hha II: Mann et al., Gene 3: 97-112 (1978); Pst I: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78 1503-1507 (1981)). Da das Vorliegen von Restriktions-Modifikations-Systemen in Bakterien diese befähigt, einer Infektion durch Bakteriophagen zu widerstehen, können Zellen, welche klonierte Restriktions-Modifikations-Gene tragen, im Prinzip selektiv als Überlebende aus Bibliotheken isoliert werden, welche dem Phagen ausgesetzt wurden. Es wurde jedoch herausgefunden, daß dieses Verfahren lediglich einen begrenzten Wert hat. Es wurde genauer herausgefunden, daß die klonierten Restriktions-Modifikations-Gene nicht immer hinreichende Phagenresistenz manifestieren, um selektives Überleben zu verleihen.
Ein anderer Klonierungsansatz involviert das Übertragen von Systemen, welche anfänglich charakterisiert wurden als Plasmid-getragene in E.coli klonierende Plasmide (EcoR V: Bougueleret et al., Nucleic Acids Res. 12: 3659-3676, 1984; PaeR7: Gingeras and Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402-406, 1983; Theriault and Roy, Gene 19: 355-359, 1982; Pvu II: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509, 1985).
Ein dritter Ansatz und ein solcher, welcher zum Klonieren einer wachsenden Anzahl von Systemen verwendet wird, involviert das Selektieren auf ein aktives Methylasegen, unter Bezugnahme auf unsere Patentanmeldung Nr. 707079 (BsuR I: Kiss et al., Nucleic Acids Res. 13: 6403-6421, 1985). Da Restriktions- und Modifikationsgene dazu tendieren, eng verknüpft zu sein, können Klone, welche beide Gene enthalten, häufig isoliert werden durch Selektieren auflediglich das eine Gen. Selektion für Methylierungsaktivität ergibt nicht immer ein vollständiges Restriktions-Modifikations- System, sondern es ergibt statt dessen manchmal nur das Methylasegen (BspR I: Szomolanyi et al., Gene 10: 219-225 (1980); Bcn I: Janulaitis et al., Gene 20: 197-204 (1982); BsuR I: Kiss and Baldauf, Gene 21: 111-119 ((1983); und Msp I: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235-1241 (1983)).
Ein mögliches Hindernis zum Klonieren von Restriktions-Modifikations-Genen liegt darin, das Endonukleasegen in einen Wirt einzuführen, der noch nicht durch Modifikation geschützt ist. Wenn das Methylasegen und Endonukleasegen zusammen auf einem einzelnen DNA-Segment eingeführt werden, muß die Methylase die Wirts-DNA schützend modifizieren, bevor die Endonuklease die Gelegenheit hat, sie zu spalten. Ein anderes Hindernis beim Klonieren von Restriktions-Modifikations-Systemen in E.coli wurde entdeckt in dem Verfahren zum Klonieren von unterschiedlichen Methylasen. Viele E.coli-Stämme haben Systeme, welche der Einführung von DNA, welche methyliertes Cytosin enthält, widerstehen (Raleigh and Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9070-9074, 1986). Demzufolge ist es notwendig, sorgfältig zu überlegen, welchen E.coli-Stamm (-Stämme) man zur Klonierung verwendet, und jene vermeidet, welche sich einer Modifikation widersetzen.
Weil gereinigte Restriktionsendonukleasen und zu einem geringeren Ausmaß Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zum Charakterisieren und Umordnen von DNA im Laboratorium sind, besteht ein kommerzieller Anreiz daran, Bakterienstämme durch rekombinante DNA-Techniken zu erhalten, welche diese Enzyme in großer Menge synthetisieren. Solche. Stämme wären nützlich, weil sie die Aufgaben der Reinigung sowie das Zur-Verfügung-Stellen der Mittel für die Herstellung in kommerziell nützlichen Mengen erleichtern würden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wird ein Klon zur Verfügung gestellt, welcher die Gene für die Acc I-Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase, abgeleitet aus Acinetobacter calcoaceticus, enthält, sowie auch verwandte Verfahren-für die Herstellung der Enzyme. Genauer betrifft die Erfindung Klone, welche die Restriktionsendonuklease Acc I exprimieren, welche die DNA-Sequenz 5'...GT(AC)(GT)AC...3' erkennt und nach dem ersten T spaltet.
Das bevorzugte Verfahren zum Klonieren dieses Enzyms umfaßt das Bilden einer Bibliothek, welche die DNA aus Acinetobacter calcoaceticus enthält, Isolieren dieser Klone, welche die DNA enthält, die für die Acc I-Modifikationsmethylase kodiert und Screenen dieser, um jene zu identifizieren, welche ebenfalls das Acc I-Restriktionsendonukleasegen enthält.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 veranschaulicht das Schema zum Klonieren und Herstellen der Acc I-Restriktionsendonuklease.
Fig. 2 ist eine Restriktionskarte eines 11 Kb EcoR I-Multifragmentes aus A. calcoaceticus-DNA, welche für die Acc I- Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase kodiert, welche in die EcoR I-Stelle des pBR322 (ATCC 37017) ligiert wurde, um pSC161RM 1-8 zu erzeugen.
Fig. 3 ist eine Restriktionskarte eines 4 Kb Cla I-Fragments, welches für die Acc I-Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase kodiert, welches aus pSC161RM 1-8 herausgeschnitten wurde und in die Acc I-Stelle von pUC19 (ATCC 37254) ligiert wurde, um pSC161RM 121-2 zu erzeugen.
Fig. 4 veranschaulicht das Verfahren, welches verwendet wird, um die Acc I-Endonuklease-überproduzierenden Plasmide pSC161RM O/P9 und pSC161RM O/P17 durch Inserieren eines BamH I-Expressions-Regulationsfragmentes aus dem Plasmid pGW10 (ATCC 40167) in pSC161RM 121-2 zu konstruieren.
Fig. 5 ist eine Fotografie eines Agarosegels, welches die Acc I-Restriktionsendonukleaseaktivität in einem Zellrohextrakt aus Temperatur-induziertem E.coli MM294 (ATCC 33625), welches pSC161RM O/P17 trägt, veranschaulicht.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Klone der Acc I-Restriktions- und Modifikationsgene, wie auch die Restriktionsendonuklease Acc I, hergestellt aus solchen Klonen. Die Acc I-Gene werden vorzugsweise durch ein Verfahren kloniert, welches die Tatsache ausnutzt, daß gewisse Klone, welche selektiert wurden auf der Basis, daß sie das Acc I-Modifikationsmethylasegen enthalten und exprimieren, auch das Acc I-Restriktionsgen enthalten. Die DNA solcher Klone ist gegen in-vitro-Verdau durch die Acc I-Restriktionsendonuklease widerstandsfähig. Diese Widerstandsfähigkeit gegen Verdau bietet ein Mittel für selektives Isolieren von Klonen, welche für die Acc I-Methylase und Restriktionsendonuklease kodieren.
Die hierin beschriebenen Verfahren, durch welche das Acc I- Restriktionsgen und Methylasegen vorzugsweise kloniert und exprimiert werden, sind in Fig. 1 veranschaulicht und schließen die folgenden Schritte ein:
1. Die DNA von Acinetobacter calcoaceticus wird gereinigt. Proben dieses Organismus sind erhältlich von der American Type Culture Collection, Nr. ATCC 53701.
2. Die DNA wird teilweise durch eine Restriktionsendonuklease, wie beispielsweise EcoR I verdaut.
3. Die verdaute DNA wird an einen Klonierungsvektor, wie beispielsweise pBR322 (ATCC 37017) ligiert, welcher eine oder mehrere Acc I-Stellen enthält. Die ligierte Mischung wird in eine geeignete Wirtszelle, wie beispielsweise E.coli RR1 (ATCC 31343) übertragen.
4. Die transformierte Mischung wird auf ein antibiotisches Medium, welches für transformierte Zellen selektiv ist, wie beispielsweise Ampicillin plattiert. Nach Inkubation werden die transformierten Zellkolonien zusammen in einer einzigen Kultur, der Zellbibliothek, gesammelt.
5. Die rekombinanten Plasmide werden in toto aus der Zellbibliothek gereinigt, um eine Plasmidbibliothek herzustellen.
6. Die Plasmidbibliothek wird dann zur Vollständigkeit in vitro mit Acc I-Restriktionsendonuklease (erhältlich von New England Biolabs, Inc., Katalog # 161) verdaut. Acc I- Restriktionsendonuklease-Verdau führt zur unterschiedlichen Spaltung nicht-modifizierter nicht Methylase enthaltender Klone, wobei die Häufigkeit der Acc I-Methylase tragenden Klone unter den überlebenden intakten Plasmiden erhöht wird. Nach dem Verdau wird die Bibliothek mit Phosphatase behandelt, um die Möglichkeit verdauter Moleküle zu transformieren weiter zu vermindern.
7. Die verdaute Plasmidbibliothek wird zurück in einen Wirt, beispielsweise E.coli-Stamm RR1 transformiert und es werden wieder transformierte Kolonien erhalten durch Platttieren auf antibiotische Platten. Die Kolonien werden aufgenommen (picked) und einzeln auf das Vorliegen des Acc I- Modifikationsgenes in der folgenden Art analysiert: Die Plasmid-DNA, welche sie tragen, wird gereinigt und in vitro mit Acc I-Restriktionsendonuklease inkubiert, um zu bestimmen, ob sie widerstandsfähig gegenüber Acc I-Verdau ist oder nicht. Die gesamte zelluläre DNA (chromosomal und Plasmid) aus den Klonen wird ebenfalls gereinigt und mit Acc I-Restriktionsendonuklease inkubiert. Die DNA von Klonen, welche das Acc I-Methylasegen tragen, sollte vollständig methyliert sein und sowohl die Plasmid-DNA als auch die Gesamt-DNA sollte als im wesentlichen oder vollständig widerstandsfähig gegenüber Verdau gefunden werden.
8. Klone, welche die Acc I-Restriktionsendonuklease tragen, werden identifiziert durch Herstellen von Rohextrakten aus den Klonen, welche in Schritt 7 als Acc I-Methylasegentragend identifiziert wurden, und der Rohextrakt auf Acc I- Restriktionsendonukleaseaktivität untersucht. Die Erfassung von Acc I-Restriktionsendonukleaseaktivität in Zellrohextrakten wird verstärkt, wenn die Extrakte hergestellt werden aus einem endo-A&supmin;-E.coli-Stamm, wie beispielsweise MM294 (ATCC 33625), in welchen die Plasmide durch Transformation übertragen wurden.
9. Die Menge an Acc I-Restriktionsendonuklease, welche durch die Klone hergestellt wird, kann erhöht werden durch Anheben der Gendosis durch die Verwendung von Vektoren mit einer großen Kopienzahl und durch Erhöhen der Transkriptionsgeschwindigkeit durch die Verwendung von hochaktiven exogenen Promotoren.
10. Die Acc I-Restriktionsendonuklease kann hergestellt werden aus Klonen, welche die Acc I-Restriktions- und Modifikations-Gene tragen durch Vermehrung in einem Fermenter in einem reichlichen Medium, welches Ampicillin enthält. Die Zellen werden anschließend durch Zentrifugation geerntet und durch Beschallung aufgebrochen, um einen Zellrohextrakt herzustellen, welcher die Acc I-Restriktionsendonukleaseaktivität enthält.
11. Der Zellrohextrakt, welcher die Acc I-Restriktionsendonukleaseaktivität enthält, wird gereinigt durch Standardproteinreinigungstechniken, wie beispielsweise Affinitätschromatographie und Ionenaustauschchromatographie.
Obwohl die oben skizzierten Schritte den bevorzugten Modus für das Durchführen der vorliegenden Erfindung darstellen, wird es dem Durchschnittsfachmann klar sein, daß der aben beschriebene Ansatz gemäß im Stand der Technik bekannten Techniken geändert werden kann.
Das folgende Beispiel ist angegeben, um Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen, wie es derzeit bevorzugt ist sie auszuführen. Es wird verstanden werden, daß dieses Beispiel veranschaulichend ist und daß die Erfindung nicht gedacht ist, darauf beschränkt zu werden, mit Ausnahme wie in den anhängenden Ansprüchen angezeigt.

BEISPIEL

Klonieren des Acc I-Restriktionsendonukleasegens

1. DNA-Reinigung: 8 g Acinetobacter calcoaceticus (ATCC 53701)-Zellpaste wurde in 32 ml 25% Rohrzucker, 50 mM Tris pH 8,0 resuspendiert. 16 ml an 0,25 M EDTA, pH 8,0 und 10 ml an 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris, pH 8,0 wurden hinzugefügt und die Mischung wurde auf Eis für 2 Stunden stehengelassen. 40 ml 1% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,0, 62 mM EDTA und 1 ml an 100% SDS wurden hinzugefügt und die Lösung wurde gemischt, um Lyse zu erzielen. Die Suspension wurde zweimal mit 90 ml an frisch äquilibriertem (0,5 M Tris, pH 8,0) Phenol und 90 ml an Chloroform extrahiert, dann bei 10 K upm für 30 Minuten zentrifugiert. Die viskose obere Schicht wurde in Dialyseschlauch überführt und gegen vier Wechsel an DNA-Puffer dialysiert (10 mM Tris, pH 7,5, 1mM EDTA). Die dialysierte Lösung wurde in ein 400 ml-Becherglas überführt und ihr Volumen wurde bestimmt (150 ml). 1,5 ml an 10 mg/ml RNase wurde hinzugegeben, um 100 ug/ml RNase zu erhalten und die Lösung wurde bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. 13 ml an 5 M NaCl wurde in die Lösung gemischt, 92 ml Isopropanol wurden darauf geschichtet und die Lösung wurde mit einem Glasstab eingerührt. Die bakterielle DNA, welche um den Glasstab, wenn sie präzipitierte, aufgewikkelt war und entfernt wurde, wurde luftgetrocknet und in 6 ml an DNA-Puffer aufgelöst.
2, Teilverdau: 800 ul 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Mercaptoethanol, 100 mM NaCl, enthaltend 80 ug an gereinigter DNA, wurde hergestellt und 100 ul Aliquote wurden in 8 separate Röhrchen gegeben. 10 Einheiten an EcoR I-Restriktionsendonuklease wurden zu dem ersten Röhrchen hinzugefügt, um 1,0 Einheiten/ug zu erhalten. 5 Einheiten an EcoR I wurden zu dem zweiten Röhrchen zugegeben (0,5 Einheiten/ug) usw., jedes nachfolgende Röhrchen erhielt die Hälfte der vorherigen Menge an EcoR I. Die Röhrchen wurden bei 37ºC für eine Stunde inkubiert, dann wärmegetrocknet bei 72ºC für 15 Minuten und 10 ul von jedem wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Röhrchen, welche moderaten, jedoch unvollständigen Verdau aufwiesen, wurden ausgewählt als die Quelle der Teilverdaufragmente zum Klonieren. (Dies waren die 0,5 u/ug, 0,25 u/ug und 0,125 u/ug Röhrchen. Die drei Lösungen wurden zusammengemischt und wie unten beschrieben verwendet).
3. Ligation: 4 ug (40 ul) EcoR I teilweise verdaute A. calcoaceticus-DNA wurde gemischt mit 2,0 ug (20 ul) EcoR I- gespaltenem und dephosphoryliertem pBR322 (ATCC 37017). 20 ul an 5X-Ligationsmischung (250 mM Tris, pH 7,5, 50 mM MgCl&sub2;, 50 mM DTT, 5 mM ATP) wurden hinzugefügt plus 16 ul an sterilem destilliertem Wasser, um das Endvolumen auf 100 ul zu bringen. 4 ul T4-DNA-Ligase wurden hinzugegeben und die Mischung wurde bei 16ºC für 4 Stunden inkubiert. Die ligierte DNA wurde verwendet, um E.coli-Stamm RR1, (ATCC 31343) wie folgt zu transformieren: 50 ul der ligierten DNA wurden mit 450 ul SSC/CaCl&sub2; gemischt (50 mM NaCl, 5 mM Na&sub3;- Citrat, 67 mM CaCl&sub2;) auf Eis und 1200 ul an eisgekühlten kompetenten E.coli RR1-Zellen (hsdR&supmin;M&supmin;, McrB&supmin;) wurden hinzugefügt. Nach einem dreiminütigen Wärmeschock bei 43ºC wurden die Zellen in 10 ml Luria-Broth (L-Broth) verdünnt und zur Sättigung bei 37ºC gezüchtet
4. Zellbibliothek: Die transformierte Zellkultur wurde zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in 1 ml Luria-Broth resuspendiert. 200 ul-Portionen wurden auf Luria-Agar (L-Agar) plattiert, enthaltend 100 u g/ml Ampicillin. Nach Über-Nacht-Inkubation bei 37ºC wurden die Platten einzeln mit 2,5 ml 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; geflutet und die transformierten Kolonien wurden zusammengeschabt und gepoolt, um die Zellbibliothek zu bilden.
5. Plasmid-Bibliothek: 2,5 ml der Zellbibliothek wurde mit 500 ml L-Broth, welches 100 ug/ml Ampicillin enthält, inokuliert. Die Kultur wurde über Nacht bei 37ºC gerüttelt und dann bei 4 K upm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 10 ml 25% Rohrzucker, 50 mM Tris, pH 8,0, bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0, wurden hinzugefügt, gefolgt von 3 ml an 10 ug/ml Lysozym in 0,25 M Tris, pH 8,0. Die Lösung wurde auf Eis für eine Stunde stehengelassen, dann wurden 12 ml lytische Mischung (1% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,0, 67 mM EDTA) kräftig einpipettiert und die Zellsuspension sanft verwirbelt, um eine Lyse zu erhalten. Nach der Lyse wurde die Mischung in ein 50 ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen übertragen und bei 15 K upm, 4ºC für 45 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. 20,0 g festes CsCl wurde in ein 50 ml-Kunststoffschraubverschlußröhrchen eingewogen und 22 g Überstand wurden in das Röhrchen pipettiert und vermischt. 1,0 ml 5 mg/ml Ethidiumbromid in 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl wurden zu der Mischung hinzugefügt. Die Lösung wurde übertragen auf zwei 5/8 in. x 3 in. Polyallomer-Zentrifugenröhrchen und verschlossen. Diese wurden dann in dem Ti70-Rotor für 42 Stunden bei 44 K upm, 17ºC zentrifugiert. Um die Plasmide zu sammeln, wurden die oberen Enden der Röhrchen mit einem Skalpell durchstochen und die untere der zwei fluoreszierenden DNA-Banden wurde mittels einer Spritze und ultraviolettem Licht gesammelt. Die untere Bande aus beiden Röhrchen wurde in ein Schraubdeckelglasröhrchen (screw-top glass tube) zusammengegeben und das Ethidiumbromid wurde entfernt durch viermaliges Extrahieren mit einem gleichen Volumen an eisgetränktem N-Butanol.
Die extrahierte Lösung wurde in Dialyseschlauch überführt und für 24 Stunden gegen vier Wechsel an DNA-Puffer dialysiert. Die dialysierte DNA-Lösung wurde in ein 15 ml-Kunststoffschraubverschlußröhrchen überführt. Die Plasmid-DNA- Konzentration betrug ungefähr 100 ug/ml.
6. Verdau der Plasmidbibliothek: 5 ug Plasmid-DNA wurden in 200 ul 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Mercaptoethanol, 50 mM NaCl mit 20 Einheiten an Acc I- Restriktionsendonuklease verdaut. Das Röhrchen wurde bei 37ºC für eine Stunde inkubiert und der Verdau dann durch Erwärmen auf 72ºC für 10 Minuten beendet. Die Lösung wurde einmal mit gleichen Volumina an Phenol und Chloroform extrahiert, dann wurde die DNA durch die Zugabe von 400 ul Isopropanol präzipitiert. Die präzipitierte DNA wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 20 ul DNA-Puffer (pH 9,0) resuspendiert, um 250 ug/ml DNA zu erhalten. 0,4 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Bakterien wurde zugegeben und das Röhrchen bei 68ºC für zwei Stunden inkubiert. 80 ul DNA-Puffer und 80 ul Chloroform wurden hinzugefügt; die Mischung wurde durch heftiges Mischen emulgiert und dann durch Zentrifugation geklärt. Die dephosphorylierte DNA wurde wieder mit Isopropanol gefällt und wiederum mit 12 Einheiten Acc I in einem 100 ul-Reaktionsvolumen verdaut.
7. Transformation: 12,5 ul der Acc I verdauten und phosphatasebehandelten Plasmidbibliothek wurde in E.coli RR1 transformiert. Die Zell/DNA-Mischung wurde auf L-Agar-Platten plattiert, welche 100 ug/ml Ampicillin enthielten und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Es wurden etwa 60 überlebende Kolonien auf den Platten gefunden. 28 davon wurden jede in 10 ml L-Broth, enthaltend Ampicillin, inokuliert, um Minikulturen herzustellen und ausgestrichen auf L-Agar- Platten, enthaltend Ampicillin, um Stammkulturen (master stocks) herzustellen.
8. Analyse der überlebenden Individuen: 28 überlebende Kolonien wurden in 10 ml Kulturen gezüchtet und die Plasmide, welche sie trugen, wurden durch das folgende Miniprep- Reinigungsverfahren hergestellt, angepaßt aus dem Verfahren von Birnboin und Doly, Nucleic Acids Res. 7:1513 (1979).

Miniprep-Verfahren:

Jede Kultur wurde wie folgt verarbeitet: Die 10 ml Über-Nacht-Kultur wurde bei 8 K upm für 5 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde weggegossen und das Zellpellet wurde in 1,0 ml 25 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, enthaltend 1 mg/ml Lysozym resuspendiert. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden 2,0 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS hinzugegeben und das Röhrchen geschüttelt, um die Zellen zu lysieren und dann auf Eis gestellt. Nachdem die Lösung sich geklärt hatte, wurden 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, hinzugefügt und geschüttelt. Das Präzipitat, welches sich gebildet hat, wurde bei 15 K upm bei 4ºC für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegossen, welches 3 ml Isopropanol enthält, und gemischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Röhrchen bei 15 K upm für 10 Minuten zentrifugiert, um die präzipitierten Nukleinsäuren zu pelletieren. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten luftgetrocknet. Nachdem das Pellet getrocknet war, wurde es in 500 ul DNA-Puffer, resuspendiert und in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Die Lösung wurde einmal mit Phenol und Chloroform extrahiert, dann wiederum mit Isopropanol präzipitiert. Das Röhrchen wurde für 2 Minuten in einer Mikrozentrifuge (microfuge) zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde luftgetrocknet. Das Pellet wurde dann in 100 ul DNA- Puffer, enthaltend 100 ug/ml RNase aufgelöst und eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Plasmidminipreps bei -20ºC gelagert, dann durch Verdau mit Acc I und EcoR I analysiert.
9. Methylasegen-Klone: Etwa von der Hälfte der Plasmide, welche analysiert wurden, wurde gefunden, daß sie zufällige EcoR I-Fragmente aus A. calcoaceticus DNA tragen, und empfindlich sind auf Verdau durch Acc I. Diese Plasmide waren unechte Überlebende und worden verworfen. Von den verbleibenden Plasmiden wurde gefunden, daß sie widerstandsfähig gegenüber Acc I sind, und bis zu fünf EcoR I-Fragmente von ungefähr 3,8, 2,5 2,4, 1,8 und 1,2 Kb an Länge (Fig. 2) tragen. Einer der Plasmide, welcher alle fünf Fragmente trug, pSC161RM 1-8, wurde weiter analysiert und es wurde gefunden, daß er sowohl das Acc I-Modifikationsmethylaseals auch das Restriktionsendonukleasegen trägt.
10. Restriktionsgen-Klone: Von pSC161RM 1-8 wurde herausgefunden, daß es das Acc I-Restriktionsendonukleasegen trägt, durch Untersuchen eines Extraktes, hergestellt aus E.coli-Stamm MM294 (ATCC 33625), in welchen das Plasmid durch Transformation übertragen wurde.

Endonukleasetest:

Um auf Endonukleaseaktivität zu testen, wurden zwei Lösungen hergestellt: (1) 10X Restriktionsendonukleasepuffer: 100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM Mercaptoethanol, 500 mM NaCl; und (2) Verdauungsreaktionsmischung: 100 ul Lambda-DNA (500 ug/ml), 100 ul 10X- Restriktionsendonuklease-Puffer, 800 ul destilliertes Wasser, um 50 ug/ml zu erhalten.
Zellextrakte wurden wie folgt hergestellt: Eine 50 ml-Kultur des Klons wurde über Nacht in L-Broth plus 100 ug/ml Ampicillin gezüchtet und die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4 K upm für 5 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 3 ml Beschallungspuffer (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA) resuspendiert. Nachdem es resuspendiert war, wurden 0,3 ml Beschallungspuffer, enthaltend 10 mg/ml Lysozym hinzugegeben. Die Suspension wurde verwirbelt und eine Stunde auf Eis stehengelassen. Eine 1 ml-Probe wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und sanft durch drei 10-Sekundenstöße beschallt, um die Zellen auf zubrechen. Das Röhrchen wurde für 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und der Überstand wurde als der Zellextrakt verwendet.
Um den Extrakt zu untersuchen, wurde die Verdauungsreaktionsmischung in fünf Röhrchen gegeben, 150 ul in das erste Röhrchen und 102,5 ul in jedes der verbleibenden vier Röhrchen. 7,5 ul des Extraktes wurden zu dem ersten Röhrchen hinzugegeben und gemischt. 47,5 ul wurden aus dem ersten Röhrchen entfernt und in das zweite Röhrchen überführt, gemischt und wiederum überführt, usw. Das erste Röhrchen erhielt demnach 1 ul Extrakt/ug DNA, das zweite Röhrchen 0,3 ul/ug, das dritte Röhrchen 0,1 ul/ug, usw. Die Röhrchen, welche jedes 100 ul enthielt, wurde bei 37ºC für eine Stunde inkubiert, dann wurde eine 20 ul-Probe eines jeden durch Gelelektrophorese analysiert.
Es wurde herausgefunden, daß Extrakte von MM294, welche pSC161RM 1-6 tragen, ungefähr 50 Einheiten an Acc I- Restriktionsendonuklease pro ml enthalten.
11. Isolierung des 4,2 Kb Cla I-Fragmentes aus pSC161RM 1- 8: 150 ul (15ug) gereinigter pSC161RM 1-8-DNA wurden in 500 ul 50 mM Tris, pH 8,0, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; mit 30 Einheiten (6 ul) des Cla I-Restriktionsenzyms bei 37ºC für 2 Stunden verdaut. Der Verdau wurde beendet durch Erwärmen auf 72ºC für 10 Minuten. Die Lösung wurde auf einem 1%- Agaroseplattengel, hergestellt und laufengelassen in TAE- Puffer (40 mM Tris, pH 8,2, 20 mM Na-Acetat, 1 mM EDTA) mit 0,01% SDS und 0,5 ug/ml Ethidiumbromid einer Elektrophorese unterworfen. Die 4,2 Kb-Bande wurde unter UV-Beleuchtung ausgeschnitten. Die Gelscheiben wurden in einer 5 ml- Spritze angeordnet und durch eine Kanüle Nr. 21 (#21 gauge needle) in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen, welches 3 ml TAE und 0,01% SDS enthält, gezwängt und sanft mit einem kleinen Glasstab gemischt. Das Röhrchen wurde bei 17 K upm für 45 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein anderes 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 300 ul 5 M NaCl und 6 ml 100% Isopropanol wurden zugegeben. Das Röhrchen wurde bei -70ºC für eine Stunde gelagert und dann wiederum bei 17 K upm für 15 Minuten zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde in 400 ul DNA-Puffer suspendiert. Die Lösung wurde einmal mit gleichen Volumina an Phenol und Chloroform extrahiert und dreimal mit Wasser äquilibriertem Ether. Das Fragment wurde mit 0,8 ml Isopropanol wieder gefällt, dann wurde es in 20 ul DNA-Puffer resuspendiert. Die Reinheit und die Konzentration des Fragmentes wurde durch Gel-Elektrophorese bestimmt. 12. Ligation des 4,2 Kb Cla I-Fragmentes an pUC19: 0,5 ug (7 ul) des gereinigten Fragmentes wurden mit 1 ug (2 ul) Acc I gespaltenen und dephosphoryliertem pUC19 (ATCC 37254) in 30 ul Ligationspuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 40 mM DTT, 1 mM ATP) gemischt. 1,5 ul T4-DNA-Ligase wurde hinzugefügt und die Mischung wurde bei 16ºC vier Stunden inkubiert. 15 ul der ligierten Mischung wurden in E.coli MM294 transformiert und die Transformanten wurden durch Plattieren auf L-Agar-Platten, welche Ampicillin enthalten, gewonnen. Sieben Transformanten wurden gescreent durch das Miniprep-Verfahren (Abschnitt 8). Sechs davon schienen das Fragment inkorporiert zu haben. Ein Extrakt eines davon, pSC161RM 121-2, wurde auf Acc I-Endonukleaseaktivität (Abschnitt 10) untersucht. Man fand heraus, daß es ungefähr zehnmal mehr Acc I-Endonuklease synthetisiert als der ursprüngliche Klon, pSC161RM 1-8, dies bedeutet, 500 Einheiten pro ml Extrakt. Die gesamte DNA aus MM294, welche pSC161RM 121-2 trägt, wurde gereinigt; man fand heraus, daß sie widerstandsfähig gegenüber Verdau durch Acc I war, was bestätigt, daß der Klon sowohl die Acc I-Methylase als auch die Endonuklease produziert.
14. Konstruktion von Acc I-überproduzierenden Plasmiden: Siehe Fig. 4. 20 ug (200 ul) des Plasmids pGW10 (ATCC 40167) wurden mit 80 Einheiten BamH I in 500 ul 6 mM Tris, pH 7,9, 6 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl bei 37ºC für eine Stunde verdaut. Das 4,3 Kb BamH I-Fragment, welches die temperaturregulierten Lambda PL- und PR-Promotoren enthält, wurde gelgereinigt (Abschnitt 11). 0,3 ug (3 ul) des gereinigten Fragmentes wurden mit 0,6 ug (6 ul) BamH I-gespaltenen, dephosphoryliertem pSC161RM 121-2 in 25 ul Ligationspuffer (Abschnitt 12) gemischt. 1 ul T4-DNA-Ligase wurde hinzugefügt und die Mischung bei 16ºC vier Stunden inkubiert. 15 u l der ligierten Mischung wurden in E.coli MM294 transformiert und Transformanten wurden durch Plattieren auf L- Agar-Platten, Ampicillin enthaltend, gewonnen und bei 30ºC 24 Stunden inkubiert. 24 Transformanten wurden zur Analyse ausgewählt. Sie wurden anfänglich gescreent, um jene zu identifizieren, welche temperaturempfindlich waren durch Ausstreichen auf Doppel-L-Agar-Platten, Ampicillin enthaltend, und Inkubieren einer Platte bei 30ºC und die andere bei 42ºC. Vier der 24 Transformanten wuchsen bei 42ºC und wurden verworfen. 14 der 20 verbleibenden temperatursensitiven Transformanten wurden analysiert durch das Miniprep- Verfahren (Abschnitt 8). Man fand heraus, daß 12 davon das BamH I-Fragment inkorporiert haben, 11 in einer Orientierung ('B') und einer in die andere Orientierung ('A'). Die beiden verbleibenden zwei Klone, welche das Fragment nicht inkorporiert hatten, wurden verworfen.
Der Klon mit der 'A'-Orientierung, pSC161RM O/P17, und einer der Klone mit der 'B'-Orientierung, pSC161RM O/P9, wurden untersucht, um die Menge an Acc I-Endonuklease zu bestimmen, welche sie synthetisierten. 100 ml-Kulturen von jedem wurden bei 30ºC in L-Broth, welches Ampicillin enthält, gezüchtet. Bei einer Zelldichte von ungefähr 3x10&sup8; Zellen/ml (optische Dichte bei 590 nm = 0,8 bis 1,0) wurden 50 ml aus jeder Kultur auf eine Inkubationstemperatur von 42ºC angehoben. Nach drei Stunden weiterer Inkubation wurden die 30ºC- und die 42ºC-Kulturen zentrifugiert und die Zellextrakte wurden daraus hergestellt und untersucht (Abschnitt 10). Von dem Klon mit der 'A'-Orientierung wurde herausgefunden, daß ungefähr 30000 Einheiten an Acc I-Endonuklease/ml Zellextrakt bei 42ºC und weniger als 100 Einheiten/ml bei 30ºC synthetisiert. Es wurde herausgefunden, daß in diesem Plasmid der Lambda PL-Promotor im Uhrzeigersinn (Fig. 4) orientiert war. Man fand heraus, daß der Klon mit der 'B'-Orientierung, in welchem der Promotor die entgegengesetzte Orientierung aufweist, ungefähr 3000 Einheiten an Acc I-Endonuklease/ml Extrakt sowohl bei 42ºC als auch bei 30ºC synthetisiert. Acinetobacter calcoaceticus synthetisiert ebenfalls ungefähr 3000 Einheiten Acc I-Endonuklease/ml Extrakt, wenn er unter optimalen Bedingungen gezüchtet wird.
E.coli MM294, enthaltend pSC161RM O/P17, ist die bevorzugte Quelle, aus welcher die Acc I-Restriktionsendonuklease gereinigt werden kann. Kulturen dieses Stammes sollten bei 30ºC zur spät-logarithmischen Phase (5x10&sup8; Zellen/ml) gezüchtet werden, dann für weitere drei Stunden auf 42ºC angehoben werden, um die Transkription vom Lambda-Promotor zu induzieren. Die Zellen sollten dann durch Zentrifugation gesammelt werden und ein Extrakt daraus entweder sofort oder nach Lagerung bei -70ºC hergestellt werden.

Claims

1. Isoliertes DNA-Segment, welches für die Accl Restriktionsendonuklease codiert, wobei die DNA erhältlich ist aus Acinetobacter calcoaceticus ATCC Nr.53701.

2. Rekombinanter DNA-Vektor mit einem Vektor, in welchen ein DNA-Segment eingefügt wurde, welches für die AccI Endonuklease codiert, die von Acinetobacter calcoaceticus ATCC Nr. 53701 hergestellt wird.

3. Wirtszelle, welche mittels des Vektors gemäß Anspruch 2 transformiert wurde.

4. Verfahren zum Klonieren von DNA, die für eine AccI Restriktionsendonuklease codiert, welches umfaßt:

(a) Reinigen der DNA aus Acinetobacter calcoaceticus ATCC Nr. 53701;

(b) teilweises Verdauen der gereinigten DNA mit EcoRI, um DNA-Fragmente zu bilden;

(c) Ligieren der DNA-Fragmente in einen Klonierungsvektor;

(d) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Klonierungsvektor aus Schritt (c), um eine Zellbibliothek zu bilden;

(e) Reinigen rekombinanter Vektoren aus der Zellbibliothek, um eine Plasmidbibliothek zu bilden;

(f) In-Kontakt-Bringen der Plasmidbibliothek aus Schritt (e) mit AccI, um einen Verdauungspool zu bilden, Übertragen des Verdauungspools in eine Wirtszelle und Testen auf das Vorliegen einer oder mehrerer Klonierungsvektoren, welche DNA enthalten, die für eine AccI Methylase codiert;

(g) Transferieren des Klonierungsvektors aus Schritt (f), welcher DNA enthält, die für die AccI Methylase codiert, in E.coli MM294 und Testen auf das Vorliegen von DNA, die für eine AccI Restriktionsendonuklease codiert; und

(h) Isolieren des Klonierungsvektors aus Schritt (g), der DNA enthält, die für die AccI Restriktionsendonuklease codiert.

5. Verfahren zum Herstellen von AccI Restriktionsendonuklease, welches umfaßt:

Kultivieren einer Wirtszelle, die mit dem Vektor aus Anspruch 2 transformiert wurde, unter Bedingungen für die Expression der Endonuklease.