DE3888648T2

DE3888648T2 - Verfahren zur Herstellung von HgiAI-Restriktionsendonuklease und -methylase.

Info

Publication number: DE3888648T2
Application number: DE3888648T
Authority: DE
Inventors: Keith Lunnen; Geoffrey Wilson
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1987-12-17
Filing date: 1988-12-16
Publication date: 1994-09-29
Anticipated expiration: 2008-12-17
Also published as: ATE103329T1; US4987074A; JPH022367A; EP0321271A3; EP0321271B1; DE3888648D1; EP0321271A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Klone für die Restriktionsendonuklease HgiAI und deren modifizierender Methylase, sowie die Herstellung dieser Enzyme aus den Klonen.
Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die auf natürliche Weise in Bakterien vorkommen. Wenn die Restriktionsendonukleasen von anderen kontaminierenden bakteriellen Komponenten gereinigt werden, können sie im Labor zur Spaltung von DNA-Molekülen in präzise Fragmente verwendet werden. Diese Eigenschaft ermöglicht es, daß DNA-Moleküle auf einzigartige Weise identifiziert und in die sie aufbauenden Gene fraktioniert werden können. Restriktionsendonukleasen haben sich als unverzichtbare Werkzeuge für die moderne genetische Forschung erwiesen. Sie sind die biochemischen "Scheren", mit deren Hilfe Gentechnik und genetische Analyse durchgeführt werden.
Restriktionsendonukleasen erkennen und binden an bestimmte Nukleotidsequenzen (die "Erkennungssequenz") entlang des DNA-Moleküls. Einmal gebunden, spalten sie das Molekül innerhalb der Sequenz oder auf einer Seite der Sequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonukleasen besitzen eine Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. In den vielen hundert Bakterienarten, die bis heute untersucht wurden, konnten über einhundert verschiedene Restriktionsendonukleasen identifiziert werden.
Bakterien besitzen gewöhnlich nur eine kleine Anzahl an Restriktionsendonukleasen pro Art. Die Endonukleasen werden nach den Bakterien benannt, aus denen sie gewonnen wurden. So synthetisiert die Art Haemophilus aegyptius beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonukleasen, die HaeI, HaeII und HaeIII genannt werden. Diese Enzyme erkennen und spalten die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy bzw. GGCC. Andererseits synthetisiert Escherichia coli RY13 nur ein Enzym, EcoRI, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
Ohne die Bindung an eine Theorie zu wollen, wird angenommen, daß die Restriktionsendonukleasen in der Natur eine Schutzfunktion für das Wohl der Bakterienzelle ausüben. Sie befähigen die Bakterien, einer Infektion durch fremde DNA-Moleküle zu widerstehen, wie z. B. durch Viren und Plasmide, die die Bakterien anderenfalls zerstören oder parasitieren würden. Sie verleihen diese Resistenz dadurch, daß sie an infizierende DNA-Moleküle binden und diese spalten, so oft die Erkennungssequenz auftritt. Die daraus resultierende Zerstückelung inaktiviert viele der infizierenden Gene und macht die DNA einem weiteren Abbau durch Exonucleasen zugänglich.
Eine zweite Komponente der Bakterienschutzsysteme sind die modifizierenden Methylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu den Restriktionsendonukleasen und sie stellen die Mittel bereit, mit deren Hilfe die Bakterien ihre eigene DNA schützen und von fremder, infizierender DNA unterscheiden können. Modifizierende Methylasen erkennen und binden an die gleiche Nukleotiderkennungssequenz wie die korrespondierenden Restriktionsendonukleasen; anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie irgendeines der Nukleotide innerhalb der Sequenz chemisch durch die Addition einer Methylgruppe. Nach der Methylierung wird die Erkennungssequenz von der Restriktionsendonuklease nicht mehr gebunden oder gespalten. Aufgrund der Aktivität ihrer modifizierenden Methylase ist die DNA einer Bakterienzelle immer vollständig modifiziert, und sie ist daher vollkommen unempfindlich gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuklease. Nur die nicht-modifizierte und daher erkennbar fremde DNA ist empfindlich gegenüber der Erkennung und dem Angriff durch die Restriktionsendonuklease.
Durch die Entwicklung gentechnischer Methoden ist es jetzt möglich, Gene zu klonieren und die durch diese Gene codierten Proteine und Enzyme in größeren Mengen herzustellen, als mit herkömmlichen Reinigungstechniken erhältlich waren. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen der Restriktionsendonukleasegene ist die Entwicklung einer einfachen und verläßlichen Methode, mit der derartige Klone innerhalb komplexer "Banken", d. h. durch "Shotgun"-Verfahren erhaltenen Klonpopulationen, identifiziert werden können, wenn diese in so geringen Häufigkeiten wie 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup4; auftreten. Vorzugsweise sollte die Methode selektiv sein, beispielsweise so, daß die unerwünschte Mehrzahl der Klone zerstört wird, während die gewünschten seltenen Klone überleben.
Restriktions-Modifikations-Systeme vom Typ 11 werden mit zunehmender Häufigkeit kloniert. Die ersten klonierten Systeme verwendeten eine Bakteriophageninfektion als Mittel zur Identifizierung oder Selektion der Restriktionsendonukleasenklone (HhaII: Mann et al., Gene 3 : 97-112, (1978); EcoRII: Kosykh et al., Molec. gen. Genet 178 : 717-719, (1980); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78 1503-1507, (1981)). Da die Anwesenheit der Restriktions-Modifikations- Systeme in Bakterien diese befähigt, einer Infektion durch Bakteriophagen zu widerstehen, können klonierte Restriktions-Modifikations-Gene tragende Zellen im Prinzip selektiv als Überlebende aus Banken isoliert werden, die den Phagen ausgesetzt wurden. Es wurde jedoch gefunden, daß diese Methode nur einen begrenzten Wert hat. Insbesondere wurde gefunden, daß die klonierten Restriktions-Modifikations-Gene nicht immer eine ausreichende Phagenresistenz aufweisen, um ein selektives Überleben zu ermöglichen.
Ein weiterer Weg zur Klonierung beinhaltet die Übertragung von Systemen, die anfänglich als "plasmid-borne" charakterisiert wurden, auf in E.coli klonierte Plasmide (EcoRV: Bougueleret et al., Nucleic Acids Res. 12 : 3659-3676, (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 402-406, (1983); Theriault und Roy, Gene 19 : 355-359, (1982); PvuII: Blumenthal et al., J.Bacteriol. 164 : 501-509, (1985)).
Ein dritter Weg, der zur Klonierung einer wachsenden Anzahl von Systemen verwendet wird, beinhaltet die Auswahl eines aktiven Methylasegens, wobei auf unsere Patentanmeldung Nr. 707079 und auf (BsuRI: Kiss et al., Nucleic Acids Res. 13 : 6403-6421, (1985)) Bezug genommen wird. Da die Restriktions- und Modifikationsgene zu einer engen Kopplung neigen, können Klone, die beide Gene enthalten, oftmals durch eine Auswahl hinsichtlich lediglich eines Gens isoliert werden. Die Auswahl nach der Methylierungsaktivität ergibt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktions- und Modifikationssystem, sondern manchmal nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10 : 219-225, (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20 : 197-204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21 : 111-119, (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258 : 1235-1241, (1983)).
Ein potentielles Hindernis bei der Klonierung von Restriktions- und Modifikationsgenen liegt in dem Versuch, die Endonukleasegene in einen Wirt einzuführen, der nicht schon durch eine Modifizierung geschützt ist. Falls das Methylasegen und das Endonukleasegen zusammen als ein einziger Klon eingeführt werden, muß die Methylase die DNA des Wirtes schützend modifizieren, bevor die Endonuklease die Gelegenheit zu deren Spaltung hat. Gelegentlich kann es daher nur möglich sein, die Gene nacheinander zu klonieren, die Methylase zuerst, danach die Endonuklease. Ein weiteres Hindernis bei der Klonierung von Restriktions- und Modifikationssystemen liegt in der Entdeckung, daß manche Stämme von E.coli in entgegengesetzter Richtung auf eine Cytosin-Modifikation reagieren; sie besitzen Systeme, die methyliertes Cytosin enthaltende DNA zerstören (Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83 : 9070-9074, (1986)). Cytosin-spezifische Methylasegene können weder alleine noch zusammen mit ihren korrespondierenden Endonukleasegenen einfach in diesen Stämmen kloniert werden. Zur Vermeidung dieses Problems ist es notwendig, mutante Stämme von E.coli (McrA&supmin; und McrB&supmin;) zu verwenden, in denen diese Systeme unwirksam sind.
Da gereinigte Restriktionsendonukleasen, und in einem geringeren Ausmaß modifizierende Methylasen, nützliche Werkzeuge zur Charakterisierung und zur Umordnung von DNA im Labor sind, besteht ein kommerzieller Anreiz, Stämme von Bakterien durch rekombinante DNA-Techniken zu erhalten, die diese Enzyme in großen Mengen synthetisieren. Solche Stämme wären nützlich, da sie sowohl die Aufgabe der Reinigung vereinfachen als auch die Mittel für eine Herstellung in wirtschaftlich brauchbaren Mengen bereitstellen würden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Klon, erhältlich aus Herpetosiphon giganteus, bereitgestellt, der die Gene der Restriktionsendonuklease HgiAI und ihrer modifizierenden Methylase enthält, sowie die damit verbundenen Verfahren zur Herstellung der Enzyme. Insbesondere betrifft diese Erfindung Klone, welche die Restriktionsendonuklease HgiAI exprimiren, ein die DNA-Sequenz G(T/A)GC(T/A)C erkennendes und unmittelbar vor den 3'-terminalen C spaltendes Enzym (siehe Brown, McClelland und Whitehead, Gene 9, 49-68 (1980), wobei diese Offenbarung hiermit durch Inbezugnahme in die Beschreibung aufgenommen wird). Die erfindungsgemäß hergestellte Restriktionsendonuklease HgiAI ist frei von den Verunreinigungen, die in HgiAI-Präparationen aus Herpetosiphon giganteus gefunden wurden.
Das bevorzugte Verfahren zur Klonierung dieses Enzyms umfaßt die Bildung einer Bank, welche die DNA aus H. giganteus enthält, das Isolieren solcher Klone, die eine die modifizierende HgiAI-Methylase codierende DNA enthalten, und das Überprüfen (screening) dieser Klone zur Identifizierung der Klone, die auch die Gene der Restriktionsendonuklease HgiAI enthalten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt das Schema zur Klonierung und Herstellung der Restriktionsendonuklease HgiAI.
Fig. 2 ist eine Restriktionskarte eines 6,7 Kb BglII- Multifragments von H.giganteus-DNA, welches die Restriktionsendonuklease HgiAI und ihre modifizierende Methylase codiert. Das Fragment wurde zur Herstellung von pKL170RM 111-14 in die BamHI-Region von pUC19 (ATCC 37254) kloniert.
Fig. 3 ist eine Photographie eines Agarosegels, welches die Aktivität der Restriktionsendonuklease HgiAI in einem Zellextrakt von pKL170RM 111-14 tragendem E.coli RR1 (ATCC 31343) zeigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft sowohl Klone der HgiAI- Restriktions- und Modifikationsgene als auch die aus solchen Klonen hergestellte Restriktionsendonuklease HgiAI. Die HgiAI-Gene werden mittels eines Verfahrens kloniert, das einen Vorteil aus der Tatsache zieht, daß gewisse Klone, die danach ausgewählt wurden, daß sie die Gene der modifizierenden HgiAI-Methylase enthalten und deren Expression bewirken, auch die HgiAI-Restriktionsgene enthalten. Die DNA solcher Klone ist resistent gegen die Digerierung durch die HgiAI- Restriktionsendonuklease. Die Resistenz gegen die Digerierung liefert ein Mittel zur selektiven Isolierung von Klonen, welche die HgiAI-Methylase und die HgiAI-Restriktionsendonuklease codieren.
Das hier beschriebene Verfahren, durch welches die HgiAI- Restriktions- und Methylasegene vorzugsweise geklont und exprimiert werden, ist in Fig. 1 gezeigt und umfaßt die folgenden Schritte:
1. Die DNA aus Herpetosiphon giganteus wird gereinigt. H.giganteus wurde von Brown et al beschrieben, siehe oben. Proben dieses Bakteriums sind von der American Type Culture Collection, Katalog Nr. 53756 erhältlich.
2. Die DNA wird mit einer Restriktionsendonuklease wie BglII teilweise digeriert.
3. Die digerierte DNA wird in den Klonierungsvektor pUC19 (ATCC 37254) eingebunden, der eine oder mehrere HgiAI-Regionen enthält. Die eingebundene DNA wird in einen geeigneten Wirt, wie beispielsweise den Escherichia coli-Stamm RR1 (ATCC 31343) transformiert.
4. Das transformierte Gemisch wird auf ein für transformierte Zellen selektives Medium, wie beispielsweise das Antibiotikum Ampicillin, plattiert. Nach einer Inkubation werden die transformierten Kolonien zusammen in einer einzelnen Kultur, der Zellbank, gesammelt.
5. Die rekombinanten Plasmide aus der Zellbank werden insgesamt zur Herstellung der Plasmidbank gereinigt.
6. Die Plasmidbank wird mit der aus H.giganteus hergestellten HgiAI-Restriktionsendonuklease vollständig digeriert. Die Digerierung mit HgiAI zerstört auf differenzierende Weise die nicht-modifizierten, die Methylase nicht enthaltenden Klone und erhöht die relative Häufigkeit der HgiAI-Methylaseklone.
7. Die digerierte Plasmidbank wird zurück in einen geeigneten Wirt, wie beispielsweise E.coli RR1, transformiert und die Transformanten werden durch Plattieren auf selektive Medien zurückgewonnen. Die Kolonien werden ausgelesen und ihre DNA wird auf die Anwesenheit des HgiAI-Modifikationsgens analysiert: die dieses tragenden Plasmide werden gereinigt und mit der HgiAI-Restriktionsendonuklease zur Bestimmung ihrer Resistenz gegen eine Digerierung inkubiert. Die gesamte zellulare DNA (chromosomale DNA und Plasmid-DNA) wird ebenfalls gereinigt und mit der HgiAI- Restriktionsendonuklease inkubiert. Die DNA von Klonen, welche das HgiAI-Modifikationsgen tragen, sollte vollständig modifiziert sein, und sowohl die Plasmid-DNA als auch die gesamte DNA sollte im wesentlichen resistent gegen eine Digerierung sein.
8. Die die HgiAI-Restriktionsendonuklease tragenden Klone werden durch Herstellung von Zellextrakten aus den in Schritt 8 identifizierten HgiAI-Methylaseklonen und durch Untersuchen der Extrakte auf eine HgiAI-Restriktionsendonukleaseaktivität identifiziert.
9. Durch Vermehrung in einem Fermenter in einem Ampicillin enthaltenden Nährmedium kann die HgiAI-Restriktionsendonuklease aus Klonen hergestellt werden, welche die HgiAI-Restriktions- und Modifikationsgene tragen. Die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und mittels Ultraschall zur Herstellung eines rohen Zellextrakts zerstört, der die HgiAI-Restriktionsendonukleaseaktivität enthält.
10. Der die HgiAI-Restriktionsendonukleaseaktivität enthaltende rohe Zellextrakt wird mittels Standardtechniken zur Proteinreinigung, wie beispielsweise der Affinitätschromatographie und der Ionenaustauschchromatographie, gereinigt.
Obgleich die vorstehend beschriebenen Schritte die bevorzugte Art zur Ausführung der vorliegenden Erfindung darstellen, ist es für einen Fachmann offensichtlich, daß der oben beschriebene Weg in Übereinstimmung mit bekannten Techniken variieren kann.
Das folgende Beispiel wird gegeben, um z.Zt. bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung aufzuzeigen. Es ist verständlich, daß dieses Beispiel illustrativ ist und daß die Erfindung als nicht darauf beschränkt angesehen wird, mit Ausnahme der in den beigefügten Ansprüchen enthaltenen Beschränkungen.

Beispiel

Klonierung der HgiAI-Restriktionsendonukleasegene

1. DNA-Reinigung: 10 g gefrorene Herpetosiphon giganteus- Zellen (ATCC 53756) wurden 1 Stunde lang auf Eis aufgetaut und dann in 20 ml von 25% Sucrose und 50 mM Tris pH 8,0 resuspendiert. 10 ml von 0,25 M EDTA pH 8,0 und 6 ml von 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris pH 8,0 wurden zugegeben. Die Suspension wurde 2 Stunden auf Eis gehalten und dann durch Zugabe von 24 ml von 1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 8,0, 67 mM EDTA und von 5 ml 10% SDS lysiert. Die Lösung wurde mit 70 ml Phenol und 60 ml Chloroform extrahiert, wobei das Phenol vorher mit 0,5 M Tris pH 8,0 äquilibriert wurde. Die Emulsion wurde 30 min bei 10·10³ U/min zur Phasentrennung zentrifugiert. Die viskose obere Phase wurde in eine neue Flasche überführt und nochmals mit Phenol und Chloroform extrahiert. Die Emulsion wurde erneut zentrifugiert, dann wurde die obere Phase gegen vier Wechsel eines DNA-Puffers (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde dann 1 Stunde bei 37ºC mit RNase bei einer Endkonzentration von 200 ug/ml digeriert. Die DNA wurde dann durch Zugabe von 5 M NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M und 0,55 Vol.-Teilen Isopropylalkohol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wurde auf einen Glasstab aufgespult, luftgetrocknet und dann in DNA-Puffer gelöst und bei 4ºC gelagert.
2. Teilweise Digerierung von DNA: 30 ug der H.giganteus- DNA wurden in 300 ul eines Restriktionsendonuklease-Digerierungspuffers (10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Mercaptoethanol, 150 mM NaCl) hinein verdünnt. Die Lösung wurde in drei 100 ul-Teile geteilt. Fünf Einheiten BglII- Restriktionsendonuklease wurden zum ersten Teil zugegeben, 2,5 Einheiten zu dem zweiten Teil und eine Einheit zu dem dritten Teil. Die Lösungen wurden 1 h bei 37ºC inkubiert, dann wurde die Digerierung durch Erwärmen auf 72ºC während 10 min beendet. Die drei Lösungen wurden vereinigt.
3. Ligation und Transformation: 3 ug (30 ul) der mit BglII teilweise digerierten H.giganteus-DNA wurden mit 1,5 ug (8 ul) des mit BamHI gespaltenen und dephosphorylierten pUC19 (ATCC 37254) vermischt. 10 ul eines 10X-Ligationspuffers (500 mM Tris pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT, 5 mM ATP) und 52 ul steriles destilliertes Wasser wurden zugegeben, um das Volumen auf 100 ul zu ergänzen. 4 ul T4-DNA- Ligase wurden zugegeben und die Lösung wurde 4 h bei 17ºC inkubiert. Die Lösung wurde durch Extraktion mit 10 ul Chloroform sterilisiert und dann durch Mikrozentrifugation während 15 sec geklärt. 80 ul der Ligationslösung wurden mit 1 ml SSC/CaCl&sub2; (50 mM NaCl, 5 mM Na&sub3;-Citrat, 67 mM CaCl&sub2;) vermischt und 2 ml eiskalte kompetente E.coli RR1-Zellen (ATCC 31343) wurden zugegeben. Die Lösung wurde 5 min bei 42ºC inkubiert, dann wurden 8 ml Luria-Brühe (L-broth) zugegeben und die Inkubation wurde 4 h bei 37ºC fortgesetzt.
4. Zellbank: Die transformierte Kultur wurde leicht zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in 1 ml Luria-Brühe resuspendiert. 200 ul-Teile der resuspendierten Zellen wurden auf 100 ug/ml Ampicillin enthaltenden Luria-Agar (L-agar) plattiert. Die Platten wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert. Die auf der Oberfläche der Platten wachsenden transformierten Zellen wurden zusammengesammelt, wobei jede der Platten mit 2,5 ml 10 mM Tris pH 7,5 und 10 mM MgCl&sub2; geflutet wurde, die Kolonien zusammengekratzt und die Suspensionen in einem einzigen Röhrchen vereinigt wurden.
5. Plasmidbank: 2,5 ml der Zellbank wurden in 500 ml einer 100 ug/ml Ampicillin enthaltenden Luria-Brühe eingeimpft. Die Kultur wurde über Nacht bei 37ºC geschüttelt und dann 5 min bei 4·10³ U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der Zellkuchen wurde bei Raumtemperatur in 10 ml von 25% Sucrose und 50 mM Tris pH 8,0 resuspendiert. 5 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0, und 3 ml von 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris pH 8,0 wurden zugegeben. Die Lösung wurde 1 h auf Eis gehalten, dann wurden 12 ml von 1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 8,0 und 67 mM EDTA zugegeben und die Suspension wurde zur Induzierung der Zell-Lyse leicht gewirbelt.
Das lysierte Gemisch wurde in ein 50 ml-Röhrchen überführt und 45 min bei 17·10³ U/min und 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. 20,0 g festes CsCl wurden in ein 50 ml-Plastikröhrchen mit Schraubverschluß eingewogen und 22,0 g des Überstands wurden in das Röhrchen pipettiert und gemischt. 1,0 ml von 5 mg/ml Ethidiumbromid in 10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl und 1 mM EDTA wurden zugegeben. Die Lösung wurde in zwei 1,59 cm·7,62 cm (5/8 Inch·3 Inch) Zentrifugenröhrchen überführt und in einem Beckman-Ti70-Rotor während 42 h bei 44·10³ U/min und 17ºC geschleudert. Zum Sammeln der Plasmide wurden die Röhrchen geöffnet, mit ultraviolettem Licht beleuchtet und die untere der zwei fluoreszierenden Banden wurde mit Hilfe einer Spritze eingesammelt. Die untere Bande aus jedem Röhrchen wurde vereinigt und das Ethidiumbromid wurde durch viermaliges Extrahieren mit einem gleichen Volumen wassergesättigtem eiskaltem N-Butanol entfernt.
Die extrahierte Lösung wurde gegen vier Wechsel eines DNA- Puffers dialysiert, danach wurde die Nucleinsäure durch Zugabe von 2 Vol.-Teilen Isopropanol und genügend 5 M NaCl zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,4 M ausgefällt. Die Lösung wurde über Nacht bei -20ºC gelagert und dann 15 min lang bei 15·10³ U/min und 0ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, der Kuchen wurde 15 min lang luftgetrocknet, dann in 50 ul 10 mM Tris pH 7,5 und 1 mM EDTA gelöst und bei -20ºC gelagert. Es wurde gefunden, daß die Konzentration der Plasmid-DNA etwa 150 ug/ml betrug.
6. Digerierung der Plasmidbank: 4,5 ug (30 ul) der Plasmidbank wurden in 150 ul des Digerierungspuffers für Restriktionsendonukleasen (Abschnitt 2) hinein verdünnt. 36 Einheiten der HgiAI-Restriktionsendonuklease wurden zugegeben und das Röhrchen wurde 1 h bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erwärmen auf 72ºC während 12 min beendet.
7. Transformierung: 12,5 ul (0,3 ug) der digerierten Bank wurden mit 100 ul SSC/CaCl&sub2; (Abschnitt 3) und 200 ul eiskalter, kompetenter E.coli RR1 vermischt. Das Gemisch wurde 3 min auf 42ºC erwärmt, dann auf eine 100 ug/ml Ampicillin enthaltende L-Agarplatte aufgebracht. Die Platte wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Digerierung mit HgiAI verminderte die Zahl der Transformanten um das 10³-fache im Vergleich mit einer Transformation durch nicht-digerierte Plasmide. Aus den Überlebenden der Digerierung mit HgiAI wurden 14 Kolonien ausgelesen; jede Kolonie wurde in 10 ml einer Ampicillin enthaltenden Luria-Brühe zur Herstellung einer Minikultur eingeimpft und zur Herstellung eines Hauptvorrats auf eine Ampicillin enthaltende L-Agarplatte aufgestrichen.
8. Analyse der überlebenden Individuen: Vierzehn der aus Abschnitt 7 erhaltenen überlebenden Kolonien wurden in 10 ml-Kulturen gezüchtet und die Plasmide, die diese Kolonien trugen, wurden mit Hilfe des folgenden "Miniprep"-Reinigungsverfahrens frei nach der Methode von Birnboin und Doly, Nucleic Acids Res. 7 : 1513 (1979) hergestellt.

"Miniprep"-Verfahren:

Jede Kultur wurde 5 min lang bei 8·10³ U/min zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen und der Zellkuchen wurde in 1,0 ml einer 1 mg/ml Lysozym enthaltenden Lösung aus 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glukose, pH 8,0, resuspendiert. Nach 10 min bei Raumtemperatur wurden 2,0 ml von 0,2 M NaOH, 1% SDS zu jedem Röhrchen zugegeben, die Röhrchen wurden zur Lyse der Zellen geschüttelt und dann auf Eis gestellt. Wenn die Lösungen klar waren, wurden jeweils 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, zugegeben und es wurde geschüttelt. Die gebildeten Niederschläge wurden bei 15·10³ U/min und 4ºC während 10 min niedergeschleudert. Jeder Überstand wurde in ein 3 ml Isopropanol enthaltendes Zentrifugenröhrchen eingegossen und gemischt. Nach 10 min bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen 10 min bei 15·10³ U/min zur Pelletierung der ausgefällten Nukleinsäuren geschleudert. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden 30 min bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Sobald sie trocken waren, wurden die Pellets in 850 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. Jeweils 75 ul 5 M NaCl wurden zugegeben und die Lösungen wurden in Eppendorf-Röhrchen überführt, die 575 ul Isopropanol enthielten, und erneut während 10 min bei Raumtemperatur ausgefällt. Die Röhrchen wurden dann 45 sec lang in einer Mikrozentrifuge geschleudert, die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden luftgetrocknet. Die Pellets wurden dann in 500 ul einer 100 ug/ml RNase enthaltenden Lösung aus 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 gelöst und 1 Stunde lang bei 37ºC zur Digerierung der RNA inkubiert. Die DNA wurde erneut durch Zugabe von 50 ul 5 M NaCl, gefolgt von 350 ul Isopropanol, ausgefällt. Nach 10 min bei Raumtemperatur wurde die DNA durch Zentrifugation während 45 sec niedergeschlagen, die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden in 150 ul 10 mM Tris und 1 mM EDTA, pH 8,0, gelöst. Die Plasmid-Minipreps wurden nachfolgend durch Digerierung mit HgiAI und EcoRI analysiert.
9. Klone der HgiAI-Methylasegene: Es wurde gefunden, daß zehn der vierzehn analysierten Plasmide empfindlich gegenüber einer HgiAI-Digerierung waren und verschiedene Strukturen besaßen. Diese Plasmide waren unecht und sie wurden verworfen. Die restlichen vier Plasmide waren resistent gegen eine HgiAI-Digerierung und trugen zwei BglII-Fragmente von 5,4 kb und 1,5 Kb (Fig. 2). Die Plasmide schienen identisch zu sein; es konnte gezeigt werden, daß eines dieser Plasmide, pKL170RM 111-14, nicht nur die modifizierende HgiAI-Methylase sondern auch die HgiAI-Restriktionsendonuklease codierte.
10. Klon des HgiAI-Restriktionsgens: Durch Untersuchung von E.coli RR1-Extrakten, die dieses Plasmid trugen, wurde aufgefunden, daß pKL170RM 111-14 die HgiAI-Restriktionsendonuklease codiert und exprimiert.

Endonukleasetest:

Eine 100 ml-Kultur aus pKL170RM 111-14 tragendem RR1 wurde über Nacht bei 30ºC in 100 ug/ml Ampicillin enthaltender Luria-Brühe gezüchtet. Die Kultur wurde 5 min bei 4·10³ U/min zentrifugiert und der Zellkuchen wurde in 3 ml 10 mM KPO&sub4; pH 7,5, 10 mM Mercaptoethanol und 0,1 mM EDTA resuspendiert. 0,3 ml von 10 mg/ml Lysozym im gleichen Puffer wurden zugegeben und die Suspension wurde 1 h auf Eis stehengelassen. 1,0 ml der Suspension wurden vorsichtig mit drei 10-Sekunden-Stößen zur Zerstörung der Zellen ultraschallbehandelt. Der ultraschallbehandelte Extrakt wurde zur Entfernung der Zelltrümmer 5 min in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und der Überstand wurde wie folgt auf die Endonukleaseaktivität untersucht:
30 ug (43 ul) gereinigte Lambda-Phagen-DNA wurden in 600 ul eines Restriktionsendonuklease-Digerierungspuffers (Abschnitt 2) verdünnt. Die Lösung wurde auf fünf Röhrchen verteilt, 150 ul in das erste Röhrchen und 100 ul in jedes der restlichen vier Röhrchen. 7,5 ul des Extrakts wurden dem ersten Röhrchen zugefügt, um 1 ul Extrakt/ug DNA einzustellen. Danach wurden 50 ul aus dem ersten Röhrchen entfernt und zur Einstellung von 0,3 ul/ug in das zweite Röhrchen überführt. Aufeinanderfolgende Übertragungen von 50 ul in die Röhrchen 3 (0,1 ul/ug), 4 (0,03 ul/ug) und 5 (0,01 ul/ug) wurden fortgesetzt. Die Röhrchen wurden 1 h bei 37ºC inkubiert und danach wurden jeweils 20 ul mittels Gelelektrophorese analysiert. Es wurde gefunden, daß der Extrakt etwa 1000 Einheiten HgiAI-Restriktionsendonuklease pro ml enthielt, entsprechend etwa 10&sup4; Einheiten pro Gramm der Zellen.
pKL170RM 111-14 tragendes E.coli RR1 ist der bevorzugte Wirt, aus dem die HgiAI-Restriktionsendonuklease gereinigt werden kann. Der Stamm sollte in Ampicillin enthaltender Luria-Brühe bei 30ºC in einem Fermenter bis zur stationären Phase gezüchtet werden. Die Zellen sollten dann durch Zentrifugation gesammelt und entweder sofort zur Herstellung des Extrakts aufgebrochen oder bei -70ºC gefroren gelagert werden, solange dies zweckdienlich ist.

Claims

1. Die Restriktionsendonuklease HgiAI codierendes, isoliertes DNA-Segment, bei dem das isolierte DNA-Segment aus Herpetosiphon giganteus ATCC Nr. 53756 erhältlich ist.

2. Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend einen Vektor, in den ein DNA-Segment gemäß Anspruch 1 inseriert worden ist.

3. Isolierte DNA, die die Restriktionsendonuklease HgiAI und ihre Methylase codiert, wobei die isolierte DNA aus Herpetosiphon giganteus ATCC Nr. 53756 erhältlich ist.

4. Klonierungsvektor, in den die isolierte DNA gemäß Anspruch 1 inseriert worden ist.

5. Klonierungsvektor, in den die isolierte DNA gemäß Anspruch 3 inseriert worden ist.

6. Wirtszelle, transformiert durch den Vektor gemäß Anspruch 4 oder 5.

7. Verfahren zum Klonieren von die Restriktionsendonuklease HgiAI codierender DNA, bei dem

(a) DNA aus Herpetosiphon giganteus ATCC Nr. 53756 gereinigt wird;

(b) die gereinigte DNA mit BglII unter Bildung von DNA- Fragmenten teilweise digeriert wird;

(c) die DNA-Fragmente in pUC19 unter Bildung eines Klonierungsvektors eingebunden werden;

(d) eine Wirtszelle mit dem Klonierungsvektor aus Stufe (c) unter Bildung einer Zellbank transformiert wird;

(e) rekombinante Vektoren aus der Zellbank unter Bildung einer Plasmidbank gereinigt werden;

(f) die Plasmidbank aus Stufe (e) mit HgiAI unter Bildung eines Digerierungspools versetzt wird, der Digerierungspool in eine Wirtszelle transformiert wird, und auf Anwesenheit von einem oder mehreren Klonierungsvektoren, die eine HgiAI- Methylase codierende DNA enthalten, geprüft wird;

(g) der Klonierungsvektor aus Stufe (f), der HgiAI-Methylase codierende DNA enthält, auf Anwesenheit von DNA geprüft wird, die eine HgiAI-Restriktionsendonuklease codiert; und

(h) der Klonierungsvektor aus Stufe (g) isoliert wird, der die Restriktionsendonuklease HgiAI codierende DNA enthält.

8. Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease HgiAI, bei dem eine mit dem Vektor gemäß Anspruch 4 oder 5 transformierte Wirtszelle unter Bedingungen für die Expression der Endonuklease kultiviert wird.

9. Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease HgiAI, bei dem

(a) DNA aus Herpetosiphon giganteus ATCC Nr. 53756 gereinigt wird;

(f) die Plasmidbank aus Stufe (e) mit HgiAI unter Bildung eines Digerierungspools versetzt wird, der Digerierungspool in eine Wirtszelle transformiert wird, und auf die Anwesenheit von einem oder mehreren Klonierungsvektoren geprüft wird, die eine HgiAI-Methylase codierende DNA enthalten;

(g) der Klonierungsvektor aus Stufe (f), der HgiAI-Methylase codierende DNA enthält, auf die Anwesenheit von eine HgiAI- Restriktionsendonuklease codierender DNA geprüft wird;

(h) der Klonierungsvektor aus Stufe (g), der die Restriktionsendonuklease HgiAI codierende DNA enthält, isoliert wird; und

(i) eine mit dem Klonierungsvektor aus Stufe (h) unter Bedingungen für die Expression der Restriktionsendonuklease HgiAI transformierte Wirtszelle kultiviert wird.