DE69201136T2

DE69201136T2 - Typ II Restriktionsendonuklease von Arthrobacter Species und Verfahren zu seiner Herstellung.

Info

Publication number: DE69201136T2
Application number: DE69201136T
Authority: DE
Inventors: Richard Morgan
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1991-02-05
Filing date: 1992-02-05
Publication date: 1995-07-27
Anticipated expiration: 2012-02-06
Also published as: EP0498404B1; JPH06105685A; DE69201136D1; EP0498404A1; US5192676A; JP3071292B2; DE498404T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Typ II- Restriktionsendonuklease, Asc I, welche aus Arthrobacter species erhältlich ist, sowie das Verfahren zur Herstellung derselben.
Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von anderen verunreinigenden bakteriellen Bestandteilen gereinigt werden, können Restriktionsendonukleasen im Labor verwendet werden, um DNA-Moleküle in präzise Fragmente zu zertrennen. Diese Eigenschaft ermöglicht, daß DNA-Moleküle eindeutig identifiziert und in ihre aufbauenden (constituent) Gene fraktioniert werden können. Restriktionsendonukleasen haben sich als unentbehrliche Werkzeuge in der modernen genetischen Forschung erwiesen. Sie sind die biochemischen "Scheren", durch welche Gentechnik und Analyse durchgeführt werden.
Restriktionsendonukleasen wirken durch ein Erkennen und Binden an bestimmte Nukleotidsequenzen (die "Erkennungssequenz") entlang des DNA-Moleküls. Wenn sie einmal gebunden sind, schneiden sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite von der Sequenz. Verschiedene Restriktionsendonukleasen haben eine Affinität für verschiedene Erkennungssequenzen. Die Mehrheit der Restriktionsendonukleasen erkennt Sequenzen mit 4 bis 6 Nukleotiden in der Länge, obwohl vor kurzem eine kleine Anzahl von Restriktionsendonukleasen isoliert wurde, welche 7 oder 8 eindeutig festgelegte Nukleotide erkennen. Die meisten Erkennungssequenzen enthalten eine zweifache Symmetrieachse und in den meisten Fällen sind alle Nukleotide eindeutig festgelegt. Jedoch haben einige Restriktionsendonukleasen degenerierte oder schwächere (relaxed) Spezifitäten, indem sie mehrere Basen an einer oder mehreren Positionen in ihrer Erkennungssequenz erkennen, und einige Restriktionsendonukleasen erkennen asymmetrische Sequenzen. Hae III, welche die Sequenz GGCC erkennt, ist ein Beispiel einer Restriktionsendonuklease mit einer symmetrischen, nicht degenerierten Erkennungssequenz, während Hae II, welche (Pu)GCGC(Py) erkennt, ein typisches Beispiel für Restriktionsendonukleasen mit einer degenerierten oder schwächeren Erkennungssequenz darstellt. Endonukleasen mit symmetrischen Erkennungssequenzen schneiden im allgemeinen symmetrisch innerhalb oder benachbart zu der Erkennungsstelle, während jene, die asymmetrische Sequenzen erkennen, dazu neigen in einem Abstand von 1 bis 18 Nukleotiden von der Erkennungsstelle entfernt zu schneiden. Über einhundert fünfundzwanzig eindeutige Restriktionsendonukleasen sind unter mehreren Tausend von Bakterienarten, die bis heute untersucht wurden, identifiziert worden.
Bakterien besitzen gewöhnlich nur eine kleine Anzahl an Restriktionsendonukleasen pro Art. Die Endonukleasen werden gemäß den Bakterien genannt, aus denen sie erhalten werden. Somit synthetisiert die Art Haemophilus aegyptius beispielsweise 3 verschiedene Restriktionsendonukleasen mit den Namen Hae I, Hae II und Hae III. Diese Enzyme erkennen und schneiden die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy bzw. GGCC. Auf der anderen Seite synthetisiert Escherichia coli RY13 nur ein Enzym, EcoR I, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
Unter der Voraussetzung nicht an die Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß in der Natur Restriktionsendonukleasen für das Wohlergehen der Bakterienzelle eine schützende Rolle spielen. Sie ermöglichen den Bakterien einer Infektion durch fremde DNA-Moleküle, wie Viren und Plasmide, zu widerstehen, welche sie andernfalls zerstören oder parasitieren würden. Sie verleihen Resistenz, indem sie an infizierende DNA-Moleküle binden und diese an jeder Stelle, wo die Erkennungssequenz vorkommt, spalten. Die resultierende Aufspaltung inaktiviert viele der infizierenden Gene und macht die DNA empfänglich für einen weiteren Abbau durch Exonukleasen.
Ein zweiter Bestandteil von bakteriellen Schutzsystemen sind die modifizierenden Methylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu den Restriktionsendonukleasen und sie liefern das Mittel, durch welches Bakterien in der Lage sind, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifizierende Methylasen erkennen und binden an dieselbe Nukleotid-Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuklease, aber anstatt die DNA zu zertrennen modifizieren sie chemisch durch Zufügung einer Methylgruppe das eine oder andere der Nukleotide innerhalb der Sequenz. Nach der Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht länger durch die Restriktionsendonuklease gebunden oder geschnitten. Die DNA einer Bakterienzelle ist aufgrund der Aktivität ihrer modifizierenden Methylase immer vollständig modifiziert und sie ist daher völlig unempfindlich gegenüber der Gegenwart der endogenen Restriktionsendonuklease. Es ist nur unmodifizierte und daher identifizierbar fremde DNA, welche empfindlich für eine Erkennung und einen Angriff der Restriktionsendonuklease ist.
Mehr als 1000 Restriktionsendonukleasen sind aus Bakterienstammen isoliert worden. Von diesen erkennen ungefähr 125 eindeutige Sequenzen, während sich der Rest gemeinsame Erkennungsspezifitäten teilt. Restriktionsendonukleasen, welche dieselbe Nukleotidsequenz erkennen, werden "Isoschizomere" genannt. Obwohl die Erkennungssequenzen von Isoschizomeren dieselben sind, können sie bezüglich der Schnittstelle (z.B. Xma I v. Sma I, Endow et al., J. Mol. Biol. 1l2, 521 (1977); Waalwijk et al., Nucleic Acids Res. 5, 3231 (1978)) und der Schnittgeschwindigkeit an verschiedenen Stellen (Xho I v. PaeR7 I, Gingeras et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 402 (l983)) variieren.
Es besteht ein fortdauernder Bedarf für neue Typ II- Restriktionsendonukleasen. Obwohl derzeit Typ II-Restriktionsendonukleasen, welche eine Anzahl von spezifischen Nukleotidsequenzen erkennen, erhältlich sind, stellen neue Restriktionsendonukleasen, die neue Sequenzen erkennen, weitere Gelegenheiten und Möglichkeiten zur genetischen Manipulation zur Verfügung. Insbesondere sind wenige Endonukleasen erhältlich, welche acht bestimmte Nukleotide erkennen. Diese umfassen Not I (GCGGCCGC), Sfi I (GGCCNNNNN GGCC), Pac I (TTAATTAA), Sse8387 I (CCTGCAGG) und Fse I (GGCCGGCC), obwohl Fse I nicht kommerziell erhältlich ist. Typ II-Restriktionsendonukleasen, welche acht Nukleotide erkennen, sind besonders nützlich bei der Manipulation von sehr großen DNA-Molekülen, wie z.B. ganzen Chromosomen, da die Notwendigkeit von acht bestimmten Nukleotiden zum Schneiden bedeutet, daß diese Enzyme weniger oft schneiden und eine kleinere, besser zu handhabende Anzahl von Fragmenten aus einem gegebenen DNA-Molekül erzeugen. Jede neue eindeutige Endonuklease ermöglicht den Wissenschaftlern-DNA an neuen Stellen präzise zu schneiden, mit all den Möglichkeiten, die dies schafft.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine neue Restriktionsendonuklease zur Verfügung gestellt, welche aus Arthrobacter species erhältlich ist, und welche im folgenden als "Asc I" bezeichnet wird, wobei die Endonuklease:
(1) die Nukleotidsequenz GGCGCGCC in einem doppelsträngigen DNA-Molekül, wie unten gezeigt, erkennt:
(wobei G für Guanin und C für Cytosin steht);
(2) die Sequenz an den Phosphodiesterbindungen zwischen dein am zweitweitesten nach 5' hin gelegenen G und dem am weitesten 5' gelegenen C schneidet, wie mit den Pfeilen gezeigt ist; und
(3) doppelsträngige Lambda c1857-DNA an den Positionen 3521 und 16648 schneidet, Adeno2-DNA an den Positionen 15665 und 25337 schneidet, und puc19, pBR322, phiX174, SV40, M13mp18 und T7-Phagen DNAs nicht schneidet.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der neuen Restriktionsendonuklease Asc I, wobei das Verfahren Kultivieren von Arthrobacter species unter Bedingungen, die zum Exprimieren von Asc I geeignet sind, Sammeln der kultivierten Zellen, Erhalten eines zellfreien Extraktes von diesen und Trennen und Sammeln der Restriktionsendonuklease Asc I aus dem zellfreien Extrakt umfaßt.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 Dieses ist ein Autoradiogramm eines Dünnschichtchromatogramms, welches verwendet wurde, um die Asc I-Schnittstelle zu bestimmen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Asc I durch Xultivieren von Arthrobacter species Stamm NEB#688 und Gewinnen der Endonuklease aus den Zellen erhalten. Eine Probe von Arthrobacter species NEB#688 wurde am 21. Dezember 1990 bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und trägt die Hinterlegungsnummer 55134.
Zum Gewinnen des Enzyms der vorliegenden Erfindung kann A. species unter Verwendung von irgendeiner geeigneten Technik kultiviert werden. Beispielsweise kann A. species in einem Medium kultiviert werden, das aus 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 1 g/l Dextrose, 1 g/l MgCl&sub2; 6H&sub2;O (pH 7,2) zusammengesetzt ist, welches unter Schütteln und Belüftung bei 30ºC inkubiert wird. Zellen in der späten logarithmischen Phase des Wachstums werden durch Zentrifugation gesammelt und entweder sofort aufgebrochen (disrupted) oder gefroren bei -70ºC gelagert.
Das Asc I-Enzym kann durch herkömmliche Proteinreinigungstechniken aus A. species isoliert werden. Beispielsweise wird eine Zellpaste in einer Pufferlösung suspendiert und durch Beschallung, Hochdruckdispersion oder enzymatischen Verdau behandelt, um eine Extraktion der Endonuklease durch die Pufferlösung zu erlauben. Intakte Zellen und Zelltrümmer werden dann durch Zentrifugation entfernt, um einen zellfreien Extrakt herzustellen, der Asc I enthält. Die Asc I-Endonuklease wird dann durch Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Molekularsiebchromatographie oder eine Kombination aus diesen Verfahren aus dem zellfreien Extrakt gereinigt, um die Endonuklease der vorliegenden Erfindung herzustellen.
Die Endonuklease der vorliegenden Erfindung, zusammen mit ihrer entsprechenden Methylase, kann ebenfalls erhalten werden, indem rekombinante DNA-Techniken verwendet werden, wie z.B. die Methylierungs-Selektions-Technik, welche von Wilson et al., EP-A-019413, offenbart ist, wobei auf deren Offenbarung hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird. Als ein Beispiel wird DNA aus einem Bakterienstamm, welcher ein R-M-System enthält, wie z.B. A. species, gereinigt, teilweise mit Klonierungs-Endonukleasen verdaut und in einen geeigneten geschnittenen, dephosphorylierten Klonierungsvektor ligiert. Die ligierte DNA wird in einen geeigneten Wirt, wie z.B. E. coli, transformiert, die Transformanten werden gepoolt und die Population an Klonierungsvektoren wird gereinigt, um Bibliotheken zu bilden. Die Klon-Bibliothek wird dann durch Verdauen mit einer Endonuklease herausgefordert, die selektiv Vektoren zerstört, welche die Methylase des R-M-Systems, welches kloniert wird, nicht enthalten und exprimieren. Vektoren, die das interessierende Methylasegen enthalten und exprimieren, werden an den Endonuklease-Erkennungsstellen modifiziert und somit immun gegen ein Schneiden. Die herausgeforderten Klonpools. werden dann in den geeigneten Wirt zurück transformiert, um die nicht verdauten Klone zu gewinnen. Die Transformanten können auf eine Endonukleaseaktivität hin gescreent werden oder durch einen Kreislauf von weiteren Runden von Reinigung und Selektion geführt werden. Schließlich werden einzelne Transformanten selektiert und ihre DNA gereinigt. Diese Klone werden auf eine Resistenz gegenüber einem Schneiden durch die interessierende Endonuklease und auf eine gemeinsame inserierte DNA hin analysiert. Zellextrakte, die aus Transformanten hergestellt wurden, die eine Endonukleaseresistenz zeigen, werden in vitro auf Methyltransferase- und Endonukleaseaktivitäten hin getestet.
Eine Anzahl von R-M-Systemen haben sich gegenüber dem Klonieren durch das Standard-Methylase-Selektionsverfahren als widerspenstig erwiesen. Diese Systeme machen Modifikationen des obigen Ansatzes nötig. Siehe Lunnen et al., Gene 74, 25 - 32 (1988), auf dessen Offenbarung hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird. Beispielsweise können die Endonuklease(n), die verwendet werden um Bibliotheken zu bilden, in einem oder beiden der R-M-Gene schneiden. In einigen Systemen können die Methylase- und Endonukleasegene nicht verbunden sein. In anderen Systemen, wie z.B. BamH I und Dde I, kann entweder aufgrund einer ineffizienten Expression der Methylase in dem Transformationswirt, wegen des inhärenten Kontrollmechanismus für eine Expression der Methylase, oder aus anderen unbekannten Gründen, die Methylase nicht ausreichend gegen ein Schneiden durch die entsprechende Endonuklease schützen. Eine andere potentielle Schwierigkeit ist, daß gewisse Methylierungsmuster in einigen Wirten durch endogene Wirtsrestriktionssysteme, wie z.B. McrA, McrB oder mrr, geschnitten werden können, was zu einer Zerstörung von Methylaseklonen führt. Ein anderes potentielles Problem entsteht, wenn die Endonuklease, die kloniert werden soll, für die Methylaseselektion nicht in ausreichender Menge oder Reinheit zur Verfügung steht. Schließlich werden in vielen Systemen Schwierigkeiten beim Exprimieren des Endonukleasegens in einem Wirt einer unterschiedlichen Bakteriengattung (genus) angetroffen.
Die Erkennungssequenz der Endonuklease der vorliegenden Erfindung kann bestimmt werden, indem die Stellen des Asc I-Schnitts in verschiedenen DNAs kartiert werden und die DNA-Sequenzen dieser Bereiche auf Homologie hin verglichen werden. Es wurde gefunden, daß die Endonuklease Asc I der vorliegenden Erfindung Lambdaphagen c1857-DNA an zwei Stellen schneidet. Diese Schnittstellen wurden in der Nähe-der Positionen 3525 und 16650 kartiert, indem Lambda c1857-DNA gleichzeitig mit Asc I und mit Endonukleasen verdaut wurde, die an bekannten Positionen schneiden, wie z.B. Apa I, SnaB I, Xba I, Xho I, Nhe I, Hind III, BstE II, Eco0109 I, Eag I und Kpn I. Es wurde ebenfalls gefunden, daß Asc I Adeno2-DNA an zwei Stellen schneidet, welche auf ähnliche Weise in der Nähe von 15670 und 25350 kartiert wurden. Es wurde gefunden, daß die Sequenz GGCGCGCC in Lambda bei 3521 und 16648 und in Adeno2 bei 15665 und 25337 auftritt und daß sie nur an diesen Positionen auftritt. Die Sequenz GGCGCGCC tritt in pUC19, pBR322, phiX174, M13mp18, SV40 und T7-Phagen DNAs nicht auf und diese DNAs werden durch Asc I nicht geschnitten. Aus diesem Ergebnis wurde geschlossen, daß Asc I die Sequenz GGCGCGCC erkennt.
Ein Oligonukleotid, welches die Asc I-Erkennungssequenz enthält, AGGCGCGCCT, wurde synthetisiert. Asc I schnitt dieses Oligonukleotid. Dieses Oligonukleotid wurde durch Standardtechniken an der Hinc II-Stelle in pUC19-DNA (ATCC#37254) inseriert, um das Plasmid pklASCI-1 zu bilden. Es wurde gefunden, daß Asc I die pklASCI-1-DNA, aber nicht das anfängliche pUC19-Plasmid schneidet. pklASCI-1 wurde verwendet, um die Lage des Schnittes innerhalb der Erkennungssequenz zu bestimmen, wie auch der Schnitt des Linkers allein, und die Schnittergebnisse bestätigten, daß Asc I die Sequenz GGCGCGCC erkennt.
Der Schnittpunkt innerhalb der Asc I-Erkennungssequenz kann durch Dideoxysequenzieranalyse der terminalen Basensequenz, welche aus dem Asc I-Schnitt von pklASCI-1 erhalten wird, bestiinmt werden (Sanger, F. et al., PNAS 74, 5463 - 5467, (1977), Brown, N.L. et al., J. Mol. Biol. 140, 143 - 148 (1980)) oder durch Analyse der Produkte aus dem Asc I- Schnitt eines markierten Oligonukleotids, welches die Asc I-Erkennungssequenz enthält. Durch die in der obigen Referenz angegebenen Verfahren (beispielhaft dargestellt in Beispiel II) wurde gefunden, daß Asc I die Phosphodiesterbindung zwischen dem am zweitweitesten nach 5' hin liegenden G und dem am weitesten nach 5' hin liegenden C in der Erkennungssequenz GG/CGCGCC schneidet, um eine einzelsträngige Extension von 4 Basen nach 5' hin zu erzeugen, wie durch die Pfeile gezeigt ist:
5' GG CGCGCC 3'
3' CCGCGC GG 5'
Das Enzym der vorliegenden Erfindung hat ebenfalls die folgenden Eigenschaften:
(a) Optimale Pufferzusammensetzung: Der optimale getestete Puffer war 50 mM Kaliumacetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesiumacetet, 1 mM Dithiothreitol (pH 7,9 bei 25ºC). Die relative Aktivität in einem Puffer, der aus 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7,9 bei 25ºC) oder 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7,9 bei 25ºC) zusammengesetzt war, betrug 25% und weniger als 5% in einem Puffer, der aus 10 mM Bis-Tris-Propan-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT (pH 7,0 bei 25ºC) zusammengesetzt war.
(b) Wärmeinaktivierung: 2,5 Einheiten von Asc I können bei 65ºC in zwanzig Minuten inaktiviert werden.
(c) Enzymstabilität: 0,13 Einheiten von Asc I schneidet 1 ug Lambdaphagen-DNA, welche mit 50 ul 50 mM Kaliumacetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol (pH 7,9 bei 25ºC) gemischt ist, vollständig in sechzehn Stunden bei 37ºC.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen, wie sie derzeit in der Praxis bevorzugt wird. Man wird verstehen, daß die Beispiele veranschaulichend sind und daß die Erfindung, außer wie in den angefügten Ansprüchen angegeben, nicht als beschränkt angesehen werden soll.

Beispiel I

HERSTELLUNG VON Asc I-ENDONUKLEASE

Arthrobacter species Stamm NEB 688 (ATCC# 55134) wurde in einem Medium kultiviert, das aus 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 1 g/l Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 1 g/l Glucose (eingestellt auf pH 7,2) bestand. Die Zellen wurden bei 30ºC unter Belüftung und Schütteln bis zur späten logarithmischen Phase inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und gefroren bei -70ºC 35 gelagert.
322 g der oben erhaltenen Zellen wurden in zwei Volumen Puffer A (20 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 6 mM 2-Mercaptoethanol, pH 7,9) suspendiert, welcher auf 0,3 M NaCl eingestellt war. Lysozym wurde bis auf 0,2 mg/ml zugegeben und die Lösung wurde mechanisch 16 Stunden lang bei 4ºC gerührt. Die Zellsuspension wurde 4-mal bei 75.841.700 Pa (11.000 PSI) durch eine Gaulin-Presse geführt. Ungefähr 12,3 mg an Protein/g an Zellen wurde freigesetzt. Das Lysat wurde 40 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert (Sharpless). Das Überstandsvolumen betrug 800 ml bei pH 6,6. Das Gewicht der Trümmer betrug 130 g. Der Überstand enthielt 400.000 Einheiten an Asc I-Aktivität.
Die Überstandslösung wurde auf eine DEAE-Sepharosesäule (314 ml, äquilibriert in Puffer A, welcher auf 0,3 M NaCl eingestellt war) aufgetragen. Der Durchfluß wurde als Batch gesammelt. Der DEAE-Durchfluß enthielt 400.000 Einheiten an Asc I-Aktivität in 800 ml.
Zu dem Durchfluß wurden 1600 ml Puffer B (20 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 6 mM 2-Mercaptoethanol, pH 7,5) zugegeben. Diese Lösung wurde auf eine 150 ml Heparin-Sepharosesäule aufgetragen, die mit Puffer B, welcher auf 0,1 M NaCl eingestellt war, äquilibriert war. Die Säule wurde mit 300 ml Puffer B, welcher auf 0,1 M NaCl eingestellt war, gewaschen. Das Enzym wurde mit einem 1500 ml Gradienten von 0,1 M bis 1 M NaCl in Puffer B eluiert. Die Fraktionen wurden, wie unten beschrieben, auf eine Asc I- und eine Exonukleaseaktivität hin getestet. Die Asc I-Aktivität eluierte bei ungefähr 62% des Gradientenvolumens. Zweihundert ml, die 400.000 Einheiten an Asc I-Aktivität enthielten, wurden gepoolt und gegen Puffer C (20 ml KPO&sub4;, 0,1 mM EDTA, 6 mM 2-Mercaptoethanol, pH 6,8), welcher auf 0,1 M NaCl eingestellt war, dialysiert. Eine Exonukleaseaktivität eluierte bei ungefähr 42% des Gradientenvolumens.
Das Dialysat wurde auf eine 59 ul Phosphocellulosesäule aufgetragen, die mit Puffer C, welcher auf 0,1 M NaCl eingestellt war, äquilibriert war. Die Säule wurde mit Puffer C, welcher auf 0,1 M NaCl eingestellt war, gewaschen und das Asc I-Enzym wurde mit einem 600 ml Gradienten von 0,1 bis 1,0 M NaCl in Puffer C eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden auf Asc I und eine nichtspezifische Endonukleaseverunreinigung hin getestet, wie unten beschrieben. Die Asc I-Aktivität eluierte von 38 bis 47% des Gradientenvolumens. Eine Endonukleaseverunreinigung eluierte von 44 bis 47% des Gradientenvolumens. Asc I-Aktivität (180.000 Einheiten) von 38 bis 43% wurden gepoolt und es wurde gefunden, daß diese im wesentlichen frei von verunreinigender Endonuklease und Exonuklease waren. Das erhaltene Asc I war im wesentlichen rein. BSA wurde als ein Stabilisator bis zu einer Endkonzentration von 200 ug/ml zugegeben und das Asc I wurde gegen einen Aufbewahrungspuffer (50% Glycerol, 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 1,0 mM Dithiothreitol, pH 7,5) dialysiert. Der Endpool von Asc I enthielt 144.000 Einheiten, was eine 36%ige Rückgewinnung darstellt.

Aktivitätsbestimmung

Asc I-Aktivität: Proben von 1 bis 10 ul wurden zu 25 ul einer Substratlösung, bestehend aus lX 50 mM Kaliumacetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol (pH 7,9 bei 25ºC), welche 0,5 ug Lambdaphagen-DNA enthielt, zugegeben. Die Reaktion wurde 5 bis 60 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 ul einer Stoplösung (50% Glycerol, 50 mM EDTA, pH 8,0 und 0,02% Bromphenolblau) beendet. Die Reaktionsmischung wurde auf ein 0,7%iges Agarosegel aufgetragen und es wurde damit eine Elektrophorese durchgeführt. Die erhaltenen Banden wurden im Vergleich mit DNA-Größenstandards identifiziert.
Exonukleaseaktivität: Eine 5 ul Probe der Proteinlösung wurde zu 50 ul 50 mM Kaliumacetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol (pH 7,9 bei 25ºC) zugegeben, welche 25 ug/ml 3H-DNA enthielt. Die Reaktion wurde eine Stunde lang inkubiert und die Anzahl an TCA-löslichen und unlöslichen Zählimpulsen verglichen. Es wurde gefunden, daß die obige Probe (25 Einheiten) weniger als 0,1% der Radioaktivität solubilisiert.
Übernachttest für verunreinigende Endonukleasen: Fünfundzwanzig Einheiten von Asc I, welche über Nacht mit Lambda-DNA inkubiert wurden, zeigten im Agarosegeltest dasselbe DNA-Bandenmuster wie eine Einheit von Asc I, welche eine Stunde lang mit Lambda-DNA inkubiert wurde.
Definition der Einheit: Eine Einheit von Asc I ist definiert als die Menge an Asc I, welche benötigt wird, um 1,0 ug Lambda-DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 ul 50 mM Kaliumacetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Nagnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol (pH 7,9 bei 25ºC), innerhalb einer Stunde bei 37ºC vollständig zu schneiden.
Optimale Pufferbedingungen: Für optimale Asc I-Aktivität wurde 50 mM Kaliumacetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol (pH 7,9 bei 25ºC) verwendet.

Beispiel II

BESTIMMUNG DER Asc I-SCHNITTSTELLE

Die Lage des Asc I-Schnittes bezogen auf die Erkennungssequenz wurde auf zwei Weisen bestimmt: Standard-Dideoxysequenzieren mit Schnitt eines Primer-Extensionsproduktes und Schnitt eines endmarkierten Oligonukleotids.

A. DIDEOXYSEQUENZIERVERFAHREN

Wie oben angegeben wurde ein Oligonukleotid-Linker mit zehn Basen, welcher die Asc I-Erkennungssequenz enthielt, 5' AGGCGCGCCT 3', an der Hinc II-Stelle in pUC19 inseriert, um das Plasmid pklAscI-1 zu bilden. Dieses Plasmid wurde dann verwendet, um die Asc I-Schnittstelle durch das Primerextensionsprotokoll wie folgt zu bestimmen.

DENATURIEREN DER DOPPELSTRÄNGIGEN MATRIZE:

3 ug des durch Cäsium gereinigten Plasmides pklASCI-1 (der Matrize) wurden in einer Gesamtmenge von 20 ul dH&sub2;O in einem 1,5 ml Eppendorfröhrchen gelöst. 2 ul 2 M NaOH, 2 mM EDTA wurden zugegeben und die Lösung wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, worauffolgend 7 ul dH&sub2;O (4ºC), 7 ul 3 M Na-Acetat pH 6,0 (4ºC) und 75 ul Ethanol (4ºC) rasch zugegeben wurden. Die Lösung wurde sofort 15 Minuten lang in ein Trockeneis/2-Propanol-Bad gestellt, um die DNA zu fällen. Die DNA wurde durch eine 10 Minuten lange Zentrifugation in einer Eppendorf zentrifuge pelletiert, 95% des Überstandes wurden durch Absaugen entfernt, 300 ul von 70% ETOH/30% dH&sub2;O wurden zugegeben und die Lösung wurde 5 Minuten lang zentrifugiert, gefolgt von dem Entfernen von ungefähr 95% des Überstandes. Das Pellet wurde dann 10 Minuten lang in einem Speed-Vac-Gerät vollständig getrocknet.

SEQUENZIERREAKTIONEN:

Zu dem getrockneten Pellet wurden 13,5 ul dH2O, 2,25 ul 10X Sequenzierpuffer (75 mM Tris pH 7,6, 55 mM DTT, 50 mM MgCl&sub2;) und 1,5 ul Primer(New England Biolabs, Inc. Katalog #1211)-Lösung mit einer Konzentration von 1,0 uM zugegeben. Die Lösung wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, um den Primer anzulagern (anneal). 3 ul [a-35S] dATP mit 800 Ci/mmol, 10 mCi/ml wurden zugegeben. 1,5 ul (7,5 Einheiten) Klenow-Fragment DNA-Polymerase (New England Biolabs, Inc. Katalog #210) wurden zugegeben. Diese Lösung wird die TPK- Mischung genannt. 3,2 ul der TPK-Mischung wurden für die A-, C-, G- und T-Sequenzierreaktionen zu 3 ul der Deoxy/Dideoxy-Nukleotid-Reaktionsmischungen (New England Biolabs, Inc. Katalog # 410) aliquotiert. Die zurückbleibende TPK- Mischung wurde zu 9 ul des A-Sequenzierreaktionsmixes, welcher keine Dideoxynukleotide enthielt, zugegeben, um einen markierten DNA-Strang zu erzeugen, welcher sich über die Asc I-Erkennungsstelle hinweg ausdehnte. Die Reaktionen wurden 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. 1 ul der dNTP Chase-Lösung (New England Biolabs, Inc. Katalog #410.) wurde zu den A-, C-, G- und T-Reaktionen zugegeben und 3 ul Chase wurden zu der Extensionsreaktion zugegeben. Die Reaktionen wurden weitere 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. 6 ul Stoplösung (New England Biolabs, Inc. Katalog #410) wurden zu den A-, C-, G- und T-Sequenzierreaktionen zugegeben und diese wurden bis zu dem Lauf auf einem Sequenziergel bei -20ºC gelagert. Die Extensionsreaktion wurde 25 Minuten lang bei 70ºC inkubiert, um die DNA-Polymerase (Klenow) zu inaktivieren, dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 9 ul der Extensionsreaktion wurden in ein 0,5 ml Eppendorfröhrchen gegeben und 6 ul wurden in ein zweites Röhrchen gegeben. Zu dem 9 ul Röhrchen wurde 1 ul (1 Einheit) Asc I-Endonuklease zugegeben. Die Reaktion wurde gemischt und 2 ul wurden auf das zweite Röhrchen übertragen. Die Enzymverdau-Reaktionen wurden 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Gefolgt auf den Verdau wurden 4 ul der Reaktionen entfernt und mit 5 ul Stoplösung gemischt. Zu den zurückbleibenden 4 ul wurden 0,25 ul (1,25 Einheiten) Klenow-Fragment zugegeben und die Reaktion wurde 12 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, worauf 5 ul Stoplösung zugegeben wurden. Die Enzymverdau-Reaktionen wurden vor der Elektrophorese ebenfalls bei -20ºC gelagert. Mit den Reaktionsprodukten wurde auf einem 8%igen Bisacrylamid-Sequenziergel eine Elektrophorese durchgeführt, wobei die Asc I- Verdaus der Extensionsreaktion neben dem Satz an Sequenzierreaktionen lagen, die mit demselben Primer erzeugt wurden.
Der Verdau des Extensionsreaktionsproduktes mit Asc I-Endonuklease erzeugte eine Bande, welche zusammen mit dem zweiten Nukleotid der Asc I-Erkennungssequenz GGCGCGCC wanderte. Eine Behandlung mit Klenow-Fragment, welche auf den Asc I-Verdau folgte, erzeugte eine Fragment, das zusammen mit dem sechsten Nukleotid in der Asc I-Erkennungssequenz GGCGCGCC wanderte. Diese Ergebnisse zeigen, daß Asc I eine DNA zwischen der zweiten und dritten Base in ihrer Erkennungssequenz 5' GG/CGCGCC 3' schneidet, um eine 5'-Extension von vier Basen zu erzeugen.
B. Asc I-Schnittstellenbestimmung unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids
Das Oligonukleotid AGGCGCGCCT wurde von der organischen Syntheseabteilung von New England Biolabs erhalten und an dem 5'-terminalen Nukleotid unter Verwendung von ³²P-ATP und T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs, Katalog # 201 wie von der Literatur des Herstellers beschrieben) markiert. Dieses Oligonukleotid ist mit sich selbst komplementär und bildet einen Duplex, welcher die Erkennungssequenz für Asc I enthält.
³²P - AGGCGCGCCT
TCCGCGCGGA- ³²P
Das markierte Oligonukleotid wurde mit Asc I unter den folgenden Reaktionsbedingungen inkubiert: 1 ug des Dodecamers wurde in 100 ul Puffer (70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM bTT) und 5 Einheiten Asc I 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch DEAE-Dünnschichtchromatographie (Polygram CEL 300 DEAE-Machery-Nagel), welche in 2% teilweise hydrolysierter RNA in 7 M Harnstoff, pH 7, bei 55ºC entwickelt wurde, analysiert. d(AG) (Bahn b), d(AGG) (Bahn c) und d(AGGC) (Bahn d) wurden mit Polynukleotidkinase mit ³²P markiert und als Standards verwendet. In einer getrennten Reaktion wurde BssH II (20 Einheiten, New England Biolabs) ebenfalls mit dem markierten Dodecamer inkubiert und diese Reaktion wurde ebenfalls analysiert (Bahn f). Das Autoradiogramm der Dünnschichtplatte ist in Figur 1 gezeigt. Bahn a ist das nicht umgesetzte 10mer, Bahn g ist eine Mischung aus den d(AG)-, d(AGG)- und d(AGGC)-Oligonukleotiden. Die Mobilität des markierten Produktes aus der Asc I-Reaktion (Bahn e) ist identisch mit dem 3mer, d(AGG) (Bahn c), und dem markierten Produkt der BssH II-Reaktion (Bahn f), was zeigt, daß Asc I DNA zwischen der zweiten und dritten Base in ihrer Erkennungssequenz 5' GG/CGCGCC 3' schneidet, um eine 5'-Extension von vier Basen zu erzeugen. Diese Ergebnisse sind mit den Dideoxy-Sequenzierreaktionen in Teil A dieses Beispiels konsistent.

Claims

1. Eine TypII Restriktionsendonuclease erhältlich aus Arthrobacter species (ATCC# 55134), die in doppelsträngigen Desoxyribonucleinsäuremolekülen die folgende Basensequenz erkennt:

5' - G G C G C G C C - 3'

3' - C C G C G C G G - 5'

und eine durch die Pfeile definierte Schnittstelle aufweist.

2. Die TypII Restriktionsendonuclease nach Anspruch 1, welche doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure lambda cI857 und Adeno-2 an zwei Stellen schneidet.

3. Ein Verfahren, um die TypII Restriktionsendonuclease nach Anspruch 1 zu erhalten, umfassend:

Kultivieren einer Probe von Arthrobacter species unter Bedingungen, welche die Produktion der Endonuclease begünstigen, und

Abtrennen der Endonuclease daraus.

4. Die TypII Restriktionsendonuclease nach Anspruch 1, wobei die Restriktionsendonuclease durch 25 Minuten Inkubation bei 65ºC inaktiviert wird.

5. Die TypII Restriktionsendonuclease nach Anspruch 1, wobei die Restriktionsendonuclease aus Arthrobacter species (ATCC# 55134) gereinigt wird.