DE69107263T2

DE69107263T2 - Klonierung der Sac-II-Restruktionsendonuklease und Methylase.

Info

Publication number: DE69107263T2
Application number: DE69107263T
Authority: DE
Inventors: Ellen Guthrie; Marta Meda
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1991-08-28
Publication date: 1995-08-03
Anticipated expiration: 2011-08-29
Also published as: DE69107263D1; JPH04349886A; EP0475195A2; EP0475195B1; DE475195T1; US5288696A; EP0475195A3; JP3071892B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes DNA-Segment, welches für die Sac II-Restriktionsendonuklease codiert, wobei das isolierte DNA-Segment aus S. achromogenes ATCC Nr. 12767 erhältlich ist. Bei dem Beginn des Klonierungsprojektes war es nicht bekannt, welche Endonukleasen oder Bedingungen beim Klonieren des Sac II-Restriktions- Modifikations-Systems erfolgreich sein würden, noch, wo die Restriktions- und Modifikationsgene innerhalb solcher Klone liegen würden. Die Klonierungsergebnisse und das nachfolgende Kartieren und die Charakterisierung der Klone, welche in Fig. 1A und Beispiel I beschrieben ist, zeigen den vorher unbekannten direkten Weg zum Klonieren und Exprimieren des Sac II-Restriktions-Modifikations-Systems.
Insbesondere erwies sich das Klonieren der Sac II-Restriktions-Modifikations-Gene aus Streptomyces achromogenes in E. coli durch die Entdeckung als kompliziert, daß, ungleich zu vielen anderen Typ II-Restriktions-Modifikations-Systemen, Sac II-Gene nicht gut in E. coli exprimieren. Da eine Methylaseselektion (die Identifizierung von Methylaseklonen durch ihre Fähigkeit, einem Sac II-Verdau zu widerstehen und diesen zu überleben) auf einer Methylaseexpression beruht, ist die Selektion auf die Sac II-Methylase nicht immer erfolgreich.
Es wurde ebenfalls gefunden, daß die Expression des Sac II- Restriktionsendonukleasegens ein Problem darstellt. Methylaseklone aus vielen anderen Typ II-Restriktions-Modifikations-Systemen können mit in-vitro Tests auf Restriktionsendonukleaseaktivität hin gescreent werden. Jedoch exprimierte keiner der Sac II-Restriktions-Modifikations-Klone eine Endonukleaseaktivität, welche durch in-vitro Tests nachweisbar war, wie z.B. dem Test, welcher in der oben angeführten EPA-Veröffentlichung 0 193 413 beschrieben ist, selbst nach Konzentrieren des rohen Zellextrakts über Phosphocellulosesäulen. Um zu bestimmen, ob das R-Gen in den M- Klonen vorhanden war, wurden zahlreiche zusätzliche Schritte benötigt. Die Schritte umfaßten: a) Klonieren von chromosomaler S. achromogenes DNA auf beiden Seiten des M-Gens (EcoR V- und Pst I-Klone), b) Subclonieren dieser Methylaseklone in einen Streptomyces-Klonierungsvektor und Transformieren dieser Plasmide in Streptomyces lividans. Auf diese Weise wurde gefunden, daß die EcoR V-Methylaseklone das R-Gen tragen, wogegen bei dem anderen Methylaseklon gefunden wurde, daß er das R-Gen nicht trägt. Um eine Überexpression der Sac II-Restriktionsendonuklease zu erhalten, wurden kleinere Subklone in S. lividans erzeugt.
Das hierin beschriebene Verfahren, durch welches das Sac II-Restriktionsgen und Methylasegen vorzugsweise kloniert und exprimiert werden, ist in den Fign. 1A und 1B dargestellt und umfaßt die folgenden Schritte:
1. Streptomyces achromogenes (ATCC Nr. 12767) wird in einem Nährmedium mit 68 g/l Sucrose, 0,2 g/l MgCl&sub2;, 5 g/l Glucose, pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt, kultiviert und unter Belüftung und Schütteln wachsen gelassen. Die Zellen werden lysiert und die genomische DNA durch die Techniken gereinigt, welche von Caserta, M. et al., J. Biol. Chem. 262, 4770-4777 (1987) beschrieben werden, und wird in dem Beispiel im Detail beschrieben.
2. Die chromosomale S. achromogenes-DNA wird vollständig und teilweise mit einer Restriktionsendonuklease, wie Z.B. Pst 1, verdaut. Andere Restriktionsenzyme, wie z.B. Sca I und EcoR V, können ebenfalls verwendet werden.
3. Die verdauten DNAs werden jeweils in einen Klonierungsvektor ligiert, wie z.B. pJRD184 (Davidson et al., Gene 39, 299-304 (1984)), welcher wenigstens eine Sac II-Stelle enthält. Andere Klonierungsvektoren, wie z.B. pACYC184 und pACYC177 (Chang, ACY, J. Bact. 134, 1141-1156 (1978)) können ebenfalls verwendet werden. Die resultierenden Mischungen werden verwendet, um einen geeigneten Wirt, wie z.B. Zellen von E. coli Stamm RR1 oder K802 (ATCC Nr. 31343 bzw. ATCC Nr. 33526), zu transformieren. RR1, welche mrr&supmin; sind, ist die bevorzugte Wirtszelle.
4. Die DNA/Zellmischungen werden vorzugsweise auf Antibiotika-Medien plattiert, welche selektiv für transformierte Zellen sind, wie z.B. Ampicillin oder Chloramphenicol. Nach der Inkubation werden die transformierten Zellkolonien zusammen gesammelt, um die ersten Zellbibliotheken zu bilden.
5. Die rekombinanten Plasmide werden in toto aus den ersten Zellbibliotheken gereinigt, um erste Plasmidbibliotheken zu erzeugen.
6. Die Plasmidbibliotheken werden dann vollständig in-vitro mit Sac II-Restriktionsendonuklease verdaut, welche unter Verwendung von Standardreinigungstechniken aus Streptomyces achromogenes-Zellen hergestellt wird. Sac II-Restriktionsendonukleaseverdau bewirkt die selektive Zerstörung von unmodifizierten, nicht Methylase-haltigen Klonen, was zu einem Anwachsen der relativen Häufigkeit von Sac II-Methylase-haltigen Klonen führt.
Exonuklease und/oder Phosphatase können ebenfalls zu dem Verdau zugegeben werden, um die Zerstörung von nicht- Methylaseklonen zu verstärken.
7. Identifizierung von Sac II-Methylaseklonen: Die DNAs aus der verdauten Plasmidbibliothek werden in einen geeigneten Wirt, wie z.B. E. coli Stamm RR1 oder K802 zurücktransformiert und transformierte Kolonien werden wieder durch Plattieren auf Antibiotika-Platten erhalten. DNA aus einzelnen Kolonien wird auf die folgende Weise auf die Gegenwart des Sac II-Modifikationsgens hin analysiert: Die Plasmid-DNA, die sie enthalten, wird gereinigt und in-vitro mit Sac II-Restriktionsendonuklease inkubiert, um zu bestimmen, ob sie resistent gegenüber einem Verdau mit Sac II ist. Die Plasmid-DNA sollte vollständig oder im wesentlichen resistent gegenüber einem Verdau sein. Die gesamte zelluläre DNA (chromosomale und Plasmid-) des Klons wird ebenfalls gereinigt und mit Sac II-Restriktionsendonuklease inkubiert. Ein weiterer Beweis, daß das Methylasegen kloniert wurde, umfaßt ein Deletieren des Inserts und Überprüfen des zurückbleibenden Vektors auf die Gegenwart von intakten Sac II-Stellen.
8. Wenn einmal festgestellt war, daß das Methylasegen kloniert wurde, wird der Klon auf Sac II-Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet. Wenn eine Aktivität nachgewiesen wird, dann ist das Sac II-Restriktionsgen mit dem Methylasegen verbunden und ist in dem Klon vorhanden. In einem solchen Fall könnte man dann auf Schritt 15 unten übergehen. Jedoch wurde gemäß der vorliegenden Erfindung gefunden, daß selbst wenn es vorhanden ist, das Restriktionsgen nicht ohne weitere genetische Manipulation, wie unten diskutiert, exprimiert wird. Das Fehlen von Restriktionsaktivität zeigt, daß entweder das Restriktionsgen nicht mit dem Methylasegen verbunden ist, oder es verbunden, aber nicht intakt mit dem Methylasegen kloniert ist, oder es intakt kloniert ist aber nicht exprimiert wird. Um zu bestimmen, welche von den drei obigen Möglichkeiten die wahre Situation ist, wird das klonierte Fragment durch Restriktion kartiert und es werden Deletionen gemacht, um zu bestimmen, wo das Methylasegen innerhalb des klonierten Fragmentes liegt. Die Information wird dann verwendet, um zu bestimmen, ob genügend DNA auf jeder Seite des Methylasegens vorhanden ist, um ein Restriktionsgen zu codieren, wenn es damit verbunden wäre. Wenn genügend Raum da ist, wird angenommen, daß das Restriktionsgen nicht verbunden ist, oder in dem Klon vorhanden ist aber nicht exprimiert wird (und man könnte auf Schritt 10 übergehen). Wenn nicht genügend Raum auf beiden Seiten des Methylasegens in der klonierten DNA vorhanden ist, um ein damit verbundenes Restriktionsgen zu codieren, wie es für den Pst I-Klon der vorliegenden Erfindung gefunden wurde, wird ein Teil des Methylasegens verwendet, um Verdaus des Sac II-Chromosoms zu sondieren, um eine genomische Karte der Region, welche sich zwischen den Grenzen der existierenden klonierten DNA ausdehnt, zu erzeugen. Diese Daten helfen, bestimmte Endonukleasen zu identifizieren, welche die Restriktions-Modifikations-Region in einzelne Fragmente spalten, welche das Methylasegen wie auch größere Mengen von benachbarter DNA enthalten. Die exakten Größen der durch solche Endonukleasen erzeugten Fragmente sind ebenfalls aus den Daten bekannt. Wenn gefunden wird, daß die Restriktions- und Modifikationsgene verbunden sind, würden solche Fragmente vermutlich ebenfalls das Restriktionsgen codieren.
9. Bibliotheken werden angelegt, indem genomische DNA aus S. achromogenes mit Restriktionsendonukleasen verdaut wird, welche durch Southern Blot-Analyse identifiziert wurden, daß sie Fragmente erzeugen, welche das intakte Sac II- Restriktions-Modifikations-System codieren könnten. Diese Fragmente werden in einen geeigneten Vektor, wie z.B. pUC19 (ATCC Nr. 37017), ligiert. Dieser wird verwendet, um einen geeigneten Wirt, wie z.B. E. coli Stamm RR1, zu transformieren. Klone, welche das Methylasegen und benachbarte DNA enthalten, werden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung eines Teils des Methylaseklons als Sonde identifiziert. Wenn sie einmal isoliert sind, werden diese Klone auf ihre Fähigkeit hin analysiert, Sac II-Methylase und Restriktionsendonuklease zu erzeugen.
10. Identifizierung von Restriktionsgenklonen: Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß Klone, welche das Sac II-Restriktionsendonukleasegen enthalten, aufgrund der geringen Expression des Gens in E. coli nicht durch den gewöhnlichen Test an rohem Zellextrakt identifiziert werden können. Daher werden Subklone konstruiert, welche verwendet werden können, um einen Wirt zu transformieren, welcher näher mit S. achromogenes verwandt ist als E. coli. Die DNA-Fragmente, welche die inserierte DNA enthalten, werden aus dem E. coli-Vektor isoliert und in einen Streptomyces- Klonierungsvektor, wie z.B. pIJ486 (Ward, J.M. et al., Mol. Gen. Genet. 203, 468-478) ligiert. Die Ligationsmischung kann dann verwendet werden, um Protoplasten eines geeigneten Wirtes, wie z.B. S. lividans TK24, gemäß dem Verfahren von Hopwood, D.A. et al., Genetic Manipulation of Streptomyces, a Laboratory Manual, auf dessen Offenbarung hier vollinhaltlich Bezug genommen wird, zu transformieren.
11. Die DNA/Zellmischungen werden vorzugsweise auf Regenerationsmedien plattiert. Wenn sie einmal regeneriert sind, werden die Transformanten mit einem Antibiotikum, wie z.B. Thiostrepton, selektiert. Nach einer Inkubation können die transformierten Zellkolonien gepickt und ausgestrichen werden, um isolierte Kolonien zu erhalten.
12. Die rekombinanten Plasmide werden von mehreren der Transformanten gereinigt.
13. Die Plasmide werden dann mit Sac II verdaut und auf einem Agarosegel untersucht, um zu bestimmen, ob die Klone eine Methylaseaktivität haben. Sie werden ebenfalls mit anderen Restriktionsendonukleasen verdaut, um sicherzustellen, daß das richtige Fragment kloniert wurde.
14. Wenn die Klone eine Methylaseaktivität haben, werden mehrere dieser Klone einzeln in flüssigem Vollmedium kultiviert. Rohextrakte der Methylaseklone werden hergestellt und auf eine Sac II-Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet.
15. Eine Restriktionskarte wird angefertigt und verschiedene Subklone werden in E. coli und in S. lividans konstruiert, um die Lage der intakten Sac II-Methylase- und Restriktionsendonukleasegene zu bestimmen. Jeder Subklon wird auf eine Überexpression des Sac II-Restriktionsendonukleasegens hin getestet.
16. Herstellung: In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Sac II-Methylase oder -Endonuklease aus transformierten Wirtszellen hergestellt werden, welche mit einem oder mehreren Plasmidklonen transformiert wurden, die das Sac II- Modifikationsgen und das überexprimierte Restriktionsgen enthalten, indem diese in einem Fermenter in einem Vollmedium, welches Thiostrepton enthält, vermehrt werden. Die Zellen werden danach durch Zentrifugation geerntet und in einer French-Presse aufgeschlossen, um einen rohen Zellextrakt herzustellen, welcher Sac II-Methylase- und Restriktionsendonukleaseaktivität enthält. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die Wirtszelle durch eine Transformation mit Plasmiden, welche das Methylasegen enthalten, im Voraus geschützt werden, gefolgt von einer Einführung von Plasmiden, welche das Endonukleasegen enthalten.
17. Reinigung: Der rohe Zellextrakt, welcher die Sac II- Methylase und Endonuklease enthält, wird durch Standardproduktreinigungstechniken, wie z.B. Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie, gereinigt.
18. Es wird gefunden, daß die so gereinigte Endonuklease frei von anderen verunreinigenden Enzymen ist, einschließlich Sac I und Sac III und im wesentlichen frei von nicht spezifischen Nukleasen ist.
Obwohl die oben ausgeführten Schritte die bevorzugte Weise zum Ausführen der vorliegenden Erfindung darstellen, wird es den Fachleuten klar sein, daß der oben beschriebene Ansatz gemäß den im Stand der Technik bekannten Techniken variieren kann.
Das folgende Beispiel wird angegeben, um Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen, wie sie derzeit in der Praxis bevorzugt ist. Man wird verstehen, daß dieses Beispiel zur Anschauung dient und daß die Erfindung nicht als darauf beschränkt angesehen werden soll, außer wie in den angefügten Ansprüchen angegeben.

Beispiel I

Klonieren von Sac II-Modifikationsmethylase- und Restriktionsendonukleasegenen

1. S. achromogenes DNA-Reinigung: 10 g eingefrorene Streptomyces achromogenes Zellen (ATCC #12767) wurden 1 Stunde lang auf Eis aufgetaut, dann in 20 ml 25% Sucrose, 50 mM Tris pH 8,0 resuspendiert. 10 ml 0,25 M EDTA pH 8,0 und 6 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris pH 8,0 wurden zugegeben. Die Suspension wurde 2 Stunden lang auf Eis gehalten, dann durch die Zugabe von 24 ml 1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 8,0, 67 mM EDTA und 5 ml 10% SDS lysiert. Die Lösung wurde mit 70 ml Phenol (welches vorher mit 0,5 M Tris pH 8,0 äquilibriert wurde) und 70 ml Chloroform extrahiert. Die Emulsion wurde 30 Minuten lang bei 10 K Upm zentrifugiert und die viskose obere Schicht wurde abgezogen. Die Schicht wurde erneut mit Phenol/Chloroform extrahiert und die Emulsion wurde wieder zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die obere Schicht wurde abgezogen und gegen vier Wechsel von 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde dann mit RNase bei einer Endkonzentration von 100 ug/ml 1 Stunde lang bei 37ºC verdaut. Die DNA wurde dann gefällt, indem NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M zugegeben wurde, mit 0,55 Volumen Isopropylalkohol überschichtet wurde, die Phasen zusammengemischt wurden, und die DNA wurde auf einem Glasstab aufgewickelt. Die DNA wurde in DNA-Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert und bei 4ºC gelagert.
2. Teilweiser Verdau von S. achromogenes-DNA: 200 ug von S. achromogenes-DNA wurden in 2 ml von Restriktionsendonuklease-Verdaupuffer (10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2- Mercaptoethanol, 100 mM NaCl) verdünnt. Die Lösung wurde auf 5 Röhrchen verteilt, 300 ul in das erste Röhrchen und 150 ul in jedes der verbleibenden Röhrchen. 210 U von Pst I (10 ul) wurden in das erste Röhrchen gemischt, um 7 U Enzym/kg DNA zu erreichen; 150 ul wurden abgezogen und in das zweite Röhrchen (3,5 U/ug) übertragen. 150 ul wurden dann aus dem zweiten Röhrchen abgezogen und in das dritte Röhrchen übertragen, und so weiter, wobei jede Übertragung eine zweifache reihenweise Verdünnung von Pst I bewirkte. Die Röhrchen wurden 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, dann 15 Minuten lang bei 72ºC erwärmt, um die Reaktionen zu stoppen. 5 ul aus jedem Röhrchen wurden durch eine Elektrophorese auf Agarosegel analysiert. Röhrchen, in welchen ein mäßiger aber unvollständiger Verdau auftrat, wurden vereinigt. Zwei zusätzliche Verdaureihen wurden auf eine ähnliche Weise unter Verwendung von Sau3A und EcoR I durchgeführt.
3. Ligation und Transformation: 6 ug (60 ul) Pst I-verdaute S. achromogenes-DNA wurden mit 3 ug (6 ul) Pst I-gespaltenem und dephosporyliertem pJRD184 (erhalten von Labofina s.a. aus Feluy, Belgien. pJRD184 ist in der Veröffentlichung: Davidson et al., Gene 39, 299-304 (1984) beschrieben) gemischt. 20 ul 500 mM Tris pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT, 5 mM ATP und 106,5 ul steriles destilliertes Wasser wurden zugegeben, um ein Volumen vom 192,5 ul zu erhalten. 7,5 ul T4-DNA-Ligase wurden zugegeben und die Lösung wurde über Nacht bei 17ºC inkubiert. Die Lösung wurde durch Extraktion mit 10 ul chloroform sterilisiert, dann durch eine Mikrozentrifugation für 15 Sekunden aufgeklart. 70 ul der Ligationslösung wurden mit 1,0 ml 50 mM NaCl, 5 mM Na&sub3;- Citrat, 67 mM CaCl&sub2; gemischt und 2,0 ml eiskalte kompetente E. coli K802(ATCC Nr. 33526)-Zellen wurden zugegeben. Die Lösung wurde 5 Minuten lang bei 44ºC inkubiert, dann wurden 12,5 ml Luria-Nährmedium (L-Nährmedium) zugegeben und die Inkubation wurde 3 Stunden lang bei 37ºC fortgesetzt. Ähnliche Ligationen wurden ebenfalls mit dem Sau3A-Verdau von S. achromogenes-DNA und BamH I-verdautem pJRD184 und mit dem EcoR I-Verdau von S. achromogenes-DNA und EcoR I-verdautem pJRD184 angesetzt. Die zusätzlichen Ligationen wurden ebenfalls in E. coli K802 transformiert.
4. Erste Zellbibliotheken: Die transformierten Kulturen wurden leicht zentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Zellen aus jeder Kultur wurden in 1,0 ml Luria- Nährmedium resuspendiert. 200 ul-Portionen der resuspendierten Zellen wurden auf Luria-Agar(L-Agar)-Platten plattiert, welche 100 ug/ml Ampicillin enthielten. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die aufgewachsenen Kolonien wurden in drei Pools gesammelt, einer für jede Ligation, indem jede Platte mit 1,5 ml 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; geflutet wurde und die Kolonien zusammen abgeschabt wurden.
5. Erste Plasmidbibliotheken: 2,0 ml von jeder Zellbibliothek wurden in 500 ml L-Nährmedium, welches 100 ug/ml Ampicillin enthielt, angeimpft. Die Kulturen wurden über Nacht bei 37ºC geschüttelt und dann 5 Minuten lang bei 4 K Upm zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und die Zellpellets wurden in 10 ml 25% Sucrose, 50 mM Tris pH 8,0 bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0 und 3 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris pH 8,0 wurden zu jedem zugegeben. Die Lösungen wurden 1 Stunde lang auf Eis gehalten, dann wurden zu jeder 12 ml 1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 8,0, 67 mM EDTA zugegeben und die Suspensionen wurden leicht gewirbelt, um eine Lyse der Zellen zu induzieren. Die lysierten Mischungen wurden auf 50 ml-Röhrchen übertragen und 45 Minuten lang bei 4ºC und 17 K Upm zentrifugiert. Die Überstände wurden mit einer Pipette entfernt. 20,0 g festes CsCl wurden in drei 50 ml-Plastikröhrchen mit Schraubdeckel eingewogen und 22,0 g von jedem Überstand wurden in jedes Röhrchen pipettiert und gemischt. 1,0 ml 5 mg/ml Ethidiumbromid in 10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA wurden zu jedem Röhrchen zugegeben. Jede der Lösungen wurde auf zwei 5/8 Inch X 3 Inch Zentrifugenröhrchen übertragen und in einem Beckmann Ti70-Rotor 42 Stunden lang bei 44 K Upm und 17ºC zentrifugiert. Um die Plasmid-DNA in jedem Röhrchen zu sammeln, wurden sie mit ultraviolettem Licht beleuchtet und die untere der zwei fluoreszierenden Banden wurde mit einer Spritze gesammelt. Das Ethidiumbromid wurde aus jeder der gesammelten Banden entfernt, indem viermal mit einem gleichen Volumen von CsCl-gesättigtem Isopropanol extrahiert wurde. Die extrahierten Lösungen wurden gegen 4 Wechsel von DNA-Puffer dialysiert, dann wurden die Nukleinsäuren über Nacht bei -20ºC durch die Zugabe von 2 Volumen Isopropanol und NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M gefällt. Die Lösungen wurden 15 Minuten lang bei 15 K Upm und 0ºC zentrifugiert, die Überstände wurden verworfen, die Pellets wurden 15 Minuten lang an der Luft getrocknet und dann wurde jedes in 500 ul 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA gelöst und bei -20ºC gelagert. Die Plasmid-DNA-Konzentrationen betrugen ungefähr 100 ug/ ml.
6. Verdau des Plasmidpools: 1 ug-Mengen der Plasmidbibliotheken wurden in 100 ul 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 10 mM NaCl 2 Stunden lang bei 37ºC mit 0, 20 und 40 U Sac II-Restriktionsendonuklease verdaut.
Gefolgt auf die Verdaus wurden 1,4 U (1,4 ul) CIP (Phospha tase aus Kalbsintestinum) zu jeder Reaktion zugegeben und 15 Minuten lang bei 37ºC und dann 15 Minuten lang bei 56ºC inkubiert. Zusätzliche 1,4 U wurden zu jeder Reaktion Zugegeben und die Temperaturschritte wurden wiederholt. Nach Abschluß der Dephosphorylierungsreaktionen wurden 20 ul (0,2 ug) jeder Bibliothek in E. coli K802 transformiert.
Die Mischungen wurden auf Luria-Agar-Platten, welche 100 g/ml Ampicillin enthielten, plattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Verdau mit Sac II-Restriktionsendonuklease verminderte die Anzahl von Transformanten ungefähr 10³- fach.
7. Analyse von Überlebenden: Zwischen zehn und 35 Kolonien wurden unter den Überlebenden von jeder Bibliothek gepickt. Jede Kolonie wurde in 10 ml Luria-Nährmedium, welches 100 ug/ml Ampicillin enthielt, angeimpft und bei 37ºC über Nacht kultiviert. Jedes der Plasmide, welche in den 77 Isolierungen vorhanden waren, wurde durch das folgende Miniprep-Reinigungsverfahren, welches von Birnboim und Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979) abgeleitet wurde, hergestellt:
Miniprep-Reinigungsverfahren: Jede Kultur wurde 5 Minuten lang bei 8 K Upm zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 1,0 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, pH 8,0, welcher 1 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden 2,0 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zu jedem Röhrchen zugegeben; die Röhrchen wurden geschüttelt, um die Zellen zu lysieren, und dann wurden sie auf Eis gestellt. Wenn sich die Lösungen einmal aufgeklart hatten, wurden 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, zu jedem zugegeben und geschüttelt. Die Niederschläge, welche sich gebildet hatten, wurden bei 15 K Upm und 4ºC 10 Minuten lang abzentrifugiert. Jeder Überstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen, welches 3 ml Isopropanol enthielt, gegossen und gemischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen 10 Minuten lang bei 15 K Upm zentrifugiert, um die präzipitierten Nukleinsäuren zu pelletieren. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang an der Luft getrocknet. Wenn sie einmal trocken waren, wurden die Pellets in 850 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. 75 ul 5 M NaCl wurden zu jedem zugegeben und die Lösungen wurden auf Eppendorfröhrchen übertragen, welche 575 ul Isopropanol enthielten und wieder 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ausgefällt. Die Röhrchen wurden dann 45 Sekunden lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden an der Luft getrocknet. Die Pellets wurden dann in 500 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, welche 100 ug/ml RNase enthielten, gelöst und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, um die RNA zu verdauen. Die DNA wurde erneut durch die Zugabe von 50 ul 5 M NaCl, gefolgt von 350 ul Isopropanol, ausgefällt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die DNA durch eine 45 Sekunden lange Zentrifugation abzentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden in 150 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 erneut gelöst. Die Plasmidminipreps wurden nachfolgend durch Verdaus mit Sac II, Pst I, EcoR I und Sau3A analysiert.
8. Identifizierung eines Sac II-Methylaseklons: Es wurde gefunden, daß 76 der 77 Plasmide, welche analysiert wurden, empfindlich für einen Sac II-Verdau sind und verschiedene Fragmente der S. achromogenes DNA enthalten. Diese Plasmide waren falsch und sie wurden verworfen. Es wurde gefunden, daß das verbleibende Plasmid resistent gegenüber einem Sac II-Verdau ist und ein einzelnes 5,9 kb Pst I-Fragment enthält. Jedoch war der Klon nicht in der Lage Sac II-Endonuklease zu synthetisieren. Das 5,9 kb Fragment wurde aus dem pJRD184 Plasmid herausgeschnitten und für eine bequemere Manipulationen in pUC19 ligiert. Dieses Plasmid wurde als pMMsacIIM 11-4 bezeichnet.
9. Lage des Methylasegens in dem 5,9 kb Pst I-Fragment: Wir nahmen an, daß das Sac II-Endonukleasegen in dem Chromosom von S. achromogenes neben dem Sac II-Methylasegen angeordnet ist. Extensives Kartieren und Subklonieren von DNA- Fragmenten des ursprünglichen Klons mit Restriktionsenzymen zeigte, daß die Methylase an einem äußersten Ende des ursprünglichen 5,9 kb Fragmentes angeordnet war. Diese Information legte nahe, daß möglicherweise die DNA, welche für das Sac II-Endonukleasegen codiert, in dem 5,9 kb Fragment nicht vorhanden war. An diesem Punkt war der Abstand zwischen den zwei Genen, die genaue Größe der Gene, und ob diese verbunden waren oder nicht, nicht bekannt. Das Fehlen von Sac II-Endonukleaseaktivität in dem Klon zeigte, daß das Restriktionsgen entweder nicht in den Klonen vorhanden war oder vorhanden war, aber nicht exprimiert wurde. In dem Fall, daß das ganze Restriktionsgen nicht vorhanden war, wurde das Klonieren von größeren Bereichen von DNA, welche zu dem Methylasegen benachbart waren, wie folgt in den Schritten 10 bis 13 erreicht. In dem Fall, daß die größeren Klone immer noch nicht die Sac II-Restriktionsendonuklease exprimierten, würden diese Klone in Streptomyces subkloniert werden, um zu bestimmen, ob ein näher verwandter Wirt das Restriktionsendonukleasegen exprimieren würde (Schritte 14 bis 17).
10. Eine Genkarte der benachbarten Regionen wurde unter Verwendung der Southern Blot-Technik bestimmt (Southern, E., J. Mol. Bio. 98, 503 (1975)). Die pMMsacIIM11-4 Plasmid-DNA wurde gereinigt und nick-translatiert, um eine Hybridisierungssonde für Southern Blots herzustellen. 0,5 ug (5 ul) Plasmid-DNA wurden mit 1,5 ul 10 x Nick-Translationspuffer (0,5 M Tris HCl, pH 7,5, 50 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2- Mercaptoethanol); 1 ul dATP, dCTP, dGTP, dTTP Mischung (500 pMol von jedem Nukleotid in dH&sub2;O); 5 ul [³²P]-dATP (Amersham; 800 Ci/mMol, 20 mCi/ml); 2 ul (20 U) E. coli DNA-Polymerase I (New England Biolabs); und 1 ul DNase I (1,0 ug/ml) gemischt. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 16ºC inkubiert, dann wurde die Reaktion durch die Zugabe von 100 ul 10 mM EDTA, pH 8,0 gestoppt.
Der Southern Blot wurde wie folgt hergestellt: S. achromogenes DNA wurde getrennt mit den Restriktionsendonukleasen Fsp I, Sca I, Kpn I, Pvu II, Bal I, EcoR V, Xmn I, Stu I, Dra I und Ssp I verdaut. Mit den Verdaus wurde auf einem 1,0% Agarosegel eine Elektrophorese durchgeführt. Das Gel wurde 15 Minuten lang in 0,25 M HCl getränkt; 30 Minuten lang in 0,5 M NaOH, 1 M NaCl; und dann 30 Minuten lang in 1 M Tris HCl pH 7,5, 3 M NaCl. Ein Nitrocelluloseblatt wurde 1 Stunde lang in Wasser getränkt, dann kurz in 5 X SSC (0,75 M NaCl, 75 mM Na&sub3;Citrat) getaucht. Das Blatt wurde auf die Oberfläche des Gels angewendet und rückseitig mit Chromatographiepapier (Whatman) abgedeckt, um als ein Saugmittel (wick) zu wirken. Das Sandwich wurde beschwert und es wurde erlaubt, daß die Übertragung des Gelinhaltes auf das Nitrocelluloseblatt 4 Stunden lang bei Raumtemperatur fortschreitet. Das Blatt wurde dann 1 Stunde lang bei 80ºC in einem Vakuumofen ausgetrocknet, um die übertragenen DNA- Fragmente auf dem Nitrocelluloseträger zu fixieren. Das Blatt wurde in einen Plastiksack übertragen, welcher 15 ml einer Lösung enthielt, die aus 3 ml 10 g/l Ficoll, 10 g/l Polyvinylpyrrolidon, 10 g/l Rindeserumalbumin; 4,5 ml 3 M NaCl, 0,3 M Na&sub3;Citrat; 1,5 ml 10% SDS; 3 ml 10% Dextransulfat; 3 ml Wasser zusammengesetzt war, und durch Inkubieren für 1 Stunde bei 63ºC prähybridisiert. Die gesamte radioaktive Sonde wurde zu dem Sack zugegeben und die Inkubation wurde bei 65ºC über Nacht fortgesetzt. Das Nitrocelluloseblatt wurde dann dreimal 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2 X SSC, 0,5% SDS gewaschen. Dieser Schritt wurde gefolgt von drei 20-minütigen Waschungen bei 65ºC in 2 X SSC, Lufttrocknen und dann über Nacht Autoradiographieren. Die Sonde hybridisierte mit einer einzelnen 14 kb-Bande in dem Fsp I-Verdau, mit einer 9,4 kb-Bande in dem Sca I-Verdau, mit einer 8,9 kb-Bande in dem EcoR V-Verdau und mit einer 14 kb-Bande in dem Stu I-Verdau. Es wurde geurteilt, daß diese Banden eine geeignete Größe zum Klonieren aufweisen und es wahrscheinlich ist, daß sie das Sac II-Endonukleasegen wie auch das Sac II-Methylasegen enthalten.
11. Herstellung von S. achromogenes-Bibliotheken: Vier neue Bibliotheken, welche aus S. achromogenes-DNA bestanden, die in das Plasmid pUC19 inseriert war, wurden in E. coli RR1 hergestellt. In getrennten Reaktionen wurde S. achromogenes-DNA vollständig mit Fsp I, Sca I, EcoR V und Stu I verdaut. Die Reaktionen wurden gestoppt, indem 15 Minuten lang auf 72ºC erwärmt wurde. 1 ug von jeder der verdauten DNAs wurde mit 1 ug Hinc II-gespaltener und dephosphorylierter pUC19-DNA (ATCC Nr. 37017) vereinigt. 3 ul 500 mM Tris pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT, 5 mM ATP wurden zugegeben und das Volumen von jeder Reaktion wurde mit Wasser auf 30 ul gebracht. 3 ul T4-DNA-Ligase wurden zu jeder Mischung zugegeben und die Ligation wurde über Nacht bei 16ºC durchgeführt. Die Ligationen wurden durch Extraktion mit 10 ul Chloroform beendet und dann wurden die Mischungen getrennt in kompetente E. coli RR1 transformiert. Die Transformationsmischungen wurden auf Luria-Agar-Platten plattiert, welche 100 ug/ml Ampicillin enthielten. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert.
12. Isolierung von überlappenden Sac II-Methylasegenfragmenten: Kolonien wurden auf eine Hybridisierung mit dem 5,9 kb Pst I-Fragment, welches das Sac II-Methylasegen enthielt, gescreent. Die Kolonien, welche die neuen Bibliotheken darstellten, welche wie in Abschnitt 13 oben beschrieben hergestellt wurden, wurden durch Kontakthebungen (contact-lifts) auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Filter wurden 30 Sekunden lang in 0,5 M NaOH, 2 M NaCl; 1 Minute lang in 0,5 M Tris HCl, pH 7,5, 3 M NaCl; 5 Sekunden lang in 0,3 M NaCl, 0,03 M Na&sub3;Citrat, 0,1% SDS; 10 Sekunden lang in 0,3 M NaCl, 0,03 M Na&sub3;Citrat eingetaucht. Die Filter wurden an der Luft getrocknet und dann wurden sie 30 Minuten lang bei 80ºC in einem Vakuumofen ausgetrocknet. Die Filter wurden prähybridisiert und dann mit der 2,0 kb Sac II-Methylasegensonde hybridisiert (unter Verwendung des Verfahrens, welches in Abschnitt 10 beschrieben ist).
Herstellung der Sac II-Methylasegensonde: Ein 2,0 kb Bgl II bis EcoR V-Subfragment des 5,9 kb Pst I-Inserts, welches in pMMsacIIM11-4 enthalten war, wurde gel-gereinigt und nick- translatiert. 10 ug der Plasmid-DNA wurden 1 Stunde lang bei 37ºC in 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol mit 120 U von jeweils Bgl II und EcoR V inkubiert. Der Verdau wurde durch Gelelektrophorese auf einem 1,0% Tris-Acetat-Agarosegel fraktioniert. Das Gel wurde 2,5 Stunden lang bei 100 mA laufengelassen, dann mit langwelligem UV-Licht beleuchtet und die 2,0 kb-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und in eine Spritze übertragen. Die Gelscheibe wurde durch eine Nadel der Größe 18 (18 gauge) in ein 5 ml-Zentrifugenröhrchen gedrückt. Das Röhrchen wurde bei 25ºC 45 Minuten lang bei 43 K Upm in einem Beckman SW 50.1-Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und die DNA wurde eine Stunde lang bei -70ºC durch die Zugabe von NaCl auf 0,5 M und 2 Volumen Isopropanol gefällt. Die gefällte DNA wurde in 500 ul 10 mM Tris HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, resuspendiert. Die DNA wurde unter Verwendung des Verfahrens, welches in Abschnitt 10 beschrieben ist, nick-translatiert. Die Filter wurden an der Luft getrocknet und dann wurden sie über Nacht autoradiographiert.
13. Identifizierung von neuen Sac II-Methylasegenklonen: Ungefähr 4000 Kolonien wurden aus der EcoR V-Bibliothek gescreent; von diesen hybridisierten sechs Kolonien stark mit der Sonde. Die sechs Klone wurden analysiert; es wurde gefunden, daß zwei von ihnen das gesuchte 8,9 kb EcoR V-Fragment enthielten und es wurde gefunden, daß die anderen vier falsch waren. Ungefähr 8000 Kolonien wurden von der Sca I- Bibliothek gescreent und vier von fünfzehn stark hybridisierenden Kolonien aus dieser Bibliothek enthielten das 9,4 kb Sca I-Fragment. Es wurden keine stark hybridisierenden Kolonien bei dem Screenen der Fsp I- und Stu I-Bibliotheken gefunden ( 5000 Kolonien gescreent/Bibliothek). Ein positiver Klon aus jeder der EcoR V- und Sca I-Bibliotheken wurde zurückgehalten und analysiert. Es wurde gefunden, daß der Klon aus der EcoR V-Bibliothek, welcher als pMMsacIIRM3 bezeichnet wurde, 6,4 kb an der Seite des Sac II-Methylasegens aufwies, welche in dem ursprünglichen Sac II-Methylaseklon am wenigsten DNA aufwies (man erinnere sich daran, daß das Sac II-Methylasegen in dem ursprünglichen Klon an einem äußersten Ende lag). Die Analyse des Klons aus der Sca I-Bibliothek, welcher als pMMsacIIRM8 bezeichnet wurde, ergab, daß dort 1,0 kb auf der einen Seite der Sac II- Methylase und 3,0 kb auf der anderen Seite vorhanden waren. Extrakte der Klone wurden auf Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet und bei keinem der Klone wurde eine Aktivität nachgewiesen.
14. Subklonieren der Sac II-Methylaseklone in S. lividans: Mit der Gewinnung der neuen Klone war nun genügend DNA auf beiden Seiten des Methylasegens kloniert, um ein Restriktionsendonukleasegen zu codieren, wenn es damit verbunden wäre, unabhängig davon, welche Seite das verbundene Gen codierte. Jedoch exprimierte keiner der Klone eine Restriktionsendonukleaseaktivität. Mit immer noch keinem Beweis, daß die zwei Sac II-Restriktions-Modifikations-Gene verbunden waren, wurden die Klone in S. lividans subkloniert, eine Art, welche näher mit S. achromogenes verwandt ist als E. coli. 10 ul (1,5 ug) pMMsacIIRM3 (der EcoR V-Methylaseklon in pUC19, Fig. 2) wurden in 50 ul 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 100 ug/ml Rinderserumalbumin, 100 mM NaCl, welche 20 U EcoR I und 20 U Hind III enthielten, 1 Stunde lang bei 37ºC verdaut. Mit dem gesamten Volumen wurde 2 Stunden lang auf einem 0,7% Agarosegel eine Elektrophorese durchgeführt. Das 7,5 kb EcoR I-Hind III-Restriktionsfragment wurde zwei Stunden lang durch eine Elektrophorese in ein DEAE-Anionenaustauschpapier überführt. Das Papier wurde zweimal in 150 ul eines Puffers gewaschen, welcher 0,1 M NaCl, 10 mM Tris pH 8,0, und 1 mM EDTA enthielt. Nachfolgend wurde die DNA aus dem Papier eluiert, indem das Papier viermal mit 75 ul eines Puffers gewaschen wurde, welcher 1,0 M NaCl, 10 mM Tris pH 8,0, und 1 mM EDTA enthielt. Die resultierende Lösung, welche das DNA-Fragment enthielt, wurde mit 300 ul Phenol/Chloroform extrahiert, gefolgt von einer Extraktion mit 300 ul chloroform, und mit 1 ml absolutem Alkohol gefällt, indem sie 15 Minuten lang in ein Trockeneis/Ethanol-Bad gestellt wurde. Die DNA wurde 5 Minuten lang bei 14 k Upm pelletiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gespült, an der Luft getrocknet und in einem Endvolumen von 10 ul 10 mM Tris pH 8, und 1 mM EDTA resuspendiert. 9 ul (0,5 ug) des gereinigten EcoR I-Hind III- DNA-Fragmentes wurden mit 1 ul (0,2 ug) von EcoR I- Hind III-gespaltenem und dephosphoryliertem pIJ486 (erhalten von Hopwood, D.A. aus Norwich, England. pIJ486 ist beschrieben in der Veröffentlichung Ward, J.M. et al., Mol. Gen. Genet. 203, 468-478), in 50 ul 1 X Ligationspuffer, welcher 1 ul T4-DNA-Ligase (400 U) enthielt, über Nacht bei 12ºC ligiert. 10 ul der Ligationsmischung wurden zu ungefähr 4 x 10&sup9; S. lividans TK24 (erhalten von Hopwood, D.A. TK24 ist beschrieben in Hopwood, D.A. et al., Genetic Manipulation of Streptomyces, a Laboratory Manual) Protoplasten zugegeben, welche, wie in Hopwood D.A. et al., ibid. beschrieben, in P-Puffer hergestellt wurden [103 g Sucrose, 0,25 g K&sub2;SO&sub4;, 2,02 g MgCl&sub2; 6H&sub2;O, 2 ml Spurenelementlösung und destilliertes Wasser bis auf 800 ml. 80 ml-Aliquots werden abgenommen und autoklaviert. Vor der Verwendung werden zu jeden 80 ml zugegeben: 1 ml 0,5% KH&sub2;PO&sub4;, 10 ml 3,68% CaCl&sub2; 2H&sub2;O und 10 ml 5,73% TES-Puffer pH 7,2. Spurenelementlösung pro Liter: 40 mg ZnCl&sub2;, 200 mg FeCl&sub3; 6H&sub2;O, 10 mg CuCl&sub2; 4H&sub2;O, 10 mg MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 10 mg Na&sub2;B&sub4;O&sub7; 10H&sub2;O und 10 mg (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; 4H&sub2;O]. 0,5 ml 25%iges Polyethylenglykol 1000 wurden zu der Protoplasten/DNA-Mischung zugegeben. Diese wurde 3-mal in einer 1 ml-Pipette hoch- und runtergezogen. 0,1 ml der Transformationsmischung wurde auf jeder von sechs R2YE-Platten plattiert [103 g Sucrose, 0,25 g K&sub2;SO&sub4;, 10,12 g MgCl&sub2; 6H&sub2;O, 10 g Glucose, 0,1 g Difco Casaminosäuren und 800 ml H&sub2;O. 80 ml dieser Lösung werden mit 2,2 g Difco-Agar gemischt und autoklaviert. Um die Platten herzustellen, wird die Basis-Agar-Lösung geschmolzen und die folgenden sterilen Lösungen werden zugegeben: 1 ml 0,5% KH&sub2;PO&sub4;, 8 ml 3,68% CaCl&sub2; 2H&sub2;O, 1,5 ml 20% L-Prolin, 10 ml 5,73% TES-Puffer pH 7,2, 0,2 ml Spurenelementlösung und 0,5 ml 1 N NaOH. Die Platten werden gegossen und wenigstens 1 Stunde lang in einem Laminarströmungsabzug getrocknet.]. Die Platten wurden nach Inkubieren über Nacht bei 30ºC mit 1,0 ml einer wäßrigen Lösung von Thiostrepton (0,5 mg/ml) überschichtet. Die Platten wurden 3 bis 4 Tage lang auf 30ºC zurückgebracht, bis die Kolonien gewachsen sind.
15. Analyse von Transformanten: 6 der überlebenden Kolonien, welche aus Selektion 15 erhalten wurden, wurden auf R2YE-Platten ausgestrichen, welche 5 ug/ml Thiostrepton enthielten, um isolierte Kolonien zu erhalten. Wenn sie angewachsen waren, wurden diese verwendet, um 5 ml TSB mit 5 ug/ml Thiostrepton anzuimpfen. Diese Kulturen wurden unter Belüftung 24 Stunden lang bei 30ºC inkubiert. Mit 0,5 ml der Kulturen wurden Minipreps gemacht. Dieses Verfahren ist identisch zu dem Verfahren, welches von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Research 7, 1513 (1979)) beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß eine 30-minütige Inkubation in 4 mg/ml Lysozym, 50 mM Glucose, 25 mM Tris pH 8,0, und 10 mM EDTA bei 37ºC notwendig ist, bevor die NaOH-SDS-Lösung zugegeben wird. 10 ul der Miniprep-DNA wurden analysiert, indem sie auf einem 0,7%-Agarosegel laufengelassen wurden. 3 der 6 Klone schienen größer zu sein als pIJ486. Sporen dieser drei Isolate wurden geerntet und verwendet, um 500 ml TSB + Thiostrepton anzuimpfen. CsCl-Plasmid-Preps wurden aus 450 ml der Kultur hergestellt, indem einer maßstabsvergrößerten (20 x) Version des Verfahrens 3 P. 93 in Hopwood et al. ibid. gefolgt wurde. Das resultierende Pellet wurde in 17 ml 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 18,7 g CsCl und 0,44 ml Ethidiumbromid (5 mg/ml) resuspendiert. Die Lösung wurde auf zwei 5/8 Inch x 3 Inch Polyallomer-Zentrifugenröhrchen übertragen und abgedichtet. Diese Röhrchen wurden bei 17ºC 48 Stunden lang bei 44 k Upm in einem Beckman-Ti70-Rotor zentrifugiert. Um die Plasmide zu sammeln, wurden die oberen Enden der Röhrchen mit einem Skalpell angestochen und die untere der zwei fluoreszierenden DNA-Banden wurde mit einer Spritze unter ultraviolettem Licht gesammelt. Die untere Bande aus den beiden Röhrchen wurde in einem 15 ml- Corex-Röhrchen vereinigt, und das Ethidiumbromid wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens an Wasser und drei Volumen an Ethanol entfernt. Nach 2 Stunden bei -20ºC wurde die DNA durch Abzentrifugieren für 20 Minuten bei 12 k Upm pelletiert. Das Pellet wurde in 2 ml 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA resuspendiert. 50 ul 8 M LiCl wurden zugegeben, und die DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefolgt durch eine Chloroformextraktion. Die DNA wurde gefällt, indem 3 Volumen Ethanol zu der wäßrigen Lösung zugegeben wurden, wie oben beschrieben wurde. Das Pellet wurde in 500 ul 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA resuspendiert. Das gereinigte Plasmid wurde mit EcoR I und Hind III verdaut, um die Gegenwart des Inserts zu bestätigen, wie auch mit Sac II, um zu bestimmen, ob der Subklon in S. lividans eine Sac II- Methylaseaktivität aufwies. Alle drei Subklone waren scheinbar identisch, hatten die korrekte Konstruktion wie auch eine Methylaseaktivität, d.h. waren nicht in der Lage, mit der Sac II-Endonuklease verdaut zu werden. 50 ml der Kultur, welche verwendet wurde, um das Plasmidprep herzustellen, wurden mit 10,3% Sucrose gewaschen, und das Pellet wurde bei -70ºC eingefroren. Beim Auftauen wurde das Pellet in 3 ml/g an nassem Zellgewicht mit einer Lösung von 50 mM Tris pH 8, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM PMSF resuspendiert. Nach einer Beschallung auf Eis wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation für 45 Minuten bei 16 k Upm entfernt. Der Überstand wurde auf Sac II-Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet. Diese Subklone werden als pEGsacIIRM1-32, 1-34 und 1-36 (Fig. 3) in S. lividans bezeichnet und hatten 2 x 10&sup5; U/g an Sac II-Endonukleaseaktivität, ungefähr dasselbe Niveau, wie das, was in S. achromogenes beobachtet wurde.
16. Bestimmung der Lage des Sac II-Restriktionsendonukleasegens: Weiteres Subklonieren des EcoR V-Fragmentes wurde in S. lividans durchgeführt, um die ungefähre Lage des Sac II-Restriktionsendonukleasegens zu bestimmen. Eine Mlu I-Deletion wurde konstruiert, welche als pEGsacIIRM4-2 (Fig. 3) bezeichnet wurde, welche sowohl auf einem Niveau von 8,5 x 10&sup5; U/g Endonuklease- als auch Methylaseaktivität hatte. Zwei Pst I-Fragmente wurden einzeln in pIJ486 kloniert. Nur der linksseitige Pst I-Subklon (pEGsacIIM6-1) zeigte Sac II-Methylaseaktivität. Keiner der Subklone ergab eine Sac II-Endonukleaseaktivität, was zeigt, daß das Sac II-Endonukleasegen die Pst I-Stelle überspannt (Fig. 3).
17. Überexpression der Sac II-Restriktionsendonuklease. Ein anderer Subklon, welcher konstruiert wurde, war einer mit dem Sca I-Hind III-Fragment (Fig. 3). Das DNA-Fragment mußte zuerst in die Sma I-Hind III-Stellen von pUC19 ligiert werden und in E. coli ED8767 transformiert werden, um nützliche Restriktionsstellen zum Klonieren in pIJ486 zu erhalten. Dieser Subklon, pEGsacIIMC4A, in E. coli zeigte Methylaseaktivität, aber es wurde keine Endonukleaseaktivität nachgewiesen. Das relevante Fragment wurde aus dem pUC19-Subklon mit EcoR I und Hind III herausgeschnitten und in EcoR I-Hind III-verdautes pIJ486 ligiert. S. lividans TK24-Transformanten, welche dieses rekombinante Plasmid, pEGsacIIRMC5, enthielten, zeigten Sac II-Methylaseaktivität. Wenn dieser Stamm, welcher als ATCC 68391 bezeichnet wurde, auf Sac II-Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet wurde, zeigte er Aktivität auf einem Niveau von 4 x 10&sup7; U/g. In Fig. 4 wurden 500 ul von Xba I-verdauter ∅C31-DNA in 1x NEB-Puffer 4 (20 mM Tris, 10 mM Mg-Acetat, 50 mM K-Acetat, und 1 mM DTT) hergestellt, 50 ul wurden in zwei Röhrchen gegeben und 25 ul wurden in jedes von 7 Röhrchen gegeben. Zusätzlich wurden 50 ul in ein Röhrchen und 25 ul in jedes von 5 Röhrchen gegeben, um als Kontrollen verwendet zu werden. 1 ul des rohen Zellextraktes (von Zellen, welche den Klon enthielten) wurde zu dem ersten 50 ul-Röhrchen zugegeben und gemischt. 1 ul wurde auf das zweite 50 ul-Röhrchen übertragen und gemischt, dann wurden 25 ul von dem Röhrchen auf ein drittes Röhrchen (welches 25 ul enthielt) übertragen und gemischt, usw., bis sechs solcher 1 : 2-Verdünnungen durchgeführt waren, indem die ersten sieben Röhrchen verwendet wurden. Für die Kontrolle wurde 1 ul (20 Einheiten) Sac II-Endonuklease zu dem ersten Kontrollröhrchen zugegeben und fünf 1 : 2-Verdünnungen (Übertragung von 25 ul) wurden mit den fünf Kontrollröhrchen durchgeführt. Alle Röhrchen wurden eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert. 25 ul von jedem Röhrchen wurden durch Gelelektrophorese analysiert.
Im Vergleich der Kontrolle mit dem rohen Zellextrakt des Klons wurden 40 000 000 Einheiten an Sac II-Aktivität pro Gramm an Klonzellen abgeschätzt. Eine Probe von NEB Nr. 673 wurde am 4. September 1990 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und trägt die ATCC-Bezeichnungs-Nr. 68391.
18. Sac II-Modifikationsmethylase und Endonuklease wurden aus ATCC 68391-Klonen erzeugt, welche das Sac II-Modifikationsgen und das überexprimierte Restriktionsgen enthielten, indem diese in einem Fermenter in einem Vollmedium, welches Thiostrepton enthielt, vermehrt wurden. Die Zellen wurden danach durch Zentrifugation geerntet und 337 g wurden 1 : 3 in 0,3 M NaCl SB pH 7,7 (10 mM KPO&sub4;, 0,1 mM EDTA, 10 mM 2-Mercaptoethanol) verdünnt und in einer French-Presse aufgebrochen, um einen rohen Zellextrakt zu erzeugen, welcher Sac II-Methylase und Restriktionsendonukleaseaktivität enthielt.
19. Die Sac II-Restriktionsendonuklease wurde aus dem rohen Zellextrakt hergestellt, welcher die Sac II-Methylase und Endonuklease enthielt, indem dieser auf eine DEAE-Sepharose-Säule (5 cm x 17 cm mit einem Bettvolumen von 333 ml) aufgetragen wurde, welche mit 0,3 M NaCl SB pH 7,7 äquilibriert worden war. Diese wurde mit 500 ml 0,2 M NaCl SB pH 7,0 gewaschen. Der Durchfluß und die Waschungen wurden bis zu 3 : 1 mit diesem selben Puffer verdünnt. Dieses wurde auf eine Heparinsepharose-Säule (4 cm x 14 cm mit einem Bettvolumen von 176 ml) aufgetragen. Nach dem Auftragen der Probe wurde die Säule mit 250 ml 0,2 M NaCl SB pH 7,0 gewaschen. Um das Protein zu eluieren, wurde ein Gradient von 0,2 M NaCl bis 1,2 M NaCl in SB pH 7,0 gefahren. Die gepoolten Fraktionen (300 ml), welche Endonukleaseaktivität enthielten, wurden gegen 0,05 M NaCl SB pH 7,8 dialysiert. Diese wurden auf eine DEAE-Sepharose-Säule (2,5 cm x 19 cm mit einem Bettvolumen von 93 ml) aufgetragen, welche mit 50 mM NaCl SB pH 7,8 äquilibriert worden war. Nach dem Auftragen wurde die Säule mit demselben Puffer gewaschen. Die Endonuklease wurde von der Säule eluiert, indem ein Gradient von 50 mM NaCl bis 0,8 M NaCl in SB pH 7,8 gefahren wurde. Die Fraktionen mit dem Aktivitätspeak wurden gesammelt und gegen Aufbewahrungspuffer (50 mM KCl, 10 mM Tris- HCl pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 ug/ml BSA und 50% Glycerol dialysiert und bei -20ºC gelagert. Die Gesamtausbeute nach dem Reinigen betrug 3 x 10&sup7; U.
Die Sac II-Endonuklease, die aus dieser Reinigung erhalten wurde, war im wesentlichen rein und frei von nicht-spezifischer Endonuklease und Exonukleasen und war vollständig frei von Verunreinigung mit Sac I- und Sac III-Endonuklease.
Die Reinheit der Sac II-Restriktionsendonuklease-Präparation wurde durch Anschauen der folgenden Kriterien überprüft: 1. Ligation: 95% der DNA-Fragmente, welche durch einen 10-fachen Überverdau erzeugt wurden, wurden mit T4-DNA- Ligase ligiert (bei einer 5'-Termini-Konzentration von 1 - 2 uM bei 16ºC). Von diesen ligierten Fragmenten waren 95% in der Lage, erneut gespalten zu werden. 2. Verlängerter Verdau: Eine 50 ul-Reaktion, welche 1 ug DNA und 80 U Enzym enthielt und 16 Stunden lang inkubiert wurde, führte zu demselben Muster an DNA-Banden, wie eine Reaktion in 1 Stunde mit 1 U Enzym erzeugte. 3. Exonukleaseaktivität: Eine Inkubation von 100 U 4 Stunden lang bei 37ºC in 50 ul Testpuffer (50 mM K-Acetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Mg- Acetat, 1 mM DTT, pH 7,9) mit 1 ug beschallter ³H-DNA (10&sup5; cpm/ug) setzte 0,15% Radioaktivität frei. 4. Endonukleaseverunreinigung: Eine Inkubation von 80 U mit 1 ug pBR322- DNA, welche keine Sac II-Stellen aufweist (4 Stunden bei 37ºC in 50 ul), ergab 20 % Konzentration zu RFII.

Claims

1. Isoliertes DNA-Segment, welches für die Sac II Restriktionsendonuklease codiert, wobei das isolierte DNA-Segment aus S. achromogenes ATCC Nr. 12767 erhältlich ist.

2. Ein rekombinanter DNA-Vektor, welcher einen Vektor enthält, in welchem ein DNA-Segment, welches für die Sac II Endonuklease codiert, die durch S. achromogenes ATCC Nr. 12767 produziert wird, eingefügt wurde.

3. Isoliertes DNA-Segment, welches für die Sac II Restriktionsendonuklease und Methylase codiert, wobei das isolierte DNA-Segment aus S. achromogenes ATCC Nr. 12767 erhältlich ist.

4. Ein Klonierungsvektor, welcher das isolierte DNA-Segment gemäß Anspruch 1 umfaßt.

5. Ein Klonierungsvektor welcher das isolierte DNA-Segment gemäß Anspruch 3 umfaßt.

6. Eine Streptomyces lividans Wirtszelle, welche mit dem Vektor gemäß Anspruch 4 oder 5 transformiert wurde.

7. Ein Verfahren zur Herstellung der Sac II Restriktionsendonuklease, umfassend: Kultivieren der transformierten Wirtszelle von Anspruch 6 unter Bedingungen für eine Expression der Endonuklease.