DE475195T1 - Verfahren zur Herstellung und Klonierung der Sac-II-Restruktionsendonuklease und Methylase. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung und Klonierung der Sac-II-Restruktionsendonuklease und Methylase.Info
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Claims (18)
1. DNA-Fragment mit einer Nukleotidsequenz, die die von S. achromogenes ATCC
Nr. 12767 erzeugte Restriktionsendonuklease SacII kodiert.
2. DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich
eine Nukleotidsequenz umfaßt, die die von S.. achromogenes ATCC Nr. 12767
erzeugte SacII-Methylase kodiert.
3. DNA-Fragment nach Anspruch 1 oder 2, erhältlich aus dem Plasmid
pEGSacITRMC5.
4. Rekombinanter Vektor, umfassend einen Vektor, in den ein DNA-Fragment
inseriert worden ist, das die von S. achromogenes ATCC Nr. 12767 erzeugte
Endonuklease SacII kodiert.
5. Rekombinanter Vektor, umfassend einen Vektor, in den das DNA-Fragment gemäß -j
Anspruch 1 oder 2 inseriert ist.
6. Wirtszelle, transformiert mit dem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 4.
7. Wirtszelle, transformiert mit dem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 5.
8. Transformierter Wirt nach Anspruch 6, bei dem die Wirtszelle Streptomyces
lividans ist.
9. Rekombinante Restriktionsendonuklease SacII, die die DNA-Sequenz CCGCGG
erkennt, wobei die Endonuklease a) aus S- achromogenes ATCC Nr. 12767
erhältlich und b) von Sad und SacIII frei ist.
10. Rekombinante Modifizierungsmethylase, erhältlich aus S- achromogenes ATCC
Nr. 12767, welche DNA vor dem Abbau durch die rekombinante Restriktionsendonuklease
SacII gemäß Anspruch 9 schützt.
11. Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease SacII, bei dem eine
mit dem Vektor gemäß Anspruch 4 transformierte Wirtszelle unter für die Expression der Restriktionsendonuklease SacII geeigneten Bedingungen kultiviert
wird.
12. Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease SacII, bei dem eine
mit dem Vektor gemäß Anspruch 5 unter für die Expression der Restriktionsendonuklease
SacII geeigneten Bedingungen kultiviert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der rekombinante Vektor das Plasmid
pEGSacüRMC5 umfaßt.
14. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Wirt Streptomyces. lividans ist.
15. Rekombinante Restriktionsendonuklease SacII, hergestellt durch das
Verfahren gemäß Anspruch 11.
16. Verfahren zum Klonieren von DNA für eine SacII-Restriktionsendonuklease,
bei dem
a) DNA aus Streptomyces achromogenes ATCC Nr. 12767 gereinigt wird;
b) die gereinigte DNA mit Eeo_RV unter Bildung von DNA-Fragmenten digeriert
wird;
c) die DNA-Fragmente in den Klonierungsvektor pJRD184 eingebunden werden;
d) eine Wirtszelle mit dem Klonierungsvektor der Stufe (c) unter Bildung einer
Zellbank transformiert wird;
e) rekombinante Vektoren aus der Zellbank unter Bildung einer Plasmidbank
gereinigt werden;
f) die Plasmidbank der Stufe e) mit SacII unter Bildung eines Verdauungs-Pools
kontaktiert wird, der Verdauungs-Pool in eine Wirtszelle transformiert wird und auf die Anwesenheit von einem oder mehreren Klonierungsvektoren, die eine
SacII-Methylase kodierende DNA enthalten, geprüft wird;
g) die in Stufe 0 erhaltene DNA, die SacII-Methylase kodierende DNA enthält,
zu einem Streptomyces-kompatiblen Klonierungsvektor subkloniert wird;
h) Streptomyces lividans-Wirtszellen mit dem Klonierungsvektor der Stufe g)
transformiert werden; und
i) die Transformanten der Stufe (h) auf Anwesenheit von eine SacII-Restriktionsendonuklease
kodierender DNA durch Identifizierung von Transformanten, die die Restriktionsendonuklease SacII erzeugen, geprüft werden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem der Streptomyces-kompatible
Klonierungsvektor pIJ4896 ist.
18. Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease SacII, bei dem
a) DNA aus Streptomyces achromogenes ATCC Nr. 12767 gereinigt wird;
b) die gereinigte DNA mit EgoJRV unter Bildung von DNA-Fragmenten teilweise
verdaut wird;
c) die DNA-Fragmente in den Klonierungsvektor pCU19 eingebunden werden;
d) eine Wirtszelle mit dem Klonierungsvektor der Stufe (c) unter Bildung
einer Zellbank transformiert wird;
e) rekombinante Vektoren aus der Zellbank unter Bildung einer Plasmidbank
gereinigt werden;
-A-
f) die Plasmidbank der Stufe (e) mit SacII unter Bildung eines Verdauungs-Pools
kontaktiert wird, der Verdauungs-Pool in eine Wirtszelle transformiert wird und die Anwesenheit von einem oder mehreren Klonierungsvektoren, die eine
SacII-Methylase kodierende DNA enthalten, geprüft wird;
g) die in Stufe (0 erhaltene DNA, die SacII-Methylase kodierende DNA enthält,
zu einem Streptomyces-kompatiblen Klonieningsvektor subkloniert wird;
h) Streptomyces lividans-Wirtszellen mit dem Klonierungsvektor der Stufe (g)
transformiert werden;
i) die Transformanten der Stufe (h) auf die Anwesenheit von eine SacII-Restriktionsendonuklease
kodierender DNA durch Identifizierung von Transformanten, die die Restriktionsendonuklease SacII erzeugen, geprüft werden;
und
j) die Transformanten der Stufe (i) unter für die Expression der Restriktionsendonuklease
SacII geeigneten Bedingungen kultiviert werden.
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