DE475195T1 - Verfahren zur Herstellung und Klonierung der Sac-II-Restruktionsendonuklease und Methylase. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung und Klonierung der Sac-II-Restruktionsendonuklease und Methylase.

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DE475195T1
DE475195T1 DE91114437T DE91114437T DE475195T1 DE 475195 T1 DE475195 T1 DE 475195T1 DE 91114437 T DE91114437 T DE 91114437T DE 91114437 T DE91114437 T DE 91114437T DE 475195 T1 DE475195 T1 DE 475195T1
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sacii
dna
restriction endonuclease
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DE91114437T
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Ellen Guthrie
Marta Meda
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New England Biolabs Inc
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
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Claims (18)

Patentansprüche
1. DNA-Fragment mit einer Nukleotidsequenz, die die von S. achromogenes ATCC Nr. 12767 erzeugte Restriktionsendonuklease SacII kodiert.
2. DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich eine Nukleotidsequenz umfaßt, die die von S.. achromogenes ATCC Nr. 12767 erzeugte SacII-Methylase kodiert.
3. DNA-Fragment nach Anspruch 1 oder 2, erhältlich aus dem Plasmid pEGSacITRMC5.
4. Rekombinanter Vektor, umfassend einen Vektor, in den ein DNA-Fragment inseriert worden ist, das die von S. achromogenes ATCC Nr. 12767 erzeugte Endonuklease SacII kodiert.
5. Rekombinanter Vektor, umfassend einen Vektor, in den das DNA-Fragment gemäß -j
Anspruch 1 oder 2 inseriert ist.
6. Wirtszelle, transformiert mit dem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 4.
7. Wirtszelle, transformiert mit dem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 5.
8. Transformierter Wirt nach Anspruch 6, bei dem die Wirtszelle Streptomyces
lividans ist.
9. Rekombinante Restriktionsendonuklease SacII, die die DNA-Sequenz CCGCGG erkennt, wobei die Endonuklease a) aus S- achromogenes ATCC Nr. 12767 erhältlich und b) von Sad und SacIII frei ist.
10. Rekombinante Modifizierungsmethylase, erhältlich aus S- achromogenes ATCC Nr. 12767, welche DNA vor dem Abbau durch die rekombinante Restriktionsendonuklease SacII gemäß Anspruch 9 schützt.
11. Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease SacII, bei dem eine mit dem Vektor gemäß Anspruch 4 transformierte Wirtszelle unter für die Expression der Restriktionsendonuklease SacII geeigneten Bedingungen kultiviert wird.
12. Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease SacII, bei dem eine mit dem Vektor gemäß Anspruch 5 unter für die Expression der Restriktionsendonuklease SacII geeigneten Bedingungen kultiviert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der rekombinante Vektor das Plasmid pEGSacüRMC5 umfaßt.
14. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Wirt Streptomyces. lividans ist.
15. Rekombinante Restriktionsendonuklease SacII, hergestellt durch das Verfahren gemäß Anspruch 11.
16. Verfahren zum Klonieren von DNA für eine SacII-Restriktionsendonuklease, bei dem
a) DNA aus Streptomyces achromogenes ATCC Nr. 12767 gereinigt wird;
b) die gereinigte DNA mit Eeo_RV unter Bildung von DNA-Fragmenten digeriert wird;
c) die DNA-Fragmente in den Klonierungsvektor pJRD184 eingebunden werden;
d) eine Wirtszelle mit dem Klonierungsvektor der Stufe (c) unter Bildung einer
Zellbank transformiert wird;
e) rekombinante Vektoren aus der Zellbank unter Bildung einer Plasmidbank gereinigt werden;
f) die Plasmidbank der Stufe e) mit SacII unter Bildung eines Verdauungs-Pools kontaktiert wird, der Verdauungs-Pool in eine Wirtszelle transformiert wird und auf die Anwesenheit von einem oder mehreren Klonierungsvektoren, die eine SacII-Methylase kodierende DNA enthalten, geprüft wird;
g) die in Stufe 0 erhaltene DNA, die SacII-Methylase kodierende DNA enthält, zu einem Streptomyces-kompatiblen Klonierungsvektor subkloniert wird;
h) Streptomyces lividans-Wirtszellen mit dem Klonierungsvektor der Stufe g) transformiert werden; und
i) die Transformanten der Stufe (h) auf Anwesenheit von eine SacII-Restriktionsendonuklease kodierender DNA durch Identifizierung von Transformanten, die die Restriktionsendonuklease SacII erzeugen, geprüft werden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem der Streptomyces-kompatible Klonierungsvektor pIJ4896 ist.
18. Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonuklease SacII, bei dem
a) DNA aus Streptomyces achromogenes ATCC Nr. 12767 gereinigt wird;
b) die gereinigte DNA mit EgoJRV unter Bildung von DNA-Fragmenten teilweise verdaut wird;
c) die DNA-Fragmente in den Klonierungsvektor pCU19 eingebunden werden;
d) eine Wirtszelle mit dem Klonierungsvektor der Stufe (c) unter Bildung einer Zellbank transformiert wird;
e) rekombinante Vektoren aus der Zellbank unter Bildung einer Plasmidbank gereinigt werden;
-A-
f) die Plasmidbank der Stufe (e) mit SacII unter Bildung eines Verdauungs-Pools kontaktiert wird, der Verdauungs-Pool in eine Wirtszelle transformiert wird und die Anwesenheit von einem oder mehreren Klonierungsvektoren, die eine SacII-Methylase kodierende DNA enthalten, geprüft wird;
g) die in Stufe (0 erhaltene DNA, die SacII-Methylase kodierende DNA enthält, zu einem Streptomyces-kompatiblen Klonieningsvektor subkloniert wird;
h) Streptomyces lividans-Wirtszellen mit dem Klonierungsvektor der Stufe (g) transformiert werden;
i) die Transformanten der Stufe (h) auf die Anwesenheit von eine SacII-Restriktionsendonuklease kodierender DNA durch Identifizierung von Transformanten, die die Restriktionsendonuklease SacII erzeugen, geprüft werden; und
j) die Transformanten der Stufe (i) unter für die Expression der Restriktionsendonuklease SacII geeigneten Bedingungen kultiviert werden.
DE91114437T 1990-09-07 1991-08-28 Verfahren zur Herstellung und Klonierung der Sac-II-Restruktionsendonuklease und Methylase. Pending DE475195T1 (de)

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