DE3432997A1 - Herstellen eines gegen arsen resistenten vektors fuer thiobacillus ferrooxidans - Google Patents

Herstellen eines gegen arsen resistenten vektors fuer thiobacillus ferrooxidans

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DE3432997A1
DE3432997A1 DE19843432997 DE3432997A DE3432997A1 DE 3432997 A1 DE3432997 A1 DE 3432997A1 DE 19843432997 DE19843432997 DE 19843432997 DE 3432997 A DE3432997 A DE 3432997A DE 3432997 A1 DE3432997 A1 DE 3432997A1
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Description

Beschreibung
Die Erfindung bezieht sich auf das Herstellen eines rekorabinanten DNA-Plasmid-Vektors für Thiobacillus ferrooxidans, der Gene für Arsenresistenz enthält und fähig ist, sich sowohl in T. ferrooxidans als auch Escherichia coli zu replizieren .
Das biologische Auslaugen von Arsenopyriterzen war bisher durch die Sensitivität der hierfür verwendeten Organismen gegen Arsen, das bei diesem Prozeß frei wird, nur mit Einschränkungen möglich.
Obwohl bereits Plasmide, die Arsenresistenz aufweisen, für andere Bakterien hergestellt wurden, gibt es, soweit der Anmelderin bekannt ist, bisher keine Berichte über die Herstellung solcher Plasmide für T. ferrooxidans, die sich ebenso in E. coli replizieren können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein DNA-Plasmid hergestellt, das Gene für Arsenresistenz enthält und sich in T. ferrooxidans replizieren kann. Diese Plasmide werden in T. ferrooxidans transformiert und stellen so die Arsenresistenz der Empfänger her.
Das Verfahren wird vorzugsweise derart durchgeführt, daß ein kryptisches DNA-Plasmid aus einem T. ferrooxidans-Stamm und ein zweites Plasmid mit ein und demselben Restriktions-
gO enzym geschnitten und die Plasmide miteinander verbunden werden, um ein rekombinantes Plasmid zu bilden, und der E. coli-Origin der Replikation aus dem rekombinanten Plasmid entfernt wird, um ein deletiertes rekombinantes Plasmid zu bilden und weiterhin durch Schneiden mit einem
gg Restriktionsenzym aus einem dritten Plasmid die Gene für Arsenresistenz entfernt werden, sodann diese Gene in das deletierte rekombinante Plasmid, das mit demselben Restriktionsenzym geschnitten wurde, inseriert werden, wodurch
Plasmide hergestellt werden, die Arsenresistenz aufweisen.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Arsenresistenz aufweisendes Plasmid pDR4i6, das eine Größe von etwa 16,5 kb hat und durch das Restriktionsenzym Pvul in fünf Fragmente mit den Größen 4,4 kb, 3,6 kb, 3,4 kb, 2,8 kb bzw. 2,3 kb teilbar ist.
Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Arsenresistenz aufweisendes Plasmid pDR420, das eine Größe von etwa 13,3 kb hat und durch das Restriktionsenzym Pvul in vier Fragmente mit den Größen 4,4 kb, 4,2 kb, 3,6 kb bzw. 1,1 kb teilbar ist.
Die erfindungsgemäßen Plasmide finden in Auslaugprozessen von Erzen Verwendung, insbesondere bei Verfahren zur Gewinnung von Gold.
Ein Beispiel der Erfindung wird im folgenden näher beschrieben unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen, wobei dargestellt ist in
Figur 1: Restriktionskarten der Plasmide pFT-FC2 und pDR401 und
Figur 2: Restriktionskarten der Plasmide pDR4O3, pDR404,
pDR4i6 und pDR420 sowie ein R46-Fragment.
Die parallele Patentanmeldung mit dem Titel "Herstellen eines selektierbaren Shuttle-Clonierungsvektors für Thiobacillus ferrooxidans" der Anmelderin beschreibt unter anderem die Herstellung des Plasmids pDR401.
Das kryptische Plasmid pTF-FC2 mit einer Größe von 12,4 oc Kilobasen (kb) wurde aus einem T. ferrooxidans FC-Stamm extrahiert, der aus einer auslaugenden Säureflüssigkeit von Fairview Mine, General Mining Union Corporation Limited, Südafrika isoliert wurde. Die Restriktionskartierung von
pTF-FC2 zeigt, daß je einmal Restriktionserkennungsstellen der Restriktionsenzyme Pstl, ΧηοΙ,ΚρηΙ, EcoRI, Apal, CIaI sowie zwei Restriktionserkennungsstellen des Restriktionsenzyms Pvul vorliegen, wie es aus Figur 1 ersichtlich ist.
Das rekombinante Plasmid pDR401 wird durch Insertion des E. coli-Plasmids pBR325 in die Pstl-Erkennungsstelle des Plasmids pTF-FC2 hergestellt. Das Plasmid pBR325 enthält die Gene für Ampicillinresistenz (Ap), Chloramphenicolresistenz (Cm) und Tetracyclinresistenz (Tc). Das Cionieren an der Pstl-Erkennungsstelle inaktiviert durch Insertion das Ap -Gen, so daß E. coli-Transformanten isoliert werden, die bezüglich der Antibiotikaresistenzen den Genotyp Cm ,
R S
Tc und Ap aufweisen. Das rekombinante Plasmid pDR401 (etwa 17,8 kb) wird aus den E. coli-Transformanten extrahiert und durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Dieses
R R neue rekombinante Plasmid enthält die Gene für Cm und Tc und ist fähig, sich sowohl in T. ferrooxidans als auch E. coli zu replizieren.
Es ist nun aber möglich, das Plasmid pDR401 (17,8 kb) oder das Plasmid pDR403 (17,8 kb) zu konstruieren, was davon abhängt, in welcher Orientierung die Insertion des Plasmids pBR325 erfolgt. Eine Restriktionskartierung des Plasmids pDR4O3 ist in Figur 2 gezeigt. (Es sollte hier darauf hingewiesen werden, daß anstelle von pBR325 andere geeignete Plasmide verwendet werden können).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der E. coli-Origin der Replikation aus dem Plasmid pDR4O3 entfernt, um das deletierte rekombinante Plasmid pDR404 (9 kb) (siehe Figur 2) zu bilden.
Aus dem Plasmid R46, einem 7,5 kb-Fragment, das die Gene
R R
As und Tc enthält und ein EcoRI-Verdauungsprodukt des IncN-Plasmics R46 (Brown & Willets 1981) ist, werden die Gene für Arsenresistenz entfernt. Dies erfolgt durch Schneiden des Plasmids R46 mit dem Restriktionsenzym EcoRI.
Die Gene für Arsenresistenz werden sodann in das Plasmid pDR404 inseriert, das mit demselben Restriktionsenzym EcoRI geschnitten wurde, um die gegen Arsen resistenten Plasmide pDR4i6 und pDR420 herzustellen.
Jedes der Plasmide pDR4i6 (16,5 kb) und pDR420 (13,3 kb) wurde durch endonucleolytisches Schneiden mit dem Restriktionsenzym Pvul charakterisiert.
Auf diese Weise wurde das Plasmid pDR4i6 in fünf Fragmente geschnitten, die die Größen 4,4 kb, 3,6 kb, 3,4 kb, 2,8 kb bzw. 2,3 kb aufweisen.
Das Plasmid pDR420 wurde durch dasselbe Enzym in vier Fragmente geschnitten, die die Größen 4,4 kb, 4,2 kb, 3,6 kb bzw. 1,1 kb aufweisen.
Stämme von T. ferrooxidans, die mit den erfindungsgemäßen Plasmiden transformiert wurden, finden Verwendung beim Auslaugen von Arsenopyriterzen, wodurch die Extraktion der Minerale aus diesen Erzen verbessert wird.
In einem bekannten Verfahren dieser Art wird Golderz Arsenopyrit ausgesetzt und wenn das Gold zur Extraktion frei gesetzt wird, geht Arsen in Lösung. Die Konzentration des Arsens steigt an und inhibiert damit die Organismen, wodurch die Wirksamkeit der Extraktion auf ein Minimum gebracht wird. Diesem Problem wird dadurch begegnet, daß das Arsen in regelmäßigen Intervallen präzipitiert und das Verfahren mit einer frischen Lösung fortgesetzt wird. Dies hat zur Folge, daß das Verfahren zeitraubend und teuer ist.
Die erfindungsgemäßen Plasmide sind resistent gegen Arsen und sind fähig, das Auslaugen von Erzen erheblich wirksamer zu gestalten, wenn sie in Stämme der Art T. ferrooxidans transformiert werden, da das Zeitintervall vor der Arsenpräzipitation, falls diese überhaupt nötig ist, verlängert werden kann.

Claims (1)

  1. 7. September 1984 P 19 065-002/er
    GENERAL MINING UNION CORPORATION LIMITED 74-78 Marshall Street
    Johanndesburg, Transvaal
    Südafrika
    Herstellen eines gegen Arsen
    resistenten Vektors für
    Thiobacillus ferrooxidans
    Patentansprüche
    1. Verfahren zum Herstellen von Vektoren für Thiobacillus ferrooxidans, die Arsenresistenz aufweisen, dadurch gekennzeichnet , daß ein kryptisches DNA-Plasmid aus einem Stamm der Art. T. ferrooxidans und ein zweites Plasmid mit ein und demselben Restriktionsenzym geschnitten und die Plasmide miteinander verbunden werden, um ein rekombinantes Plasmid zu bilden, und der E. coli-Origin der Replikation aus dem rekombinanten Plasmid entfernt wird, um ein deletiertes rekombinantes Plasmid zu bilden, und weiterhin durch Schneiden mit einem Restriktionsenzym
    aus einem dritten Plasmid die Gene für Arsenresistenz entfernt werden, sodann diese Gene in das deletierte rekombinante Plasmid, das mit demselben Restriktionsenzym geschnitten wurde, inseriert werden, wodurch Plasmide hergestellt werden, die Arsenresistenz aufweisen.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet', daß das kryptische DNA-Plasmid das Plasmid pTF-FC2 ist und eine Größe von 12,4 kb aufweist. 10
    3- Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das zweite Plasmid das Plasmid pBR325 ist.
    4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß das rekombinante Plasmid das Plasmid pDR403 ist und eine Größe von 17,8 kb hat.
    5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4,
    dadurch gekennzeichnet , daß das deletierte
    rekombinante Plasmid das Plasmid pDR404 ist, das eine Größe von 9 kb hat.
    6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß das dritte Plasmid das Plasmid R46 ist, das eine Größe von 7,5 kb hat und As -Gene enthält.
    7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß das dritte Plasmid mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten wird.
    8. Ein Arsenresistenz aufweisendes Plasmid, das durch das Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt wurde.
    9. Ein Arsenresistenz aufweisendes Plasmid pDR4i6, dadurch
    gekennzeichnet, daß es eine Größe von etwa 16,5 kb aufweist und durch das Restriktionsenzym Pvul in fünf Fragmente der Größen 4,4 kb, 3,6 kb, 3,4 kb, 2,8 kb bzw. 2,3 kb teilbar ist.
    10. Ein Arsenresistenz aufweisendes Plasmid pDR420, dadurch gekennzeichnet , daß es eine Größe von etwa 13,3 kb hat und durch das Restriktionsenzym Pvul in vier Fragmente der Größen 4,4 kb, 4,2 kb, 3,6 kb bzw. 1,1 kb teilbar ist.
    11. Verfahren zum Herstellen eines Arsenresistenz aufweisenden Plasmids, im wesentlichen gekennzeich net durch die vorliegende Beschreibung mit Bezug auf die anliegenden Zeichnungen.
    12. Ein Arsenresistenz aufweisendes Plasmid, im wesentlichen gekennzeichnet durch
    die vorliegende Beschreibung mit Bezug auf die anliegenden Zeichnungen.
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