AT391144B - Verfahren zum konstruieren von arsen- resistenten vektoren fuer thiobacillus ferrooxidans - Google Patents

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Description

Nr. 391144
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von Rekombinations-DNA-Plasmidvektoren für Thiobacillus ferrooxidans, welche Arsenresistenz-Gene enthalten und sowohl in T. ferrooxidans als auch Escherichia coli replizieren können.
Die biologische Auslaugung von Arseno-Pyriterzen war bisher durch die Empfindlichkeit der eingesetzten Organismen auf Arsen, das im Verfahren fteigesetzt wird, beschränkt
Obwohl arsenresistente Plasmide für andere Bakterien hergestellt wurden, existieren keine Berichte über die Herstellung derartiger Plasmide für T. ferrooxidans, welche auch in E. coli replizieren können.
Erfindungsgemäß wird ein DNA-Plasmid hergestellt, welches Arsenresistenz-Gene enthält und in T. ferrooxidans replizieren kann. Diese Plasmide können in T. ferrooxidans transformiert werden und erhöhten die Arsenresistenz des Empfängers.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Herstellen von arsenresistenten Vektoren für T. ferrooxidans, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein kryptisches DNA-Plasmid aus einem T. ferrooxidans-Stamm und ein zweites Plasmid, das Antibiotikumresistenz-Gene in E. coli codiert, mit dem gleichen Restriktionsenzym gespalten werden, die Plasmide unter Bildung eines Rekombinationsplasmids verknüpft werden, der E. coli-Replikationsursprung vom Rekombinationsplasmid unter Bildung eines deletierten Rekombinationsplasmids entfernt wird, die Arsenresistenz-Gene von einem dritten Plasmid durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym entfernt werden und die Gene in das deletierte Rekombinationsplasmid durch Spaltung mit dem gleichen Restriktionsenzym insertiert werden.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Arsenresistenz-Plasmid pDR416 mit der Größe von etwa 16,5 kb, das durch das Restriktionsenzym Pvul in fünf Fragmente der Größen 4,4 kb, 3,6 kb, 3,4 kb, 2,8 kb bzw. 2,3 kb geteilt wird.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Arsenresistenz-Plasmid pDR420 mit der Größe von etwa 13,3 kb, das durch das Restriktionsenzym Pvul in vier Fragmente der Größen 4,4 kb, 4,2 kb, 3,6 kb und 1,1 kb geteilt wird.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Plasmide können bei der Auslaugung von Erzen, insbesondere bei der Gewinnung von Gold, verwendet werden.
Die Erfindung wird im nachstehenden an Hand der Zeichnungen beschrieben, worin Fig. 1 Restriktionsmappen der Plasmide pTF-FC2 und pDR401 und Fig. 2 Restriktionsmappen der Plasmide pDR403, pDR404, pDR4l6 und pDR420 sowie eines R46-Fragments sind.
Die gleichzeitig eingereichte Erfindung der Patentinhaberin mit dem Titel "Verfahren zum Herstellen eines Plasmidvektors für Thiobacillus ferrooxidans" beschreibt u. a. die Herstellung des Plasmids pDR401.
Aus einem T. ferrooxidans FC-Stamm, isoliert aus einer sauren Laugenflüssigkeit der Fairview-Mine, General Mining Union Corporation Limited, Südafrika, wurde ein 12,4 Kilobasen (kb) kryptisches Plasmid pTF-FC2 extrahiert. Vom Microbiology Department der Universität von Cape Town wurde glaubhaft gemacht, daß die Mine allgemein zugänglich ist und das Isolieren des Plasmids aus der Bakterienart T. ferrooxidans wiederholbar ist. Die Restriktionsmappe von pTF-FC2 zeigt, daß es eine einzige Pstl-, Xhol-, Kpnl-, EcoRl-, Apal- und Clal-Restriktionsstelle und zwei Pvul-Restriktionsstellen aufweist (siehe Fig. 1).
Ein Rekombinationsplasmid pDR401 wurde durch Insertieren des E. coli-Plasmids pBR325 in die Pstl-Stelle von pTF-FC2 hergestellt. pBR325 enthält die Gene für Ampicillin (Ap)-, Chloramphenicol (Cm)- und Tetracyclin (Tc)-Resistenz. Klonieren an der Stelle Pst2 insertionsinaktivierte das Ap^-Gen, und E. coli
Transformanten, nämlich Cm*\ Tc^ und Ap^, wurden isoliert. Das Rekombinationsplasmid pDR401 (etwa 17,8 kb) wurde aus den E. coli-Transformanten extrahiert und durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Dieses neue Rekombinationsplasmid enthält die Gene für Cm^ und Tc^ und kann in T. ferrooxidans und E. coli replizieren.
Es ist auch möglich, obwohl von der Orientierung der Insertion des Plasmids pBR325 abhängig, das Plasmid pDR401 (17,8 kb) oder das Plasmid pDR403 (17,8 kb) herzustellen, von denen eine Restriktionsmappe in Fig. 2 gezeigt ist. (Es soll an dieser Stelle auch darauf hingewiesen werden, daß gegebenenfalls auch andere geeignete Plasmide anstelle von pBR325 verwendet werden können.)
Erfindungsgemäß wird derE. coli-Replikationsursprung vom pDR403-Plasmid unter Bildung des deletierten Rekombinationsplasmids pDR404 (9 kb) entfernt (siehe Fig. 2).
Arsenresistenz-Gene werden vom Plasmid R46, einem 7,5 kp-Fragment, welches die As^ und Tc^-Gene enthält und ein EcoRl-Digest des IncN-plasmischen R46 (Brown & Willets, 1981) ist, entfernt. Dies wird durch Spalten des R46-Plasmids mit dem Restriktionsenzym ECoRl bewirkt Die Arsenresistenz-Gene werden in das Plasmid pDR404 durch Spaltung mit dem gleichen Restriktionsenzym EcoRl insertiert, wodurch die Arsenresistenz-Plasmide pDR416 und pDR420 gebildet werden.
Jedes der Plasmide pDR416 (16,5 kb) und pDR420 (13,3 kb) wurde durch endonukleolytische Spaltung mit dem Restriktionsenzym Pvul gekennzeichnet
Das Plasmid pDR416 wird auf diese Weise in fünf Fragmente gespalten, welche die Größen 4,4 kb, 3,6 kb, 3,4 kb, 2,8 kb bzw. 2,3 kb besitzen.
Das Plasmid pDR420 wird durch das gleiche Enzym in vier Fragmente der Größen 4,4 kb, 4,2 kb, 3,6 kb bzw. 1,1 kb gespalten. -2-

Claims (9)

  1. Nr. 391 144 Stämme von T. femooxidans, in welche die Plasmide der vorliegenden Erfindung transformiert wurden, finden Verwendung für das Auslaugen von Arseno-Pyriterzen und die dadurch verstärkte Extraktion von Mineralien daraus. Nach einem bekannten Verfahren wird Golderz dem Arseno-Pyrit ausgesetzt und, wenn Gold für die 5 Extraktion freigesetzt wird, geht Arsen in die Lösung. Die Arsenkonzentration wird immer stärker und dies hemmt den Organismus, wodurch die Extraktionswirksamkeit absinkt. Dem Problem wird entsprochen, indem das Arsen in regelmäßigen Intervallen ausgefällt und das Verfahren mit frischer Lösung fortgesetzt wird. Als Ergebnis wird das Verfahren zeitaufwendig und teuer. Die erfindungsgemäß erhaltenen Plasmide sind arsenresistent und, transformiert in T. ferrooxidans-Stämme, 10 bewirken sie ein beschleunigtes Auslaugen der Erze. Dies ergibt sich, weil der Zeitraum, bevor eine Arsenausfällung, wenn überhaupt, benötigt wird, erhöht wird. 15 PATENTANSPRÜCHE 20 1. Verfahren zum Herstellen von arsenresistenten Vektoren für Thiobacillus ferrooxidans, dadurch 25 gekennzeichnet, daß ein kryptisches DNA-Plasmid aus einem T. ferrooxidans-Stamm und ein zweites Plasmid, das Antibiotikumresistenz-Gene in E. coli codiert, mit dem gleichen Restriktionsenzym gespalten werden, die Plasmide unter Bildung eines Rekombinationsplasmids verknüpft werden, der E. coli-Replikationsursprung vom Rekombinationsplasmid unter Bildung eines deletierten Rekombinationsplasmids entfernt wird, die Arsenresistenz-Gene von einem dritten Plasmid durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym 30 entfernt werden und die Gene in das deletierte Rekombinationsplasmid durch Spaltung mit dem gleichen Restriktionsenzym insertiert werden.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als kryptisches DNA-Plasmid pTF-FC2 mit der Größe von 12,4 kb eingesetzt wird. 35
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als zweites Plasmid pBR325 eingesetzt wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Rekombinationsplasmid pBR403 40 die Größe 17,8 kb aufweist.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das deletierte Rekombinationsplasmid pDR404 die Größe 9 kb aufweist.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als drittes Plasmid R46 (7,5 kb), welches As^-Gene enthält, eingesetzt wird.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das dritte Plasmid mit dem Restriktionsenzym EcoRl gespalten wird. 50
  8. 8. Arsenresistenz-Plasmid pDR416, gekennzeichnet durch eine Größe von etwa 16,5 kb und durch das Restriktionsenzym Pvul in fünf Fragmente der Größen 4,4 kb, 3,6 kb, 3,4 kb, 2,8 kb bzw. 2,3 kb teilbar.
  9. 9. Arsenresistenz-Plasmid pDR420, gekennzeichnet durch eine Größe von etwa 13,3 kb und durch das 55 Restriktionsenzym Pvul in vier Fragmente der Größen 4,4 kb, 4,2 kb, 3,6 kb bzw. 1,1 kb teilbar. Hiezu 2 Blatt Zeichnungen -3- 60
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