DD283836A5 - Verfahren zur bildung von antigenen hbv-teilchen - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Bildung von antigenen HBV-Teilchen, die im wesentlichen aus preS ind 2-Protein bestehen, beschrieben. Das Verfahren umfasst folgende Stufen: a) Transformieren einer methylotrophen Hefe mit mindestens einem Vektor, der mindestens eine Expressionskassette aufweist, die ein strukturelles Gen für preS ind 2 enthält, das operativ mit einem regulatorischen Bereich und einer 3'-Terminationssequenz verknüpft ist, und anschließend b) Züchten des erhaltenen transformierten Hefestamms unter geeigneten Bedingungen zur Bildung des HBsAG-preS ind 2-Proteins. Ferner werden neue DNA-Moleküle und mit diesen Molekülen transformierte Wirte beschrieben.{HBV-Teilchen; preS ind 2-Protein; Transformation; Methylotrophe Hefe; Vektor; Expressionskassette; Terminationssequenz}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Techik.

Charakteristik de» bekannten technischen Lösungen

Hepatitis B-Virus (HBV) verursacht sowohl akute als auch chronische Erkrankungen und stellt weltweit ein Problem der öffentlichen Gesundheitspflege dar. HBV macht sich als eine chi onisch schwächende Infektion bemerkbar, die nach und nach zu schweren Leberschäden, primären Karzinomen und zum Tod führen kann. In der Mehrzahl der Fälle erholen sich die Patienten vollständig von HBV. Jedoch werden erhebliche Anteile der mit HBV infizierten Bevölkerungskreise zu chronischen Trägern der Krankheit mit der Gefahr einer Übertragung auf andere.

Jüngste Fortschritte in der rekombinanten DNA-Technik haben zu wertvollen Methoden zur Aufklärung der genetischen Struktur

von HBV sowie zur Bereitstellung von Mitteln zur Herstellung von Impfstoffen gegen HBV goführt. Man weiß nunmehr, daß das

HBV-Genom aus annähernd 3,2-kb-Paaren von partiell doppolsträngiger DNAmit einer kovalent gebundenen DNA-Polymerase,

in einem 27nm-Nucloocapsid eingeschlossen, besteht, Das Nucleocapsid ist von einer Lipoproteinhülle umgeben, die auszellulären Lipidnn und Hepatitis B-Oberflächencntigonon (HBsAg) besteht. Dioses Gebilde wird als das Virion bezeichnet undweist einen Durchmesser von 42 nm auf.

Es wurde auch festgestellt, daß die virale Hülle aus drei unterschiedlichen, aber verwandten Oberflächenproteinen besteht. Diese Proteine werden im allgemeinen als S-, preS₂- und preS,-Proteine bezeichnet. Jedes Virion umfaßt "00- bis

4C0-S-Proteinmoleküle und 40 bis 80preS₂- und preSfProteinmoleküle.

Das S-Protein besteht aus 226 Aminosäuren und stellt die Hauptkomponente der normalen viralen Lipoproteinhülle dar. Das S-Protein weist etwa 24 bis 25 Kilodalton (kDa) auf und kann als P24 oder P25 bezeichnet werden. Das S-Protein kann auch zu

einem 27-28 Küodalton-Glykoprotein glykosyliert sein, das als GP27 oder GP 28 bezeichnet wird.

Beim zweiten HBsAg-Protein handelt es sich um das preS₂-Oberflächenantigen, das auch als mittleres HBsAg-Polypeptid

bezeichnet wird. PreS₂ besteht aus 281 Aminosäuren, die durch Addition von 55 Aminosäuren an das N-Encie des S-Proteinsgebildet werden. Das preS₂-Protein weist etwa 31 Kilodalton auf und kann als P31-Protein bezeichnet werden. Das preS₂-Proteinbesitzt ebenfalls zwei glykosylierte Formen von 33 und 36 Kilodalton, die als GP33 bzw. GP36 bezeichnet werden. Es wirdangenommen, daß dieses Antigen eine zusätzliche antigene Reaktion bei Personen, die gegenüber S nicht oder nur schwachreagieren, hervorruft.

Beim dritten HBsAg-Protein handelt es sich um das preSi-Oberflächenantigen, das auch als spätes HBsAg-Polypeptid bezeichnet

wird. PreSi besteht aus 389-400 Aminosäuren (je nach dem antigenen Untertyp von HBV). Die für PreS, besondere Sequenzbesteht aus 108-119 Aminosäuren, die an das N-Ende des vollständigen preS₂-Proteins addiert sind. Das preS,-Protein weistetwa 43 Kilodalton auf und kann als P43-Protein bezeichnet werden. preS, existiert ebenfalls in einer glykosylierten Form mit46 Kilodalton, die als GP46-Glykoprotein bezeichnet werden kann.

Im Verlauf einer HBV-Infektion werden vollständige virale Nucleocapside mit einer Lipoproteinhülle eingewickelt, wodurch

42-nm-Teilchen gebildet werden. Während der HBV-Infektion werden auch leere 22-nm-Teilchen gebildet, die vorwiegend ausden S- und preSj-Proteinen bestehen und auch einige preS,-Proteine enthalten. Während das vollständige virale Nucleocapsidinfektiös ist, sind die leeren 22-nm-Teilchon nicht infektiös. Die leeren Teilchen rufen jedoch eine für eine Immunität ausreichende

Immunreaktion hervor und können zur Herstellung von Impfstoffen gegen HBV verwendet werden. Mit 22-nm-Teilchen gebildete Hepatitis B-Impfstoffe wurden bisher aus dem Plasma von humanen HBV-Trägern hergestellt. Ungünstigerweise müssen aus Humanplasma gewonnene 22-nm-Teilchen eingehend gereinigt werden, um infektiöse HBV-Teilchen sowio andere im Plasma vorliegende Krankheitserreger zu entfernen. Ferner unterliegt die Herstellung von Hepatitis B-Impfstoffen aufgrund der begrenzten Zugänglichkeit von Humanplasma ernsten Beschränkungen. Die Anwendung von rekombinanter DNA-Technik hat es möglich gemacht, das Hepatitis S-Protein in einem 22-nm-Teilchen in

transformierten Säugetierzellinien und Hefe zu exprimieren.

Bemühungen zur Herstellung des antigenen und als potentieller Impfstoff wirksamen preS₂-Proteins haben sich als

ungewöhnlich schwierig erwiesen. Es hat sich herausgestellt, daß das preS₂-Protein sehr empfindlich gegenüber einer

Proteolyse in rekombinanten Systemen ist. Die Proteolyse ergibt zwei kleinere Proteinfragmente, bei denen die antigene Beschaffenheit von preS₂ nicht erhalten bleibt. Ferner ist es sehr schwierig, das preS₂-Protein in rekombinanten Systemen zu

exprimieren. Der Expressionsgrad von preS₂ beträgt etwa '/to des Anteils an S-Protein in den gleichen rekombinr.ntenSystemen.

Daher würde es einen erheblichen Fortschritt bedeuten, ein Verfahren zur Herstellung von antigenen HBV-Teilchen zu

entwickeln, die im wesentlichen aus unglykosyliertem preS₂-Protein von HBV bestehen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, einen neuen Wen -:ur Herstellung von antigenen HBV-Teilchen bereitzustellen, die zur Herstellung von Impfstoffen geeignet sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen Weg für die verstärkte- Bildung von antigenen HBV-Teilchen bereitzustellen, die im wesentlichen aus unglykosyliertem preS₂-Protein von HBV bestehen. Ferner sollen erfindungsgemäß neue Vektoren mit einem Gehalt an DNA-Sequsnzen bereitgestellt werden, die für das preS₂-Protein kodieren. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, neue rr-ethylotrophe Hefen bereitzustellen, die mit einem oder mehreren Vektoren transformiert sind und zur verstärkten Bildung von HBV-Teilchen mit einen Gehalt an preS₂-Protein fähig sind. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur verstärkten Bildung von antigenen HBV-Teilchen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine methylotrcphe Hefe mit mindestens einem Vektor, der eine kompatible Expressionskassette mit einem strukturellen Gen für preS₂ enthält, transformiert und die erhaltenen Transformanten unter für die Bildung der Teilchen geeigneten Bedingungen züchtet.

Fig. 1: stellt HBV dar, das das preS₂-Gen von HBV Serotyp adw. enthält. Das Plasmid AM6 ist ein Derivat des in Fig. 1 gezeigten

HBV-Geroms, worin das pBr322-Plasmid an der EamHI-Stelle in Position 26 eingebaut ist. Fig. 2: zeigt das Plasmid pYM4, ein von pBr322 abgeleitetes Plasmid mit dem an der BamHI-Stelle eingebauten Pichia pastoris-HIS4-Gen. Klammern geben an, daß diese Stelle zerstört worden ist. Das HIS4-Gen ist in pYJ30 (NRRL B-15890)

hinterlegt

Fig.3: stellt das Plasmid pYM 10 dar. pYM 10 ist ein Derivat von pYJ 30 (NRRL B-15890), bei dem die BamHI-Stelle in 2959 zerstörtworden ist. Die Klammern in der Figur bezeichnen eine zerstörte Restriktionsstelle.

Fig. 4: zeigt das Plasmid pA0804, das einen linearen, integration, ortsspezifischen Vektor in dem Fragment im Uhrzeigersinn von BgI Il bis BgI Il enthält. Das strukturelle Gen kann an der einzigen EcoRI-Stello d oses Plasmids eingebaut weiden.

Das preS]-Strukturgen ist bekannt und wurde von Lo, Characteristics of preSj Region of Hepatitis B Virus, Biochemical amJ Biophysical Research Communications, Bd. 135 (1986), S. 382 sequenziert, Zahlreiche auf diesem Gebiet tötige Wissenschaftler

haben dieses Strukturgen geklont und exprimiert; vgl. z. B. Lo sowie Valenzuela, Synthöf is and Assembly in Yeast of Hepatitis 3

Surface Antigen Particles Containing the Polyalbumin Receptor, Biotechnology, Bd. 3 (ia85), S.317, um nur zwei zu nennen. Das Strukturgen kann also von auf diesem Gebiet tätigen Wissenschaftlern erhalten, synthetisiert oder reisoliert werden. Ferner ist

festzuhalten, daß beliebige preS₂-Serctypen für die praktische Durchführung der Erfindung eingesetzt werden können.

Das in der erfindungsgemäßen Praxis eingesetzte preSj-Strukturgen, Serntype adw. wurde aus Plasmid AM6 erhalten. Das Plasmid AM6 ist ein Derivat des in Fig. 1 gezeigten HBV-Genoms, wobei das pBr322-Plasmid an der BamHIStelle in Position 26

eingebaut ist. Die Nucleotidsequenz dieses preSj-Strukturgons ist in Tabelle I aufgeführt. Die darin verwendeten Plasmidekönnen in beliebigen geeigneten E.coli-Wirten, wie MC 1061, gezüchtet werden.

Zwei Segmente von preS₂-Strukturgenen wurden aus dem Plasmid AM 6 gewonnen, und die Nuclootidsequenz für die ersten 13 Aminosäuren des N-Endes wurde in vitro synthetisiert. Die Synthese der hier verwendeten Nucleotidsequenz kann entweder

durch chemische oder enzymatisch^ Verfahren erreicht werden, z. B. durch chemische Verfahren auf der Basis der

Phosphotriester- oder Phosphitchemie. Der für das C-Ende kodierende Bereich mit einem Gehalt an 75% des Strukturgens für preSj wurde aus dem Plasmid AM 6 durch Dral-Verdanung des Plasmids erhalten. Die Dral-Verdauung wurde unter Einsatz von handelsüblicher Dral-Endonucloaso

durchgeführt (sämtliche Endonucleasen wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers eingesetzt). Die Dral-Fragmentewurden sodann mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.

Ein octamerer Stu !-Linker (AAGGCCTT) wurde sodann gemäß üblichen DNA-Synthosetechniken hergestellt und mit den Dra I- Fragmenten unter Verwendung von T4-Ligase in stumpfondiger Verknüpfung verbunden. Die Verknüpfung wurde durch Phenolextraktion gefolgt von einer Ethanolfäliung beendet. Die erhaltenen Fragmente wurden sodann zur Entfernung von Multimeren von Stu I mit Stu I-Endonuclease verdaut. Die Stu I-Linkerfragmente wurden sodann mit Xba I verdaut. Das erhaltene Stu I/Xba I-Fragment von etwa 600 bp mit dem für das C-Ende kodierenden Bereich des preS₂-Strukturgens wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses 600-bp-Fragment wurde mit T4-Ligase in ein 5,7-kb-Xbal/Stu-Verdauungsprodukt des Plasmids pYM4, Fig.2, das durch Agarosegelelektrophorese isoliert worden war, geknüpft. Das Ligationsgemisch wurde sodann direkt zur Transformation von leistungsfähigen E. coli-Zellen (MC 1061) verwendet, die

sodann in Gegenwart von Ampicillin gezüchtet wurden.

Tabelle I

7 10 20 30 4,0

GAATTC ATG CAGTG^GAACTCCACTGCC T TCCACCAAAC ΐ β

Start _von

50 60 70 80

T G C A C G Λ T C C C A G Λ G T C Λ G Ü C G T C T C T Λ T C T ΐ CCTUC ΐ ϋ G

90 100 . Uu 120

T G G C T C C Λ G T T C Λ G G Λ Λ C Λ Ü T Λ Λ Λ C C C ΐ G C T C C G Λ Λ ΐ Λ T T

130 140 150 160

GCCTCTCACATCTCGTCA A' TCTCCGCGAG G ACT GGGCACC

170 172 180 190 200

CTGTGACGAAC ATG GAGAACATCACATCAGGATTCCTAGG

Start S

210 220 . 230 240

ACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACA

250 260 270 . 280

AGAATCCTCACAATAC C q CAGAGTCTAGAC TCGTGG TGGA

290 300 310 320

CTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAT Ci:C CCC TGTG T CTTGG

330 340 350 360

CCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACC

370 380 390 400

TCCTGTCCTCCAAT T T GTCC T G U ΐ T ATCGCTGG Λ T U ΐ G T C

410 420 430 440

TGCGGCGTTTTATCA ΐ Λ ΐ ΐ CCTC ΐ T CATCCTÜC T G Ι) ΐ Λ ΐ G

450 460 470 480

CCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGCTATG

490 500 510 520

TTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCA

530 540 550 560

GTACGGGACCATGCAAAACC ΐ GCACGACTCC T GCTCAAGG

570 580 590 600

CAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACG

610 620 630 640

GATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCGTCCTGGG

Tabelle I - Fortsetzung

650 660 670 680

CTTTCGCAAAAT/»CC T Λ T G Ü CA ti T C G G C C T C Λ ϋ T C C G ΐ T ΐ

6V 700 710 720

CTC T TGGCTuAG T TTACTAG ΐ GCCA T TT GT TCAü TUG T TC

730 740 750 /60

G TAGGÜ CTTTCCCCCACTGTTTGG C TTT CAGCTA T Λ Ί¹ GGA

770 780 790 800

TGATGTGGTATTGGGGGCCAAG TCTG T ACAGCA T CGTGAG

810 820 830 840

TCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGG

850 852 GTATACATT TAA ACCC TAA

Stop-Codon

Mit Erfolg transformierte Kolonien wurden ausgewählt, und die Plasmid-DNA gemäß dem Verfahren von Birnboim und DoIy (Nucleic Acids Research. Bd.7 [1979), Seite 1313) extrahiert.

Die extrahierte Plasmid-DNA wurde mit Stu I verdaut, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. EcoR I-Linker wurden hergestellt und mit T4 mit den Stu I-Fragmenten verknüpft. Überschüssige Linker wurden durch EcoR I-Verdauung entfernt. Diese (Or EcoR I-Vei knüpfungsbehandlung unterworfenen Fragmente wurden weiter mit Xba I verdaut und der Elektrophorese unterzogen, um Fragmente mit einen*. Gehalt an dem C-endständigen Bereich des preS₂-Str jkturgens zu isolieren. Das Xba l-EcoRI-Virdauungsprodukt wurde in Xbal-EcoRI-geschnittenespUC 18 eingebaut. Das Ligationsgomisch wurde in leistungsfähige E. coli-Zellen (MC 1061) transformiert, die dann in Gegenwart von Ampicillin gezüchtet wurden Die den C-endständigen Bereich des preS₂-Strukturgens enthaltenden transformierten Zellen wurden durch Fragmentverdauungsanalyse unter Verwendung von CIa I und Xba! ausgewählt. Das gemäß diesem Verfahren ausgewählte Plasmid wurde als pHS2-B bezeichnet.

Der Mittelbereich des preSj-Gens wurde gewonnen, indem man zunächst das Plasmid AM 6 mit Xba I und BamH I verdaut"). Das gewünschte 250-bp-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Das 250-bp-Xba l/BamH I-Fragment wurde sodann in pUC 18, das mit Xba I und BamH I verdaut worden war, ligiert und zur Transformation von E. coli MC 1061 verwendet. In Gegenwart von Ampicillin gezüchtete Kulturen wurden analysiert, indem man die Plasmid-DNA gewann und mit BamH I verdaute. Von den Plasmiden, die bei der Elektrophorese ein lineares 2,7-kb-Fragment enthielten, wurde angenommen, daß sie das gewünschte 250-bp-Fragment enthielten. Eine transformierte Kolonie mit einem Gehalt an dem 250-bp-Fragment wurde isoliert und im Großmaßstab gezüchtet. Die P!asmid-DNA wurde isoliert und aus der mit EcoRI und BamH I verdauten Kolonie gereinigt. Die Vektorbande wurde durch Elektrophorese isoliert. Der Vektor wurde sodann mit dem nachstehenden, kinasebehandelten, doppelsträngigen Oligonucleotid verknüpft.

Pst I BamH I

5'AATTCAATCCCTCTGCAG 3' 3'GTTAGGCAGACGTCCTAG 5

Das Ligationsreaktionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli MC 1061 verwendet. Kolonien mit dem richtigen Insert wurden aufgrund der Ampicillinresistenz ausgewählt. Dieses Plasmid wurde als pPS2 bezeichnet.

Der N-endständige Kodierungsbereich von preS₂ wurde als ein synthetisches Oligonucleotid der folgenden Sequenz hergestellt.

Hindlll Pst I

5' AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3' ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAGB'

Diese Sequenz wurde in ein Hind III- und Pst I-Verdauungsprodukt von pUC 18 geklont. Die gewünschten Transformanten waren durch die Anwesenheit eines Fragments von etwa 75 bp nach EcoRI-Verdauung und Elektrophorese gekennzeichnet. Die gemäß diesem Verfahren ausgewählten Plasmide wurden als pTBO-2A bezeichnet.

-6- 283 826

Dar Mittelboreich des Gens wurde durch Verdauung des Vektors pTBO-2 A mit l'ttl und Xba I hi.izuge'iigt. Beim Insert handelte es sich um das 250-bb-Pstl-Xbal-Fragment von pPS2. Die Transformanten waren durch die Anwesenheit eines >300bp EcoRI-Fragments sowie eines 290-bp-Xbal/HindHI-Fragments charakterisiert. Das genaue Isolat wurde als pTBO-3 bezeichnet. Das vollständige preSjGon wurde durch Inserieren des Hind Ill/Xba I-Fragments aus pTBO-3 in mit Xba I/Hind III verdautes pHS 2 B erhalten. Ampicillinresistente Transformanten waren durch die Anwesenheit einos 82b-bp-EcoRI-Fragments gekennzeichnet. Dieser Baustein wurde als pTBO4 bezeichnet.

Die Züchtung des vorstehend aufgeführten E. coli-Stammes kann nach beliebigen geeigneten Methoden erfolgen. Allgemeine Techniken zur Züchtung von E. coil sind bekannt, und Anpassungen dieser Methoden an die spaziellon Bedürfnisse der hier verwendete^ Stämme liegen im Bereich des Könnens eines Fachmanns.

Die Gewinnung von Plasmid-DNA aus E. coli katiü aufgrund ihrer kompakten Größe und der geschlossenen sphärischen, superhelikalen Form nach mehreren Techniken erfolgen. Beispielsweise können die Wirtszellen im Anschluß an die Ernte durch Zentrifugation pelletisiert und anschließend resuspendiert und lysiert werden. Das Lysat sollte zur Entfernung von Zellbruchsttllen zentrifugiert und der die DNA enthaltende Überstand gewonnen werden. Eine Phenolextraktion kann durchgeführt werden, um den Großteil von anderen Verunreinigungen aus der DNA zu entfernen. Die mit Phenol extrahierte DNA kann sodann unter Anwendung einer Dichtegradientenzentrifugation oder einer Gelfiltrationstechnik weiter behandelt werden, um die Plasmid-DNA von der bakteriellen DNA zu trennen. Diese für die vorerwähnte Trennung angewandten Techniken sind dem Fachmann geläufig. Zahlreiche Verfahren zur Durchführung dieser Techniken sind bekannt. Die Nucleaseverdauung d3s Plasmids kann durch Wchl geeigneter Endonucleasen erreicht werden, die das gewählte Plasrnid in solcherweise schneiden, daß die Gewinnung des preSj-Strukturgens erleichtert wird. Die verwendeten Endonucleasen hängen vom Plasmid ab, aus dem das preSj-Gen herauszuschneiden ist. Beispielsweise kann das im Plasmid AM 6 enthaltene preSj-Strukturgen in einem Dral-Hincll-Fragmunt gewonnen werden.

Die Gelelektrophorese von DNA kann unter Anwendung von zahlreichen Techniken durchgeführt werden; vgl. P. G. Sealy und E. M. Southern, Gel Electrophoresis of Nucleic Acids -A Practical Approach (Herausgeber D. Rickwood und B. D. Harnes), 1982, Seite 39. Eine Elution kann ebenfalls unter Anwendung, zahlreicher für das beteiligte Gel geeigneter Techniken durchgeführt werden, z. B. durch Elektroelution, Diffusion, Gelauflösung (Agarosegele) oder physikalische Extrusion (Agarosegele). Ferner ist darauf hinzuweisen, daß bei einigen Gelen, z. B. hei hochwertiger Agarose von niedriger Schmelztemperatur, eine Elution möglicherweise nicht erforderlich ist.

Nachdem das Fragment, das das preS₂-Strukturgen oder Fragmente davon anthält, isoliert worden ist, können zusätzliche Arbeitsgänge erforderlich sein, bevor es in den Vektor inseriert wird. Diese Arbeitsgänge können die Addition von Linkern oder eine stumpfendige Ausgestaltung des Fragmentes umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.

Im Anschluß an die Isolation des preS₂-Strukturgens wird das Gen in einen geeigneten methylotrophen Hefevektor, z. B. in ein Plasmid, inseriert. Für die praktische Durchführung der Erfindung werden Vektoren bevorzugt, die mit der Gattung Pichia und insbesondere mit Pichia pastoris verträglich sind.

Plasmide stellen seit lengem die in der rckombinanten DNA-Technik angewandten Grundelemente dar. Bei Plasmiden handelt es sich um kreisförmige, extrachromosomale, doppelsträngige DNA, die in Mikroorganismen vorkommt. Plasmide treten pro Zelle als einfache oder mehrfache Kopien auf. In der Plasmid-DNA ist die für die Plasmidreproduktion erforderliche Information enthalten, d. h. eine Replikationsursprungsstelle ist für die bakterielle Replikation enthalten. Ein oder mehrere Mittel zur phänotypischen Auswahl des Plasmids in transformierten Zellen können ebenfalls in der im Plasmid kodierten Information enthalten sein. Phänotypische oder Selektionsmarker, wie antibiotische Resistenzgene oder Gene, die Defekte in den biochemischen Stoffwechselwegen des Wirts ausgleichen, ermöglichen die Erkennung, Auwahl und Aufrechterhaltung von Klonen der Wirtszellen, die transformiert worden sind.

Um das preS₂-Strukturgen in methylotropher Hefe lu exprimioren, muß das Gen in operativer Weise mit einem 5'-Requlationsbereich und einer 3'-Terminationssequenz verknüpft sein, wodurch die Expressionskassette gebildet wird, die über einen Vektor in den Wirt inseriert wird.

Nachstehend finden sich zu Klarstellungszweckon Definitionen für verschiedene Ausdrücke.

Der Ausdruck „operativ verknüpft" bezieht sich auf eine benachbarte Stellung, in der die Komponenten so angeordnet sind, daß sie ihre Funktion erfüllen.

Der Ausdruck „regulatorischer Bereich" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die auf verschiedene Stimuli reagieren und die Geschwindigkeit der mRNA-Transkription beeinflussen.

Der Ausdruck „3'-Terminationssequenz" bezieht sich auf Sequenzen in der 3'-Stellung zum Stopp-Codon, die eine Stabilisierung der mRNA bewirken, z.B. Sequenzen, die eine Polyadenylierung hervorrufen.

Der Ausdruck „mit Pichia verträglich" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die ihre normale Funktion in Pichia ausüben, wie von Pichia abgeleitete Regulationsbereiche und 3'-Terminationssequenzen.

Für die praktische Durchführung der Erfindung werden integrative Vektoren bevorzugt, z. B. der lineare, ortsspozifische, integrative Vektor von Cregg gemäß EP-A-86114700.7. Derartige Vektoren umfassen eine angeordnete Sequenz von mindestens (1) einem ersten inserierbaren DNA-Fragment; (2) einem solektierbaren Markergen; und (3) einem zweiten inserierbaren DNA-Fragment.

Das erste und zweite inserierbare DNA-Fragment weist jeweils mindestens etwa eine Länge von 200 Nucleotiden sowie Nucleotidsequenzen auf, die zu Bereichen der Genom-DNA von Spezies der Gattung Pichia homolog sind. Die verschiedenen Komponenten des integrativen Vektors sind seriell unter Bildung eines linearen DNA-Fragments so angeordnet, r'aß die Expressionskassette und das selektierbare Markergen sich zwischen dem 3'-Ende des ersten inserierbaren DNA-Fragments und dem 5'-Ende des zweiten inserierbaren DNA-Fragments befinden.

Das erste und zweite inserierbare DNA-Fragment sind in bezug zueinander im seriell angeordneten linearen Fragment so orientiert, wie sie im Ausgangsgenom oriantiert sind.

Bei den Nucleotidsequenzen, die als erstes und zweites inserierbares DNA-Fragment geeignet sind, handelt es sich um Nucleotidsequenzen, die zu separatem Bereichen der nativen Genomstelle, an der eine Genornmodifikation erfolgen soll, homolog sind. Soll beispielsweise eine Genommodifikation am Ort des Alkohol-oxidase-Gons erfolgen, so handelt es sich beim verwendeten ersten und zweiten inserierbaren DNA-Fragment um Sequenzei.. die zu separaten Bereichen des Orts des Alkoholoxidase-Gens homolog sind. Damit eine Genommodifikation im Sinne der vorliegenden Erfindung er'olgt, müssen die beiden inserierbaren DNA-Fragmente in bezug zueinander im linearen Fragment in der gleichen relativen Orientierung orientiert sein, wie sie im Ausgangsgenom vorliegt. Beispiele für Nucleotidsequenzen, die als erstes und zweites inserierbares DNA-Fragment verwendet werden können, sind Nuclootidsequenzon, die aus folgender Gruppe ausgewählt sind: Alkohol-oxidaso (AOX 1 )-Gen, Dihydroxyaceton-synthase-IDHAS 1 )-Gen, p40-Gen und HIS4-Gen. Das A0X1-Gen, DHAS 1-Gen, p40-Gen und HIS4-Gen sind in der europäischen Offenlegungsschrift 0183071 beschrieben, auf die* hier vollinhaltlich bezug genommen wird. Das erste inserierbare DNA-Fragment kann einen einsatzfähigen Regulationsbereich enthalten, der den in der Expressionskassette eingesetzten Regulationsbereich umfassen kann. Die Verwendung des ersten inserierbaren DNA-Fragments als Regulationsbereich für eine Expressionskassette stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Fig.4 zeigt ein Diagrimm eines Vektors, der sich des ersten inseriorbaren DNA-Fragments als Regulationst ereich für eine Kassette bedient.

Gegebenenfalls können, wie in Fig.4 gezeigt, eine oder mehrere Insertionsstellen und eine 3'-Terminationssequenz unmittelbar in 3'-Stellung zum ersten inserierbaren DNA-Fragment angeordnet sein. Diese Anordnung des linearen, ortsspezifischen, integrativen Vektors hat den zusätzlichen Vorteil, daß eine fertige Stelle zur Insertion eines Strukturgens bereitgestellt wird, ohne daß die Addition einer kompatiblon 3'-Terminationssequenz erforderlich ist.

Ferner ist es notwendig, mindestens ein selektierbares Markergen in die zur Transformation des Wirtsstammes verwendete KDN aufzunehmen. Dies erleichtert die Auswahl und die Isolation von solchen Organismen, in die transformierende DNA eingebaut worden ist. Das Markergen verleiht den ι transformierten Organismus ein phänotypisches Merkmal, das der Wirt nicht aufwies, z.B. die wiederhergestellte Fähigkeit zur Bildung einer spezieller Aminosäure, während der nichttransformierte Wirt einen Defekt im spezifischen biosynthetischen Weg zur Herstellung dieser Aminosäure aufweist oder eine Resistenz gegen Antibiotika und dgl.

Beispiele für selektierbare Markergene sind solche aus der Gruppe HIS4-Gen und ARG4-Gen von Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae, Invertase-Gen (SUC2) von Saccharomyces cerevisiae oder G418-Phosphotransferase-Gen von den E.coli-transponierbaren Elementen Tnßüi oder Tn903

Der Fachmann erkennt, daß weitere DNA-Sequenzen in die in der erfindungsgemäßen Praxis verwendeten Vektoren ebenfalls eingebaut werden können, z. B. bakterielle Plasmid-DNA, Bakteriophagen-DNA und dgl. Derartige Sequenzen ermöglichen die Amplifikation und Aufrechterhaltung dieser Ve¹ toren in bakteriellen Wirten.

Enthält das erste inserierbare DNA-Fragment keinen Regulationsbereich, muß ein geeigneter Regulationsbereich unter operativer Verknüpfung in das Strukturgen inseriert werden, um eine betriebsfähige Expressionskassefe zu gewährleisten. In ähnlicher Weise muß, wenn an der Insertionsstelle zur Vervollständigung der Expressionskassette keine 3'-Terminationssequenz vorgesehen ist, eine derartige 3'-Terminationssequen7 operativ mit dem einzubauenden Strukturgen verknüpft werden. Dem Fachmann sind zahlreiche Regulationsbereiche bekannt, die charakterisiert worden sind und die in Verbindung mit methylotrophen Hefen verwendet werden können. Beispiele für Regulationsbereiche, die keine Beschränkung bedeuten, sind Heferegulationsbereiche aus der Gruppe saure Phosphatase-, Galactokinase-, Alkohol-dohydrogena.se-, Cytochrom c-, α-Mating-Faktor und Glycerinaldehyd-S-phosphat-dehydrogenase-Regulationsbereiche, isoliert aus Saccharomyces cerevisiae; primäre Alkoholoxidase (AOX 1)-, Dihyclroxyacoton-synthase (DHAS 1)-, p40- und HIS4-Regulationsbereiche, abgeleitet von Pichia pastoris, und dgl. In der erfindungsgemäßen Praxis werden derzeit als bevorzugte Regulationsbereiche solche eingesetzt, die durch die Fähigkeit charakterisiert sind, auf Methanol enthaltende Madien zu reagieren, z. B. Regulationsbereiche aus der Gruppe AOX1, und ρ40, die in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung 780102 offenbart sind. Für die erfindungsgemäße Praxis wird der AOX1 -Regulationsbereich besonders bevorzugt.

Wie vorstehend erörtert, können 3'-Terminationssequenzen in der Expreesionskassette verwende*, werden oder einen Teil des Vektors darstellen. Die 3'-Terminationssequenzen können bei operativ jr Verknüpfung mit einem Gen eine Termination, Polyadenylierung und/oder Stabilisierung der Messenger-RNA, für die das Strukturgen kodiert, bewirken. Einig? Beispiele für geeignete Quellen für 3'-Terminationssequenzen, die für die erfindungsgemäße Pi axis geeignet sind, sind ohne Beschränkung hierauf- die Saccharomyces cerevisiae-, Hansenula polymorpha- und Pichia-3'-Terminationsseqi 3nzen. Bevorzugt sind solche von Pichia pastoris, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe 3'-Terminationssequenzen des ACiXI-Gens, DHAS1-Gens, p40-Gens und HIS4-Gens. Besonders bevorzugt ist die 3'-Terminationssequenz des AOX1-Gens.

Für die praktische Durchführung der Erfindung ist derzeit die Verwendung von linearen Transformationsvektoren bevorzugt, beispielsweise die Bglll-Fragmente der in Fig.4 gezeigten Bausteine.

Die Insertion des preS₂-Strukturgens in geeignete Vektoren kann durch beliebige geeignete Techniken erfolgen, die den gewählten Vektor an einer oder mehreren geeigneten Stellen spaltet und zu mindestens einer operativen Expressionskassette, die das im Vektor vorhandene preS₂-Strukturgen enthält, führt.

Die Ligation des preS₂-Strukturgens kann durch eine beliebige geeignete Ligationstechnik erfolgen, beispielsweise unter Verwendung von T4-DNA-Ligase.

Die anfängliche Selektion, Vermehrung und gegebenenfalls Verstärkung des Ligationsgemisches des preS₂-Strukturgens und eines Vektors werden vorzugsweise durchgeführt, indem man das Gemisch in einen bakteriellen Wirt, z. B. coli, transformiert. Geeignete Transformutionstechniken für E. coli sind aus dem Stand der Technik bekannt. Ferner sind Selektionsmarker und bakterielle Replikationsursprungsstellen, die für die Aufrechterhaltung eines Vektors in einen bakteriellen Wirt erforderlich sind, aus dem Stand der Technik bekannt.

Die Isolation und/oder Reinigung des gewünschA3n Plasmids mit einem Gehalt an dem preS₂-Strukturgen in einem Expressionssystem kann gemäß beliebigen geeigneten Maßnahmen für die Trennung von Plasmid-DNA aus Wirts-DNA erfolgen.

In ähnlicher Wuise können die durch Ligation gebildeten Vektoren vorzugsweise nach Vermehrung getestet werden, um die Anwesenheit des preS₂-Gens und dessen operative Verknüpfung mit einem Regulationsbereich und einer 3'-Terminationssequenz zu verifizieren. Dies kann nach einer Reihe von Techniken durchgeführt werden, zu denen - ohne Beschränkung hierauf-die Endonucloaseverdauung, Golelektrophorese oder Fndonucleaseve'dauung-Southern-Hybridisierung gehören.

Die Transformation von Plasmiden oder linearen Vektoren in Hefewirte kann durch geeignete Transformationstechikon erreicht werden, zu denen-ohno Beschränkung hierauf-die Techniken von Hinnen et al., Proc. Natl.Acad. Sei., Bd.75 (1978), S. 1929; Ho et al., J. Bacteriol., Bd. 153 (1983), S. 163); Cregg et al., Mol. Cell Biot., Bd.5 (1985), S.3376; oder Sreekrishna et al., Gene, Bd. 59 (1987), S. 115, gehören. Für die erfindungsgemäße Praxis ist θε wünschenswert, einen Überschuß an linearen Vektoren einzusetzen und mehrfache Insertionen 'lurr·- Southern-Hybridisierung zu wählen.

Beim Hefewirt für die Transformation kann es sich um beliebige geeignete methylotrophe Hefe handeln. Zu den mdthylotrophen Hefen gehören-ohne Beschränkung hierauf-zum Wachstum auf Methanol fähige Hefen dor Gattungen Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula. Eine Liste von speziellen Spezies, die als Beispiele für diese Klasse von Hefe dienen, finden sich bei C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, (1982), S. 269. Derzeit bevorzugt werden methylotrophe Hefen der Gattung Pichia, z. B. die auxotrophe Hefe Pichia pastnris GS115 (NRRL Y-15851). Auxotrophe methylotrophe Hefen sind auch aufgrund ihrer leichten Auswahl für die erfindungsgemäße Praxis von Vorteil. Es ist festzuhalten, daß methylotrophe Wildtyp-Hofestämme mit dem gleichen Erfolg verwendet werden können, wenn ein geeignetes Transformationsmarkergen gewählt wird, z.B. die Verwendung von SUC2 zur Transformation von Pichia pastoris in einen Stamm, der zum Wachstum auf Saccharose fähig ist, oder wenn ein antibiotischerResistenzmarker verwendet wird, wie G 418^R-Gen.

Transformierte methylotrophe Hefezellen können unter Anwendung geeigneter Techniken ausgewählt werden, z. B. - ohne Beschränkung hierauf-durch Züchtung von vorher uuxotrophen Zellen nach Transformation in Abwesenheit eines notwendigen biochemischen Produkts (aufgrund der Auxotrophie der Zellen), Auswahl durch Nachweis eines neuen Phänotyps („methanol slow") oder Züchtung in Gegenwart eines Antibiotikums, das für die Hefe in Abwesenheit eines im Transformanten enthaltenen Resistenzgens toxisch ist.

Isolierte transformierte methylotrophe Hefezellen werden durch geeignete Fermentationstechniken gezüchtet, z.B. durch Schüttelkolbenfermentation, Fermentation hoher Dichte oder die Techniken gemäß Cregg et al., High-Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast, Pichia Pastoris, Bio/Technology, Bd. 5 (1987), S.479.

Die Expression kann nach für den eingesetzten Regulationsbereich geeigneten Methoden durchgeführt werden. Vorzugsweise kann bei Verwendung von auf Mothanol reagierenden Regulationsbereichen die Im uktion der Expression erfolgen, indem man die transformierten Zellen in einem Nährmedium einem für den eingesetzten Regulationsbereich geeigneten Alkohol aussetzt. Die antigenen Teilchen können in roher Form gewonnen werden, indem man transformierte Zeüan, die ausreichend lang induziert worden sind, der Lysis unter Anwendung von Standardtechniken unterwirft, z. B. durch Mahlen mit einer Perlmühle, gefolgt von einer ausreichenden Zentrifugation zur Entfernung von Zellbruchstücken. Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren für die Extraktion eines heterologen Proteins aus einzelligen Wirtsorganismen bekannt, die an die Stelle des vorstehenden allgemeinen Extraktionsverfahrens treten können oder zur weiteren Reinigung verwendet werden können. Das in der erfindungsgemäßen Praxis bevorzugte Reinigungsverfahren umfaßt eine Lyse der transformierten Zellen in Gegenwart von gepufferten chaotrophen Verbindungen, präzipitierenden Lipiden und kontatuisierenden Proteinen aus dem bei der Lyse erhaltenen Überstand, Diafiltration des Überstandes, Behandeln des Retentats mit Kieselsäure, Auswaschen kontaminierender Proteine aus dem von der Kieselsäure absorbierten Hepatitis-B-Oberflächenantigen mit einem Puffer eines pH im Bereich von 6-8, Eluieren des Antigens von der Kieselsäure mit einem gepufferten Eluiermittel eines pH im Bereich von 9,5-11, das 0,5 bis 8 Molar an Harnstoff ist, worauf dio Antigen enthaltenden Fraktionen einer Gelfiltration und danach die Antigen enthaltende Fraktion einer Anionenaustauschchromatographie unterworfen werden.

Ausführungsbeispiele

Allgemeine Informationen zu den Beispielen:

In den Beispielen wurde Pichia paotoris GS115 (his4) NRRL Y-15851 als Wirtshefestamm verwendet.

Medien

YPD, 1 Liter 10g Hefeextrakt

20g Pepton

20g Dextrose

LB-Brühe, 1 Liter 5,0g Hefeextrakt (Difco)

10,0g Trypton (Difco) 5,OgNaCI

Beispiel I

Konstruktion des Vektors pTBO4

Plasmid AM 6 ist ein Derivat des in Fig. 1 gezeigten HBV-Genoms, wobei das pBR322-Plasmid an der BamH I-Stelle in Position 26 inseriert ist.

-9- 2Ö3 836

Der Vektor pTB04 enthält das Gen, das für die 281-Amlnosäuren-preS_rForm des Hepatitis B-Oberflächenantigons kodiert. Das Gen wurde in drei Segmenten konstruiert: Das C-terminale Segment, 75% des Strukturgens, ein N-terminaler Linker, der für 13 Aminosäuren kodiert und der restliche Zentralbereich. Das das preS₂-Gon, Serotyp adw, enthaltend)) Plasmid AM β stellte die Quelle für den c-terminalen Bereich und den Mittelbereich des hier verwendeten preSj-Gens dar. Die Sequenz ist bei Valenzuela et al., ICN-UCLA Symposia on Animal Virus Genetics, (1980), S.57-70, beschrieben, wobei folgonde Modifikation gilt:

native Sequenz ATG-CAG-TGG-AAT-TCC

mutierte Sequenz ATG-CAG-TGG-AAC-TCC

A. C-termlnaier Bereich von preS]

(Sämtliche Restriktionsenzyme wurden von der Firma Boehringer, Mannheim, bezogen und gemäß den Angaben des Herstellers eingesetzt).

Der C-terminate Bereich wurde aus dem Plasmid AM 6 (Fig. 1) durch Verdauung mit Dra I, welches das HBV-Genom an zwei Stellen, davon einmal am Codon für die letzte Aminosäure des Oberflächenantigens, schneidet. Die Enden wurden durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm in einem Reaktionsvolumen von 30μΙ (1U Enzym 1 Stunde bei 37⁰C in 50 millimolar Tris -4HCI, pH-Wert 9,0,1 millimolar MgCI₂,100 mikromolar ZnCI;, 1 millimolar Spermidin) dephosphoryliert. Das gesamte Verdauungsprodukt wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt (Maniatis et al.). Ein oktamerer Stu I-Linker (AAGGCCTT) wurde mit einem DNA-Synthosegerät der Firma Applied Biosyslrms Modell 380A unter Anwendung der Cyanoäthylphosphorarnidit-Chemie synthetisiert. 1 μg der Stu I-Linker wurde in destilliertem Wasser gelöst. Eine 10ng Aliquotmenge wurde entfernt und in einem Gesamtvolumen von 50 μΙ mit einem Gehalt an 70 millimolar Tris · HCI, pH-Wert 7,6, 10 millimolar MgCI₂,5 millimolar Dithiothreit, 1 millimolar ATP und 10 Einheiton Polynucleotid-kinase 30 Minuten bei 37⁰C mit Phosphat markiert. Die Linker wurden auf 9O⁰C erwärmt, um die onzymatische Reaktion zu beenden, und langsam auf Raumtemperatur gekühlt, um die Bildung von doppelsträngiper DNA zu erleichtern. Die Stu I-Linker wurden zum vorstehenden Dral-Verdauungsprodukt gegeben und mit T4-Ligase auf folgende Weise verknüpft. Die Reaktion erfolgte in einem 10-μ! Volumen mit einem Gehalt an 6,6m Tris HCI, pH-Wert 7,6,5 millimolar MgCI₂,5 millimolar Dithiothreit, 1 millimolar ATP und 1 Weiss-ünit T4-Ligase 1 Stunde bei 23⁰C. Die Ligationsreaktion wurde durch Phenolextraktion beendet, wonach mit Ethanol gefällt wurde. Eine Stu I-Restriktionsverdauung wurde sodann mit > 5OU Enzym über Nacht durchgeführt, um Multimere des Stu I-Linkers zu entfernen. Die Kombination aus Dra Ι-Verdauung und Stu I-Linker stellte das durch die Dra I-Verdauung entfernte Stopp-Codon der Translation wieder her.

Die Stu I-Linker-DraI-Fragmonte wurden mit Xba I verdaut, was das gewünschte Stu I/Xba I-Fragment von etwa 600bp ergab. Es wurde aus einem 0,8% präparativen Agarosegel isoliert. Dieses Fragment enthielt den C-endständigen 75-%-Bereich des Gens und wurde in den Vektor ρYM4 (Fip.2) geklont, der mit Xba I und Stu I verdaut und auf die vorstehend beschriebene Weise dephosphoryliert worden war. (pYM4 kann aus dem Plasmid ρYM 30 durch Verdauung von pYM30 mit CIa I und Religation der Enden erhalten werden. pYM30 ist in einem E. coli-Wert beim Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, Hint6rlegungsnummer NRRL B-15890 hinterlegt). Das 5,7 kb-Restriktionsfragment von pYM4 wurde aus 0,8% präparativem Agarosegel isoliert. Der Vektor pYM4 wurde nur wegen seiner zweckmäßigen Restriktionsstellen verwendet. 50ng des Vektors und 500 ng des Inserts wurden 1 Stunde bei 23⁰C in 50 millimolarem Tris · HCI, pH-Wert 7,4,10 millimolar MgCI₂,10 millimolar Dithiothreit, 1 millimolar Spermidin und 1 mülimolar ATP mit 1 Weiss-Unit T4-Ligase in einem Volumen von 10μΙ verknüpft. Die Ligationsreaktion wurde direkt zur Transformation von kompetenten MC 1061-Zellen (E. coli) zur Erzielung von Ampicillinresistenz verwendet. E. coli Stamm MC 1061 ist beim Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, unter der Hinterlegungsnummer NRRL-18016 zugänglich. MC1061 weist folgenden Genotyp auf: F(-), ara D139 delta (laclPOZY) X74 galk galU hsr hsm(+) rpsL delta (araABOIC leu> 769λ MC1061 wurde auf folgende Wsise für die Transformation kompetent gemacht. Eine Kultur in der mittleren logarithm iiscnen Phase (mid-log) (50ml) von E. coli MC 1061 wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 3 000 U/min und 4°C in einer Dj mon IEC DPR 600-Zentrifuge geerntet und in 10 milli.nolar NaCI gewaschen. Die Kultur wurde in 25ml 50 millimolar CaCI₂ 30 Minuten bei 0°C resuspendiert. Die Zellen wurden sodann auf die vorstehende Weise zentrifugiert und in 2 ml 50 millimolar CaCI₂ resuspendiert. Zur Transformation wurde das Ligationsreaktionsgemisch zu 100μΙ der kompetenten Zellsuspension gegeben und 15 Minuten auf Eis bei 0°C inkubiert, 5 Minuten einem WärmeschocK von 37⁰C unterworfen und 5 Minuten bei 23⁰C inkubiert. Die Zellen wurden direkt auf LB-Agarplatten mit einem Gehalt an 50pg/ml Ampicillin ausgestrichen. Die Platten wurden 10 bis 16 Stunden bei 37⁰C inkubiert. Die erhaltenen Kolonien wurden geerntet und durch Restriktionsverdauung charakterisiert. Zellen wurden in 5-ml-L-Brühe mit einem Gehalt an 50μ/ιηΙ Ampicillin 5 Stunden bei 37⁰C gezüchtet, und DNA wurde gemäß dem Verfahren von Birnboim und DoIy (Nucleic Acids Research, Bd.7 [1979), S. 1513) hergestellt. Die Minipräparationen wurden mit BamHI und Xba I verdaut. Von Kulturen mit einem 1,5kb Xba/Bam-Fragrnent wurde angenommen, daß sie das Insert aufweisen. Ein DNA-Präparat von einer Kultur im Großmaßstab wurde auf die vorstehende Weise gereinigt und anschließend der Bandenbildung an einem Cesiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten unterworfen. Dieser Klon wurde pHS 1 genannt.

Das Plasmid pHS 1 wurde mit Stu I verdaut, auf die vorstehende Weise dephosphoryliert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Auf die vorstehende Weise synthetisierte EcoRI-Linker (GGAATl CC) wurden phosphoryliert, der Selbsttempsrung unterworfen und mit dieser stumpfendigen DNA verknüpft.

Überschüssige Linker wurden durch Verdauung mit EcoRI über Nacht entfernt. Die DNA wurde anschließend mit Xba I verdaut, sodann mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Ein Dublett mit em 600-bp-Xba l-EcoR I-Fragment von Interesse und ein Vektorfragment von 582 bp (Xba l-EcoR I) wurde durch 1,0% präparative Gelelektrophorese isoliert. Diese Fragmente (500 ng) wurden der Ligation in mit Xba l-EcoR l-verdautes und dephosphoryliertes puC 18 (50 ng) gemäß der vorstehenden Beschreibung unterworfen und zur Transformation vom MC 1061 zur Erzeugung von Ampicillinresistenz auf die vorstehend beschriebene

Weise verwendet. Restriktionsverdauungsprodukte der Minipräparation-DNA wurden dazu verwendet, um zu bestimmen, welches der beiden Fragmente geklont worden war. Das unerwünschte) Fragment wies eine CIa I-Stelle auf, so daß ein CIa I/Xba I-Doppelverdauungsprodukt Fragmente von etwa 560bp + 2400bp liefern würde, während das richtige Fragment bei CIaI-Verdauung ein lineares 3kb-Fragment ergab. Die in Frage kommender. Produkte wurden mit EcoRI und Xbal unter Bildung von Fragmenten von 600bo + 2400 bp verdaut. Ein derartiger Klon wurde im Großmaßstab gereinigt und mit pHS 2-B bezeichnet. Dieses Produkt enthält eine EcoRI-Stelle nach dem letzten Codon am C-terminalen Bereich des vollständigen preS₂-Gens.

B. Mittelbereich des preS^Gens

Der Mittelbereich des preSj-Gens wurde auf folgende Weise geklont. Das Plasmid AM 6 wurde mit Xba I und BamH I verdaut, und ein Fragment von 250bp wurde aus einem 0,8% präparation Agarosegel isoliert. Dieses Fragment (50ng) wurde auf die vorstehend beschriebene Weise mit 5 ng pUC 18, das mit Xba I und BamH I verdaut ui.ddephosphoryliert worden war, verknüpft. Die Ligationsreaktion wurde angewandt, um auf die vorstehende Weise den Stamm E. cdi MC 1061 unter Erzielung von Ampicillinresistenz zu transformieren. Minipräparationen wurden mit BamH I verdaut. Produkte mit einem Gehalt an einem linearen 2,7-kb-Fragment wurden ausgewählt. Ein Isolat wurde im Großmaßstab gezüchtet, und die DNA wurde aof die vorstehend beschriebene Weise isoliert und gereinigt. Dieser Klon wurde mit pPS 1 bezeichn Dor Klon wurde mit EcoR I und BamH I geschnitten, und die Vektorbande isoliert und durch 0,8% präparative Agarosegeloiektrophorese gareinigt. Mit diesem Vektor wurde das folgende, einer Kinasebehandlung unterworfene, doppelsträngige Oligonuclootid, das auf die vorstehend beschriebene Weise synthetisiert worden war, verknüpft:

EcoRI Pstl Bamlll 5¹ AATTCAATCCGTCTGCAG 3' 3¹ GTTAGGCAGACGTCCTAG 5'

Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coil MC 1061 unter Erzielung von Ampicillinresistenz zu transformieren. Minipräparationen wurden durch Pstl-Verdauung chaiakterisiert. Ein Klon mit einem Gehalt an einem 250-pb-Pstl-Fragment wurde ausgewählt, eine DNA-Präpantion im Großmaßstab wurde durchgeführt, und das Plasmid pBS2 wurde isoliert.

C. N-terminaler Bereich des preS₂-Gens

Der N-terminale Bereich mit dem EcoR I-Linker und den für die ersten 13 Aminosäuren kodierenden Sequenzen wurde aus einem synthetischen Oligonucleotid mit einem Gehalt an der folgenden Sequenz, das auf die vorstehende Wbise synthetisiert worden war, erzeugt:

Hindill EcoRI Pstl

5' AGC.TTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3' 3' ACTTAAGTACGTC.ÄCCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG 5'

Dieses Fragment enthielt Hindlll- und Pstl-Enden sowie eine EccRI-Sequenz vor dem ATG. Dies? Sequenz wurde in mit HindIII- und Pstl-vsrdautes und dephosphoryliertes pUC 18 geklont, indem man einen 10fachen Überschuß des Oligonucleotids mit dem Vektor verknüpfte und die Transformanten durch die Anwesenheit einer kleinen EcoRI-Stelle (~75bp) charakterisierte. Ein derartiger Klon wurde mit pTBO-2 A bezeichnet.

Der Mittelbereich des Gens wurde durch Verdauung des Vektors pTBO-2 A mit Pst I und Xba I addiert. Beim Insert handelte es sich um das 250-bp-Pst-Xba-Fragment von pPS2. Transformanten wurden durch die Anwesenheit eines > 300 bp EcoRI-Fragments sowie eines 290bp-Xba I/Hind Ill-Fragments charakterisiert. Das richtige Isolat wurde mit pTBO-ä bezeichnet. Das vollständige preS₂-Gen wurde erhalten, indem man das Hind Ill/Xba I-Fragment aus pTBO-3 in mit Xba I/Hind III vet Jautes pHS 2 B inserierte. Ampicillinresistente Transformanten wurden wie oben durch die Anwesenheit eines 625-bp-EcoRI-Fragments charakterisiert. Dieser Baustein wurde als pTBO4 bezeichnet.

Beispiel Il

Konstruktion des Vektors pTBO5 A

Der Vektor ρAO804 ist in einem E. coli-Wirt beim Northern Regional Research Center des United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18114 erhältlich. pAO 804 wird durch Isolation der Plasmid-DNA, Verdauung mit EcoRI und Gelelektrophorese zur Gewinnt ng des ~ 7,5kb-Fragments, bei dem es sich um lineares und an seiner einzigen EcoRI-Stelle geschnittenes pA0804 handelt, erhalten.

Ein Vektor mit einem Gehalt an dem für preS₂ kodierenden Gen wurde aus den Vektoren ρAO804 und pTB04 (pTBO4 wurde in Beispiel I abgeleitet) aufgebaut. 2 pg von ρAO804 wurden auf die vorstehend beschriebene Weise mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase in 30μΙ Reaktionsvolumen (1U Enzym bei 37⁰C 1 Stunde in 50 millimolar Tris · HCI, pH-Wert 9,0,1 millimolar MgCI₂,100 mikromolar ZnCIi, 1 millimolar Spermidin) behandelt. pTBO4 wurde der EcoRI-Verdauung unterworfen, und ein 825bp-Fragment, das für preS₂ kodierte, wurde freigesetzt. Dieses Fragment wurde unter Anwendung von präparativer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung von 0,8% Agarose gereinigt. 500 ng des Fragments und 50ng pAO804 wurden unter Anwendung der in Beispiel I beschriebenen Methoden verknüpft. Der erhaltene Vektor wurde verwendet, um MC 1061 unter Erzielung von Ampicillinresistenz unter Anwendung des in Beispiel I beschriebenen Verfahrens zu transformieren. Die DNA wurde unter Anwendung des Verfahrens von Birnboim und DoIy (Nucleic Acids Research, Bd. ν [1979], S. 1513) isoliert und durch Verdauung mit Pstl charakterisiert. Von einem Klon, der ein 2,1 kb-PstI-Fragment enthielt, wurde festgestellt, daß er das Insert in der richtigen Orientierung enthielt. Er wurde mit PTB05A bezeichnet.

Beispiel III

Entwicklung des Multlkople preSj-Gtammes OS115/pTB005A (S 10) und des Einzelkaplb-Stammes QS115/pTB05A Der Multikople-Stamm GS115/pTB05A (S 10) wurde durch Reinigung des 5,9kb-Bg III Fragmentes aus pTBO5A an 0,8% pfäparativom Agarosegel erzeugt. 10pg des Fragments wurden über Nacht unter Anwendung der in Beispiel I beschriebenen Bedingungen der Selbstligation unterworfen. Aliquotanteile des Ligationsreaktionsgemisches wurden auf die Anwesenheit von Material mit hohem Molekulargewicht in 0,6% Agarosegel überwacht. Dieses Material wurde zur Transformation von Pichia pastoris GS115 unter Anwendung der von Cregg et al., Bio/Technology, Bd. 5 (1987), Sein 479-485 beschriebenen Sphäroplasten-TransformationstechniKverwondet.Transformanten wurde auf Minimalmedien regeneriert und auf die folgende Weise dem Screening im Bezug auf den geeigneten mutanten Phänotypen unterworfen. Die Transformanten wurden durch Abkratzen der Plattenoberflächo in Gegenwart von sterilem destilliertem Wasser vereinigt und 15 Sekunden der Ultraschallbehandlung bei niedriger Leistung unterworfen. Anschließend wurden sie auf A₄₀₀ = 0,1 verdünnt und in Verdünnungen von 10~³ und 10~⁴ doppelt auf Minimalp atton mit einem Gehalt an Glycerin als Kohlenstoffquello ausgestrichen und 2-3 Tage bei 3O⁰C inkubiert. Sodann wurden sie der Replicaplattierur.g auf Minimalplatten, denen 100μΙ Methanol In der Dampfphase zugesetzt wurde, unterworfen. Nach 24stündiger Inkubation bei 3O⁰C zeigte sich, daß 10 bis 20% der Transformanten auf Methanol langsamerwuchsen als der Rest der Transformanten. Zehn dieser langsam wachsenden Kolonien wurden sodann für die weitere Analyse ausgewählt. Sie wurden von der Glycerin enthaltenden Minimalplatte abgenommen, gemäß Beispiel V in Schüttelkolben gezüchtet und gemäß Beispiel VIII auf dia Aktivität an 22-nm-ähnlichen Teilchen getestet. Eine Transformante mit einer vierfach erhöhten Aktivität wurde ferner durch Southern-Blot-Analyse (Maniaiis et al.,) charakterisiert. Ein BgI Il-Verdauungsprodukt dor Multikopie-TransformanO wurdo auf Nitrocellulose übertragen. Das Filter wurde mit der Nick-translatierten HIS4-spezifischen Sonde pYM4 (pYM4 ist in Beispiel 1 beschrieben) der Sondenbehandlung unterworfen. Das Blot enthielt zwei hybridisierende Bander., eine vom gonomischen HIS4-Ort und eine vum Expressionsvektor. Das Vei hältnis der Intensität der Bando, die von den Expressionsl.assetten im Multikopie-Stamm abgeleitet ist, zur Intensität der Bande einer Einzelkopie, normalisiert im Bezug auf die Intensität der HIS4-Genombar. Jen, ergab insgesamt 4 Kopien p^ro Zeil;. Der Einzelkopie-Starnm GS 115/pTBO 5 A wurde auf die gleiche Weise erzeugt, wobei die Selbstligaticiisreaktion des Fragments unterblieb.

Beispiel IV

Hefe-DNA-Minipräparation

10¹-Zellen/ml wurden in 5ml YPD bei 3O⁰C über Nacht gezüchtet und sodann unter Verwendung einer DAMON !EC DPR600-Klinikzentrifuge 5 Minuten bei 3000 U/min pelletisiert. Das Pellet wurde in 0,5ml Im Sorbit, 0,1 ml 0,5m EDTA, pH-Wert 7,5 resuspendiert und die Probe wurde in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugonröhrchen übertragen. 0,02 ml von 2,b mg/ml Zymolase 60000 (Miles Laboratories) wurden zugesetzt und die Probe wurde 60 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert. Die Zellen wurden unter Vt-Wendung der Mikrozentrifuge 1 Minute bei hoher Geschwindigkeit pelletisiert und in 0,5ml 50 millimoiarem Tris HCI, pH-Wert 7,4 und 20 millimolar EDTA resuspendiert. 0,05ml 10% SDS wurden zugesetzt, die Probe wurde vermischt und 30 Minuten bei 65⁰C inkubiert. 0,2 ml Gm Kaliumacetat wurde zugesetzt, und die Probe wurde 60 Minuten auf Eis inkubiert. Sodann wurde die Probe nochmals 5 Minuten bei hoher Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert.

Der Überstand wurde in ein frisches, 1,5ml fassendes Mikrozentrifugenröh'chen übertragen, und 1 Volumenteil Isopropanol wurde bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Probe wurde vermischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur zum Absotzen gebracht und sodann kurz (10 Sekunder) mit hoher Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und das Pellet an der Luft getrocknet. Nach Resuspendieren dec Pellets in 0,3ml 10 millimolbrTris · HCI,pH-Wert 7,4 und 1 millimolar EDTA wurden 15μΙ einer 1 mg/ml-Lösung von pankraatischer RNase zugesetzt, und die Probe wurde 30 Minuten bei 37⁰C inkubiert. 0,03 ml 3 m Natriumaceiat wurde zugesetzt, die Probe wurde vermischt, und 0,2 ml Isopropanol wurden zugesetzt. Sodann wurde die Probe zur Pelletitierung der DNA bei hoher Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgegossen, das Pellet getrocknet und in C,1 bis 0,3ml 10 millimolarom Tris · HCI, pH-Wert 7,4 und 1 miliimolar EDTA resuspendiert (Anmerkung: vor Einsatz der DNA in einem Restriktionsverdauungsprodukt kann es erforderlich sein, die Lösung 15 Minuten bei hoher Geschwindigkeit in der Mikrozentrifuge zu zentrifugieren, um etwaiges unlösliches Material, das die Verdauung hemmen kann, zu entfernen.

Beispiel V

Schüttelkolben-Expressionsuntersuchungen

Vor der Fermentierung wurden sämtliche Stämme auf folgende Weise in Schüttelkolben gezüchtet, um den Expressionsgrad zu ermitteln. Routinemäßig wurde eine Transformante in 0,67% Hefe-Stickstoffbase mit einem Gehalt an 2 bis 5% Glycerin überimpft und über Nacht bei 30⁰C bis zum Erreichen der mittleren bis spaten logarithmischen Phase gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen durch 5minütige Zentrifugation bei 3 000 U/min unter Verwendung einer Damon IEC-DPR-600-Klinikzentrifuge gewonnen. Das Rollet wurde zweimal in sterilem Wasser gewaschen, sodann in einer Dichte von 0,5 Aeoo-Einheiten/rnl auf 0,67 % YNB mit einem Gehalt an 1 % Methanol überiinpft und 4 bis 6 Tage bei 3O⁰C unter mäßigem Schütteln 4 bis 6 Tage geschüttelt. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquotmengen von öOAeoo-Einheiten entfernt und bei -20°C gelagert. Proteinextrakte wurden aus diesen Aliquotmengen hergestellt und für eine AUSRIA"- und Wustern-Blot-Analyse (vgl. Beispiele VIII bzw. VII) verwendet. Aliquotanteile der Zellen (lOOAeoo-Einheiten) wurden auf 1: χ 100 mm Borsilikat-Kulturröhrchen übertragen und zweimal durch Zentrifugation in einer Sorvall-Zentrifuge Modell RC-5B bei 12 000 U/min mit 20 Volumenteilen Lysispuffer (0,5m NaCI, 0,1 % Triton X-100 |Gew./Vol.], 1 m Phenylmethylsulfonylfluorid und 10 millimolar Natriumphosphat, pH-Wert 7,5) gewaschen. Zellproben wurden mit 0,5g säuregewaschenen Glasperlen (0 imm) plus 0,35ml Lysispuffer resuspendiert und 8mal 1 Minute mit einem Wirbelmischer mit maximaler Geschwindigkeit bewegt. Zwischen den Mischvorgäng.'n wurde das Gemisch mindestens 1 Minute auf Eis gekühlt. (Nach beendeter Lysis wurde die Lösung der aufgebrochenen fellen entfern*, die Glasperlen wurden mit 0,35ml Lysispuffer gewaschen, und die beiden Lösungen wurden vereinigt und unter Verwendung der Sorvall RC-5 B-Zentrifuge bei 4°C und 13000U/min zur Entfernung von Zellbruchstücken zentrifugiert) Proteinprobe'i wurden sodann durch AUSRIA" und Western-Blot-Analyse (vgl. Tabelle I) getestet. Die Proteinkonzentration wurde gemäß dom Lowry-Vorfahren nach Fällung nvt Trichloressigsäure bestimmt.

-12- 283 830

Tobelle I

Analyse der preS₂-Expression

Stamm % Protein % Protein AUSRIß Western

1. GS115/

pTBO5A 0,11% 0,23%

2. GS115/

pTBO5A(S10) 0,31% 0,63%

Beispiel Vl

Fermentatlons-Expressions-Untersuchunyen Fermentationen wurden auf folgende Weise durchgeführt.

500ml Hefe-Stickstoffbase (YNB) + 2% Glycerin wurden in einem Fernbach-Kolben von einer Anzuchtkultur oder einer Minimalglukopeplatvo der Kultur beimpft (die Platten lassen sich durch monatliche Passage ohne nachweisbare Beeinträchtigung der Stämme erhalten). Nach eintägigem Schütteln bei 200U/min und 30°C wurde das Inoculum auf 7,5 Liter Minimalmedium (Tabelle II) mit einem Gehalt an 480g Glycerin, 40mg Biotin und40ml Spurensalzlösung (Tabelle III) überimpft. Der Fermenter wurde bei 3O⁰C und einem pH-Wert von 5,5 belassen, wobei dio Kultur in einem absatzweisen Verfahren bis zum Verbrauch des Glycerins (etwa 24 Stunden) wuchs. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von NH₃-GaC kontrolliert. Der Glycerinverbrauch wurde durch einen scharfen Abfall der CGyEntwicklung und einen scharfen Anstieg des gelösten Sauerstoffs (oder Abnahme der Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit) festgestellt. Eine Methanolzufuhr wurde in einer Geschwindigkeit von 18ml/h begonnen, um den Fermenter auf eine Konzentration von ~ 0,5% MeOH zu bringen. Diese Konzentration wurde beibehalten. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf der Grundlage der tatsächlichen Geschwindigkeit des Methanolvei brauchs eingestellt. Aiiquotanteile von 20 ml an Spurensalzen wurden in Abständen von etwa 2 Tagen zugesetzt, um die Geschwindigkeit des Methanolverbrauchs aufrecht zu erhalten. Die Konzentration an HBsAg stieg bei der Methanolzufuhr etwa 3 Tage an.

Tabelle Il

Zusammensetzung des Mediums (7,5 Liter)

480 g	Tabelle III	Glycerin	H2O	0,06
40 mg	IMfSpurensalzlösung	Biotin		0,08
134 ml	Kupfer)!,!-sulfat·	H3PO4 (85%)		0,30
5,8 g	Kaliumiodid	CaSO4 2H2O		0,20
92 g	H2SO4		0,02
75 g	MgSO4 -7 H2O		2,00
21g	KOH		4,8
		5,00 ml/Liter
5H2O
Mangansulfat-H2O
Natriummolybdat
Borsäure
Zinksulfat H5O
EisendlD-chlorid
Schwefelsäure

In InHeIIe IV sir J die AUSRIA^R-Ergebnisse gemäß der Beschreibung von Beispiel VIII von Extrakten, die aus den im Fermenter gezüchteten Stämmen hergestellt worden sind, wiedergegeben.

Tabelle IV

Stamm volumetrische Ausbeute (mg/

Liter) über AUSRIA"

GS115/pTBO5A 9

GS115/pTBO5A(310) 60

Beispiel VII

Nachwels und Bestätigung der Anwesenheit von preS₂

Western Blo's (Maniatis et al.) wurden an Proteinen, die aus Iysierten Pichia-Zellen gemäß Beispiel V gewonnen worden waren, durchgeführt. Der verwendete Antikörper war spezifisch für HBsAG (Produkt der Firma Calbiochom, Charge Nr.702106), Verdünnung 1:1000.

Ferner zeigte die SDS/PAGE-Analyse und die Silberfärbung eines partiell gereinigten Proteinpräparats die Anwesenheit von preS₂-Polypeptid p31 an.

Beispiel VIII AUSRIA^RRIA-Protokoll Die AbboU AUSRIA"-Testpackung wurde zur Messung der Menge an HBsAg, die durch das Pichia-Produkticnssystem

synthetisiert worden war, verwendet. Der in der Testpackung enthaltene Antikörper bindet HBsAg-Teilchen, aber nicht HBsAg-

Monomere. Sämtliche Verdünnungen wurden in 1,0% Rinderserumalbumin, 0,02% Natriumazid in phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 vorgenommen. Das Verfahren entsprach im wesentlichen den Angaben in der PacKungsbeilage. Die Eichkurve wurde folgendermaßen aufgestellt.

Röhrchen	ng im Test	Puffer (μΙ)	Positive
Nr.			Kontrolle (μΙ)
1-4	ohne NSB	ohne	200 nur Puffer
6-6	0,1	195	5
7-8	0,2	190	10
9-10	0,5	175	25
11-12 .	1,0	150	50
13-14	2,0	100	100
15-16	3,0	50	150
17-18	4,0	ohne	200

Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden folgendermaßen markiert: AA BB CC DD

1	1	2	3	4
2	5	6	7	8
3	9	10	11	12
4	13	14	15	16
5	17	18	19	20 usw

In die einzelnen Vertiefungen wurden zunächst die Perlen, anschließend der Puffer und schließlich der Standard (Positivkontrolle) oder die verdünnte Probe gegeben. Unbekannte Proben wurden verdünnt, um Signale im Bereich der Eichkurve zu erhalten. Schätzwerte der Probenverdünnungen in mg/ml wurden typischerweise durch 0,02 dividiert, um die anzuwendende Verdünnung zu erhalten. Im allgemeinen wurden ΙΟΟμΙ der Probe zu einer Vertiefung mit sinem Gehalt an 100 μΙ Puffer gegeben. Die Vertiefungen wurden abgedeckt. Sodann wurde vorsichtig mit dem Tablett auf den Labortisch geklopft. Die Proben wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um eine maximale Bindungswirkung zu erreichen. Am nächsten Tag wurden die einzelnen Vertiefungen 4mal mit entionisiertem Wasser unter Verwendung des Pentawash-Systems der Firma Abbott Laborotories gewaschen. 200μΙ des "\J-anti-Hbs wurden in jede Vertiefung gegeben, das Tablett wurde vorsichtig angestoßen und sodann 1 Stunde bei 45⁰C im Wasserbad inkubiert. Die Perlen wurden zunächst gewaschen und dann ausgezählt. Die Konzentrationen der unbekannten Proben wurden aus der Eichkurve ermittelt.

Claims (8)

1. Verfahren zur verstärkten Bildung von antigenen HBV-Teilchen. gekennzeichnet durch

a) Transformieren einer methylotrophen Hefe mit mindestens einem Vektor, der mindestens eine Expressionskassette aufweist, die ein strukturelles Gen für preS2 enthält, das operativ mit einem regulatorischen Bereich und einer 3'-Terminationssequenz verknüpft ist, und anschließend

b) Züchten des erhaltenen transformierten Hefestammes unter geeigneten Bedingungen zur Bildung des HBsAg-preS₂-Proteins.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor unter Plasmiden oder linearen, integrativen, ortsspezifischen Vektoren ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Vektor um einen linearen, integrativen, ortsspezifischen Vektor handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der linearo, integrative, ortsspezifische Vektor folgende serielle Anordnung enthält:

a) ein erstes inserierbares DNA-Fragment,

b) ein Markergen und mindestens eine Expressionskassette, die ein strukturelles Gen für preS₂ enthält, das operativ mit einem regulatorischen Bereich und einer 3'-Terminationssequenz verknüpft ist und

c) ein zweites inserierbares DNA-Fragment; wobei die Reihenfolge des Markergens und der Kassette von Komponente (b) vertauscht sein kann.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das erste inserierbare DNA-Fragment und das zweite inserierbare DNA-Fragment von der DNA-Sequenz eines Gens, das aus Pichia pastoris isoliert und aus der Gruppe AOX1, p40, DHAS und HIS4 ausgewählt ist, abgeleitet ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskassette folgende Bestandteile enthält:

a) einen regulatorischen Bereich, ausgewählt aus der Gruppe AOX1, ρ 40, DHAS, isoliert von Pichia pastoris, saure Phosphatase, Galactokinase, Alkohol-dehydrogenase, Cytochrom c, a-Mating-Faktor und Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, isoliert aus Saccharomyces cerevisiae, operativ verknüpft mit

b) einem strukturellen Gen für preS₂, operativ verknüpft mit

c) einer 3'-Terminationssequenz aus Pichia pastoris, ausgewählt unter den aus dem AOXi-Gen, p40-Gen, DHAS-Gen und HIS4-Gen isolierten 3'-Terminationssequenzen.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Markergen unter HIS4 und ARG 4, isoliert aus Pichia pastoris, SUC 2, isoliert aus Saccharomyces cerevisiae und G 418*-Gen von Tn903 undTn601 ausgewählt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektorfolgende Bestandteile enthält:

a) ein erstes inserierbares DNA-Fragment, das etwa 1 Kilobase des 5'-AOX 1-Regulationsbereichs, isoliert aus Pichia pastoris, darstellt, operativ verknüpft mit

b) einem strukturellen Gen für preS₂, operativ verknüpft mit

c) der 3'Terminationssequenz von AOX1, isoliert aus Pichia pastoris, verknüpft mit

d) einem Markergen, bei dem es sich um HIS4, isoliert aus Pichia pastoris, handelt, verknüpft mit

e) einem zweiten inserierbaren DNA-Fragment, bei dem es sich um etwa 0,65 Kilobasen der 3'-AOX 1-Terminationcsequenz handelt.