JPH0284176A - メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ｐｒｅＳ↓２タンパク質の発現 - Google Patents
メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ｐｒｅＳ↓２タンパク質の発現Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組換えＤＮＡバイオテクノロジー分野に関する
ものである。一つの局面では本発明は実質的にｐｒｅＳ
２のタンパク質からなる抗原粒子をメチロトロフィック
酵母内で増幅して発現させる方法に関するものである。
ものである。一つの局面では本発明は実質的にｐｒｅＳ
２のタンパク質からなる抗原粒子をメチロトロフィック
酵母内で増幅して発現させる方法に関するものである。
別の局面では本発明は新しいＤＮ八へ子およびそれを用
いて形質転換した新しい酵母株に関するものである。
いて形質転換した新しい酵母株に関するものである。
（従来の技術）
Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕ
ｓ： ＨＢＶ）は急性および慢性の双方の疾患の原因と
なり、世界的な公衆衛生問題を投げかけている。ＨＢＶ
は進行性の重度肝臓障害、−次性癌および死を引き起こ
し得る慢性的に衰弱する感染として現われる。
ｓ： ＨＢＶ）は急性および慢性の双方の疾患の原因と
なり、世界的な公衆衛生問題を投げかけている。ＨＢＶ
は進行性の重度肝臓障害、−次性癌および死を引き起こ
し得る慢性的に衰弱する感染として現われる。
多くの場合には、患者は完全にＨＢＶから回復する。
しかし、ＨＢＶに感染した集団のなかで注目に値する割
合の患者を他者に移す可能性を持つ、疾患の慢性的保有
者となる。
合の患者を他者に移す可能性を持つ、疾患の慢性的保有
者となる。
近年の組換えＤＮＡ技術の進歩によりＨＢＶの遺伝的構
造を明らかにするとともに、ＨＢＶに対するワクチンを
調製するための手・段を与えるような多くの有用な方法
が提示されてきた。 ＨＢＶゲノムは約３．２キロ塩基
対の部分的二本鎖ＤＮ＾および共有結合したＤＮＡポリ
メラーゼとともに２７ｎ＋ａヌクレオカプシド中に封入
されていることが知られている。ヌクレオカプシドは細
胞性脂質およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ ）から
なるリポタンパク質内に封入されている；これはウィル
ス粒子（ｖｉｒｉｏｎ ）と呼ばれ、直径は４２ｎ輪で
ある。
造を明らかにするとともに、ＨＢＶに対するワクチンを
調製するための手・段を与えるような多くの有用な方法
が提示されてきた。 ＨＢＶゲノムは約３．２キロ塩基
対の部分的二本鎖ＤＮ＾および共有結合したＤＮＡポリ
メラーゼとともに２７ｎ＋ａヌクレオカプシド中に封入
されていることが知られている。ヌクレオカプシドは細
胞性脂質およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ ）から
なるリポタンパク質内に封入されている；これはウィル
ス粒子（ｖｉｒｉｏｎ ）と呼ばれ、直径は４２ｎ輪で
ある。
ウィルス被膜は、３種の異なるが関連した表面タンパク
質からなることも見いだされた。これらのタンパク質は
一般にＳ、ｐｒｅＳ、、およびｐｒｅＳｌタンパク質と
呼ばれる。各々のウィルス粒子は３００〜４００のＳタ
ンパク質分子、および４０〜８０のｐｒｅＳ２およびｐ
ｒｅＳ１タンパク質分子から構成される。
質からなることも見いだされた。これらのタンパク質は
一般にＳ、ｐｒｅＳ、、およびｐｒｅＳｌタンパク質と
呼ばれる。各々のウィルス粒子は３００〜４００のＳタ
ンパク質分子、および４０〜８０のｐｒｅＳ２およびｐ
ｒｅＳ１タンパク質分子から構成される。
Ｓタンパク質は２２６アミノ酸からなり、通常のウィル
ス性すポタンパク質被膜の主要な成分である。
ス性すポタンパク質被膜の主要な成分である。
Ｓタンパク質は約２４〜２５キロダルトン（ｋＤａ ）
であり、Ｐ２４あるいはＰ２５と表記される。Ｓタンパ
ク質はグリコジル化されて２７〜２８キロダルトンの糖
タンパク質となることもあり、ＧＰ２７あるいはＣＰ２
Ｂとも表記される。
であり、Ｐ２４あるいはＰ２５と表記される。Ｓタンパ
ク質はグリコジル化されて２７〜２８キロダルトンの糖
タンパク質となることもあり、ＧＰ２７あるいはＣＰ２
Ｂとも表記される。
第二のＨＢｓＡｇタンパク質はｐｒｅＳ２表面抗原であ
り、中期ＨＢｓＡｇポリペプチドとも呼ばれる。ｐｒｅ
Ｓ２はＳタンパク質のＮ末端に５５アミノ酸が付加する
ことによって形成される２８１アミノ酸からなる。 ｐ
ｒｅＳ２タンパク質は約３１キロダルトンであり、Ｐ３
１タンパク質とも呼ばれる。ｐｒｅＳ２タンパク質は３
３キロダルトンと３６キロダルトンの二つのグリコジル
化された状態があり、それぞれＧＰ３３およびＧＰ３６
と表記される。この抗原は、Ｓに反応しない人あるいは
弱く反応する人の付加的な抗原反応を引き起こすと考え
られる。
り、中期ＨＢｓＡｇポリペプチドとも呼ばれる。ｐｒｅ
Ｓ２はＳタンパク質のＮ末端に５５アミノ酸が付加する
ことによって形成される２８１アミノ酸からなる。 ｐ
ｒｅＳ２タンパク質は約３１キロダルトンであり、Ｐ３
１タンパク質とも呼ばれる。ｐｒｅＳ２タンパク質は３
３キロダルトンと３６キロダルトンの二つのグリコジル
化された状態があり、それぞれＧＰ３３およびＧＰ３６
と表記される。この抗原は、Ｓに反応しない人あるいは
弱く反応する人の付加的な抗原反応を引き起こすと考え
られる。
第三のＨＢｓＡｇタンパク質はｐｒｅＳ 、表面抗原で
あり、後期１１８ｓＡｇポリペプチドとも呼ばれる。
ｐｒｅＳ、は３８９〜４００アミノ酸（ＨＢＶのサブタ
イプに依存する）からなる、 ｐｒｅＳ、に特異的な配
列は、完全なｐｒｅＳ２タンパク質のＮ末端に付加して
いる１０８〜１１９アミノ酸からなる。 ｐｒｅＳ、タ
ンパク質は約４３キロダルトンであり、Ｐ４３とも呼ば
れる。ｐｒｅＳｌはＧＰ４Ｂ糖タンパク質と表記される
４６キロダルトンのグリコジル化された状態でも依存す
る。
あり、後期１１８ｓＡｇポリペプチドとも呼ばれる。
ｐｒｅＳ、は３８９〜４００アミノ酸（ＨＢＶのサブタ
イプに依存する）からなる、 ｐｒｅＳ、に特異的な配
列は、完全なｐｒｅＳ２タンパク質のＮ末端に付加して
いる１０８〜１１９アミノ酸からなる。 ｐｒｅＳ、タ
ンパク質は約４３キロダルトンであり、Ｐ４３とも呼ば
れる。ｐｒｅＳｌはＧＰ４Ｂ糖タンパク質と表記される
４６キロダルトンのグリコジル化された状態でも依存す
る。
ＨＢＶの感染の過程において、完全なウィルスヌクレオ
カプシドはりボタンバク質被膜に覆われており、４２ｎ
−の粒子を形成する。ＨＢＶ感染の際に主にＳおよびｐ
ｒｅＳ２タンパク質からなりｐｒｅＳ、も含む空の２２
ｎ輪粒子も形成する。完全なウィルスヌクレオカプシド
が感染性であるのに対し、空の２２ｎｍ粒子は非感染性
である。しかし、空の粒子は免疫性を与えるのに十分な
免疫反応を引き起こし、Ｈ［ｌＶに対するワクチンの調
製に使用することができる。
カプシドはりボタンバク質被膜に覆われており、４２ｎ
−の粒子を形成する。ＨＢＶ感染の際に主にＳおよびｐ
ｒｅＳ２タンパク質からなりｐｒｅＳ、も含む空の２２
ｎ輪粒子も形成する。完全なウィルスヌクレオカプシド
が感染性であるのに対し、空の２２ｎｍ粒子は非感染性
である。しかし、空の粒子は免疫性を与えるのに十分な
免疫反応を引き起こし、Ｈ［ｌＶに対するワクチンの調
製に使用することができる。
歴史的には、２２ｎｍ粒子で調製されたＢ型肝炎ワクチ
ンはＨＢＶの保有者の血清から調製された。不運なこと
に、ヒトの血清由来の２２ｎ−粒子は感染性１１ＢＶ粒
子および他の血清由来病原菌を除くために非常によく精
製されなければならない、さらに、Ｂ型肝炎ワクチンの
調製はヒト血清の入手が制限されているために厳しく制
限されてきた。
ンはＨＢＶの保有者の血清から調製された。不運なこと
に、ヒトの血清由来の２２ｎ−粒子は感染性１１ＢＶ粒
子および他の血清由来病原菌を除くために非常によく精
製されなければならない、さらに、Ｂ型肝炎ワクチンの
調製はヒト血清の入手が制限されているために厳しく制
限されてきた。
組換えＤＮＡ技術を利用することにより、２２ｎｎ＋粒
子内の肝炎Ｓタンパク質を形質転換した哺乳類細胞系お
よび酵母内で発現させることが可能になった。
子内の肝炎Ｓタンパク質を形質転換した哺乳類細胞系お
よび酵母内で発現させることが可能になった。
抗原性を持ち、ワクチンとして効果的である可能性のあ
るｐｒｅＳ２タンパク質を産生ずる努力は通常困難であ
るとされてきた。 ｐｒｅＳ２タンパク質は組換え系で
は非常にタンパク質分解を受は易いことが知られていた
。タンパク質分解により、ｐｒｅＳ。
るｐｒｅＳ２タンパク質を産生ずる努力は通常困難であ
るとされてきた。 ｐｒｅＳ２タンパク質は組換え系で
は非常にタンパク質分解を受は易いことが知られていた
。タンパク質分解により、ｐｒｅＳ。
の抗原性を保持しない二つの小さなタンパク質断片が得
られる。さらに、ｐｒｅＳ２タンパク質は組換え系にお
いて発現させることが非常に困難であった。 ｐｒｅＳ
２の発現レベルは同一の組換え系で産生されるＳタンパ
ク質のレベルの約１７１０である。
られる。さらに、ｐｒｅＳ２タンパク質は組換え系にお
いて発現させることが非常に困難であった。 ｐｒｅＳ
２の発現レベルは同一の組換え系で産生されるＳタンパ
ク質のレベルの約１７１０である。
以上のことから、実質的にＨＢＶのグリコジル化されて
いないｐｒｅＳ２タンパク質からなる抗原性ＨＢＶ粒子
の産生法の開発は本分野への重要な寄与となるであろう
。
いないｐｒｅＳ２タンパク質からなる抗原性ＨＢＶ粒子
の産生法の開発は本分野への重要な寄与となるであろう
。
（発明が解決しようとする課題）
本発明は、
ＨＢＶのグリコジル化されていないｐｒｅＳ２タンパク
質から実質的に構成される抗原性ＨＢＶ粒子の増幅産生
法、 ｐｒｅＳ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む新
しいベクター ｐｒｅＳ２タンパク質からなるＨＢＶ粒子の増幅された
産生を行なうことができる１種以上のベクターで形質転
換した新しいメチロトロフィック酵母：および グリコジル化されていないｐｒｅＳ、タンパク質からな
る抗原性ＨＢＶ粒子産生法によって産生された産物 を含む多くの局面を有する。
質から実質的に構成される抗原性ＨＢＶ粒子の増幅産生
法、 ｐｒｅＳ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む新
しいベクター ｐｒｅＳ２タンパク質からなるＨＢＶ粒子の増幅された
産生を行なうことができる１種以上のベクターで形質転
換した新しいメチロトロフィック酵母：および グリコジル化されていないｐｒｅＳ、タンパク質からな
る抗原性ＨＢＶ粒子産生法によって産生された産物 を含む多くの局面を有する。
本発明により、ｐｒｅＳ２の構造遺伝子を含む適合性発
現カセットを有する少なくとも一つのベクタ−でメチロ
トロフィック酵母を形質転換することおよび得られた形
質転換体を粒子の産生に適した条件下で培養することか
らなる、抗原性ＨＢＶ粒子の増幅された産生のための方
法を与えるものである。
現カセットを有する少なくとも一つのベクタ−でメチロ
トロフィック酵母を形質転換することおよび得られた形
質転換体を粒子の産生に適した条件下で培養することか
らなる、抗原性ＨＢＶ粒子の増幅された産生のための方
法を与えるものである。
（課題を解決するための手段）
先ず、図面について簡単に説明する。
第１図は、ＨＢＶ血清型ａｄｗのｐｒｅＳ２遺伝子を含
むＨＢＶの模式図できあ。プラスミド八Ｍ６は第１図に
示されたＨＢＶゲノムの誘導体であり、ｐＢＲ３２２プ
ラスミドが２６位のＢａｗｌ（１部位に挿入されている
。
むＨＢＶの模式図できあ。プラスミド八Ｍ６は第１図に
示されたＨＢＶゲノムの誘導体であり、ｐＢＲ３２２プ
ラスミドが２６位のＢａｗｌ（１部位に挿入されている
。
第２図は、ＢａｍＨ１部位に挿入されたピキア・パスト
リスＨＩＳ４遺伝子を含むｐＢ８３２２由来プラスミド
であるｐＹＭ４の模式図である。括弧はその制限酵素部
位が破壊されていることを示す、 ＨＩＳ４遺伝子はｐ
ＹＪ３０ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９０）内の遺伝子と
して寄託されている。
リスＨＩＳ４遺伝子を含むｐＢ８３２２由来プラスミド
であるｐＹＭ４の模式図である。括弧はその制限酵素部
位が破壊されていることを示す、 ＨＩＳ４遺伝子はｐ
ＹＪ３０ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９０）内の遺伝子と
して寄託されている。
第３図はプラスミドｐＹＭ１０の模式図である。ｐＹＭ
ｌｏは２９５９位のｅａｓｔ（１部位が破壊されている
ｐＹＪ３（１（ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９０）の誘導体で
ある。区内の括弧は制限酵素部位が破壊されていること
を示す。
ｌｏは２９５９位のｅａｓｔ（１部位が破壊されている
ｐＹＪ３（１（ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９０）の誘導体で
ある。区内の括弧は制限酵素部位が破壊されていること
を示す。
第４図は時計回りにＢｇｌｌｌからＢｇＩＩ［までの断
片に直鎖状部位特異的組み込みベクターを含むプラスミ
ドルへ０８０４の模式図である。構造遺伝子はこのプラ
スミドの唯一のＥｃｏＲ１部位に挿入することができる
。
片に直鎖状部位特異的組み込みベクターを含むプラスミ
ドルへ０８０４の模式図である。構造遺伝子はこのプラ
スミドの唯一のＥｃｏＲ１部位に挿入することができる
。
ｐｒｅＳ２構造遺伝子は本分野ではよく知られており、
ロー（ＬＯ）により塩基配列が決定された（Ｃｈａｒａ
ｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｒ ｐｒｅＳ２Ｒｅｇｉｏｎ
ｏｒ Ｉ（ｅｐａｔｉｔｉｓ ＢＶｉｒｕｓ、 １３
５ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏａ＋ｍｕｎｉｃａｔ
ｉｏｎｓ ３８２ （１９８６）） 、本分野の多数の
研究者がこの構造遺伝子をクローン化し、ローおよびバ
レンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）、５ｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ａｎｄ Ａｓ５ｅ＋ｍｂｌｙ ｉｎ Ｙｅａｓｔ
ｏｒ ｔ（ｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ５ｕｒ４ａｃｅ
Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｃｏｎｔ
ａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｏ１ｙａｌｂｕａｉｉｎ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、 ３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
３１７ （１９８５）などのようにそれを発現させた
。したがって、該構造遺伝子は合成されたものあるいは
再分離されたものが本分野の研究者から得ることができ
る。あらゆる血清型のｐｒｅＳ２でも本発明の実施に使
用できることも認識されるであろう。
ロー（ＬＯ）により塩基配列が決定された（Ｃｈａｒａ
ｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｒ ｐｒｅＳ２Ｒｅｇｉｏｎ
ｏｒ Ｉ（ｅｐａｔｉｔｉｓ ＢＶｉｒｕｓ、 １３
５ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏａ＋ｍｕｎｉｃａｔ
ｉｏｎｓ ３８２ （１９８６）） 、本分野の多数の
研究者がこの構造遺伝子をクローン化し、ローおよびバ
レンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）、５ｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ａｎｄ Ａｓ５ｅ＋ｍｂｌｙ ｉｎ Ｙｅａｓｔ
ｏｒ ｔ（ｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ５ｕｒ４ａｃｅ
Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｃｏｎｔ
ａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｏ１ｙａｌｂｕａｉｉｎ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、 ３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
３１７ （１９８５）などのようにそれを発現させた
。したがって、該構造遺伝子は合成されたものあるいは
再分離されたものが本分野の研究者から得ることができ
る。あらゆる血清型のｐｒｅＳ２でも本発明の実施に使
用できることも認識されるであろう。
本発明の実施に使用したｐｒｅＳ２楕遺遺伝子血清型ａ
ｄｗプラスミドＡＭ６から得たものである。プラスミド
八Ｍ６は第１図に示した）ＩＢＶゲノムに由来するもの
であり、ｐＢＲ３２２プラスミドが２６の位置のＢａｍ
Ｈ１部位に挿入されている。このｐｒｅＳ２構造遺伝子
のヌクレオチド配列を表１に示す。ここで用いたプラス
ミドはＭＣ１０６１などの適当な大腸菌宿主内で増幅す
ることができる。大腸菌ＭＣｌ０８１株は米国農務省北
部リサーチセンター（ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅ
ｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）から
寄託番号ＮＲＲＬ １８０１６として入手可能である６ ｐｒｅＳ２構造遺伝子の二つの断片はプラスミド八Ｍ６
から回収され、Ｎ末端の最初の１３アミノ酸のヌクレオ
チド配列がｉｎ ｖｉｔｏｒｏで合成された０個々で用
いたヌクレオチド配列の合成は、ホスホトリエステルあ
るいは亜リン酸塩化合物に基づいた化学的方法などの化
学的あるいは酵素的手段のいずれかによって行なうこと
ができる。
ｄｗプラスミドＡＭ６から得たものである。プラスミド
八Ｍ６は第１図に示した）ＩＢＶゲノムに由来するもの
であり、ｐＢＲ３２２プラスミドが２６の位置のＢａｍ
Ｈ１部位に挿入されている。このｐｒｅＳ２構造遺伝子
のヌクレオチド配列を表１に示す。ここで用いたプラス
ミドはＭＣ１０６１などの適当な大腸菌宿主内で増幅す
ることができる。大腸菌ＭＣｌ０８１株は米国農務省北
部リサーチセンター（ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅ
ｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）から
寄託番号ＮＲＲＬ １８０１６として入手可能である６ ｐｒｅＳ２構造遺伝子の二つの断片はプラスミド八Ｍ６
から回収され、Ｎ末端の最初の１３アミノ酸のヌクレオ
チド配列がｉｎ ｖｉｔｏｒｏで合成された０個々で用
いたヌクレオチド配列の合成は、ホスホトリエステルあ
るいは亜リン酸塩化合物に基づいた化学的方法などの化
学的あるいは酵素的手段のいずれかによって行なうこと
ができる。
ｐｒｅＳ２構造遺伝子の７５％を含むＣ末端コード領域
はプラスミド八Ｍ６のＤｒａ ｊ消化によって得られた
。
はプラスミド八Ｍ６のＤｒａ ｊ消化によって得られた
。
Ｄｒａ Ｉ消化は市販されているＤｒａ Ｉエンドヌク
レアーゼを用いて行なった（全てのエンドヌクレアーゼ
は販売元の指示に従って使用した）。次に、Ｄｒａｌ断
片をフェノールで抽出し、エタノール沈澱を行なった。
レアーゼを用いて行なった（全てのエンドヌクレアーゼ
は販売元の指示に従って使用した）。次に、Ｄｒａｌ断
片をフェノールで抽出し、エタノール沈澱を行なった。
次に、通常のＤＮ＾合成法によりオクタマーＳｔｕリン
カ−（＾＾ＧＧＣＣＴＴ ）を調製し、Ｔ４リガーゼを
用いて平滑末端連結反応でＤｒａ ｌ ＵＴ片に連結し
た。
カ−（＾＾ＧＧＣＣＴＴ ）を調製し、Ｔ４リガーゼを
用いて平滑末端連結反応でＤｒａ ｌ ＵＴ片に連結し
た。
連結反応はフェノール抽出で停止させ、続いてエタノー
ル沈澱を行なった。得られた断片はＳｔｕ Ｉエンドヌ
クレアーゼで消化し、ＳＬｕ ｌのマルチマーを除いた
、 次に、Ｓｔｕ ｌリンカ−をつけた断片をＸｂａ Ｉで
消化した。得られたｐｒｅＳ２構造遺伝子のＣ末端コー
ド領域を含んだ約６００塩基対のＳｔｕ ｒ ／Ｘｂａ
Ｉ断片をゲル電気泳動で分離した。
ル沈澱を行なった。得られた断片はＳｔｕ Ｉエンドヌ
クレアーゼで消化し、ＳＬｕ ｌのマルチマーを除いた
、 次に、Ｓｔｕ ｌリンカ−をつけた断片をＸｂａ Ｉで
消化した。得られたｐｒｅＳ２構造遺伝子のＣ末端コー
ド領域を含んだ約６００塩基対のＳｔｕ ｒ ／Ｘｂａ
Ｉ断片をゲル電気泳動で分離した。
この６００塩基対断片を第２図のプラスミドｐＹＭ４の
アガロースゲル電気泳動で分離した５、７ｋｂＸｂａｉ
／５ｔｕｌ消化産物にＴ４リガーゼを用いて連結した。
アガロースゲル電気泳動で分離した５、７ｋｂＸｂａｉ
／５ｔｕｌ消化産物にＴ４リガーゼを用いて連結した。
プラスミドｐＹＭ４は公開されたヨーロッパ特許出願１
８０８９９号などに記述されている。
８０８９９号などに記述されている。
連結反応混合液を次に直接、大腸菌コンピテント細胞（
ＭＣ１０６１）の形質転換に使用し、アンピシリン存在
下で培養した。正しく形質転換されたコロニーを選択し
、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）とドリー（Ｄｏｌ
ｙ）の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ ７：１５１３ （１９７９））によってプラス
ミドＤＮＡを抽出した。
ＭＣ１０６１）の形質転換に使用し、アンピシリン存在
下で培養した。正しく形質転換されたコロニーを選択し
、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）とドリー（Ｄｏｌ
ｙ）の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ ７：１５１３ （１９７９））によってプラス
ミドＤＮＡを抽出した。
０Ｌ） ＯＣＪ ６ＣＪ Ｃ１（ｊ （：Ｉ（
ＯＣＪ （）（Ｊ （：ＩＣｊＣｏ ｏす０
０ Ｃ％ｌ Ｃｏ （） −
ωυ 豐← ザＩ＋ 寸Ｉ＋ りＣＪ ＬＱＣＪ
ロロ ロロ（−ト− ＣＪ （Ｊ ＣＪ ｌ−ロ Ｑト（＜
υ 〈 ← ０＜ ｅｌ（Ｊ （）ＣＪ （）＜ ０＜
（）（Ｊ ＯＣＪ ０＜ｈ ■ の
ト − り ■ 曽曽Ｑ ωリ −ロ
！← ｈω ０− り〈 Ｏ口υ ト一 く ← Ｉ−（ロ ロ ロ ← ロ ロ ロ ロ ζ−４ｃ ４： ４： Ｑ −コ −Ｃ← −Ｃ 抽出したプラスミドＤＮＡをＳｔｕ Ｉで消化し、フェ
ノール抽出およびエタノール沈澱を行なった。 Ｅｃｏ
Ｒ１リンカ−を調製し、Ｔ４リガーゼで該Ｓｔｕ ｌ断
片に連結した。過剰のリンカ−をＥｃｏＲＩ消化によっ
て除去した。このＥｃｏＲＩリンカ−をつけた断片をさ
らにＸｂａ Ｉで消化し、ｐｒｅＳｚ構造遺伝子のＣ末
端部分を含む断片を電気泳動によって分離した。
ＯＣＪ （）（Ｊ （：ＩＣｊＣｏ ｏす０
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ノール抽出およびエタノール沈澱を行なった。 Ｅｃｏ
Ｒ１リンカ−を調製し、Ｔ４リガーゼで該Ｓｔｕ ｌ断
片に連結した。過剰のリンカ−をＥｃｏＲＩ消化によっ
て除去した。このＥｃｏＲＩリンカ−をつけた断片をさ
らにＸｂａ Ｉで消化し、ｐｒｅＳｚ構造遺伝子のＣ末
端部分を含む断片を電気泳動によって分離した。
Ｘｂａ Ｉ −ＥｃｏＲＩ消化産物をＸｂａ Ｉ −Ｅ
ｃｏＲＩで切断したｐｔｌｃ１８に連結した。連結混合
液で大腸菌コンピテント細胞（ＭＣ１０６１）を形質転
換し、アンピシリン存在下で培養した。 ｐｒｅＳ２楕
遣遺伝子のＣ末端部分を含む形質転換体細胞をＣｌａ
ＩおよびＸｂａ Ｉを用いた消化断片解析によって選択
した。この過程で選択されたプラスミドをｐＨ５２−Ｂ
と命名した。
ｃｏＲＩで切断したｐｔｌｃ１８に連結した。連結混合
液で大腸菌コンピテント細胞（ＭＣ１０６１）を形質転
換し、アンピシリン存在下で培養した。 ｐｒｅＳ２楕
遣遺伝子のＣ末端部分を含む形質転換体細胞をＣｌａ
ＩおよびＸｂａ Ｉを用いた消化断片解析によって選択
した。この過程で選択されたプラスミドをｐＨ５２−Ｂ
と命名した。
ｐｒｅＳ２遺伝子の中央部はまずプラスミド＾Ｈ６をｘ
ｂａｌおよびＢａｍＨｆで消化することにより回収した
。
ｂａｌおよびＢａｍＨｆで消化することにより回収した
。
目的の２５０塩基対断片はゲル電気泳動によって分離し
た０次に、２５０ｂｐ Ｘｂａ Ｉ ／ＢａｍＨｌ断
片をＸｂａ １およびＢａｍＨＩで消化したｐｕｃ１８
に連結し、大腸菌ＨＣｌ６０１の形質転換に使用した。
た０次に、２５０ｂｐ Ｘｂａ Ｉ ／ＢａｍＨｌ断
片をＸｂａ １およびＢａｍＨＩで消化したｐｕｃ１８
に連結し、大腸菌ＨＣｌ６０１の形質転換に使用した。
アンピシリン存在下で増殖する培養物について、プラス
ミドＤＮ＾を回収してＢａｍＨｌで消化することにより
解析した。
ミドＤＮ＾を回収してＢａｍＨｌで消化することにより
解析した。
電気泳動で２．７ｋｂの直頒状断片を含むプラスミドを
目的の２５０ｂｐ断片を含むものであると見なした。
目的の２５０ｂｐ断片を含むものであると見なした。
２５０ｂｐ断片を含む形質転換体コロニーの一つを分離
し、大量に培養した。コロニーからプラスミドＤＮＡを
分離、精製し、ＥｃｏＲｌとｈｍＨＩで消化した。
し、大量に培養した。コロニーからプラスミドＤＮＡを
分離、精製し、ＥｃｏＲｌとｈｍＨＩで消化した。
電気泳動によってベクターのバンドを分離した。
ベクターは下に示すリン酸化した二本鎖オリゴヌクレオ
チドをもちいて連結した。
チドをもちいて連結した。
ｈ葺 −旧
５′ ＾ＡＴＴＣＡＡＴＣＣＣＴＣＴＧＣＡＧ ３
’３°ＧＴＴＡＧＧＣＡＧＡＣＧＴＣＣＴＡＧ ５“
連結反応混合液を大腸菌ＭＣ１６０１の形質転換に使用
し、正しい挿入断片を含むコロニーをアンピシリン耐性
によって選択した。このプラスミドをｐｐＳ２と命名し
た。
’３°ＧＴＴＡＧＧＣＡＧＡＣＧＴＣＣＴＡＧ ５“
連結反応混合液を大腸菌ＭＣ１６０１の形質転換に使用
し、正しい挿入断片を含むコロニーをアンピシリン耐性
によって選択した。このプラスミドをｐｐＳ２と命名し
た。
ｐｒｅＳ２のＮ末端コード領域を以下の配列のき成オリ
ゴヌクレオチドとして調製した。
ゴヌクレオチドとして調製した。
ＨｉｎｄＩＩＩＰｓｔ
５゛ ＾ＧＣＴＴにへへＴＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡ
ＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣΔ＾＾ＣＴＣＴＧ
Ｃへ ３′＾ＣＴＴ＾＾ＧＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡ
ＧにＴにＡＣに［；＾＾ＧＧＴＧＧＴＴＴ（：ＡＧ
５’この配列をｐＵｃ１８の旧ｎｄＩ［ｌとＰｓｔ Ｉ
による消化産物にクローニングした。目的の形質転換体
はＥｃｏＲＩ消化後に消化法動を行い、約７５ｂｐの断
片が存在することによって確認した。この方法によって
選択されたプラスミドをｐＴＢｏ−２八と命名した。
ＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣΔ＾＾ＣＴＣＴＧ
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による消化産物にクローニングした。目的の形質転換体
はＥｃｏＲＩ消化後に消化法動を行い、約７５ｂｐの断
片が存在することによって確認した。この方法によって
選択されたプラスミドをｐＴＢｏ−２八と命名した。
該遺伝子の中央部を、ベクターｐＴＩｌＯ−２＾をＰｓ
ｔ ＩおよびＸｂａ Ｉで消化することによりつけ加え
た；挿入断片はｐＰＳ２由来の２５０ｂｐびＰｓｔ ｌ
−Ｘｂａ ｌ断片である。形質転換体は＞ ３００ｂ
ｐのＥｃｏＲｌ断片および２９０ｂｐのＸｂａ Ｉ ／
）ＩｉｎｄＩ［［断片の存在によって確認した。
ｔ ＩおよびＸｂａ Ｉで消化することによりつけ加え
た；挿入断片はｐＰＳ２由来の２５０ｂｐびＰｓｔ ｌ
−Ｘｂａ ｌ断片である。形質転換体は＞ ３００ｂ
ｐのＥｃｏＲｌ断片および２９０ｂｐのＸｂａ Ｉ ／
）ＩｉｎｄＩ［［断片の存在によって確認した。
正しい挿入が行なわれたプラスミドをｐＴＢｏ−３と命
名した。完全なｐｒｅＳ２遺伝子は、Ｘｂａ Ｉ ／Ｂ
ｉｎｄＩ［［で消化したｐＨ５２ＢにｐＴＢｏ−３由来
の旧ｒｅｄ ｍ ／Ｘｂａ ｌ断片を挿入することによ
り得た。アンピシリン耐性の形質転換体を８２５ｂｐの
ＥｃｏＲｌ断片の存在によって解析した。正しい構造の
ものをｐＴＢｏ４と名付けた。
名した。完全なｐｒｅＳ２遺伝子は、Ｘｂａ Ｉ ／Ｂ
ｉｎｄＩ［［で消化したｐＨ５２ＢにｐＴＢｏ−３由来
の旧ｒｅｄ ｍ ／Ｘｂａ ｌ断片を挿入することによ
り得た。アンピシリン耐性の形質転換体を８２５ｂｐの
ＥｃｏＲｌ断片の存在によって解析した。正しい構造の
ものをｐＴＢｏ４と名付けた。
上記の大腸菌の培養はいかなる適当な方法によっても行
なうことができる。−船釣な大腸菌の培養法は本分野で
は既知であり、ここで用いられる株に特異的に必要とさ
れるそのいかなる応用法ら本分野の通常の技術に熟達し
た者の能力内で行なわれる。
なうことができる。−船釣な大腸菌の培養法は本分野で
は既知であり、ここで用いられる株に特異的に必要とさ
れるそのいかなる応用法ら本分野の通常の技術に熟達し
た者の能力内で行なわれる。
大腸菌からのプラスミドＤＮへの回収は、その大きさの
小さいことおよび閉じた球状のスーパーへワックス形の
ために、いくつかの方法によって行なうことができる０
例えば、菌を回収した後、宿主細胞を遠心でベレットに
し、再懸濁して溶菌させる。溶菌液を遠心して細胞残渣
を除去し、ＤＮＡと含む上清を得る６次にフェノール抽
出を行い、ＤＮＡから他の混合物のほとんどを除く。フ
ェノール抽出したＤＮＡは密度勾配遠心あるいはゲル濾
過によって大腸菌ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを分離す
る。
小さいことおよび閉じた球状のスーパーへワックス形の
ために、いくつかの方法によって行なうことができる０
例えば、菌を回収した後、宿主細胞を遠心でベレットに
し、再懸濁して溶菌させる。溶菌液を遠心して細胞残渣
を除去し、ＤＮＡと含む上清を得る６次にフェノール抽
出を行い、ＤＮＡから他の混合物のほとんどを除く。フ
ェノール抽出したＤＮＡは密度勾配遠心あるいはゲル濾
過によって大腸菌ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを分離す
る。
上述の分離技術はよく知られており、これらの技術を行
なう多数の方法が知られている。
なう多数の方法が知られている。
プラスミドのヌクレアーゼ消化は、ｐｒｅＳｚ構造遺伝
子の回収を容易にするように選択したプラスミドを切断
する適当なエンドヌクレアーゼを選択して行なう。使用
するエンドヌクレアーゼはｐｒｅＳ２遺伝子が切り出さ
れるプラスミドに依存する。例えば、プラスミド＾Ｍ６
に含まれるｐｒｅＳ２ｔＴ！４逍遺伝子はＤｒａ Ｉ
−Ｈｌｎｃ ＩＩ断片中に回収される。
子の回収を容易にするように選択したプラスミドを切断
する適当なエンドヌクレアーゼを選択して行なう。使用
するエンドヌクレアーゼはｐｒｅＳ２遺伝子が切り出さ
れるプラスミドに依存する。例えば、プラスミド＾Ｍ６
に含まれるｐｒｅＳ２ｔＴ！４逍遺伝子はＤｒａ Ｉ
−Ｈｌｎｃ ＩＩ断片中に回収される。
ＤＮＡのゲル電気泳動は多数の方法で行なうことができ
る。ｐ、ｃ、シーリー（Ｓｅａｌｙ）とＥ、Ｍ、サザン
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ） 、Ｇｅｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｅｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ−＾Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ＾ｐｐｒｏａｃｈ （Ｄ、リックウ
ッド（Ｒｉｃｋｗｏｏｄ） 、Ｂ、Ｄ、ヘイムス（ｌａ
ｍｅ！！ ）編集）ｐ。
る。ｐ、ｃ、シーリー（Ｓｅａｌｙ）とＥ、Ｍ、サザン
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ） 、Ｇｅｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｅｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ−＾Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ＾ｐｐｒｏａｃｈ （Ｄ、リックウ
ッド（Ｒｉｃｋｗｏｏｄ） 、Ｂ、Ｄ、ヘイムス（ｌａ
ｍｅ！！ ）編集）ｐ。
３９ （１９８２）参照、溶出も使用したゲルに合った
多数の方法、例えば電気的溶出、拡散、ゲル溶解（アガ
ロース）、物理的押出（アガロース）などによって行な
われる。高品質の低温融解アガロースなどの数種のゲル
の場合には溶出は必ずしも必要ではないことも知られて
いる。
多数の方法、例えば電気的溶出、拡散、ゲル溶解（アガ
ロース）、物理的押出（アガロース）などによって行な
われる。高品質の低温融解アガロースなどの数種のゲル
の場合には溶出は必ずしも必要ではないことも知られて
いる。
ｐｒｅＳ２構造遺伝子を含む断片またはその一部を含む
断片が分離されると、ベクターに挿入する前にさらなる
操作が必要となる。これらの操作には、リンカ−の付加
あるいは断片の平滑末端化などが含まれるがそれに制限
されるものではない。
断片が分離されると、ベクターに挿入する前にさらなる
操作が必要となる。これらの操作には、リンカ−の付加
あるいは断片の平滑末端化などが含まれるがそれに制限
されるものではない。
ｐｒｅＳ２構造遺伝子の分離後、該遺伝子はプラスミド
などの適当なメチロトロフィック酵母ベクターに挿入さ
れる０本発明の実施に推奨されるベクターはピキア属に
適するものであり、最も望ましいのはピキア・パストリ
スに適合するものである。
などの適当なメチロトロフィック酵母ベクターに挿入さ
れる０本発明の実施に推奨されるベクターはピキア属に
適するものであり、最も望ましいのはピキア・パストリ
スに適合するものである。
プラスミドは以前から組換えＴｈＮＡ技術で使用されて
きた基本的な要素の一つである。プラスミドは微生物中
に見いだされる染色体外の環状二本鎖ＤＮＡである。プ
ラスミドは細胞あたり１コピーあるいは多コピーで存在
することが見いだされている。プラスミドにはプラスミ
ドの複製に関する情報、すなわち細菌の複製のための複
製開始点が含まれている。形質転換された細胞中のプラ
スミドを形質で選択する手段となる一つ以上の情報もプ
ラスミド上にコードされている。抗生物質耐性遺伝子あ
るいは宿主に欠損している生化学的経路を相補する遺伝
子などの形質マーカーあるいは選択マーカーにより、形
質転換された宿主細胞クローンが認識、選択されて維持
されることができる。
きた基本的な要素の一つである。プラスミドは微生物中
に見いだされる染色体外の環状二本鎖ＤＮＡである。プ
ラスミドは細胞あたり１コピーあるいは多コピーで存在
することが見いだされている。プラスミドにはプラスミ
ドの複製に関する情報、すなわち細菌の複製のための複
製開始点が含まれている。形質転換された細胞中のプラ
スミドを形質で選択する手段となる一つ以上の情報もプ
ラスミド上にコードされている。抗生物質耐性遺伝子あ
るいは宿主に欠損している生化学的経路を相補する遺伝
子などの形質マーカーあるいは選択マーカーにより、形
質転換された宿主細胞クローンが認識、選択されて維持
されることができる。
メチロトロフィック酵母でｐｒｅＳ、構造遺伝子を発現
させるためには、該遺伝子は使用可能な様式で５′制御
配列および３′終止配列に連結されていなければならず
°、これはベクターを介して宿主に挿入される発現カセ
ットを構成する。
させるためには、該遺伝子は使用可能な様式で５′制御
配列および３′終止配列に連結されていなければならず
°、これはベクターを介して宿主に挿入される発現カセ
ットを構成する。
以下の語句は、明確化のためにここで定義するものであ
る。
る。
使用可能な様式で連結−ｍ−要素がその機能を実行する
ために配置された位置関係を意味する。
ために配置された位置関係を意味する。
制御領域−ｍ−多様な刺激に反応し、ｍＲＮ＾転写効率
に影響するＤＮＡ配列。
に影響するＤＮＡ配列。
３′終止配列−−−ポリアデニル化を行なわせる配列な
どの、ｅ＋ＲＮ＾の安定化に働く終止コドンの３゛側の
塩基配列。
どの、ｅ＋ＲＮ＾の安定化に働く終止コドンの３゛側の
塩基配列。
゛°ピキア適合性”とは、ピキア内で通常の機能が働く
ようなピキア由来の制御配列および３′終止配列などの
ＤＮＡ配列を意味する。
ようなピキア由来の制御配列および３′終止配列などの
ＤＮＡ配列を意味する。
本発明の実施には、ヨーロッパ出願番号８８１１４７０
０．７号に記載されたフレラグ（Ｃｒｅｇｇ ）の直鎖
状部位特異的組み込みベクターなどの組み込みベクター
が望ましい、これは現在は、ヨーロッパ出願公開２２６
７５２号として公表されている。このようなベクターは
少なくとも１）第一の挿入可能［ＩＮＡ断片： ２）！
！択可能マーカー遺伝子：および第二の挿入可能ＤＮＡ
断片の該操作された配列を含む。
０．７号に記載されたフレラグ（Ｃｒｅｇｇ ）の直鎖
状部位特異的組み込みベクターなどの組み込みベクター
が望ましい、これは現在は、ヨーロッパ出願公開２２６
７５２号として公表されている。このようなベクターは
少なくとも１）第一の挿入可能［ＩＮＡ断片： ２）！
！択可能マーカー遺伝子：および第二の挿入可能ＤＮＡ
断片の該操作された配列を含む。
第一の挿入可能ＤＮＡ断片および第二の挿入可能ＤＮＡ
断片はそれぞれ少なくとも約２００ｂｐであり、ピキア
属の穫のゲノムｌ）Ｎ＾の一部と相同性のあるヌクレオ
チド配列を有する。挿入ベクターの多様な要素は、発現
カセット及び選択可能マーカー遺伝子が第一の挿入可能
ＤＮＡ断片の３′末端と第二の挿入可能叶＾断片の５°
末端の間に位置するような直鎖状ＯＮ＾断片を形成する
ように順に配置される。
断片はそれぞれ少なくとも約２００ｂｐであり、ピキア
属の穫のゲノムｌ）Ｎ＾の一部と相同性のあるヌクレオ
チド配列を有する。挿入ベクターの多様な要素は、発現
カセット及び選択可能マーカー遺伝子が第一の挿入可能
ＤＮＡ断片の３′末端と第二の挿入可能叶＾断片の５°
末端の間に位置するような直鎖状ＯＮ＾断片を形成する
ように順に配置される。
第一の挿入可能ＤＮＡ断片および第二の挿入可能ＤＮＡ
断片は互いに、元来のゲノムに於ける向きと同じ向きで
核層に並べられた直鎖状断片上に並べられる。
断片は互いに、元来のゲノムに於ける向きと同じ向きで
核層に並べられた直鎖状断片上に並べられる。
第一および第二の挿入可能ＯＮ＾断片として有用なヌク
レオチド配列は、ゲノムの修飾が起こる元来のゲノム部
位の分断された部分と相同なヌクレオチド配列である。
レオチド配列は、ゲノムの修飾が起こる元来のゲノム部
位の分断された部分と相同なヌクレオチド配列である。
従って、例えば、ゲノム修飾がアルコールオキシダーゼ
遺伝子座で起こる場合には、用いられる第一及び第二の
挿入可能ＤＮＡ断片はアルコールオキシダーゼ遺伝子座
の分断された部分と相同な配列となる。本発明によるゲ
ノム修飾を行なうためには、二つの挿入可能ＤＮＡ断片
が元のゲノムに存在するのと同じ相対的向きで、直鎖状
断片中に互いに位置しなければならない。
遺伝子座で起こる場合には、用いられる第一及び第二の
挿入可能ＤＮＡ断片はアルコールオキシダーゼ遺伝子座
の分断された部分と相同な配列となる。本発明によるゲ
ノム修飾を行なうためには、二つの挿入可能ＤＮＡ断片
が元のゲノムに存在するのと同じ相対的向きで、直鎖状
断片中に互いに位置しなければならない。
第一および第二の挿入可能ＤＮＡ断片として使用可能な
ヌクレオチド配列の例は、アルコールオキシダーゼ（＾
０ｘ１）遺伝子、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＨ
ＡＳＩ ）遺伝子、ｐ４０遺伝子および１ｌＩｓ４遺伝
子からなる群から選択されたヌクレオチド配列である。
ヌクレオチド配列の例は、アルコールオキシダーゼ（＾
０ｘ１）遺伝子、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＨ
ＡＳＩ ）遺伝子、ｐ４０遺伝子および１ｌＩｓ４遺伝
子からなる群から選択されたヌクレオチド配列である。
只■遺伝子、…旦遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４
遺伝子は公開されたヨーロッパ特許出願０１８３０７１
号（フィリップス・ペトロレウム社）に含まれている。
遺伝子は公開されたヨーロッパ特許出願０１８３０７１
号（フィリップス・ペトロレウム社）に含まれている。
第一の挿入可能ＤＮＡ断片は発現カセットで使用される
制御領域を含む使用可能な制御領域を含んでいる６発現
カセットの制御領域として第一の挿入可能ＤＮＡ断片を
使用することは、本発明の望ましい態様である。第４図
はカセットの制御領域として第一の挿入可能ＤＮＡ断片
を用いたベクターの模式図である。
制御領域を含む使用可能な制御領域を含んでいる６発現
カセットの制御領域として第一の挿入可能ＤＮＡ断片を
使用することは、本発明の望ましい態様である。第４図
はカセットの制御領域として第一の挿入可能ＤＮＡ断片
を用いたベクターの模式図である。
さらに、第４図に示されているように、挿入部位および
３′終止配列は第一の挿入可能ＤＮＡ断片の３′側に接
して位置する。直鎖状部位特異的挿入ベクターのこの構
造は、適合性のある３′終止配列の付加を必要とするこ
となく構造遺伝子の挿入に適した部位を与えるというさ
らなる長所がある。
３′終止配列は第一の挿入可能ＤＮＡ断片の３′側に接
して位置する。直鎖状部位特異的挿入ベクターのこの構
造は、適合性のある３′終止配列の付加を必要とするこ
となく構造遺伝子の挿入に適した部位を与えるというさ
らなる長所がある。
また、宿主株の形質転換に使用される少なくとも一つの
選択可能マーカー遺伝子がＤＮＡに含まれていることも
必要である。これにより、形質転換されたＤＮＡが導入
されたこれらの菌の選択および分離が容易になる。マー
カー遺伝子は宿主が持っていない形質的特徴、例えば形
質転換されていない細胞では特異的アミノ酸生合成経路
で欠損している特定のアミノ酸産生能の回復あるいは抗
生物質耐性などを与える。
選択可能マーカー遺伝子がＤＮＡに含まれていることも
必要である。これにより、形質転換されたＤＮＡが導入
されたこれらの菌の選択および分離が容易になる。マー
カー遺伝子は宿主が持っていない形質的特徴、例えば形
質転換されていない細胞では特異的アミノ酸生合成経路
で欠損している特定のアミノ酸産生能の回復あるいは抗
生物質耐性などを与える。
選択可能マーカー遺伝子の例は、ピキア・パストリスお
よびサッカロミセス・セレビジエ由来のＨＩＳ４遺伝子
およびΔＦｔＧ４遺伝子、サッカロミセス・セレビジエ
由来のインベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２）、あるいは大
腸菌転移可能因子Ｔｎ６０１またはＴｎ９０３由来の６
４１８ホスホトランスフエラーゼ遺伝子からなる群から
選択される。
よびサッカロミセス・セレビジエ由来のＨＩＳ４遺伝子
およびΔＦｔＧ４遺伝子、サッカロミセス・セレビジエ
由来のインベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２）、あるいは大
腸菌転移可能因子Ｔｎ６０１またはＴｎ９０３由来の６
４１８ホスホトランスフエラーゼ遺伝子からなる群から
選択される。
例えば、細菌プラスミドＤＮ＾、バクテリオファージＤ
ＮＡなどのさらなるＯＮ＾配列も本発明の実施で用いら
れるベクターに含められることは、本分野の通常の技術
に熟達した者に認識されるであろう。
ＮＡなどのさらなるＯＮ＾配列も本発明の実施で用いら
れるベクターに含められることは、本分野の通常の技術
に熟達した者に認識されるであろう。
このような配列により、これらのベクターの細菌宿主に
於ける増幅および維持が可能になる。
於ける増幅および維持が可能になる。
第一の挿入ＤＮ＾断片が制御領域を含まない場合には、
使用可能な発現カセットを得るためには適当な制御領域
を使用可能な様式で該構造遺伝子に連結させて挿入する
ことが必要となる。同様に、３′終止配列は挿入部位に
与えられていない場合には、発現カセットを完全にする
ために、３′終止配列を使用可能な様式で構造遺伝子に
連結させて挿入することが必要である。
使用可能な発現カセットを得るためには適当な制御領域
を使用可能な様式で該構造遺伝子に連結させて挿入する
ことが必要となる。同様に、３′終止配列は挿入部位に
与えられていない場合には、発現カセットを完全にする
ために、３′終止配列を使用可能な様式で構造遺伝子に
連結させて挿入することが必要である。
本分野の通常の技術に熟達した者は、解析されていてメ
チロトロフィック酵母と関連して使用できる多数の制御
領域に気づくであろう、制御領域の例としては、サッカ
ロミセス・セレビジエから分離された酸フォスファター
ゼ、ガラクトキナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、
チトクロームｃ、α接合因子およびグリセルアルデヒド
３リン酸デヒドロゲナーゼの制御領域：ピキア・パスト
リスから分離された第一アルコールオキシダーゼ（＾０
ｘ１）、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＡＳＩ ）
、ｐ４０の制御領域および旧８４制御領域などからなる
群から選択される酵母制御領域を含むが、これに制限さ
れるものではない０本発明の実施に用いる望ましい制御
領域は現在のところ＾ＯＸ１、ＤＨＡＳ１、ｐ４０から
なる群から選択される制御領域のような、メタノール含
有培地に反応する能力によって特徴づけられるものであ
り、公開されたヨーロッパ特許出願０１８３０７１号に
開示されている。
チロトロフィック酵母と関連して使用できる多数の制御
領域に気づくであろう、制御領域の例としては、サッカ
ロミセス・セレビジエから分離された酸フォスファター
ゼ、ガラクトキナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、
チトクロームｃ、α接合因子およびグリセルアルデヒド
３リン酸デヒドロゲナーゼの制御領域：ピキア・パスト
リスから分離された第一アルコールオキシダーゼ（＾０
ｘ１）、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＡＳＩ ）
、ｐ４０の制御領域および旧８４制御領域などからなる
群から選択される酵母制御領域を含むが、これに制限さ
れるものではない０本発明の実施に用いる望ましい制御
領域は現在のところ＾ＯＸ１、ＤＨＡＳ１、ｐ４０から
なる群から選択される制御領域のような、メタノール含
有培地に反応する能力によって特徴づけられるものであ
り、公開されたヨーロッパ特許出願０１８３０７１号に
開示されている。
本発明の実施に最も推奨される制御領域は＾ＯＸＩ制御
領域である。
領域である。
３′終止配列は上述のように発現カセットあるいはベク
ターの一部として使用され得る。３′終止配列は構造遺
伝子と使用可能な様式で連結すると該遺伝子にコードさ
れるメツセンジャーＲＮ＾の終止、ポリアデニル化、お
よび／あるいは安定化に働く。
ターの一部として使用され得る。３′終止配列は構造遺
伝子と使用可能な様式で連結すると該遺伝子にコードさ
れるメツセンジャーＲＮ＾の終止、ポリアデニル化、お
よび／あるいは安定化に働く。
本発明の実施のための３°終終止列の典型的な由来のい
くつかの例としては、サッカロミセス・セレビジエ、ハ
ンセヌラ・ポリモルファ（）Ｉａｎｓｅｎｕ Ｉａ匹丘
赳球ｂ）、およびピキアの３°終終止列が含まれるが、
これに制限されるものではない、望ましいもツバ、ＡＯ
ＸＩ遺伝子、ＤＨＡＳＩ遺伝子、ｐ４０３１！伝子およ
びＨＩＳ４１伝子の３′終終止列からなる群から選択さ
れるようなピキア・パストリス由来のものである。特に
望ましいのはへ〇ＸＩ道伝子の３″終終止列である。
くつかの例としては、サッカロミセス・セレビジエ、ハ
ンセヌラ・ポリモルファ（）Ｉａｎｓｅｎｕ Ｉａ匹丘
赳球ｂ）、およびピキアの３°終終止列が含まれるが、
これに制限されるものではない、望ましいもツバ、ＡＯ
ＸＩ遺伝子、ＤＨＡＳＩ遺伝子、ｐ４０３１！伝子およ
びＨＩＳ４１伝子の３′終終止列からなる群から選択さ
れるようなピキア・パストリス由来のものである。特に
望ましいのはへ〇ＸＩ道伝子の３″終終止列である。
本発明の実施には現在は第４図に示した構造のＢｇｌＩ
［断片のような直鎖状形質転換ベクターを使用すること
が望ましい。
［断片のような直鎖状形質転換ベクターを使用すること
が望ましい。
適当なベクターへのｐｒｅＳｚ構造遺伝子の挿入は、選
択されたベクターを適当な部位で切断し、ベクター内に
存在したｐｒｅＳ２ｔｉ造遺伝子を含む少なくとも一つ
の使用可能な発現カセットが得られるような適当な方法
によって行なわれる。
択されたベクターを適当な部位で切断し、ベクター内に
存在したｐｒｅＳ２ｔｉ造遺伝子を含む少なくとも一つ
の使用可能な発現カセットが得られるような適当な方法
によって行なわれる。
ｐｒｅＳ２構造遺伝子の連結反応は、Ｔ４ ＤＮ＾リ
ガーゼを用いるなどの適当な連結反応技術によって行わ
れる。
ガーゼを用いるなどの適当な連結反応技術によって行わ
れる。
ｐｒｅＳ２構造遺伝子とベクターの連結反応混合液の最
初の選択、増殖および任意の増幅は、大腸菌などの細菌
宿主に混合液を形質転換する事によって行なうのが望ま
しい。適当な大腸菌形質転換法は本分野ではよく知られ
ている。さらに、ベクターの細菌宿主内での維持に必要
な選択マーカーおよび細菌複製開始点も本分野では既知
である。
初の選択、増殖および任意の増幅は、大腸菌などの細菌
宿主に混合液を形質転換する事によって行なうのが望ま
しい。適当な大腸菌形質転換法は本分野ではよく知られ
ている。さらに、ベクターの細菌宿主内での維持に必要
な選択マーカーおよび細菌複製開始点も本分野では既知
である。
発現系におけるｐｒｅＳ１構造遺伝子を含む目的の１ラ
スミドの分離および／あるいは精製は宿主ＤＮＡからプ
ラスミドＤＮＡを分離する適当な方法で行なわれる。
スミドの分離および／あるいは精製は宿主ＤＮＡからプ
ラスミドＤＮＡを分離する適当な方法で行なわれる。
同様に、連結によって形成されたベクターは増幅後にｐ
ｒｅＳ２遺伝子の存在およびその制御領域と３′終終止
列に使用可能な様式で連結していることを確実にするた
めに確認を行なうことが望ましい。
ｒｅＳ２遺伝子の存在およびその制御領域と３′終終止
列に使用可能な様式で連結していることを確実にするた
めに確認を行なうことが望ましい。
これは、エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動あるい
はエンドヌクレアーゼ消化−サザンハイブリダイゼーシ
ョンなどの多様な技術によって行うことができるが、こ
れらに制限されるものではない。
はエンドヌクレアーゼ消化−サザンハイブリダイゼーシ
ョンなどの多様な技術によって行うことができるが、こ
れらに制限されるものではない。
プラスミドあるいは直鎖状ベクターの酵母宿主細胞への
形質転換は、ヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）他、Ｐｒｏｅ、
Ｈａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ｔｌｓ八７５．（１９７
Ｂ） へ９２９ ；伊藤他、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
１５３．（１９８３） １６３ ；フレラグ（Ｃｒｅｇ
ｇ ）他、阿ｏ１．ｃｅ１１．Ｂｉｏ１．５（１９８５
） ３３７６； あるいはスリークリシュナ（５ｒｅ
ｅｋｒｉｓｈｎａ ）他、Ｇｅｎｅ、 ５９（１９８７
） １１５などの方法を含む適当な形質転換法によって
行なうことができるが、これらに制限されるものではな
い。本発明の実施に望ましいものは、フレラグの形質転
換法である０本発明の実施には、過剰の直鎖状ベクター
を使用し、サザンハイブリダイゼーションによって多数
の挿入について選択を行なうことが望ましい。
形質転換は、ヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）他、Ｐｒｏｅ、
Ｈａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ｔｌｓ八７５．（１９７
Ｂ） へ９２９ ；伊藤他、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
１５３．（１９８３） １６３ ；フレラグ（Ｃｒｅｇ
ｇ ）他、阿ｏ１．ｃｅ１１．Ｂｉｏ１．５（１９８５
） ３３７６； あるいはスリークリシュナ（５ｒｅ
ｅｋｒｉｓｈｎａ ）他、Ｇｅｎｅ、 ５９（１９８７
） １１５などの方法を含む適当な形質転換法によって
行なうことができるが、これらに制限されるものではな
い。本発明の実施に望ましいものは、フレラグの形質転
換法である０本発明の実施には、過剰の直鎖状ベクター
を使用し、サザンハイブリダイゼーションによって多数
の挿入について選択を行なうことが望ましい。
形質転換のための酵母宿主は適当なメチロトロフィック
酵母全てである。メチロトロフィック酵母はハンセヌラ
（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ） 、カンディダ（Ｃａｎ虹ム）
、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ） 、ピキア、サ
ツカロミセス、トルロプシス（７）およびロドトルラ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されるメ
タノール上で増殖可能な酵母を含むが、それに制限され
るものではない。このクラスの酵母の例である特異的な
種のリストは、Ｃ，アントニー（＾ｎｔｈｏｎｙ） 、
Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｒＭｅｔｈｙｌ
ｏｔｒｏｐｈｓ、 ２６９ （１９８２）に示されてい
る。現在望ましいものは、栄養要求性ピキア・パストリ
スＧＳ１１５ （）ｌＲＲＬ Ｙ−１５８５１＞などの
ピキア属のメチロトロフィック酵母である。栄養要求性
メチロトロフィック酵母はまた、その選択の容易さのた
めに本発明の実施に適している。野生型メチロトロフィ
ック酵母株は、銭μをピキア・パストリスの形質転換に
もちいて蔗糖上で増殖可能とすることあるいはＧ１４８
’遺伝子などの抗生物質耐性マーカーを用いるなど、適
当な形質転換マーカー選任子が選択されれば同様に効果
的に使用されると考えられる。
酵母全てである。メチロトロフィック酵母はハンセヌラ
（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ） 、カンディダ（Ｃａｎ虹ム）
、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ） 、ピキア、サ
ツカロミセス、トルロプシス（７）およびロドトルラ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されるメ
タノール上で増殖可能な酵母を含むが、それに制限され
るものではない。このクラスの酵母の例である特異的な
種のリストは、Ｃ，アントニー（＾ｎｔｈｏｎｙ） 、
Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｒＭｅｔｈｙｌ
ｏｔｒｏｐｈｓ、 ２６９ （１９８２）に示されてい
る。現在望ましいものは、栄養要求性ピキア・パストリ
スＧＳ１１５ （）ｌＲＲＬ Ｙ−１５８５１＞などの
ピキア属のメチロトロフィック酵母である。栄養要求性
メチロトロフィック酵母はまた、その選択の容易さのた
めに本発明の実施に適している。野生型メチロトロフィ
ック酵母株は、銭μをピキア・パストリスの形質転換に
もちいて蔗糖上で増殖可能とすることあるいはＧ１４８
’遺伝子などの抗生物質耐性マーカーを用いるなど、適
当な形質転換マーカー選任子が選択されれば同様に効果
的に使用されると考えられる。
形質転換されたメチロトロフィック酵母細胞は、形質転
換後の栄養要求性であった細胞を要求される生化学的産
物（該細胞の栄養要求性による）の非存在下で培養する
こと、新しい形質の検出（“メタノール・スロー（ｍｅ
ｔｈａｎｏｌ ｓｌｏｗ）”）による選択、あるいは形
質転換体に含まれている耐性遺伝子が存在しなければ酵
母に対して毒性を持つ抗生物質の存在下で培養すること
を含む適当な技術を用いて選択することができるが、こ
れに制限されるものではない。
換後の栄養要求性であった細胞を要求される生化学的産
物（該細胞の栄養要求性による）の非存在下で培養する
こと、新しい形質の検出（“メタノール・スロー（ｍｅ
ｔｈａｎｏｌ ｓｌｏｗ）”）による選択、あるいは形
質転換体に含まれている耐性遺伝子が存在しなければ酵
母に対して毒性を持つ抗生物質の存在下で培養すること
を含む適当な技術を用いて選択することができるが、こ
れに制限されるものではない。
分離されたメチロトロフィック酵母形質転換体は、振ど
うフラスコ発酵、高密度発酵あるいはフレラグ他、 Ｈ
ｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ ＥｘｐｒｅＳｓｉｏｎ ａｎｄ
Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｓ５ｅ＋＊ｂｌｙ ｏｆ
Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ５ｕｒｆａｃｅ Ａ
ｎｔｉｇｅｎｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈ
ｉｃ Ｙｅａｓｔ、 Ｐｉｃｈｉａ Ｐａ５ｔｏｒｉｓ
。
うフラスコ発酵、高密度発酵あるいはフレラグ他、 Ｈ
ｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ ＥｘｐｒｅＳｓｉｏｎ ａｎｄ
Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｓ５ｅ＋＊ｂｌｙ ｏｆ
Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ５ｕｒｆａｃｅ Ａ
ｎｔｉｇｅｎｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈ
ｉｃ Ｙｅａｓｔ、 Ｐｉｃｈｉａ Ｐａ５ｔｏｒｉｓ
。
５ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７９ （１９８
７）に示された方法などの適当な発酵法によって培養す
る。
７）に示された方法などの適当な発酵法によって培養す
る。
発現は用いる制御領域に応じた方法によって行なう、メ
タノール反応性制御領域を使用することが望ましく、そ
の場合には発現誘導は宋養培地中の該形質転換体さ細胞
を用いる制御領域に適したアルコールにさらすことによ
って行なう。
タノール反応性制御領域を使用することが望ましく、そ
の場合には発現誘導は宋養培地中の該形質転換体さ細胞
を用いる制御領域に適したアルコールにさらすことによ
って行なう。
抗原性粒子は、ビーズ破砕した後に細胞の残渣を除くの
に十分な遠心を行なうなどの標準的な方法を用いて、十
分な時間誘導を行なった形質転換体細胞を破壊して精製
されていない状態で回収される。本分野の通常の技術に
熟達した者は、上記の一般的な抽出法あるいはさらなる
精製法に代わる、単細胞宿主生物から均質でないタンパ
ク質を抽出することができる多数の方法に気付くであろ
う０本発明の実施に推奨される精製法は１９８８年４月
１３日にフレラグらによって提出された審査中の出願人
、代理人事項番号３２３４２ＵＳに開示されている１本
発明の実施のためにそこに示された望ましい精製法は、
緩衝化したカオトロピック化合物の存在下で形質転換体
細胞を溶解させること、溶解によって得られた上清から
脂質および混在するタンパク質を沈澱させること、上清
を沢過すること、保持された物質をシリカで処理するこ
と、ｐＨが６〜８の範囲の緩衝液でシリカに吸着したＢ
型肝炎表面抗原から混在するタンパク質を洗い出すこと
、０．５〜８モルの尿素を含むｐＨ９，５〜１１の緩衝
化した溶出液でシリカから抗原を溶出させること、得ら
れた抗原を含む両分をゲル濾過にかけ、その後に抗原を
含む両分を陰イオン交、換クロマトグラフィーにかける
ことを含む。
に十分な遠心を行なうなどの標準的な方法を用いて、十
分な時間誘導を行なった形質転換体細胞を破壊して精製
されていない状態で回収される。本分野の通常の技術に
熟達した者は、上記の一般的な抽出法あるいはさらなる
精製法に代わる、単細胞宿主生物から均質でないタンパ
ク質を抽出することができる多数の方法に気付くであろ
う０本発明の実施に推奨される精製法は１９８８年４月
１３日にフレラグらによって提出された審査中の出願人
、代理人事項番号３２３４２ＵＳに開示されている１本
発明の実施のためにそこに示された望ましい精製法は、
緩衝化したカオトロピック化合物の存在下で形質転換体
細胞を溶解させること、溶解によって得られた上清から
脂質および混在するタンパク質を沈澱させること、上清
を沢過すること、保持された物質をシリカで処理するこ
と、ｐＨが６〜８の範囲の緩衝液でシリカに吸着したＢ
型肝炎表面抗原から混在するタンパク質を洗い出すこと
、０．５〜８モルの尿素を含むｐＨ９，５〜１１の緩衝
化した溶出液でシリカから抗原を溶出させること、得ら
れた抗原を含む両分をゲル濾過にかけ、その後に抗原を
含む両分を陰イオン交、換クロマトグラフィーにかける
ことを含む。
以下の実施例は本発明の実施をさらに例示するためのも
のであるが、制限を与えるものではない。
のであるが、制限を与えるものではない。
〈実施例）
に しｆ−ｆ
プラスミドｐＵｃ１８はベーリンガー・マンハイム社な
どから市販されている。
どから市販されている。
ピキア・パストリスＧＳ１１５（ｈｉｓ４） ＮＲＲＬ
Ｙ−１５８５１が本実施例で使用された宿主酵母株で
ある。
Ｙ−１５８５１が本実施例で使用された宿主酵母株で
ある。
培地
ＹＰＤ、１リツトル １０Ｆｌ 酵母抽出物
２０ｇ ペプトン ２０ｇ ブドウ糖 ＬＢ培地、１リツトル ５．０ｇ 酵母抽出物（デ
イフコ社）１０．０ｇ トリプトン（デイフコ社）５
．０ｇＮａＣＩ （実施例１） ベクターＴＢＯ４の プラスミド＾Ｈ６は第１図に示されたＨＢＶゲノムに由
来するものであり、ｐＢＲ３２２プラスミドが２６位の
Ｂａ障Ｈ１に挿入されている。
２０ｇ ペプトン ２０ｇ ブドウ糖 ＬＢ培地、１リツトル ５．０ｇ 酵母抽出物（デ
イフコ社）１０．０ｇ トリプトン（デイフコ社）５
．０ｇＮａＣＩ （実施例１） ベクターＴＢＯ４の プラスミド＾Ｈ６は第１図に示されたＨＢＶゲノムに由
来するものであり、ｐＢＲ３２２プラスミドが２６位の
Ｂａ障Ｈ１に挿入されている。
ベクターｐＴＢＯ４はＢ型肝炎表面抗原のｐｒｅＳ２型
２８１アミノ酸をコードする遺伝子を含む。該遺伝子は
３つの部分で構成された：すなわち、構造遺伝子のＣ末
端７５％、１３アミノ酸をコードするＮ末端リンカ−１
および残りの中央部である。ｐｒｅＳ２遺伝子、ａｄｉ
ａ血清型を含むプラスミド八Ｍ６はここで用いたｐｒｅ
Ｓｚ遺伝子のＣ末端部分および中央部の供給源となった
ものである。塩基配列はバレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕ
ｅｌａ ）他、ＩＣＮ−ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉａ
ｏｎ ＡｎｉｍａＶｉｒｕｓ にｅｎｅｔｉｃｓ、 ｐ
、 ５７−７０ （１９８０）に表されており、以下の
修飾を受けている： 元の塩基配列 ＾ＴＧ−ＣＡＣ−ＴＧＣニー＾＾Ｔ
−ＴＣＣ変異塩基配列 ＾ＴＧ−Ｃ八Ｇ−ＴへＧ−
＾＾Ｃ−ＴＣＣＡ、ｒｅＳのＣ− （全ての制限酵素はベーリンガーマンハイム社から入手
したものであり、販売元の指示に従って使用した。） Ｃ末端部分はＤｒａ Ｉで消化することによりプラスミ
ドΔＭ６から分離した。Ｄｒａ ｌは二カ所でＩＩＢＶ
ゲノムを切断し、その一つは表面抗原の最後のアミン酸
のコドンの位置である。その末端はウシ腸アルカリホス
ファターゼを用いて反応体積３０ｕ ＩＩで処理して脱
リン酸化した（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ ｐＨ９，０
，１ｍＭＭｇＣＩｚ １１００ｐ ＺｎＣｌ２．１ｗ＋
Ｍスペルミジン中、１υの酸素で３７℃、１時間）、完
全な消化産物をフェノール抽出し、エタノール沈澱を行
なった（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他）、シア
ノエチルホスホルアミダイト法でアプライド・バイオシ
ステムス・モデル３８０＾のＤＮＡ合成機によってオク
タマーのＳｔｕ ■リンカー（ＡＡＧＧＣＣＴＴ ）を
合成した。１１１ｇのＳｔｕ ■リンカーを蒸留水に溶
解した。 １ｏｎＨのアリコートを採り、７０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−Ｃ１、ｐＨ７，６，１０ａ＋Ｍ ＭｇＣｌ２．
５ｍＭジチオトレイトール、１ｔＭ＾ＴＰおよび１０ユ
ニツトのポリヌクレオチドキナーゼを含む５０．１の反
応溶液中で３７℃で３０分間処理してリン酸でラベルし
た。
２８１アミノ酸をコードする遺伝子を含む。該遺伝子は
３つの部分で構成された：すなわち、構造遺伝子のＣ末
端７５％、１３アミノ酸をコードするＮ末端リンカ−１
および残りの中央部である。ｐｒｅＳ２遺伝子、ａｄｉ
ａ血清型を含むプラスミド八Ｍ６はここで用いたｐｒｅ
Ｓｚ遺伝子のＣ末端部分および中央部の供給源となった
ものである。塩基配列はバレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕ
ｅｌａ ）他、ＩＣＮ−ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉａ
ｏｎ ＡｎｉｍａＶｉｒｕｓ にｅｎｅｔｉｃｓ、 ｐ
、 ５７−７０ （１９８０）に表されており、以下の
修飾を受けている： 元の塩基配列 ＾ＴＧ−ＣＡＣ−ＴＧＣニー＾＾Ｔ
−ＴＣＣ変異塩基配列 ＾ＴＧ−Ｃ八Ｇ−ＴへＧ−
＾＾Ｃ−ＴＣＣＡ、ｒｅＳのＣ− （全ての制限酵素はベーリンガーマンハイム社から入手
したものであり、販売元の指示に従って使用した。） Ｃ末端部分はＤｒａ Ｉで消化することによりプラスミ
ドΔＭ６から分離した。Ｄｒａ ｌは二カ所でＩＩＢＶ
ゲノムを切断し、その一つは表面抗原の最後のアミン酸
のコドンの位置である。その末端はウシ腸アルカリホス
ファターゼを用いて反応体積３０ｕ ＩＩで処理して脱
リン酸化した（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ ｐＨ９，０
，１ｍＭＭｇＣＩｚ １１００ｐ ＺｎＣｌ２．１ｗ＋
Ｍスペルミジン中、１υの酸素で３７℃、１時間）、完
全な消化産物をフェノール抽出し、エタノール沈澱を行
なった（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他）、シア
ノエチルホスホルアミダイト法でアプライド・バイオシ
ステムス・モデル３８０＾のＤＮＡ合成機によってオク
タマーのＳｔｕ ■リンカー（ＡＡＧＧＣＣＴＴ ）を
合成した。１１１ｇのＳｔｕ ■リンカーを蒸留水に溶
解した。 １ｏｎＨのアリコートを採り、７０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−Ｃ１、ｐＨ７，６，１０ａ＋Ｍ ＭｇＣｌ２．
５ｍＭジチオトレイトール、１ｔＭ＾ＴＰおよび１０ユ
ニツトのポリヌクレオチドキナーゼを含む５０．１の反
応溶液中で３７℃で３０分間処理してリン酸でラベルし
た。
リンカ−溶液を９０℃に加熱して酵素反応を停止させ、
ゆっくり室温まで冷却して二本鎖のＤＮＡ形成を行なわ
せた。該Ｓｔｕ ｌリンカ−を上述のＤｒａ Ｉ消化産
物に加えて、以下のようにＴ４リガーゼで連結させた０
反応は、６．６ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１、 ｐＨ７，６，
５＋Ｍ ＨｇＣｌ２．５働Ｈジチオトレイトール、１＋
＊ＨＡＴＰおよび１ワイスユニツトのＴ４リガーゼを含
む１０１Ｉ１１の反応液中で２３℃で１時間行なった。
ゆっくり室温まで冷却して二本鎖のＤＮＡ形成を行なわ
せた。該Ｓｔｕ ｌリンカ−を上述のＤｒａ Ｉ消化産
物に加えて、以下のようにＴ４リガーゼで連結させた０
反応は、６．６ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１、 ｐＨ７，６，
５＋Ｍ ＨｇＣｌ２．５働Ｈジチオトレイトール、１＋
＊ＨＡＴＰおよび１ワイスユニツトのＴ４リガーゼを含
む１０１Ｉ１１の反応液中で２３℃で１時間行なった。
連結反応はフェノール抽出で停止させ、続いてエタノー
ル沈澱を行なった。５ｔｕｌ制限酵素による消化を５０
１１以上の酸素を用いて一晩行い、Ｓｔｕ ｌリンカ−
のマルチマーを除いた。Ｄｒａｌ消化産物およびＳｔｕ
ｌリンカ−が結合したものはＤｒａ ｌ消化によって
除去された翻訳終止コドンを回復した。
ル沈澱を行なった。５ｔｕｌ制限酵素による消化を５０
１１以上の酸素を用いて一晩行い、Ｓｔｕ ｌリンカ−
のマルチマーを除いた。Ｄｒａｌ消化産物およびＳｔｕ
ｌリンカ−が結合したものはＤｒａ ｌ消化によって
除去された翻訳終止コドンを回復した。
Ｓｔｕ ｌリンカ−を付加したＤｒａ Ｉ断片をＸｂａ
ｌで消化し、約６００ｂｐの目的のＳｔｕ Ｉ ／Ｘ
ｂａ Ｉ断片を得た；これは０．８ｚ調整用アガロース
ゲルから分離した。
ｌで消化し、約６００ｂｐの目的のＳｔｕ Ｉ ／Ｘ
ｂａ Ｉ断片を得た；これは０．８ｚ調整用アガロース
ゲルから分離した。
この断片は該遺伝子のＣ末端７５１を含んでおり、ｘｂ
ａｌとＳｔｕ Ｉで消化して上述のように脱リン酸化し
たベクターｐＹＭ４（第２図）にクローニングした。
ａｌとＳｔｕ Ｉで消化して上述のように脱リン酸化し
たベクターｐＹＭ４（第２図）にクローニングした。
（ｐＹＭ４はプラスミドｐＹＭ３０をＣｌａ Ｉで消化
し、末端を再度連結させることによって得られる。 ｐ
ＹＭ３０は米国イリノイ州ベオリアの米国農務省北部リ
サーチセンターに受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９０と
して寄託されている大腸菌宿主から得られる。 ） ｐ
ＹＭ４の５゜７ｋｂ制限酵素消化断片は０．８ｚ調整用
アガロースゲルから分離した。ベクターはｐＹＭ４は単
に便利な制限酵素部位のために使用したものである。５
０ｎＨのベクターおよび５００ｎＨの挿入断片を５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。
し、末端を再度連結させることによって得られる。 ｐ
ＹＭ３０は米国イリノイ州ベオリアの米国農務省北部リ
サーチセンターに受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９０と
して寄託されている大腸菌宿主から得られる。 ） ｐ
ＹＭ４の５゜７ｋｂ制限酵素消化断片は０．８ｚ調整用
アガロースゲルから分離した。ベクターはｐＹＭ４は単
に便利な制限酵素部位のために使用したものである。５
０ｎＨのベクターおよび５００ｎＨの挿入断片を５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。
ｐｔ１７．４．１０ｎＭ ＭｇＣ１，、１０ｍＭジチオ
トレイトール、１ｍＭスペルミジン、ＩＩｌＩＭ＾ＴＰ
および１ワイスユニツトのＴ４リガーゼを含む１０ｐ１
の反応液中で２３℃で１時間連結させた。連結反応液を
直接、大腸菌ＭＣ１０６１コンピテント細胞の形質転換
に使用してアンピシリン耐性で選択した。大腸菌ＭＣ１
０６１株は受託番号ＮＲＲＬ−１８０１６としてイリノ
イ州ベオリアの米国農務省北部リサーチセンターから入
手可能である。
トレイトール、１ｍＭスペルミジン、ＩＩｌＩＭ＾ＴＰ
および１ワイスユニツトのＴ４リガーゼを含む１０ｐ１
の反応液中で２３℃で１時間連結させた。連結反応液を
直接、大腸菌ＭＣ１０６１コンピテント細胞の形質転換
に使用してアンピシリン耐性で選択した。大腸菌ＭＣ１
０６１株は受託番号ＮＲＲＬ−１８０１６としてイリノ
イ州ベオリアの米国農務省北部リサーチセンターから入
手可能である。
ＭＣ１０６１は以下の遺伝子型を有する： Ｆ（−）、
ａｒａ、 Ｄ１３９△（ＩａｃｌＰＯＺＹ） ｘ７４
ｇａｌｋ ｇａｌＵ ｈｓｒ ｈｓｍ（＋）ｒｐｓＬ
Δ（ａｒａＡＢＯＩｃ Ｉｅｕ） ７６９７゜ＭＣ１０
６１は以下のようにして形質転換に対してコンピテント
とした。
ａｒａ、 Ｄ１３９△（ＩａｃｌＰＯＺＹ） ｘ７４
ｇａｌｋ ｇａｌＵ ｈｓｒ ｈｓｍ（＋）ｒｐｓＬ
Δ（ａｒａＡＢＯＩｃ Ｉｅｕ） ７６９７゜ＭＣ１０
６１は以下のようにして形質転換に対してコンピテント
とした。
大腸菌ＭＣ１０６１の対数増殖中期の培養液（５０ｍｆ
）をデーモンＩＥＣＤＰＲ６００遠心機で４℃で５分間
３００Ｏｒｐｍで遠心して菌を回収し、１０１ＩＩＨの
ＮａＣｌで洗浄した。
）をデーモンＩＥＣＤＰＲ６００遠心機で４℃で５分間
３００Ｏｒｐｍで遠心して菌を回収し、１０１ＩＩＨの
ＮａＣｌで洗浄した。
培養液を２５−１の５Ｏｎ＋Ｍ ＣａＣｌ２に再懸濁し
、０℃で３０分分間−た。細胞を上述のように遠心し、
２ｎ＋ｌの５０ｗ１ ＣａＣ１ｔに再懸濁した。形質
転換には、１００ｐｌのコンピテント細胞を懸濁液に連
結反応液を加え、氷上でＯ℃１５分間靜置し装３７℃で
５分間ヒートショックをかけた後に２３℃で５分間イン
キュベートした。
、０℃で３０分分間−た。細胞を上述のように遠心し、
２ｎ＋ｌの５０ｗ１ ＣａＣ１ｔに再懸濁した。形質
転換には、１００ｐｌのコンピテント細胞を懸濁液に連
結反応液を加え、氷上でＯ℃１５分間靜置し装３７℃で
５分間ヒートショックをかけた後に２３℃で５分間イン
キュベートした。
細胞を直接５０１１１７ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒
天プレートにまいた。プレートを３７℃で１０〜１６時
間インキュベートした。得られたコロニーを回収し、制
限酵素による消化で解析した。細胞を５０１ｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むし培地５１中で５時間培養し、ＤＮＡ
をバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）とドリー（Ｄｏｌ
ｙ）、（Ｎｕｃｌｅｉｅ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ ７：１５１３ （１９７９） ）の方法で調製した
。ミニプレツブＤＮＡをＢａｗｌ ＩおよびＸｂａｌで
消化した。１．５ｋｂ Ｘｂａ Ｉ ／ＢａｍＨＩ断片
が得られた培養液を挿入断片を有するものと見なして、
一つの培養液について上述のように大量ＤＮＡ調製を行
い、さらに塩化セシウム−エチジウムブロマイド勾配で
バンディングさせて精製した。このクローンをｐＨ５１
と命名した。
天プレートにまいた。プレートを３７℃で１０〜１６時
間インキュベートした。得られたコロニーを回収し、制
限酵素による消化で解析した。細胞を５０１ｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むし培地５１中で５時間培養し、ＤＮＡ
をバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）とドリー（Ｄｏｌ
ｙ）、（Ｎｕｃｌｅｉｅ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ ７：１５１３ （１９７９） ）の方法で調製した
。ミニプレツブＤＮＡをＢａｗｌ ＩおよびＸｂａｌで
消化した。１．５ｋｂ Ｘｂａ Ｉ ／ＢａｍＨＩ断片
が得られた培養液を挿入断片を有するものと見なして、
一つの培養液について上述のように大量ＤＮＡ調製を行
い、さらに塩化セシウム−エチジウムブロマイド勾配で
バンディングさせて精製した。このクローンをｐＨ５１
と命名した。
プラスミドｐＨ５１をＳｔｕ ｌで消化し、上述のよう
に脱リン酸化し、フェノール 抽出、エタノール沈澱を
行なった。上述のように合成したＥｅｏＲｌリンカ−を
リン酸化し、自己アニーリングさせ、該平滑末端を有す
るＤＮＡと連結させた。過剰なリンカ−はＥｃｏＲＩで
一晩消化して除き、続いて該ＤＮＡをＸｂａ ｌで消化
してフェノール抽出およびエタノール沈澱を行なった。
に脱リン酸化し、フェノール 抽出、エタノール沈澱を
行なった。上述のように合成したＥｅｏＲｌリンカ−を
リン酸化し、自己アニーリングさせ、該平滑末端を有す
るＤＮＡと連結させた。過剰なリンカ−はＥｃｏＲＩで
一晩消化して除き、続いて該ＤＮＡをＸｂａ ｌで消化
してフェノール抽出およびエタノール沈澱を行なった。
目的の６００ｂｐ Ｘｂａ Ｉ −ＥｃｏＲＩ断片と
ベクターの５８２ｂｐ断片（Ｘｂａ Ｉ −ＥｃｏＲＩ
）を含むダブレットを１．Ｏ１調製用ゲル電気泳動に
よって分離した。これらの断片（５００ｎｇ ）を上述
のようにＸｂａ Ｉ −ＥｃｏＲＩで消化して脱リン酸
したｐＵｃ１８（５０ｎｇ ）に連結させ、上述のよう
にＭＣ１６０１の形質転換に用いてアンピリジン耐性に
関して選択した。
ベクターの５８２ｂｐ断片（Ｘｂａ Ｉ −ＥｃｏＲＩ
）を含むダブレットを１．Ｏ１調製用ゲル電気泳動に
よって分離した。これらの断片（５００ｎｇ ）を上述
のようにＸｂａ Ｉ −ＥｃｏＲＩで消化して脱リン酸
したｐＵｃ１８（５０ｎｇ ）に連結させ、上述のよう
にＭＣ１６０１の形質転換に用いてアンピリジン耐性に
関して選択した。
ミニプレツブＤＮＡを制限酵素で消化したものを、二つ
の断片のうちクローニングされた断片の決定に用いた。
の断片のうちクローニングされた断片の決定に用いた。
目的としない断片はＣ１ａ １部位を持ち、Ｃ１ａ Ｉ
／Ｘｂａ に１消化産物は約５６０ｂｐと２４００ｂ
ｐの断片を生じるが、正しい断片ではＣ１ａ Ｉ消化に
より直鎖状の３ｋｂの断片を与える。候補となったもの
はＥｃｏＲＩおよびＸｂａ Ｉで消化して６００ｂｐと
２４００ｂｐの断片が得られた。このようなりローンの
一つを大量に精製し、ｐＨ５２−Ｂと命名した。これは
完全なｐｒｅＳ２遺伝子のＣ末端領域の最後のコドンの
後にＥｃｏＲ１部位を有する。
／Ｘｂａ に１消化産物は約５６０ｂｐと２４００ｂ
ｐの断片を生じるが、正しい断片ではＣ１ａ Ｉ消化に
より直鎖状の３ｋｂの断片を与える。候補となったもの
はＥｃｏＲＩおよびＸｂａ Ｉで消化して６００ｂｐと
２４００ｂｐの断片が得られた。このようなりローンの
一つを大量に精製し、ｐＨ５２−Ｂと命名した。これは
完全なｐｒｅＳ２遺伝子のＣ末端領域の最後のコドンの
後にＥｃｏＲ１部位を有する。
Ｂ、「ｅＳ２遺 の
ｐｒｅＳｓ遺伝子の中央部は以下のようにしてクローニ
ングした。プラスミドΔＭ６をＸｂａ ｌおよびＢａｍ
）ＩＩで消化し、２５０ｂｐの断片を０．８ｚ調製用ア
ガロースゲルから分離した。この断片（５０ｎｇ ）を
上述のように、Ｘｂａ ＩとＢａｍＨＩで消化して脱リ
ン酸化した５Ｈのｐｔｌｃ１８に連結した。連結反応液
は上述のように大腸菌ＭＣ１０６１株の形質転換に使用
し、アンピシリン耐性で選択した。ミニプレツブＤＮＡ
をＢａｍ）ＩＩで消化し、２．７ｋｂの直鎖状断片を含
むものを選択した。そのようなものの一つを大量に培養
して上述のようにＤＮＡを調製、精製した。このクロー
ンをｐＰｓｌと命名した。該クローンをＥｃｏＲＩとＢ
ａｗｌ（Ｉで消化し、ベクターのバンドを０．８１ｍ製
用アガロースゲル電気泳動で分離し、精製した。このベ
クターに以下のリン酸化した二本鎖合成オリゴヌクレオ
チドを上述のように連結させた。
ングした。プラスミドΔＭ６をＸｂａ ｌおよびＢａｍ
）ＩＩで消化し、２５０ｂｐの断片を０．８ｚ調製用ア
ガロースゲルから分離した。この断片（５０ｎｇ ）を
上述のように、Ｘｂａ ＩとＢａｍＨＩで消化して脱リ
ン酸化した５Ｈのｐｔｌｃ１８に連結した。連結反応液
は上述のように大腸菌ＭＣ１０６１株の形質転換に使用
し、アンピシリン耐性で選択した。ミニプレツブＤＮＡ
をＢａｍ）ＩＩで消化し、２．７ｋｂの直鎖状断片を含
むものを選択した。そのようなものの一つを大量に培養
して上述のようにＤＮＡを調製、精製した。このクロー
ンをｐＰｓｌと命名した。該クローンをＥｃｏＲＩとＢ
ａｗｌ（Ｉで消化し、ベクターのバンドを０．８１ｍ製
用アガロースゲル電気泳動で分離し、精製した。このベ
クターに以下のリン酸化した二本鎖合成オリゴヌクレオ
チドを上述のように連結させた。
ＥｃｏＲｉ Ｐｓｔ Ｉ Ｂａｗｌ（１５′＾＾
ＴＴＣ＾＾ＴＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧ ３’３′ ＧＴＴ
ＡＧＧＣＡＧＡＣＧ丁ＣＣＴＡＧ ５’連結反応液は
大腸菌ＭＣＩＱ６１の形質転換に使用し、アンピシリン
耐性で選択した。ミニプレツブＤＮＡをＰｓｔ Ｉ消化
で解析した。 ２５０ｂｐのＰｓｔ ｌ断片を含むクロ
ーンの一つを選び、ＤＮ八へ量調製を行い、プラスミド
ｐＰｓ２を分離した。
ＴＴＣ＾＾ＴＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧ ３’３′ ＧＴＴ
ＡＧＧＣＡＧＡＣＧ丁ＣＣＴＡＧ ５’連結反応液は
大腸菌ＭＣＩＱ６１の形質転換に使用し、アンピシリン
耐性で選択した。ミニプレツブＤＮＡをＰｓｔ Ｉ消化
で解析した。 ２５０ｂｐのＰｓｔ ｌ断片を含むクロ
ーンの一つを選び、ＤＮ八へ量調製を行い、プラスミド
ｐＰｓ２を分離した。
Ｃ，ｒｅＳ２ のＮ
ＥｃｏＲｌリンカ−および最初の１３アミノ酸をコード
する配列を含むＮ末端領域を上述のように合成した以下
の配列からなる合成オリゴヌクレオチドから生成した： ＨｉｎｄｌＩＩ ＥｃｏＲＩ
Ｐｓｔ １５′ へＧＣＴＴＧ＾＾ＴＴＣＡ
ＴＧＣＡＧＴＧＧ＾＾ＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡ
ＣＣ＾へ＾ＣＴＣＴＧＣ＾ ３３′ ＾ＣＴＴ＾＾ＧＴ
ＡＣＧＴＣＡＣＣＴＴＣ：八Ｃ，ＧＴＧＡＣＧＧ＾＾（
：ＧＴＧＧＴＴＴＧＡＧ ５’この断片はＨｉｎｄｌ
およびＰｓｔ Ｉ末端を含み、＾ＴＧの前にＥｃｏＲ１
部位を持つ。ベクターに１０倍過剰のオリゴヌクレオチ
ドを連結させることによってこの配列を旧ｎｄｌ［［と
Ｐｓ口で消化して脱リン酸化したｐυＣ１８にクローニ
ングし、形質転換体を小さなＥｃｏＲ■部位の存在（７
５ｂｐ ） 、によって解析した。このようなりローン
をｐＴＢｏ−２八と命名した。
する配列を含むＮ末端領域を上述のように合成した以下
の配列からなる合成オリゴヌクレオチドから生成した： ＨｉｎｄｌＩＩ ＥｃｏＲＩ
Ｐｓｔ １５′ へＧＣＴＴＧ＾＾ＴＴＣＡ
ＴＧＣＡＧＴＧＧ＾＾ＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡ
ＣＣ＾へ＾ＣＴＣＴＧＣ＾ ３３′ ＾ＣＴＴ＾＾ＧＴ
ＡＣＧＴＣＡＣＣＴＴＣ：八Ｃ，ＧＴＧＡＣＧＧ＾＾（
：ＧＴＧＧＴＴＴＧＡＧ ５’この断片はＨｉｎｄｌ
およびＰｓｔ Ｉ末端を含み、＾ＴＧの前にＥｃｏＲ１
部位を持つ。ベクターに１０倍過剰のオリゴヌクレオチ
ドを連結させることによってこの配列を旧ｎｄｌ［［と
Ｐｓ口で消化して脱リン酸化したｐυＣ１８にクローニ
ングし、形質転換体を小さなＥｃｏＲ■部位の存在（７
５ｂｐ ） 、によって解析した。このようなりローン
をｐＴＢｏ−２八と命名した。
遺伝子の中央部はベクターｐＴＢＯ−２八をＰｓｔ ｌ
とｘｂａｌで消化することによって付加した；挿入断片
はｐＰｓ２由来２５０ｂｐ Ｐｓｔ Ｉ −Ｘｂａ
ｌ断片を用いた。形質転換体は３００ｂｐ以上のＥｃｏ
Ｒｌ断片および２９０ｂｐのＸｂａ Ｉ ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片の存在によって解析した。正しい挿入断片を
持つものをｐＴＢＯ−３と名付けた。完全なｐｒｅＳ、
遺伝子は、ｐＴＢｏ−３由来の旧ｎｄ ｍ ／Ｘｂａ
Ｉ ｉＦｉ片をＸｂａ Ｉ ／ＨｉｎｄＩ［［消化ｐＨ
ｓ２Ｂに挿入することによって得た。アンピシリン耐性
形質転換体は上述のように８２４ｂｐ ＥｃｏＲｌ断
片の存在によって解析した。
とｘｂａｌで消化することによって付加した；挿入断片
はｐＰｓ２由来２５０ｂｐ Ｐｓｔ Ｉ −Ｘｂａ
ｌ断片を用いた。形質転換体は３００ｂｐ以上のＥｃｏ
Ｒｌ断片および２９０ｂｐのＸｂａ Ｉ ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片の存在によって解析した。正しい挿入断片を
持つものをｐＴＢＯ−３と名付けた。完全なｐｒｅＳ、
遺伝子は、ｐＴＢｏ−３由来の旧ｎｄ ｍ ／Ｘｂａ
Ｉ ｉＦｉ片をＸｂａ Ｉ ／ＨｉｎｄＩ［［消化ｐＨ
ｓ２Ｂに挿入することによって得た。アンピシリン耐性
形質転換体は上述のように８２４ｂｐ ＥｃｏＲｌ断
片の存在によって解析した。
この構造を持つプラスミドをｐＴＢＯ４と命名した。
（実施例２）
ベ ターＴＢ０５＾の
ｐＡＯ８０４ベクターは、受託番号ＮＲＩ（ｌ、 Ｂ−
１８１１４として米国イリノイ州ペオリアの米国農務省
北部リサーチセンターから得られる大腸菌宿主から回収
される。 ｐＡＯ８０４はプラスミドＤＮＡを分離し、
ＥｃｏＲＩで消化、ゲル電気泳動で〜７．５ｋｂ断片を
分離することによって、唯一のＥｃｏＲ１部位で切断さ
れた直鎖状ｐ＾０８０４として回収される。ｐｒｅＳ２
をコードする遺伝子を含むベクターを、ベクターｐＡＯ
８０４およびｐＴＢＯ４（ｐＴＢＯ４は実施例１由来）
から横築した。２ｉｇのｐ＾０８０４を上述のようにＥ
ｃｏＲｆで消化し、３０ＩＪ＋の反応液中でアルカリホ
スファターゼで処理した（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ
ｐＨ９，０，ｌｅＭ ＭｇＣｌ２．１００１Ｊ８ Ｚｎ
Ｃ１，。
１８１１４として米国イリノイ州ペオリアの米国農務省
北部リサーチセンターから得られる大腸菌宿主から回収
される。 ｐＡＯ８０４はプラスミドＤＮＡを分離し、
ＥｃｏＲＩで消化、ゲル電気泳動で〜７．５ｋｂ断片を
分離することによって、唯一のＥｃｏＲ１部位で切断さ
れた直鎖状ｐ＾０８０４として回収される。ｐｒｅＳ２
をコードする遺伝子を含むベクターを、ベクターｐＡＯ
８０４およびｐＴＢＯ４（ｐＴＢＯ４は実施例１由来）
から横築した。２ｉｇのｐ＾０８０４を上述のようにＥ
ｃｏＲｆで消化し、３０ＩＪ＋の反応液中でアルカリホ
スファターゼで処理した（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ
ｐＨ９，０，ｌｅＭ ＭｇＣｌ２．１００１Ｊ８ Ｚｎ
Ｃ１，。
１ｍＭスペルミジン中ＩＵの酵素で３７℃、１時間）。
ｐＴＢＯ４はＥｃｏＲｌで消化し、ｐｒｅＳ２遺伝子を
コードする８２５ｂｐ断片を得た。この断片を０．８ｚ
アガロースを用いて調製用アガロースゲル電気泳動で精
製した。該断片５００ｎｇとｐ＾０８０４を５０ｎｇを
実施例１に示した方法で連結させた。得られたベクター
を実施例１で示した方法でＭＣ１０６１の形質転換に使
用しアンピシリン耐性で選択した。 ＤＮＡはバーンボ
イムとドリー（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ ７： １５１３）の方法で分離し、Ｐｓｔ
ｌ消化で解析した。２．１ｋｂのＰｓｔｌ断片を含むク
ローンが正しい向きで挿入断片を有するものであるとし
て、ｐＴＢ０５＾と命名した。
コードする８２５ｂｐ断片を得た。この断片を０．８ｚ
アガロースを用いて調製用アガロースゲル電気泳動で精
製した。該断片５００ｎｇとｐ＾０８０４を５０ｎｇを
実施例１に示した方法で連結させた。得られたベクター
を実施例１で示した方法でＭＣ１０６１の形質転換に使
用しアンピシリン耐性で選択した。 ＤＮＡはバーンボ
イムとドリー（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ ７： １５１３）の方法で分離し、Ｐｓｔ
ｌ消化で解析した。２．１ｋｂのＰｓｔｌ断片を含むク
ローンが正しい向きで挿入断片を有するものであるとし
て、ｐＴＢ０５＾と命名した。
（実施例３）
”？ルチコビー株ＧＳ１１５／ｐＴＢ０５＾ハｏ、８％
調製用アガロースゲルでｐＴＢ０５＾から５．９ｋｂ断
片を精製することによって生成した。１１０１Ｉの断片
を実施例１に示した条件下で一晩自己連結させた。連結
反応溶液のアリコートは０．６ｚアガロースゲル上で高
分子量物質の存在について確認した。これをフレラグら
、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：３７９−４８５
（１９８７）のスフェロプラスト形質転換方によってピ
キア・パストリスＧＳｌｌ５の形質転換に用いた。形質
転換体は最少培地上で再生させ、以下の方法で適当な変
異表現型に関して選択した。形質転換体は、滅菌蒸留水
の存在下でプレート表面を掻き取り、１５秒間低出力で
音波処理した。それを＾、。。・０．１に希釈し、炭素
源としてグリセロールを含む最少培地プレートに２枚ず
つ１０弓および１０−４の希釈でまき、３０℃で２〜３
日間インキュベートした０次にこれらを、気相として１
００ｕｌのメタノールを加えた最少培地プレート上にレ
プリカした。３０℃で２４時間インキュベートしたのち
、形質転換体の１０〜２０％はメタノール上でほかのも
のより増殖が遅くなっていることが明らかになった。増
殖が遅くなったコロニーを１０個選択してさらに解析を
行なった。これらはグリセロールを含む最少培地プレー
トからつついて実施例■に示すようにフラスコで振どう
培養を行ない、実施例８に示すような２２ｎｍ様粒子活
性についてアッセイした。活性が４倍上昇していた形質
転換体の一つをサザンプロット分析（マニアイス他）で
さらに解析した。マルチコピー形質転換体のＢｇｌｌｌ
消化断片をニトロセルロースにトランスファーし、ニッ
クトランスレーションを行なった凹特異的プローブｐＹ
Ｍ４ （ｐＹＭ４は実施例１参照）をプローブとした。
調製用アガロースゲルでｐＴＢ０５＾から５．９ｋｂ断
片を精製することによって生成した。１１０１Ｉの断片
を実施例１に示した条件下で一晩自己連結させた。連結
反応溶液のアリコートは０．６ｚアガロースゲル上で高
分子量物質の存在について確認した。これをフレラグら
、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：３７９−４８５
（１９８７）のスフェロプラスト形質転換方によってピ
キア・パストリスＧＳｌｌ５の形質転換に用いた。形質
転換体は最少培地上で再生させ、以下の方法で適当な変
異表現型に関して選択した。形質転換体は、滅菌蒸留水
の存在下でプレート表面を掻き取り、１５秒間低出力で
音波処理した。それを＾、。。・０．１に希釈し、炭素
源としてグリセロールを含む最少培地プレートに２枚ず
つ１０弓および１０−４の希釈でまき、３０℃で２〜３
日間インキュベートした０次にこれらを、気相として１
００ｕｌのメタノールを加えた最少培地プレート上にレ
プリカした。３０℃で２４時間インキュベートしたのち
、形質転換体の１０〜２０％はメタノール上でほかのも
のより増殖が遅くなっていることが明らかになった。増
殖が遅くなったコロニーを１０個選択してさらに解析を
行なった。これらはグリセロールを含む最少培地プレー
トからつついて実施例■に示すようにフラスコで振どう
培養を行ない、実施例８に示すような２２ｎｍ様粒子活
性についてアッセイした。活性が４倍上昇していた形質
転換体の一つをサザンプロット分析（マニアイス他）で
さらに解析した。マルチコピー形質転換体のＢｇｌｌｌ
消化断片をニトロセルロースにトランスファーし、ニッ
クトランスレーションを行なった凹特異的プローブｐＹ
Ｍ４ （ｐＹＭ４は実施例１参照）をプローブとした。
プロットにより二つのバンドが検出された。単一コピー
に比較したマルチコピー株の発現カセット由来のバンド
の強さの比はＨＩＳ４のゲノミックのバンドの強さで標
準化して、細胞あたり計４コピーとなった。
に比較したマルチコピー株の発現カセット由来のバンド
の強さの比はＨＩＳ４のゲノミックのバンドの強さで標
準化して、細胞あたり計４コピーとなった。
単一コピー株ＧＳ１１５／ｐＴＢ０５＾は断片の自己連
結反応を省いて同様に行なって生成された。
結反応を省いて同様に行なって生成された。
（実施例４）
、ＤＮＡミニプレツブ
１０４細胞／ ｍｌを５社のＹＰＤで３０℃で一晩培養
し、デー％ ７．ｌＥＣＤＰＲ６００臨床用遠心機テ３
００Ｏｒｐｍテ５分間遠心した。ベレットを０．５ｄの
１Ｍソルビトール、０．１ｍｆの０．５ＨＥＤＴ＾、ｐ
Ｈ７，５に再懸濁し、１．５ｍｌの微量遠心チューブに
試料を移した。０．０２ｄの２゜５ｎｇ／＠１ ザイ
モリエース６０，０００ （マイルス・ラボラドリース
）を加え、試料を３７℃で６０分間インキュベートした
。細胞を高速で１分間遠心して５０ｎ＋ＭＴｒｉｓ−Ｃ
１、 ｐＨ７，４および２０ｍＭ ＥＤＴ＾に再度懸
濁した。
し、デー％ ７．ｌＥＣＤＰＲ６００臨床用遠心機テ３
００Ｏｒｐｍテ５分間遠心した。ベレットを０．５ｄの
１Ｍソルビトール、０．１ｍｆの０．５ＨＥＤＴ＾、ｐ
Ｈ７，５に再懸濁し、１．５ｍｌの微量遠心チューブに
試料を移した。０．０２ｄの２゜５ｎｇ／＠１ ザイ
モリエース６０，０００ （マイルス・ラボラドリース
）を加え、試料を３７℃で６０分間インキュベートした
。細胞を高速で１分間遠心して５０ｎ＋ＭＴｒｉｓ−Ｃ
１、 ｐＨ７，４および２０ｍＭ ＥＤＴ＾に再度懸
濁した。
０．０５＠１（７）１０１ ＳＤＳを加え、試料を混合
し６５℃テ３０分間インキュベートした。 ０．２ａｉ
’の５Ｍ 酢酸カリウムを添加し、試料を氷上で６０
分間おいた。試料を再度高速で５分間遠心した。
し６５℃テ３０分間インキュベートした。 ０．２ａｉ
’の５Ｍ 酢酸カリウムを添加し、試料を氷上で６０
分間おいた。試料を再度高速で５分間遠心した。
上清を新しい１．５ｍｉ微量遠心チューブにうつし、室
温で等量のインプロパツールを加えた。試料を混合し、
室温で５分間静置し、つぎに高速で非常に短時間（１０
秒）遠心チューブ内で遠心した。上清を捨ててベレット
を風乾した。ベレットを０．３ｄの１０ｍＨＴｒｉｓ−
Ｃ１、ｐＨ７，４および１ ｍＭ ＥＤＴ＾に再懸濁し
、１５．１７の１ｍｇ／−の膵臓ＲＮａｓｅ溶液を添加
し、試料を３７℃で３０分間インキュベートした。 ０
．０３ｍｆの３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、試料を混合し
、０．２ｍｌのインプロパツールを加えた。試料を高速
で遠心してＤＮＡのベレット化を行なった。上清を捨て
、ベレットを乾燥させて０．１〜０．３ｍ１ｌの１０１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＣＩ。
温で等量のインプロパツールを加えた。試料を混合し、
室温で５分間静置し、つぎに高速で非常に短時間（１０
秒）遠心チューブ内で遠心した。上清を捨ててベレット
を風乾した。ベレットを０．３ｄの１０ｍＨＴｒｉｓ−
Ｃ１、ｐＨ７，４および１ ｍＭ ＥＤＴ＾に再懸濁し
、１５．１７の１ｍｇ／−の膵臓ＲＮａｓｅ溶液を添加
し、試料を３７℃で３０分間インキュベートした。 ０
．０３ｍｆの３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、試料を混合し
、０．２ｍｌのインプロパツールを加えた。試料を高速
で遠心してＤＮＡのベレット化を行なった。上清を捨て
、ベレットを乾燥させて０．１〜０．３ｍ１ｌの１０１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＣＩ。
ｐＨ７，４、および１ ｍ）４ ＥＤＴ＾に再懸濁した
。（注意：ＤＮＡを制限酵素反応に使用する前に、高速
で１５分間遠心して、消化を阻害するインヒビターの可
能性のある不溶性物質を除いた）。
。（注意：ＤＮＡを制限酵素反応に使用する前に、高速
で１５分間遠心して、消化を阻害するインヒビターの可
能性のある不溶性物質を除いた）。
（実施例５）
妖上づ一１ラメ≦すｌ叉１
発酵に先立ち、発現レベルを確実にするために全ての株
を以下のように振どうフラスコ内で培養した１通常、形
質転換体は、２〜５％グリセロールを含む０．６７％酵
母窒素ベースを植え、３０℃で一晩対数増殖後期まで培
養した。細胞を、デーモンＩＥＣＤＰＲ６００臨床用遠
心機を用いて３０００ｒｐ＋＊で５分間遠心して集菌し
た。ベレットを滅菌水で２回洗浄し、０．５＾ｓｏｏユ
ニツト／ ｍｌの濃度で１ｚメタノールを含む０．６＄
ＹＮＢに植えて、３０°Ｃで穏やかに振とうしなから４
〜６日間培養した。複数回、５０＾６００ユニツトのア
リコートを取り、−２０℃で保存した。
を以下のように振どうフラスコ内で培養した１通常、形
質転換体は、２〜５％グリセロールを含む０．６７％酵
母窒素ベースを植え、３０℃で一晩対数増殖後期まで培
養した。細胞を、デーモンＩＥＣＤＰＲ６００臨床用遠
心機を用いて３０００ｒｐ＋＊で５分間遠心して集菌し
た。ベレットを滅菌水で２回洗浄し、０．５＾ｓｏｏユ
ニツト／ ｍｌの濃度で１ｚメタノールを含む０．６＄
ＹＮＢに植えて、３０°Ｃで穏やかに振とうしなから４
〜６日間培養した。複数回、５０＾６００ユニツトのア
リコートを取り、−２０℃で保存した。
タンパク質をこれらのアリコー１−から調整し、ΔＵＳ
ＲＩ＾およびウェスタンプロット解析（それぞれ実施例
８および７参照）に使用した。細胞のアリコー）（１０
０＾６゜。ユニット）を１３ Ｘ １００ｍｍポロシリ
ケイト培養チューブに写し、２０倍量の溶解緩衝液（０
５８ＮａＣｌ、 ０．１１） リドンＸ−１００（Ｗ／
Ｖ） 、１Ｍ ７ フ化フェニルメチルスルフォニル、
および１０＋ｎｔ４リン酸ナトリウム、ｐＨ７，５）中
で、ツルバールモデルＲＣ−５８で４℃、１２，０００
ｒｐ＋ｍで遠心して２回洗浄した。
ＲＩ＾およびウェスタンプロット解析（それぞれ実施例
８および７参照）に使用した。細胞のアリコー）（１０
０＾６゜。ユニット）を１３ Ｘ １００ｍｍポロシリ
ケイト培養チューブに写し、２０倍量の溶解緩衝液（０
５８ＮａＣｌ、 ０．１１） リドンＸ−１００（Ｗ／
Ｖ） 、１Ｍ ７ フ化フェニルメチルスルフォニル、
および１０＋ｎｔ４リン酸ナトリウム、ｐＨ７，５）中
で、ツルバールモデルＲＣ−５８で４℃、１２，０００
ｒｐ＋ｍで遠心して２回洗浄した。
細胞試料を０．５ｇの酸で洗浄したグラスビーズ（０，
５ａｕｅ）および０．３５ａ＋１の溶解緩衝液で再懸濁
して、ポルテックスを用いて最大速度で１分間隔で８回
撹拌した。撹拌の間には少なくとも１分間混合液を氷上
で冷やした。（溶解が完全に終わった後、破砕した細胞
溶液を除き、グラスビーズを０３５ｎ＋ｆの溶解緩衝液
で洗い、二つの溶液を併せてツルバールＲＣ−５Ｂで４
℃、１３，０ＯＯｒｐ−で遠心して細胞残渣を除去した
。蛋白試料を次にオースリア（＾ＵＳＲＩ＾）およびウ
ェスタンプロット解析でアッセイした（表１）。蛋白濃
度はＴＣ＾沈澱沈澱−ローリで決定した。
５ａｕｅ）および０．３５ａ＋１の溶解緩衝液で再懸濁
して、ポルテックスを用いて最大速度で１分間隔で８回
撹拌した。撹拌の間には少なくとも１分間混合液を氷上
で冷やした。（溶解が完全に終わった後、破砕した細胞
溶液を除き、グラスビーズを０３５ｎ＋ｆの溶解緩衝液
で洗い、二つの溶液を併せてツルバールＲＣ−５Ｂで４
℃、１３，０ＯＯｒｐ−で遠心して細胞残渣を除去した
。蛋白試料を次にオースリア（＾ＵＳＲＩ＾）およびウ
ェスタンプロット解析でアッセイした（表１）。蛋白濃
度はＴＣ＾沈澱沈澱−ローリで決定した。
宍１ ｐｒｅＳ２発現解析
株 ％タンパク質
へ〇５ＲＩＡ”
％タンパク質
ウェスタン
１ 、 ＧＳ１１５／ｐＴＢ０５Ａ ０．
１１ｇ２ 、 ＧＳ１１５／ｐＴＢ０５＾（ＳＩＯ）
０．３１＄（実施例６） 免１見曵邂逝 発酵は以下のように行なった。フェルンバッハフラスコ
中の５００−の酵母窒素ベース（ＹＮＢ） ＋２１グリ
セロールに種培養液あるいは最少グルコースプレート培
地からの細胞を植えた。（プレートは検出される株の低
下なしに数カ月維持できる。）２００ｒｐ−で３０℃で
１０振とうした後、４８０ｇグリセロール、４０Ｂビチ
オン、および４０ｄ ）レース０．２３＄ ０．８３１ 塩溶液（表■）を含む７，５リツトルの最少培地（表■
）に植えた。ファーメンタ−はグリセロールが使いきら
れる（約２４時間）バッチモードで培養液を培養する間
、３０℃、 ｐＨ５，５を維持させた。ｐＨはＮＨ，ガ
スを加えることによって調節した。グリセロールの涸渇
はＣＯ□発生の急激な減少および溶解しまた酸素の急激
な上昇（あるいは酸素取り込み速度の減少）によって観
察された。メタノール添加は１８Ｊ／ｈｒからはじめて
ファーメンタ−のレベルを〜０．５＄ ＭｅＯＨまでに
し、このレベルに維持させた。
１１ｇ２ 、 ＧＳ１１５／ｐＴＢ０５＾（ＳＩＯ）
０．３１＄（実施例６） 免１見曵邂逝 発酵は以下のように行なった。フェルンバッハフラスコ
中の５００−の酵母窒素ベース（ＹＮＢ） ＋２１グリ
セロールに種培養液あるいは最少グルコースプレート培
地からの細胞を植えた。（プレートは検出される株の低
下なしに数カ月維持できる。）２００ｒｐ−で３０℃で
１０振とうした後、４８０ｇグリセロール、４０Ｂビチ
オン、および４０ｄ ）レース０．２３＄ ０．８３１ 塩溶液（表■）を含む７，５リツトルの最少培地（表■
）に植えた。ファーメンタ−はグリセロールが使いきら
れる（約２４時間）バッチモードで培養液を培養する間
、３０℃、 ｐＨ５，５を維持させた。ｐＨはＮＨ，ガ
スを加えることによって調節した。グリセロールの涸渇
はＣＯ□発生の急激な減少および溶解しまた酸素の急激
な上昇（あるいは酸素取り込み速度の減少）によって観
察された。メタノール添加は１８Ｊ／ｈｒからはじめて
ファーメンタ−のレベルを〜０．５＄ ＭｅＯＨまでに
し、このレベルに維持させた。
流動速度は実際のメタノール消費速度に基づいて合わせ
た。微量塩類の２０ｍ１アリコートを約２日おきにメタ
ノール消費速度を維持するために加えた。
た。微量塩類の２０ｍ１アリコートを約２日おきにメタ
ノール消費速度を維持するために加えた。
ＨＢｓＡｇのレベルはメタノールを与えて約３日間増加
した。
した。
表■
（７，５リツトル）
グリセオール
ビオチン
１１３ＰＯ，（８５＄）
ＣａＳＯ４・２Ｈ２０
Ｈ２ＳＯ。
Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０
ＯＨ
培地組成
８０ｇ
０ｍｇ
５．８ｇ
２ｇ
５ｇ
１ｇ
表１［［１１４１微量塩類溶液
硫酸第二銅・５Ｈ，ＯＯ，０６
ヨウ化カリウム ０．０８
硫酸マンガン・Ｈ２Ｏ０，３０
モリブデン酸ナトリウム ０．２０
ホウ酸 ０．０２
硫酸亜鉛・Ｈ，０２，００
塩化第二鉄・Ｈ２Ｏ４，８
硫酸 ５．ＯＯｄ／リットル表■
は実施例８で示したファーメンタ−で培養した株から調
整した抽出物の＾ＵＳＲＩ＾の結果を示している。
は実施例８で示したファーメンタ−で培養した株から調
整した抽出物の＾ＵＳＲＩ＾の結果を示している。
人Ｎ
株 ＾ＵＳＲＩ＾に ・ 翔 Ｌ
ＧＳＩ １５／ｐＴＢ０５＾ ９ＧＳ１
１５／ｐＴＢ０５＾（ＳＩＯ） ６０（実施例７
） ｒｅＳ の の と ： 実施例５で述べたようにピキア細胞を溶解して回収した
タンパク質についてウェスタンプロットを行なった（マ
ニアティス他）。用いた抗体はＨＢｓＡｇに特異的なも
ので、カル・バイオケムから入手したＬｏｔ＃ ７０２
１０６を１ ：１０００希釈で用いた。
ＧＳＩ １５／ｐＴＢ０５＾ ９ＧＳ１
１５／ｐＴＢ０５＾（ＳＩＯ） ６０（実施例７
） ｒｅＳ の の と ： 実施例５で述べたようにピキア細胞を溶解して回収した
タンパク質についてウェスタンプロットを行なった（マ
ニアティス他）。用いた抗体はＨＢｓＡｇに特異的なも
ので、カル・バイオケムから入手したＬｏｔ＃ ７０２
１０６を１ ：１０００希釈で用いた。
さらに、部分的に生成したタンパク質調製物のＳＤＳ／
ＰＡＧＥ解析および銀染色により、ｐｒｅＳ２ポリペプ
チド、ｐ３１の存在が示唆された。
ＰＡＧＥ解析および銀染色により、ｐｒｅＳ２ポリペプ
チド、ｐ３１の存在が示唆された。
（実施例８）
■鋒艮」遅韮
アボットへ〇ＳＲＩ＾アッセイキットをピキア産生系で
合成されたＨＢｓＡｇ量の測定に用いた。キットに含ま
れている抗体はＨＢｓＡｇ粒子に結合し、ＨＢｓＡｇモ
ノマーには結合しない。すべての希釈はリン酸緩衝化生
理食塩水、 ｐＨ７，４中、１．０＄ ＢＳ＾、０．
０２＄Ｎａアジドで行なった。以下で行なった方法は実
質的にキットの指示に示されたものである。標準曲線は
以下のように作成した。
合成されたＨＢｓＡｇ量の測定に用いた。キットに含ま
れている抗体はＨＢｓＡｇ粒子に結合し、ＨＢｓＡｇモ
ノマーには結合しない。すべての希釈はリン酸緩衝化生
理食塩水、 ｐＨ７，４中、１．０＄ ＢＳ＾、０．
０２＄Ｎａアジドで行なった。以下で行なった方法は実
質的にキットの指示に示されたものである。標準曲線は
以下のように作成した。
址カ
核■液 伍団篩拶竪梗２
ｎｏｎｅ ２００ ｂｕｆｆｅｒ ｏｎｌｙｔ
ｏｏ ｔｏ。
ｏｏ ｔｏ。
ｎｏｎｅ ２００
微量タイターデイツシュのウェルは次のようにラベルし
た。
た。
＾＾ Ｂｅ ＣＣ ＤＤ
ｌ １２３４ ５ １７ １８ １９
２０ など各ウェルにまずビーズを、次に緩衝液
加え、最後に標準（ポジティブコントロール）あるいは
希釈した試料を加えた．未知のものはシグナルが標準曲
線の範囲内になるように希釈した．試料濃度のｍｇ／ａ
ｌの見積は、典型的には用いた希釈を得るためには０．
０２で割った．通常１００， ｌの試料を１００１、１
１の緩衝液が入っているウェルに加えた．ウェルは蓋を
してトレイをベンチトップに対して軽くたたいた。試料
を一晩室温でインキュベートして最大の結合効率を得た
．翌朝各ウェルをアボット・ラプスのペンタウォッシュ
システムを用いて脱イオン水で４回洗浄した， ｚｏｏ
ｕ＋の１２５１ 坑−ＨＢｓを各ウェルに加え、トレ
イを軽くたたき、４５℃のウォーターバスで１時間イン
キュベートした．ビーズを上述のように洗浄して、カウ
ントした．未知試料の濃度は標準曲線がち決定した。
ｌ １２３４ ５ １７ １８ １９
２０ など各ウェルにまずビーズを、次に緩衝液
加え、最後に標準（ポジティブコントロール）あるいは
希釈した試料を加えた．未知のものはシグナルが標準曲
線の範囲内になるように希釈した．試料濃度のｍｇ／ａ
ｌの見積は、典型的には用いた希釈を得るためには０．
０２で割った．通常１００， ｌの試料を１００１、１
１の緩衝液が入っているウェルに加えた．ウェルは蓋を
してトレイをベンチトップに対して軽くたたいた。試料
を一晩室温でインキュベートして最大の結合効率を得た
．翌朝各ウェルをアボット・ラプスのペンタウォッシュ
システムを用いて脱イオン水で４回洗浄した， ｚｏｏ
ｕ＋の１２５１ 坑−ＨＢｓを各ウェルに加え、トレ
イを軽くたたき、４５℃のウォーターバスで１時間イン
キュベートした．ビーズを上述のように洗浄して、カウ
ントした．未知試料の濃度は標準曲線がち決定した。
第１図は、ｎａｖ血清型ａｄｗノｐｒｅＳ２遺伝子を含
ｔＪＨＢＹの模試図である。 第２図は、Ｂａｗ８ １部位に挿入されたピキア・パス
トリスＨＩＳ４遺伝子を含むｐＢＲ３２２由来プラスミ
ドであるｐＹＮ４の模試図である。 第３図はプラスミドｐＹＭ１０の模試図である。 第４図は時計回りにＢｇｌｌからＢｇｉまでの断片に直
鎖状部位特異的組み込みベクターを含むプラスミドｐＡ
Ｏ８０４の模試図である。
ｔＪＨＢＹの模試図である。 第２図は、Ｂａｗ８ １部位に挿入されたピキア・パス
トリスＨＩＳ４遺伝子を含むｐＢＲ３２２由来プラスミ
ドであるｐＹＮ４の模試図である。 第３図はプラスミドｐＹＭ１０の模試図である。 第４図は時計回りにＢｇｌｌからＢｇｉまでの断片に直
鎖状部位特異的組み込みベクターを含むプラスミドｐＡ
Ｏ８０４の模試図である。
Claims (22)
- （１）ａ）使用可能な様式で制御領域および３′終止配
列と連結したｐｒｅＳ＿２の構造遺伝子を含む少なくと
も一つの発現カセットを有する少なくとも一つのベクタ
ーでメチロトロフィック酵母を形質転換すること：およ
び、その後に ｂ）得られた形質転換体酵母株を該ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ
＿２タンパク質が産生される適当な条件下で培養するこ
とからなる抗原性ＨＢＶ粒子の産生法。 - （２）該ベクターがプラスミド、あるいは直鎖状部位特
異的組み込みベクターからなる群から選択される特許請
求の範囲第１項記載の方法。 - （３）該ベクターが直鎖状部位特異的組み込みベクター
である特許請求の範囲第２項記載の方法。 - （４）該直鎖状部位特異的組み込みベクターがａ）第一
の挿入可能ＤＮＡ断片、 ｂ）マーカー遺伝子、および、使用可能な様式で制御領
域および３′終止配列と連結したｐｒｅＳ＿２の構造遺
伝子含む少なくとも一つの発現カセット、および、 ｃ）第二の挿入可能ＤＮＡ断片、 を順に含み、要素ｂ）のマーカー遺伝子とカセットの順
番が交換可能である特許請求の範囲第３項記載の方法。 - （５）第一の挿入可能ＤＮＡ断片および第二の挿入可能
ＤＮＡ断片がピキア・パストリス（￥Ｐｉｃｈｉａｐａ
￥￥ｓｔｏｒｉｓ￥）から分離された遺伝子のＤＮＡ配
列由来であり、￥ＡＯＸ１￥、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥お
よび￥ＨＩＳ４￥からなる群から選択される特許請求の
範囲第４項記載の方法。 - （６）該発現カセットが ａ）ピキア・パストリスから分離された￥ＡＯＸ１￥、
ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥、サッカロミセス・セレビジエ（
￥Ｓａｃｃｈａ￥￥ｒｏｍｙｃｅｓ￥￥ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ￥）から分離された酸ホスファターゼ、ガラクト
シダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チトクローム
ｃ、α接合因子、およびグリセルアルデヒド３−リン酸
デヒドロゲナーゼからなる群から選択され、使用可能な
様式でｂ）に連結している制御領域、 ｂ）使用可能な様式でｃ）に連結しているｐｒｅＳ＿２
の構造遺伝子、 ｃ）￥ＡＯＸ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥
遺伝子、および￥ＨＩＳ４￥遺伝子から分離された３′
終止配列からなる群から選択されるピキア・パストリス
由来の３′終止配列 からなる、特許請求の範囲第４項記載の方法。 - （７）該マーカー遺伝子がピキア・パストリスから分離
された￥ＨＩＳ４￥および￥ＡＲＧ４￥、サッカロミセ
ス・セレビジエから分離された￥ＳＵＣ２￥、および￥
Ｔｎ９０３￥および￥Ｔｎ６０１￥のＣ４１８＾Ｒ遺伝
子からなる群から選択される特許請求の範囲第４項記載
の方法。 - （８）該ベクターが ａ）ピキア・パストリスから分離された約１キロベース
の￥ＡＯＸ１￥５′制御領域であり、使用可能な様式で
ｂ）に連結している第一の挿入可能ＤＮＡ断片、 ｂ）使用可能な様式でｃ）に連結しているｐｒｅＳ＿２
の構造遺伝子、 ｃ）ｄ）に連結している、ピキア・パストリスから分離
された￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、 ｄ）ｅ）に連結している、ピキア・パストリスから分離
された￥ＨＩＳ４￥であるマーカー遺伝子、 ｅ）約０．６５キロベースの３′￥ＡＯＸ１￥終止配列
である第二の挿入可能ＤＮＡ断片を含む特許請求の範囲
第４項記載の方法。 - （９）ａ）第一の挿入可能ＤＮＡ断片、 ｂ）マーカー遺伝子および、制御領域および３′終止配
列と使用可能な様式で連結しているｐｒｅＳ＿２の構造
遺伝子を含む少なくとも一つの発現カセット、および ｃ）第二の挿入可能ＤＮＡ断片 の要素で順に構成されており、要素ｂ）のマーカー遺伝
子とカセットの順序が交換可能である直鎖状部位特異的
組み込みベクター。 - （１０）該第一の挿入可能ＤＮＡ断片および同第二の挿
入可能ＤＮＡ断片がピキア・パストリスから分離された
遺伝子のＤＮＡ配列由来であり、￥ＡＯＸ１￥、ｐ４０
。 ￥ＤＨＡＳ￥、および￥ＨＩＳ４￥からなる群から選択
される特許請求の範囲第９項記載のベクター。 - （１１）該発現カセットが ａ）ピキア・パストリスから分離されたＡＯＸ１、ｐ４
０、ＤＨＡＳ、およびＨＩＳ４、サッカロミセス・セレ
ビジエから分離された酸フォスファターゼ、ガラクトシ
ダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チトクロームｃ
、α接合因子およびグリセルアルデヒド３リン酸デヒド
ロゲナーゼからなる群から選択され、ｂ）に使用可能な
様式で連結している制御領域 ｂ）使用可能な様式でｃ）に連結しているｐｒｅＳ＿２
の構造遺伝子 ｃ）ピキア・パストリスから分離された￥ＡＯＸ１￥遺
伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝子、および￥Ｈ
ＩＳ４￥遺伝子由来の３′終止配列からなる群から選択
される３′終止配列 からなる特許請求の範囲第９項または第１０項記載のベ
クター。 - （１２）該マーカー遺伝子がピキア・パストリスから分
離された￥ＨＩＳ４￥、￥ＡＲＧ４￥：サッカロミセス
・セレビジエから分離された￥ＳＵＣ２￥および細菌の
￥Ｔｎ９０３￥および￥Ｔｎ６０１￥のＧ１４８＾ｎか
らなる群から選択される特許請求の範囲第９項、第１０
項、第１１項記載のベクター。 - （１３）該ベクターが ａ）ピキア・パストリスから分離された使用可能な約１
キロベースの￥ＡＯＸ１￥遺伝子５′制御領域であり、
使用可能な様式でｂ）に連結している第一の挿入可能Ｄ
ＮＡ断片 ｂ）使用可能な様式でｃ）に連結しているｐｒｅＳ＿２
の構造遺伝子 ｃ）ｄ）に連結している、ピキア・パストリスから分離
された￥ＡＯＸ１￥遺伝子の３′終止配列ｄ）ｅ）に連
結している、ピキア・パストリスから分離された￥ＨＩ
Ｓ４￥遺伝子であるマーカー遺伝子ｅ）約０．６５キロ
ベースの￥ＡＯＸ１￥遺伝子３′終止配列である第二の
挿入可能ＤＮＡ断片 を含む特許請求の範囲第９項記載のベクター。 - （１４）使用可能な様式で３′終止配列に連結したｐｒ
ｅＳ＿２の構造遺伝子に使用可能な様式で連結している
制御領域からなる少なくとも一つの発現カセットを含む
少なくとも一つのベクターで形質転換したメチロトロフ
ィック酵母。 - （１５）該酵母がピキア・パストリスである特許請求の
範囲第１４項記載のメチロトロフィック酵母。 - （１６）該酵母がピキア・パストリスＧＳ１１５株であ
る特許請求の範囲第１４項記載のメチロトロフィック酵
母。 - （１７）ａ）第一の挿入可能ＤＮＡ断片、 ｂ）使用可能な様式でｃ）と連結しているマーカー遺伝
子およびｐｒｅＳ＿２の構造遺伝子を含む少なくとも一
つのピキア適合性発現カセット、 ｃ）ピキア・パストリスから分離された￥ＡＯＸ１￥遺
伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝子、および￥Ｈ
ＩＳ４￥遺伝子由来の３′終止配列からなる群から選択
された３′終止配列、 ｄ）第二の挿入可能ＤＮＡ断片 で順に構成され、要素ｂ）のマーカー遺伝子およびカセ
ットの順番が交換可能である少なくとも一つの直鎖状部
位特異的組み込みベクターで該ＧＳ１１５が形質転換さ
れている特許請求の範囲第１６項記載のピキア・パスト
リスＧＳ１１５株。 - （１８）該ベクターが ａ）ｂ）に使用可能な様式で連結している、ピキア・パ
ストリスから分離された約１キロベース￥ＡＯＸ１￥５
′制御領域である第一の挿入可能ＤＮＡ断片 ｂ）ｃ）に使用可能な様式で連結しているｐｒｅＳ＿２
の構造遺伝子 ｃ）ｄ）に連結しているピキア・パストリスから分離さ
れた￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列ｄ）ｅ）に連結してい
るピキア・パストリスから分離された￥ＨＩＳ４￥であ
るマーカー遺伝子ｅ）約０．６５キロベースの￥ＡＯＸ
１￥３′終止配列である第二の挿入可能ＤＮＡ断片 を含むものである特許請求の範囲第１７項記載の直鎖状
部位特異的組み込み可能ベクター。 - （１９）ピキア・パストリスＧＳ１１５／ｐＴＢ０５Ａ
。 - （２０）該ＧＳ１１５株が１コピー以上の該直鎖状部位
特異的組み込みベクターで形質転換されている特許請求
の範囲第１７項記載の形質転換されたピキア・パストリ
スＧＳ１１５株。 - （２１）ピキア・パストリスＧＳ１１５／ｐＴＢ０５Ａ
（Ｓ１０）。 - （２２）特許請求の範囲第１項記載の方法によって産生
された抗原性ＨＢＶ粒子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18642188A | 1988-04-25 | 1988-04-25 | |
| US186421 | 1988-04-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0284176A true JPH0284176A (ja) | 1990-03-26 |
Family
ID=22684891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1105729A Pending JPH0284176A (ja) | 1988-04-25 | 1989-04-25 | メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ｐｒｅＳ↓２タンパク質の発現 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0339567A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0284176A (ja) |
| KR (1) | KR890016175A (ja) |
| CN (1) | CN1040053A (ja) |
| AU (1) | AU605036B2 (ja) |
| DD (1) | DD283836A5 (ja) |
| DK (1) | DK196689A (ja) |
| FI (1) | FI891941A (ja) |
| HU (1) | HUT52556A (ja) |
| IL (1) | IL89991A0 (ja) |
| IN (1) | IN171656B (ja) |
| NO (1) | NO891687L (ja) |
| NZ (1) | NZ228774A (ja) |
| PL (1) | PL279105A1 (ja) |
| PT (1) | PT90359A (ja) |
| YU (1) | YU85589A (ja) |
| ZA (1) | ZA892886B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009113542A1 (ja) * | 2008-03-13 | 2009-09-17 | 国立大学法人 浜松医科大学 | ＨＢｓペプチド融合体 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341074C (en) | 1987-06-22 | 2000-08-08 | Hans A. Thoma | Hbv surface antigen particles, prepared by recombinant dna processes, composed of different epitopes, selected from the pre-s and s-peptides as a new vaccine |
| IL90161A0 (en) * | 1988-05-13 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of hepatitis b s and pres2 proteins in methylotrophic yeasts |
| US6197548B1 (en) * | 1990-04-02 | 2001-03-06 | Medeva Pharma Limited | Transformed Pichia expressing the pertactin antigen |
| CU22290A1 (es) * | 1990-10-08 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la obtencion de antigeno de superficie del virus de la hepatitis b de superior capacidad inmunoganica y su uso en un preparado vacunal |
| WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
| LT3988B (en) | 1992-02-17 | 1996-06-25 | Fermentas Biotech Inst | Recombinant plasmides pfs19, pfps2-48 and pjlfds1 codingsynthesis of human hepatite b of surfice virus antigenes, methods fof producing thereof |
Family Cites Families (6)
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|---|---|---|---|---|
| US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
| US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
| US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| AP56A (en) * | 1987-01-30 | 1989-09-26 | Smithkline Biologicals S A | Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigehs containing them. |
-
1989
- 1989-04-17 IL IL89991A patent/IL89991A0/xx unknown
- 1989-04-17 NZ NZ228774A patent/NZ228774A/xx unknown
- 1989-04-19 IN IN298/CAL/89A patent/IN171656B/en unknown
- 1989-04-19 ZA ZA892886A patent/ZA892886B/xx unknown
- 1989-04-21 AU AU33282/89A patent/AU605036B2/en not_active Ceased
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- 1989-04-24 YU YU85589A patent/YU85589A/sh unknown
- 1989-04-24 NO NO89891687A patent/NO891687L/no unknown
- 1989-04-24 FI FI891941A patent/FI891941A/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-04-24 PT PT90359A patent/PT90359A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-04-25 KR KR1019890005443A patent/KR890016175A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-04-25 CN CN89102660A patent/CN1040053A/zh active Pending
- 1989-04-25 HU HU891980A patent/HUT52556A/hu unknown
- 1989-04-25 DD DD89327953A patent/DD283836A5/de not_active IP Right Cessation
- 1989-04-25 JP JP1105729A patent/JPH0284176A/ja active Pending
- 1989-04-25 PL PL27910589A patent/PL279105A1/xx unknown
- 1989-04-25 EP EP89107457A patent/EP0339567A1/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009113542A1 (ja) * | 2008-03-13 | 2009-09-17 | 国立大学法人 浜松医科大学 | ＨＢｓペプチド融合体 |
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| FI891941A0 (fi) | 1989-04-24 |
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| AU3328289A (en) | 1989-11-02 |
| DK196689A (da) | 1989-10-26 |
| NZ228774A (en) | 1991-05-28 |
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