HUT52556A - Process for expressing hephatithis b pre s under two proteins in methilotrophe yeast - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás lényegében preS2 proteinből álló antigén-részecskék fokozott kifejezésére metilotróf élesztőkben, valamint eljárás uj DNS-molekulák, és az ezekkel transzformált uj élesztő-törzsek előállítására.

A He páti ts B vírus (HBV) mind akut, mind krónikus betegségek kórokozója, és világszerte közegészségügyi problémákat okoz. A HBV krónikus legyöngülést okozó infekció formájában jelentkezik, amely progressziven súlyosbodó májkárosodáshoz, elsődleges karcinomához és halálhoz vezet. Az esetek többségében a betegek teljesen felépülnek a HBV fertőzésből. Azonban a népesség jelentős része, amely HBV fertőzésen esett át, a betegség krónikus hordozójává válik, aki képes a betegséget másoknak átadni.

A rekombináns DNS-technika jelenlegi' fejlődése számos hasznos módszert eredményezett a HBV genetikus szerkezetének felderítésére, valamint lehetővé tette a HBV elleni vakcinák előállítását. A HBV genom jelenlegi tudásunk szerint egy 27 nm-es nukleokapszidba zárt, DNS-polimerázzal kovalensen kötött, kb. 3,2 kilobázispárból álló, részlegesen kettős szálú DNS-ből áll. A nukleokapszidot egy lipoprotein-burok veszi körül, amely celluláris lipidekből és hepatitisz B felületi antigénekből (HBsAg) áll; ezt virionnak nevezik, és átmérője 42 nm.

Az is ismert, hogy a vírus-burok három különböző, de egymáshoz hasonló felületi proteinből tevődik össze. Ezeket a proteineket általában S, preS2 és preS^ protein nek nevezik. Minden egyes virion 300 - 400 S protein molekulát és 40 - 80 preS₂ és preS^ protein molekulát tartalmaz .

Az S protein 226 aminosavból áll, és a normál virus-lipoprotein-burok fő komponense. Az S protein móltömege kb. 24 - 25 000, és P24 vagy P25-nek is szokták nevezni. Az S protein egy 27 - 28 000 móltömegü glükoproteinnel glükozilálva is lehet, ezt ismert módon GP27-nek vagy GP28-nak rövidítik.

A HBsAg második protein-komponense a preS₂ felületi antigén, amelyet középső HBsAg polipeptid nek is neveznek. A preS₂ protein 281 aminosavból áll, és az S protein N-terminális végéhez 55 aminosav hozzákapcsolásával képződik. A preS₂ protein móltömege kb. 31000, és P31 proteinnek is szokás nevezni. A preS₂ proteinnek is van két glükozilált formája, amelyek móltömege 33 000, és 36 000, ezeket GP33-nak, illetve GP36-nak nevezik. Feltételezik, hogy ez az antigén további antigén-választ kelt olyan egyedekben, akik az S-re nem, vagy csak gyengén válaszolnak.

A harmadik HBsAg protein a preS^ felületi antigén, amelyet késői HBsAg polipeptidnek is szokta nevezni. A preSj_ 389 - 400 aminosavból áll (a HBV antigén altípusától függően). A preS^-re egyedülállóan jellemző szekvencia 108 - 119 aminosavból áll, amely a teljes preS₂ protein N-terminálisához kapcsolódik. A preS-j protein kb. 43 000 móltömegü, és P43-nak is nevezik. A preS^-nek szintén van glükozilált formája, ez 46 000 móltömegü, és GP46 glükoproteinnek nevezik.

• · · ·

- 4 A HBV fertőzés során a teljes virális nukleokapszidok egy lipoprptein-burokbán vannak, 42 nm-es részecskéket képezve. A HBV fertőzés során üres, 22 nm-es részecskék is képződnek, amelyek főleg S és preS2 proteinből, és kevés preS-]_ proteinből állnak. Mig a teljes virális nukleokapszid fertőzőképes, a 22 nm-es üres részecskék nem fertőznek. Az üres részecskék azonban immunválaszt keltenek, amely elegendő az immunitás biztosításához, és igy a HBV elleni vakcinák előállítására használhatók.

A 22 nm-es részecskékkel előállított Hepatitis B vakcinákat először HBV-t hordozó emberek plazmájából állították elő. A humán plazmából származó 22 nm-es részecskéket azonban igen alaposan meg kell tisztítani, hogy eltávolítsák a fertőzőképes HBV-részecskéket, és a plazmában lévő egyéb patogéneket. Ezenkívül a Hepatitis B vakcina előállítását erősen korlátozza a humán plazma korlátozott mértékben való hozzáférhetősége.

Rekombináns DNS biotechnológia alkalmazásával lehetővé vált a 22 nm-es részecskékben lévő hepatitis S protein kifejezése transzformált emlős sejtvonalakban és élesztőben.

Az antigén tulajdonságú, és vakcinákban várhatóan hatásos preSg protein előállítása azonban rendkívül nehéznek bizonyult. Azt tapasztalták, hogy a preS2 protein rekombináns rendszerekben igen érzékeny a proteolizisre. A proteolizis eredményeként két kisebb protein-fragmentum keletkezik, amelyek nem rendelkeznek a pteS2 antigén tulajdontulajdonságával. Ezenkívül, a preS₂ proteint igen nehéz re • · · · • · · · ··· ·· · · · · ······ · · • · · · · · ·

- 5 kombináns rendszerekben kifejezni. A preS₂ kifejeződésének mértéke kb. 1/10-e az S protein szintjének, ugyanazon rekombináns rendszerben.

Ezért jelentős lépésnek öünik olyan eljárás kifejlesztése, amely lehetővé teszi a lényegében a HBV nem-glükozilált preS₂ proteinjéből álló antigén HBV részecskék előálli tását.

A találmány célja ennek megfelelően olyan eljárás kidolgozása volt, amellyel a lényegében HBV nem-glükozilált preS₂ proteinjéből álló, antigén tulajdonságú HBV részecskék nagyobb hozammal állíthatók elő.

A találmány további tárgya a preS₂ proteint kódoló DNS szekvenciákat tartalmazó uj vektorok előállítására szolgáló eljárás.

Ezenkívül a találmány tárgya a preS₂ proteint tartalmazó HBV részecskék fokozott kifejezésére képes vektorral vagy-vektorokkal transzformált uj, metilotróf élesztők előállítása.

A találmányt közelebbről az alábbiakban ismertetjük.

A találmány értelmében az antigén HBV részecskék fokozott képződését úgy érjük el, hogy egy metilotróf élesztőt legalább egy vektorral transzformálunk, amelyben van egy, a nreSg kifejeződéséhez szükséges szerkezeti gént tartalmazó, kompatibilis kazetta, és a kapott transzformást a HBV részecskék kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztjük.

- 6 Az 1. ábrán látható az adw szerotipusos HBV preS₂ génjét rartalmazó HBV szerkezete. Az AM6 plazmid az 1. ábrán látható HBV genom származéka, amelyben a 26-os helyzetben lévő BamHI helyen pBR322 plazmid van illesztve.

A 2. ábrán látható a pYM4 plazmid, egy pBR322ből származó plazmid, amely a BamHI helyen beillesztve tartalmazza a Pichia partoris HIS4 gént. A HIS4 gén a pYJ30-ban (NRR1 B-15890) van letétbe helyezve.

A 3. ábrán látható a pYMlO plazmid. A pYMIO a pYJ30 (NRRL B-15890) származéka, amelyben a 2959 helyzetben lévő BamHI hely működésképtelen. Az ábrán a zárójelek jelölik a tönkretett restrikciós helyet.

A 4. ábrán látható a pA0804 plazmid, amely a BglII-től BglII felé óramutató járásával egyező irányban lévő fragmentumban egy lineárisan beépített hely-specifikus vektort tartalmaz. A szerkezeti gént az ebben a plazmidban lévő egyetlen EcoRI helyre lehet beilleszteni.

ApreS₂ szerkezeti gén a szakirodalomból jól ismert, szekvenciáját Lo határozta meg /Characteristics of preS₂ Region of Hepatitis B Vírus, Biochem. Biophys. Rés. Comm. 135, 382 (1986. Sokan - például Lo és Velanzuela - klónozták ezt a szerkezeti gént, és expressziós rendszerekben ki is fejezték ÁSycthesis and Assembly in Yeast of Hepatitis B Surface Antigén Particles Oontaining Polyalbumin Receptor, Biotechnology 3, 317 (1985).7. A szerkezeti gén igy ezen a szakterületen dolgozóktól kapható, vagy szintetizálható, illetve újra izolálható. Megjegyezzük, hogy ····· ·· ···· • · · · ··· ·· ♦·· · ······ · · ··· · ·· ·

- 7 a találmány szerinti eljárás megvalósítására bármely preSp szerotipus használható.

A találmány szerinti eljárás kivitelezésére használt adw szerotipusu preS£ szerkezeti gént AM6 plazmádból kaptuk. Az AM6 plazmid az 1. ábrán látható HBV genomból származik, ahol a 26-os helyzetben lévő BamHI helyre egy pBR322 plazmid van illesztve. A preS2 szerkezeti gén nukleotid-szekvenciáját az 5. ábrán mutatjuk be. A találmány szerinti eljárásban használt plazmidok bármely megfelelő E. coli gazdasejtben - például MC1061-ben - tenyészthe tők.

Az AM6 plazmidból kinyerjük a preS2 szerkezeti gén két szakaszát, és az N-terminális vég első 13 aminosavját kódoló nukleotid-szekvenciát in vitro szintetizáljuk. A nukleotid-szekvenciát vagy kémiai, vagy enzimatikus utón szintetizálhatjuk, például a f oszf o-tri ész terek vagy foszfitok kémiáján alapuló eljárásokkal.

A preS2~t kódoló szerkezeti gén 75 %-át tartalmazó C-terminális kódoló régiót AM6 plazmidból állítjuk elő, a plazmid Dral-gyel való emésztésével. A. Dral-es emésztést kereskedelmi forgalomban lévő Dral endonukleázzal végezzük (minden felhasznált endonukleázt a gyártó cég előírásait követve használunk). A Dral fragmentumokat ezután fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk.

Ezután, szokásos DNS-szintézissel előállítjuk az oktamer Stul linkért (kötő-szekvenciát) (A.AGG-CCTT), és T4 ligázzal a Dral fragmentumokhoz kötjük, blunt end ligá• · · · · • · ·· • · · ·· ··· · ······ · · ··· · ·· ·

- 8 lássál. A ligálást fenolos extrakcióval állítjuk le, és utána etanolos kicsapást végzünk. A kapott fragmentumokat ezután Stul endonukleázzal emésztjük, az Stul multimerjeinek eltávolítása céljából.

A Stul-gyel összekötött fragmentumokat ezt követően Xbal-gyel emésztjük. A kapott Stul/Xbal fragmentumot - amely a preS2 szerkezeti gén C-terminálist kódoló régióját tartalmazza, és kb. 600 bázispárból áll - gél-elektroforézissel izoláljuk.

Ezt a 600 bázispárból álló fragmentumot ezt követően T4 ligázzal a 2. ábrán látható pYM4 plazmid Xbal/ Stul-gyel emésztett, 5,7 kilobázisból álló fragmentumával ligáljuk, amelyet agaróz gél-elektroforézissel izoláltunk.

A ligációs elegyet ezután közvetlenül használjuk megfelelő E.coli sejtek (MC1016) transzformálására, amelyeket ezt követően ampicillint tartalmazó tápközegben tenyésztünk. Kiválasztjuk a sikeresen transzformált telepeket, és a plazmid DNS-t Bimbóim és Boly /Nucleic Acid Researcb 7, 1513 (1979)7 módszere szerint extraháljuk.

Az extrahált plazmid DNS-t Stul-gyel emésztjük, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. EcoRI linkereket állítunk elő, és a Stul fragmentumokhoz kötjük T4 ligáz segítségével. A linker feleslegét EcoRI-gyel emésztve távoli tjük el. Az EcoRI-vel kötött fragmentumokat Xbalgyel tovább emésztjük, és elektroforézissel izoláljuk a preS2 szerkezeti gén C-terminális kódcló végét tartalmazó fragmentumokat-.

···· ·

- 9 Az Xbal-EccRI emésztéssel kapott fragmentumot Xbal-EcoRI-vel hasított pUC18-cal ligáljuk. A ligációs elegyet megfelelő E. coli sejtekbe (MC1061) transzformáljuk, és a sejteket ezután ampicillin jelenlétében tenyésztjük. A preS₂ szerkezeti gén C-terminális részét tartalmazó transzformált sejteket fragmentum emésztési analízissel szelektáljuk, Glal és Xbal segítségével. Az igy szelektált plazmidot pHS2-nek jelöljük.

A preS₂ gén középső szakaszát úgy állítjuk elő, hogy először az AM6 plazmidot Xbal-gyel és BamHI-gyel emésztjük. A kívánt 250 bázispárból álló fragmentumot gél-elektroforézissel izoláljuk. A 250 bázispárból álló Xbal-BamHI fragmentumot ezután Xbal-gyel és BamHI-gyel hasított pUC18hoz kötjük, amelyet E. coli MC1061 transzformálására használunk. Az ampicillin jelenlétében szaporodó tenyészetet a plazmid-DNS kinyerésével és BamHI-gyel való emésztésével analizáljuk. Úgy tekintjük, hogy azok a plazmidok, amelyek elektrofőretikus vizsgálat szerint tartalmaznak egy 2700 bázisból álló fragmentumot, tartalmazzák a kívánt 250 bázispárból álló fragmentumot is. A 250 bázispárból álló fragmentumot tartalmazó transzformált relepek egyikét izoláljuk, és nagy léptékben tenyésztjük. A plazmid-DNS-1 az EcoRIgyel és BamHI-gyel emésztett telepből izoláljuk és tisztítjuk. A vektor-sávot elektroforézissel izoláljuk. A vektort ezután az alábbi, kinázzal kezelt kettős szálú oligonukleotiddal kötjük össze;

···· ·

- 10 Ps ti BamHI

5’ AATTCAATCCGTCTGCAG 5’

3’GTTAGGCAGACGTCCTAG 5’

A ligációs reakcióeleggyel E. coli MC1061 sejteket transzformálunk, és a megfelelő beillesztett szekvenciát tartalmazó telepeket ampicillin-rezisztencia segítségével szelektáljuk. A plazmidot pPS2-nek jelöljük.

A preS2 N-terminális kódoló régióját mint szintetikus oligonukleotid ot állitjuk elő, amelynek szekvenciája: Hindui PstI

5’ AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3’

ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG 5’

Ezt a szekvenciát HindlII-mal és Pstl-gyel emésztett pUC18-ba klónozzuk. A kívánt transzformánsokat EcoRI-gyel végzett emésztés és elektroforézis után egy kb. 75 bázispárból álló fragmentum jelenléte jellemzi. A fenti eljárással kapott plazmidot pTB0-2A-nak jelöljük.

A gén középső részét a pTB0-2A vektor Pstl-gyel és Xbal-gyel végzett basitásával építjük be.,, a beillesztett szakasz a pPS2-ből származó, 250 bázispárt tartalmazó Pstl-Xbal fragmentum. A transzformált sejteket egy 300 bázispárnál hosszabb EcoRT fragmentum és a 290 bázispárból álló Xbal-HindlII fragmentum jelenléte jellemzi. A megfelelő izolált vektort pTB0-3-nak jelöljük.

A teljes preS2 gént úgy kapjuk, hogy a pTB0-3-ból származó HindlII/Xbal fragmentumot Xbal/HindIII-mal hasított ···· ♦ * · · · ··· ·· ··· · ♦····· · · ··· · ·· ·

- 11 pHS2B-be illetsz tjük. Az arapicillin-rezisz tens transzformánsokat a 825 bázispárból álló EcoRl fragmentum jelenléte jellemzi. Az igy kapott plazmidot pTBO4-nek jelöljük.

A fent említett E. coli törzseket bármely megfelelő tápközegben tenyészthetjük. Az E. coli tenyésztésének szokásos módszerei a szakirodalomból ismertek, és a fenti módszereknek a találmány szerinti eljárásban alkalmazott törzsek specifikus szükségleteihez való igazítása szakember számára kézenfekvő.

A plazroid-DNS E. coliból való kinyerése a kompakt szerkezet és a közel gömbalaku, szuperhélix forma következtében többféle módszerrel is lehetséges. Például a learatott gazdasejteket centrifugálással tömörithetjük, majd ujraszuszpendáljuk és lizáljuk. A lizátumból centrifugálással eltávolítjuk a sejttörmeléket, és a DNS-t tartalmazó felüluszót továbbtisztitjuk. A DNS szennyeződéseinek többséget fenolos extrahálással távolíthatjuk el. A fenollal extrahált DNS-t sürüség-gradiens centrifugálással vagy gélszüréssel továbbtisztitva elválasztjuk a bakteriális DNS-t a plazmid-DNS-tői. A szétválasztási eljárások a szakirodalomból jól ismertek, és számos mód ismeretes ezeknek az eljárásoknak a megvalósítására.

A plazmid nukleázos emésztését megfelelően megválasztott endonukleazokkal végezzük, amelyek a kiválasztott plazmidot úgy hasítják, hogy apreS₂ szerkezeti gén visszanyerése lehetővé váljon. Az end onukleázokat a plazmádtól függően választjuk meg, amelyből a pr'eS₂ gént ki akarjuk hasítani. Például az Αΐ«ΐ6 plazmádban léve preS₂ szerkezeti gént ··♦· • ··

- 12 egy Lral-HincII fragmentumból nyerhetjük ki.

A DNS gél-elektrof orézisét különféle módszerekkel végezhetjük /például P.G. Sealy és E.M. Southern,

Gél Electrophoresis of Nucleic Acids - A Practical Approach, szerkesztők: D. Rickwood és B.D. Hames, 39. oldal (1982)7.

Az eluálást is különféle, az adott géltől függően megválasztott módszerekkel hajthatjuk végre, például elektroelució.t, diffúziót, gél-oldást (agaróz gél), vagy fizikai kiszorítást (agaróz gél) alkalmazhatunk. Ezenkívül megjegyezzük, hogy bizonyos gélek - például jó minőségű, alacsony olvadáspontu agaróz - esetén nem szükséges eluálást alkalmazni .

A preS2 szerkezeti gént vagy annak fragmentumait tartalmazó fragmentum izolálása után további műveleteket kell végezni, mielőtt azt egy vektorba illesztenénk. A fenti műveletként például a fragmentumhoz linkereket vagy blunt end”-et (tompa véget) kapcsolhatunk.

A preSg szerkezeti gén izolálát követően a gént megfelelő metilotróf élesztő vektorba, például plazmidba illesztjük. A találmány szerinti eljárásban vektorként előnyösen a Picbia nemzetséggel, legelőnyösebben a Pichia pastorisszal összeférhető vektort használunk.

A plazmidok a rekombináns DNS technológiában régen alkalmazott alap-elemek egyikét képezik. A plazmidok mikroorganizmusokban előforduló cirkuláris, extrakromoszomális kettős szálú DNS-ek. A plazmidokból sejtenként egy vagy több példány található. A plazmid-DNS-ben megtalálható a plazmid reprodukálásához szükséges információ, azaz

a bakteriális replikációhoz szükséges replikációs kezdet.

A plazmidbán kódolt információ tartalmazhatja a plazmid fenotipusos szelektálásához szükséges egy vagy több kódot is a transzformált sejtben. A fenotipusos, vagy széLekciós markerek (jelzők), például antibiotikum-rezisztencia gén vagy gének - amelyek a gazdasejt biokémiai tulajdonságaiból teljesen hiányoznak - lehetővé teszik a transzformált gazdasejt-klónok felismerését, szelektálását és fenntartását.

Ahhoz, hogy a preS₂ szerkezeti gén metilotróf élesztőben kifejezhető legyen, a gént működésképesen kötni kell egy 5’-*regulátor szakaszhoz és egy 3’-terminációs szekvenciához, és az igy kapott expressziós kazettát illesztjük a gazdasqjtbe, vektor segítségével.

Az érthetőség kedvéért az alábbiakban definiáljuk a következő kifejezéseket.

Működésképesen kötött alatt olyan kapcsolódási helyzetet értünk, amelyben a komponensek konfigurációja lehetővé teszi azt, hogy funkciójukat ellássák.

Regulátor szakasz alatt olyan DNS-szekvenciát értünk, amely különféle ingerekre válaszolva meghatározza a mRNS transzkripciójának sebességét.

3terminációs szekvencia alatt a 3’-vég stop kod ónig tartó szekvenciáját értjük, amely stabilizálja a mRNS-t, ilyenek például a poliadenilezést kiváltó szekvenciák.

Pichiával kompatibilis (összeférhető) alatt olyan DNS-szekvenciákat értünk, amelyek Pichiában képesek normál ···♦ · 4« ···« « * · 4 ·«· · · ··« 4

444444 4 · ··· 4 *4 ·

- 14 funkciójuk ellátására, ilyenek például a Pichiából származó regulátor szakaszok és 3’-terminációs szekvenciák.

A találmány szerinti eljárásban előnyösen beépíthető vektorokat, például Cregg-féle hely-specifikus beépíthető vektort (86 114 700.7 számú európai szabadalmi leírás) használunk. A fenti vektorok egy fenti módon elrendezett szekvenciát tartalmaznak, amelyek legalább 1) egy első beilleszthető DNS-fragmentumból; 2) egy szelekciós marker génből; és 3) egy második beilleszthető DNS-fragmentumból állnak.

Az első és második beilleszthető DNS-fragmentumok legalább kb. 200 nukleotid hosszúságúak, és a Pichia nemzetségbe tartozó fajok genom DNS-ének részeivel homológ nukleotid-szekvenciákat tartalmaznak. A beépíthető vektor különböző komponensei úgy vannak egymás után elrendezve, hogy lineáris DNS-fragmentumot - azaz expressziós kazettát - képeznek, és a szelekciós marker gén az első beilleszthető DNS-fragmentűm 3’-vége és a második beilleszthető DNS-fragmentum 5’-vége között helyezkedik el. Az első és a második beilleszthető DNS-fragmentűm egymáshoz képest úgy vannak orientálva az egymás után elrendezett lineáris fragmentumban, ahogy a szülő genomban is orientálódnak.

Az első és második beilleszthető DNS-fragmentum nukleotid-szekvenciájaként olyan szekvenciák alkalmazhatók, amelyek a natív genom hely azon különböző szakaszaival homológok, ahol a genom módosításának végbe kell mennie. Ha például a genom módosítását az alkohol-oxídáz gén helyén kívánjuk végrehajtani, az első és második beilleszthető DNS-frag '* »··4 • 4 · _φ ··· · · 9·· · ·····# · , *♦· 4 «» *

- 15 meritumok az alkohol-oxidáz gén helyének különálló szakaszaival homológ szekvenciák lesznek. Ahhoz, hogy a találmány szerinti gén-mód ősitás létrejöjjön, a két beilleszthető DNS-fragmentumnak egymáshoz képest olyan orientációban kell lennie a lineáris fragmentumban, mint ahogy a szülő genomban vannak. Első és második beilleszthető DNS-fragmentumként például az alábbi nukleotid-szekvenciák alkalmazhatók; alkohol-oxidáz (A0X1) gén, dihidroxi-acetonszintetáz (DHAS1) gén, p40 gén és HIS4 gén. Az A0X1 gént, DHAS1 gént, p40 gént és HIS4 gént az A 183 071 számon közrebocsátott európai szabadalmi leírás ismerteti.

Az első beilleszthető DNS-fragmentűm egy működőképes regulátor szakaszt tartalmazhat, amely az expressziós kazettában felhasznált regulátor szakaszt foglalhatja magában. A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja szerint az első beilleszthető DMS-fragmentumot az expressziós ’kazetta regulátor szakaszaként alkalmazzuk. A 4. ábrán látható az első beiDészthető DNS-fragmentumOt a kazetta regulátor szakaszaként tartalmazó vektor diagrammja.

Amint az a 4. ábrán látható, az első beilleszthető DNS-fragmentűm 3*-végéhez közvetlenül illesztési hely Xragy helyek/és egy 3’-terminációs szekvencia helyezhető. A lineáris, hely-specifikus beépíthető vektornak ez a konformációja azzal az előnnyel jár, hogy a szerkezeti gén beillesztésére kész helyet biztosit, anélkül, hogy egy kompatibilis 3’-terminációs szekvenciát is be kellene építeni.

···· · * Μ···· •· · · ··· · · ···f :

- 16 A gazdasejt transzformálására használt DNS-be szükségszerűen legalább egy szelekciós marker gént is be kell építeni. Ez megkönnyíti azoknak a mikroorganizmusoknak a szelektálását és izolálását, amelyekbe beépült a transzformáló DNS. A marker gén olyan fenőtípusos tulajdonságot kölcsönöz a transzformált organizmusnak, amellyel a gazdasejt nem rendelkezik, például ha a transzformálatlan gazdasejtben egy specifikus aminosav bioszintézis-sorozatában valahol hiba van, helyreállítja a specifikus aminosavat termelő képességet, vagy bizonyos antibiotikummal szembeni rezisztenciát kölcsönöz, stb.

A szelekciós marker géneket például a Pichia pastoris és Saocharomyces cerevisiae mikroorganizmusokból származó HIS4 gén és ARG4 gén, a Saccbaromyces cerevisiaeből származó invertáz gén (SUC2) vagy az E. coli felcserélhető ΤηβΟΙ vagy Tn9O3 elemeiből származó G418 foszfotranszferáz gén közül választhatjuk.

Szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárásban használt vektorokba további DNS-szekvenciákat is beépíthetünk, például bakteriális plazmid-DNS-t, bakteriofág DNS-t, és hasonló szekvenciákat. Ezek a szekvenciák elősegítik ezeknek a vektoroknak a gazdasejtbe való bevitelét és az abban való fennmaradását.

Ha az első beilleszthető DNS-fragmentum nem tartalmaz regulátor szakaszt, a szerkezeti génhez működőképesen kötött, megfelelő regulátor szakaszt kell beépíteni, hogy működőképes expressziós kazettát kapjunk. Hasonlóképpen, ha a beillesztési helyen nincs 3*-terminációs szekven·· ···<» • •ν ·«· »··· · « · • ·· ·

- 17 cia az expressziós kazetta teljessé tételéhez, a beillesztendő szerkezeti génhez működőképesen egy 3’-terminációs szekvenciát is kell kötni.

A szakirodalomból számos regulátor szakasz ismeretes, amelyeket metilotróf élesztőkben alkalmazni lehet. A fenti regulátor szakaszokra példaként említhetjük az élesztő regulátor szakaszokat, amelyeket Saccharomyces cerevisiae-ből izolált savas foszfatáz, galaktokináz, alkohol dehidrogenáz, citokrom c, alfa-párosodási faktor és gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz regulátor szakasz; Pichia pastorisból származó primer alkohol-oxidáz (A0X1), dihidroxi-aceton szintetáz (DHAS1), p40 regulátor szakasz, HIS4 regulátor szakasz és hasonlók közül választhatunk. A találmány szerinti eljárásban regulátor szakaszként előnyösen metanol-tartalmú közegekre .reagálni képes regulátor szakaszokat használunk, ilyenek például az A0X1, DHAS1, p40 regulátor szakaszok, amelyek az A 183 071 számon közrebocsátott európai szabadalmi leírásból ismertek.

A találmány szerinti eljárás szempontjából legelőnyösebb regulátor szakasz az A0X1 regulátor szakasz.

A 3’-terminációs szekvenciát az expressziós kazettába beépíthetjük, vagy része lehet a vektornak, amint azt már említettük. A 3’-terminációs szekvencia feladata a szerkezeti gén által kódolt mRNS szintézisének befejezess, a mRNS poliadenilezése és/vagy stabilizálása, amikor egy génhez működőképesen kötődik. A 3’-terminációs sekvencia a találmány szerinti eljárásban például Saccharomyces cerevisiae-ből, Hansenula polymorpha-ból és Pichia-ból szár18

mazhat. Előnyösek a Picbia pastorisból származó 3’-terminációs szekvenciák, például az A0X1 gén, a DHAS1 gén, a p4O gén és HIS4 gén 3’-terminációs szekvenciái. Különösen előnyös az AOX1 gén 3’-terminációs szekvenciája.

A találmány szerinti eljárásban különösen előnyösen lineáris transzformációs vektorokat használunk, például a 4. ábrán látható konstrukció BglII fragmentumait.

A preS₂ szerkeze ti gént a megfelelő vektorokba bármely megfelelő eljárással beilleszthetjük, amellyel a választott vektor a megfelelő helyen Xragy helyeken/hasítható, és legalább e,gy működőképes kazettát eredményez, ami a vektorban jelenlévő preS₂ szerkezeti gént tartalmazza.

A preS₂ szerkezeti gén ligálását bármely arra alkalmas ligációs módszerrel végezhetjük, például T4 DNS-ligáz alkalmazásával.

A preS₂ szerkezeti gén és egy vektor ligációs elegyének kezdeti szelektálása, szaporítása és adott eseiben megsokszorozása előnyösen úgy történik, hogy az elegyet egy bakteriális gazdasejtbe, például E. coliba transzformáljuk. Az E. coli transzformálására alkalmas eljárások a szakirodalomból ismertek. Ezenkívül, a szelekciós markerek és a vektornak bakteriális gazdasejtben való fenntartásához szükséges bakteriális replikációs kezdetek is jól ismertek a szakirodalomból.

A preS₂ gént egy expressziós rendszerben tartalmazó kívánt plazmidok izolálását és/vagy tisztítását bármely, a plazmid-DNS-nek a gazdasejt DNS-étől való elválasztására alkalmas eljárással elvégezhetjük.

Hasonlóképpen, a kapcsolással kapott vektorokat előnyösen szaporítás után vizsgáljuk a preS₂ gén jelenléte és regulátor szakaszhoz, valamint 3terminációs szekvenciához való működőképes kötődése szempontjából. Ezt számos módszerrel végezhetjük, többek között endonukleázos emésztéssel, gél-elektrof orézissel vagy end onukleázos emésztéssel egybekötött Southern-hibridizációs eljárással.

A plazmidok vagy lineáris vektorok élesztő-gazdasejtekbe való transzformálását megfelelő transzformálási eljárásokkal, többek között Hinnen és munkatársai /proc. Natl. Acad. Sci. 75, 1929 (1978)/; Ito és munkatársai /J. Bacteriol. 153, 163 (1983_7; Cregg és munkatársai /Mól. Cell, Bioi. 5, 3376 (1985/7; ®^s Sreekrishna és munkatársai /Gene 59, 115 (1987)7 módszere szerint végezhetjük. Előnyösen Cregg-féle módszert használunk a találmány szerinti eljárás megvalósításakor. A találmány szerinti eljárás kivitelezése során előnyös, ha a lineáris vektort feleslegben alkalmazzuk, és a többszörös inzerteket Souther-hibridizációs technikával szelektáljuk.

A transzformálásra bármely megfelelő metilotróf élesztő alkalmazható élesztő-gazdasejtként. Metilotróf élesztő alatt többek között olyan élesztőt értünk, amely metanol jelenlétében képes szaporodni, ide tartoznak például a Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis és Rhodotorula nemzetségek. Az élesztők fenti osztályába tartozó specifikus fajokat például C. Anthony ismerteti /The Biocbemistry of Methylotrophs, 269 (1982//.

A találmány szerinti eljárásban előnyösek a Pichia nemzetségbe tartozó metilotróf élesztők, például az auxotróf Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851). A találmány szerinti eljárásban az auxotróf metilotróf élesztők is előnyösek, mivel azokat könnyű szelektálni. Megjegyezzük, hogy a vad tipusu metilotróf élesztő-törzsek is ugyanolyan eredményesen alkalmazhatók, ha megfelelő transzformációs marker gént választunk, például az SUC2 alkalmazásával a Pichia pastorist szacharózon szaporodni képes törzzsé transzformáljuk, vagy antibiotikum-rezisztencia markert - például G418 gént - használunk.

A transzformált metilotróf élesztősejteket megfelelő módszerek alkalmazásával szelektálhatjuk, például úgy, hogy a korábban auxotróf sejteket a transzformálást követően a sejt auxotrófiája következtében igényelt biokémiai termék távollétében tenyésztjük, uj fenotipus felismerésével szelektálunk (metbanol slow), vagy olyan antibiotikum jelenlétében tenyésztjük a transzformált sejtet, amely a transzformánsban lévő rezisztencia-gén hiányában toxikus a sejtre.

Az izolált transzformált metilotróf élesztő sejteket megfelelő fermentációs eljárásokat alkalmazva tenyésztjük, például rázott lombikban, nagy sűrűségű fermentálással vagy Cregg és munkatársai által ismertetett egyéb eljárásokkal /High-Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigén in the Me thylotrophic Yeast, Pichia Pastoris, Bio/Technology 5, 479 (1987)./.

Az expressziót az alkalmazott regulator szakasznak megfelelő eljárásokkal végezhetjük. Ha metanoltól függő regulátor szakaszt alkalmaztunk, az expresszió indukálását előnyösen úgy végezzük, hogy a transzformált sejteket megfelelő tápközegben a használt regulátor szakasznak megfelelő alkohollal kezeljük.

Az antigén—részecskékét nyers formában úgy nyerhetjük ki, hogy a megfelelő ideig indukált transzformált sejteket lizáljuk, megfelelő módszerekkel, például gyöngygyei őrölve, majd a sejttörmeléket centrifugálással eltávolítjuk. Szakemberek számos eljárást ismernek heterológ proteinek egysejtű gazdaszervezetekből való extrahálására, amellyel a fent említett, általánosan használt extrakciós eljárás vagy további ..tisztitási eljárás helyettesíthető.

A találmány szerinti eljárásban előnyös tisztítási műveletként a transzformált sejteket pufferolt bontóhatású vegyületek jelenlétében lizáljuk, a lipideket és szennyező proteineket a lizissel kapott felüluszóból kicsapjuk, a felüluszót diaszürjük, a visszatartott anyagot szilikagéllel kezeljük, a szilikagélen abszorbeált Hepatitis B felületi antigénből a szennyező proteineket pufferoldattal (pH 6-8) végzett mosással eltávolítjuk, az antigént a sziligakélről pH 9,5 - 11 értékű, 0,5 - 8 mól/1 karbamidot tartalmazó pufferrel eluáljuk, az igy kapott, antigént tartalmazó frakciókat gélszürjük, majd az antigént tartalmazó frakciókat anioncserélő kromatográfiás eljárásnak vetjük alá.

A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni, a korlátozás szándéka nélkül.

A Pichia pastoris GS115 (bis4) NRRL Y-15851 élesztőtörzset használjuk gazda-mikroorganizmusként. A felhasznált tápközegek összetétele a következő: YLP tápközeg: literenként 10 g élesztőkivonat g pepton g dextróz

LB tápközeg: literenként 5,0 g élesztőkivonat (Difco)

10,0 g tripton (Bifco)

5,0 g nátrium-klorid.

1. példa pTB04 vektor szerkesztése

Az AM6 plazmid az 1. ábrán látható HBV genom származéka, amelyben a pBR 322 plazmid a 26-os helyzetben a BamHI helyre van beillesztve.

A pTB04 vektor a Hepatitis B felületi antigénjét képező preS2 281 aminosavját kódoló gént tartalmaz. A gént bárom részből állítjuk össze: a szerkezeti gén 0-terminális részének 75 %-ából, egy 13 aminosavat kódoló N-terminális linkerből, és a maradék középső részből. A preSg gént tartalmazó AM6 plazmid (adw szerotipus) a forrása a használt preS2 gén C-terminális részének és középső részének. A szekvencia a Valenzuela és munkatársai által leírtnak felel meg ^ICN-UCLA Symposia on Animál Vírus Genetics, 57-70. oldal (1980)7, az alábbi eltéréssel:

• · · · • · · ♦ · ··· · ······ · · • · · · · · · természetes szekvencia ATG-CAG-TGG-AAT-TCC mutagén szekvencia ATG-CAG-TGG-AAC-TCC ·

A. A preS₂ C-terminális részének előállítása

A felhasznált restrikciós enzimek a Boehringer Mannheim termékei, és a gyártó előírásainak megfelelően alkalmazzuk azokat.

A C-terminális részt az AM6 plazmidból (1. ábra) izoláljuk, Dral-es emésztéssel, amely a HBV genomot két helyen hasítja, az egyik ezek közül a felületi antigén utolsó aminosavjának kod ónjánál van. A végeket borjubél lúgos foszfatázos kezeléssel defoszforilezzük 30 /ul-es reakciótérfogatban (1 E enzim, 37 °C-on, 1 órán keresztül, 50 mmól/1 Tris.HCl (pH 9,0), 1 mmól/1 MgCl₂, 100 yumól/1 ZnCl₂, 1 mmól/1 spermidin). A teljes emésztett terméket fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk (Maniatis és munkatársai mód szere),

DNS-szintetizátorral előállítjuk az oktamer Stul linkért (AAGGCCTT) (Applied Biosystems Model 380A), ciano-etil-foszforamidites eljárással. 1 yug Stul linkért desztillált vízben oldunk. Az oldatból 1 ng alikvotot kiveszünk, és foszfáttal jelezzük 50 yul végtérfogatban, amely 70 mmól/1 Tris.HCl-t (pH 7,6), 10 mmól/1 MgCl₂~t, 5 mmól/1 ditio-treitet, 1 mmól/1 ATP-t és 10 egység polinukleotid-kinázt tartalmaz, 37 °C-on, 30 percen keresztül. Az enzimreakció leállítására a linkért 90 °C-ra melegítjük, majd lassan szobahőmérsékletre hütve elősegítjük a kettős szálú DNS kialakulását.

• · · · ········ · ······ · · ··· · ·· ·

- 24 A fenti Pral-es emésztéssel kapott termékhez hozzáadjuk a Stul linkereket, és T4~gyel ligáljuk az alábbiak szerint. A 10 yul térfogatú reakcióelegy 6,6 mól/1 Tris.HCl-t (pH 7,6), 5 mmól/1 MgCl₂-ot, 5 mmól/1 ditio-treitet, 1 mmól/1 ATP-t és 1 Weiss-egység T4~ligázt tartalmaz, a reakcióhőmérséklet 23 °C, a reakcióidő 1 óra. A ligálást fenolos extrakcióval fejezzük be, majd etanolos kicsapást végzünk. Az Suul restrikciós emésztési terméket ezután egy éjszakán keresztül 50 egység enzimmel kezeljük, a Stul linker multimerek eltávolítása céljából. A Dral-es emésztés termékét és a Stul linkereket kombinálva helyreállítjuk a Dral-es emésztéssel eltávolított stop kodont.

A Stul-gyel összekötött Dral fragmentumokat Xbal-gyel emésztve kapjuk a kívánj kb. 600 bázispárt tartalmazó Stul/Xbal fragmentumot, amelyet 0,8 %-os preparativ agaróz gélből izolálunk. A fenti fragmentum tartalmazza a gén C-terminális részének 75 %-át, és ezt a fragmentumot Xbal-gyel és Stul-gyel emésztett és fentiek szerint defoszforilezett pYM4 vektorba klónozzuk (2. ábra), (a pYM4-et pYM30-ból állíthatjuk elő úgy, hogy a pYM30-at Clal-gyel emésztjük és a végeket újra összekapcsoljuk. A pYM30 a Northern Régiónál Research Center, United States Department of Agriculture, Peoria, Illionis törzsgyü jteményben NRRL B-15890 számon letétbe helyezett E. coli gazdasejtből hozzáférhe tő.)

A pYM 5,7 kilobázisból álló restrikciós fragmentumát 0,8 %-os agaróz gélből izoláljuk. A pYM4 vektort pusztán csak a megfelelő restrikciós helyei miatt alkalmaz • · · · zuk. 50 ng vektort és 500 ng beillesztendő fragmentumot 23 °C-on 1 órán keresztül ligálunk 10 /ul reakcióelegyben, amely 50 mmól/1 Tris-HCl-t (pH 7,4), 10 mmól/1 MgC^-ot, 10 mmól/1 ditio-tritet, 1 mmól/1 spermidint, 1 mmól/1 ATP-t és 1 Weiss-egység T4 ligázt tartalmaz. A ligációs elegyet közvetlenül használjuk a megfelelő MC1061 sejtek (E. coli) transzformálására, ampicillin-rezisztencia kialakítására. (Az E. coli MC1061 törzs szintén a Northern Régiónál . Research Center-bői szerezhető be, letéti száma NRRL-18016.) Az MC1061 genotípusa a következő: P(-), ara D139 delta (laclPOZY) X74 galk galU hsr hsm(+) rpsL delta (araABOIC leu) 7697. Az MC1061-et az alábbi kezeléssel tesszük transzformálhatóvá. 50 ml log-fázis közepén lévő E. coli MC1061 tenyészetet centrifugálással learatunk (Damon IEC DPR600 centrifuga, 3000 f ordulat/perc, 5 percj 4 °C), és 10 mól/1 koncentrációjú nátrium-kloriddal mossuk a sejteket. A sejteket 25 ml 50 mmól/1 koncentrációjú CaC^-oldatban 0 °C-on 30 percen keresztül ujraszuszpendáljuk, a fentiek szerint centrifugáljuk, és 2 ml 50 mmól/l-es CaC^ oldatban ujraszuszpendáljuk. A transzformálást úgy végezzük, hogy 100 yul igy kapott sejtszuszpenzióhoz hozzáadjuk a ligációs elegyet, és jégfürdőn, 0 °0-on 15 percen keresztül inkubáljuk, 37 °C-on 5 percen keresztül hő-sokkoljuk és 23 °C-on 5 percen keresztül inkubáljuk. A sejteket közvetlenül 50 /Ug/ml ampicillint tartalmazó LB-agar lemezre szélesztjük. A lemezeket 37 °C-on

10-16 órán keresztül inkubáljuk. A kapott telepeket learat-

juk és

; restrikciós endonukleázos emésztéssel jellemezzük. A sejteket 50 /Ug/ml ampicillint tartalmazó ír-

• ·· · ······ · · • · · · · · ·

- 26 -tápfolyadék 5 ml-ében 5 órán keresztül 37 °C-on tenyésztjük, és a DNS-t Birnboim és Boly /Nucleic Acid Research 7, 1513 (1979).7 módszerével kinyerjük. A DNS-preparátum okát BamHI-gyel és Xbal-gyel emésztjük. Az 1,5 kilobázis Xba/Bam fragmentumot eredményező tenyészeteket tekintjük úgy, hogy tartalmazzák a beillesztett DNS-t. Az ilyen temyészetek egyikét nagy térfogatban tenyésztjük és a DNS-t a fentiek szerint kinyerjük és tisztítjuk, majd cézium-klorid—etidium-bromid grádiensen szétválasztjuk. Az igy kapott kiónt pHSl-nek jelöljük.

A pHSl-et Stul-gyel emésztjük, a fentiek szerint defoszforilezzük, fenollal extrabáljuk és etanollal kicsapjuk. A fentiek szerint szintetizált EcoRI linkereket (GGAATTCC) foszforilezzük, magában hőkezeljük, és ehhez a tompavégű DNS-hez ligáljuk. A linkerek feleslegét egy éjszakán keresztül tartó EcoRI-gyel végzett emésztéssel eltávolítjuk és a DNS-t ezt követően Xbal-gyel emésztjük, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Egy, a kívánt 600 bázispárból álló Xbal-EcoRI fragmentumot tartalmazó kettős szálú DNS-t és egy 582 bázispárból álló vektor-fragmentumot (Xbal-EcoRI) izolálunk 1,0 %-os preparativ gél-elektroforézissel. A fenti fragmentumokból 500 ng-ot 50 ng Xbal-gyel és EcoRI-gyel emésztett és defoszforilezett pUC18-cal ligálunk a fentiek szerint, és ampicillin-rezisztencia kialakítására MClOőlsejtek transzformálására használjuk, a fentiek szerint.

A mikropreparativ DNS restrickciós emésztésével meghatározzuk, hogy a két fragmentum közül melyik klónozódott. A nemkívánatos fragmentum egy Ólai helyet tartalmaz, igy egy Clal/Xbal kettős emésztéssel kapott termékben két, kb. 560 és 2400 bázispárt tartalmazó fragmentum van, mig a helyes fragmentumból Clal-gyel végzett emésztéssel egy lineáris 3 kilobázist tartalmazó fragmentum keletkezik. A vizsgált transzforménsckból nyert -tenyészeteket EccRI-gyel és

Xbal-gyel emésztve 600 bázispárból + 2400 bázispárból álló fragmentumokat kapunk. Egy ilyen kiónt nagy léptékben tisztítunk és pHS2-B-nek jelöljük. Ez a klón egy EcoRI helyet tartalmaz a teljes preS2 gén C-terminális szakaszának utolsó kod ónja után.

B. A 'preS2 gén középső szakaszának előállítása

A preS2 gén középső szakaszát az alábbiak szerint klónozzuk.

Az AM6 plazmidot Xbal-gyel és BamHI-gyel emésztjük, és 0,8 %-os preparativ agaróz gélből izolálunk egy 250 bázispárból álló fragmentumot.

ng fenti fragmentumot 5 ng Xbal-gyel és BamHI-gyel emésztett és defoszforilezett pUC18-cal ligálunk, a fentiek szerint.

A ligációs eleggyel transzformáljuk az E. coli MC1061 törzset, és ampicillin-rezisztenciára szelektáljuk, a fentiek szerint.

A DNS-mikropreparátumokat BamHI-gyel emésztjük, és kiválasztjuk a 2,7 kilobázis lineáris fragmentumot tartalmazó telepeket. Egy fenti telepet nagy léptékben tenyésztünk, és a DNS-t a fentiek serint izoláljuk és tisztítjuk. Az igy nyert kiónt pPSl-nek jelöljük.

A fenti kiónt EcoRl-gyel és BamHI-gyel hasítjuk, « · · · * · ·« ··· · ···«·· · · • · · · · · ·

- 28 és a vektor-sávot 0,8 %-os preparativ agaróz gél-elektroforézissel izoláljuk és tisztítjuk. Az igy kapott vektorhoz kötjük a fentiek szerint szintetizált, kinázzal kezelt, kettős szálú alábbi oligonukleotidot;

EcoRI Esti BamHI

5’ AATTCAATCCGTCTGCAG 3’

3’ GTTAGGCAGACGTCCTAG 5’

A ligációs eleggyel E. coli MC1061 törzset transzformálunk, és kiválasztjuk az ampicillin-rezisztens telepeket. A DNS-mikropreparátumokat Pstl-es hasítással vizsgáljuk. Kiválasztunk egy kiónt, amely egy 250 bázispárból álló PstI fragmentumot tartalmaz, és nagy léptékben tenyésztjük, majd a DNS-t izoláljuk. Az igy nyert plazmidot pPS2-nek jelöljük.

C. Δ_2£θterminális szakaszának előállítása

Az EcoRI linkért és az első 13 aminosavat kódoló szekvenciát magában foglaló N-terminális szakaszt egy szintetikus oligonukleotidból állítjuk elő, amely a következő, fentiek szerint szintetizált szekvenciát tartalmazza: Hindin EcoRI PstI

5’ AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3’

3’ ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG 5’

Ez a fragmentum tartalmazza a HindlII és PstI végeket, valamint az ATG-t megelőzően egy EcoRI szekvenciát. Ezt a szekvenciát HindlII-mal és Pstl-gyel hasított és defoszforilezett pUC18 vektorba klónozzuk, oly módon, hogy a vektort 10-szeres oligonukleotid-feleslegge 1 ligáljuk, ···· « ·« » · · ··· · · ··· ·«···· · ··· · ·· • ··· *

majd a transzformánsokat a kis EcoRI hely (kb. 75 bázispár) jelenlétével jellemezzük. Az igy nyert kiónt pTB0-2A-nak jelöljük.

A gén középső szakaszának beépítésére a pTBO-2A vektort Pstl-gyel és Xbal-gyel hasítjuk; a beillesztett szakasz a PPS2 250 bázispárból álló Pst-Xba fragmentuma. A transzformánsokat a 300 bázispárnál nagyobb EcoRI fragmentum és a 290 bázispárból álló Xbal/HindlII fragmentum jelenléte jellemzi. A helyes szekvenciát tartalmazó vektort pTB0-3-nak jelöljük.

A teljes preS₂ gént úgy nyerjük, hogy a pTBO-3 HindlII/Xbal fragmentumát Xbal/HindlII-mal hasított pHS2B plazmidba illesztjük. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokat a fentiek szerint egy 825 bázispárból álló EcoRI fragmentum jelenléte jellemzi. Ezt a plazmidot pTB04-nek jelöljük.

II. példa

A pTB05A vektor előállítása

A pA0804 vektor egy E. coli gazdatörzsben van letétbe helyezve a Northern Régiónál Research Center· of the United States Department of Agricultűre-ben (Peoria, Illionis), NRR1 B-18114 számon. A pA0804-et úgy nyerjük ki, hogy a plazmid-DNS-t izoláljuk, EcoRI-gyel emésztjük, gél-elektroforézissel elválasztjuk a kb. 7,5 kilobázist tartalmazó fragmentumot, ami egy lineáris pA0804 szakasz, az egyetlen EcoRI helyén hasítva.

A preS₉-t kódoló gént tartalmazó vektort a • · ·

- 30 pA0804 és ρΤΒ04 vektorokból szerkesztjük meg (a pTB04 előállítását az I. példában ismertettük). 2/Ug pAO8O4-et a fentiek szerint EcoRI-gyel hasítunk, és 30 yul reakciótérfogatban lúgos foszfatázzal kezeljük (1 egység enzim, 37 °C, 1 óra, 50 mmól/1 Tris.HCl (pH 9,0), 1 mmól/1 MgC^, 100 yumól/1 ΖηΟ1£, 1 mmól/1 spermidin). A pTB04~et EcoRI-gyel hasítjuk, igy egy 825 bázispárt tartalmazó fragmentum válik szabaddá, amely a preS₂ gént kódolja. Ezt a fragmentumot 0,8 %-os agarózzal preparativ gél-elektroforézissel tisztítjuk. 500 ng fenti fragmentumot és 50 ng pA0804-et az I. példában ismertetett módon ligálunk. A kapott vektorral transzformáljuk az E. coli MC1061 törzset, az I. példában leírtak szerint, ampicillin-rezisztenssé. A DNS-t Birnboim és Doly /Nucleic Acids Research 7, 1513 (197917 módszere szerint izáláljuk, és Pstl-gyel hasítva jellemezzük. Az egy 2,1 kilobázis PstI fragmentumot tartalmazó klánban van a' beillesztett szekvencia helyes orientációban. Ezt a kiónt pTB05A-nak jelöljük.

III. példa

A több preSg példányt kifejező GS115/pTB05A(S10) jörzS-és.az egy példányt kifejező GS115/pTBO5A törzs előállítása

A több példányt kifejező GS115/pTB05A(S10) törzset az alábbiak szerint állítjuk elő. A pTB05A-ból származó 5,9 kilobázis BglII fragmentumot 0,8 %-os preparativ agaróz gélen tisztítjuk. A fragmentum 10 /Ug-ját egy éjszakán keresztül ön-ligáljuk, az I. példában ismertetett körűimé- 31 -

nyék között.A ligációs reakcióelegy alikvotjaiban kimutatjuk a nagy móltömegü anyag jelenlétet, 0,6 %-os agaróz gélen. Ezt használjuk Pichia pastoris GS115 transzformálására, Cregg és munkatársai szferoplaszt-transzformálási módszerét alkalmazva /Bio/Technology 5, 479 - 485 (1987)7· A transzformánsokat minimál-tápközegben regeneráljuk, és a megfelelő mutáns fenotipusra az alábbiak szerint vizsgál juk.

A transzformánsokat a lemez felületéről lekaparva,'steril desztillált viz alkalmazásával összegyűjtjük és alacsony teljesítménnyel 15 percen keresztül ultrahanggal kezeljük. Ezután a szuszpenziót Αθθθ = 0,1 értékre bigitjuk, -3 -4 és 10 és 10 higitásban szénforrásként glicerint tartalmazó minimál szilárd tápközegre szélesztjük, két párhuzamos mintát készítünk. A lemezeket 30 °C-on 2-3 napon keresztül inkubáljuk, majd minimál-lemezekre replikázzuk, amelyekhez gőzfázisban 100

metanolt adunk órás inkubálás után látszik, hogy a transzformánsok 10 - 20 %-a lassabban szapo rodik metanol jelenlétében, mint a többi transzformáns. A fenti lassan szaporodó telepek közül tizet további vizsgálatok céljára kiválasztunk.

A fenti transzformánsokat levesszük a glicerint tartalmazó minimál-lemezről, rázott tenyészetet készítünk az V. példában ismertetett módon, és 22 nm-es részecskeméret aktivitásra a VIII. példában leírtak szerint vizsgáljuk. Egy transzformánst, amely négyszeres aktivitás-növekedést mutat, Southern biot analízissel (Maniatis és munkatársai) továbbvizsgálunk. A több példányt kifejező transzformánst

- 32 BglII-vel hasítjuk, és a hasítási terméket ni tro-cellulózra visszük, és a szűrőt az úgynevezett nick-transzlatált HIS4 specifikus mintával, a pYM4-gyel hibridizáljuk (a pYM4-et az I. példában ismertetjük). A szűrőn két hibridizációs sáv található; egy. a genom HIS4 helyről és egy az expressziós vektorból. Az expressziós kazettákból származó sávok intenzitásának aránya a több példányt termelő törzsben az egyetlen példányhoz viszonyítva, amelyet a HIS4 genom-sáv intenzitása jelent, azt mutatja, hogy sejtenként összesen 4 példányt termelődött.

Az egyetlen példányt termelő GS115/pTBO5A törzset ugyanígy állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy elhagyjuk a fragmentum ön-ligálási reakcióját.

IV. példa élesztő DNS-mikropreparátum készítése

10⁴ sejt/ml tenyészetet 5 ml YPD tápközegben egy éjszakán keresztül 30 °C-on tenyésztünk, majd Damon IEC DPR600 klinikai centrifugával 3000 fordulat/perccel 5 percen keresztül centrifugáljuk. Az üledéket 0,5 ml 1 mól/1 koncentrációjú szorbitban, 0,1 ml 0,5 mól/1 koncentrációjú EDTA-ban (pH 7,5) ujraszuszpendáljuk, és a mintát 1,5 ml-es mikrofuga-csőbe visszük. Hozzáadunk 0,02 ml 2,5 mg/ml Zymolyase 60 OOO-et (Miles Laboratories), és a mintát 37 °C-on 60 percen keresztül inkubáljuk. A sejteket mikrofugában, nagy sebességű centrifugálással tömöritjük (1 perc), és 0,5 ml 50 mmól/1 koncentrációjú Tris.HCl-ben (pH 7,4) és 20 mmól/1 EDTA-ban ujraszuszpendáljuk. Hozzáadunk 0,05 ml 10 %-os SDS-t, a mintát keverjük, és 65 °C-on 30 percen keresztül inkubáljuk. Hozzáadunk 0,2 ml 5 mól/1 koncentrációjú kálium-acetatot, és a mintát jégfürdőn 60 percen keresztül inkubáljuk. A mintát mikrofugában nagy sebességgel 5 percen keresztül ujracentrifugáljuk.

A felüluszót tiszta 1,5 ml-es mikrofuga-csőbe visszük, és szobahőmérsékleten hozzáadunk 1 térfogat izopropanolt. A mintát keverjük, és szobahőmérsékleten 5 percen keresztül állni hagyjuk, majd röviden (10 másodpercen keresztül) nagy sebességgel mikrofugában centrifugáljuk. A felüluszót elöntjük és az üledéket levegőn szárítjuk. Az üledéket 0,3 ml 10 mmól/1 Tris.HCl-ben (pH 7,4) és 1 mmól/1 EDTA-ban ujraszuszpendáljuk, majd hozzáadunk 15 /U1 1 mg/ml koncentrációjú pankreász-RNáz oldatot, és a mintát 37 °C-on 30 percen keresztül inkubáljuk. Hozzáadunk 0,03 ml 3 mól/1 koncentrációjú nátrium-acetatot, a mintát összekeverjük, és hozzáadunk 0,2 ml izopropanolt. A mintát mikrofugában nagy sebességgel centrifugálva DNS-üledéket kapunk. A felüluszót elöntjük, az üledéket szárítjuk és 0,1 - 0,3 ml 10 mmól/1 Tris.HCl (pH 7,4) és 1 mmól/1 EDTA-ban ujraszuszpendáljuk. (Figyelem: A DNS-t a restrikciós emésztés előtt oldatban 15 percen keresztül nagy sebességgel mikrofugában centrifugálni kell, hogy eltávolitsunk minden olyan oldhatatlan anyagot, amely gátolhatja az emésztést.)

V. példa

Expresszió_vizsgá1ata_rázott_tenyészetben

A fermentálást megelőzően az összes törzset rá- 34 zott lombikban tenyésztjük, az alábbiak szerint, hogy megbecsüljük az expresszié szintjét. Rutinszerűen, a transzformánst 0,67 % élesztő nitrogénforrást tartalmazó alaptáptalajba oltjuk, amely 2 - 5 % glicerint tartalmaz, és egy éjszakán keresztül 30 °C-on tenyésztjük a logaritmikus fázis közepe - vége eléréséig. A sejteket ezután Damon IEC DPR600 klinikai centrifugával 3000 fordulat/perccel 5 percen keresztül centrifugálva összegyűjtjük. Az üledéket steril vízzel kétszer mossuk, majd 0,5 egység/ml sűrűséggel 1 % metanolt tartalmazó 0,67 %-os YNB táptalajba oltjuk, és enyhe rázással 30 °C-on 4-6 napon keresztül tenyésztjük. Különböző időpontokban 50 Αθθθ egységnyi alikvotokat veszünk a tenyészetből, és -20 °C-on tároljuk.

A fenti módon nyert alikvotokból protein-extraktumókát készítünk, amelyeket AUSRIA θ3 Western biot analízissel (VIII, illetve VII. péld?,) vizsgálunk.

Az alikvotnyi sejtet (100 Αθθθ egység) 13 x 100 mm-es boroszilikát kémcsövekbe visszük, és centrifugálást alkalmazva kétszer mossuk 20 térfogatnyi lizáló pufferrel /0,5 mól/1 NaCl, 0,lv% Triton X-100, 1 mól/1 fenil-metil-szulfonil-fluorid és 10 mmól/1 nátrium-foszfát (pH 7,51/, Sorvall Model RC-5B centrifugában 12000 fordulat/perccel 4 °C-on centrifugálva. A sejtmintákat 0,5 g savval mosott 0,5 mm-es üveggyönggyel és 0,35 ml lizáló pufferrel ujraszuszpend áljuk , és nyolcszor 1 percen keresztül vortex-keverőben maximális sebességgel keverjük. Az egyes keverési intervallumok között az elegyet jeges fürdőn legalább 1 percen keresztül hütjük. A lizis befejeztével a szétroncsolt

- 55 sejtek, oldatát eltávolítjuk, az üveggyöngyöket 0,55 ml lizáló pufferrel mossuk, és a két oldatot egyesítjük és Sorvall RC-5B centrifugával 15000 f ordulat/perccel 4 °C-on centrifugálva eltávolítjuk a sejt-törmeléket. A protein-mintát ezután AUSRIA és Western biot módszerrel analizáljuk (I. táblázat). A protein-koncentrációt Lowry módszerével határozzuk meg, trifluor-ecetsavas kicsapás után.

I. táblázat: preS£ kifejeződésének vizsgálata

Törzs	Protein % (AUSRIA™)	Protein % (Western biot)
GS115/pTBO5A	0,11	0,25
GS115/pTB05A(S10)	0,51	0,65

VI. példa

Expresszió vizsgálata fermentáció közben

A fermentálást az alábbiak szerint végezzük.

500 ml, 2 % glicerinnel kiegészített, élesztő nitrogénforrást tartalmazó táptalajt (YNB) Fernbach-lombikba helyezünk, és inokulum-tenyészettel vagy minimál glükóz szilárd tápközeges tenyészettel beoltjuk. (A lemezeket havonkénti átoltással tarthatjuk fenn, észrevehető sejtkárosodás nélkül.)

A tenyészetet 200 fordulat/perccel 50 °c-on 1 napon keresztül rázatjuk, az inokulumot 7,5 1 minimál-tápközegbe (II. táblázat) oltjuk, amely 480 mg glicerint, 40 mg • · «

- 56 biotint és 40 ml nyomelem-oldatot (III. táblázat) tartalmaz. A fermentálást 50 °-on, pH 5,5 értéken végezzük, szakaszos fermentálást alkalmazva, kb. 24 órán keresztül, a glicerin teljes felhasználásáig. A pH-t ammóniagáz beadagolásával szabályozzuk. A glicerin elfogyását a szén-dioxid-fejlődés éles csökkenése jelzi, és az oldott oxigén erős növekedése (vagy az oxigén-felvétel sebességének csökkenése). 18 ml/óra sebességgel elkezdjük a metanol betáplálását, amellyel a metanol-szintet kb. 0,5 %-ra állítjuk és a továbbiakban ezt a koncentrációt tartjuk. Az áramlási sebességet a pillanatnyi metanol-felhasználási sebesség alapján szabályozzuk.

A metanol-fogyasztás szintjének fenntartására kb. két naponta 20 ml nyomélem-sóoldatot adagolunk. A HBsAg szintje kb.

napon keresztül növekszik a metanol-bevezetés hatására.

II. táblázat: 7,5	1 tápközeg összetétele
Komponens	Mennyis	ég
glicerin	480	g
biotin	40	mg
H3PO4 (85 %-os)	154	ml
CaS04.2H20	5,8	g
h2so4	92	g
MgSO4.7H2O	75	g
KOH	21	g

III. táblázd: IM^_ nyomelem-sóoldat összetétele

Komponens	Mennyiség
réz(ll)-szulfát.5H2O	0,06 g/1
kálium- jód id	0,08 g/1
mangán—szulfát.2H20	0,30 g/1
nátrium-molibd át	0,20 g/1
bórsav	0,02 g/1
cink-szulfát.H2O	2,00 g/1
vas(lll)-klorid.H20	4,8 g/1
kénsav	5,00 ml/1

A fermentorban tenyésztett törzsekből készült extraktumok AUSRIA™-analizisének eredményeit (VIII. példa szerint) a IV. táblázat tartalmazza.

IV. táblázat

Törzs	Volumetriás hozam (mg/1) AU SRI A™ módszerrel
GS115/pTBO5A	9
GS115/pTB05A(S10)	60

···♦* ·· ···« • ♦ · · •♦· · · ··· · ······ » · • · · · · · ·

VII. __péld a

A preS£ ,~je le nlétének kimutatása és bizonyítás a

Az V. példa szerint lizált Pichia sejtekből nyert protein Wetern biot analízisét Maniatis és munkatársai módszerével végezzük. Az alkalmazott, HBsAg-re specifikus antitest a Cal Biochem terméke (tételszám: 702106), amelyet 1 : 1000 hígításban használunk.

Ezenkívül a preS£ polipeptid (p31) jelenlétét egy részlegesem tisztított protein-készítmény SDS/PAGE analízisével és ezüst-festésével is kimutattuk.

VIII. példa

AU SRI A~^_RIA módszer

A Pichia expressziós rendszerben szintetizált HBsAg mennyiségének meghatározására Abbott AUSRIA készletet használunk. A készletben lévő antitest a HBsAg-részecskékhez kötődik, nem a HBsAg-monomerekhez. Az összes hígítást 1,0 % BSA-t és 0,02 % nátrium-azidot tartalmazó, foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH 7,4) végezzük. A'vizsgálatot lényegében a készlethez mellékelt útmutatás szerint hajtjuk végre. A standard görbét az alábbiak szerint készítjük.

Cső	.száma	ng vizsgált	Puffer (/ul)	Pozitív	kontroll (yul)
1	- 4.	nincs RSB	-	200 <	:-sak puffer
5	- 6.	0,1	195	5
7	- 8.	0-2	190	10.
9	-10.	0,5	175	25
11	-12.	1,0	150	50
13	-14	2,0	100	100

• ·· • ··

- 39 15 - 16. 3,0 50 150

- 18. 4,0 nincs 200

	A t	nikroti trátor	lyukait az	alábbiak szerint
jelöljük.
	AA	BB	CC	DD
1	1	2	3	4
2	5	6	7	8
3	9	10	11	12
4	13	14	15	16
5	17	18	19	20 stb.

Először a. gyöngyöket tesszük minden egyes lyukba, azután a puffért, és végül a standardotXpozitiv kontrolit) vagy a hígított mintát Az ismeretleneket úgy hígítjuk, hogy a standard görbe tartományába eső értékeket kapjunk. A becsült mg/ml koncentráció-értékeket rendszerint 0,02-vel osztva kapjuk az alkalmazandó hígítást. Rendszerint 100 /ul mintát adunk a 100 /ul puffért tartalmazó lyukba. A lyukakat lefedjük és a tálcát finoman az asztal lapjához ütögetjük. A mintákat ezután egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk, a maximális kötődés elérésére. A következő reggel minden egyes lyukat négyszer ionmentes vízzel mosunk, az Abbott Labs gyártotta Pentawash system segítségével. Minden lyukba 200 /ul ^I-anti-HBs-τ merünk, a tálcát gyengén megütögetjük, majd 45 °C-os vízfürdőn 1 órán keresztül inkubáljuk. A gyöngyöket a fentiek szerint messék és mérjük a radioaktivitást. Az ismeretlen minta koncentrációját a

Claims (20)

1. Szabadalmi igénypontok < ' ¹ ' —

   1. Eljárás antigén HBV-részecskék fokozott kifejezésére, azzal jellemezve, hogy /a/ egy metilotróf élesztőt legalább egy vektorral transzformálunk, amelyben legalább egy expressziós kazetta van, amely a preS^ szerkezeti génjét tartalmazza működőképesen egy regulátor szakaszhoz és egy 3’-terminációs szakaszhoz kötve, majd /b/ a kapott transzformáns élesztőtörzset megfelelő körülmények között tenyésztve kifejezzük a HBsAg preS£ proteint .
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy vektorként plazmidot vagy lineáris, integrativ, hely-specifikus vektort használunk.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy vektorként lineáris, integrativ, hely-specifikus vektort használunk.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy lineáris, integrativ hely-specifikus vektorként olyan vektor használunk, amely sorrendben /a/ egy első beilleszthető DNS-fragmentumból, /b/ egy marker génből, és legalább egy, a preS^ szerkezeti gént egy regulátor szakaszhoz és egy 3’-terminációs sza * · · • ·· ·· ··· · ······ · · •·· · · · ·

   - 42 kaszhoz működőképesen kötve tartalmazó expressziós kazettából, és /c/ egy második beilleszthető DNS-fragmentumból áll, mimellett a /b/ komponensben a marker gén és a kazetta sorrendje felcserélhető.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy első beilleszthető DNS-fragmentumként és második beilleszthető DNS-fragmentumként egy Pichia pastorisból izolált, az A0X1, p40, DHAS és HIS4 gének egyikéből származó szekvenciát használunk.
6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy expressziós kazettaként olyan kazettát használunk, amely /a/ Pichia pastorisból izolált A0X1, p40, DHAS vagy HIS4; vagy Saccharomyces cerevisiae-ből izolált savas foszfatáz, galaktokináz, alkohol-dehidrogenáz, citokróm c, alfa-párosodási faktor vagy gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz regulátor szakaszból, az ahhoz működőképesen kötött /b/ preS₂~t kódoló szerkezeti génből, és az ahhoz működőképesen kötött /c/ Pichia pastorisból származó A0X1 génből, p40 génből,

   DHAS génből vagy HIS4 génből izolált 3’-terminációs szekvenciából áll.

   • · ♦ ♦
7. 7. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy marker génként Pichia pastorisból izolált HIS4 vagy ARG4 gént, Saccharomyces cerevisiaeből izolált SUC2 gént vagy a Tn903 vagy Tn601 G418^R génjét használjuk.
8. 8. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy vektorként olyan vektort használunk, amely tartalmaz /a/ egy első beilleszthető DNS—fragmentumot, ami a Pichia pastorisból izolált 5’ A0X1 regulátor szakasz kb. 1 kilobázisból álló része, működőképesen kötve /b/ a preS^-t kódoló szerkezeti génhez, amely működőképesen van kötve /c/ a Pichia pastorisból izolált A0X1 3’-terminációs szekvenciához, amely /d/ a Pichia pastorisból izolált HIS4 marker génhez van ligáivá, amely /e/ a 3’ A0X1 terminációs szekvenciájának kb. 0,65 kilobázist tartalmazó szakaszából álló második beilleszthető DNS-fragmentumhoz van ligáivá.
9. 9. Eljárás lineáris, integrativ, hely-specifikus vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy /a/ egy első beilleszthető DNS-fragmentumot, /b/ egy marker génből és legalább egy, a preS^ szerkezeti gént egy regulátor szakaszhoz és egy 3’-terminációs szakaszhoz működőképesen kötve tartalmazó expressziós • ··· ·

   -álkazettát, és /c/ egy második beilleszthető DNS-fragmentumot a megadott sorrendben egymáshoz kapcsolunk, mimellett a /b/ komponensben a marker gén és a kazetta sorrendje felcserélhető .
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy első beilleszthető DNS-fragmentumként és második beilleszthető DNS—fragmentumként egy Pichia pastorisból izolált, az A0X1, páO, DHAS és HISá gének egyikéből származó szekvenciát használunk.
11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, a:z z a 1 jellemezve , hogy expressziós kazettaként olyan kazettát használunk, amely /a/ Pichia pastorisból izolált A0X1, páO, DHAS vagy HISé;

    vagy Saccharomyces cerevisiae-ből izolált savas foszfatáz, galaktokináz, alkohol-dehidrogenáz, citokrom c, alfa-párosodási faktor vagy gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz regulátor szakaszból, az ahhoz működőképesen kötött /b/ preS^t kódoló szerkezeti génből, és az ahhoz működőképesen kötött /c/ Pichia pastorisból származó A0X1 génből, páO génből, DHAS génből vagy HISá génből izolált 3’-terminációs szekvenciából áll.
12. 12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy marker génként Pichia pastoris• · ·· · ·· *·4· • · · · * · · ·· · ·« · ····«· · · • · · · · 4 ·

    - 4 5 ból izolált HIS4 vagy ARG4 gént, Saccharomyces cerevisiaeből izolált SUC2 gént vagy a bakteriális Tn9O3 vagy TnóOl G148^ génjét használjuk.
13. 13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy /a/ Pichia pastorisból izolált 5’ A0X1 gén kb. 1 kilobázis hosszúságú, működőképes regulátor szakaszát mint első beilleszthető DNS-fragmentumot működőképesen kötjük /b/ a preS^-t kódoló szerkezeti génhez, amelyet működőképesen kötünk /c/ Pichia pastorisból izolált A0X1 gén 3’-terminációs szekvenciájához, amelyet /d/ Pichia pastorisból izolált HIS4 génhez, mint marker génhez ligálunk, amelyet /e/ a 3’ A0X1 terminációs szekvencia kb. 0,65 kilobázis hosszúságú szakaszát képező szekvenciához, mint második beillesztett DNS-fragmentumhoz ligálunk.
14. 14. Eljárás antigén HBV-részecskék termelésére képes metilotróf élesztőtörzsek előállítására, azzal jellemezve , hogy a metilotróf élesztőtörzset legalább egy vektorral transzformáljuk, amely vektor legalább egy expresszióskazettát tartalmaz, amely egy regulátor szakaszból, az ahhoz működőképesen kötött, preS₂~t kódoló szerkezeti génből, és az ahhoz működőképesen kötött 3’-terminációs szekvenciából áll.

    ···· · •· ···· ··· · · ··· · »····· · · • · · · ·· ·

    - 46 •
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy metilotróf élesztőtörzsként Pichia pastorist használunk.
16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy metilotróf élesztőtörzsként Pichia pastoris GS115 törzset használunk.
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a Pichia pastoris GS115 törzset legalább egy lineáris, integrativ, hely-specifikus vektorral transzformáljuk, amely sorrendben /a/ egy első beilleszthető DNS-fragmentumból, /b/ egy marker génből, és legalább egy, Pichiával összeférhető, a preS₂~t kódoló szerkezeti gént tartalmazó expressáós kazettából, az ahhoz működőképesen kötött /c/ Pichia pastorisból származó A0X1 génből, p40 génből, DHAS génből vagy HIS4 génből izolált 3’-terminációs szekvenciából, és /d/ egy második beilleszthető DNS-fragmentumból áll, mimellett a /b/ komponensben a marker gén és a kazetta sorrendje felcserélhető.
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a lineáris, integrativ, hely-specifikus vektorként olyan vektort használunk, amely /a/ első beilleszthető DNS-fragmentumként Pichia pastorisból izolált 5’ A0X1 gén kb. 1 kilobázis hosszúságú regulátor szakaszából, az ahhoz működőképesen kötött ·· ···· • · • ·« · • · · ·« · ··· ··«·

    - 47 /b/ preS₂~t kódoló szerkezeti génből, az ahhoz működőképesen kötött /c/ Pichia pastorisból izolált A0X1 3terminációs szekvenciájából, az ahhoz ligáit /d/ Pichia pastorisból izolált HIS4 marker génből és az ahhoz ligáit /e/ a 3’ A0X1 terminális szekvencia kb. 0,65 kilobázis hoszszuságu szakaszát képező szekvenciából, mint második beillesztett DNS-fragmentumból áll.
19. 19. A 17. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris

    GS115/pTB05A előállítására, azzal jellemezv e , hogy a Pichia pastoris GS115 törzset egy példány lineáris, integratív, hely-specifikus vektorral transzformáljuk.
20. 20. A 17. igénypont szerinti eljárás Pichia pastoris

    GS115/pTB05A/S10/ előállítására, azzal jellemezve , hogy a Pichia pastoris GS115 törzset több, mint egy példány lineáris, integratív, hely-specifikus vektorral transzformáljuk.