DD285373A5

DD285373A5 - Verfahren zur bildung von antigenen hbv-teilchen

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Publication number: DD285373A5
Application number: DD89328581A
Authority: DD
Inventors: Gregory P Thill
Original assignee: ��@��@��k��
Priority date: 1988-05-13
Filing date: 1989-05-12
Publication date: 1990-12-12
Also published as: FI107265B; ATE151109T1; GR3023985T3; IN171696B; MX26715A; NO891921L; FI19992546A; EP0341746A3; PL161997B1; NZ228948A; DK235289A; NO891921D0; PL279426A1; EP0341746B1; CN1038668A; AU618596B2; FI892312A0; IL90161A0; US5650296A; JP2614314B2

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Bildung von antigenen HBV-Teilchen, die im wesentlichen aus Hepatitis B-S- und preS2-Protein bestehen, beschrieben. Das Verfahren umfasst folgende Stufen: a) Transformieren einer methylotrophen Hefe mit mindestens einer Expressionskassette, die ein strukturelles Gen für S enthält, das operativ mit einem regulatorischen Bereich und einer 3`-Terminationssequenz verknüpft ist, und mindestens einer Expressionskassette, die ein strukturelles Gen für preS2 enthält, das operativ mit einem regulatorischen Bereich und einer 3'-Terminationssequenz verknüpft ist, und anschließend b) Züchten des erhaltenen transformierten Hefestammes unter geeigneten Bedingungen zur Bildung des HBsAg-preS2-Proteins. Ferner werden neue DNA-Moleküle und mit diesen Molekülen transformierte Wirte beschrieben.{HBV-Teilchen; preS2-Protein; Transformation; methylotrophe Hefe; Vektor; Espressionskassette; Terminationssequenz}

Description

Hierzu 10 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technik

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Hepatitis B-Virus (HBV) verursacht sowohl akute als lauch chronische Erkrankungen und stellt weltweit ein Problem der öffentlichen Gesundheitspflege dar. HSV macht sich als eine chronisch schwächende Infektion bemerkbar, die nach und nach zu schweren Leberschäden, primären Karzinomen und zum Tod führen kann. In der Mehrzahl der Fälle erholen sich die Patienten vollständig von HBV. Jedoch werden erhebliche Anteile der mit HBV infizierten Bevölkerungskreise zu chronischen Trägern der Krankheit mit der Gefahr einer Übertragung auf andere.

Jüngste Fortschritte in der rekombinanten DNA-Technik haben zu wertvollen Methoden zur Aufklärung der genetischen Struktur von HBV sowie zur Bereitstellung von Mitteln zur Herstellung von Impfstoffen gegen HBV geführt. Man weiß nunmehr, daß das HBV-Genom aus annähernd 3,2kb-Paaren von partiell doppelsträngiger DNA mit einer kovalent gebundenen DNA-Polymerase, in einem 27nm-Nucleocapsid eingeschlossen, besteht. Das Nucl6ocapsid ist von einer Lipoproteinhülle umgeben, die aus zellulären Lipiden und Hepatitis B-Oberflächenantigenen (HBsAg) besteht. Dieses Gebilde wird als das Virion bezeichnet und weist einen Durchmesser von 42nm auf.

Es wurde auch festgestellt, daß die virale Hülle aus drei unterschiedlichen, aber verwandten Oberflächenproteinen besteht. Diese Proteine werden im allgemeinen als S-, preS₂- und preS,-Proteine bezeichnet. Jedes Virion umfaßt 300 bis 400 S-Proteinmoleküle und 40 bis 80 preS₂- und preSi-Proteinmoleküle.

Das S-Protein besteht aus 226 Aminosäuren und stellt die Hauptkomponente der normalen viralen Lipoproteinhülle dar. Das S-Protein weist etwa 24 bis 25 Kilodalton IkDa) auf und kann als P24 oder P25 bezeichnet werden. Das S-Protein kann auch zu einem 27-28 Kilodalton-Glykoprotein glykosyliert sein, das als GP27 oder GP28 bezeichnet wird.

Beim zweiten HBsAg-Protein handelt es sich um das preS₂-Oberflächenantigen, das auch als mittleres HBsAg-Polypeptid bezeichnet wird. PreS₂ besteht aus 281 Aminosäuren, die durch Addition von 65 Aminosäuren an das N-Ende des S-Proteins gebildet werden. Das preS₂-Protein weisi etwa 31 Kilodalton auf und kann als P31-Protein bezeichnet werden. Das preS₂-Protein besitzt.ebenfalls zwei glykosylierte Formen von 33 und 36 Kilodalton, die als GP33 bzw. GP36 bezeichnet werden. Es wird angenommen, daß dieses Antigen eine zusätzliche antigene Reaktion bei Personen, die gegenüber S nicht oder nur schwach reagieren, hervorruft.

Beim dritten HBsAg-Protein handelt es sich um das preSt-Oberflächenantigen, das auch als spätes HBsAg-Polypeptid bezeichnet wird. PreSi besteht aus 389-400 Aminosäuren (je nach dem antigenen Untertyp von HBV). Die für preSi besondere Sequenz besteht aus 108-119 Aminosäuren, die an das N-Ende des vollständigen preS₂-Proteins addiert sind. Das preS,-Protein weist etwa 43 Kilodalton auf und kann als P43-Protein bezeichnet werden. PreSi existiert ebenfalls i>; einer glykosylierten Form mit 46 Kilodalton, die als GP46-Glykoprotein bezeichnet werden kann.

Im Verlauf einer HBV-Infoktion werden vollständige virale Nucleocapside mit einer Lipoproteinhiille eingewickelt, wodurch 42 nm-Teilchen gebildet werden. Während der HBV-Infektion werden auch leere 22 nm-Teilchen gebildet, die vorwiegend aus den S- und pieS₂-Proteinen bestehen und auch einige preS,-Proteine enthalten. Während das vollständige virale Nucleocapsid infektiös ist, sind die leeren 22 nm-Teilchen nicht infektiös. Die leeren Teilchen rufen jedoch eine für eine Immunität ausreichende Immunreaktion hervor und können zur Herstellung von Impfstoffen gegen HBV verwendet werden. Mit 22nm-Teilchen gebildete Hepatitis B-Impfstoffe wurden bisher aus dem Plasma von humanen HBV-Trägern hergestellt. Ungünstigerweise müssen aus Humanplasma gewonnene 22 nm-Teilchen eingehend gereinigt werden, um infektiöse HBV-Teilchen sowie andere im Plasma vorliegende Krankheitserreger zu entfernen. Ferner unterliegt die Herstellung von Hepatitis B-Impfstoffen aufgrund der begrenzten Zugänglichkeit von Humanplasma ernsten Beschränkungen.

Die Anwendung von rekombinanter DNA-Technik hat es möglich gemacht, das Hepatitis S-Protein in einem 22 nm-Teilchen, z. B. in transformierten Säugetierzellinien und in Saccharomyces cerevisiae zu exprimieren. Die derzeit verwendeten Säugetiersysteme sind teuer in der Anwendung, während die Saccharomyces-Systeme relativ niedrige Ausbeuten an S-Protein ergeben.

Bemühungen zur Herstellung des antigenen und möglicherweise als Impfstoff wirksameren preS₂-Proteins haben sich als ungewöhnlich schwierig erwiesen. Es hat sich herausgestellt, daß das preS₂-Protein sehr empfindlich gegenüber einer Proteolyse in rekombinanten Systemen ist. Die Proteolyse ergibt zwei kleinere Proteinfragmente, bei denen die antigene Beschaffenheit von preS₂ nicht erhalten bleibt. Ferner ist es sehr schwierig, das preS₂-Protein in rekombinanten Systemen zu exprimieren. Der Expressionsgrad von pre3₂ beträgt etwa Viο des Anteils an S-Protoin in den gleichen rekombinanten Systemen. Daher würde es einen erheblichen Fortschritt bedeuten, ein Verfahren zur Herstellung von antigenen HBV-Teilchen mit einem Gehalt an S-Protein und preS_r Protein von HBV zu entwickeln. Diese HBV-Teilchen würden das überwiegende S-Protein mit dem potentiell stärker antigenen preS₂-Protein in einer potentiell als Impfstoff wirksameren Form vereinen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, einen neuen Weg zur Herstellung von antigenen HBV-Teilchen bereitzustellen, die zur Herstellung von Impfstoffen geeignet sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen Weg für die verstärkte Bildung von antigenen HBV-Teilchen bereitzustellen, die Im wesentlichen aus S-Protein und preS₂-Protein von HBV bestehen. Ferner sollen erfindungsgemäß neue Vektoren mit einem Gehalt an DNA-Sequenzen bereitgestellt werden, die für S-Protein und preS₂-Protein kodieren. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, neue methylotrophe Hefen bereitzustellen, die mit einem oder mehreren Vektoren transformiert sind, die zur verstärkten Bildung von HBV-Teilchen mit einem Gehalt an S-Protein und an einem unglykosyliertem preS₂-Protein fähig sind.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur verstärkten Bildung von antigenen HBV-Teilchen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine methylotrophe Hefe mit mindestens einer wirtskompatiblen Expressionskassette, die ein Strukturgen für das S-Protein enthält, und mit mindestens einer vektorkompatiblen Expressionskassette, die ein Strukturgen für das preS₂-Protein enthält, transformiert und die erhaltenen Transformanten unter für die Bildung der Teilchen geeigneten Bedingungen züchtet.

Fig. 1: stellt das Plasmid pA0801 dar, bei dem es sich um ein von pBR 322 abgeleitetes Plasmid ohne eine EcoRI-Stolle

in Position 1 handelt und das eine Bglll-Stelle statt der pBR322 Pvull-Stelle enthält und ein 700bp BGIII/Xhol-Fragmcnt

der 3'-AOX1-Terminationssequenz von pBSAGI5l (NRRL #18021 !enthält. Fig. 2: stellt das Piasmid pA0802 dar, bei dem es sich um ein Derivat von Plasmid pA0801 handelt und das eine

Promotor-Gen-Terminator-Expressionskassette aus Plasmid pBSAGI5l (NRRL #18021), inseriert an der Clal-Stelle von

Plasmid pA0801, enthält

Fig. 3: stellt das Plasmid pA0803 dar, bei dem es sich um ein van PA0802 abgeleitetes Plasmid handelt, bei dem die für

HBsAG kodierende Sequenz durch eine Stul-EcoRI-Verdauung entfernt worden ist und dem am gleichen Ort eine

EcoRI-Stelle inseriert worden ist

Fig. 4: stellt das Plasmid pA0811 da., das von Plasmid pA0803 durch Verdauen mit BamHI und Inserieren eines

2,0 Kb-Fragments mit dem Saccharomyces ARG4-Gen abgeleitet worden ist. Fig. 5A: stellt schematisch die Konstruktion der Plasmide pA0801 und pA0802 dar. Fig. 5B: stellt schematisch die Konstruktion der Plasmide pA0803 und pA0811 dar.

Fig. 6: stellt HBV dar, das das ProS₂-Gen von HBV-Serotype adw enthält. Das Plasmid AM6 Ist ein Derivat des HBV-Genoms,

wobei das BamHI-verdaute pBR322-Plasmid an der BamHI-Stelle in Position 26 inseriert ist. Fig. 7: ' zeigt das Plasmid pYM4, ein von pBR322 abgeleitetes Plasmid mit dem an der BamHI-Stelle inserierten

Pichia pastoris-HIS4-Gen. Klammern geben an, daß die entsprechende Stelle zerstört worden ist. Das HIS4-Gen ist in

pYJ30 (NRRL B-15890) hinterlegt

Fig. 8: stellt das Plasmid pYM10 dar. pYM10 ist ein Derivat von pYJ30 (NRRL B-15890), bei dem die BamHI-Stelle in 2959

zerstört worden ist. Die Klammern in der Figur bezeichnen eine zerstörte Restriktionsstelle. Fig. 9: zeigtdas Plasmid pA0804, das einen linearen, integrativen ortsspezifischen Vektor in dem im Uhrzeigersinn gehenden

Fragment von BgIII bis BgIII enthält. Das strukturelle Gen kann an der einzigen EcoRI-Stelle dieses Plasmids eingebaut

werden.

Das preS₂-Strukturgen ist beknnnt und wurde von Lo, Characteristics of preS₂ Region of Hepatitis B Virus, Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 135 (1986), S.382 sequenziert. Zahlreiche auf diesem Gebiet tätige Wissenschaftler

haben dieses Strukturgen geklont und exprimiert; vgl. z. B. Lo sowie Valenzuela, Synthesis and Assembly in Yeast of Hepatitis B

Surface Antigen Particles Containing the Polyalbumin Receptor, Biotechnology, Bd.3 (1985), S.317, um nurzwei zu nennen. Das Strukturgen kann also von auf diesem Gebiet tätigen Wissenschaftlern erhalten, synthetisiert oder reisoliert werden. Ferner ist

festzuhalten, daß beliebige preS₂-Serotypen für die praktische Durchführung der Erfindung eingesetzt werden können.

Das S-Strukturgen ist ebenfalls bekannt und wurde auch von Lo, a. a. 0., sequenziert. Das Strukturgen kann vom Handel bezogen,

synthetisiert oder reisoliert werden. Es ist festzuhalten, daß für die erfindungsgemiße Praxis beliebige Serotypen eingesetztwerden können.

Das in der erfindungsgemäßen Praxis eingesetzte preS₂-Strukturgen, Serotype adw. wurde aus Plasmid AM 6 erhalten. Das Plasmid AM 6 ist ein Derivat des in Fig. 6 gezeigten HBV-Genoms, wobei das pBR 322-Plasmid an der BamHI-Stelle in Position

eingebaut ist. Die Nucleotidsequenz dieses preS₂-Strukturgens ist in Tabelle I aufgeführt. Die darin verwendeten Plasmidekönnen in beliebigen geeigneten E.coli-Wirten, wie MC1061, gezüchtet werden.

Zwei Segmente von preS₂-Strukturgenen wurden aus dem Plasmid AM 6 gewonnen, und die Nucleotidsequenz für die ersten

13 Aminosäuren des N-Endes wurde in vitro synthetisiert. Die Synthese der hier verwendeten Nucleotidsequenz kann entwederdurch chemische oder enzymatische Verfahren erreicht werden, z. B. durch chemische Verfahren auf der Basis der

Phosphotriester-, Phosphit- oder Cyanoethylphosphoramiditrhemie. Der für das C-Ende kodierende Bereich mit einem Gehalt an 70% des Strukturgens für preS₂ wurde aus dem Plasmid AM 6 durch Dral-Verdauung des Plasmids erhalten. Die Dral-Verdauung wurde unter Einsatz von handelsüblicher Dral-Endonuclease

durchgeführt (sämtliche Endonucleasen wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers eingesetzt). Die Dral-Fragmentewurden sodann mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.

Ein octamerer Stul-Linker (AAGGCCTT) wurde sodann gemäß üblichen DNA-Synthesetechniken hergestellt und mit den Dral- Fragmenten unter Verwendung von T4-Ligase in stumpfendiger Verknüpfung verbunden. Die Verknüpfung wurde durch Phenolextraktion gefolgt von einer Ethanolfällung beendet. Die erhaltenen Fragmente wurden sodann zur Entfernung von Multimeren von Stul mit Stul-Endonuclease verdaut. Die Stul-Linkerfragmente wurden sodann mit Xbal verdaut. Das erhaltene Stul/Xbal-Fragment von etwa 600bp mit dem für das C-Ende kodierenden Bereich des preS₂-Strukturgens wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses 600bp-Fragment wurde mitT4-Ligase in ein 5,7kb-Xbal/Stu-Verdauungsprodukt des Plasmids ρYM4, Fig.2, das durch Agarosegelelektrophorese isoliert worden war, eingebunden. Das Ligationsgemisch wurde sodann direkt zur Transformation von leistungsfähigen E. coli-Zellen (MC 1061) verwendet, die

sodann in Gegenwart von Ampicillin gezüchtet wurden.

Tabelle I

7 10 20 30 40

CAATTC ATG CAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTC Stai-t von PreS₂

50 60 70 80

TGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGTATCTTCCTGCTGG

90 100 UO 120

TGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGCTCCGAATATT

130 140 150 160

GCCTCTCACATCTCGTCAATCTCCGCGAGGACTGGGGACC

170 172 180 190 200

CTGTGACGAAC ATG GAGAACATCACATCAGGATTCCTAGG

Start von S

210 220 230 240

acccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgaca

Tabel.e I- Fortsetzung

250 260 270 280

AGÄATCCTCACAATACCGCACAGTCTAGA CTCGTCGTCGA

290 300 . 310 320

CTTCTCTCAATTTTCTAGGCGGATCTCCCGTGTGTCTTGG

330 340 350 360

CCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACC

370 380 390 AOO

TCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTC

410 ' 420 430 440

TGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATG

450 460 470 480

CCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATG

490 500 510 520

TTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCA

530 540 550 560

GTACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGG

570 580 590 600

CAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACG

610 620 630 640

GATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCGTCCTGGG

650 660 670 680

CTTTCCCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTT

690 700 710 720

CTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTC

730 740 750 760

GTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGA

770 780 790 800

TGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAG

810 820 830 840

TCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGG

850 852 GTATACATT TAA

Stopp-Codon Mit Erfolg transformierte Kolonien wurden ausgewählt, und die Plasmid-DNA gemäß dem Verfahren von Birnboim und DoIy

(Nucleic Acids Resarch, Bd. 7 [1979], Seite 1513) extrahiert.

Die extrahierte Plasmid-DNA wurde mit Stul verdaut, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. EcoRI-Linker wurden

hergestellt und mit den Stul-Fragmenten verknüpft. Überschüssige Linker wurden durch EcoRI-Verdauung entfernt. Diese der

EcoRI-Verknüpfungsbehandlung unterworfenen Fragmente wurden weiter mit Xbal verdaut und der Elektrophorese unterzogen,

um Fragmente mit einem Gehalt an dem C-endständigen Bereich des preS₂-Strukturgens zu isolieren.

Das Xbal-EcoRI-Verdauungsprodukt wurde in Xbal-EcoRI-geschnittenes pUC 18 eingebaut. Das Ligationsgemisch wurde in

leistungsfähige E.coli-Zellen (MC 1061) transformiert, die dann in Gegenwart von Ampicillin gezüchtet wurden. Die den C-

endständigen Bereich des preS₂-Strukturgens enthaltenden transformierten Zellen wurden durch Fragmentverdauungsanalyseunter Verwendung von CIaI und Xbal ausgewählt. Das gemäß diesem Verfahren ausgewählte Plasmid wurde als pHS2-B

bezeichnet.

Der Mittelbereich des preS₂-Gens wurde gewonnen, indem man zunächst das Plasmid AM 6 mit Xbal und BamHI verdaute. Das

gewünschte 250bp-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Das 250bp-Xbal/BamHI-Fragment wurde sodann inpUC 18, das mit Xbal und BamHI verdaut v/orden war, ligiert undzurTransformation von E.coli MC1061 verwendet. In Gegenwart

von Ampicillin gezüchtete Kulturen wurden analysiert, indem man die Plasmid-DNA gewann und mit BamHI verdaute. Von den Plasmiden, die bei der Elektrophorese ein lineares 2,7kb-Fragment enthielten, wurde angenommen, daß sie das gewünschte 250bp-Fragment enthielten. Eine transformierte Kolonie mit einem Gehalt an dem 250 bp-Fragment wurde isoliert und im Großmaßstab gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde isoliert und aus der mit EcoRI und BamHI verdauten Kolonie gereinigt. Die Vektorbande wurde durch Elektrophorese isoliert. Der Vektor wurde sodann mit dem nachstehenden, kinasebehandelten, doppelsträngigen Oligonucleotid verknüpft.

Pstl BamHI S'AA TTCAATCCGTCTGCAG 3'

3'GTTAGGCAGACGTCCTAG 5'

Das Ligationsreaktionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli MC 1031 verwendet. Kolonien mit dem richtigen Insert

wurden aufgrund der Ampicillinresisteru «.^-newählt. Dieses Plasmid wurde als pPS2 bezeichnet.

Der N-endständige Kodierungsbereich von preSj wurde als ein synthetisches Oligonucleotid der folgenden Sequenz hergestellt. Hindill Pstl

5' AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3' ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAGB'

Diese Sequenz wurde in ein Hindill- und Pstl-Verdauungsprodukt von pUC 18 geklont. Die gewünschten Transformanten waren durch die Anwesenheit eines Fragments von etwa 75 bp nach EcoRI-Verdauung und Elektrophorese gekennzeichnet. Die gemäß diesem Verfahren ausgewählten Plasmide wurden als pTBO-2 A bezeichnet.

Der Mittelbereich des Gens wurde durch Verdauung des Vektors pTBO-2 A mit Pstl und Xbal hinzugefügt. Beim Insert handelte es sich um das 250bp-Pstl-Xbal-Fragment von pPS2. Die Transformanten waren durch die Anwesenheit eines >300bp EcoRI-Fragments sowie eines 290bp Xbal/Hindlll-Fragments charakterisiert. Das korrekte Isolat wurde als pTBO-3 bezeichnet. Das vollständige preS₂-Gen wurde durch Inserieren des Hindlll/Xbal-Fragments aus pTBO-3 in mit Xbal/Hindlll verdautes pHS 2 B erreicht.- Ampicillinresistente Transformanten waren durch die Anwesenheit eines 825 bp-EcoRI-Fragments gekennzeichnet. Dieser Baustein wurde als pTBO4 bezeichnet.

Die Züchtung des vorstehend aufgeführten E.coli-Stammes kann nach beliebigen geeigneten Methoden erfolgen. Allgemeine Techniken zur Züchtung von E.coli sind bokannt, und Anpassungen dieser Methoden an die speziellen Bedürfnisse der hier verwendeten Stämme liegen im Bereich des Könnens eines Fachmanns.

Die Gewinnung von Plasmid-DNA aus E.coli kann aufgrund ihrer kompakten Größe und der geschlossenen sphärischen, superhelikalen Form nach mehreren Techniken erfolgen. Beispielsweise können die Wirtszellen im Anschluß an die Ernte durch Zentrifugation pelletisiert und anschließend resuspendiert und lysiert werden. Das Lysat sollte zur Entfernung von Zellbruchstücken zentrifugiert und der die DNA enthaltende Überstand gewonnen werden. Eine Phenolextraktion kann durchgeführt werden, um den Großteil von anderen Verunreinigungen aus der DNA zu entfernen. Die mit Phenol extrahierte DNA kann sodann unter Anwendung einer Dichtegradientenzentrifugation oder einer Gelfiltrationstechnik weiter behandelt werden, um die Plasmid-DNA von der bakteriellen DNAzu trennen. Diese für die vorerwähnte Trennung angewandten Techniken sind dem Fachmann geläufig. Zahlreiche Verfahren zur Durchführung dieser Techniken sind bekannt. Die Nucleaseverdauung des Plasmids kann durch Wahl geeigneter Endonucleasen erreicht worden, die das gewählte Plasmid in solcherweise schneiden, daß die Gewinnung des preS₂-Strukturgens erleichtert wird. Die verwendeten Endonucleasen hängen vom Plasmid ab, aus dem das preS₂-Gen herauszuschneiden ist. Beispielsweise kann das im Plasmid AM 6 enthaltene preS₂-Strukturgen gemäß Beispiel I gewonnen werden,

Die Gelelektrophorese von DNA kann unter Anwendung von zahlreichen Techniken durchgeführt werden; vgl. P. G. Sealy und E. M. Southern, Gel Electrophoresis of Nucleic Acids -A Practical Approach (Herausgeber D. Rickwood und B. D. Harnes), 1982, Seite 39. Eine Elution kann ebenfalls unter Anwendung zahlreicher, für das beteiligte Gel geeigneter Techniken durchgeführt werden, z. B. durch Elektroelution, Diffusion, Gelauf lösung (Agarosegele) oder physikalische Extrusion (Agarosegele). Ferner ist darauf hinzuweisen, daß bei einigen Gelen, z. B. bei hochwertiger Agarose von niedriger Schmelztemperatur eine Elution möglicherweise nicht erforderlich ist.

Nachdein das Fragment, das das preS₂-Strukturgen oder Fragmente davon enthält, isoliert worden ist, können zusätzliche Arbeitsgänge erforderlich sein, bevor es in den Vektor inseriert wird. Diese Arbeitsgänge können die Addition von Linkern oder eine stumpfendige Ausgestaltung des Fragmentes umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.

Für eine Ausführungsform der Erfindung wurde das S-Gen durch M 13-Mutagenese aus dem preS₂-Gen konstruiert. Die M 13-Mutagenese wurde zur Deletion der ersten 165 Basenpaare, die für die ersten 55 Aminosäuren des preS₂-Strukturgens kodieren, durchgeführt, was zur Insertion einer EcoRI-Stelle unmittelbar in 5'-Stellung zum ATG-Startkodon für das S-Strukturgen führte. Die Techniken für die M 13-Mutagenese sind dem Fachmann bekannt. Eine repräsentative Technik ist die Technik von Zoller und Smith, Methods in Enzymology, Bd. 100 (1983), S.486. M13-Vektor en und die für die Mutagenese erforderlichen Reagentien sind im Handel erhältlich, beispielsweise von der Firma New England Biolabs.

Die vorstehend beschriebene Mutagenese wurde eingeleitet, indem man zunächst das preS_rStrukturgen in die doppelsträngige, kreis'örmige, replikative Form (oder RF) des M 13-Vektors inserierte (wegen der einfachen Anwendung wurde m 13mp 18 ausgewählt, obgleich auch andere M 13-Vektoren verwendet werden könnten). Das preS₂-Strukturgen im Plasmid pTB 04 wurde in E. coli MC 1061 vermehrt. Das Plasmid DNA wurde unter Anwendung des Verfahrens von Birmboim und DoIy (vgl. oben) isoliert. Das Plasmid pTB04 wurde sodann mit EcoRI verdaut. Das etwa 825 Ba.senpaare enthaltene EcoRI-Fragment mit einem Gehalt an preS₂-Strukturgen wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde sodann in die EcoRI-Stelle von m 13 mp 18 inseriert. Das Ligationsgemisch wurde anschließend zur Transformation von kompetenten Bakterienzellen, wie JM101 oder JM103, verwendet. Die Transformanten wurden aufgrund einer Farbreaktion ausgewählt, die anzeigte, daß das gewünschte Fragment des ß-Galactosidase-Gen unterbrochen hatte und auf Indikatorplatten klare anstelle von blauben Plaques bildete.

Die Orientierung der Insertion kann durch Sequenzierung, Endonucleaseverdauung und Gelelektrophorese oder andere geeignete Techniken bestimmt werden. Ein Klon, in dem Initiatormethionin nahe dem M 13-Universalprimer inseriert war, wurde Isoliert und für die erste Mutagenese verwendet

Anschließend wurde in vitro ein kurzes Oligonucleotid mit folgender Nucleotidsequenz synthetisiert:

CGGGT-ACCGA-GCTCG-AATTC-ATGGA-GAACA-TCACA-TCAGG

Die in der erfindungsgemäßen Praxis verwendeten synthetischen Sequenzen können entweder durch chemische oder durch enzymatieche Verfahren hergestellt werden. Geeignete Verfahren (ohne Beschränkung hierauf) sind chemische Verfahren auf der Basis der Phosphotriester-, Phosphit- oder Cyanoethy.'phosphoramiditchemie.

Die einzelsträngige Form von M13 mit dem inserierten Strukturgen wurde hergestellt. Das synthetische Oligonucleotid, das teilweise mit dem 5'-Flankenbereich des preS₂-Gens komplementär war, und das 5'-Ende des S-Kodierungsbereichs wurden sodann durch Temperung mit dem einzelsträngigen M 13-Vektor mit einem Gehalt an dem preS₂-Strukturgen verbunden. Unter Verwendung des partiell komplementären synthetischen Oligonucleotids als Primer wurde die DNA-Synthese in vitro mit dem Klenow-Fragment und Desoxynucleotid-triphosphaten bei 4°C durchgeführt. Das partiell komplementäre synthetische Oligonucleotid wurde sodann um die kreisförmige M 13-Schablone herum erweitert. Das Reaktionsgemisch wurde zur Transformation-von kompetenten JM101- oder JM 103-Zellen verwendet. Die Transformanten wurden dem Screening durch Übertragung der Plaques auf Nitrocellulose und durch Hybridisierung mit einem radioaktiv markierten Oligonucleotid unterworfen, so daß mutante Stränge hybridisierten, während dies bei der Originalschablone nicht der Fall war. Diese Mutanten wurden sodann zur Herstellung einer Schablone verwendet, die zur Transformation von JM103 eingesetzt wurde. Diese Transformanten wurden auf die vorstehend beschriebene Weise erneut dem Screening unterworfen. Positive Transformanten aus dem zweiten Screening wurden anschließend sequenziert, und Plaques mit der korrekten Sequenz wurden identifiziert. Die doppelsträngige replikative Form dieser Kolonien wurde mit EcoRI verdaut, und ein 678hp-Fragment mit einem Gehalt an dem S-Strukturgen wurde isoliert. Diese Sequenz ist in Tabelle Il angegeben.

Tabelle Il

170 172 180 190 200

CAATTC ATC CAGAACATCACATCAGGATTCCTAGG Start S

210 22ü -230 240

ACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACA

250 · 260 270 280

agaatcctcacaataccgcagagtctagactcgt. g gtgga

290 300 310 320

cttctctcaattttctagggggatctcccgtgtgtcttgg

330 340 350 360

CCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACC

370 380 390 400

tcctgtcctccaatttgtcctggttatcgctggatgtgtc

410 420 430 440

tgcggcgttttatcatattcctcttcatcctgctgctatg

450 460 470 480

cctcatcttcttattggttcttctggattatcaaggtatg

490 500 510 520

ttgcccgtttgtcctctaattccaggatcaacaacaacca

530 540 550 560

gtacgggaccatgcaaaacctgcacgactcctgctcaagg

570 580 590 600

caactctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacg

610 620 630 640

gatggaaattgcacctgtattcccatcccatcgtcctggg

-8- 285 373 Tabelle II- Fortsetzung

650 660 670 680

CTTTCCCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTT

690 700 710 720

CTCTTCGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTC

730 740 750 760

GTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGA

770 780 790 800

TGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAG

810 820 830 840

TCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGG

850 852 GTATACATT TAA

Stopp-Codon

Im Anschluß an die Isolation der S-preS₂-Strukturgene werden die Gene in einen geeigneten methylotrophen Hefevektor, z. B. in ein Plasmid oder einen linearen, ortsspezifischen, integrativen Vektor inseriert. Für die praktische Durchführung der Erfindung werden Vektoren bevorzugt, die mit der Gattung Pichia und insbesondere mit Pichia pastoris verträglich sind. Plasmide stellen seit langem die in der rekombinanten DNA-Technik angewandten Grundelemente dar. Bei Plasmiden handelt es sich um kreisförmige, extrachromosomale, doppelsträngige DNA, die in Mikroorganismen vorkommt. Plasmide treten pro Zelle als einfache oder mehrfache Kopien auf. In der Plasmid-DNA ist die für die Plasmidreproduktion erforderliche Information enthalten, d. h. eine Replikaticnsursprungsstelle ist für die bakterielle implikation enthalten. Ein oder mehrere Mittel zur phänotypischen Auswahl des Plasmids in transformierten Zellen können ebenfalls in der im Plasmid kodierton Information enthalten sein. Phänotypische oder Selektionsmarker, wie antibiotische Resistenzgene oder Gene, die Defekte in den biochemischen Stoffwechselwegen des Wirts ausgleichen, ermöglichen die Erkennung, Auswahl und Aufrechterhaltung von Klonen der Wirtszellen, die transformiert worden sind.

Um das preS₂-Strukturgen und das S-Strukturgen in rri6thylotropher Hefe zu exprimieren, müssen die einzelnen Gene in operativer Weise mit einem δ'-Regulationsbereich und einer 3'-Term!nationssequenz verknüpft sein, wodurch die Expressionskassette gebildet wird, die über einen Vektor in den Wirt inseriert wird. Nachstehend finden sich zu Klarstellungszwecken Definitionen für verschiedene Ausdrücke.

Der Ausdruck »operativ verknüpft" bezieht sich auf eine benachbarte Stellung, in der die Komponenten so angeordnet sind, daß sie ihre Funktion erfüllen.

Der Ausdruck „regulatorischer Bereich" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die auf verschiedene Stimuli reagieren und die Geschwindigkeit der mRNA-Transkription beeinflussen.

Der Ausdruck „3'-Terminationssequenz" bezieht sich auf Sequenzen in der 3'-Stellung zum Stopp-Codon, die eine Stabilisierung der mRNA bewirken, z.B. Sequenzen, die eine Polyadenylierung hervorrufen.

Der Ausdruck „wirtskompatibel" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die ihre normale Funktion in Wirten ausüben, wie von Wirten abgeleitete Regulationsbereiche und 3'-Tt;rminationssequenzen.

Für die praktische Durchführung der Erfindung werden integrative Vektoren bevorzugt, z. B. der lineare, ortsspezifische, integrative Vektor von Cregg gemäß EP-A-O 226752 {86114 700.7). Derartige Vektoren umfassen eine angeordnete Sequenz von mindestens (1) einem ersten inserierbaren DNA-Fragment; (2) einem selektierbaren Markergen; und (3) einem zweiten inserierbaren DNA-Fragment.

Inserierbare DNA-Fragmente weisen jeweils mindestens etwa eine Länge von 2GO Nucleotiden sowie Nucleotidsequenzen auf, die zu Bereichen der Genom-DNA des Wirts homolog sind. Die verschiedenen Komponenten des linearen, ortsspezifischen, integrativen Vektors sind sei iell unter Bildung eines linearen DNA-Fragments so angeordnet, daß die Expressionskassette und das selektierbare Markergen sich zwischen dem 3'-Ende des ersten inserierbaren DNA-Fragments und dem 5'-Ende des zweiten inserierbaren DNA-Fragments befinden. Das erste und zweite inserierbare DNA-Fragment sind in bezug zueinander im seriell angeordneten linearen Fragment so orientiert, wie sie im Ausgangsgenom orientiert sind.

Bei den Nucleotidsequenzen, die als erstes und zweites inserierbares DNA-Fragment geeignet sind, handelt es sich um Nucleotidsequenzen, die zu separaten Bereichen der nativen Genomstelle, an der eine Genommodifikation erfolgen soll, homolog sind. Soll beispielsweise eine Genommodifikation am Ort des Alkohol-oxidase-Gens erfolgen, so handelt es sich beim verwendeten ersten und zweiten inserierbaren DNA-Fragment um Sequenzen, die zu separaten Bereichen des Orts des Alkoholoxidase-Gens homolog sind. Damit eine Genommodifikation im Sinne der vorliegenden Erfindung erfolgt, müssen die beiden inserierbaren DNA-Fragmente in bezug zueinander im linearen Fragment in der gleichen relativen Orientierung orientiert sein, wie sie im Ausgangsgenom vorliegt. Beispiele für Nucleotidsequenzen, die als erstes und zweites inserierbares DNA-Fragment verwendet werden können, sind Nucleotidsequenzen, die aus folgender Gruppe ausgewählt sind: Alkohol-oxidase (AOX 1 )-Gen, Dihydroxyaceton-synthase (DHAS 1 )-Gen, p40-Gen und HIS4-Gen. Das AOX1-Gen, DHAS1-Gen, p40-Gen und HIS4-Gen sind in EP-A-0183 071 (85113 737.2), auf die Bezug genommen wird, of'enhart.

Das erste inserierbare DNA-Fragment kann einen einsalzfähigen Regulationsbereich enthalten, der den in der Expressionskassette eingesetzten Regulationsbereich umfassen kann. Die Verwendung des ersten inserierbaren DNA-Fragments als Regulationsbereich für eine Expressionskassette stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar Fiy.4 zeigt ein Diagramm eines Vektors, der sich des ersten inserierbaren DNA-Fragments als Regulationsbereich für eine Kassette bedient. Gegebenenfalls können, wie in Fig.9 gezeigt, eine oder mehrere Insertionsstellen und eine 3'-Terminationssequenz unmittelbar

in 3'-Stellung zum ersten inserierbaren DNA-Fragment angeordnet sein. Diese Anordnung des linearen, ortsspezifischen,integrativen Vektors hat den zusätzlichen Vorteil, daß ein fertige Stelle zur Insertion eines Strukturgen*? bereitgestellt wird, ohnedaß die Addition einer kompatiblen 3'-Term!nationssequenz erforderlich ist.

Ferner ist es notwendig, mindestens ein selektierbares Markergen in die zur Transformation des Wirtstammes verwendete DNA

aufzunehmen. Dies erleichtert die Auswahl und die Isolation von solchen Organismen, in die transformierende DNA eingebautworden ist. Das Merkergen verleiht dem transformierten Organismus ein phänotypisches Merkmal, das der Wirt nicht aufwies,

z. B. die wiederhergestellte Fähigkeit zur Bildung einer speziellen Aminosäure, während der nichttransformierte Wh* einen

Defekt im spezifischen biosynthetischen Weg zur Herstellung dieser Aminosäure aufweist, oder eine Resistenz gegci Antiobiotika und dgl. Beispiele für selektierbare Markergene sind solche aus der Gruppe HIS4-Gen und ARG4-Gen von Pichia pastoris un J Saccharomyces cerevisiae, Invertase-Gen (SUC2) von Saccharomyces cerevisiae oder Neomycin-Phosphotransfer. se-Gen von

den E.coli-transponierbaren Elementen Tn 601 oder Tn 903.

Der Fachmann erkennt, daß weitere DNA-Sequenzen den in der erfindungsgemäßen Praxis verwendeten Vektoren ebenfalls

einverleibt werden können, z. B. bakterielle Plasmid-DNA, Bakteriophagen-DNA und dgl. Derartige Sequenzen ermöglichen die

Amplifikation und Aufrechterhaltung dieser Vektoren in bakteriellen Wirten. Enthält das erste inserierbare DNA-Fragment keinen Regulationsbereich, muß ein geeigneter Regulationsbereich untor

operativer Verknüpfung in das Strukturgen inseriert werden, um eine betriebsfähige Expressionskassette zu gewährleisten. InähnlicherWeise muß, wenn an der Insertionsstelle zur Vervollständigung der Expressionskassette keine 3'-Terminationssequenzvorgesehen ist, eine derartige 3'-Terminationssequenz operativ mit dem einzubauenden Strukturgen verknüpft werden.

Dem Fachmann sind zahlreiche Regulationsbereiche bekannt, die charakterisiert worden sind und die in Verbindung π it

methylotrophen Hefen verwendet werden können. Beispiele für Regulationsbereiche, die keine Beschränkung bedeuten, sind

Heferegulationsbereiche aus der Gruppe saura Phosphatasek-, Galactokinase-, Alkohol-dehydrogenase-, Cytochrom c-,

a-Mating-Faktor und Glycerinaldehyd-S-phosphat-dehydrogenase-Regulationsbereiche, isoliert aus Saccharomyces cerevisiae;primäre Alkoholbxidase (AOXD-, Dihydroxyaceton-synthase (DASD-, ρ 40- und HIS4-Regulationsbereiche, abgeleitet von

Pichia pastoris, und dgl. In der erfindungsgemäßen Praxis werden derzeit als bevorzugte Regulationsbereiche solche eingesetzt,

die durch die Fähigkeit charakterisiert sind, auf Methanol enthaltende Medien zu reagieren, z. B. Regulationsbereiche aus der

Gruppe A0X1, DHAS1 und ρ40, die in EP-A-0183071 (85113737.2) offenbart sind. Für die erfindungsgemäße Praxis wird der AOX1 -Regulationsbereich besonders bevorzugt. Wie vorstehend erörtert, können 3'-Terminationssequenzen in der Expressionskassette verwendet werden oder einen Teil des Vektors darstellen. Die 3'-Terminationssequenzen können bei operativer Verknüpfung mit einem Gen eine Termination, Prolyadenylierung und/oder Stabilisierung der Messenger-RNA, für die das Strukturgen kodiert, bewirken. Einige Beispiele für

geeignete Quellen für 3'-Teiminationssequenzen, die für die erfindungsgemäße Praxis geeignet sind, sind-ohne Beschränkunghierauf-die Saccharomyces cerevisiae·, Hansenula polymorpha- und Pichia-3'-Terminationssequenzen. Bevorzugt sind solchevon Pichia pastoris, boispielsweis3 ausgewählt aus der Gruppe 3'-Terminationssequenzen des AOX1-Gens, DHAS1-Gens,p40-Gens und HIS4-Gens. Besorders bevorzugt ist die 3'-Terminationssequenz des AOX1-Gens.

Der Fachmann erkennt, daß weitere DNA-Sequenzen ebenfalls den in der erfindungsgemäßen Praxis verwendeten Vektoren

einverleibt werden können, z. B. bakterielle Plasmid-DNA, Bakteriophagen-DNA und dergl. Derartige Sequenzen ermöglichen die

Amplifikation und Aufrechterhaltung dieser Vektoren in bakteriellen Wirten. Ein weiterer geeigneter Vektor ist ein integrator Vektor, der in sequentieller Anordnung mindestens (1) ein inserierbares DNA-Fragment, (2) ein selektierbares Markergen, (3) eine Expressionskassette und gegebenenfalls (4) ein weiteres inserierbares DNA-Fragment enthält. Diese Komponenten des integrativen Vektors sind mit denen äquivalent, die im linearen, integrativen,

ortsspezifischen Vektor verwendet werden, mit der Ausnahme, daß dort nur ein inserierbares DNA-Fragment vorliegen muß,von integrativen Vektoren jedoch angenommen wird, daß der gesamte Vektor durch homologe Rekombination integriert wird.

Bevorzugt sind ringförmige integrative Vektoren, wie in Fig.4 gezeigt. Für die praktische Durchführung der Erfindung ist derzeit

die Verwendung von linearen Transformationsvektoren bevorzugt, beispielsweise die BgI Il-Fragmente der in Fig. 9 gezeigten

Bausteine sowie die Ringform des integrativen Vektors von Fig.4. Die Insertion eines S- oder preS₂-Strukturgens in geeignete Vektoren kann durchg beliebige geeignete Techniken erfolgen, die

den gewählten Vektor an einer oder mehreren geeigneten Stellen spaltet und zu mindestens einer operativen

Expressionskassette, die ein im Vektor vorhandenes S- oder preS₂-Strukturgen enthält, führt. Die Ligation eines S- oder preS₂-Struturgens kann durch eine beliebige geeignete Ligationstechnik erfolgen, beispielsweise

unter Verwendung von T4-DNA-Ligase.

Die anfängliche Selektion, Vermehrung und gegebenenfalls Verstärkung des Ligationsgemisches eines S- oder preS₂- Strukturgens und eines Vektors wird vorzugsweise durchgeführt, indem man das Gemisch in einen bakteriellen Wirt, z. B. E. coli,

transformiert. Geeignete Transformationstechniken für E. coli sind aus dem Stand der Technik bekannt. Ferner sind

Selektionsmarker und bakterielle Replikationsursprungsstellen, die für die Aufrechterhaltung eines Vektors in einen bakteriellen Wirt erforderlich sind, aus dem Stand der Technik bekannt. Die Isolation und/oder Reinigung des gewünschten Plasmids mit einem Gehalt an einem S- oder preS₂-Strukturgen in einem Expressionssystem kann gemäß beliebigen geeigneten Maßnahmen für die Trennung von Plasmid-DNA aus Wirts-ONA

erfolgen.

In ähnlicher Weise können die durch Ligation gebildeten Vektoren vorzugsweise nach Vermehrung getestet werden, um die Anwesenheit eines S- oder preS₂-Gens und deren operative Verknüpfung mit einem Regulationsbereich und einer 3'-Terminatlonesequen2 zu verifizieren. Dies kann nach einer Reihe von Techniken durchgeführt werden, zu denen - ohne Beschrankung hierauf- die Endonucleaseverdauung, Gelelektrophorese oder Endonuclear everdiuung-Southern-Hybridisierung gehören.

Für die erfindungsgemäße Praxis müssen mindestens zwei unterschiedliche kompatible Expressionskassetten in die Wirtszelle transformiert werden. Es gibt mehrere Methoden, mit denen diese beiden unterschiedlichen Expressionskassetten in den Wirt inseriert werden können, beispielsweise indem man zwei funktioneile Expressionskassetten in einen Vektor (viraler, Plasmid- oder linearer, ortsspezifischer, integrativer Vektor) plaziert und einen Wirt mit diesen Vektoren transformiert. Ein weiteres Verfahren zur Transformation eines Wirts mit mindestens zwei unterschiedlichen Expressionskassetten (S und preS₂ besteht in der Transformation des Wirts mit zwei unterschiedlichen Vektoren, von denen einer die S-Expressionskassette und der andere die preS]-Expressionskassette enthält. Die Transformation mit zwei unterschiedlichen Vektoren (doppelte Transformation) kann durch gleichzeitige Transformation (beide Vektoren sind bei einem einzigen Transformationsereignis vorhanden) oder sequentiell (ein Vektor wird in den Wirt transformiert, wonach sich eine zweite Transformation mit dem anderen Vektor in die bereits vorher transformierten Wirtszellen anschließt) erreicht werden. Die doppelte sequentielle Transformation stellt derzeit das bevorzugte Transformationsverfahren dar.

Die Transformation von Plasmiden oder linearen Vektore η in Hefewirte kann durch geeignete Transformationstechniken erreicht werden, zu denen-ohne Beschränkung hierauf, die Techniken von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., Bd.75 (1978), S. 1929; Ito et al., J. Bacteriol. Bd. 153 (1983), S. 163; Cregg et al., Mol. Cell Biol. Bd. E (1985), S. 3376; oder Sreekrishna et al.. Gene, Bd. 59 (1987), S. 115, gehören. Für die erfindungsgemäße Praxis ist die Transformationstechnik von Cregg bevorzugt. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist es wünschenswert, einen Überschuß an linearen Vektoren einzusetzen und mehrfache Insertionen durch Southern-Hybridisierung zu wählen.

Beim Hefewirt für die Transformation kann es sich um beliebige geeignete methylotrophe Hefen handeln. Zu den methyoltrophen Hefen gehören-ohne Beschränkung hierauf-zum Wachstum auf Methanol fähige Hefen der Gattungen Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula. Eine Liste von speziellen Spezies, die als Beispiele für diese Klasse von Hefen dienen, findet sich bei C.Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, (1982), S. 269. Derzeit bevorzugt werden methylotrophe Hefen der Gattung Pichia, z. B. die auxotrophe Hefe Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) oder PPF1 (NRRL-Y-18017). Auxotrophe methylotrophe Hefen sind auch aufgrund ihrer leichten Auswahl für die erfindungsgemäße Praxis von Vorteil. Es ist festzuhalten, daß methylotrophe Wildtyp-He'estämme mit dem gleichen Erfolg verwendet werden können, wenn ein geeignetes Transformationsmarkergen gewählt wird, z. B. die Verwendung von SUC 2 zur Transformation von Pichia pastoris in einen Stamm, der zum Wachstum auf Saccharose fähig ist, oder wenn ein antibiotischer Resistenzmarker verwendet wird, wie das G 418^R-Gen.

Für die erfindungsgemäße Praxis ist es derzeit bevorzugt, die beiden Selektionsmarker in Kombination zu verwanden, um eine Selektion in bezug auf die stabile Transformation von Sund preS₂ in den Wirt zu erreichen. Somit ist es für die erfindungsgemäße Praxis vorteilhaft. Wirt- und Vektorkombinationen zu verwenden, die gewährleisten, daß bei Verwendung von zwei unterschiedlichen Selektionsmarkern in zwei unterschiedlichen Vektoren die einzelnen Marker unabhängig ausgewählt werden. Eine derartige Kombination aus Wirt und Vektor stellt die Verwendung von PPF1 (HIS4, ARG4) mit den Vektoren ρ Α 0804 (HIS4-Marker) und ρA0811 (ARG4-Marker) dar. Eine weitere mögliche Kombination ist die Verwendung eines Auxotrophen, der nur in einem Weg einen Defekt aufweist, in Kombination mit einem Gen, das zum Defekt komplementär ist, und einem antibiotischen Resistenzgen oder einem Gen, das einen neuen Phänotyp, wie SUC2, erzeugt.

Transformierte methylotrophe Hefezellen können unter Anwendung geeigneter Techniken ausgewählt werden, z. B. - ohne Beschränkung hierauf- durch Züchtung von vorher auxotrophen Zellen nach Transformation in Abwesenheit eines notwendigen biochemischen Produkts (aufgrund der Auxotrophie der Zellen), Auswahl durch Nachweis eines neuen Phänotyps („methanol slow") oder Züchtung in Gegenwart eines Antibiotikums, das für die Hefe in Abwesenheit eines im Transformanten enthaltenen Resistenzgens toxisch ist.

Isolierte transformierte methylotrophe Hefezellen werden durch geeignete Fermentationstechniken gezüchtet, z. B. durch Schüttelkolbenfermentation, Fermentation hoher Dichte oder die Techniken gemäß Cregg et al., High-Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast, Pichia Pastoris, Bio/Technology, Bd. 5 (1987), S. 479.

Die Expression kann nach für Jen eingesetzten Regulationsbereich geeigneten Methoden durchgeführt werden. Vorzugsweise kann bei Verwendung von auf Methanol reagierenden Regulationsbereichen die Induktion der Expression erfolgen, indem man die transformierten Zellen in einem Nährmedium einem für den eingesetzten Regulationsbereich geeigneten Alkohol aussetzt. Die antigenen Teilchen können in roher Form gewonnen werden, indem man transformierte Zellen, die ausreichend lang induziert worden sind, der Lysis unter Anwendung von Standardtechniken unterwirft, z. B. durch Mahlen mit einer Perlmühle, gefolgt von einer ausreichenden Zentrif ugation zur Entfernung von Zellbruchstücken. Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren für die Extraktion eines heterologen Proteins aus einzelligen Wirtsorganismen bekannt, die an die Stelle des vorstehenden allgemeinen Extraktionsverfahrens treten können oder zur weiteren Reinigung verwendet werden können. Das in der erfindungsgemäßen Praxis bevorzugte Reinigungsverfahren umfaßt eine Lyse der transformierten Zellen in Gegenwart von gepufferten chaotrophen Verbindungen, präzipitierenden Lipiden und kontaminierenden Proteinen aus dem bei der Lyse erhaltenen Überstand, Diafiltration des Überstands, Behandeln des Retentats mit Kieselsäure, Auswaschen kontaminierender Proteine aus dem von der Kieselsäure absorbierten Hepatitis-B-Oberflächenantigen mit einem Puffer eines pH im Bereich von 6-8, Eluieren des Antigens von der Kieselsäure mit einem gepufferten Eluiermittel eines pH im Bereich von 9,5-11, das 0,5 bis 8 Molar an Harnstoff ist, worauf die Antigen enthaltenden Fraktionen einer Gelfiltration und danach die Antigen enthaltende Fraktion einer Anionenaustauschchromatographie unterworfen werden.

Ausführungsbelspiele Allgemeine Informationen zu den Beispielen:

Stimme

Pichia pastoris GS115 (his4) iJRRL Y-15851 wurde in den Beispielen als Wirtshefestamm verwundet.

Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) MRRL Y-18017.

E. coli MC 1061 NRRL18016

E. coli JM103 delta (lax pro) thi rpsL (strA) supE endA sbcB hsdR.

Medien

20 g Hefeextrakt 2<j g Pepton 20 g Dextrose

5,0 g Hefeextrakt (Difco) 10,0 g Try pton(Difco) 5,OgNaCI

1,0 millimolar EDTA in 0,01 m (pH 7,4) Tris-Puffe,

20% Polyethylenglykol-3350

10millimolarCaCI₂

lOmillimolarTris-HCI (pH 7,4) Sterilfiltration

0,2mTris-HCi(pH7,5)

0,1 m MgCi₂

0,5 m NaCI

0,01 mDithiothreit (DTT)

0,2mTris-HCI(pH7,5)

0,ImMgCl₂

0..1 m DTT

4,4 g NaOH

7,4 g Na₂EDTA 27,6 g NaH₂PO₄ H₂O 21OgNaCI

-pH mit NaOH eingestellt auf 7,5-8,0 -H₂O ad U iter

5,OgNaCI 96,8Trizma-Base

9,74 g Glycin Wasser ad 1 Liter

Beispiel I

Konstruktion des Vet tors pTb'O4

Plasmid AM6 ist ein Derivat des in Fig. 1 gezeigten HBV-Genoms, wobei das pBR322-Plasmid an der BamHI-Stelle in Position inseriert ist.

Der Vektor pTB 04 enthält das Gen, das für die 281-Aminosäuren-preS₂-Form des Hepatitis B-Oberflächenantigens kodiert. Das Gen wurde in drei Segmenten konstruiert: Das C-terminale Segment, 75% des Strukturgens, ein N-terminaler Linker, der für Aminosäuren kodiert und der restliche Zentralbereich. Das das preS₂-Gen, Serotyp adw, enthaltende Plasmid AM 6 stellte die Quelle für den C-terminalen Bereich und den Mittelbereich des hier verwendeten preS_r Gens dar. Die Sequenz ist bei Valenzuela et ai., ICN-UCLA Symposia on Animal Virus Genetics, (1980), S. 57-70, beschrieben, wobei folgende Modifikation gilt:

YPD, 1 Liter LB-Brühe, 1 Liter

TE-Puffer PEG-Lösung

LösungA

Lösung B 2OxSSPE

χ Transfer-Puffer

native Sequenz mutierte Sequenz

ATG-CAG-TGG-AAT-TCC

ATG-CAG-TGG-AAC-TCC.

A. C-termlnaler Bereich von preS₂

(Sämtliche Restriktionsenzyme wurde von der Firma Boehringer Mannheim bezogen und gemäß den Angaben des Herstellers eingesetzt).

Der C-terminale Bereich wurde aus dem Plasmid AM 6 (Fig. 1) durch Verdauung mit Dra I, welches das HBV-Genom an zwei Stellen, davon einmal am Codon für die letzte Aminosäure des Oberflächenantigens, schneidet. Die Enden wurden durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm in einem Reaktionsvolumen von 30μΙ (1U Enzym 1 Stunde bei 37⁰C in millimolar Tris · HCI, pH-Wert 9,0,1 millimolar MgCI₂,100 mikromolar ZnCI₂,1 millimolar Spermidin) dephosphoryliert. Das gesamte Verdauungsprodukt wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt (Maniatis et al.). Ein oktamerer Stul-Linker (AAGGCCTT) wurde mit einem DNA-Synthesegerät der Firma Applied Biosystems Modell 380A unter Anwendung der

Cyanoethylphosphoramidit-Chemie synthetisiert. 1 μρ der Stu I-Linker wurde in destilliertem Wasser gelöst. Eine 10 ng Aliquotmenge wurde entfernt und in einem Gesamtvolumen von 50 μΙ mit einom Gehalt an 70 millimolar Tris HCI, pH-Wert 7,7, 10 mlllimolar MgCI₂,5 millimolar Dithiothreit, 1 millimolar ATP und 10 Einheiten Polynucleotid-kinase 30 Minuten bei 37⁰C mit Phosphat markiert. Die Linker wurden auf 9O⁰C erwärmt, um die enzymatische Reaktion zu beenden, und langsam auf Raumtemperatur gekühlt, um die Bildung von doppelsträngiger DNA zu erleichtern. Die Stul-Linker wurden zum vorstehenden Dral-Verdauungsprodukt gegeben und mit T4-Ligase auf folgende Weise verknüpft. Die Reaktion erfolgte in einem 10μΙ Volumen mit einem Gehaltan 6,6 m Tris · HCI, pH-Wert 7,6,5 millimolar MgCI₂,5 millimolar Dithiothreit, 1 millimolar ATP und 1 Weiss-Unit T4-Ligasa 1 Stunde be° 23°C. Die Ligationsreaktion wurde durch Phenolextraktion beendet, wonach mit Ethanol gefällt wurde. Eine Stu I-Restriktionsverdauung wurde sodann mit > 60U Enzym über Nacht durchgeführt, um Multimere des Stu I-Linkers zu entfernen. Die Kombination aus Dral-Verdauung und Stul-Linker stellte das durch die Dral-Verdauung entfernte Stopp-Codon der Translation wieder her.

Die Stu I-Linker-Dral-Fragmente wurden mit Xba I verdaut, was das gewünschte Stul/Xbal-Fragment von etwa 600 bp ergab. Es wurde aus einem 0,8% präparativen Agarosegel isoliert. Dieses Fragment enthielt den C-endständigen 75% Bereich des Gens und wurde in den Vektor ρ YM 4 (Fig. 2) geklont, der mit Xba I und Stu I verdaut und auf die vorstehend beschriebene Weise dephosphoryliert worden war. (pYM4 kann aus dem Plasmid pYM 30 durch Verdauung von pYM 30 mit CIa I und Religation der Enden erhalten werden. pYM30 ist in einem E. coli-Wirt beim Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, Hinterlegungsnummer NRRL B-15890 hinterlegt). Das 5,7kb-Restriktionsfragment von pYM4 wurde aus 0,8% präparativem Agarosegel isoliert. Der Vektor pYM4 wurde nur wegen seiner zweckmäßigen Restriktionsstellen verwendet. 50ng des Vektors und 500ng des Inserts wurden 1 Stunde bei 23⁰C in 50 millimolarem Tris HCI, pH-Wert 7,4,10 millimolar MgCl₂,10 millimolar Dithiothreit, 1 millimolar Spermidin und 1 millimolar ATP mit 1 Weiss-Unit T4-Ligase in einem Volumen von 10μΙ verknüpft. Die Ligationsreaktion wurde direkt zur Transformation von kompetenten MC 1061 -Zellen (E.coli) zur Erzielung von Ampicillinresistenz verwandet. E.coli Stamm MC 1061 ist beim Northern Regional Research Conter, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, unter der Hinterlegungsnummer NRRL-18016 zugänglich. MC 1061 weist folgenden Genotyp auf: F(-), ara D139 delta (laclPOZY) X74 galk galU hsr hsm(+) rpsL delta (araABOIC leu) 7697. MC 1061 wurde auf folgende Weise für die Transformation kompetent gemacht. Eine Kultur in der mittleren logarithmischen Phase (mid-log) (50ml) von E.coliMC1061 wurdedurch5minütigeZentrifugation bei 3000U/minund4°C in einer Damon IEC DPR600-Zentrifuge geerntet und in 10 millimolar NaCI gewaschen. Die Kultur wurde in 25ml 50 millimolar CaCI₂ 30 Minuten bei O⁰C resuspend -jrt. Die Zellen wurden sodann auf die vorstehende Weise zentrifugiert und in 2 ml 50 millimolar CaCI₂ resuspendiert. Zur Transformation wurde das Ligationsreaktionsgemisch zu 100μΙ der kompetenten Zellsuspension gegeben und 15 Minuten auf Eis bei O⁰C inkubiert, 5 Minuten einem Wärmeschock von 37⁰C unterworfen und 5 Minuten bei 23⁰C inkubiert. Die Zellen wurden direkt auf LB-Agarplatten mit einem Gehalt an 50pg/ml Ampicillin ausgestrichen. Die Platten wurden 10 bis 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Die erhaltenen Kolonien wurden geerntet und durch Restriktionsverdauung charakterisiert. Zellen wurden in 5 ml L-Brühe mit einem Gehalt an 50μ9/ιτιΙ Ampicillin 5 Stunden bei 37°Cgezüchtet, und DNA wurde gemäß dem Verfahren von Birnboim und DoIy (Nucleic Acids Research, Bd.7 [1979], S. 1513) hergestellt. Die Minipräparationen wurden mit BamHI und Xbal verdaut. Von Kulturen mit einem 1,5kb Xba/Bam-Fragment wurde angenommen, daß sie das Insert aufweisen. Ein DNA-Präparat von einer Kultur im Großmaßstab wurde auf die vorstehende Weise gereinigt und anschließend der Bandenbildung an einem Cesiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten unterworfen. Dieser Klon wurde pHS 1 genannt. Das Plasmid pHS 1 wurde mit Stu I verdaut, auf die vorstehende Weise dephosphoryliert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Auf die vorstehende Weise synthetisierte EcoR I-Linker (GGAATTCC) wurden phosphoryliert, der Selbsttemperung unterworfen und mit dieser stumpfendigen DNA verknüpft.

Überschüssige Linker wurden durch Verdauung mit EcoRI über Nacht entfernt. Die DNA wurde anschließend mit Xba I verdaut, sodann mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Ein Dublett mit dem 600bp Xba 1-EcoR I-Fragment von Interesse und ein Vektorfragment von 582 bp (Xbal-EcoRI) wurde durch 1,0% präparative Gelelektrxnl.orese isoliert. Diese Fragmente (500ng) wurden der Ligation in mit Xbal-EcoRI-verdautes und dephosphoryliertes pUC18 (50 ng) gemäß der vorstehenden Beschreibung unterworfen und zur Transformation vom MC 1061 zur Erzeugung von Ampicillinresistenz auf die vorstehend beschriebene Weise verwendet. Restriktionsverdauungsprodukte der Minipräparation-DNA wurden dazu verwendet, um zu best nmen, welches der beiden Fragmente geklont worden war. Das unerwünschte Fragment wies eine CIa I-Stelle auf, so daß ein CIa I/Xba I-Doppelverdauungsprodukt Fragmente von etwa 560bp + 2400 bp liefern würde, während das richtige Fragment bei CIa I-Verdauung ein lineares 3 kb-Fragment ergab. Die in Frage kommenden Produkte wurden mit EcoR I und Xba I unter Bildung von Fragmenten von 600bp + 2400bp verdaut. Ein derartiger Klon wurde im Großmaßstab gereinigt und mit pHS2-B bezeichnet. Dieses Produkt en'^ält eine EcoR I-Stelle nach dem letzten Codon am C-terminalen Bereich des vollständigen preS₂-Gens.

B. Mittelbereich des preS₂-Gens

Der Mittelbereich des preS₂Gens wurde auf folgende Weise geklont. Das Plasmid AM 6 wurde mit Xba I und BamH I verdaut, und ein Fragment von 250bp wurde aus einem 0,8% präparativen Agarosegel isoliert. Dieses Fragment (50ng) wurde auf die vorstehend beschriebene Weise mit 5ng pUC 18, das mit Xba I und BamH I verdaut und dephosphoryliert worden war, verknüpft. Die Ligationsreaktion wurde angewandt, um auf die vorstehende Weise den Stamm E.coli MC 1061 unter Erzielung von Ampicillinrt sistenz zu transformieren. Minipräparationen wurden mit BamH I verdaut. Produkte mit einem Gehalt an einem linearen 2,7 kb-Fragment wurden ausgewählt. Ein Isolat wurde im Großmaßstab gezüchtet, und die DNA wurde au f die vorstehend beschriebene Weise isoliert und gereinigt. Dieser Klon wurde mit pPS 1 bezeichnet. Der Klon wurde mit Eco Rl und BamHI geschnitten, und die Vektorbande isoliert und durch 0,8% präparative Agarosegelelektrophorese gereini|jt. Mit diesem Vektor wurde das folgende, einer Kinasebehandlung unterworfene, doppelsträngige Oligonucleotid, das auf die vorstehend beschriebene Weise synthetisiert worden war, verknüpft:

EcoRI Pstl BamHI

5' AATTCAATCCGTCTGCAG 3' 3' GTTAGGCAGACGTCCTAG 5'

Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E.coli MC 1061 unter Erzielung von Ampicillinresistenz zu transformieren. Minipräparationen wurden durch Pstl-Verdauung charakterisiert. Ein Klon mit einem Gehalt an einem 250bp Pstl-Fragment wurde ausgewählt, eine DNA-Präparation im Großmaßstab wurde durchgeführt, und das Plasmid pPS2 wurde isoliert.

C. N-termlnaler Bereich des preS₂-Gens

Der N-terminale Bereich mit dem EcoR I-Linker und den für die ersten 13 Aminosäuren kodierenden Sequenzen wurde aus einem synthetischen Oligonucleotid mit einem Gehalt an der folgenden Sequenz, das auf die vorstehende Weise synthetisiert worden war, erzeugt:

Hindlll EcoRI Pstl

5' AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3' 3'ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAGb'

Dieses Fragment enthielt Hind III- und Pst I-Enden sowie eine EcoRI-Sequenz vor dem ATG. Diese Sequenz wurde in mit Hind III- und Pst l-verdautes und dephosphoryliertes pUC 18 geklont, indem man einen 10fachen Überschuß des Oligonucleotids mit dem Vektor verknüpfte und die Transformanten durch die Anwesenheit einer kleinen EcoRI-Stelle (~75bp) charakterisierte. Ein derartiger Klon wurde mit pTBO-2 A bezeichnet.

Der Mittelbereich des Gens wurde durch Verdauung des Vektors pTBO-2 A mit Pstl und Xba I addiert. Beim Insert handelte es sich um das 250bp Pst-Xba-Fragment von pPS 2. Transformanten wurden durch die Anwesenheit eines >300bp EcoR I-Fragments sowie eines 290bp Xba I/Hindlll-Fragments charakterisiert. Das korrekte Isolat wurde mit pTBO-3 bezeichnet. Das vollständige preS₂-Gen wurde erhalten, indem man das Hind Ill/Xba I-Fragment aus pTBO-3 in mit Xba I/Hind III verdautes pHS 2 B inserierte. Ampicillinresistente Transformanten wurden wie oben durch die Anwesenheit eines 825bp EcoR I-Fragments charakterisiert. Dieser Baustein wurde als pTB04 bezeichnet.

Beispiel Il Konstruktion des Vektors pTB05A

Ein Vektor mit einem Gehalt an dem für preS₂ kodierenden Gen wurde aus den Vektoren pA0804 und pTB04 (Beispiel V bzw. I) aufgebaut. 2 \ig von ρ A 08Ol wurden auf die vorstehend beschriebene Weise mit EcoR I verdaut und mit alkalischer Phosphatase in 30μΙ Reaktionsvolumen (1U Enzym bei 37⁰C1 Stunde in 50 millimolar Tris · HCI, pH-Wert 9,0,1 millimolar MgCI₂,100 mikromolar ZnCI₂,1 millimolar Spermidin) behandelt. pTB04 wurde der EcoRI-Verwendung unterworfen, und ein 825 bp-Fragment, das für preS₂ kodierte, wurde freigesetzt. Dieses Fragment wurde unter Anwendung von präparativer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung von 0,8% Agarose gereinigt. 500 ng des Fragments und 50 ng ρ Α 0804 wurden unter Anwendung der in Beispiel I beschriebenen Methoden verknüpft. Der erhaltene Vektor wurde verwendet, um MC 1061 unter Erzielung von Ampicillinresistenz unter Anwendung des in Beispiel I beschriebenen Verfahrens verwendet. Die DNA wurde unter Anwendung des Verfahrens von Birnboim und DoIy (Nucleic Acids Research, Bd. 7 [1979], S. 1513) isoliert und durch Verdauung mit Pst I charakterisiert. Von einem Klon, der ein 2,1 kb-Pstl-Fragment enthielt, wurde festgestellt, daß er das Insert in der richtigen Orientierung enthielt. Er wurde mit PTB05 A bezeichnet.

Beispiel III Konstruktion der pTB047-Schablone

1 Mg doppelsträngige m 13mp 18-DNA (von Beispiel I) wurde mit EcoR I verdaut und durch Behandlung mit alkalischer

Phosphatase aus Kälberdarm in einem Reaktionsvolumen von 30pl(1U-Enzym 1 Stunde bei 37°C in 50 mülimolar Tris · HCI,

pH-Wert 9,0,1 millimolar MgCI₂,100 pm ZnCI₂,1 millimolar Spermidin) dephosphoryliert. Das 825 bp-EcoR I -Fragment mit einem

Gehalt an dem preS₂-Gen wurde aus pTB04 (vgl. Beispiel I) durch Verdauung mit EcoRI isoliert und anschließend aus 0,8%

präparativem Agarosegel isoliert. 50 ng des m 13mp 18-Vektors und 500 ng des EcoRI-lnserts wurden auf folgende Weise mit

T4-DNA-Ligase verknüpft. Die Reaktion erfolgte in einem 10pe Volumen mit einem Gehalt an 6,6m Tris · HCI, pH-Wert 7,6,

5 millimolar MgCI₂,5 mülimolar Dithiothreit, 1 millimolar ATP und 1 Weiss-Unit T4-Ligase 1 Stunde bei 23⁰C.

Das Ligationsgemisch wurde sodann zur Transformation von E.coli JM103-Zellen, die auf folgende Weise kompetent gemacht

worden waren, verwendet. Eine Kultur in der mittleren logarithmischen Phase (mid-log) (50ml) von E.coli-JM 103-Zellen wurdedurch öminütige Zentrifugation bei 3000U/min und 4^£C in einer klinischen Damon IEC DPR600-Zentrifuge geeriitet und in10 millimolar NaCI gewaschen. Di ι Kultur wurde in 25ml 30 millimolar CaCi₂ 30 Minuten bei O⁰C resuspendiert. Die Zellenwurden sodann auf die vorstehende Weise zentrifugiert und in 2ml 50 millimolar CaCI₂ resuspendiert.

Zur Transformation wurde das Ligationsreaktionsgemisch zu 100μΙ der kompetenten Zellsuspension gegeben und 15 Minuten

auf Eis bei 0°C inkubiert, 5 Minuten einem Wärmeschock von 37"C unterworfen und 5 Minuten bei 23⁰C inkubiert. Die Zellenwurden sodann auf Weichagar mit einem Gehalt an IPTG und X-gal ausgestrichen und auf LB-Meri'um verteilt und bei 37⁰C über

Nacht inkubiert. Sodann wurden Platten einem Screening auf klarePlaques unterworfon. Um festzustellen, welche Plaques das Insert in der korrekten Orientierung aufwiesen, wurde doppelsträr.gige DNA hergestellt,

und separate Verdauungen mit EcoR I und Xba I wurden durchgeführt. Bei einem Produkt wurde festgestellt, daß es das

Initiatormethionin des Inserts nahe am M 13-Universalprimor aufwies und sodann eine Schablone mit einem Gehalt am

gegensinnigen Strang des Inserts erzeugte. Dieses Produkt wurde als pTB047 bezeichnet.

Beispiel IV Konstruktion von pTBO-6 und pHB6 Eine DNA-Sequenz, die für eine 226-Aminosäureform von HBsAg (die S-Form) kodierte, wurde erzeugt, indem man die für ersten

55 Aminosäuren von preS₂ kodierenden 165 bp deletierte. Dies wurde erreicht, indem man die Schablone pTB047 (aus Beispiel

III) der M 13-Primer-gerichteten Deletionsmutagenese unter Verwendung des folgenden Oligonucleotidprimers unterwarf:

EcoRI 5'CGGGTACCGAGCTCGAATTCATGGAGAACATCACAtCAGGS'

Dieses Produkt wurde unter Verwendung des DNA-Synthesegeräts der Firma Applied Biosystems Modell 380A unter Anwendung der Cyanoethylphosphoramiditchemie synthetisiert. Die Mutagenese wurde auf folgende Weise durchgeführt. Eine Mlnlpräparatlon im Großmaßstab wurde auf positiven Plaques, die etwa 7 Stunden in 2 ml LB-Medien inkubiert worden waren, durchgeführt. 25ml der LB-Medien wurden mit 250μΙ frisch gezüchteten JM103-Zellen beimpft. Die Kultur wurde 1 Stunde gezüchtet und mit ΙΟΟμΙ der 7 Stunden alten Plaquekultur beimpft. Die Kultur wurde sodann über Nacht gezüchtet. Anschließend wurde die Kulturzweimal 10 Minuten bei 10000U/min mit einem Sorvall RC-5 B Rotor SS 34 zentrifugiert, um den Überstand zu klären. 3,5ml 20% PEG/2,5m NaCI wurden zu der Kultur gegeben, die dann 5 Stunden bei 4°C inkubiert wurde. Anschließend wurde die Kultur auf die vorstehende Weise 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 2ml TE-Puffer resuspendiert. Anschließend wurde das Pellet mit Phenol (mit TE äquilibriert), einmal mit Phenol/ Chloroform, zweimal mit CHCI₃ und einmal mit Ether extrahiert. 8m LiCI wurde bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,8m zugesetzt. 3 Volumina Ethanol wurden zugesetzt, wonach man die Lösung bei 20°C über Nacht stehen ließ, um die vorhandene DNA auszufällen. Anschließend wurde die Lösung 10 Minuten auf die vorstehend beschriebene Weise bei lOOOOU/minzentrifugiert und mit 70% Ethanol gespült. Der Niederschlag wurde in 150μ110 millimolar Tris · HCI, pH-Wert 7,4 resuspendiert. 1 pMol der M 13-rekombinanten Schablone wurde mit 20 pMol des Oligonucleotidprimers und 1 μΙ der Lösung A vermischt. Destilliertes Wasser wurde bis zu einem Endvolumen von 10μΙ zugesetzt. Die Probe wurde anschließend 5 Minuten bei 65⁰C inkubiert. Sodann wurde die Temperatur 30 Minuten auf 37⁰C gesenkt

Anschließend wurde die Probe mit folgenden Bestandteilen versetzt:

Lösung B	1μΙ
1OmMdATP	1μΙ
1OmMdCTP	1μΙ
1OmMdGTP	1μΙ
1OmMdTTP	1μΙ
5 μ/μΙ Klenow	2μΙ
destilliertes Wasser	3μΙ
	20 μΙ

und mindestens 4 bis 6 Stunden bei 15⁰C inkubiert.

Anschließend wurde die Probe mit destilliertem Wasser 1:40 verdünnt. 5μΙ wurden zur Transformation von 6 Röhrchen mit kompetenten JM 103-Zellen (jeweils 200 μΙ) verwendet. Die transformierten JM 103-Zellen wurden auf LB-Medien mit einem Weichagarüberzug ausgestrichen. Die positiven Plaques wurden sodann durch Filterhybridisierung dem Screening unterworfen. Eine zum Oligonucleotidprimer komplementäre Hybridisierungssonde wurde auf die vorstehend beschriebene Weise synthetisiert. 15 pMol dieser Sonde wurden 10 Minuten bei 65⁰C in einem Gesamtvolumen von 25μΙ inkubiert. 3μΙ 10Χ Kinasepuffer (Maniatis et al.) 10μ110 millimolar ATP und 1 μΙ Polynucleotid-Kinaso (IOOU/μΙ) wurden zugesetzt. Die Probe wurde 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert und sodann über eine mit G-50 Sephadex gepackte Säule gegeben. Der erste von der SrIuIe kommende Peak wurde gesammelt.

Nitrocellulosefilter wurden für die Hybridisierung mit der vorstehenden Sonde vorbereitet, indem man die Filter 5 bis 10 Minuten auf die Transformationsplatten legte und orientierte. Sodann wurden die Filter von den Platten entfernt und 3 Minuten auf einer Denaturierungslösung (1,5m NaCI, 0,5 η NaOH) mit ihrer Rückseite oben auf der Lösung schwimmen gelassen. Die Filter wurden sodann 5 Minuten in die Denaturierungslösung getaucht und anschließend 5 Minuten in eine Neutralisationslösung (1 m Tris · HCI, pH-Wert 8,1,5m NaCI) übertragen. Der neutralisiere Filter wurde sodann 5 Minuten auf 2XSSC (1XSSC = 150 millimolar NaCI, 15 millimolar Natriumeitrat) übertragen. Der Filter wurde an der Luft getrocknet und 1 Stunde unter Vakuum auf 8O⁰C erwärmt. Die Filter wurden 1 Stunde bei 65⁰C in einem verschlossenen Kunststoffbeutel mit einem Gehalt an 5ml Hybridisierungspuffer, 10X Denhardts (1X Denhardts ist 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin), 0,5% SDS und 5XSSPE vorhybridisiert. Der Puffer wurde mit 5 ml/Filter an frischem Hybridisierungspuffer ersetzt. Das vorher hergestellte radioaktive, komplementäre Oligonucleotid wurde zunächst 5 Minuten bei 65⁰C inkubiert, und anschließend wurde eine ausreichende Sondenmenge zum frischen Hybridisierungspuffer, der den Filter enthielt, gegeben, um 1 χ 10^ecpm/ml zu erzeugen. Die Hybridisierung wurde bei 5°C unter der berechneten Schmelztemperatur der Sonde 4 Stunden durchgeführt.

Die Filter wurden sodann dreimal 10 Minuten bei Raumtemperatur jeweils mit 6XSSC gewaschen. Schließlich wurden die Filter einmal mit 6XSSC bei der Hybridisierungstemperatur gewaschen. Sodann wurden die Filter zum Trocknen auf 3 MM Whatman-Papier gelegt. Man ließ die Filter über Nacht auf einen Film (bezüglich der Orientierung markiert) einwirken. Die positiven Plaques wurden jeweils entnommen und getrennt 5 Stunden in 2 ml LB-Brühe bei 37⁰C gezüchtet.

Minischablonenpräparate wurden aus jeder dieser positiver Plaques hergestellt. 1 ml der Plaquekultur wurde in ein Eppendorf-Gefäß übertragen und 5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge Modell 5414 zentrifugiert. 800μΙ des Überstands wurden gewonnen und mit 200μΙ 20% PEG mit einem Gehalt an 2,5m NaCI versetzt. Der Überstand wurde sodann 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 10 Minuten in der Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet wurde in 200 μΙ TE (10 millimolar Tris, pH-Wert 7,4,1 millimolar EDTA) erneut in Lösung gebracht. Das gelöste Pellet wurde sodann mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die Schablonen-DNA der oberen wäßrigen Phase wurde durch Zugabe von LiCI-Lösung bis zum Erreichen einer Li-Cl-Konzentration von 0,8m ausgefällt. 2,5 bis 3 Volumina Ethanol wurden zugesetzt und die Probe wurde 5 Minuten auf Trockeneis gefällt. Der Niederschlag wurde 10 Minuten auf die vorstehend beschriebene Weise zentrifugiert. Mit TE wurde ein Endvolumen von 150μΙ hergestellt.

200μΙ von kompetenten JM 103-Zellen wurden mit dergewonnenen DNA transformiert. 1μΙ einer Vio-Verdünnung der isolierten Phagen-DNA wurde bei der Transformation verwendet. Das Transformationsgemisch wurde ausgestrichen. Die Plaques wurden auf die vorstehend beschriebene Weise mit Oligonuclectiden dem Screening unterworfen. Eine Minipräparation im Großmaßstab wurde mit positiven Plaques durchgeführt, die etwa 7 Stunden in 2 ml LB-Medien inkubiert worden waren. 25μΙ LB-Medien wurden jeweils mit 250μΙ frisch gezüchteten JM103-Zellen beimpft. Die Kultur wurde 1 Stunde gezüchtet und mit 100μΙ der 7 Stunden alten Plaquekultur beimpft. Die Kultur wurde über Nacht gezüchtet und sodann zweimal 10 Minuten bei

10000U/min mit einer Sorvall RC-SB-Zentrifuge mit einem SS34-Rotor zentrifugiert, um den Überstand zu klären. Sodann wurde die Kultur mit 3,5ml 20% PEG/2,5m NaCI versetzt und 5 Stunden bei 4°C inkubiert. Hierauf wurde die Kultur wieder 10 Minuten auf die vorstehend beschriebene Weise zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet in 2 ml TE-Puffer resuspendiert. Anschließend wurde das Pellet mit Phenol extrahiert, mit TE äquilibriert, und sodann einmal mit Phenol/Chloroform, zweimal mit CHCI₃ und einmal mit Ether extrahiert. 8 m LiCI wurde bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,8m zugesetzt. 3 Volumina Ethanol wurden zugesetzt und die Lösung wurde zur Ausfällung der vorhandenen DNA über Nacht stehengelassen. Anschließend wurde die Lösung 10 Minuten auf die vorstehend beschriebene Weise bei 10000U/min zentrifugiert und mit 70% Ethanol gespült. Der Niederschlag wurde in 150μ110 millimolarem Tris-Puffer (pH-Wert 7,4) resuspendiert.

Positive Kolonien wurden durch Kolonienhybridisierung (Grundstein und Hogness, PNAS, Bd.72 [1975], Seite 3961) und unter Anwendung der Didesoxysequenzierung zur Auffindung der M 13-Bausteine mit der korrekten Mutation sequenziert. RF-DNA wurde unter Anwendung der alkalischen Lysismethode von Maniatis et al. gewonnen. Ein 678 bp-EcoR I-Fragment wurde auf einem 0,8% präparativen Agarosegel isoliert und in pA0804 und ρA0811 (vgl. Beispiel V bzw. Vl) subkloniert. E. coli MC 1061-Zellen wurden gemäß Beispiel I mit jedem der beiden Vektoren transformiert. Transformanten mit der richtigen Orientierung wuraen durch Xbal-Verdauung von DNA-Mimipräparationen (ebenfalls gemäß Beispiel I) identifiziert. Eine von ρ Α 0804 abgeleitete Transformante wurde mit pTB06 bezeichnet, während eine von ρA0811 abgeleitete Transformante mit pHB6 bezeichnet wurde.

Beispiel V Konstruktion von ρA0803 und pA0804

pA0804 ist ein Vektor, der zum ortsspezifischen Aufbrechen der P. pastoris AOX1-Stelle in der Lage ist. Er enthält folgende Elemente: den AOX1 -Promotor und -Transkriptionsterminator, getrennt durch eine einzige EcoRI-Klonierungsstelle; das Wildtyp-Pichia-HIS4-Gen; ein DNA-Genomsegment vom 3'-Ende der AOX1 -Stelle stromabwärts vom Transkriptionsterminator; Sequenzen, die zur Selektion und Replikation in einem bakteriellen Wirt erforderlich sind. Die Komponenten werden so angeordnet, daß ein Restriktionsverdauungsprodukt des Vektors ein DNA-Fragment freisetzt, das die Expressionskassette und selektive Marker, deren Enden homolog zu einem kontinuierlichen Bereich des Genoms, der AOX1 -Stelle, sind und in stabiler Weise bei der Transformation in das Chromosom inseriert werden können.

pA0804 ist ein Derivat des Hepatitis B-Oberflächenantigen-Expressionsplasmids pBSAGI5l (NRRL 18021). Es wurde in einem Plasmid auf der Basis von pBR 322 mit folgenden Modifikationen aufgebaut. pBR 322 wurde mit EcoRI verdaut, wonach sich eine Phenolextraktion und eine Ethanolfällung anschlossen. Die Enden wurden sodann unter Verwendung von Klenow-Polymerase gefüllt. 2pg von mit EcoRI verdautem pBR 322 wurden 15 Minuten in einem 25μΙ Reaktionsvolumen mit einem Gehalt an 50 rr.illimolar Tris · HCI, pH-Wert 7,2,10 millimolar MgSO₄,100pm Dithiothreit, 50pg/ml Rinderserumalbumin, 100pm dATP, 100 pm dTTP und 1 Unit Klenow-Polymerase inkubiert. Im Anschluß an die Phenolextraktion und Äthanolfällung wurde die DNA zum Schließen des Plasmids verknüpft. Das Ligationsreaktionsprodukt wurde zur Transformation von E. coli MC 1061 verwendet. Die Transformanten wurden einem Screening in bezug auf die Abwesenheit der EcoRI-Stelle sowie auf die Anwesenheit von diagnostischen Stellen, wie Pstl, Pvull und Sail, unterworfen. Ein derartiges Plasmid wurde als pBR322-RI bezeichnet. Dieses Plasmid wurde ferner zum Einbau einer Bglll-Stelle an der Pvull-Stelle modifiziert. Das Plasmid wurde mit Pvull verdaut. Phosphorylierte Bglll-Linker (GAGATCTC) wurden in stumpfendiger Verknüpfung zugesetzt. Die überschüssigen Linker wurden durch Bglll-Verdauung über Nacht entfernt, und das Plasmid wurde unter Verwendung von T4 DNA-Ligase geschlossen. Das Ligationsreaktionsprodukt wurde zur Transformation von E. coli MC 1061 zur Erzielung von Ampicillinresistenz verwendet. Die Transformanten wurden durch Restriktionsverdauung mit BgIII zum Nachweis der Anwesenheit einer Bglll-Stelle und mit einem Sall/Bglll-Verdauungsprodukt zum Nachweis, daß die Bglll-Stelle sich an der früheren Pvull-Stelle befand, charakterisiert. Das Plasmid wurde als pBR322 BgIII-RI bezeichnet.

pA0804 und pA0811 wurden durch Einfangen von DNA-Fragmenten aus pBSAGI5l und Zusammenbau in pBR322 BgIII-RI geschaffen. Das 3'-Zielsegment der AOX1-Stelle wurde von pBSAGI5l als ein 700bp Bglll/Xhol-Fragment entfernt, wovon 50 ng mit 5ng des Ausgangsplasmids, das mit Sail und BgIII verdaut worden war, verbunden wurden. Das Ligationsreaktionsprodukt wurde zur Transformation von E. coli MC 1061 zur Erzielung von Ampicillinresistenz verwendet. Die Transformanten wurden durch eine BamHI/Bglll-Verdauung der DNA-Minipräparation, wie in Beispie! I beschrieben, charakterisiert, wobei ein Fragment von etwa 900bp beobachtet wurde. Eine derartige Transformante wurde ausgewählt und die DNA in großem Maßstab gereinigt. Dieses Plasmid wurde mit pA0801 bezeichnet.

Das Plasmid pBSAGI5l wurde mit CIaI verdaut, und ein 2,1 Kb-Fragment mit einem Gehalt an der Promotor-Gen-Terminator-Expressionskassette wurde isoliert. 2 \ig von pA0801 wurden mit CIaI verdaut und mit alkalischer Phosphatase in einem Reaktionsvolumen von 30 μΙ (1U Enzym bei 37 ⁰C1 Stunde in 50 millimolar Tris · HCI, pH-Wert 9,0,1 millimolar MgCI₂,100 pm ZnCI₂,1 millimolar Spermidin) behandelt. 50ng des Clal-Fragments wurden mit 5ng des pA0801 -Vektors verknüpft, und das Ligationsreaktionsprodukt wurde zur Transformation von E. coli MC 1061 zur Erzielung von Ampicillinresistenz verwendet. Die Kolonien wurden durch Bglll-Verdauung charakterisiert, um festzustellen, daß das Fragment inseriert war und sich in der richtigen Orientierung unter Bildung eines Spektrums von 2,3 und 2,7kb-Fragmenten befand. Diese einzelne Transformante mit pA0802 bezeichnet.

Das Plasmid pA0802 wurde an der einzigen Stul-Stelle am 3'-Ende des Hepatitis B-Oberfächenantigen-Gens verdaut. EcoRI-Linker wurden phosphoryliert, getempert und mit dem Stul-verdauten Plasmid verknüpft. Überschüssiger Linker wurde durch Verdauung über Nacht mit EcoRI entfernt. Das EcoRI-Verdauungsprodukt schneidet auch am 5'-Ende des HBsAg-Strukturgens und entfernt damit das Gen. Nach Religation wurden der Promotor und der Transkriptionstorminator durch eine einzige EcoRI-Klonierungsstelle verbunden. Ampicillinresistenie Transformanten wurden wiederum durch Bglll-Verdauung charakterisiert. Eine Transformante mit dem korrekten Spektrum (2,3 Sl 2,1 kb) wurde identifiziert und mit pA0803 bezeichnet.

Das Plasmid ρA0803 wurde mit BamHI verdaut, und das 2,7 kb Bglll-Fragment aus ρYM10 (Fig.8) wurde durch präparative Agarosegel-Elektrophorese isoliert und mit dem BamHI-verdauten, dephosphorylierten pA0803 verknüpft (pYM 10 ist ein Derivat von pYJ 30 (NRRL B-15890), wobei die BamHI-Stelle in Position 2959 zerstört ist.) Transformanten wurden durch die Anwesenheit einer Xbal-Stolle unter Bildung eines Fragments von 7,4kb und einem Bglll-Spektrum von 2,3 und 5,1 kb charakterisiert. Dieses Plasmid wurde mit pA 0804 bezeichnet.

Beispiel Vl Konstruktion von pA0811

Ein zweites verwandtes Plasmid mit einem Gehalt an dem Saccharomyces ARG4-Gen anstelle des Pichia HIS4-Gens wurde ebenfalls konstruiert. Eine mögliche Quelle für das ARG 4-Gen ist das 2,0 kb Hpal-Fragment aus pYM 25, einem Plasmid in einem

E. coli-Wirt, NRRL B-18015. Dieser Stamm ist beim Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois erhältlich.

Das Fragment wurde aus 0,8% präparativem Agarosegel gereinigt. 500 ng des Fragments wurden mit 50ng BamHI-verdautem, gefülltem ρA0803 (vgl. Beispiel V) verknüpft. Das Ligationsreaktionsprodukt wurde zur Transformation von E.coli MC 1061 zur Erzielung von Ampicillinresistenz verwendet. Transformanten wurden durch Bglll-Verdauung charakterisiert. Die korrekte Insertgröße wurde durch Elektrophorese an Agarosegel bestätigt. Dieses Plasmid wurde mit pA0811 bezeichnet.

Beispiel VII Hefo-DNA-Minlprfiparatlon

10⁴ Zellen/ml wurden in 5 ml YPD bei 30°C über Nacht gezüchtet und sodann unter Verwendung einer DAMON IEC DPR600-Klinikzentrifuge 5 Minuten bei 3000U/min pelletisiert. Das Pellet wurde in 0,5ml 1 m Sorbit, 0,1 ml 0,5m EDTA₁ pH-Wert 7,5 resuspendiert und die Probe wurde in 1,5ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen 0,02ml von 2,5mg/ml Zymolase 60 000 (Miles Laboratories) wurden zugesetzt und die Probe wurde 60 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Die Zellen wurden unter Verwendung der Mikrozentrifuge 1 Minute bei hoher Geschwindigkeit pelletisiert und in 0,5ml 50 millimolarem Tris · HCI, pH-Wert 7,4 und 20 millimolar EDTA resuspendiert. 0,05ml 10% SDS wurden zugesetzt, die Probe wurde vermischt und 30 Minuten bei 65⁰C inkubiert. 0,2 ml 5m Kaliumacetat wurde züge setzt, und die Probe wurde 60 Minuten auf Eis inkubiert. Sodann wurde die Probe nochmals 5 Minuten bei hoher Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert.

Der Überstand wurde in ein frisches, 1,5ml fassendes Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, und 1 Volumenteil Isopropanol wurde bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Probe wurde vermischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur zum Absetzen gebracht und sodann kurz 10 Sekunden) mit hoher Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und das Pellet an der Luft getrocknet. Nach Resuspendieren des Pellets in 0,3 ml 10 millimolar Trie · HCI, pH-Wert 7,4 und 1 millimolar EDTA wurden 15μΙ einer 1 mg/ml-Lösung von pankreatischer RNase zugesetzt, und die Probewurde 30 Minuten bsi 37⁰C inkubiert. 0,03ml 3m Natriumacetat wurde zugesetzt, die Probe wurde vermischt, und 0,2ml Isopropanol wurden zugesetzt. Sodann wurde die Probe zur Pelletisierung der DNA bei hoher Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgegossen, das Pellet getrocknet und in 0,1 bis 0,3ml 10 millimolarem Tris · HCI, pH-Wort 7,4 und 1 millimolar EDTA resuspendiert (Anmerkung: vor Einsatz der DNA in einem Restriktionsverdauungsprodukt kann es erforderlich sein, die Lösung 15 Minuten bei hoher Geschwindigkeit in der Mikrozentrifuge zu zentrifugieren, um etwaiges unlösliches Material, das die Verdauung hemmen kann, zu entfernen).

Beispiel Viii

Entwicklung von Mlschtellchen-Stfimmen

Zwei Mischteilchen-Stämme mit einem Gehalt an den Expressionskassetten, die für die S (p24)- und preS₂ (p31)-Formen von Hepatitis B-Oberflächenantigen kodieren, wurden auf folgende Weise konstruiert. Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) wurde mit 1 Mg ungeschnittenem pHB 6 unter Anwendung der Sphäroplastentransformationstechnik von Cregg et al, Bio/Technology, Bd. 5 (1987), Seite 479 transformiert (pHB6 ist ein Subklon von pA0811 mit einem Gehalt an dem in den Beispielen IV und Vl beschriebenen S-Gen). Transformanten mit Argininprototrophie wurden an Minimalmedien mit einem Gehalt an Histidin rt ieneriert und auf folgende Weise einem Screening in bezug auf die Integrationsstelle unterworfen.

DNA aus diesen Transformanten und von Wildtyp-Pichia pastoris wurden gemäß Beispiel VII hergestellt, mit EcoRI verdaut und der Elektrophorese an 0,8% Agarose unterworfen.

Southern-Blots dieser DNAs wurden durchgeführt (Maniatis et al., 1983). Die Filter wurden mit einer AOX1-spezifischen Sonde (pPG 4.0 NRRL# 15868) oder mit einer HIS 4-spezifischen Sonde (pYM 4) hybridisiert. pYM 4 ist in Beispiel I beschrieben. Die Integrationsstelle wurde durch Vergleich des Hybridisierungsspektrums einer gegebenen Transformante mit dem Wildtyp-Stamm bestimmt. Eine Veränderung der Größe der Wildtypbande war ein Beweis für eine Integration an dieser Stelle. Die Transformante mit einer Integration am 5'·Ε η de der AOX1-Stelle, die aber noch ein Wildtyp AOX1-Gen sowie eine HIS4-Mutation enthielt, wurde-mit PPF1/pHB6 bezeichnet.

Dieser Stamm wurde sodann auf die vorstehend beschriebene Weise mit Bglll-geschnittenem pTB05A (aus Beispiel II) transformiert. Transformanten mit Histidinprototrophie wurden auf Minimalmedien regeneriert und einem Screening in bezug auf den „methanol slow" (Mut-)-Phänotyp unterworfen, was sine Integration an der AOX1 -Stelle anzeigte. Das Screening in bezug auf diesen Phänotyp wurde auf folgende Weise durchführt.

Transformanten wurden durch Abkratzen der Platte in Gegenwart von sterilem destilliertem Wasser vereinigt und 15 Sekunden der Ultraschallbehandlung bei niedriger Leistung unterworfen. Anschließend wurden sie auf A₆₀O = 0,1 verdünnt und in Verdünnungen von 10~³ und 10~⁴ doppelt auf Minimalplatten mit einem Gehalt an Glycerin als Kohlenstoffquelle ausgestrichen und 2 bis 3 Tage bei 30°C inkubiert. Sodann wurden sie der Replikaplattierung auf Minimalplatten, denen 100μΙ Methanol in der Dampfphase zugesetzt wurde, unterworfen. Nach 24stündiger Inkubation bei 3O⁰C zeigte sich, daß 10 bis 20% der Transformanten auf Methanol langsamerwuchsen als der Rest der Transformanten. Zehn dieser langsam wachsenden Kolonien wurden sodann für die weitere Analyse ausgewählt. Sie wurden von der Glycerin enthaltenden Minimalplatte abgenommen, gemäß Beispiel IX in Schüttelkolben gezüchtet und gemäß Beispiel Xl auf die Aktivität an 22 nm-ähnlichen Teilchen getestet. Die Transformanten wurden, wie vorstehend für pHB6 beschrieben, charakterisiert. Ein erhaltener Stamm wurde mit PPF1/pTB012-1 bezeichnet. Er exprimierte eine Kopie des ρ24- und des p31-Proteins.

Es wurde ein weiterer Stamm identifiziert, in dem zwei Kopien der preS₂-Expressionskassette integriert waren. Er wurde als PPF1 /ptB012-2 bezeichnet. Er exprlmierte zwei Kopien des preS₂-Gens und eine Kopie des S-Gens. Der Teilchenexpressionsgrad ist in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III Stamm Kassette Proteine Teilchenexpressionsgrad (AUSRIA)"

	1 preS₂	ρ 31	-150-200
PPF1/pTB012-1	1S	ρ 24	pg Teilchen/ml Lysat

	2 preS₂	p31	-150-200
PPFVpTB 012-2	1S	ρ 24	pg Teilchen/ml Lysat

Ferner ergab die SDS/PAGE-Analyse und die Silberfärbung eines partiell gereinigten Proteinpräparats die Anwesenheit von ρ 24 und ρ 31.

Beispiel IX Schuttelkolben-Expressionsuntersuchungon

Vor der Fermentierung wurden sämtliche Stämme auf folgende Weise in Schüttelkolben gezüchtet, um den Expressionsgrad zu ermitteln. Routinemäßig wurde eine Transformante in 0,67% Hefe-Stickstoffbase mit einem Gehalt an 2 bis 5% Glycerin überimpft und über Nacht bei SO⁰C bis zum Erreichen der mittleren bis späten logarithmischen Phase gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen durch 5minütige Zentrifugation bei 3000U/min unter Verwendung einer Damon IEC DPR600-Klinikzentrifuge gewonnen. Das Pellet wurde zweimal in sterilem Wasser gewaschen, sodann in einer Dichte von 0,5 Aeoo-Einheiten/m! auf 0,67 % YNB mit einem Gehalt an 1 % Methanol überimpft und 4 bis 6 Tage bei 30°C unter mäßigem Schütteln 4 bis 6 Tage geschüttelt. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquotsmengen von 5OAeoo-Einheiten entfernt und bei -20°C gelagert. Proteinextrakte wurden aus diesen Aliquotmengen hergestellt und für eine AUSRIA^R-Analyse (vgl. Beispiel Xl) und eine Western-Blot-Analyse (Tobin et al., PNAS, Bd.76/1979), S.4350) verwendet. Als Antikörper wurde Charge Nr.702106 von Calbiochem in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet. Aliquotanteile der Zellen (lOOAeoo-Einheiten) wurden auf 13x 100mm Borsilikat-Kulturröhrchen übertragen und zweimal durch Zentrifugation in einer Sorvall-Zentrifuge Modell RC-5B bei 12000U/min mit 20 Volumonteilen Lysispuffer (0,5 m NaCI, 0,1 % Triton X-100 [Gew./Vol.], 1 m Phenylmethylsulfonylfluorid und 10 millimolar Natriumphosphat, pH-Wert 7,5) gewaschen. Zellproben wurden mit 0,5g säuregewaschenen Glasperlen (0,5ml) plus 0,35ml Lysispuffer resuspendiert und 8mal 1 Minute mit einem Wirbelmischer mit maximaler Geschwindigkeit bewegt. Zwischen den Mischvorgängen wurde das Gemisch mindestens 1 Minute auf Eis gekühlt. (Nach beendeter Lysis wurde die Lösung der aufgebrochenen Zellen entfernt, die Glasperlen wurden mit 0,35ml Lysispuffer gewaschen, und die beiden Lösungen wurden vereinigt und unter Verwendung der Sorvall RC-5B-Zentrifuge bei 4°C und 13000U/min zur Entfernung von Zellbruchstücken zentrifugiert) Proteinproben wurden sodann durch AUSRIA^R und Western-Blot-Analyse getestet. Die Proteinkonzentration wurde gemäß dem Lowry-Verfahren nach Fällung mitTrichloressigsäure bestimmt.

Beispiel X Fermentations-Expressions-Untersuchungen

Fermentationen wurden auf folgende Weise durchgeführt. 500ml Hefe-Stickstoffbase (YNB) +2% Glycerin wurden in einem Fernbach-Kolben von einer Anzuchtkultur oder einer Minimalglukoseplatte der Kultur beimpft (die Platten lassen sich durch monatliche Passage ohne nachweisbare Beeinträchtigung der Stämme erhalten). Nach eintägigem Schütteln bei 200 U/min und 30°C wurde das Inoculum auf 7,5 Liter Minimalmedium (Tabelle IV) mit einem Gehalt an 480g Glycerin, 40mg Biotin und 40ml Spurensalzlösung (Tabelle V) überimpft. Der Fermenter wurde bei 3O⁰C und einem pH-Wert von 5,5 belassen, wobei die Kultur in einem absatzweisen Verfahren bis zum Verbrauch des Glycerins (etwa 24 Stunden) wuchs. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von NH₃-GaS kontrolliert. Der Glycerinverbrauch wurde durch einen scharfen Abfall der CO₂-Entwicklung und einen scharfen Anstieg des gelösten Sauerstoffs (oder Abnahme der Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit) festgestellt. Eine Methanolzufuhr wurde in einer Geschwindigkeit von 18 ml/h begonnen, um den Fermenter auf eine Konzentration von - 0,5% MeOH zu bringen. Diese Konzentration wurde beibehalten. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf der Grundlage der tatsächlichen Geschwindigkeit des Methanolverbrauchs eingestellt. Aliquotanteile von 20ml an Spurensalzen wurden in Abständen von etwa 2 Tagen zugesetzt, um die Geschwindigkeit des Methanolverbrauchs aufrecht zu erhalten. Die Konzentration an HBsAg stieg bei der Methanolzufuhr etwa 3 Tage an.

Tabelle IV	Glycerin
	Biotin
Zusammensetzung des Mediums (7,5 Liter)	H₃PO₄ (85%)
480 g	CaSO₄-2H₂O
40 mg	H₂SO₄
134ml	MgSO₄-7H₂O
5.8 g	KOH
92 g
75g
21g

Tabelle V	0,06
IMt-Spurensalzlösung	0,08
Kupfer(ll)-sulfat-6H]0	0,30
Kaliumiodid	0,20
Mangansulfat-H₂O	0,02
Natriummolybdat	2,00
Borsäure	4,8
Zinksulfat -H₂O	5,00 ml/Liter
Eisen(lll)-chlorid-H₂O
Schwefelsäure

Beispiel Xl AUSRIA^RRIA-Protokoll

Die Abbott AUSRIA^R-Testpackung wurde zur Messung der Menge an HBsAg, die durch das Pichia-Produktionssystem synthetisiert worden war, verwendet. Der in der Tentpackung enthaltene Antikörper bindet HBsAg-Teilchen aber nicht HBsAg-Monomere. Sämtliche Verdünnungen wurden in 1,0% Rinderserumalbumin, 0,02% Natriumazid in phosphatgepufferter Kochsalzlösung von pH-Wert 7,4 vorgenommen. Das Verfahren entsprach im wesentlichen den Angaben in der Packungsbeilage. Die Eichkurve wurde folgendermaßen aufgestellt.

Röhrchen-Nr.	ng im Test	Puffer (μΙ)	AA	BB	CC	DD	Positive Kontrolle (μΙ)
1-4	kein NSB	ohne	1	2	3	4	200 nur Puffer
5-6	0,1	195	5	6	7	8	5
7-6	0,2	190	9	10	11	12	10
9-10	0,5	175	13	14	15	16	25
11-12	1,0	150	17	18	19	20 usw.	50
13-14	2,0	100		100
15-16	3,0	50		150
17-18	4,0	ohne		200








	Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden folgendermaßen mr iert:

1
2
3
4
5

In die einzelnen Vertiefungen wurden zunächst die Perlen, anschließend der Puffer und schließlich der Standard (Positivkontrolle) oder die verdünnte Probe gegeben. Unbekannte Proben wurden verdünnt, um Signale im Bereich der Eichkurve zu erhalten. Schätzwerte der Prob6nverdünnungen in mg/ml wurden typischerweise durch 0,02 dividiert, um die anzuwendende Verdünnung zu erhalten. Im allgemeinen wurden 100 μΙ der Probezu einer Vertiefung mit einem Gehalt an 100 μΙ Puffer gegeben. Die Vertiefungen wurden abgedeckt. Sodann wurde vorsichtig mit dem Tablett auf den Labortisch geklopft. Die Proben wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um eine maximale ßindungswirkung zu erreichen. Am nächsten Tag wurden die einzelnen Vertiefungen 4mal mit entionisiertem Wasser unter Verwendung des Pentawash-System der Firma Abbott Laborotories gewaschen. 200μΙ des ¹²⁶J-anti-Hbs wurden in jede Vertiefung gegeben, das Tablett wurde vorsichtig angestoßen und sodann 1 Stunde bei 45°C im Wasserbad inkubiert. Die Perlen wurden zunächst gewaschen und dann ausgezählt. Die Konzentrationen der unbekannten Proben wurdon aus der Eichkurve ermittelt.

Claims

1. Verfahren zur Bildung von antigenen HBV-Teilchen, die im wesentlichen aus S- und preS₂-Proteinen bestehen, gekennzeichnet durch

a) Transformieren einer methylotrophen Hefe mit mindestens einer Expressionskassette, die ein strukturelles Gen für S enthält, das operativ mit einem regulatorischen Bereich und einer 3'-Terminationssequenz verknüpft ist, und mindestens einer Expressionskassette, die ein strukturelles Gen für preS₂ enthält, das operativ mit einem regulatorischen Bereich und einer 3'-Terminationssequenz verknüpft ist, und anschließend

b) Züchten des erhaltenen transformierten Hefestammes unter geeigneten Bedingungen zur Bildung des HBV-Teilchen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit mindestens einem Vektor aus der Gruppe Plasmide und lineare, integrative, ortsspezifische Vektoren durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektoren integrativ sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein erster integrativer, ortsspezifischer Vektor, derfolgende Bestandteile in serieller Anordnung enthält,

i) ein erstes inserierbares DNA-Fragment,

ii) ein Markergen und mindestens eine Expressionskassette, die ein strukturelles Gen für preS₂ enthält, das operativ mit einem regulatorischen Bereich und einer 3'-Terminationssequenz verknüpft ist und

iii) ein zweites inserierbares DNA-Fragment,
wobei die Reihenfolge des Markergens und der Kassette von Komponente (ii) vertauscht sein kann;

b) und ein zweiter integrativer Vektor verwendet werden, der folgende Bestandteile enthält: i) mindestens ein erstes inserierbares DNA-Fragment, ii) ein Markergen und mindestens eine Expressionskassette, die ein strukturelles Gen für S enthält, das operativ mit einem regulatorischen Bereich und einer 3'-Terminationssequenz verknüpft ist,
wobei die Reihenfolge des Markergens und der Kassette von Komponente (ii) vertauscht sein kann.

5. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das inserierbare DNA-Fragment von der DNA-Sequenz eines Gens, das aus Pichia pastoris isoliert und aus der Gruppe AOX1, ρ40, DHAS und HIS4 ausgewählt ist, abgeleitet ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Expressionskassette folgende Bestandteile enthält:

a) einen regulatorischen Bereich, ausgewählt aus der Gruppe ACX1, ρ40, DHAS, isoliert von Pichia pastoris, saure Phosphatase, Galactokinase, Alkohol-dehydrogenase, Cytochrom c, a-Mating-Faktor und Glycerinaldehyd-S-phosphat-dehydrogenase, isoliert aus Saccharomyces cerevisiae, operativ verknüpft mit

b) einem strukturellen Gen für preS2, operativ verknüpft mit

c) einer 3'-Terminationssequenz aus Pichia pastoris, ausgewählt unter den aus dem AOX1-Gen, p40-Gen, DHAS-Gen und HIS4-Gen isolierten 3'-Terminationssequenzen.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Expressionskassette folgende Bestandteile enthält:

a) einen regulatorischen Bereich, ausgewählt aus der Gruppe AOX1, ρ40, DHAS, isoliert von Pichia pastoris, saure Phosphatase, Galactokinase, Alkohol-dehydroganase, Cytochrom c, a-Mating-Faktor und Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, isoliert aus Saccharomyces cerevisiae, operativ verknüpft mit

b) einem strukturellen Gen für S, operativ verknüpft mit

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Markergen unter HIS4 und ARG 4, isoliert aus Pichia pastoris, SUC2, isoliert aus Saccharomyces cerevisiae und Neomycin-Gen von Tn 903 und Tn 601 ausgewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Markergene unterschiedlich sind und unabhängig voneinander ausgewählt sind.

10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß derdaspreS2-Strukturgen enthaltende Vektor folgende Bestandteile enthält:

a) ein erstes inserierbares DNA-Fragment, das etwa 1 Kilobase des 5'-AOX1-Regulationsbereichs, isoliert aus Pichia pastoris, darstellt, operativ verknüpft mit

b) einem strukturellen Gen für preS2, operativ verknüpft mit

c) der 3'-Terminationssequenz von AOX1, isoliert aus Pichia pastoris, verknüpft mit

d) einem Markergen, bei dem es sich um HIS4, isoliert aus Pichia pastoris, handelt, verknüpft mit

e) einem zweiten inserierbaren DNA-Fragment, bei dem es sich um etwa 0,65 Kilobasen der 3'-AOX 1-Terminationssequenz handelt.

11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der das preS 2-Strukturgen enthaltende Vektor folgende Bestandteile enthält;

a) ein inserierbares DNA-Fragment, das etwa 1 Kilobase des 5'-AOX1-Regulationsbereichs, isoliert aus Pichia pastoris, darstellt, operativ verknüpft mit

b) einem strukturellen Gen für S, operativ verknüpft mit

d) einem Markergen, bei dem es sich um ARG 4, isoliert aus Saccharomyces cerevisiae, handelt, verknüpft mit

e) einem inserierbaren DNA-Fragment, bei dem es sich um etwa 0,65 Kilobasen der 3'-AOX1-Terminationssequenz handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des integrativen Vektors serieller Anordnung folgende Bestandteile angeordnet werden:

a) mindestens ein inserierbares DNA-Fragment, bei dem es sich um einen operativen regulatorischen Bereich des 5'-AOX 1-Gens mit einer Länge von etwa 1 Kilobase, isoliert aus Pichia pastoris, handelt, operativ verknüpft mit

b) einem Strukturgen für S, operativ verknüpft mit

d) einem Markergen, bei dem es sich um aus Pichia pastoris isoliertes ARG 4 handelt, verknüpft mit

13. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Pichia pastoris PPF1/pTB012-1 gebildet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Pichia pastoris PPF 1/pTB02-2 gebildet wird.