FI107265B - Hepatiitti B:n S- ja PreS2-proteiinien ilmentäminen metylotrofisissa hiivoissa - Google Patents

Hepatiitti B:n S- ja PreS2-proteiinien ilmentäminen metylotrofisissa hiivoissa Download PDF

Info

Publication number
FI107265B
FI107265B FI992546A FI19992546A FI107265B FI 107265 B FI107265 B FI 107265B FI 992546 A FI992546 A FI 992546A FI 19992546 A FI19992546 A FI 19992546A FI 107265 B FI107265 B FI 107265B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gene
isolated
aox1
dna
pichia pastoris
Prior art date
Application number
FI992546A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI19992546A (fi
Inventor
Gregory Patrick Thill
Original Assignee
Res Corp Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Res Corp Technologies Inc filed Critical Res Corp Technologies Inc
Publication of FI19992546A publication Critical patent/FI19992546A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI107265B publication Critical patent/FI107265B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

107265
Hepatiitti B:n S- ja PreS2 -proteiinien ilmentäminen metylot-rofisissa hiivoissa 5 Tämä hakemus on jakamalla erotettu kantahakemuksesta 892312.
Tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA-teknologian aluetta. Yhdeltä näkökannalta tämä keksintö koskee menetelmää antigeenisten partikkelien tehostetuksi ilmentämiseksi, jotka sisäl-10 tävät pääasiallisesti hepatiitti B:n S-proteiinin ja preS2- proteiinin, metylotrofisissä hiivoissa. Toiselta näkökannalta esillä oleva keksintö koskee uusia DNA-molekyylejä ja niillä transformoituja uusia hiivakantoja.
15 Hepatiitti B -virus (HBV) aiheuttaa sekä akuutteja että kroonisia sairauksia ja muodostaa maailmanlaajuisen kansanterveysongelman. HBV ilmenee kroonisesti heikentävänä infektiona, joka voi johtaa koko ajan pahenevaan vakavaan maksavaurioon, primäärikarsinoomaan ja kuolemaan. Useimmissa tapauksissa po-20 tilaat toipuvat täydellisesti HBV:stä. Merkittävä osa HBV:llä infektoituneesta populaatiosta kehittyy kroonisiksi taudin- *:* kantajiksi, mikä mahdollistaa taudin tarttumisen muihin.
« « · · - < · • · · « · · ι·ι· : Viimeaikaiset edistysaskeleet DNA-tekniikoissa ovat tuoneet « · - .':2J5 käyttöön monia käyttökelpoisia menetelmiä HBV:n geneettisen • « « rakenteen selvittämiseksi kuin myös keinojen tuottamiseksi • · · * rokotteiden valmistukseen HBV:tä vastaan. HBV:n genomin tiedetään tällä hetkellä koostuvan suunnilleen 3,2 kiloemäsparia • · · *·' * sisältävästä osittain kaksois juos teisestä DNA: sta, johon DNA- • · · :.:3U polymeraasi on kovalenttisesti liittynyt, kooltaan 27 nm:n nukleokapsidin sisällä. Nukleokapsidia verhoaa lipoproteiini- kuori, joka koostuu solulipideistä ja hepatiitti B:n pinta- antigeeneistä (HBsAg); tätä nimitetään virioniksi, jonka *.* * halkaisija on 42 nm.
» · • · · *.35
On myös havaittu, että viruksen kuori koostuu kolmesta erilaisesta mutta läheisesti toisiaan muistuttavasta pintaprote- 107265 2
Unista. Näitä proteiineja nimitetään yleisesti S-, PreSa-ja PreSi-proteiineiksi. Jokainen virioni käsittää 300-400 S-proteiinimolekyyliä ja 40-80 preS=- ja preSi-proteiinimole-kyyliä.
5 S-proteiini sisältää 226 aminohappoa, ja se on normaalin viraalisen lipoproteiinikuoren pääkomponentti. S-proteiini käsittää suunnilleen 24-25 kilodaltonia (kDa), ja sitä voidaan nimittää P24:ksi tai P25:ksi. S-proteiini voidaan myös 10 glykosyloida 27-28 kilodaltonia käsittäväksi glykoproteiinik-si, joita nimitetään GP27:ksi tai GP28:ksi.
Toinen HBsAg-proteiini on PreSÄ-pinta-antigeeni, jota nimitetään myös HBsAg-keskipolypeptidiksi. PreSs* käsittää 281 ami-15 nohappoa, jotka muodostuvat lisättäessä 55 aminohappoa S- proteiinin N-päähän. PreSs-proteiini käsittää suunnilleen 31 kilodaltonia, ja sitä voidaan nimittää P31-proteiiniksi. PreS=-proteiini sisältää kaksi glykosyloitunutta muotoa, 33 kilodaltonia ja 36 kilodaltonia, joita nimitetään vastaavasti 20 GP33:ksi ja GP36:ksi. Tämän antigeenin ajatellaan tuovan esiin antigeenisen lisävasteen henkilöissä, jotka eivät rea-goi S:ään, tai jotka reagoivat heikosti S:ään.
; Kolmas HBsAg-proteiini on PreS*-pinta-antigeeni, jota myös “•25 nimitetään myöhäiseksi HBsAg-polypeptidiksi. PreSx käsittää '.· : aminohappoja välillä 389-400 (riippuen HBV:n antigeenisestä « · 4 *.· · alalajista). PreSa;lle ominainen sekvenssi käsittää 108-119 aminohappoa, joka sekvenssi on lisätty täydellisen PreS3-proteiinin N-päähän. PreS*.-proteiini käsittää suunnilleen 43 30 kilodaltonia, ja sitä voidaan myös nimittää P43-proteiiniksi. • t PreSi esiintyy myös 46 kilodaltonia käsittävässä glykosyloi- dussa muodossa, jota nimitetään GP46-glykoproteiiniksi.
• · ;*·*. HBV-infektion edetessä, kokonaiset virusnukleokapsidit ovat .·. : 35 verhoutuneina lipoproteiinikuoreen, muodostaen kooltaan 42 « · · nm:n partikkeleita. HBV-infektion aikana muodostuu myös tyh- 107265 3 jiä 22 nm:siä partikkeleita, jotka käsittävät enimmäkseen £-ja preS=-proteiineja, ja jonkin verran preSx-proteiineja. Samalla kun kokonainen virusnukleokapsidi on tarttuva, kooltaan 22 nm:set tyhjät partikkelit eivät ole tarttuvia. Tyhjät S partikkelit saavat kuitenkin aikaan immuunivasteen, joka riittää antamaan immuniteetin, ja joita voidaan käyttää HBV-rokotteiden valmistukseen.
Hepatiitti B -rokotteita, valmistettuina 22 nm:n partikkelien 10 avulla todenperäisesti, valmistettiin HBV:tä kantavien ihmisten plasmasta. Ihmisen plasmasta saatavat 22 nm:n partikkelit on valitettavasti perusteellisesti puhdistettava infektiivis-ten HBV-partikkelien, kuin myös kaikkien muiden plasmaperäis-ten patogeenien poistamiseksi. Hepatiitti B -rokotteen val-15 mistaminen on lisäksi ollut äärimmäisen rajallista, johtuen ihmisplasman rajoitetusta saatavuudesta.
Käyttämällä hyväksi yhdistelmä-DNA -teknologiaa, on ollut mahdollista ilmentää hepatiitin S-proteiinia 22 nm:n partik-20 kelissä esimerkiksi transformoiduissa nisäkässolulinjoissa ja Saccharomyces cerevisiaessa. Yleisesti käytetyt nisäkäs-“! systeemit ovat kalliita käyttää, ja Saccharomyces-systeemit » c « tuottavat suhteellisen alhaisia S-proteiinisaantoja.
« « « • < « 4 '25 Yritykset antigeenisen ja potentiaalisesti.rokotteena tehok-
« « I
·.· " kaamman PreS*-proteiinin tuottamiseksi ovat osoittautuneet epätavallisen vaikeiksi. PreS=-proteiinin on todettu olevan hyvin altis proteolyysiin rekombinanttisysteemeissä. Prote- olyysissä muodostuu kaksi pienempää proteiiniosaa, jotka .•”.30 eivät ehkä sisällä PreS=:n antigeenisyyttä. PreSz-proteiinia • · · on lisäksi ollut hyvin vaikea ilmentää rekombinanttisystee-. * * meissä. PreSs·:n ilraenemistaso on suunnilleen 1/10 samoissa rekombinanttisysteemeissä tuotetun S-proteiinin tasosta.
• · · - · » « · · . .35 -Ala edistyisi merkittävästi, jos kehitettäisiin tehostettu menetelmä antigeenisten HBV-partikkelien tuottamiseksi, jotka 4 1072!65 sisältävät HBV:n S-proteiinia ja PreS=t-proteiinia . Näissä partikkeleissa toimisivat yhdessä pääasiallinen S-proteiini potentiaalisesti enemmän antigeenisen PreSe-proteiinin };anssa potentiaalisesti rokotteena tehokkaammassa muodossa.
S
Tämän keksinnön tarkoituksena on sen vuoksi tuoda käyttöön menetelmä antigeenisten HBV-partikkelien tehokkaaksi tuottamiseksi, jotka sisältävät pääasiallisesti HBV:n S-prote:.inia ja PreS=-proteiinia.
10 Tämän keksinnön toisena tarkoituksenaton vielä tuoda käyttöön uusia vektoreita, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka koodattavat S-proteiinia ja PreSs-proteiinia.
15 Tämän keksinnön kohteena on edelleen tuoda käyttöön uusia metylotrofisia hiivoja, jotka on transformoitu vektorilla tai vektoreilla, jotka mahdollistavat HBV-partikkelien tehokkaan tuotannon, jotka sisältävät S-proteiinia ja glykosyloi-tumatonta PreSs-proteiinia.
20 Tämän keksinnön toisena kohteena on vielä tuote, joka on tuotettu pääasiallisesti S-proteiinia ja PreS^-proteiinia j _ sisältävän antigeenisen HBV-partikkelin tuotantomenetelnän '1 I avulla.
' 25 « « t Nämä ja muut keksinnön mukaiset kohteet selviävät tässä yh-·.·· teydessä käyttöön annettavasta selvityksestä ja patenttivaa timuksista.
• · · • · · • · · 30 Esillä olevan keksinnön mukaisesti on keksitty menetelmä * . antigeenisen HBV-partikkelin tehokkaaksi tuottamiseksi, joka | menetelmä käsittää sen, että transformoidaan metylotrofinen hiiva vähintään yhdellä isäntään soveltuvalla ekspressioka- :*·*: setillä, joka sisältää S-proteiinin rakennegeenin, ja νέ hin- I 35 tään yhdellä vektoriin soveltuvalla ekspressiokasetilla, joka • « sisältää PreS=-proteiinin rakennegeenin, ja viljellään muo- 107265 5 dostuneita transformantteja olosuhteissa, jotka ovat sopivia partikkelituotannon aikaansaamiseksi.
Kuviossa l esitetään plasmidi pA0801, joka on pBR322-peräinen 5 plasmidi ilman EcoRI-paikkaa asemassa 1, ja joka sisältää Bglll-paikan pBR322:n PvuII-paikan tilalla, sisältäen 700 ep:a sisältävän Bglll/XhoI-palan 3* AOXl-lopetussekvenssis-tä plasmidista pBSAGISI (NRRL no. 18021).
10 Kuviossa 2 esitetään plasmidi pA0802, joka on plasmidin PA0801 johdannainen, sisältäen promoottori-geeni-terminaatto-ri -ekspressiokasetin plasmidista pBSAGI5I (NRRL no. 18021} liitettynä plasmidin pA0801 Clal-paikkaan.
15 Kuviossa 3 esitetään plasmidi pA0803, joka on pA0802-peräinen plasmidijosta HBsAgrtä koodittava sekvenssi on poistettu StuI-EcoRI-hydrolysaatin mukana, ja joka sisältää EcoRI-pai-kan liitettynä samaan paikkaan.
20 Kuviossa 4 esitetään plasmidi pA0811, joka saatiin plasmidista pA0803, hydrolysoimalla pA0803:a BamHI:llä ja liittämällä 2,0 ke sisältävä pala, joka sisälsi Saccharomyces ARG4 -gee-: nin.
I | » t ,',,25 Kuviossa 5A annetaan käyttöön kaavion muodossa plasmidien pAOSOl ja pA0802 konstruointi.
• » *
Kuviossa 5B annetaan käyttöön kaavion muodossa plasmidien : : : PA0803 ja pA0811 konstruointi.
:T30 * . Kuvio 6 sisältää esityksen HBV:stä., joka sisältää HBV:n adw- serotyypin PreS^-geenin. Plasmidi AM6 on kuviossa 6 esitettävän HBV-genomin johdannainen, jossa BamHIrllä hydrolysoitu - pBR322-plasmidi on liitetty BamHI-paikkaan asemassa 26.
: ’ ·. |35
Kuviossa 7 esitetään plasmidi pYM4, pBR322-peräinen plasmidi.
6 - 107265 joka sisältää Pichia pastoris HIS4 -geenin liitettynä B.imHI-paikassa. Sulut osoittavat tuhoutuneen paikan. HISA-geeni on talletettuna pYJ30:ssä (NRRL B-15890).
5 Kuviossa..8 esitetään plasraidi pYMIO. pYMIO on plasmidin pYJ30 (NRRL B-15890) johdannainen, jonka.BamHI-kohta asemassa 2959 on tuhoutunut. Kuviossa olevat sulut osoittavat tuhoutuneen katkaisukohdan.
10 Kuviossa 9 esitetään plasmidi pA080A, joka sisältää lineaarisen yhdistävän paikkaspesifisen vektorin palassa, joka on myötäpäivään Bglllrsta BglII:een. Rakennegeeni voidaan liittää tämän plasmidin erikoiseen EcoRZ-paikkaan.
15 Rakennegeeni PreSs tunnetaan alalla hyvin, ja sen on sekven-soinut Lo, Characteristics of PreSa Region of Hepatitis B Virus, 135 Biochemical and Biophysical Research Communications 382 (1986).Monet tämän alueen tutkijat ovat kloonanneet tämän rakennegeenin ja ilmentäneet sitä, kuten esimerkiksi 20 Lo, ja Valenzuela, Synthesis and Assembly in Yeast of Hepatitis B Surface Antigen Particles Containing the Polyalbunin ,:. Receptor, 3 Biotechnology 317 (1985), nimettynä vain kaksi.
: Rakennegeeni voidaan siten saada alan tutkijoilta, synteti- T ! soida tai uudelleeneristää. On myös tunnettua, että mitä 25 tahansa PreSa-serotyyppiä voidaan käyttää tämän keksinnön soveltamisessa käytäntöön.
« * * « « «
Rakennegeeni S on myös hyvin tunnettu alalla, ja Lo, edellä, on myös sekvensoinut sen. Rakennegeeni voidaan saada kaupal- :*·*: 30 lisesti, se voidaan syntetisoida tai uudelleeneristää. Tlede- *. tään myös, että mitä tahansa S-serotyyppiä voidaan käyttää [ tämän keksinnön soveltamisessa käytäntöön.
• · :T: PreSss-rakennegeenin serotyyppiä adw, jota on käytetty yhdessä 35 tämän keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa, saatiin plasmi- « t dista AM6. Plasmidi AM6 on kuviossa 6 esitetyn HBV-genomLn 107265 7 johdannainen, jossa pBR322-plasmidi on liitettynä BamHI-koh-dassa asemassa 26. Tämän PreSa-rakennegeenin nukleotidisek-venssi annetaan taulukossa 1. Tässä käytettäviä plasmideja voidaan viljellä jokaisessa sopivassa E. coli -isännässä, 5 kuten esimerkiksi MC1061:ssä.
Kaksi osaa PreS1-rakennegeeneistä otettiin talteen plasmidis-ta AM6, ja N-pään 13 ensimmäisen aminohapon nukleotidisek-venssi syntetisoitiin in vitro. Tässä käytetty nukleotidisek-10 venssin synteesi voidaan suorittaa joko kemiallisella tai entsymaattisella tavalla, kuten esimerkiksi kemiallisilla menetelmillä, jotka perustuvat fosfotriesteri-, fosfiitti-tai syaanietyylifosforamidiittikemiaan.
15 C-pään koodittava alue, joka käsittää 75 % PreS=:n rakenne-geenistä, saatiin plasmidista AM6 plasmidin Dral-hydrolyysin avulla. Dral-hydrolyysi suoritettiin käyttämällä kaupallisesti saatavaa Dral-endonukleaasia (kaikki endonukleaasi käytettiin noudattaen valmistajan ohjetta). Dral-palat uutettiin 20 sen jälkeen fenolilla ja saostettiin etanolilla.
«
I I I
* 1 1 · «|« Oktaraeerinen Stul-linkkeri (AAGGCCTT) valmistettiin sen jäi- I « t · : keen nornaalin DNA-synteesitekniikan mukaisesti ja liitettiin • f 4 ,·. ; Dral-palasiin käyttämällä T4-ligaasia tasapääligaatiossa.
• « · !.,'25 Ligaatio lopetettiin fenoliuutolla, jota seurasi etanolisaos-« · « tus. Muodostuneet palaset hydrolysoitiin sen jälkeen Stul- 4 · · ‘ endonukleaasilla Stul-multimeerien poistamiseksi.
· · ·.· · Stul-kytketyt palaset hydrolysoitiin sen jälkeen Xbal:llä.
:::30 Tuloksena oleva, suunnilleen 600 ep:a sisältävä Stul/Xbal- palanen, joka sisälsi PreS1-rakennegeenin C-pään koodattavan • · alueen, eristettiin geelielektroforeesin avulla.
• · . v 1 Tämä 600 ep-.a sisältävä pala liitettiin sen jälkeen T4-ligaa- \:35 sin avulla plasmidin pYM4 5,7 ke:n Xbal/StuI-hydrolysaattiin, kuvio 2, joka oli eristetty agaroosigeelielektroforeesin . 8 107265 avulla .
Ligaatioseosta käytettiin sen jälkeen suoraan kompetenttien E. coli -solujen (MC1061) transformaatioon, joita kasvat.et-5 tiin sen jälkeen ampisilliinin läsnä ollessa.
Taulukko 1 7 10 20 30
10 G .A A T T C A T G CAGTGGAACTCCACTGCCTTC
PreSa:n alku - 40 50 . 60 CACCAAACTCTG C-A G G.A T. C CCAGAGTCAGG 15 70 80 90
GGTCTGTATCTTCCTGCTGGTGGCTCCAGT
20 100 110 120
TCAGGAACAGTAAACCCTGCTCCGAATATT
25 130 140 150
GCCTCTCACATCTCGTCAATCTCCGCGAGG
160 170 172 180
30 ACTGGGGACCCTGTGACGAAC A T G G A G A A C
S:n alku : 190 200 - 210
ATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTC
.:.35 « · · · 220 230 240 gtgtta.caggcggggtttt t c ttgttgaca ; 40 250 260 270
::: AGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGAC
« · « • · · · ‘ 45 280 290 300
TCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG
• · · : 310 320 330 ... 50 GGATCTCCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCG * * · • · · « 340 350 360
*"·: CAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACC
....: 55 370 380 390
... TCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGC
• · · Y 60 ·.: 400 410 420
' TGGATGTGTCTGCGGCGTT. TTATCATATTC
107265 9
Taulukko 1 (jatkoa) 430 440 450 CTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTC 5 460 470 480
TTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATG
10 490 500 510
TTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCA
i 15 520 530 540 ACAACAACCAGTACGGGACCAT G. C A A A A C C .
550 560 570
20 TGCACGACTCCTG-CT.jCA.AGGCAACTCTATG
580 590 600
TTTCCCTCATG.TTGCTGTACAAAACCTACG
25 610 620 630
GATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCA
30 640 650 660
TCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGG
35 670 680 690
GAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTC
700 710 720
.40 AGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTC
« · · 730 740 750
GTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCA
: .*.45 < « « '** ' 760 770 780
GCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCA
:Y:S0 790 800 810
AGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTTATA
I I I
-55 820 830 . . . 840
... CCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGG
• · · • · · ♦ 850 852
’60 GTATACATT TAA
Y#. loppukodoni • · *# * Onnistuneesti transformoituneita pesäkkeitä valikoitiin, ja plasmidi-DNA:ta uutettiin Birnboimin ja Dolyn menetelmällä :'\:65 -- [Nucleic Acids Research 7:1513 (1979)].
10 107265
Uutettua plasmidi-DNA:ta hydrolysoitiin Stul.-llä, uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. EcoRI-linkkereitä valmistettiin ja liitettiin Stul-palasiin. Linkkeriylimäärä poistettiin EcoRI-hydrolyysillä. EcoRI-kytketyt palat hylro-5 lysoitiin edelleen Xbal.-llä ja elektroforesoitiin niiden palasten eristämiseksi, jotka sisälsivät preSs-rakennegeanin C-pään osan.
Xbal-EcoRI -hydrolysaatti liitettiin Xbal-EcoRI:llä katkais-10 tuun plasmidiin pUC18. Ligaatioseos transformoitiin korape-tentteihin E. coli -soluihin (MC1061), joita kasvatettiin sen jälkeen ampisilliinin läsnä ollessa. Transformoituja soluja, jotka sisälsivät preSe-rakennegeenin C-pään osan valikoitiin palahydrolyysianalyysillä käyttäen Clal:tä j«; 15 Xbal.-tä. Tällä menetelmällä valikoitua plasraidia merkitti.in tunnuksella pHS2-B.
PreS3-geenin keskiosa otettiin talteen hydrolysoimalla ensin plasmidi AM6 Xbal:llä ja BamHI:llä. Tavoiteltu 250 ep-.a si-20 sältävä pala eristettiin geelielektroforeesin avulla. 25C
ep:a sisältävä Xbal/BamHI-pala liitettiin sen jälkeen plasmi- « diin pUCIS, joka oli hydrolysoitu Xbal:llä ja BamHI.-llä, ja : käytettiin E. colin MC1061 transformointiin. Viljelmät, jotka ;·,· kasvoivat ampisilliinin läsnä ollessa, analysoitiin ottamalla .•;\25 plasmidi-DNA talteen, ja hydrolysoimalla sitä BamHI.-llä.
« < t ,·;·/ Niiden plasmidien, jotka sisälsivät 2,7 kbrsen palan elektro- * · « foresoitaessa, katsottiin sisältävän halutun 250 ep.-a sisäl-
... tävän palasen. Yksi transformoitu pesäke, joka sisälsi 25D
• · · *·* ep:sen palan, eristettiin, ja sitä kasvatettiin suuressa ··· • · · *♦* *30 mitassa. Plasmidi-DNA eristettiin ja puhdistettiin pesäkkaes- *:··* tä, joka hydrolysoitiin EcoRI:llä ja BamHI:llä. Vektorivy 5hy- ke eristettiin elektroforeesilla. Vektori ligoitiin sen jäi- • · keen seuraavan kinaasilla käsitellyn kaksijuosteisen oligo- • « · *·' ’ nukleotidin kanssa.
« « :.··:35 107265 11
PstI BamHI
5‘ AATTCAATCCGTCTGCAG 3 * 3 * GTTAGGCAGACGTCCTAG S’ S Ligaatioreaktioseosta käytettiin E. colin MC1061 transformoinein, ja pesäkkeet, joissa oli oikea insertti, valikoitiin ampisilliiniresistenssin perusteella. Tätä plasmidia » nimitettiin koodilla pPS2.
10 PreS=;n N-pään koodittava alue valmistettiin synteettisenä oligonukrleotidina, jolla on seuraava sekvenssi.
Hindlll PstI
5’ AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3’ ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG S * 15 Tämä sekvenssi kloonattiin plasmidin pUC18 Hindlll- ja Pstl-hydrolysaattiin. Halutut transformantit karakterisoitiin suunnilleen 75 ep:sen palan läsnäolon perusteella EcoRI-hyd-rolyysin ja elektroforeesin jälkeen. Tällä menetelmällä vali-20 koituja plasmideja merkittiin koodilla pTB0-2A.
« * i iti ·
Geenin keskiosa lisättiin hydrolysoimalla vektori pTBO-2A
Pstl:llä ja Xbal:llä; insertti oli 250 ep:a sisältävä PstI-• < · · : Xbal -pala pPS2:sta. Transformantit karakterisoitiin >300 « « ... 25 ep:sen EcoRI-palan kuin myös 290 ep.-sen Xbal/Hindlll-palan • « e !.. läsnäolon perusteella. Oikeaa isolaattia merkittiin koodilla « « « * pTBO-3. Kokonainen preSa-geeni saatiin aikaan liittämällä Hindlll/Xbal-pala pTBQ-3:sta Xbal/Hindlll:11a hydrolysoituun • · · : pHS2B:hen. Ampisilliinille resistentit transformantit karak- • · · ·.·* :30 terisoitiin 825 ep.-sen EcoRI-palan läsnäolon perusteella.
Tätä konstruktiota nimitettiin koodilla pTB04.
• « • · . Edellä mainitun E. coli -kannan viljely voidaan suorittaa • · · • v * millä tahansa sopivalla menetelmällä. Alalla tunnetaan jo < < '/><35 hyvin yleiset menetelmät E. colin viljelemiseksi, ja kaikki näiden menetelmien mukaelmat tässä käytettyjen kantojen spe 107265 12 sifisten vaatimusten mukaisesti ovat alaa tuntevien toteutettavissa .
Plasmidi-DNA:n talteenotto E. colista voidaan toteuttaa isei-5 den menetelmien avulla, johtuen sen tiiviistä koosta ja suljetusta pallomaisesta superkierremuodosta. Isäntäsolut voidaan esimerkiksi saaliin talteenoton jälkeen pelletoida sent-rifugoimalla, ja suspendoida sen jälkeen uudelleen ja haettaa. Lysaatti tulisi sentrifugoida solujäänteiden poistani-10 seksi, ja DNA:n sisältävä supernatantti tulisi jättää jäljelle. Sen-jälkeen voidaan suorittaa fenoliuutto enimmän muun kontaminaation poistamiseksi DNA:sta. Fenolilla uutettua DNAita voidaan-sen jälkeen edelleen käsitellä, käyttäen t:i-heysgradienttisentrifugoi-nti- tai geel-isuodatustekniikkau, 15 plasmidi-DNA:n erottamiseksi bakterisesta DNAista. Tekniikat edellä viitatun erottamisen aikaansaamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja, ja lukuisia menetelmiä näiden tekniikoiden toteuttamiseksi tunnetaan.
20 Plasmidin nukleaasihydrolyysi voidaan suorittaa valitsemalla « ·'.·,! sopivat endonukleaasit, jotka katkaisevat valikoidun plaumi- t<);' din siten, että preSa-rakennegeenin talteenotto helpottuu.
• Käytettävät endonukleaasit ovat riippuvaisia siitä plasm:.dis-< · « · ;\j ta, josta preSs-geeni on tarkoitus leikata. Plasmidin AM(> * · .1:1.25 sisältämä preSs-rakennegeeni voitaisiin esimerkiksi ottaa * · · !.. talteen kuten on kuvailtu esimerkissä I.
• « · a · DNA:n geelielektroforesointi voidaan suorittaa käyttämällä • · $ • · · V 1 lukuisia alalla tunnettuja tekniikoita, kuten esimerkiksi P.
• · · J30 G. Sealy ja E. M. Southern, Gel Electrophoresis of Nuole:.c Acids - A Practical Approach (D. Rickwood ja B. D. Hames • · >##,· edit.) s. 39 (1982). Eluointi voidaan myös toteuttaa käyntä- • ♦ mällä lukuisia tekniikoita, jotka sopivat kyseessä oleva].le ··· *.1 1 geelille, kuten esimerkiksi elektroeluointi, diffuusio, i’ee- :,1··35 liliuotus (agaroosigeelit) tai fysikaalinen ekstruusio (;»ga-roosigeelit). On lisäksi tunnettua, että eluointi ei ehkä 13 107265 ole välttämätöntä joillakin geeleillä, kuten esimerkiksi korkealaatuinen, alhaissulamislämpötila-agaroosi.
Silloin kun preS^-rakennegeenin tai sen osia sisältävä kappa-5 le eristetään, voidaan tarvita lisäkäsittelyjä ennenkuin se liitetään vektoriin. Nämä käsittelyt voivat sisältää, mutta eivät niihin rajoittuen, linkkerien lisäämisen tai palan * tekemisen tasapäiseksi.
10 Yhtä tämän keksinnön mukaista suoritusmuotoa varten konstruoitiin -S-geeni preSa-geenistä M13-mutageneesin avulla. M13-mutageneesia käytettiin ensimmäisten 165 emäsparin poistamiseksi (jotka koodattavat ensimmäiset 55 aminohappoa preS*-rakennegeenistä), mikä johti EcoRI-kohdan liittämiseen välit-15 tömästi S-rakennegeenin ATG-aloituskodonin 5*-puolelle. Ne, jotka tuntevat alaa, tuntevat hyvin M13-mutageneesin tekniikat, yhden tyypillisen tekniikan, jota voitaisiin käyttää, ollessa Zollerin ja Smithin tekniikka [Methods in Enzymology 100:468(1983)]. M13-vektoreita ja mutageneesiin tarvittavia 20 reagensseja on saatavissa kaupallisista lähteistä, kuten ( esimerkiksi New England Biolabs.
i I I I t I I t < i Mutageneesi, kuten edellä on kuvattu, aloitettiin liittämällä ;'<(j ensin preSs-rakennegeeni M13-vektorin kaksijuosteiseen, ympy- ,'\·,2Ζ rän muotoiseen replikaatiomuotoon, eli RF:ään (johtuen sen $ t « helppokäyttöisyydestä, ml3mpl8 valikoitiin, vaikka muita M13- t « «
• vektoreita olisi voitu käyttää). PreS^-rakennegeeniä, plasrai-dissa pTB04, lisättiin E. colissa MC1061, ja plasmidi-DNA
• · · *.* * eristettiin käyttämällä Birnboimin ja Dolyn, edellä, menetel- «·« V:30 mää. pTB04-plasmidi hydrolysoitiin sen jälkeen EcoRIrllä.
Suunnilleen 825 emäsparia sisältävä EcoRI-pala, joka sisälsi • « preSss-rakennegeenin, eristettiin geelielektroforeesin avulla.
• · . Tämä palanen liitettiin sen jälkeen vektorin ml3mpl8 EcoRI- ··· . V ' paikkaan. Ligaatioseosta käytettiin sen jälkeen transformoi- < « •'.'*135 taessa kompetentteja bakteerisoluja, kuten esimerkiksi JM101 tai JM103. Transformantteja valikoitiin värireaktion perus- 107265
IA
teella, joka osoitti, että haluttu palanen oli keskeyttänyt β-galaktosidaasigeenin ja muodostaisi kirkkaita plakkeja sinisten asemesta indikaattorimaljoilla.
5 Liitännäisen sijaintiasema voidaan määrittää sekvensoima11a, endonukleaasihydrolyysillä ja geelielektroforesoinnilla, tai millä tahansa sopivalla tekniikalla. Yksi klooni, jossa Lni-tiaattorimetioniini oli liitetty lähelle Ml3-yleisaluketCa, eristettiin, ja sitä käytettiin ensimmäiseen mutageneesiLn.
10
Seuraavaksi syntetisoitiin in vitro lyhyt oligonukleotidL, joka sisälsi seuraavan nukleotidisekvenssin: CGGGT-ACCGA-GCTCG-AATTC-ATGGA-GAACA-TCACA-TCAGG Tässä keksinnössä käytäntöön sovellettavia synteettisiä i>ek-15 venssejä voidaan tuottaa joko entsymaattisilla tai kemiallisilla menetelmillä. Sopiviin menetelmiin sisältyvät, muf:a ei niihin rajoittuen, kemialliset menettelyt, jotka perustuvat fosfotriesteri-, fosfiitti- tai syaanietyylifosforam;.-diittikemiaan.
20
Vektorista M13 valmistettiin yksijuosteinen muoto, joka sisälsi liitetyn rakennegeenin. Synteettinen oligonukleotici, joka on osittain komplementaarinen preSs-geenin viereiset1.
5’-alueen ja S:ää koodittavan alueen 5'-pään suhteen, yhcis-“! 25 tettiin yksijuosteiseen Mi3-vektoriin, joka sisälsi preSa- « « 4 ;··; rakennegeenin. Käyttämällä osittain komplementaarista syn- « · « : teettistä oligonukleotidia alukkeena, DNA-synteesi suorite- • · ·. taan in vitro Klenow-kappaleen ja deoksioligonukleotiditri- • · · ·.· · fosfaattien kanssa A^Crssa. Osittain komplementaarista syn- : ::30 teettistä oligonukleotidia jatkettiin sen jälkeen ympyrän muotoisen M13-templaatin ympärille. Reaktioseosta käytettiin transformoitaessa kompetentteja JM101- tai JMi03-soluja. Transformantteja seulottiin siirtämällä plakit nitrosellu- • · · loosalle, ja hybridisoimalla radioaktiivisesti leimatun oli- « 107265 15 Näitä mutantteja käytettiin sen jälkeen, kun valmistettiin templaatti, jota käytettiin JM103:n transformaatioon. Nämä transformantit seulottiin jälleen kuten aikaisemmin. Toisen seulonnan positiiviset sekvensoitiin sen jälkeen, ja oikean 5 sekvenssin sisältävät plakit identifioitiin. Näiden pesäkkeiden kaksijuosteinen yhdistävä muoto hydrolysoitiin sen jälkeen EcoRI:llä, ja 678 emäsparinen palanen eristettiin, joka sisälsi S-rakennegeenin. Tämä sekvenssi annetaan taulukossa 2.
10
Taulukko 2 170 172 180 190
15 G A A T T C A T G GAGAACATCACATCAG
£>: n alku 200 210 220
GATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGG
20 230 240 250
CGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCA
25 260 270 280
CAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGA
30 290 300 310
CTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCT C.C C G
320 330 340
35 TGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAA
ί : 350 360 370
CCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTC
•; 40 l«ll : 380 . 390 . 400
CAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTC
t 1 •.2545 I..1 410 420 430 :: : tgcggcgttttatcatattcctcttcatcc • · · • · · ’·1 150 440 450 460
TGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGGTTC
«♦« : 470 480 490
,·:·55 TTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTT
• · · S00 S10 520
* 1 GTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCA
....60 • · «M « · · < 4 t · • · · * · · 2 « · 107265 16
Taulukko 2 (jatkoa) 530 SAO 550 GTACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTC 5 560 570 580
CTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCAT
10 590 600 610
GTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATT
t 15 620 630 6A0
GCACCTGTATTCCCATCCCATCGTCCTGGG
650 660 670
20 CTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCT
680 690 700 CAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAG 25 710 720 730
TGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAG <3 G C T T T
30 7A0 750 760
CCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGA
35 770 780 790
TGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACA
800 810 820
AO GCATCGTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTAC
830 8A0 850 CAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTT A5 “ 852
... AA
‘! Töppukodoni ;··; 50 · S- ja preS^-rakennegeenien eristämisen jälkeen geenit liite- ♦ · *.**: tään sopivaan metylotrofihiivavektoriin, kuten esimerkiksi • · · V 1 plasmidiin tai lineaariseen paikkaspesifiseen yhdistävään :T: vektoriin. Tämän keksinnön käytäntöön soveltamisen kannalta 55 edullisia vektoreita ovat sellaiset, jotka soveltuvat Pichia-suvun kanssa, ja edullisimmin Pichia pastoriksen kanssa.
» · · • · Φ • · · *· ^ Plasmidit ovat olleet kauan eräitä peruselementtejä, joita ' ' on käytetty yhdistelmä-DNA -teknologiassa. Plasmidit ovat ""•60 renkaan muotoista ekstrakromosomaalista kaksijuosteista DNA:- • · « • · · • · · · » · · • · · • · 107265 17 ta, jota tavataan mikro-organismeista. Plasmidien on todettu esiintyvän yksinkertaisina tai moninkertaisina kopioina solua kohti. Piasmidi-DNA.-han sisältyy informaatio, jota tarvitaan plasmidin lisäämiseen, so. replikoinnin alkukohta sisältyy 5 bakteerin replikointia varten. Yksi tai useampi keino valikoida plasmidi fenotyyppisesti transformoiduissa soluissa voidaan myös sisällyttää plasmidiin koodattuun informaatioon. Fenotyyppiset tai valikoivat markkerit, kuten esimerkiksi antibioottiresistenssigeenit tai geenit, jotka täydentävät 10 vajavuuksia isännän biokemiallisilla reiteillä, mahdollistavat transformoitujen isäntäsolujen kloonien tunnistamisen, valikoinnin, ja säilyttämisen.
PreSz- ja S-rakennegeenien ilmentämiseksi metylotrofisessa 15 hiivassa, jokaisen geenin on oltava toiminnallisesti kytketty 51 -säätelyalueeseen ja 3’ -loppusekvenssiin, mikä muodostaa ekspressiokasetin, joka liitetään isäntään vektorin välityksellä.
20 Seuraavat ilmaisut määritellään tässä selventämistarkoituk-sessa.
Toiminnallisesti kytketty—viittaa rinnakkaisasemaan, jossa komponentit ovat asettuneet niin, että ne suorittavat tehtä-, 25 vänsä .
«1(1 \ Säätelyalue—DNA-sekvenssejä, jotka reagoivat erilaisiin • · · *♦ ärsykkeisiin ja vaikuttavat mRNA:n kopioinnin nopeuteen.
··· • ♦ · • « · « • « · :.::30 3'-loppusekvenssi—lopetuskodonin 31-puolella olevat sekvens sit, jotka toimivat mRNA:n stabiloimiseksi, kuten esimerkiksi :1·1: sekvenssit, jotka saavat esiin polyadenylaation.
·»· • · · • · · • , "Isäntäsoluun sopiva” tarkoittaa DNA-sekvenssejä, jotka suo- • · · · « *35 rittavat normaalia toimintaa isännissä, kuten esimerkiksi • · · · · • 1 isäntäperäiset säätelyalueet ja 3'-loppusekvenssit.
• · · • · · • · · · 4 · · • · · • · 107265 18
Yhdistävät vektorit ovat edullisia esillä olevan keksinnön käytäntöön soveltamisen kannalta, kuten esimerkiksi Cregg'in lineaarinen, paikkaspesifinen yhdistävä vektori, jota on 5 kuvailtu julkaisussa EP-A-0 226 752 (86 114 700,7). Sellaiset vektorit sisältävät mainitun järjestetyn sekvenssin, joka käsittää vähintään 1) ensimmäisen liitettävän DNA-palasan; 2) selektoitavan markkerigeenin; ja 3) toisen liitettävän DNA-palasen.
10
Liitettävät DNA-palaset ovat vähintään noin 200 nukleotidia pitkiä, ja sisältävät nukleotidisekvenssejä, jotka ovat homologisia isännän genomisen DNA:n osien kanssa. Lineaarisen, paikkaspesifisen yhdistävän vektorin eri komponentit ovat 15 sarjaraaisesti järjestyneet, muodostaen lineaarisen DNA-palasen siten, että ekspressiokasetti ja selektoitava markkeri-geeni ovat» sijoittuneet ensimmäisen liitettävän DNA-palan 3’-pään ja toisen liitettävän DNA-palan 5'-pään väliin. Ensimmäinen ja toinen liitettävä DNA-palanen ovat suuntautuneet 20 toistensa suhteen sarjamaisesta järjestyneessä lineaarisessa palassa siten, kuin ne ovat suuntautuneet perusgenomissa.
Nukleotidisekvenssejä, jotka ovat käyttökelpoisia ensimmäisinä ja toisina liitettävinä DNA-paloina, ovat nukleotidisek-25 venssit, jotka ovat homologisia natiivin genomisen paikm erillisten osien kanssa, jossa paikassa genominen modif.Lkaa- « « < 1 tio on tapahtuva.Siten, esimerkiksi, jos genominen modifikaa- • · · **,/ tio on tapahtuva alkoholioksidaasigeenin lokuksessa, käytet- • · · *·1 tävät ensimmäiset ja toiset DNA-palaset ovat sekvenssejä, • · « V 1 30 jotka ovat homologisia alkoholioksidaasigeenilokuksen erillisten osien kanssa. Jotta genomista modifikaatiota tapahtui-: : : si esillä olevan keksinnön mukaisesti, kahden liitettävän DNA-palasen on suuntauduttava toistensa suhteen lineaarisessa * , palassa samassa keskinäisessä orientaatiossa kuin esiin :yes- ,35 sään perusgenomissa. Esimerkkejä nukleotidisekvensseistii, joita voitaisiin käyttää ensimmäisinä ja toisina liitettävinä ««· • · · • « « · « · · « · t « · 107265 19 DNA-palasina, ovat nukleotidisekvenssit, jotka on valikoitu ryhmästä, johon kuuluvat alkoholioksidaasi (AOXl) -geeni, dihydroksiasetonisyntetaasi {DHASl) -geeni, p40-geeni ja HIS4-geeni. AOXl-geeni, DHASl-geeni, p40-geeni ja HIS4-geeni 5 tuodaan esille julkaisussa EP-A-0 183 071 (85 113 737,2), joka on sisällytetty tässä yhteydessä viitteenä.
Ensimmäinen liitettävä DNA-palanen voi sisältää toiminnallisen säätelyalueen, joka voi käsittää säätelyalueen, jota on 10 käytetty ekspressiokasetissa. Ensimmäisen liitettävän DNA- palasen-käyttäminen ekspressiokasetin säätelyalueena on tämän keksinnön mukainen edullinen suoritusmuoto.. Kuviossa 4 esitetään kaavakuva vektorista, jossa käytetäään ensimmäistä liitettävää DNA-palaa kasetin säätelyalueena.
15
Liitäntäpaikka tai paikat ja 3'-loppusekvenssi voidaan valinnaisesti sijoittaa välittömästi ensimmäisen liitettävän DNA-palan 3’-puolelle. Tämä lineaarisen, paikkaspesifisen yhdistävän vektorin konformaatio antaa lisäetuna käyttöön valmiin 20 paikan rakennegeenin liittämiseksi, tarvitsematta lisätä yhteensopivaa 3'-loppusekvenssiä.
Isäntäkannan transformaatiossa käytettävään DNA:hän on myös , välttämätöntä sisällyttää vähintään yksi selektoitava markke- 1 I « ];,25 rigeeni. Tämä helpottaa niiden organismien valikointia ja 4 eristämistä, jotka ovat liittäneet itseensä transformoitua • at *;· \ DNA:ta. Merkkigeeni antaa transformoidulle organismille feno- • · · *· tyyppisen ominaisuuden, jota isännällä ei ollut, esim., spe- • · · *.* : sifisen aminohapon tuottokyvyn palautuminen silloin, kun • · · :30 transformoimattoman isäntäkannan spesifisen aminohapon bio- synteesireitti on vajaavainen, tai antibioottiresistenssi ja :*·*: vastaavat ominaisuudet.
• · · • · · • · · * . Tyypilliset selektoitavat markkerigeenit voidaan valikoida ]35 ryhmästä, johon kuuluvat HIS4-geeni ja ARG4-geeni Pichia ' ' pastoriksesta ja Saccharomyces cerevisiaesta, invertaasigeeni • · · « · * «« • « 107265 20 (SUC2) Saccharomyces cerevisiaesta, tai neoraysiinifosfonrans-feraasigeeni E. colin Tn60l- tai 7n903-transposonielementeis-tä.
S Ne, jotka tuntevat alan, käsittävät, että muita DNA-sekvens-sejä voidaan myös sisällyttää vektoreihin, joita käytetään esillä olevan keksinnön soveltamisessa käytäntöön, kuten * esimerkiksi bakterinen plasmidi-DNA, bakteriofagi-DNA js vastaavat. Sellaiset sekvenssit mahdollistavat näiden vsskto-10 rien monistumisen ja säilymisen bakteeri-isännissä.
Jos ensimmäinen liitettävä DNA-palanen ei sisällä säätely-aluetta , sopiva säätelyalue täytyy liittää toiminnallisesti kytkettynä rakennegeeniin, jotta saataisiin aikaan käyttökel-15 poinen ekspressiokasetti. Samalla tavalla, jos 3’-loppusek-venssiä ei ole käytettävissä liittämispaikassa, ekspressio-kasetin tekemiseksi täydelliseksi, 3'-pään loppusekvenssi on kytkettävä toiminnallisesti liitettävään rakennegeeniin.
20 Alaa tuntevat ovat tietoisia lukuisista säätelyalueista, jotka on karakterisoitu, ja joita voitaisiin käyttää yhdessä metylotrofisten hiivojen kanssa. Tyypillisiin säätelyalueisiin kuuluvat, mutta ei niihin rajoittuen, hiivan säätelyalu-': eet, jotka on valikoitu ryhmästä, johon kuuluvat happamen 25 fosfataasin, galaktokinaasin, alkoholidehydrogenaasin, syto- : kromi c:n, alfa-pariutumistekijän ja glyseraldehydi 3-fos- 1 faattidehydrogenaasin säätelyalueet eristettyinä Saccharomy- • ♦♦ *,.* ces cerevisiaesta; primäärisen alkoholioksidaasin (A0X1), • · · *·*/ dihydroksiasetonisyntetaasin (DHAS1), p40:n säätelyalueet, ja • · · *·* * 30 HIS4 säätelyalue, jotka ovat peräisin Pichia pastoriksesta ja vastaavat. Tällä hetkellä edullisia säätelyalueita, joita • · · ί,ί · käytetään esillä olevan keksinnön käytäntöön soveltamisessa, : ovat ne, joille on tunnusomaista niiden kyky reagoida meta- t *<f nolia sisältäviin alustoihin, sellaisten säätelyalueiden < · .35 ollessa valikoituna ryhmästä, johon kuuluvat A0X1, DHAS1, . p40, ja joita on tuotu esille julkaisussa EP-A-0 133 071 (35 • 4 » « « · « « I I I I · « • · 107265 21 113 737,2).
Edullisin säätelyalue tämän keksinnön käytäntöön soveltamisessa on AOXi-säätelyalue.
S
3'-pään loppusekvenssejä voidaan käyttää ekspressiokasetissa, tai ne voivat käsittää osan vektorista, kuten edellä on kuvailtu. 3'-pään loppusekvenssit voivat toimia siten, että ne päättävät, polyadenyloivat ja/tai stabiloivat lähetti-RNA:ta, 10 jota rakennegeeni koodittaa, ollessaan toiminnallisesti kytkettyinä geeniin. Muutamiin esimerkkeihin kuvaavista 3'-lop-pusekvenssilähteistä tämän keksinnön käytäntöön soveltamisessa, kuuluvat, mutta ei niihin rajoittuen, Saccharomyces cere-visiaen, Hansenula polymorphan, ja Pichian 3'-pään loppusek-15 venssit. Edullisia ovat ne, jotka ovat peräisin Pichia pasto-riksesta, kuten esimerkiksi ne, jotka on valikoitu ryhmästä, joka sisältää AOXl-geenin, DHASl-geenin, p40-geenin ja HIS4-geenin 3'-pään loppusekvenssit. Erityisen edullinen on AOXl-geenin 3'-pään loppusekvenssi.
20
Ne, jotka tuntevat alan, tietävät, että muita DNA-sekvenssejä voidaan myös sisällyttää vektoreihin, joita käytetään esillä olevan keksinnön käytäntöön soveltamisessa, kuten esimerkiksi bakterinen plasmidi-DNA, bakteriofagi-DNA, ja vastaavat.
25 Sellaiset sekvenssit mahdollistavat näiden vektorien monistumisen ja säilymisen bakteeri-isännissä. .
• · • · · *· " Toinen sopiva vektori voisi olla yhdistävä vektori, joka • · · : sisältäisi järjestäytyneen sekvenssin käsittäen ainakin 1) ·« « : t : 30 liitettävän DNA-palasen, 2) selektoitavan markkerigeenin, 3) ekspressiokasetin ja valinnaisesti 4) toisen liitettävän DNA-palasen. Yhdistävän vektorin komponentit vastaavat lineaari-sessa, yhdistävässä paikkaspesifisessä vektorissa käytettäviä • · · *· t komponentteja, paitsi että tarvitaan vain yksi liitettävä ' '35 DNA-palanen, yhdistävien vektorien otaksutaan kuitenkin yh- *·'1· distävän koko vektoria homologisen rekombinaation avulla.
• · 1 • · · • · · · • 1 · « · · • · 107255 22
Ympyrän muotoiset yhdistävät vektorit ovat edullisia, kuten sellaiset, joita on esitetty kuviossa A. Esillä olevan keksinnön käytäntöön soveltamisessa on tällä hetkellä edullista käyttää lineaarisia transformaatiovektoreita, kuten esiraer-5 kiksi kuviossa 9 esitettyjen rakenteiden Bglll-palaset je kuviossa A esitettävän yhdistävän vektorin ympyrän muotoinen muoto.
S- tai preSa-rakennegeenin liittäminen sopiviin vektoreihin 10 voidaan toteuttaa millä tahansa sopivalla tekniikalla, joka katkaisee valitun vektorin sopivassa kohdassa tai kohdissa, ja johtaa vähintään yhteen käyttökelpoiseen ekspressiokaiiet-tiin, joka sisältää S- tai preSa-rakennegeenin, niiden ollessa läsnä vektorissa.
15 S- tai preSa-rakennegeenin ligointi voidaan toteuttaa millä tahansa sopivalla ligaatiotekniikalla, kuten esimerkiksi käyttäen TA DNA -ligaasia.
20 S- tai preSa-rakennegeenin ja vektorin muodostaman ligaat.io- seoksen alkuvalikointi, lisääminen ja valinnainen monistemi- nen suoritetaan edullisesti transformoimalla seos bakteeri- isäntään, kuten esimerkiksi E. coliin. Sopivat E. colin transformaatiotekniikat ovat alalla hyvin tunnettuja. SeJek- .25 tiomarkkerit ja bakteriset replikoinnin aloituskohdat, jotka ^ ovat välttämättömiä vektorin säilymisen kannalta bakteeri- ‘I* 1 isännässä, tunnetaan lisäksi myös hyvin alalla.
• · · « · · • · ··· • « · ’·* * Halutun plasmidin eristäminen ja/tai puhdistaminen, joka • ·· *.* 30 plasmidi sisältää S- tai preSÄ-geenin ekspressiosysteemissä, voidaan toteuttaa millä tahansa sopivalla menetelmällä plas-: raidi-DNA:n erottamiseksi isäntä-DNArsta.
• · · • · · • · · *. Samalla tavalla vektorit, jotka ovat muodostuneet ligaatios- 35 sa, voidaan testata edullisesti lisääntymisen jälkeen, jotta varmistettaisiin S- tai preSa-geenin länäolo ja sen käyttö- « « · « t I ( t 107265 23 kelpoinen kytkeytyminen säätelyalueeseen ja 3'-loppusekvens-siin. Tämä voidaan toteuttaa monella eri tekniikalla, joihin kuuluvat, mutta ei niihin rajoittuen, endonukleaasihydrolyy-si. geelielektroforeesi, tai endonukleaasihydrolyysi-Sout-5 hern-hybridisaatio.
Tämän keksinnön mukaisessa käytännössä vähintään kaksi eri yhteensopivaa ekspressiokasettia on transformoitava isäntä-., soluun. On olemassa useita menetelmiä, joiden avulla nämä 10 kaksi eri ekspressiokasettia voidaan liittää isäntään, kuten esimerkiksi kahden toiminnallisen ekspressiokasetin sijoittaminen vektoriin (virus, plasmidi tai lineaarinen, paikkas-pesifinen yhdistävä vektori), ja isännän transformointi näil- . lä vektoreilla. Toinen menetelmä isännän transformoimiseksi 15 vähintään kahdella eri ekspressiokasetilla (S ja preSa) olisi isännän transformointi kahdella eri vektorilla, toisen sisältäessä S-ekspressiokasetin ja toisen sisältäessä preSa-eks-pressiokasetin. Transformointi kahdella eri vektorilla (kaksinkertainen transformaatio) voitaisiin toteuttaa samanaikai-20 sella transformaatiolla (molemmat vektorit läsnä yhdessä transformaatiotapahturaassa), tai perättäisesti (yhden vektorin transformointia isäntään seuraa toinen transformaatio toisella vektorilla aikaisemmin transformoituihin isäntäso- luihin). Kaksinkertainen perättäinen transformaatio on tällä < < ( 25 hetkellä edullinen transforraaatiomenetelmä.
4 4 4 4 « 4 4 · · 4 4« 'I' 1 Plasmidien tai lineaaristen vektorien transformointi hiiva- • · · ·./ isäntiin voidaan toteuttaa sopivilla transformaatioteknii- • » · *·* koilla, mukaanlukien, mutta ei niihin rajoittuen, ne menetel- • · · * 30 mät, joita ovat selittäneet Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad.
Sei. 75, (1978) 1929; Ito et ai., J. Bacteriol. 153. (1983) 163; Cregg et ai., Mol. Cell Biol.S (1985) s. 3376; tai Sree-krishna et ai., Gene, 59 (1987) s. 115. Creggin transformaa-* , tiomenetelmä on tämän keksinnön käytännön kannalta edullinen.
, 35 Tämän keksinnön mukaisessa yhdessä suoritusmuodossa on edullista käyttää lineaaristen vektorien ylimäärää, ja valikoida 4 f 4 4 4 4 4 4 I · I ( 4 4 107265 24 moninkertaisia liitännäisiä Southern-hybridisaation avulla.
Hiivaisäntä transformaatiota varten voi olla mikä tahansa sopiva metylotrofinen hiiva. Metylotrofisiin hiivoihin lue-5 taan mukaan, mutta ei niihin rajoittuen, hiivat, jotka kykenevät kasvamaan raetanolilla, valikoituina suvuista, joihin kuuluvat Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomy-ces, Torulopsis ja Rhodotorula. Luettelon spesifisistä lajeista, jotka ovat tyypillisiä esimerkkejä tähän luokkaan 10 kuuluvista hiivoista, voi löytää julkaisusta C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982). Tällä hetkellä edullisia ovat metylotrofiset hiivat, jotka kuuluvat Pichia-sukuun, kuten esimerkiksi auksotrofinen Pichia pastoris 3S115 (NRRL Y—15851) tai PPFi (NRRL Y-18017). Auksotrofiset mety-15 lotrofiset hiivat ovat myös edullisia tämän keksinnön mu iäiselle käytännölle niiden helpon valikoitavuuden perusteena. Tiedetään, että villityyppisiä metylotrofisiä hiivakantoja voidaan käyttää yhtä hyvällä menestyksellä, jos valitaan sopiva transformoiva markkerigeeni, kuten esimerkiksi S.UC2:n 20 käyttäminen Pichia pastoriksen transforraoimiseksi kannaksi, joka kykenee kasvamaan sakkaroosilla, tai käytetään antibi-oottiresistenssiraarkkeria, kuten esimerkiksi GAAlS^-geen^ä.
Esillä olevan keksinnön mukaisessa käytäntöön soveltamisessa 25 on edullista käyttää kahta selektiomarkkeria yhdessä, S:n ja : preSÄ:n pysyvän transformaation isäntään valikoimiseksi.
< ; Keksinnön mukaisen käytännön kannalta on siten edullista • ·· *..1 käyttää isäntä- ja vektoriyhdistelmiä, jotka varmistavat, « « · *♦1 1 että kun käytetään kahta eri selektiomarkkeria kahdessa eri ·«« t · · ‘•**30 vektorissa, kumpikin markkeri voidaan valikoida toisistaan riippumatta. Yhtenä sellaisena isännän ja vektorin yhdistel- • i1 · raänä voisi-oll^L se, että käytetään PPFl:tä (HIS4, ARG4) vek- :T: torien pA0804 (HIS4-markkeri) ja pA081l (ARG-markkeri) kans- sa. Toinen mahdollinen yhdistelmä voisi olla se, että käyte- • · .35 tään auksotrofia, joka on vajaavainen vain yhdellä reitillä, yhdessä geenin kanssa, joka on vajavuuden suhteen kompleiren- « « · • « « • « · • · * · « « 107265 25 taarinen, ja antibioottiresistenssigeenin kanssa, tai geenin, joka synnyttää uuden fenotyypin, kuten esimerkiksi SUC2.
Transformoituja metylotrofisiä hiivasoluja voidaan valikoida 5 käyttämällä sopivia tekniikoita, mukaanlukien, mutta ei niihin rajoittuen, aikaisemmin auksotrofisten solujen viljely transformoinnin jälkeen ilman tarvittavaa biokemiallista · tuotetta (johtuen solun auksotrofiästä), uuden fenotyypin ("metanolihidas") havaitsemisen perusteella, tai viljely 10 antibiootin läsnä ollessa, joka on toksinen hiivalle trans-formantin sisältämän resistenssigeenin puuttuessa..
Eristettyjä transformoituja metylotrofisiä hiivasoluja viljellään sopivilla fermentointimenetelmillä, kuten esimerkiksi 15 ravistelupullofermentaatio, suurtiheyksinen fermentaatio tai Cregg'in et ai. julkaisema menetelmä, High-Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast, Pichia Pastoris, 5 Bio/Technology 479 (1987).
20
Ilmentäminen voidaan toteuttaa menetelmillä, jotka ovat sopivia käytettävälle säätelyalueelle. Jos käytetään metanolille reagoivia säätelyalueita, ilmentymisen indusointi voidaan i . !,· toteuttaa altistamalla transformoidut solut ravintoalustassa 25 käytetyn säätelyalueen kannalta sopivalle alkoholille.
« « 1(4 I ( I ( (
Antigeeniset partikkelit voidaan ottaa talteen raa’assa muo- • · dossa, hajottamalla transformoidut solut, joita on indusoitu • · · t1..# riittävä ajanjakso, käyttämällä tavanomaisia menetelmiä, • · · * 30 kuten esimerkiksi lasihelmijauhatus, jota seuraa solujääntei den poistamiseen riittävä sentrifugointi. Ne, jotka tuntevat • « · *·2 alaa, ovat tietoisia lukuisista menetelmistä, joita on saata- ·«» · V 1 villa heterologisen proteiinin uuttamiseksi yksisoluisista t . isäntäorganisraeista, jotka voisivat korvata edellä olevan .,,,:35 yleisen uuttomenetelmän, tai lisäpuhdistamiseksi. Tämän kek- 4 % • sinnön mukaisen käytännön kannalta edullinen puhdistusraene-• « · • · · • · · · • > i • ·» 2 • ♦ 107265 26 teiniä käsittää sen, että suoritetaan transformoitujen solujen hajotus puskuroitujen kaotrofisten yhdisteiden läsnä ollessa, saostetaan lipidit ja kontaminoivat proteiinit hajotuksensa saadusta supernatantista, diasuodatetaan supernatantti, käsi-5 teilaan retentaattia piihapon kanssa, pestään kontaminoivat proteiinit piihappoon absorboidusta hepatiitti B -pinta-antigeenistä puskurilla, jonka pH on alueella 6-8, eluoidaan antigeeni piihaposta puskuroiduilla eluentilla, jonka pH on alueella 9,5-11, ja joka on urean suhteen 0,5 - 8 aolaari.nen, 10 saatetaan siten saadut antigeeniä sisältävät jakeet geeli.suodatukseen, ja sen jälkeen saatetaan antigeeniä sisältävä jae anioninvaihtokromatografiaan.
Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit annetaan käyttöön tämän 15 keksinnön mukaisen käytännön valaisemiseksi edelleen.
Esimerkit
Kannat
Pichia pastoris GS115 (hisA) NRRL Y-158S1 oli näissä esimer-20 keissä käytetty isäntähiivakanta.
Pichia pastoris PPFl (argA hisA) NRRL Y-18017.
E. coli MC1061 NRRL 18016.
25 E. coli JM103 delta (lac pro} thi rpsL (strA) supE endA sbcB hsdR.
• · • · · • · · • · · ·
Alustat ;1j1j30 YPD, 1 litra 20 g hiivauutetta 20 g peptonia * · 1 20 g dekstroosia • · · • · · LB-liemi, 1 litra 5,0 g hiivauutetta (Difco) • « · "·] 35 10,0 g tryptonia (Difco) *:·1: 5,0 g NaCl.-a « « « « · • · • t« • · · • · · · • · · « · · • · 107265 27 TE-puskuri 1,0 mM EDTA:a 0,01 M (pH 7,4) Tris-puskurissa 5 PEG-liuos 20 % polyetyleeniglykoli-3350:a 10 mM CaClÄ:a 10 mM Tris-HCl:a (pH 7,4) —steriloidaan suodattamalla 10 Liuos A 0,2 M Tris-HCl:a (pH 7,5) - 0,1 M MgClara 0,5 M NaCl:a 0,01 M ditiotreitolia (DTT) 15 Liuos B 0,2 M Tris-HCl:a (pH7,5) 0,1 M MgCla: a 0,1 M DTT:a 20X SSPE 4,4 g NaOH:a 20 7,4 g NasEDTA:a 27,6 g NaH=PCU-H=0:a 210 g NaCl:a — pH säädetään 7,5-8,0:ksi NaOH:11a — HaO:lla l litraksi . .'.25 10X Siirtopuskuri 5,0 g NaCl:a !’1! 96,8 g Trizma Base:a « « · ”1 ! 9,74 g glysiiniä • · · *· 1’ vedellä 1 litraksi • · · *30 ···
·.· 1 Esimerkki I
Vektorin TB04 konstruointi :T: Plasraidi AM6 on kuviossa 6 esitetyn HBV-genomin johdannainen, jossa pBR322-plasmidi on liitettynä BamHI-paikassa asemassa '.35 26.
• · ··«1· • · * • · · • · · • · · · * « · • · · • · 107265 28
Vektori T304 sisältää geenin, joka koodittaa hepatiitti ]) -pinta-antigeenin 281 aminohappoista preSs-muotoa. Geeni konstruoitiin kolmessa osassa: C-terminaalinen 75 % rakennegoe-nistä, N-terminaalinen linkkeri, joka koodittaa 13 aminohap-5 poa, ja jäljellä oleva keskiosa. Plasmidi AM6, joka sisäksi preSÄ-geenin, adw-serotyyppiä, oli lähteenä tässä käytetyille preSs-geenin C-terminaaliselle osalle ja keskiosalle. Sekvenssin ovat tuoneet esille Valenzuela et ai., ICN-UCLA Symposia on Animal Virus Genetics, ss. 57-70 (1980), seuraavasti 10 modifioituna:
natiivisekvenssi ATG-CAG-TGG-AAT-TCC
mutagenoitu sekvenssi ATG-CAG-TGG-AAC-TCC
15 A. PreS=»-geenin C-terminaalinen osa (Kaikki restriktioentsyymit saatiin Boehringer Mannheim’kta, ja niitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti).
C-terminaalinen osa eristettiin plasmidista AM6 (kuvio 1] 20 hydrolysoimalla Dral:llä, joka katkaisee HBV-genomin kahdessa paikassa, joista toinen on pinta-antigeenin viimeisen aminohapon kodonin kohdalla. Päät defosforyloitiin käsittelemiillä vasikan suoliston alkaalisella fosfataasilla 30 μΐ:n reak-tiotilavuudessa (1 U entsyymiä 37ec.-ssa 1 tunnin aikana 50 < : : :25 mM Tris .HC1 :ssä, pH 9,0, jossa 1 mM MgClÄ:a, 100 μΜ ZnCls;:a, '· 1 mM spermidiiniä) . Koko hydrolysaatti uutettiin fenolilla • · · · • ja seostettiin etanolilla (Maniatis et ai.). Oktameerinen • · · · .·. : Stul-linkkeri (AAGGCCTT) syntetisoitiin Applied Biosystens'in * · ·
Model 380A DNA-synteesilaitteella käyttäen syaanietyylifc sfo- 4 · « "... 30 ramidiittikeraiaa. 1 ug Stul-linkkeriä liuotettiin tislatt uun • · ·
* veteen. 10 ng:n erä poistettiin ja leimattiin fosfaatilla SO μ1:η kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 70 mM Tris.HCl:a, pH
• · ·
*.1 1 7,6, 10 mM MgClara, 5 mM ditiotreitolia, 1 mM ATP:a ja 1C
« i « V 1 yksikköä polynukleotidikinaasia, 30 minuutin aikana 37^:353.
....:35 Linkkereitä kuumennettiin 90°C:seen entsymaattisen reaktion » » lopettamiseksi, ja jäähdytettiin hitaasti huoneen lämpötilaan • · • · · « · · • · 1 · · • · · • · 107265 29 kaksijuosteisen DNA:n muodostumisen helpottamiseksi. Stul-linkkerit lisättiin edellä olevaan Dral-hydrolysaattiin ja ligoitiin T4-ligaasin kanssa seuraavasti. Reaktio tapahtui 10 ui:n tilavuudessa, joka sisälsi 6.6 M Tris.HCl:a, pH 7,6, 5 5 mM MgCl=:a, 5 mM ditiotreitolia, 1 mM ATP:a ja 1 Weissin yksikön T4-ligaasia, yhden tunnin aikana 23eC:ssa. Ligaatio-reaktio lopetettiin fenoliuutolla, jota seurasi etanolisaos-tus. Stul-restriktiohydrolyysi suoritettiin sen jälkeen >50 U:n kanssa entsyymiä yli yön, Stu-linkkerimultimeerien pois-10 taraiseksi. Dral-hydrolyysin ja Stul-linkkereiden yhdistelmä palautti translaation loppukodonin, jonka Dral-hydrolyysi 011 poistanut.
Stul:llä kytketyt Dral-palaset hydrolysoitiin Xbalrllä, mikä 15 tuotti halutun StuI/Xbal-palan, joka sisälsi suunnilleen 600 ep:a; se eristettiin 0,8-%:sta preparatiivisesta agaroosigee-listä. Tämä palanen sisälsi C-terminaalisen 75 7» geenistä, ja se kloonattiin vektoriin pYM4 (kuvio 2}, joka oli hydrolysoitu Xbalrllä ja Stul:llä, ja defosforyloitiin kuten edel-20 lä. (pYM4 voidaan saada plasmidista pYM30 hydrolysoimalla pYM30 Clalrllä ja ligoimalla päät uudelleen. pYM30 on saatavissa E. coli-isännässä, joka on talletettu the Northern Regional Research Center'ssä, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, talletusnumero NRRL B-15890). 25 pYM4:n 5,7 kertä sisältävä restriktiopalanen eristettiin 0,8-%:sta preparatiivisesta agaroosigeelistä. Vektoria pYM4 käy- ··" tettiin pelkästään sen sopivien restriktiopaikkojen takia.
• * : 50 ng vektoria ja 500 ng liitännäistä ligoitiin 23°C:ssa 1 • ·
!/·· tunnin aikana 50 mM Tris.HC1 .*ssä, pH 7,4, jossa oli 10 mM
: i :30 MgCls-ra. 10 mM ditiotrei tolia, 1 mM spermidiiniä, 1 mM ATP.-a ja 1 Weissin yksikkö T4-ligaasia 10 ui m tilavuudessa. Ligaa-tioreaktiota käytettiin suoraan transformoitaessa kompetent-teja MC1061-soluja (E. coli) ampisilliiniresistenteiksi. E.
I f « - coli -kantaa MC1061 on saatavissa the Northern Regional Re- « · « *. 35 search Center'stä, United States Department of Agriculture, ·:**: Peoria, Illinois, talletusnumerolla NRRL-18016. MC1061:n • * • · · « « · * » * • · • · · • 0 107265 30
genotyyppi on seuraavanlainen: F(-), ara D139 delta (lacCPO-ZY) X74 galk galU hsr hsm(+) rpsL delta (araABOIC leu) 7697. MCI061 tehtiin kompetentiksi transformaatiota varten seu:'aa-valla tavalla. E. coli MC1061:n keskilogaritmivaiheinen kas-5 vusto (50 ml) otettiin talteen sentrifugoimalla Damon IEO
DPR600 -sentrifugilla nopeudessa 3000 rpm 5 minuutin aikana Akeissa, ja pestiin 10 mM:ssa NaCl:ssa. Kasvusto suspendoi— tiin uudelleen 25 ml:aan 50 mM CaCl=;a 30 minuutin aikani 0eC:ssa. Solut sentrifugoitiin kuten edellä ja suspendoitiin 10 uudelleen 2 ml:aan 50 mM CaCla:a. Ligaatioreaktio lisättiin transformaatiota varten 100 ul:aan kompetenttia solususpansiota, ja inkuboitiin 0eC.-ssa jäiden päällä 15 minuutin aikana, kuumashokkikäsiteltiin 37*»C:ssa 5 minuutin ajan ja i iku-boitiin 23eC:ssa S minuutin ajan. Solut maljaviljeltiin auo-1S raan LB-agarmaljoille, jotka sisälsivät 50 ug/ml ampisilLii-niä. Maljoja inkuboitiin 37eC:ssa 10-16 tunnin ajan. Muodostuneet pesäkkeet otettiin talteen ja karakterisoitiin rest-riktiohydrolyysin avulla. Soluja kasvatettiin 5 mlrssa L-lientä, joka sisälsi 50 ug/ml arapisilliiniä, 5 tunnin ajan 20 37eC:ssa, ja DNA preparoitiin Birnboimin ja Dolyn menetelmällä [Nucleic Acids Research 7,1513 (1979)]. Pienimittaiset valmisteet hydrolysoitiin BamHI:llä ja Xbal:llä. Viljelmien, jotka tuottivat 1,5 ke:siä Xba/Bam-palasia, ajateltiin sisältävän insertin, ja yhden viljelmän suurimittainen DNA-valrais-, .25 te puhdistettiin kuten edellä, minkä jälkeen se jaettiin vyöhykkeisiin keesiumkloridietidiurabromidigradientissa. Tätä *·** kloonia nimitettiin koodilla pHSl.
• · · • · » ··· « • » · *· '· Plasmidi pHSl hydrolysoitiin Stul:llä, defosforyloitiin kuten • · · :.· :30 edellä, uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. EcoRI-♦ « * ·* linkkerit (GGAATTCC), jotka oli syntetisoitu kuten edellä,
fosforyloitiin, niiden annettiin itsekseen yhdistyä, ja ne liitettiin tähän tasapäiseksi tehtyyn DNA:hän. Ylimäärä link-.·:·. kareista poistettiin yön aikana EcoRI-hydrolyysillä , ja DNA
• t35 hydrolysoitiin myöhemmin Xbal:llä, minkä jälkeen uutettiin I M · ( fenolilla ja saostettiin etanolilla. Dupletti, joka sisälsi M I < I • · • « · ♦ · * « · · 107265 31 kiinnostuksen kohteena olevan 600 ep.-sen Xbal-EcoRI-palasen ja 582 ep:sen (Xbal-EcoRI) vektoripalasen, eristettiin 1- 7.:11a preparatiivisella geeiielektroforeesilla. Nämä palaset (500 ng) liitettiin Xbal-EcoRI:llä hydrolysoituun ja defosfo-5 ryloituun plasmidiin pUCIS (50 ng) . kuten edellä on kuvattu, ja niitä käytettiin transformoitaessa MC1061 ampisilliinille resistentiksi kuten edellä on kuvailtu. Pienimittaisen DNÄ-valmisteen restriktiohydrolysaatteja käytettiin sen määrittämiseksi, kumpi kahdesta palasesta oli kloonautunut. Ei-toi-10 vottu pala sisälsi Clal-paikan, niin että Clal/Xbal-kaksois-hydrolyysi tuottaisi suunnilleen 560 ep.-sia + 2400 ep:sia palasia, kun taas oikea palanen tuotti lineaarisen 3 ke:ta sisältävän palasen Clal/Xbal-hydrolyysissä. Kandidaatit hydrolysoitiin EcoRI:n ja Xbal:n kanssa, jolloin saatiin 600 15 ep:a + 2400 ep:a sisältäviä palasia. Yksi sellainen klooni puhdistettiin suuressa mittakaavassa, ja sitä nimitettiin koodilla pHS2-B. Tämä sisältää EcoRI-paikan viimeisen kodonin jälkeen täydellisen preSa-geenin C-terminaalisella alueella.
20 B. PreSss-geenin keskiosa
PreS=.-geenin keskiosa kloonattiin seuraavasti. Plasmidi AM6 hydrolysoitiin Xbalm ja BamHIm kanssa, ja 250 ep:a sisältävä palanen eristettiin 0,8-%:sta preparatiivisesta agaroosi-geelistä. Tämä pala (50 ng) ligoitiin kuten edellä on kuvail-: ‘:25 tu 50 ng:aan plasmidia pUC18, joka oli hydrolysoitu Xbal:n ja BamHIm kanssa, ja defosforyloitiin. Ligaatioreaktiota käytettiin transformoitaessa E. colin kanta MC1061 ampisil- • · · T I liinille resistentiksi kuten edellä. Pienimittaiset valmis- « » » teet hydrolysoitiin BamHI:llä, ja ne, jotka sisälsivät 2,7 • · « *·’ 130 ke:sen palasen, valittiin. Yhtä isolaattia kasvatettiin suu- • · · ’.· 1 ressa mitassa, ja DNA eristettiin ja puhdistettiin kuten on kuvailtu. Tätä kloonia nimitetään koodilla pPSl. Klooni kat- kaistiin EcoRI:llä ja BamHIrllä, ja vektorivyöhyke eristet- tiin ja puhdistettiin 0,8-%:sen preparatiivisen agaroosigee- '.35 lielektroforeesin avulla. Tähän vektoriin liitettiin seuraa- . vanlainen kinaasilla käsitelty kaksiruosteinen oligonukleoti- • » • · · • · · • · · · • · · • ·« « · 107265 32 di, joka oli syntetisoitu kuten edellä:
EcoRI Pstl BamHI 5’ AATTCAATCCGTCTGCAG 3’ S 31 GTTAGGCAGACGTCCTAG 51
Ligaatioreaktiota käytettiin transformoitaessa E. coli MC1061 ampisilliinille resistentiksi. Pienen mitan valmisteet karakterisoitiin Pstl-hydrolyysin avulla. Yksi klooni, joka jiisäl-10 si 250 ep:sen Pstl-palan, valittiin, suurimittainen DNA-pre-parointi suoritettiin, ja plasmidi pPS2 eristettiin.
C. PreSa-geenin N-terminaalinen osa N-terminaalinen alue, joka käsitti EcoRI-linkkerin ja kol-15 meatoista ensimmäistä aminohappoa koodittavat sekvenssit, muodostettiin synteettisestä oligonukleotidista, joka sisälsi seuraavan sekvenssin, joka oli syntetisoitu kuten edellä.·
Hindlll EcoRI Pstl 20 5’ AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3' 3’ ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG 5’ Tämä palanen sisälsi Hindlll- ja Pstl-päät, kuin myös ATG:tä edeltävän EcoRI-sekvenssin. Tämä sekvenssi kloonattiin Hln- 25 dIII:lla ja Pstl:llä hydrolysoituun ja defosforyloituun plas- midiin pUC18, ligoimalla kymmenkertainen ylimäärä oligoa ♦••j vektoriin, ja karakterisoimalla transformantit pienen EcoRI- ΐ·ϊ : paikan (noin 75 ep) läsnäolon perusteella. Sellaista kloonia • · merkittiin koodilla pTBO-2A.
:T:30
:T: Geenin keskiosa lisättiin hydrolysoimalla vektori pTBO-2A
Pstl:llä ja Xbal:llä; liitännäinen oli 250 ep:nen Pst-Xba-pala pPS2:sta. Transformantit karakterisoitiin >300 ep.-sen • ·
EcoRI-palan kuin myös 290 ep.-sen Xbal/Hindlll-palan läsnäolon *. 35 perusteella. Oikeaa isolaattia nimitettiin koodilla pTBO-3.
Kokonainen preS=-geeni saatiin aikaan liittämällä HindllC/- • · « « · · « · · · · • » 107265 33
Xbal-pala pTBO-3:sta Xbal/Hindlll:11a hydrolysoituun pHS2B:-hen. Ampisilliinille resistentit transformantit karakterisoitiin kuten edellä 825 ep:sen EcoRI-palan läsnäolon perusteella. Tätä rakennetta nimitettiin koodilla pTB04.
5
Esimerkki II
Vektorin pTBOSA konstruointi
Vektori, joka sisälsi geenin, joka koodittaa preSarta, konstruoitiin vektoreista pAO804 ja pTB04 (esimerkit V ja I, vas-10 taavasti). 2 ug plasmidia pAO804 hydrolysoitiin EcoRI:llä kuten edellä ja käsiteltiin alkaalisella fosfataasilla 30 μ1:η reaktiotilavuudessa (1 U entsyymiä 37^0:ssa 1 tunnin aikana 50 mM Tris.HCl:ssä pH 9,0, joka sisälsi 1 mM MgClÄ:a, 100 μΜ ZnCl»:a, 1 mM spermidiiniä) . pTB04 hydrolysoitiin Eco-15 Rl:llä, ja 825 ep:a sisältävä palanen, joka koodittaa preS*-geeniä, irrotettiin. Tämä palanen puhdistettiin käyttäen preparatiivista agaroosigeelielektroforeesia, jossa käytettiin 0,8-%:sta agaroosia. 500 ng palasta ja 50 ng pAO804:ää ligoitiin käyttäen esimerkissä I kuvailtuja menetelmiä. Muo-20 dostunutta vektoria käytettiin transformoitaessa MC1061 ampisilliinille resistentiksi, käyttäen esimerkissä I kuvailtua menetelmää. DNA eristettiin käyttäen Birnboimin ja Dolyn menetelmää [Nucleic Acids Research 7:1513 (1979)] ja karakterisoitiin hydrolysoimalla Pstl:llä. Kloonista, joka sisälsi 25 2,1 ke:sen Pstl-palan, määritettiin liitännäinen oikeassa orientaatiossa, ja sitä merkittiin koodilla pTBOSA.
·«»· • ·
··· · Esimerkki III
• · *.**: pTB047-templaatin konstruointi • · · V "30 1 ug kaksijuosteista ml3mpl8-DNA:ta (esimerkistä I) hydro- :T: lysoitiin EcoRI:llä ja defosforyloitiin käsittelemällä vasi kan suoliston alkaalisella fosfataasilla 30 μ1:η reaktiotila-vuudessa (1 U entsyymiä 37eC:ssa 1 tunnin aikana 50 mM Tris.- * i « HCl: ssä , pH 9,0, joka sisälsi 1 mM MgCls:a, 100 μΜ ZnCl=:a, • · · '· 35 1 mM spermidiiniä). 825 ep:a sisältävä EcoRI-palanen, joka sisälsi preSa-geenin, eristettiin pT804.*stä (katso esimerkki • · • · · • · · • « « « · • · * « «4 • · 107265 34 I) hydrolysoimalla EcoRIrllä, ja eristettiin sen jälkeen 0,8-%:sta preparatiivisesta agaroosigeelistä. 50 ng ml3mpl8-vektoria ja 500 ng EcoRI-liitännäistä ligoitiin T4 DNA -ligaa-sin kanssa seuraavasti. Reaktio tapahtui 10 μ1.·η tilavujdes-5 sa, joka sisälsi 6,6 M Tris.HCl:a, pH 7,6, 5 mM MgCle:a, 5 mM ditiotreitolia, 1 mM ATP:a ja 1 Weissin yksikön T4-ligaa-sia, 1 tunnin aikana 23eC:ssa.
Ligaatioseosta käytettiin sen jälkeen transformoitaessa E.
10 coli JM103 -soluja, jotka oli tehty kompetenteiksi seur,aavalla tavalla. E. coli JM103 -solujen keskilogaritmivaihee;;sa oleva kasvusto (50 ml) otettiin talteen sentrifugoimalla kliinisellä Damon IEC DPR600 -sentrifugilla nopeudessa 3000 rpm 5 minuutin aikana 4eC:ssa, ja pestiin 10 mM NaCl:ssn.
15 Viljelmä suspendoitiin uudelleen 25 ml:aan 50 mM CaCl=:n 30 minuutin aikana 0eC:ssa. Solut sentrifugoitiin kuten edellä ja suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan 50 mM CaCla:a.
Transformaatiota varten ligaatioreaktio lisättiin 100 μ].:aan 20 kompetenttia solususpensiota ja inkuboitiin 0eC:Ssa jäiden päällä 5 minuutin ajan. Solut viljeltiin sen jälkeen pehmyta-gariin, joka sisälsi IPTG:a ja X-gal:a, ja levitettiin I,B-alustoille ja inkuboitiin 37eC:ssa yli yön, ja maljoilta seulottiin kirkkaita plakkeja.
. ,,25
I < I
‘ Sen määrittämiseksi, mitkä plakit sisälsivät liitännäisen ”·· oikeassa orientaatiossa, valmistettiin kaksijuosteista ENA:- • · · ί·ί ’ ta, ja suoritettiin erilliset hydrolysoinnit EcoRI:llä ja • · ·.’·1 Xbal:llä. Liitännäisen initiaattorimetioniinin todettiin • · 1 V :30 olevan M13-yleisalukkeen vieressä, ja sen jälkeen voitiin luoda templaatti, joka sisälsi liitännäisen merkityksettömän * juosteen. Tätä merkittiin koodilla pTB047.
• · · • · · • i 1
Esimerkki IV
« i t ’· 35 pTBO-6: n ja pHB6 : n konstruointi * 1 DNA-sekvenssi, joka koodittaa HBsAg:n (S-muoto) 226 aminohap- • · · • · · • · · · • · · • · · • · 107265 35 poista muotoa, muodostettiin poistamalla 165 ep:a, jotka • koodittivat preS-s:n 55 ensimmäistä aminohappoa. Tämä toteutettiin altistamalla templaatti pTB047 (esimerkistä III) M13-alukekohdisteiseen deleetiomutageneesiin, käyttämällä seuraa-5 vaa oligonukleotidialuketta:
EcoRI
5' CGGGTACCGAGCTCGAATTCATGGAGAACATCACATCAGG 3' Tämä syntetisoitiin käyttäen Applied Biosystems’in Model 380A 10 DNA -synteesilaitetta käyttäen syaanietyylifosforamidiittike- miaa. Mutageneesi suoritettiin seuraavalla tavalla.
Suurimittainen minipreparointi suoritettiin positiivisilla plakeilla, joita oli inkuboitu suunnilleen 7 tunnin ajan 2 15 ml:ssa LB-alustaa. 25 ml:aan LB-alustaa siirrostettiin 250 Ui vastakasvatettuja JM103-soluja. Viljelmää kasvatettiin 1 tunnin ajan, ja siihen siirrostettiin 100 μΐ 7 tunnin ikäistä plakkiviljelmää. Kasvustoa kasvatettiin sen jälkeen yli yön. Kasvusto sentrifugoitiin kahdesti nopeudella 10000 rpm 10 20 minuutin aikana Sorvali RC-5B -roottorissa SS34, supernatan- tin kirkastamiseksi. 3,5 ml 20-%:sen PEG:n/2,5 M NaCl:h liuosta lisättiin kasvustoon, ja sitä inkuboitiin 5 tunnin ajan <1eC:ssa. Kasvustoa sentrifugoitiin sen jälkeen kuten edellä 10 minuutin aikana. Supernatantti hylättiin, ja pelletti , 25 suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan TE-puskuria. Pellettiä uu- tettiin sen jälkeen fenolilla (tasapainotettu TE:llä), uutet- •••i tiin kerran fenoli/klorofonnilla, uutettiin kahdesti CHC1».-- • 1 : 11a ja kerran eetterillä. 8 M LiCl:a lisättiin loppupitoisuu- • · Σ/·1 den 0,8 M saavuttamiseksi. 3 tilavuuserää etanolia lisättiin, :1:1:30 ja liuos jätettiin yöksi seisomaan 20ec.-ssa, läsnä olevan .1·1; DNA:n saostamiseksi. Liuos sentrifugoitiin sitten nopeudella 10000 rpm 10 minuutin ajan, kuten aikaisemmin on kuvailtu, ja huuhdeltiin 70-%:11a etanolilla. Sakka suspendoitiin uu-delleen 150 nl:aan 10 raM Tris.HCl:a, pH 7,4.
* » · • » · *. 35
Yksi pmooli M13-rekombinanttitemplaattia sekoitettiin 20 ♦ · • « » • · · • · » · • 1 · • · · • · 36 107265 praoolin kanssa oligonukleotidialuketta ja l μ1:η kanssa liuos A:ta. Tislattua vettä lisättiin, jotta saatiin lopputilavuu-deksi 10 ui. Näytettä inkuboitiin öS^c.-ssa 5 minuutin ajan, ja lämpötila alennettiin sen jälkeen 37eC:seen 30 minuutiksi. 5
Seuraavia komponentteja lisättiin sen jälkeen näytteeseen: Liuos B l ui 10 raM dATP 1 ui 10 mM dCTP 1 ui 10 10 mM dGTP 1 ui 10 mM d-TTP 1 ui 5u/ul Klenow 2 ui tisl. vesi 3 ui 20 ui 15 ja annettiin inkuboitua 15eC:ssa vähintään 4-6 tunnin ajan.
Näytettä laimennettiin sen jälkeen 1:40 tislatulla vedellä.5 ui:aa käytettiin transformoimaan 6 putkea, jotka sisälsivät kompetentteja JMl03-soluja (200 ui kussakin). Transformoidut 20 JM103-solut maljattiin LB-alustoille pehmytagar pintakerroksena. Positiiviset plakit seulottiin sen jälkeen suodatushy-bridisaatiolla. Hybridisaatiokoetin, joka oli komplementaarinen oligonukleotidialukkeen suhteen, syntetisoitiin kuten edellä on kuvailtu. 15 pmoolia tätä koetinta inkuboitiin 25 65**c:ssa 10 minuutin aikana kokonaistilavuudessa 25 ui. 3 ui 10X kinaasipuskuria (Maniatis et ai.), 1 μΐ 10 mM ATP:a, ja 1 ui polynukleotidikinaasia (100 U/μΙ) lisättiin. Näytettä ; inkuboitiin 1 tunnin ajan 37®C:ssa, ja se ajettiin Sephalex • · :1.· G-50 -kolonnin läpi. Ensimmäinen kolonnista tullut piikki :1Γί30 otettiin talteen.
• · · • · r • « ·
Nitroselluloosasuotimet valmistettiin edellä mainitulla Uoet- .·;·, timella hybridisaatiota varten, asettamalla ja suuntaamalla • · · suotimet transformaatiomaljoille 5-10 minuutiksi. Suotimet < 1 · '. 35 poistettiin sen jälkeen maljoilta, ja niitä kellutettiin denaturoivan liuoksen pinnalla (1,5 M NaCl, 0,5 N NaOH) 3 • · « « · • · · • « « « « · · • · · « · 107265 37 minuutin aikana, takasivun ollessa liuoksen päällä. Suotimet upotettiin denaturoivaan liuokseen 5 minuutin ajaksi ja siirrettiin sen jälkeen neutraloivaan liuokseen (1 M Tris.HCl, pH 8, 1,5 M NaCl) 5 minuutin ajaksi. Neutraloitu suodin siir-5 rettiin sen jälkeen 2X SSC-liuokseen (IX SSC on 150 raM NaCl:-a, 15 mM Na-sitraattia) 5 minuutin ajaksi. Suodin ilmakuivat-tiin, ja sitä paistettiin 1 tunnin ajan 801»C:ssa vakuumissa. Suotimia esihybridisoitiin 1 tunnin ajan 65°:ssa, saumatussa muovipussissa, joka sisälsi 5 ml hybridisaatiopuskuria, 10X 10 Denhardts:ia (IX Denhardts on 0,02 7» Ficoll.-ia, 0,02 7· poly-vinyylipyrrolidonia, 0,02 % naudan seerumin albumiinia}, 0,5 7. SDS:a, ja 5X SSPE:a. Puskuri korvattiin 5 ml:lla/suodin tuoretta hybridisaatiopuskuria. Aikaisemmin valmistettua radioaktiivista komplementaarista oligonukleotidia inkuboi-15 tiin ensin 651C:ssa 5 minuutin ajan, ja sen jälkeen lisättiin riittävä määrä koetinta tuoreeseen hybridisaatiopuskuriin, joka sisälsi suotimen, jotta saatiin 1 x 101· cpm/ml. Hybridisaatio suoritettiin 5eC:tta alle koettimen lasketun sula-mislämpötilan 4 tunnin aikana.
20
Suotimia pestiin sen jälkeen kolme kertaa, 10 minuuttia/ kerta, 6X SSC:n kanssa huoneen lämpötilassa. Suotimia pestiin lopuksi yhden kerran 6X SSCrllä hybridisaatiolämpötilassa.
Suotimet asetettiin 3 MM:n Whatman-paperille kuivatettaviksi, 25 ja valotettiin sen jälkeen filmille yön ajaksi (orientaatio merkittynä). Kolme positiivista plakkia poimittiin ja kasva- ...· tettiin kukin erikseen 2 ml:ssa LB-lientä 371C:ssa S tunnin : aikana.
• · · · • · • · · • r · • · .1:\30 Minitemplaattipreparointeja suoritettiin kullakin näistä • · · .·;·. positiivisista plakeista. Yksi ml plakkiviljelmää siirrettiin « « ·
Eppendorf-putkeen ja sentrifugoitiin 5 minuutin aikana Eppen- ... dorf Model 5414 -sentrifugilla. 800 μΐ supernatanttia otet- • · · *·1 1 tiin talteen, ja 200 μΐ 20-S:sta PEG:iä/2,5 M NaCl.-a lisät-
Ml V 135 tiin siihen. Supernatanttia inkuboitiin sen jälkeen huoneen ·:··· lämpötilassa 10 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 10 minuuttia • · • · · • · · • · · · • · · • · · • · 33 107265
Eppendorf-sentrifugissa. Supernatantti poistettiin aspiroi-malla, ja pelletti liuotettiin uudelleen 200 ul:aan TE:a (10 mM Tris;a, pH 7,4; l mM EDTA.-a). Uudelleenliuotettu pellatti uutettiin sen jälkeen fenoli/kloroformilla, ja ylemmän vasi-5 faasin sisältämä templaatti-DNA seostettiin lisäämällä LLC1-liuosta, kunnes saavutettiin 0,8 M LiCl-pitoisuus. 2,5-3 tilavuusosaa etanolia lisättiin, ja näyte saostettiin kuivan jään päällä 5 minuutin aikana. Saostumaa sentrifugoitiin 10 minuutin ajan, kuten edellä on kuvailtu. Lopulliseksi ti La-10 vuudeksi säädettiin 150 μΐ TE:llä.
200 ui kompetentteja JM103-soluja transformoitiin talteenote-tulla DNA; 11a. 1 μΐ eristetyn fagi-DNA:n 1/10-laimennusta käytettiin transformointiin. Transformaatioseos viljelti:.n, 15 ja plakit seulottiin oligonuleotidin kanssa, kuten aikaisemmin on kuvailtu.
Suuren mitan minipreparointi suoritettiin positiivisilla plakeilla, joita oli inkuboitu suunnilleen 7 tunnin ajan 2 20 mlrssa LB-alustaa. 25 ml: aan LB-alustaa siirrostettiin 2i>0 ui vasta kasvatettuja JM103-soluja. Viljelmää kasvatettiin yhden tunnin ajan, ja siihen siirrostettiin 100 μΐ 7 tunr.in ikäistä plakkikasvustoa. Viljelmää kasvatettiin sen jälkeen yli yön ja sentrifugoitiin sen jälkeen kahdesti nopeudella 25 lOOOOrpra 10 minuutin ajan Sorvali RC-5B -sentrifugin SS34- roottorissa, supernatantin kirkastamiseksi. 3,5 ml 20-%;ta PEG: iä/2,5 M NaCl.-a lisättiin viljelmään, ja sitä inkuboitiin 5 tuntia 4®C:ssa. Kasvusto sentrifugoitiin sen jälkeen kuten ;1·,· edellä 10 minuutin aikana. Supernatantti heitettiin pois, ja ;·:·.30 pelletti suspendoitiin uudelleen 2 ml: aan TE-puskuria. Pel- .•••c lettiä uutettiin sen jälkeen fenolilla, tasapainotettiin « · 1 TE;llä, uutettiin kerran fenoli/kloroformilla, uutettiin ... kahdesti CHCl^.-lla ja kerran eetterillä. 8 M LiClra lisät- • · · '·1 1 tiin, jotta saataisiin loppupitoisuudeksi 0,8 M. Kolme tila- < « < *·1 ‘35 vuusosaa etanolia lisättiin, ja liuos jätettiin seisomaan *:··· yli yön. läsnä olevan DNA:n saostamiseksi. Liuosta sentrifu-
IMU < I
« « « · • I «
I I I
· ♦ · # • ·» • · 107265 39 goitiin 10 minuutin ajan nopeudessa 10000 rpra kuten aikaisemmin on kuvailtu, ja huuhdeltiin 70-55:11a etanolilla. Sakka suspendoitiin uudelleen 150 ulraan 10 raM Tris:a (pH 7,4).
5 Positiiviset pesäkkeet identifioitiin pesäkehybridisaation avulla [Grunstein ja Hogness, PNAS 72,3961 (1975)] ja sekven-soitiin käyttäen dideoksisekvensointia niiden M13-rakenteiden löytämiseksi, jotka sisälsivät oikean mutaation. RF-DNA otettiin talteen käyttäen alkaalista hajotusmenetelmää, Maniatis 10 et ai. 678 ep:a sisältävä EcoRI-palanen eristettiin 0,8-5£:-sella preparatiivisella agaroosigeelillä ja subkloonattiin plasmideihin pA0804 ja pA0811 (katso esimerkit V ja VI, vastaavasti). E. coli MC1061 -soluja transformoitiin kummallakin näistä kahdesta vektorista, kuten on kuvailtu esimerkissä I.
15 Transformantit, jotka sisälsivät oikean orientaation, identi fioitiin pienen mitan DNA-valmisteiden Xbal-hydrolyysillä (myös kuvailtu esimerkissä .I). Toista transformanttia, joka saatiin pAO804:stä, nimitettiin koodilla pTB06; pA0311-pe-räistä transformanttia nimitettiin koodilla pHB6.
20
' Esimerkki V
pAO803:n ja pA0804:n konstruointi pAO804 on vektori, joka kykenee paikkaspesifiseen P. pastoris AOX1 -lokuksen katkaisemiseen. Se sisältää seuraavat elemeh- 25 tit: AOX1-promoottori ja kopioinnin lopettaja, joita erottaa ·.: erikoinen EcoRI-kloonauspaikka; villityyppisen Pichian HIS4- geeni; genominen DNA-osa AOXl-lokuksen 3’-päästä kopioinnin : lopettajan alapuolella; sekvenssit, jotka ovat välttämättömiä ··· · :1·,£ valikointiin ja replikointiin bakteeri-isännässä. Komponentit • · ,1;1.30 ovat järjestyneet siten, että vektorin restriktiohydrolysaa- • e · tista vapautuu DNA-palanen, joka sisältää ekspressiokasetin • · « ja selektoitavan markkerin, joiden päät ovat homologisia ... genomin jatkuvan osan, AOXl-lokuksen, suhteen, ja ne voidaan • ♦ · . 1·2 pysyvästi liittää kromosomiin transformaation aikana.
• « « ·.1 135 ·;··· pA0804 on hepatiitti B:n pinta-antigeeniekspressioplasmidin • · • « · • « · « · · « • « ♦ « · · 2 « · 107265 40 pBSAGISI johdannainen (NRRL 18021). Se koottiin pBR322-peräi-seen plasmidiin. joka sisälsi seuraavat modifikaatiot. pBR322 hydrolysoitiin EcoRIrllä, mitä seurasi fenoliuutto ja et:ano-lisaostus. Päät täytettiin sen jälkeen käyttäen Klenow-poly-S raeraasia. 2 ug EcoRI-hydrolysoitua plasmidia pBR322 inkvboi-tiin huoneen lämpötilassa 15 minuutin aikana 25 μΐ.-n res k-tiotilavuudessa. joka sisälsi 50 mM Tris.HCl.-a, pH 7,2, 10 mM MgSO-1.-a, 100 μΜ ditiotreitolia, 50 ug/ml naudan seerumin albumiinia, 100 μΜ dATP:a, 100 μΜ dTTP:a ja 1 yksikön Klenow-10 polymeraasia. Fenoliuuton ja etanolisaostuksen jälkeen ENA ligoitiin plasmidin sulkemiseksi, ja ligaatioreaktiota käytettiin transformoitaessa E. coli MC1061. Transformantteja seulottiin EcoRI-paikan puuttumisen suhteen, kuin myös diagnostisten paikkojen, kuten esimerkiksi PstI, PvuII ja Sali, 15 suhteen. Sellaista plasmidia nimitettiin koodilla pBR322-RI.
Tätä plasmidia-modifioitiin edelleen Bglll-paikan sisällyttämiseksi PvuII-paikkaan. Plasraidi hydrolysoitiin PvuII:11a,· ja fosforyloituja Bglll-linkkereitä (GAGATCTC) lisättiin 20 tasapääligaatiossa. Linkkeriylimäärä poistettiin yli yön kestäneellä Bglll-hydrolyysillä, ja plasmidi suljettiin jälleen käyttäen T4 DNA -ligaasia. Ligaatioreaktiota käytettiin transformoitaessa E. coli MC1061 ampisilliinille resisteitik-si. Transformantit karakterisoitiin restriktiohydrolyysiLlä 25 Bglll:n kanssa Bglll-paikan läsnäolon osoittamiseksi, ja Sall/Bglll-hydrolyysillä, mikä osoitti, että Bglll-paikki oli entisessä PvuII-paikassa. Tätä plasmidia merkittiin koo- : dilla PBR322 BglII-RI.
• · « · • I» « · .;'u30 - pA0804 ja pA0811 muodostettiin poistamalla DNA-palasia pDSA- • · n GI5I: sta , ja kokoamalla ne pBr322 BglII-RI:een. AOXl-lokuksen • · « 3’-pään kohdesegmentti poistettiin pBSAGISI:stä 700 ep:s<ma ... Bglll/XhoI-palana, josta 50 ng liitettiin 5 ngraan kantaplas- « · · * midia, jota oli hydrolysoitu Sällillä ja Bglll.-lla. Ligaa-*·' '35 tioreaktiota käytettiin transformoitaessa E. coli MC1061 ·;·· ampisilliinille resistentiksi. Transformantit karakterisoi- • « I « 4 « a « • i · • · · • 1 « « • · · • « · « · 107265
AI
tiin pienessä mitassa tehdyn DNA:n BamHI/Bglll-hydrolysaatin avulla, kuten on kuvailtu esimerkissä I, siten että suunnilleen 900 ep:a sisältävä pala todettiin. Yksi sellainen trans-formantti valittiin, ja DNA puhdistettiin suuressa mitassa.
5 Sellaiselle plasmidille annettiin nimi pAOBOi.
Plasmidi pBSAGISI hydrolysoitiin Clalrllä, ja 2,1 ke:nen palanen, joka sisälsi promoottori-geeni-terminaattori -eks-pressiokasetin, eristettiin. 2 ug plasmidia pAOSOi hydroly-10 soitiin Clalrllä ja käsiteltiin alkaalisella fosfataasilla 30 μΐ:n_reaktiotilavuudessa (1 U entsyymiä 371»C:ssa 1 tunnin aikana 50 roM Tris.HCl:ssä, joka sisälsi 1 mM MgCl2;a, 100 μΜ ZnCl2:a, 1 mM spermidiiniä). 50 ng Clal-palasta liitettiin 5 ng:aan pA0801-vektoria, ja ligaatioreaktioseosta käytettiin 15 transformoitaessa E. coli MC1061 ampisilliinille resistentik si. Nämä pesäkkeet karakterisoitiin Bglll-hydrolyysillä sen varmistamiseksi, että pala oli liittynyt ja oli oikeassa orientaatiossa, antaen 2,3 ja 2,7 kiloemäksisten palasten spektrin. Tätä yksinkertaista transformanttia nimitettiin 20 koodilla pAO802.
Plasmidi pAO802 hydrolysoitiin tunnusomaisessa Stul-paikassa hepatiitti B:n pinta-antigeenin geenin 3’-päässä. EcoRI-link-kerit fosforyloitiin, yhdistettiin ja ligoitiin Stul:llä 25 hydrolysoituun plasmidiin. Linkkeriylimäärä poistettiin yli < e yön kestäneellä EcoRI-hydrolyysillä. EcoRI-hydrolyysi katkai-see myös HBsAg-rakennegeenin 5’-päässä, poistaen siten gee- • · •tj · nin. Ligoitaessa uudelleen, promoottori ja kopioinnin ter- minaattori yhdistettiin tunnusomaisen EcoRI-paikan avulla.
• · •’•1;30 Ampisilliinille resistentit transformantit karakterisoitiin taas BgllX-hydrolyysin avulla, ja transformantti, joka sisäl- • · « si oikean spektrin (2,3 & 2,1 ke:tä) identifioitiin, ja sitä ... nimitettiin koodilla pA0803.
• · « • · · « » · « · « **|'35 Plasmidi pA0803 hydrolysoitiin BamHI:llä, ja 2,7 ke:stä si- sältävä pala pYMl0:stä (kuvio 8) eristettiin preparatiivisel- « • · «M • · · • · Λ ♦ * · ♦ • 1 · « · 107265 42 la agaroosigeelielektroforeesilla ja liitettiin BaraHI:lln hydrolysoituun defosforyloituun plasmidiin pA0803. CpYMlO on plasmidin pYJ30 (NRRL B-15890) johdannainen, BamHI-paikan asemassa 2959 ollessa tuhoutunut]. Transformantit karakte-5 risoitiin Xbal-paikan läsnäolon suhteen , tuottaen 7,4 ke:sen palasen ja 2,3 ja 5,1 ke:sen Bglll-spektrin. Tätä plasmidia nimitettiin koodilla pAO804.
Esimerkki VI
10 pA0811:n konstruointi
Toinen asiaan liittyvä plasmidi, joka sisältää Saccharomyces ARG4 -geenin Pichia HIS4 -geenin asemesta, konstruoitiin myös. Yksi mahdollinen ARG4-geenin lähde on 2,0 ke:nen Hpal-palanen, joka on saatu pYM25:stä, plasmidi E. coli-isänniissä 15 NRRL B-18015. Tämä plasmidi on saatavissa the Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture'sta, Peoria, Illinois.
Pala puhdistettiin 0,8-%:sta preparatiivisesta agaroosigee-20 lista.... 500 ng palasta liitettiin 50 ng.-aan BamHI: llä hydrolysoitua, täytettyä plasmidia pAO803 (katso esimerkki V). Ligaatioreaktiota käytettiin transformoitaessa E. coli MC1061 ampisilliinille resistentiksi. Transformantit karakterisoitiin Bglll-hydrolyysin avulla, ja oikea inserttikoko varmis-; ;‘;25 tettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Tätä plasmidia nimi-tettiin koodilla pA0811.
» * · • · ♦ · ·
Ύ \ Esimerkki VII
• · · '""n
Hiivan pienessä mitassa preparoitu DNA
• · · *•^*30 10“* solua/ml kasvatettiin 5 ral:ssa YPDrtä 30eC:ssa yli yön, *.* * ja pelletoitiin käyttäen kliinistä Damon IEC DPR600 -sent.ri- fugia nopeudella 3000 rpm 5 minuutin ajan. Pelletti suspen- • · · : doitiin uudelleen 0,5 ml .-aan 1 M sorbitolia, 0,1 ml: aan C ,5 M EDTA: a , pH 7,5, ja näyte siirrettiin 1,5 ml: n mikrofugd put- * .35 keen. 0,02 ml 2,5 mg/ml Zymolyase 60000 (Miles Laboratories)- . liuosta lisättiin, ja näytettä inkuboitiin 37®C:ssa 60 minuu- • · I i · • · 107265 43 tin ajan. Solut pelletoitiin käyttäen mikrofugia 1 minuutin ajan suurella nopeudella, ja suspendoitiin uudelleen 0,5 ml:aan 50 mM Tris.HCl:a pH 7,4 ja 20 mM EDTA:a. 0,05 ml loista SDS:ää lisättiin, näyte sekoitettiin, ja sitä inkuboi-5 tiin 65eC:ssa 30 minuutin ajan. 0,2 ml 5 M kaliumasetaattia, ja näytettä inkuboitiin jäiden päällä 60 minuuttia. Näyte sentrifugoitiin jälleen mikrofugissa suurella nopeudella 5 minuutin ajan.
10 Supernatantti siirrettiin uuteen 1,5 ml:n raikrofugiputkeen, ja 1 tilavuusosa isopropanolia lisättiin huoneen lämpötilassa. Näytettä sekoitettiin, ja sen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 5 minuuttia, sen jälkeen sitä sentrifugoitiin hyvin lyhyesti <10 sekuntia) mikrofugissa suurella nopeudel-15 la. Supernatantti kaadettiin pois, ja pelletti ilmakuivahtiin . Kun pelletti oli suspendoitu uudelleen 0,3 ml:aan 10 mM Tris.HClra, pH 7,4 ja 1 mM EDTA:a, lisättiin haiman 1 mg/ml RNaasi-liuosta, ja näytettä inkuboitiin 37eC:ssa 30 minuuttia. 0,03 ml 3 M natriumasetaattia lisättiin, näyte 20 sekoitettiin, ja 0,2 ml isopropanolia lisättiin. Näyte sentrifugoitiin mikrofugissa suurella nopeudella DNA:n pelletoi-miseksi. Supernatantti kaadettiin sen jälkeen pois, pelletti kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 0,1-0,3 ml:aan 10 mM Tris.HCl:a, pH 7,4 ja 1 mM EDTA:a. (Huomattakoon: ennen DNA:n , 25 käyttämistä restriktiohydrolyysissä, voi olla tarpeellista
< < I
sentrifugoida liuosta 15 minuuttia suurella nopeudella mikro- 1' . fugissa, kaiken liukenemattoman aineen poistamiseksi, joka « · * *;* j voi inhiboida hydrolyysiä).
4 · 4 • · · « · • · ·
; 30 Esimerkki VIII
• · · : Sekapartikkelikantojen kehittäminen
Kaksi sekapartikkelikantaa, jotka sisälsivät ekspressiokaset-:*·*; teja, jotka koodittavat hepatiitti B:n pinta-antigeenin S
. ;*j*; (p24)- ja preS= (p31)-muotoja, konstruoitiin seuraavasti.
•. 35 Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) transformoitiin 1 ug:lla ’ katkaisematonta pHB6-plasmidia, käyttäen Creggin et ai. ku- • · 0 « • · « « · 107265 44 vailemaa sferoplastitransformaatiotekniikkaa, 3io/Technology 5, 479 (1987). (pHB6 on pA08ll-plasmidin subklooni, joka sisältää S-geenin, jota on kuvailtu esimerkeissä IV ja /1). Transforaantit, jotka osoittivat arginiiniprototrofiaa, re-5 generoitiin rainimaalialustoilla, jotka sisälsivät histidii-niä, ja seulottiin integraatiokohdan suhteen seuraavasti.
Näiden transformanttien ja villityyppisen Pichia pastorLksen DNA:ta preparoitiin, kuten on kuvailtu esimerkissä VII, hyd-10 rolysoitiin EcoRI.-llä, ja elektroforesoitiin 0,8-%: 11a aga-roosilla. Näiden DNA-preparaattien Southern-blottaukset suoritettiin (Maniatis et ai. 1983), ja suotimet hybridiso.itiin AOXl-spesifisen koettimen (pPG4,0 NRRL no. 15868) kanssa tai HIS4-spesifisen koettimen (pYM4) kanssa. pYM4:ää on kuvattu 15 esimerkissä I.
Integraatiopaikka määritettiin vertailemalla tietyn transfor-mantin hybridisaatiospektriä villityyppiseen kantaan. Kaikki muutokset villityyppisen vyöhykkeen koossa olivat osoituksena 20 integraatiosta siinä lokuksessa. Transformanttia, joka sisäl si integraation AOXl-lokuksen 5'-päässä, ja silti sisälsi villityyppisen AOXi-geenin, kuin myös HIS4-mutaation, nd.mätettiin koodilla PPFl/pHB6.
« < < '< 25 Tähän kantaan transformoitiin sen jälkeen Bglll-katkaistu pTBOSA (esimerkistä II), kuten edellä on kuvailtu. Trans for- • · ·.· · mäntit, jotka osoittivat histidiiniprototrofiaa, regeneroi- tiin minimaalialustoilla ja seulottiin "metanolihidas" • · ;*·*; (Mut-) -fenotyypin suhteen, mikä osoitti AOXl-lokuksen integ- 30 raation. Fenotyyppiseulonta suoritettiin seuraavalla tavalla.
... Transformantit kerättiin yhteen raapimalla maljan pintaa • · · • · · steriilin tislatun veden läsnä ollessa, ja niitä sonikoitiin • « · *·[ * pienellä teholla 15 sekunnin ajan. Ne laimennettiin myöhemmin *:**:35 Αβ,οσ-arvoon = 0,1 ja siirrostettiin rinnakkaislaimennuksina ·:··! 10-3 ja 10ninimaalimaljoille, jotka sisälsivät glyserolia • · · • · · * « • * · • ·« « · 107265 45 hiilenlähteenä, ja niitä inkuboitiin 30°C:ssa 2-3 päivää.
Sen jälkeen ne toistomaljättiin minimaalimaljoille, joihin lisättiin 100 ui metanolia höyryfaasissa. 24-tuntisen inku-boinnin jälkeen 30eC:ssa oli ilmeistä, että 10-20 % transfor-5 mänteistä kasvoi hitaammin metanolilla kuin muut transforraan-tit. Kymmenen näistä hitaasti kasvavista pesäkkeistä valikoitiin sen jälkeen analysoitaviksi edelleen. Ne poimittiin · minimaalimaljalta, joka sisälsi glyserolia, niitä kasvatettiin ravistelupulloissa, kuten on kuvailtu esimerkissä IX, 10 ja niistä määritettiin 22 nm:ä vastaavan partikkelin aktiivisuus, kuten on kuvailtu esimerkissä XI. Transformantit karakterisoitiin, kuten on kuvailtu edellä pHB6:n osalta. Yhtä muodostettua kantaa nimitettiin koodilla PPFl/pTB012-l, ja se ilmensi yhden kopion sekä p24- että p31-proteiineja.
15
Toinen kanta identifioitiin, joka oli integroinut kaksi kopiota preSa-ekspressiokasetista. Sitä nimitettiin koodilla PPFl/pTB012-2, ja se ilmensi kahta kopiota preSa-geenistä, ja yhtä kopiota S-geenistä.
20
Partikkeliekspressiotasot esitetään taulukossa 3.
Taulukko 3 Partikkeliekspressiotasot
Kanta_Kasetti Proteiinit (AUSRIATt11) 25 PPFl/pTB012-l 1 preSa p31 noin 150-200 ug partikke- lia/ml lysaattia 1 S p24 • · : PPFl/pTB012-2 2 preSa p31 noin 150-200 ug partikke- • · :.1·· lia/ml lysaattia :T: 30 IS p24 ··« • · · • « ·
Lisäksi, SDS/PAGE-analyysi ja osittain puhdistetun proteii-nivalmisteen hopeavärjäys osoittivat sekä p24:n että p31.-n • · · läsnäolon.
« I « *. 35 • · • « t · · • · • · · » · · · » « · • · · 107265 46
Esimerkki IX
Ravistelupulloekspressiokokeet
Ennen fermentointia kaikkia kantoja kasvatettiin ravisteilu-pulloissa seuraavasti, ekspressiotasojen varmistamiseksi.
5 Transformantti siirrostettiin tavanomaisesti 0,67 —51- seen hiivan typpiperusalustaan, joka sisälsi 2-5 % glyserolia, ja sitä kasvatettiin yli yön 30eC:ssa keski- myöhäislogaritmi-seen vaiheeseen. Solut kerättiin sen jälkeen talteen sertri-fugoimalla, käyttäen kliinistä Damon IEC DPR600 -sentriiugia 10 nopeudella 3000 rpm 5 minuutin ajan. Pellettiä pestiin steriilissä vedessä kahdesti, se siirrostettiin sen jälkeer tiheydessä 0,5 A«.oo-yksikköä/ml fosfaattipuskuroituun 0,67-51:seen YNB:hen, joka sisälsi 1 % metanolia, ja sitä kasvatettiin 4-6 päivää 30eC:ssa kohtalaisessa sekoituksessa. Eri.
15 ajankohtina poistettiin näyte-eriä, jotka sisälsivät 50 A«00-yksikköä, ja niitä säilytettiin -20eC:ssa. Näistä näyte-eristä valmistettiin proteiiniuutteita käytettäviksi AUSRIA'™ (katso esimerkki XI(- ja Western blot-analyyseihin [Towbin . et ai. PNAS 76, 4350, (1979)]. Vasta-aine oli Calbiochem’in 20 Lot no. 702106, käytettynä 1:1000-laimennoksena. Solueriä (100 A1oo-yksikköä) siirrettiin borosilikaattisiin kasvatus-putkiin, 13 x 100 mm, ja niitä pestiin kahdesti sentrifugoi-raalla Sorvali Model RC-5B:ssä nopeudella 12000 rpm, 4eC:ssa 20:llä tilavuusosalla ha.iotuspuskuria [0,5 M NaCl: a, 0,1 7.
, ,',25 Triton X-100:a (w/v) , 1 M fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 10 mM natriumf osf aattia, pH 7,5]. Solunäytteet suspendoi-tiin uudelleen 0,5 gramman kanssa happopestyjä lasihelmi S
• · · ··· · (0,5 mm) plus 0,35 ml ha jotuspuskuria, ja niitä sekoitettiin • · · *· 1ϊ kahdeksan sekoituskertaa yhden minuutin intervallein maksi- • · · V 130 Alinopeudella, käyttäen pyörresekoittajaa. Intervallien välis-• ·« ί.ί · sä seosta jäähdytettiin jäissä vähintään yhden minuutin ajan.
Sen jälkeen kun hajotus oli lopetettu, rikottu solususpe isio ;1!1; poistettiin, ja lasihelmet pestiin 0,35 ml:11a hajotuspu:sku~ ria. Kyseiset kaksi liuosta yhdistettiin sen jälkeen ja ;»ent- • ,35 rifugoitiin. käyttäen Sorvali RC-5B:tä nopeudella 13000 rpm, 4°C:s s a, solujäänteiden poistamiseksi. Proteiininäytteet • « I « « • « « « « ♦ · « « • « · 107265 47 määritettiin sen jälkeen AUSRIA™- ja Western blot-analyy-seillä. Proteiinipitoisuus määritettiin Lowryn menetelmällä TCA-saostuksen jälkeen.
5 Esimerkki X
Fermentointiekspressiokokeet
Fermentaatiot suoritettiin seuraavasti. Viiteensataan ml .-aan Yeast Nitrogen Base (YNB)-alustaa + 2 7. glyserolia Fernbachin pullossa siirrostettiin ymppiviljelmää tai minimaaliglukoo-10 simaljaviljelmää. (Maljoja voidaan säilyttää siirrostaen kuukausittain ilman havaittavaa kannan degeneroitumista). Yhden ravistelupäivän jälkeen nopeudella 200 rpm 30°C:ssa, ymppi siirrostettiin 7,5 litraan minimaalialustaa (taulukko 4), joka sisälsi 480 g glyserolia, 40 mg biotiinia, ja 40 ml 15 hivensuolaliuosta (taulukko 5). Fermentoria pidettiin 30eC:- ssa ja pH:ssa 5,5 viljelmän kasvaessa panoskasvatuksena, kunnes glyseroli kului loppuun (noin 24 tuntia). pH:ta säädettiin lisäämällä NH0-kaasua. Glyserolin loppuminen havaittiin COs:n kehittymisen äkkinäisenä laskemisena ja liuenneen 20 hapen terävänä kohoamana (tai hapenottonopeuden laskuna).
Metanolin syöttö aloitettiin nopeudella 18 ml/h, fermentori-pitoisuuden saattamiseksi tasolle noin 0,5 % MeOH.-a saakka, ja sitä pidettiin tällä tasolla. Virtausnopeutta säädettiin perustuen metanolin todelliseen kulutusnopeuteen. Hivensuolo-25 ja lisättiin kahdenkymmenen ml:n erissä suunnilleen kahden päivän välein metanolin kulutusnopeuden ylläpitämiseksi.
HBsAg:n taso lisääntyi suunnilleen 7-8 päivää metanolisyötön • · · : aikana.
• « « « t • ·· :T?3o • · · • 1 · • · · • · · • · · • · · • · · • « · • · 1 35 • · • · * « · • · · · · • · · 107265 48
Taulukko A
Alustan koostumus (7.5 litraa) A80 g glyserolia AO mg biotiinia 5 134 ml HoPCU:ää (SS 7.) 5,8 g CaSO^.. 2HaO : ta 92 g H=SO^:ää 75 g MgSO1.. 7HssO: ta 21 g KOH:ia 1 10
Taulukko 5 ΙΜχ-hivensuolaliuos Kuprisulfaatti.SHssO 0,06
Kaliumjodidi 0,08 15 Mangaanisulfaatti.H=0 0,30
Natriummolybdaatti 0,20
Boorihappo 0,02
Sinkkisulfaatti.H=0 2,00
Ferrikloridi.HaO 4,8 20 Rikkihappo 5,00 ml/litra
Esimerkki XI
AUSRIA^-RIA-menettelyohje
Abbott'in AUSRIA™-raäärityspakkausta käytettiin Pichian tuo-, 25 tantosysteemin avulla syntetisoituneen HBsAgm määrän määrit- i f tämiseksi. Pakkauksen sisältämä vasta-aine sitoutuu HBsAg- ··-- partikkeleihin, ei HBsAg-monomeereihin. Kaikki laimennukset • · : tehtiin l,0-%:seen BSAihan, 0,02-55:seen Na-atsidiin fosf aat- ♦ · ♦,1·· tipuskuroidussa saliinissa, pH 7,4. Noudatettu menetteli’ :Ύ· 30 vastasi pääasiallisesti pakkausohjeissa selvitettyä ohjeitta. :1·1; Standardikäyrä valmistettiin seuraavasti.
• · · • · · • · · • · « • · « « · · *. 35 • 1 • · « · · « · · ♦ · · · • · · • « · • · -49 107265
Putki no. ns määrityksessä Puskuria(ul) Posit, kontr.ful) I- 4 ei N5B:tä ei 200 vain puskuria 5-6 0,1 195 5 7-8 0,2 190 10 S 9-10 0,5 175 25
II- 12 1,0 150 SO
13-14 2,0 100 100 15-16 3,0 50 150 17-18 4,0 ei 200 10
Mikrotiitterilevyn kaivoja merkittiin seuraavasti AA BB CC DD 112 3 4 15 2 5 6 7 8 3 9 10 11 12 4 13 14 15 16 5 17 18 19 20 jne...
20 Jokaiseen kaivoon lisättiin ensin helmet, sen jälkeen puskuri, ja lopuksi standardi (positiivinen kontrolli) tai laimennettu näyte. Tuntemattomat laimennettiin, niin että saatiin signaalit standardikäyrän alueelle. Näytepitoisuuksien estimaatit mg/ml:na jaettiin tyypillisesti 0,02:11a, jotta saa-. 25 tiin käytettävä laimennus. Tavallisesti.lisättiin 100 μΐ näytettä kaivoon, joka sisälsi 100 μΐ puskuria. Kaivot pei- ··** tettiin, ja tarjotinta kopautettiin kevyesti työtasoa vasten.
• · : Näytteitä inkuboitiin sen jälkeen yli yön huoneen lämpötilas- • · :.*·· sa, maksimaalisen sitoutumistehon saavuttamiseksi. Seuraavana : : :30 aamuna jokainen kaivo pestiin 4 kertaa deionisoidulla vedel-lä, käyttäen Pentawash-systeemiä, jonka oli toimittanut Abbott Labs. 200 μΐ 1SSJ anti-HBs:ää lisättiin jokaiseen kai-voon, tarjotinta kopautettiin kevyesti, ja sitä inkuboitiin • · · .···, sen jälkeen 45°C:sessa vesihauteessa 1 tunnin ajan. Helmet • · · 35 pestiin kuten edellä ja laskettiin. Tuntemattomien pitoisuu- ’·”· det määritettiin standardikäyrältä.
• « ·«« « « · • · · « « I » · • · ♦ • ·

Claims (9)

107265
1. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se käsittää a) vähintään yhden insertoitavan DNA-fragmentin, joka on 5'-AOX1-geenin toiminnallinen säätelyalue, jonka pituus on 5 noin yksi kiloemäs ja joka on eristetty Pichia oastoriksesta. toiminnallisesti kytkettynä b) S:n rakennegeenin, toiminnallisesti kytkettynä c) AOX1:n 31-pään lopetussekvenssiin, joka on eristetty Pichia pastoriksesta. ligatoituna 10 d) markkerigeenin, joka on ARG4, joka on eristetty Pichia pastoriksesta. ligatoituna e) toiseen insertoitavaan DNA-fragmenttiin, joka on noin 0,65 kiloemästä AOX1:n 3'-pään lopetussekvenssistä; tai a) vähintään yhden insertoitavan DNA-fragmentin, joka on .5'-15 AOX1-geenin toiminnallinen säätelyalue, jonka pituus on noin yksi kiloemäs ja joka on eristetty Pichia pastoriksesta. toiminnallisesti kytkettynä b) preS2:n rakennegeenin, toiminnallisesti kytkettynä • « · c) AOX1;n 3’-pään lopetussekvenssiin, joka on eristetty ΓΊ 20 Pichia pastoriksesta. ligatoituna • · · • · · • ·· ♦ d) markkerigeenin, joka on HIS4, joka on eristetty Pichia pastoriksesta. ligatoituna • · · • · · e) toiseen insertoitavaan DNA-fragmenttiin, joka on noin 0,65 kiloemästä A0X1:n 3'-pään lopetussekvenssistä. • ·
2. Metylotrofinen hiiva, tunnettu siitä, että se on trans· . formoitu vähintään yhdellä ekspressiokasetilla, joka käsittää • · · säätelyalueen, joka on toiminnallisesti kytketty preS2:n rs.- • ♦ *···* kennegeeniin, joka on toiminnallisesti kytketty 3'-pään lope- :Y: tussekvenssiin, ja vähintään yhdellä ekspressiokasetilla, ; o- ;\;30 ka käsittää säätelyalueen, joka on toiminnallisesti kytketty • · 107265 S:n rakennegeeniin, joka on. toiminnallisesti kytketty 3'-pään 1 ope tus s elevens s i in.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen metylotrofinen hiiva, tunnettu siitä, että hiiva on Pichia pastoria.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen metylotrofinen hiiva, tun nettu siitä, että hiiva on Pichia paat-.rvH käen kanta PPF1.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen metylotrofinen hiiva, tunnettu siitä, että mainittu Pichia paat-oris PPPi on transformoitu 10 a) vähintään yhdellä lineaarisella, paikkaspesifisellä yh- distelmävektorilla, joka käsittää sarjamaisesta järjestyneinä i) ensimmäisen insertoitavan DNA-fragmentin, ii) markkerigeenin ja vähintään yhden £ichia-yhteensopivan ekspresssiokasetin, joka sisältää preSasn rakennegeenin, 15 joka on toiminnallisesti kytketty iii) 3'-pään lopetussekvenssiin, joka valikoidaan ryhmästä, johon kuuluu 31-pään lopetussekvenssi eristettynä ΔΩΧ1-geenistä, p40-geenistä, DHAS-geenistä, ja HIS4-geenistä, jotka on eristetty Pichia paat-.orikssst.a, *20 iv) toisen insertoitavan DNA-fragmentin, «·«· : :1: jolloin markkerigeenin ja komponentti (ii):n kasetin keski- • · · 1 ,\j näistä järjestystä voidaan vaihtaa; ja • ( • · « • t 1 *·1 1 b) vähintään yhdellä paikkaspesifisellä yhdistelmävektoril- · la, joka sisältää seuraavan: i) vähintään yhden insertoitavan DNA-fragment in, « · * 1 1 ii· ii) markkerigeenin ja vähintään yhden 2ichia-yhteensopi- van ekspresssiokasetin, joka sisältää S:n rakennegeenin, joka .1··. on toiminnallisesti kytketty • · · • · • · • · · · • · · • ·« • · 107265 iii) 3'-pään lopetussekvenssiin, joka valikoidaan ryhmästä, johon kuuluu 3'-pään lopetussekvenssi eristettynä AOX1-geenistä, p40-geenistä, DHAS-geenistä, ja HIS4-geenistä, ;ot-ka on eristetty Pichia pastoriksesta. 5 jolloin markkerigeenin ja komponentti (ii):n kasetin keskinäistä järjestystä voidaan vaihtaa.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen metylotrofinen hiiva, tunnettu siitä, että yhdistelmävektori kohdassa (b) käsittää a) ensimmäisen ihsertoitavan DNA-fragmentin, joka on noir. 10 yhden kiloemäksen verran AOX1:n 5'-pään säätelyalueesta, joka on eristetty Pichia pastoriksesta. toiminnallisesti kytkettynä b) preS2:n rakennegeenin, toiminnallisesti kytkettynä c) AOX1:n 3'-pään lopetussekvenssiin, joka on eristetty
15 Pichia pastoriksesta. ligoituna d) markkerigeeniin, joka on Pichia pastoriksesta eristetty HIS4. ligoituna e) toiseen insertoitavaan DNA-fragmenttiin, joka on noin 0,65 kiloemästä AOX1:n 31-pään lopetussekvenssistä. I « ;< 20
7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen metylotrofinen hiiva, tun- • · · · :nettu siitä, että mainittu yhdistelmävektori kohdassa (a) kä-• · · * .·. : sittää • · · • « • · · *.* * a) ensimmäisen insertoitavan DNA-fragmentin, joka on noir • · · : yhden kiloemäksen verran AOX1:n 5'-pään säätelyalueesta, joka 25 on eristetty Pichia pastoriksesta. toiminnallisesti kytketty- * M ·:··: na t I b) S:n rakennegeenin, toiminnallisesti kytkettynä « · » · · • · .···. c) AOX1:n 3'-pään lopetussekvenssiin, joka on eristetty ’·* Pichia pastoriksesta. ligoituna • « ♦ « · • · • · · 107265 d) markkerigeeniin, joka on Saccharomyces cerevisiaesta eristetty ARG4. ligoituna e) toiseen insertoitavaan DNA-fragmenttiin, joka on noin 0,65 kiloemästä AOX1:n 3'-pään lopetussekvenssistä.
8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen metylotrofinen hiiva, tun nettu siitä, että mainittu Pichia pastoris PPF1 transformoidaan useammalla kuin yhdellä kopiolla mainitusta lineaarisesta paikkaspesifisestä yhdistelmävektorista.
9. Pichia pastoris PPF1 (NRRL Y-18017) transformoituna 10 pTB05A:n kahdella preS2-geenin kopiolla ja yhdellä S-geenin kopiolla (esimerkki II).
FI992546A 1988-05-13 1999-11-29 Hepatiitti B:n S- ja PreS2-proteiinien ilmentäminen metylotrofisissa hiivoissa FI107265B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19371488A 1988-05-13 1988-05-13
US19371488 1988-05-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI19992546A FI19992546A (fi) 1999-11-29
FI107265B true FI107265B (fi) 2001-06-29

Family

ID=22714736

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI892312A FI104639B (fi) 1988-05-13 1989-05-12 Hepatiitti B:n S- ja PreS2 -proteiinien ilmentäminen metylotrooppisissa hiivoissa
FI992546A FI107265B (fi) 1988-05-13 1999-11-29 Hepatiitti B:n S- ja PreS2-proteiinien ilmentäminen metylotrofisissa hiivoissa

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI892312A FI104639B (fi) 1988-05-13 1989-05-12 Hepatiitti B:n S- ja PreS2 -proteiinien ilmentäminen metylotrooppisissa hiivoissa

Country Status (25)

Country Link
US (2) US5670630A (fi)
EP (1) EP0341746B1 (fi)
JP (1) JP2614314B2 (fi)
KR (1) KR100193701B1 (fi)
CN (1) CN1038668A (fi)
AT (1) ATE151109T1 (fi)
AU (1) AU618596B2 (fi)
CA (1) CA1340617C (fi)
DD (1) DD285373A5 (fi)
DE (1) DE68927921T2 (fi)
DK (1) DK235289A (fi)
ES (1) ES2101676T3 (fi)
FI (2) FI104639B (fi)
GR (1) GR3023985T3 (fi)
HU (1) HU207532B (fi)
IE (1) IE81158B1 (fi)
IL (1) IL90161A0 (fi)
IN (1) IN171696B (fi)
MX (1) MX26715A (fi)
NO (1) NO300465B1 (fi)
NZ (1) NZ228948A (fi)
PL (1) PL161997B1 (fi)
PT (1) PT90553A (fi)
YU (1) YU98689A (fi)
ZA (1) ZA893440B (fi)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5032516A (en) * 1985-10-25 1991-07-16 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
PL168787B1 (pl) * 1989-08-03 1996-04-30 Smithkline Beecham Biolog Sposób wytwarzania czastki kompozytowej PL
GB9007416D0 (en) * 1990-04-02 1990-05-30 Wellcome Found Expression of heterologous protein in yeast
US6197548B1 (en) 1990-04-02 2001-03-06 Medeva Pharma Limited Transformed Pichia expressing the pertactin antigen
EP0521348A1 (en) * 1991-06-18 1993-01-07 Korea Institute Of Science And Technology Chimeric antibody with specificity for hepatitis B virus pre-S2 surface antigen and cell line producing same
LT3988B (en) 1992-02-17 1996-06-25 Fermentas Biotech Inst Recombinant plasmides pfs19, pfps2-48 and pjlfds1 codingsynthesis of human hepatite b of surfice virus antigenes, methods fof producing thereof
CA2101610A1 (en) * 1992-08-07 1994-02-08 William D. Prevatt Production of bacillus entomotoxins in methylotrophic yeast
GB9402832D0 (en) * 1994-02-15 1994-04-06 Smith Kline Beecham Biolog S A Novel process
US5955349A (en) * 1996-08-26 1999-09-21 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica
EP0889966A1 (en) * 1995-11-09 1999-01-13 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in pichia methanolica
US5716808A (en) * 1995-11-09 1998-02-10 Zymogenetics, Inc. Genetic engineering of pichia methanolica
MX9605082A (es) 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
JP2008500364A (ja) * 2004-05-25 2008-01-10 キメラコア， インコーポレイテッド 自己集合性ナノ粒子薬物送達システム
CN1704475A (zh) * 2004-05-31 2005-12-07 成都生物制品研究所 羧端含前s2免疫决定簇的乙肝表面抗原融合基因及蛋白质
EP1773861A4 (en) * 2004-07-22 2008-04-16 Glycofi Inc MALATE SYNTHASE REGULATION SEQUENCES FOR THE EXPRESSION OF A HETEROLOGOUS GENE IN PICHIA
CN100381171C (zh) * 2004-12-30 2008-04-16 成都生物制品研究所 含前s1、前s2和s抗原决定簇的乙肝表面抗原复合颗粒
CA2648581A1 (en) * 2006-04-07 2008-09-12 Chimeros, Inc. Compositions and methods for treating b- cell malignancies
WO2008124165A2 (en) * 2007-04-09 2008-10-16 Chimeros, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
AU2012305714A1 (en) 2011-09-09 2014-03-27 Biomed Realty, L.P. Methods and compositions for controlling assembly of viral proteins
ES2926021T3 (es) 2012-10-23 2022-10-21 Toolgen Inc Composición para escindir un ADN objetivo que comprende un ARN guía específico para el ADN objetivo y ácido nucleico codificador de proteína Cas o proteína Cas, y uso de la misma

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR76274B (fi) * 1981-08-04 1984-08-04 Univ California
EP0401941A3 (en) * 1984-07-11 1991-04-17 Takeda Chemical Industries, Ltd. Hepatitis b virus surface antigen and production thereof
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
US4816564A (en) * 1986-01-31 1989-03-28 Merck & Co., Inc. Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast
JPS62236496A (ja) * 1986-04-07 1987-10-16 Green Cross Corp:The ＨＢｓＡｇの製造方法
US4963483A (en) * 1987-10-13 1990-10-16 Merck & Co., Inc. Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast
IL89991A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of hepatitis b pres2 protein in methylotrophic yeasts

Also Published As

Publication number Publication date
NO891921L (no) 1989-11-14
ATE151109T1 (de) 1997-04-15
KR890017361A (ko) 1989-12-15
US5670630A (en) 1997-09-23
FI892312A0 (fi) 1989-05-12
GR3023985T3 (en) 1997-10-31
IE81158B1 (en) 2000-05-03
DD285373A5 (de) 1990-12-12
FI104639B (fi) 2000-03-15
FI892312A (fi) 1989-11-14
CN1038668A (zh) 1990-01-10
NO300465B1 (no) 1997-06-02
KR100193701B1 (ko) 1999-06-15
IE891563L (en) 1989-11-13
JP2614314B2 (ja) 1997-05-28
EP0341746B1 (en) 1997-04-02
MX26715A (es) 1993-10-01
PL161997B1 (pl) 1993-08-31
NZ228948A (en) 1991-06-25
ES2101676T3 (es) 1997-07-16
DE68927921T2 (de) 1997-07-17
PL279426A1 (en) 1990-01-22
NO891921D0 (no) 1989-05-11
CA1340617C (en) 1999-06-29
DE68927921D1 (de) 1997-05-07
AU618596B2 (en) 1992-01-02
ZA893440B (en) 1990-01-31
EP0341746A2 (en) 1989-11-15
PT90553A (pt) 1989-11-30
FI19992546A (fi) 1999-11-29
HU207532B (en) 1993-04-28
AU3473489A (en) 1989-11-16
YU98689A (sh) 1992-07-20
EP0341746A3 (en) 1991-04-24
JPH0227990A (ja) 1990-01-30
IN171696B (fi) 1992-12-12
IL90161A0 (en) 1989-12-15
DK235289A (da) 1989-11-14
HUT52557A (en) 1990-07-28
DK235289D0 (da) 1989-05-12
US5650296A (en) 1997-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI107265B (fi) Hepatiitti B:n S- ja PreS2-proteiinien ilmentäminen metylotrofisissa hiivoissa
FI95929B (fi) Hepatitis B pinta-antigeenin tuotanto hiivassa
KR940005588B1 (ko) 효모에서 b형 간염 바이러스 단백질을 제조하는 방법
FI94427B (fi) Säätelyalue heterologista geeni-ilmaisua varten hiivassa
KR0181940B1 (ko) 변형된 HBsAg 라아지 단백질
USRE35749E (en) Constructs of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter and methods for expressing genes using said constructs
US5089398A (en) Enhanced yeast transcription employing hybrid GAPDH promoter region constructs
DK169152B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af et antistof mod HBsAg
AU605036B2 (en) Expression of hepatitis B2 pres protein in methylothrophic yeasts
AU619753B2 (en) Hepatitis b surface antigen vaccine
EP0301083A1 (en) Retroviral expression vectors and methods for producing hbv antigens
JPH06172392A (ja) 粒子を形成する多重ｂ型肝炎ウイルス表層タンパク質
EP0235430A1 (en) Novel protein and production thereof
PL168408B1 (pl) Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL
KR900005534B1 (ko) 복합 프로모터를 이용한 효모 발현 벡터에 의한 b형 간염 바이러스 표면항원들의 제조방법
EP0277770A1 (en) Alpha-mating factor promoter is modified by deleting pre-pro secretory leader sequence
IE903178L (en) Synthesis of human virus antigens by yeast

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired