JPH0227990A - メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ＳおよびＰｒｅＳ↓２タンパク質の発現 - Google Patents
メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ＳおよびＰｒｅＳ↓２タンパク質の発現Info
- Publication number
- JPH0227990A JPH0227990A JP1121313A JP12131389A JPH0227990A JP H0227990 A JPH0227990 A JP H0227990A JP 1121313 A JP1121313 A JP 1121313A JP 12131389 A JP12131389 A JP 12131389A JP H0227990 A JPH0227990 A JP H0227990A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- linked
- pichia pastoris
- isolated
- aox1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 172
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 title description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 28
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims abstract description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 121
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 88
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 88
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 40
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 39
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 26
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 claims description 24
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 claims description 24
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 21
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 claims description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 15
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 claims description 3
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 claims description 3
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 101100004044 Vigna radiata var. radiata AUX22B gene Proteins 0.000 claims description 3
- SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N mating hormone Chemical compound C([C@@H](C(=O)NC(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCS(C)=O)C(=O)NC(CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CN=CN1 SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N 0.000 claims description 3
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101710093617 Dihydroxyacetone synthase Proteins 0.000 claims 7
- PVFDPMYXCZLHKY-MLLWLMKGSA-M sodium [(1R,2R,4aR,8aS)-2-hydroxy-5-[(2E)-2-[(4S)-4-hydroxy-2-oxooxolan-3-ylidene]ethyl]-1,4a,6-trimethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl sulfate Chemical compound [Na+].C([C@@H]1[C@](C)(COS([O-])(=O)=O)[C@H](O)CC[C@]11C)CC(C)=C1C\C=C1/[C@H](O)COC1=O PVFDPMYXCZLHKY-MLLWLMKGSA-M 0.000 claims 7
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 claims 2
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 claims 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims 1
- 101150055569 arc4 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 41
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 37
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 18
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 18
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 10
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 10
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 8
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 3
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 3
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229910013470 LiC1 Inorganic materials 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical class [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJDPBWLDVFCXNP-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethyl dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OCCC#N NJDPBWLDVFCXNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 101100464927 Bacillus subtilis (strain 168) ppsB gene Proteins 0.000 description 1
- 101001047514 Bos taurus Lethal(2) giant larvae protein homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100035893 CD151 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101710118846 CD151 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100440696 Caenorhabditis elegans cor-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001070941 Castanea Species 0.000 description 1
- 235000014036 Castanea Nutrition 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001315286 Damon Species 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010067193 Formaldehyde transketolase Proteins 0.000 description 1
- 101150029299 G4 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241001149669 Hanseniaspora Species 0.000 description 1
- 101100351324 Homo sapiens PDPN gene Proteins 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100037265 Podoplanin Human genes 0.000 description 1
- -1 Polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 244000018633 Prunus armeniaca Species 0.000 description 1
- 235000009827 Prunus armeniaca Nutrition 0.000 description 1
- 101150095071 RGCC gene Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 101150101877 XI gene Proteins 0.000 description 1
- QMXBEONRRWKBHZ-UHFFFAOYSA-N [Na][Mo] Chemical compound [Na][Mo] QMXBEONRRWKBHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 101150012763 endA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 101150101299 gene 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 108010045897 polyalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 208000011571 secondary malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組換えＤＮＡバイオテクノロジー分野に関する
ものである。一つの局面では本発明は実質的にＢ型肝炎
Ｓタンパク質およびｐｒｅＳ２タンパク質からなる抗原
粒子をメチロトロフィヴク酵母内で増幅して発現させる
方法に関するものである。別の局面では本発明は新しい
ＤＮＡ分子およびそれを用いて形質転換した新しい酵母
株に関するものである。
ものである。一つの局面では本発明は実質的にＢ型肝炎
Ｓタンパク質およびｐｒｅＳ２タンパク質からなる抗原
粒子をメチロトロフィヴク酵母内で増幅して発現させる
方法に関するものである。別の局面では本発明は新しい
ＤＮＡ分子およびそれを用いて形質転換した新しい酵母
株に関するものである。
（従来の技術）
Ｂ型肝炎つイＡ／ス（Ｈｅｐａｔｉ ｔｉｓ Ｂ ｖｉ
ｒｕｓ ：ＨＢｖ）は急性および慢性の双方の疾患の原
因となり、世界的な公衆衛生問題、を投げかけている。
ｒｕｓ ：ＨＢｖ）は急性および慢性の双方の疾患の原
因となり、世界的な公衆衛生問題、を投げかけている。
ＨＢＶは進行性の重度肝臓障害、−次性癌および死を引
き起こし得る慢性的に衰弱する感染として現われる。多
くの場合には、患者は完全にＨＢＶから回復する。しか
し、ＨＢＶに感染した集団のなかで注目に値する割合の
患者は疾患を他者に移す可能性を持つ、疾患の慢性的保
有者となる。
き起こし得る慢性的に衰弱する感染として現われる。多
くの場合には、患者は完全にＨＢＶから回復する。しか
し、ＨＢＶに感染した集団のなかで注目に値する割合の
患者は疾患を他者に移す可能性を持つ、疾患の慢性的保
有者となる。
近年の組換えＤＮＡ技術の進歩によりＨＢ、Ｖの遺伝的
構造を明らかにするとともに、ＨＢＶに対するワクチン
を調製するための手段を与えるような多（の有用な方法
が提示されてきた。ＨＢＶゲノムは約３．２キロ塩基対
の部分的二本鎖ＤＮＡおよび共有結合したＤＮＡポリメ
ラーゼとともに２７ｎｍヌクレオカプシド中に封入され
ていることか知られている。ヌクレオカプシドは細胞性
脂質およびＢ形肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなるリ
ポタンパク質内に封入されている：これはウィルス粒子
（ｖｉｒｉｏｎ ）と呼ばれ、ｉｉ径は４２ ｎｍであ
る。
構造を明らかにするとともに、ＨＢＶに対するワクチン
を調製するための手段を与えるような多（の有用な方法
が提示されてきた。ＨＢＶゲノムは約３．２キロ塩基対
の部分的二本鎖ＤＮＡおよび共有結合したＤＮＡポリメ
ラーゼとともに２７ｎｍヌクレオカプシド中に封入され
ていることか知られている。ヌクレオカプシドは細胞性
脂質およびＢ形肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなるリ
ポタンパク質内に封入されている：これはウィルス粒子
（ｖｉｒｉｏｎ ）と呼ばれ、ｉｉ径は４２ ｎｍであ
る。
ウィルス被膜は、３種の異なるが関連した表面タンパク
質からなることも見いだされた。これらのタンパク質は
一般にＳ、 ｐｒｅＳ２、およびｐｒｅＳ。
質からなることも見いだされた。これらのタンパク質は
一般にＳ、 ｐｒｅＳ２、およびｐｒｅＳ。
タンパク質と呼ばれる。各々のウィルス粒子は３００〜
４００のＳタンパク質分子、および４０〜８０のｐｒｅ
Ｓ２およびｐｒｅＳエタンバク漬分子から構成される。
４００のＳタンパク質分子、および４０〜８０のｐｒｅ
Ｓ２およびｐｒｅＳエタンバク漬分子から構成される。
Ｓタンパク質は２２６アミノ酸からなり、通常のウィル
スｌｉ ＩＪボタンバク質被被膜主要な成分である。Ｓ
タンパク質は約２４〜２５キロダルトン（ＫＤａ）であ
り、Ｐ２４あるいはＰ２５と表記される。Ｓタンパク質
はグリコジル化されて２７〜２８キロダルトンの糖タン
パク質となることもあり、ＧＰ２７あるいはＧＰ２８と
も表記される。
スｌｉ ＩＪボタンバク質被被膜主要な成分である。Ｓ
タンパク質は約２４〜２５キロダルトン（ＫＤａ）であ
り、Ｐ２４あるいはＰ２５と表記される。Ｓタンパク質
はグリコジル化されて２７〜２８キロダルトンの糖タン
パク質となることもあり、ＧＰ２７あるいはＧＰ２８と
も表記される。
第二のＨＢｓＡｇタンパク質は９）８８２表面抗原であ
り、中期ＨＢｓＡｇポリペプチドとも呼ばれる。
り、中期ＨＢｓＡｇポリペプチドとも呼ばれる。
ｐｒｅＳ２はＳタンパク質のＮ末端に５５アミノ酸が付
加することによって形成される２８１アミノ緻からなる
。ｐｒｅＳ２タンパク質は約３１キロダルトンであり、
Ｐ３１タンパク質とも呼ばれる。
加することによって形成される２８１アミノ緻からなる
。ｐｒｅＳ２タンパク質は約３１キロダルトンであり、
Ｐ３１タンパク質とも呼ばれる。
ｐｒｅＳ２タンパク質は６３キロダルトンと６６キロダ
ルトンの二つのグリコジル化された状態があり、それぞ
れＧＰ３３およびＧＰ３６と表記される。この抗原は、
Ｓに反応しない人あるいは弱く反応する人の付加的な抗
原反応を引き起こすと考えられる。
ルトンの二つのグリコジル化された状態があり、それぞ
れＧＰ３３およびＧＰ３６と表記される。この抗原は、
Ｓに反応しない人あるいは弱く反応する人の付加的な抗
原反応を引き起こすと考えられる。
第三のＨＢｓＡｇタンパク質はｐｒｅ８１表面抗原であ
り、後期ＨＢＳＡｇポリペプチドとも呼ばれる。
り、後期ＨＢＳＡｇポリペプチドとも呼ばれる。
ｐｒｅＳ１４！３８９−４００７ ／酸（ＨＢＶ（７
）サブタイプに依存する）からなる、、ｐｒｅＳｌに特
異的な配列は、完全なｐｒｅＳ２タンパク質のＮ末端に
付加している１０８〜１１９アミノ酸からなる。
）サブタイプに依存する）からなる、、ｐｒｅＳｌに特
異的な配列は、完全なｐｒｅＳ２タンパク質のＮ末端に
付加している１０８〜１１９アミノ酸からなる。
ｐｒｅＳ１タンパク質は約４３キロダルトンであり。
Ｐ４３とも呼ばれる。ｐｒｅＳ工１ヱＣ，Ｐ４６糖タン
パク質と表記される４６キロダルトンのグリコジル化さ
れた状態でも存在する。
パク質と表記される４６キロダルトンのグリコジル化さ
れた状態でも存在する。
ＨＢＶの感染の過程において、完全なウイルスヌクレオ
カプシドはりボタンバク質被膜に扱われており、４２
ｎｍの粒子を形成する。ＨＢＶ感染の際に主にＳおよび
ｐｒｅＳ ２タンパク質からなりｐｒｅＳ□も含む空の
２２ｎｍ粒子も形成する。完全なウィルスヌクレオカプ
シドが感染性であるｄ）に対し、空の２２ ｎｍ粒子は
非感染性である。
カプシドはりボタンバク質被膜に扱われており、４２
ｎｍの粒子を形成する。ＨＢＶ感染の際に主にＳおよび
ｐｒｅＳ ２タンパク質からなりｐｒｅＳ□も含む空の
２２ｎｍ粒子も形成する。完全なウィルスヌクレオカプ
シドが感染性であるｄ）に対し、空の２２ ｎｍ粒子は
非感染性である。
しかし、空の粒子は免疫注す与えるｄ）に十分な免疫反
応を引き起こし、ＨＢＶに対するワクチンの調製に使用
することができる。
応を引き起こし、ＨＢＶに対するワクチンの調製に使用
することができる。
歴史的には、２２ ｎｍ粒子で調製されたＢ型肝炎ワク
チンはＨＢＶの保有者の血清から調製された。不運なこ
とに、ヒトの血清由来の２２ｎｍ粒子は感染性ＨＢＶ粒
子および他の血清由来病原菌を除（ために非常によ（精
製されなければならない。さらに、Ｂ型肝炎ワクチンの
調製はヒト血清の人手が制限され℃いるために厳しく制
限され℃きた。
チンはＨＢＶの保有者の血清から調製された。不運なこ
とに、ヒトの血清由来の２２ｎｍ粒子は感染性ＨＢＶ粒
子および他の血清由来病原菌を除（ために非常によ（精
製されなければならない。さらに、Ｂ型肝炎ワクチンの
調製はヒト血清の人手が制限され℃いるために厳しく制
限され℃きた。
組換えＤＮＡ技術を利用することにより、２２ｎｍ粒子
内の肝炎Ｓタンパク質を形質転換した開孔類細胞系およ
びサッカロミセス・セレビジエ内で発現あせることが可
能になった。現在用（・られている涌乳類細胞系は使用
するために高額の費用がかかり、サツカロミセス系はＳ
タンノ（り質が比較的少量しか産生されない。
内の肝炎Ｓタンパク質を形質転換した開孔類細胞系およ
びサッカロミセス・セレビジエ内で発現あせることが可
能になった。現在用（・られている涌乳類細胞系は使用
するために高額の費用がかかり、サツカロミセス系はＳ
タンノ（り質が比較的少量しか産生されない。
抗原性な持ち、ワクチンとし℃効果的である可能性のあ
るｐｒｅＳ２タンノ（り質を産生ずる努力（工通常困難
であるとされ℃きた。ｐｒｅＳ２タンノ、＜り質は組換
え系では非常にタンノくり質分解な受は易いことが知ら
れていた。タンノくり質分解により。
るｐｒｅＳ２タンノ（り質を産生ずる努力（工通常困難
であるとされ℃きた。ｐｒｅＳ２タンノ、＜り質は組換
え系では非常にタンノくり質分解な受は易いことが知ら
れていた。タンノくり質分解により。
ｐｒｅＳ２の抗原性を保持しない二つの小さなタンパク
質断片が得られる。さらに、ｐｒｅＳ２タンノ・り質は
組換え系におい１発現させることが非常に困難であった
。ｐｒｅＳ２の発現レベルは同一の組換え系で産生され
るＳタンノくり質のレベルの約１／１０である。
質断片が得られる。さらに、ｐｒｅＳ２タンノ・り質は
組換え系におい１発現させることが非常に困難であった
。ｐｒｅＳ２の発現レベルは同一の組換え系で産生され
るＳタンノくり質のレベルの約１／１０である。
Ｅ（ＢＶのＳタンパク質およびｐｒｅＳ２タンノくり質
な含む抗原性ＨＢＶ粒子の産生法の開発は本分野への重
要な寄与となるであろう。この粒子は、主要なＳタンノ
４り質とより抗原性が強−・可能性のあるｐｒｅＳ２タ
ンパク質とを、よりワクチンとして効果的な可能性のあ
る形態で結合させるであろ（発明が解決しようとする課
題） 本発明の一つの局面は、ＨＢＶのＳタンノくり質および
ｐｒｅＳ２タンパク質から実質的に構成される抗原ａＨ
ＢＶ粒子の改良された産生法である。
な含む抗原性ＨＢＶ粒子の産生法の開発は本分野への重
要な寄与となるであろう。この粒子は、主要なＳタンノ
４り質とより抗原性が強−・可能性のあるｐｒｅＳ２タ
ンパク質とを、よりワクチンとして効果的な可能性のあ
る形態で結合させるであろ（発明が解決しようとする課
題） 本発明の一つの局面は、ＨＢＶのＳタンノくり質および
ｐｒｅＳ２タンパク質から実質的に構成される抗原ａＨ
ＢＶ粒子の改良された産生法である。
本発明の別の局面は、Ｓタンノくり質およびｐｒｅＳ
タンパク質をコードするＤＮＡ配列な含む新ま しいベクターを与えることである。
タンパク質をコードするＤＮＡ配列な含む新ま しいベクターを与えることである。
本発明のさらに別の局面は、Ｓタンノくり質およびグリ
コジル化され℃いないｐｒｅＳ ２タンノくり質かもな
るＨＢＶ粒子の増幅された産生を行なうことができる１
種以上のベクターで形質転換した新しいメチロトロフィ
ック酵母を与えることである。
コジル化され℃いないｐｒｅＳ ２タンノくり質かもな
るＨＢＶ粒子の増幅された産生を行なうことができる１
種以上のベクターで形質転換した新しいメチロトロフィ
ック酵母を与えることである。
本発明のまた別の局面を耘Ｓタンパク質およびグリコジ
ル化されていないｐｒｅＳ２タンパク質からなる抗原性
ＨＢＶ粒子生産方法によつ℃生産された産物である。
ル化されていないｐｒｅＳ２タンパク質からなる抗原性
ＨＢＶ粒子生産方法によつ℃生産された産物である。
（課題を解決するための手段）
本発明は、Ｓタンパク質の構造遺伝子な含む宿主適合性
発現カセットおよびｐｒｅＳ２ タンノくり質の構造
遺伝子を含む少なくとも一つのベクター適合性発現カセ
ットでメチロトロフィック酵母を形質転換することおよ
び得られた形質転換体を粒子の産生に適した条件下で培
養することからなる、抗原１ＨＢｖ粒子の改良された生
産のための方法を与えるものである。
発現カセットおよびｐｒｅＳ２ タンノくり質の構造
遺伝子を含む少なくとも一つのベクター適合性発現カセ
ットでメチロトロフィック酵母を形質転換することおよ
び得られた形質転換体を粒子の産生に適した条件下で培
養することからなる、抗原１ＨＢｖ粒子の改良された生
産のための方法を与えるものである。
ここで図面について説明する。
第１図は、１位にＥｃｏＲ１部位がないｐＢＲ３２２由
来プラスミドであるｐＡＯ８０１の模式図であり、ｐＢ
Ｒ３２２のＰＶｕ１部位のかわりにＢｇｌ ［部位を有
し、ｐＢｓＡＧｌ ５１ （ＮＲＲＬ＃１８０２１ ）
由来の７００ ｂｐ ３′ＡＯＸ１ 位末端配列Ｂｇｌ
ｌｌ／Ｘｈｏ Ｉ 断片ヲ含す。
来プラスミドであるｐＡＯ８０１の模式図であり、ｐＢ
Ｒ３２２のＰＶｕ１部位のかわりにＢｇｌ ［部位を有
し、ｐＢｓＡＧｌ ５１ （ＮＲＲＬ＃１８０２１ ）
由来の７００ ｂｐ ３′ＡＯＸ１ 位末端配列Ｂｇｌ
ｌｌ／Ｘｈｏ Ｉ 断片ヲ含す。
第２図は、プラスミドｐＢＢＡＧ１５１ （Ｎ ＲＲＬ
＃１８０２１ ）由来のプロモーター遺伝子−ターミネ
ーター発現カセットがプラスミドｐＡＯ８Ｑ１ のＣ
ｌａｌ部位に挿入され℃いろ、ｐＡ０８０１由来のグラ
スミドｐＡＯ８０２の模式図である。
＃１８０２１ ）由来のプロモーター遺伝子−ターミネ
ーター発現カセットがプラスミドｐＡＯ８Ｑ１ のＣ
ｌａｌ部位に挿入され℃いろ、ｐＡ０８０１由来のグラ
スミドｐＡＯ８０２の模式図である。
第３図は％５ｔｕｌ−ＥｃｏＲ１消化によりＨＢＳＡｇ
コード領域を除き、同じ位置にＥｃｏ ｌ が挿入さ
れ℃いるｐＡ０８０２由来プラスミドであるｐＡＯ８０
りの模式図である。
コード領域を除き、同じ位置にＥｃｏ ｌ が挿入さ
れ℃いるｐＡ０８０２由来プラスミドであるｐＡＯ８０
りの模式図である。
第４図は、ｐＡＯ８０３をＢａｍＨＩで消化シ、サツカ
ロミセスＡＦｔＧ４遺伝子を服務２．Ｑｋｔ）断片を挿
入した。プラスミドｐＡ０８０３由来のｐＡＯ８１１の
模式図である。
ロミセスＡＦｔＧ４遺伝子を服務２．Ｑｋｔ）断片を挿
入した。プラスミドｐＡ０８０３由来のｐＡＯ８１１の
模式図である。
第５Ａ図は、プラスミドｐＡＯ８０１およびｐＡＯ８０
２の構造の模式図である。
２の構造の模式図である。
第５Ｂ図は、プラスミドｐＡＯ８０３およびｐＡＯ８ｔ
ｌの構造の模式図である。
ｌの構造の模式図である。
第６図は、ＨＢＶ血清型ａｄＷのｐｒ８ｓ２遺伝子を含
むＨＢＶの模式図である。プラスミドＡＭ＜５は第６図
に示されたＨＢＶゲノムの誘導体であり。
むＨＢＶの模式図である。プラスミドＡＭ＜５は第６図
に示されたＨＢＶゲノムの誘導体であり。
ｐＢＲ３２２プラスミドが２６位（７）Ｂａｍ８１部位
に挿入されている。
に挿入されている。
第７図は、ＢａｍＨ１部位に挿入されたピキア・パスト
リスＦ（１８４遺伝子を含むｐＢＦｔ３２２由来プジス
ミドであるｐＹＭ４ の模式図である。括弧はその制
限酵素部位が破壊されていることを示す。
リスＦ（１８４遺伝子を含むｐＢＦｔ３２２由来プジス
ミドであるｐＹＭ４ の模式図である。括弧はその制
限酵素部位が破壊されていることを示す。
ＨＩＳ４遺伝子ハｐＹＪ ３０ （ＮＲＲＬ Ｂ−１
５８９０）内の遺伝子として寄託されている。
５８９０）内の遺伝子として寄託されている。
第８図はグラスミドｐＹＭ１（１の模式図である。
ｐＹＭ１０ｓ！２９５９位のＢａｍ８１部位が破壊され
ている。ｐＹＪ３０ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９０）
の誘導体である。区内の括弧は制限酵素部位が破壊され
ていることを示す。
ている。ｐＹＪ３０ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９０）
の誘導体である。区内の括弧は制限酵素部位が破壊され
ていることを示す。
第９図は時計回りにＢｇｌｌからＢｇｌ ｌまでの断片
に直鎖状部位特異的組込みベクターを含むプラスミドｐ
ＡＯ８０４の模式図である。＃ｌｌ造遺伝子はこのグラ
スミドの唯一のＥｃｏ８１ 部位に挿入することがで
きる。
に直鎖状部位特異的組込みベクターを含むプラスミドｐ
ＡＯ８０４の模式図である。＃ｌｌ造遺伝子はこのグラ
スミドの唯一のＥｃｏ８１ 部位に挿入することがで
きる。
ｐｒｅＳ２構造遺伝子は本分野ではよく知られており、
ロー（ＬＯ）により塩基配列が決定された（ ｃｈａｒ
ａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｐｒｅＳ２Ｒｅｇｉｏ
ｎｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ 、 １
３５ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ Ｅ３．ｏｐｈｙ
ｓｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｔ−ｃａ
ｔｉｏｎｓ ３８２（１９８６））。本分野の多数の研
究者がこの構造遺伝子なりローン化し、ローおよびバレ
ンズエラ、（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ）、５ｙｎｔｈｅ
ｓｉｓａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ Ｙｅａｓｔ
ｏｆ ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢ ５ｕｒｆａｃｅ Ａｎ
ｔｉｇｅｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｃｏｎｔａｉ−ｎｉ
ｎｇ ｔｈｅ Ｐｏｌｙａｌｂｕｍｉｎ Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ、３Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１７（１９
８５）などのようにそれを発現させた。したがり℃、該
溝構造遺伝子合成されたものあるいは再分離されたもの
が本分野の研究者から得ることができる。あらゆる血清
型のｐｒｙｓ ２でも本発明の実施に使用できることも
認識されるであろ５゜ Ｓ構造遺伝子も本分野ではよ（知られており。
ロー（ＬＯ）により塩基配列が決定された（ ｃｈａｒ
ａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｐｒｅＳ２Ｒｅｇｉｏ
ｎｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ 、 １
３５ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ Ｅ３．ｏｐｈｙ
ｓｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｔ−ｃａ
ｔｉｏｎｓ ３８２（１９８６））。本分野の多数の研
究者がこの構造遺伝子なりローン化し、ローおよびバレ
ンズエラ、（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ）、５ｙｎｔｈｅ
ｓｉｓａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ Ｙｅａｓｔ
ｏｆ ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢ ５ｕｒｆａｃｅ Ａｎ
ｔｉｇｅｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｃｏｎｔａｉ−ｎｉ
ｎｇ ｔｈｅ Ｐｏｌｙａｌｂｕｍｉｎ Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ、３Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１７（１９
８５）などのようにそれを発現させた。したがり℃、該
溝構造遺伝子合成されたものあるいは再分離されたもの
が本分野の研究者から得ることができる。あらゆる血清
型のｐｒｙｓ ２でも本発明の実施に使用できることも
認識されるであろ５゜ Ｓ構造遺伝子も本分野ではよ（知られており。
これもロー（上述）により塩基配列が決定された。
該構造遺伝子は合成物あるいは再分離物として市販され
ており入手することができる。本発明の実施にはいかな
る血清型のＳも使用可能であることも理解されるであろ
う。
ており入手することができる。本発明の実施にはいかな
る血清型のＳも使用可能であることも理解されるであろ
う。
本発明の一つの態様の実施に使用したｐｒｅＳ ２構造
遺伝子血清型ａｄｗはプラスミドＡＭ６から得たもので
ある。プラスミドＡＭ６は第６図に示した１（ＢＶゲノ
ムに由来するものであり、Ｔ）ＢＦＩ３２２プラスミド
が２６の位置のＢａｍＨｉ部位に挿入されている。この
ｐｒｅＳ２構造遺伝子のヌクレオチド配列を表１に示す
。ここで用いたプラスミドはＭＣ１０６１などの適当な
大腸菌宿主内で増幅することができる。
遺伝子血清型ａｄｗはプラスミドＡＭ６から得たもので
ある。プラスミドＡＭ６は第６図に示した１（ＢＶゲノ
ムに由来するものであり、Ｔ）ＢＦＩ３２２プラスミド
が２６の位置のＢａｍＨｉ部位に挿入されている。この
ｐｒｅＳ２構造遺伝子のヌクレオチド配列を表１に示す
。ここで用いたプラスミドはＭＣ１０６１などの適当な
大腸菌宿主内で増幅することができる。
ｐｒｅＳ２構造遺伝子の二つの断片はプラスミドＡＭ６
から回収され、Ｎ末端の最初の１３アミノ酸のヌクレオ
チド配列が１ｎＶｉｔｒ’ｏで合成された。
から回収され、Ｎ末端の最初の１３アミノ酸のヌクレオ
チド配列が１ｎＶｉｔｒ’ｏで合成された。
ここで用いたヌクレオチド配列の合成は、ホスホトリエ
ステル、亜リン酸塩、あるいはシアンエチルホスホルア
ミダイト（ｃｙａｍｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍ
ｉｄｉｔｅ）化合物に基づいた化学的方法などの化学的
あるいは酸素的手段のいずれかによって行なうことがで
きる。
ステル、亜リン酸塩、あるいはシアンエチルホスホルア
ミダイト（ｃｙａｍｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍ
ｉｄｉｔｅ）化合物に基づいた化学的方法などの化学的
あるいは酸素的手段のいずれかによって行なうことがで
きる。
ｐｒｅＳ２構造遺伝子の７５％を含むＣ末端コード領域
はグラスミドＡＭ６のＤｒａｌ消化によって得られた。
はグラスミドＡＭ６のＤｒａｌ消化によって得られた。
Ｄｒａ ｌ消化は市販されているＤｒａｌエンドヌクレ
アーゼを用いて行なった（全てのエンドヌクレアーゼは
販売元の指示に従って使用した）。 次に、Ｄｒａｌ断
片をフェノールで抽出し、 エタノール沈殿を行なった
。
アーゼを用いて行なった（全てのエンドヌクレアーゼは
販売元の指示に従って使用した）。 次に、Ｄｒａｌ断
片をフェノールで抽出し、 エタノール沈殿を行なった
。
次に、通常のＤＮＡ合成法によりオクタマーの５ｊｕｌ
リンカ−（ＡＡＧＧＣＣＴＴ）を調製し、Ｔ４リガーゼ
を用いて平滑末端連結反応でＤｒａｌ断片に連結した。
リンカ−（ＡＡＧＧＣＣＴＴ）を調製し、Ｔ４リガーゼ
を用いて平滑末端連結反応でＤｒａｌ断片に連結した。
連結反応はフェノール抽出で停止させ、続いてエタノー
ル沈ｉ＊ｖ行なった。得られた断片は５ｔｕｌエンドヌ
クレアーゼで消化し、５ｔｕｌのマルチマーを除いた。
ル沈ｉ＊ｖ行なった。得られた断片は５ｔｕｌエンドヌ
クレアーゼで消化し、５ｔｕｌのマルチマーを除いた。
次に、５ｔｕｌリンカ−をつけた断片なＸｂａｌで消化
した。得られたｐｒｅＳ ２構造遺伝子のＣ末端コード
領域を含んだ約６００塩基対の５ｔｕｌ／Ｘｂａｌ断片
をゲル電気泳動で分離した。
した。得られたｐｒｅＳ ２構造遺伝子のＣ末端コード
領域を含んだ約６００塩基対の５ｔｕｌ／Ｘｂａｌ断片
をゲル電気泳動で分離した。
この６００塩基対断片を第２図のプラスミドｐＹＭ４の
アガロースゲル電気泳動で分離した５、７Ｋｂ Ｘｂａ
ｌ／Ｓｔｕ ｌ 消化産物にＴ４リガーゼを用いて
連結した。
アガロースゲル電気泳動で分離した５、７Ｋｂ Ｘｂａ
ｌ／Ｓｔｕ ｌ 消化産物にＴ４リガーゼを用いて
連結した。
連結反応混合液を次に直接、大腸菌コンピテント細胞（
ＭＣ１０６１）の形質転換に使用し、アンピシリン存在
下で培養した。正しく形質転換されたコロニーを選択し
、バーンボイム（Ｂ １ｒｎｂｏ ｉｎ ）とドリー（
Ｄｏｌｙ）の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡＣｉｄＳＲｅｓ
ｅａｒｃｈ ７ ： １５１３ （１９７９） に
よってプラスミドＤＮＡを抽出した。
ＭＣ１０６１）の形質転換に使用し、アンピシリン存在
下で培養した。正しく形質転換されたコロニーを選択し
、バーンボイム（Ｂ １ｒｎｂｏ ｉｎ ）とドリー（
Ｄｏｌｙ）の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡＣｉｄＳＲｅｓ
ｅａｒｃｈ ７ ： １５１３ （１９７９） に
よってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡを５ｊｕｌで消化し。
フェノール抽出およびエタノール沈澱を行なった。
ＥｃｏＲ１リンカ−を調製し、Ｔ４リガーゼで該５ｊｕ
ｌ断片に連結した。過剰のり／カーをＥｃｏＦｔｌ消化
によって除去した。このＥＯＯＲ１リンカ−をつけた断
片なさらにＸｂａ （で消化し、ｐｒａｓ２構造遺伝子
のＣ末端部分を含む断片を電気泳動によって分離した。
ｌ断片に連結した。過剰のり／カーをＥｃｏＦｔｌ消化
によって除去した。このＥＯＯＲ１リンカ−をつけた断
片なさらにＸｂａ （で消化し、ｐｒａｓ２構造遺伝子
のＣ末端部分を含む断片を電気泳動によって分離した。
ｘｂａ ｌ −ＥｃｏＲｌ消化産物をＸｂａｌ−ＥＣＯ
ＲＩで切断したｐＵＣ１８に連結した。連結混合液で大
Ｊｌコンピテント細胞（ＭＣ１０６１）を形質転換し、
アンピシリン存在下で培養した。ｐｒｅＳ２構造遺伝子
のＣ末端部分を含む形質転換体線側をＣ１ａｌおよびＸ
ｂａｌを用いた消化断片解析により℃選択した。この過
程で選択されたプラスミドなｐＨ３２−Ｂと命名した。
ＲＩで切断したｐＵＣ１８に連結した。連結混合液で大
Ｊｌコンピテント細胞（ＭＣ１０６１）を形質転換し、
アンピシリン存在下で培養した。ｐｒｅＳ２構造遺伝子
のＣ末端部分を含む形質転換体線側をＣ１ａｌおよびＸ
ｂａｌを用いた消化断片解析により℃選択した。この過
程で選択されたプラスミドなｐＨ３２−Ｂと命名した。
ｐｒｅＳ２遺伝子の中央部はまずプラスミドＡＭ６をＸ
ｂａｌおよびＢａｍＨｌで消化することにより回収した
。目的の２５０塩基対断片はゲル電気泳動によって分離
した。次に、２５０ｂｐＸｂａｌ／ＢａｍＨｌ断片をＸ
ｂａｌおよびＢＡｍＨｌ で消化したｐｔＪｃｉａに連
結し、大胞菌ＭＣ１６０１の形質転換に使用した。アン
ピシリン存在下で増殖する培養液について、プラスミド
ＤＮＡを回収して１３ａｍＨＩで消化することにより解
析した。電気泳動で２．７Ｋｂの直鎖状（１ｉｎｅａｒ
） 断片を含ｔｒ７’ ９スミドを目的の２５０ｂｐ
断片を含むものであると見なした。２５０ｂｐ断片を含
む形質転換本コロニーの一つを分離し、大量に培養した
。コロニーからプラスミドＤＮＡを分離、Ｎ製し、Ｅｃ
ｏＲｌとＢａｍＨＩで消化した。電気泳動によってベク
ターのバンドを分離した。ベクターは下に示すリン酸化
した二本鎖オリゴヌクレオチドをもちいて連結した。
ｂａｌおよびＢａｍＨｌで消化することにより回収した
。目的の２５０塩基対断片はゲル電気泳動によって分離
した。次に、２５０ｂｐＸｂａｌ／ＢａｍＨｌ断片をＸ
ｂａｌおよびＢＡｍＨｌ で消化したｐｔＪｃｉａに連
結し、大胞菌ＭＣ１６０１の形質転換に使用した。アン
ピシリン存在下で増殖する培養液について、プラスミド
ＤＮＡを回収して１３ａｍＨＩで消化することにより解
析した。電気泳動で２．７Ｋｂの直鎖状（１ｉｎｅａｒ
） 断片を含ｔｒ７’ ９スミドを目的の２５０ｂｐ
断片を含むものであると見なした。２５０ｂｐ断片を含
む形質転換本コロニーの一つを分離し、大量に培養した
。コロニーからプラスミドＤＮＡを分離、Ｎ製し、Ｅｃ
ｏＲｌとＢａｍＨＩで消化した。電気泳動によってベク
ターのバンドを分離した。ベクターは下に示すリン酸化
した二本鎖オリゴヌクレオチドをもちいて連結した。
Ｐｓｔｌ ＢａｍＨｌ
５’ ＡＡＴＴＣＡＡＴＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧ
３’３．１ＧＴＴＡＧＧＣＡＧＡＣＧＴＣＣＴＡＧ
５／連結反応混合液を大腸菌ＭＣ１６０１の形質転換に
使用し、正しい挿入断片を含むコロニーを、アンピシリ
ン耐性によって選択した。このプラスミドをｐＰＳ２と
命名した。
３’３．１ＧＴＴＡＧＧＣＡＧＡＣＧＴＣＣＴＡＧ
５／連結反応混合液を大腸菌ＭＣ１６０１の形質転換に
使用し、正しい挿入断片を含むコロニーを、アンピシリ
ン耐性によって選択した。このプラスミドをｐＰＳ２と
命名した。
ｐｒｅＳ２のＮ末端コード領域を以下の配列の合成オリ
ゴヌクレオチドとして調製した。
ゴヌクレオチドとして調製した。
１ｎｄ１
５／ＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＣ
ＴＣＣＡＡＣＴＴＡＡＧＴＡＣＧＴＯＡＣＣＴＴＧＡＧ
ＧＴ５ｔｌ ＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡ ３’
ＧＡＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧＡＧ ５’この配列
を１）ＵＣｌ３のＨｉｎｄｌとＰＳｔｌｉＣよる消化産
物にクローニングした。目的の形質転換体はＥｃｏＲ１
消化後に消化法動を行い、約７５ ｂｐの断片が存在す
ることによって確認した。この方法によって選択された
プラスミドをｐＴＢｏ−２Ａと命名した。
ＴＣＣＡＡＣＴＴＡＡＧＴＡＣＧＴＯＡＣＣＴＴＧＡＧ
ＧＴ５ｔｌ ＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡ ３’
ＧＡＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧＡＧ ５’この配列
を１）ＵＣｌ３のＨｉｎｄｌとＰＳｔｌｉＣよる消化産
物にクローニングした。目的の形質転換体はＥｃｏＲ１
消化後に消化法動を行い、約７５ ｂｐの断片が存在す
ることによって確認した。この方法によって選択された
プラスミドをｐＴＢｏ−２Ａと命名した。
該遺伝子の中央部を、ベクター１）ＴＢＯ−２ＡをＰｓ
ｔｌおよびＸｂａｌ で消化することによりっけ加え
た；挿入断片はｐｐｓ２由来の２５０ｂｐのＰｓｔｌ
−Ｘｂａ ｌ断片である。形質転換体は〉３００ｂｐの
ＥｃｏＲ１断片および２９０ｂｐのＸｂａＩ／Ｈｉｎｄ
ｌ 断片の存在によって確認した。正しい挿入が行な
われたグラスミドをｐＴＢＯ−３と命名した。完全なｐ
ｒｅＳ２遺伝子は、Ｘｂａｌ／Ｈｉｎｄ履で消化したｐ
）ｌｓ２ＢｌｃｐＴＢｏ−３由来ノＨｉｎｄ１／Ｘｂａ
ｌ断片を挿入することにより得た。アンピシリン耐性の
形質転換体を８２５ｂｐのＥＣ０ＲＩ断片の存在によっ
℃解析した。正しい構造のものをｐＴＢＯ４と名付けた
。
ｔｌおよびＸｂａｌ で消化することによりっけ加え
た；挿入断片はｐｐｓ２由来の２５０ｂｐのＰｓｔｌ
−Ｘｂａ ｌ断片である。形質転換体は〉３００ｂｐの
ＥｃｏＲ１断片および２９０ｂｐのＸｂａＩ／Ｈｉｎｄ
ｌ 断片の存在によって確認した。正しい挿入が行な
われたグラスミドをｐＴＢＯ−３と命名した。完全なｐ
ｒｅＳ２遺伝子は、Ｘｂａｌ／Ｈｉｎｄ履で消化したｐ
）ｌｓ２ＢｌｃｐＴＢｏ−３由来ノＨｉｎｄ１／Ｘｂａ
ｌ断片を挿入することにより得た。アンピシリン耐性の
形質転換体を８２５ｂｐのＥＣ０ＲＩ断片の存在によっ
℃解析した。正しい構造のものをｐＴＢＯ４と名付けた
。
上記の大腸菌の培養はいかなる適当な方法によっ℃も行
なうことかできる。一般的な大腸菌の培養法は本分野で
は既知であり、ここで用いられる株に特異的に多装とさ
れるそのいかなる応用法も本分野の通常の技術に熟達し
た者の能力内で行なわれる。
なうことかできる。一般的な大腸菌の培養法は本分野で
は既知であり、ここで用いられる株に特異的に多装とさ
れるそのいかなる応用法も本分野の通常の技術に熟達し
た者の能力内で行なわれる。
大腸菌からのプラスミドＤＮＡの回収は、その大きさの
小さいことおよび閉じた球状のスーパーへリヴクス形の
ために、いくつかの方法によって行なうことができる。
小さいことおよび閉じた球状のスーパーへリヴクス形の
ために、いくつかの方法によって行なうことができる。
例えば、菌を回収した後、宿主細胞を遠心でベレットに
し、再懸濁し℃溶菌させる。溶菌液を遠心し℃細胞残渣
を除去し、ＤＮＡを含む上溝を得る。次（／ｃフェノー
ル抽出を行い、ＤＮＡから他の混合物のはとんどを除く
。
し、再懸濁し℃溶菌させる。溶菌液を遠心し℃細胞残渣
を除去し、ＤＮＡを含む上溝を得る。次（／ｃフェノー
ル抽出を行い、ＤＮＡから他の混合物のはとんどを除く
。
フェノール抽出したＤＮＡは密度勾配遠心あるいはゲル
濾過によって大腸ｆｉＤＮＡからプラスミドＤＮＡを分
離する。上述の分離技術はよく知られ℃おり、これらの
技術を行なう多数の方法が知られている。
濾過によって大腸ｆｉＤＮＡからプラスミドＤＮＡを分
離する。上述の分離技術はよく知られ℃おり、これらの
技術を行なう多数の方法が知られている。
プラスミドのヌクレアーゼ消化は、ｐｒｅＳ２構造遺伝
子の回収を容易にするように選択したプラスミドを切断
する適当なエンドヌクレアーゼを選択して行な５．使用
するエンドヌクレアーゼはｐｒｅＳ２遺伝子が切り出さ
れるプラスミドに依存する。例えば、プラスミドＡＭ６
に含まれるｐｒｅＳ２構造遺伝子は実施例１に示すよう
に回収された。
子の回収を容易にするように選択したプラスミドを切断
する適当なエンドヌクレアーゼを選択して行な５．使用
するエンドヌクレアーゼはｐｒｅＳ２遺伝子が切り出さ
れるプラスミドに依存する。例えば、プラスミドＡＭ６
に含まれるｐｒｅＳ２構造遺伝子は実施例１に示すよう
に回収された。
ＤＮＡのゲＡ４ｆ気泳動ｔｔｐ、Ｇ、シーリー（Ｓｅａ
ｌｙ）とＥ、Ｍ、サザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ ）、ｅｅ
ｌ ＥｌｅｉＣｔｒＯｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ −Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａ
ｐｐｒｏａｃｈ （Ｄ。リックウッド（Ｒｉｃｋｗｏｏ
ｄ）、Ｂ、Ｄ、ヘイムス（ＨａｍｅＳ）ｉ集）ｐ、３９
（１９８２）などの既知の多数の方法で行な５ことがで
きる。溶出も使用したゲルに合った多数の方法１例えば
電気的溶出、拡散、ゲル溶解（アガロースゲル）、物理
的押出（アガロースゲル）などによって行なわれる。高
品質の低温融解アガロースなどの数種のゲルの場合には
溶出は必ずしも必要ではないことも知られている。
ｌｙ）とＥ、Ｍ、サザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ ）、ｅｅ
ｌ ＥｌｅｉＣｔｒＯｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ −Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａ
ｐｐｒｏａｃｈ （Ｄ。リックウッド（Ｒｉｃｋｗｏｏ
ｄ）、Ｂ、Ｄ、ヘイムス（ＨａｍｅＳ）ｉ集）ｐ、３９
（１９８２）などの既知の多数の方法で行な５ことがで
きる。溶出も使用したゲルに合った多数の方法１例えば
電気的溶出、拡散、ゲル溶解（アガロースゲル）、物理
的押出（アガロースゲル）などによって行なわれる。高
品質の低温融解アガロースなどの数種のゲルの場合には
溶出は必ずしも必要ではないことも知られている。
ｐｒｅＳ２構造遺伝子を含む断片あるいはその一部を含
む断片が分離されると、ベクターに挿入する前にさらな
る操作が必要となる。これらの操作には、リンカ−の付
加あるいは断片の平滑末端化などが含まれるがそれに制
限されるものではない。
む断片が分離されると、ベクターに挿入する前にさらな
る操作が必要となる。これらの操作には、リンカ−の付
加あるいは断片の平滑末端化などが含まれるがそれに制
限されるものではない。
本発明の一つの態様のために１Ｍ１３ミユータジエネシ
スによってｐｒｅＳ２遺伝子からＳ遺伝子を構築した。
スによってｐｒｅＳ２遺伝子からＳ遺伝子を構築した。
Ｍ１５ミュータジェネシスは最初の１６５塩基対（ｐｒ
ｅＳ２構造遺伝子の最初の５５アミノ酸をコードする）
を欠失させてＳ構造遺伝子のＡＴＧ開始コドンのすぐ５
′側にＥｃｏＲ１部位を挿入させるために行なった。Ｍ
１３ミュータジェネシス技術は本分野の通常の技術に熟
達した者にはよく知られ℃おり、使用し得る一つの代表
的な方法はシアー（ＺＯｌｌｅｒ ）およびスミス（Ｓ
ｍ ｉ ｔｈ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎＺｙｍｏ
ｌｏｇｙｌｏｏ ： ４６８（１９８３））の方法であ
る。ミュータジエネシスに必要なＭ１３ベクターおよび
試薬は、ニュー・イングランド・バイオラプズなどから
市販されている。
ｅＳ２構造遺伝子の最初の５５アミノ酸をコードする）
を欠失させてＳ構造遺伝子のＡＴＧ開始コドンのすぐ５
′側にＥｃｏＲ１部位を挿入させるために行なった。Ｍ
１３ミュータジェネシス技術は本分野の通常の技術に熟
達した者にはよく知られ℃おり、使用し得る一つの代表
的な方法はシアー（ＺＯｌｌｅｒ ）およびスミス（Ｓ
ｍ ｉ ｔｈ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎＺｙｍｏ
ｌｏｇｙｌｏｏ ： ４６８（１９８３））の方法であ
る。ミュータジエネシスに必要なＭ１３ベクターおよび
試薬は、ニュー・イングランド・バイオラプズなどから
市販されている。
上述のミュータジェネシスは１まずＭ１３ベクター（そ
の簡便さのためにｍ１３Ｔｎｐ１８な選択したが、他の
Ｍ１３ベクターも使用可能である）の二本鎖環状複製型
１丁なわちＲＦ ＶｃｐｒｅＳ２構造遺伝子を挿入する
ことから始める。プラスミドｐＴＢＯ４上のｐｒｅＳ２
構造遺伝子を大腸菌ＭＯＩ Ｏ６１内で増幅させ、プラ
スミドＤＮＡをバーンポイム（Ｂｉｒｍｌ）Ｏｉｍ ）
とドリー（Ｄｏｌｙ ）、 上述の方法で分離した。ｐ
ＴＢＯＪプラスミドを次にＥｃｏＲＩで消化した。ｐｒ
ｅＳ２構造遺伝子な含む約８２５塩基対のＥｃｏＲ１１
断片なゲル電気泳動によって分離した。この断片をｍ１
３ｍｐ１８のＥｃｏＲ１部位に挿入した。連結反応液を
次にＪＭｌｏｌあるいはＪＭ１０３などの大腸菌コンピ
テント細胞の形質転換に用いた。形質転換体は、目的の
断片がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を分断したことによ
り指示プレート上に青いプラークの代わりに透明なプラ
ークが形成される発色反応に基づいて選択した。
の簡便さのためにｍ１３Ｔｎｐ１８な選択したが、他の
Ｍ１３ベクターも使用可能である）の二本鎖環状複製型
１丁なわちＲＦ ＶｃｐｒｅＳ２構造遺伝子を挿入する
ことから始める。プラスミドｐＴＢＯ４上のｐｒｅＳ２
構造遺伝子を大腸菌ＭＯＩ Ｏ６１内で増幅させ、プラ
スミドＤＮＡをバーンポイム（Ｂｉｒｍｌ）Ｏｉｍ ）
とドリー（Ｄｏｌｙ ）、 上述の方法で分離した。ｐ
ＴＢＯＪプラスミドを次にＥｃｏＲＩで消化した。ｐｒ
ｅＳ２構造遺伝子な含む約８２５塩基対のＥｃｏＲ１１
断片なゲル電気泳動によって分離した。この断片をｍ１
３ｍｐ１８のＥｃｏＲ１部位に挿入した。連結反応液を
次にＪＭｌｏｌあるいはＪＭ１０３などの大腸菌コンピ
テント細胞の形質転換に用いた。形質転換体は、目的の
断片がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を分断したことによ
り指示プレート上に青いプラークの代わりに透明なプラ
ークが形成される発色反応に基づいて選択した。
挿入の向きは、塩基配列決定、エンドヌクレアーゼ消化
とゲル電気泳動他の適当な方法により℃決定した。開始
のメチオニンがＭ１３ユニノ（−サルプライマーの近傍
に挿入されているクローンの一つを分離し、最初のミュ
ータジエネシスに用（・た。
とゲル電気泳動他の適当な方法により℃決定した。開始
のメチオニンがＭ１３ユニノ（−サルプライマーの近傍
に挿入されているクローンの一つを分離し、最初のミュ
ータジエネシスに用（・た。
次に、以下のヌクレオチド配列からなる短いオリゴヌク
レオチドを１ｎＶｉｔｒｏで合成し・た：ＣＧＧＧＴ−
ＡＧＣＧＡ−ＧＣＴＣＧ−ＡＡＴＴＣ−ＡＴＧＧＡ−Ｇ
ＡＡＣＡ−ＴＣＡＣＡ−ＴＧＡＧＧ本発明の実施に用い
た合成配列は、酵素的ある（・は化学的手段のいずれか
で産生される。適当な手段としては、ホスホトリエステ
ル、ホスファイト、あるいはシアノエチルホスホルアミ
ダイト化合物に基づいた化学的方法が含まれるが、これ
に制限されるものではない。
レオチドを１ｎＶｉｔｒｏで合成し・た：ＣＧＧＧＴ−
ＡＧＣＧＡ−ＧＣＴＣＧ−ＡＡＴＴＣ−ＡＴＧＧＡ−Ｇ
ＡＡＣＡ−ＴＣＡＣＡ−ＴＧＡＧＧ本発明の実施に用い
た合成配列は、酵素的ある（・は化学的手段のいずれか
で産生される。適当な手段としては、ホスホトリエステ
ル、ホスファイト、あるいはシアノエチルホスホルアミ
ダイト化合物に基づいた化学的方法が含まれるが、これ
に制限されるものではない。
挿入した構造遺伝子を有する一本鎖型のＭ１３を調製し
た。ｐｒｅＳ２遺伝子の５′隣接領域およびＳコード領
域の５′末端と部分的に相補性のある合成オリゴヌクレ
オチドをｐｒｅＳ２構造遺伝子な含む一重鎖Ｍ１３ベク
ターにアニールさせた５部分的に相補性のある合成オリ
ゴヌクレオチドをブライマーとし、クレノー断片とデオ
キシオリゴヌクレオチド３リン酸を用い、４℃でｉｎ
ｖｉｔｒｏ テＤＮＡ合成を行なった。部分的相補性合
成オリゴヌクレオチドは環状鋳型Ｍ１３ｄ）に沿って伸
長させた。反応混合液をＪＭｌｏｌあるいはＪＭ１０３
のコンピテント細胞の形質転換に用いた。形質転換体は
プラークをニトロセルロースに移し、変異体−重鎖はハ
イブリダイズするがもとの鋳型ハノ・イブリダイズしな
いように放射性標識したオリゴヌクレオチドとハイブリ
ダイズさせることにより選択した。つぎに変異体を鋳型
の調製に用いそれをＪＭ１０３の形質転換に使用した。
た。ｐｒｅＳ２遺伝子の５′隣接領域およびＳコード領
域の５′末端と部分的に相補性のある合成オリゴヌクレ
オチドをｐｒｅＳ２構造遺伝子な含む一重鎖Ｍ１３ベク
ターにアニールさせた５部分的に相補性のある合成オリ
ゴヌクレオチドをブライマーとし、クレノー断片とデオ
キシオリゴヌクレオチド３リン酸を用い、４℃でｉｎ
ｖｉｔｒｏ テＤＮＡ合成を行なった。部分的相補性合
成オリゴヌクレオチドは環状鋳型Ｍ１３ｄ）に沿って伸
長させた。反応混合液をＪＭｌｏｌあるいはＪＭ１０３
のコンピテント細胞の形質転換に用いた。形質転換体は
プラークをニトロセルロースに移し、変異体−重鎖はハ
イブリダイズするがもとの鋳型ハノ・イブリダイズしな
いように放射性標識したオリゴヌクレオチドとハイブリ
ダイズさせることにより選択した。つぎに変異体を鋳型
の調製に用いそれをＪＭ１０３の形質転換に使用した。
これらの形質転換体を再度前述のように選択した。二次
スクリーニングでポジティブだったものの塩基配列を決
定し、正しい塩基配列を有するプラークを同定した。
スクリーニングでポジティブだったものの塩基配列を決
定し、正しい塩基配列を有するプラークを同定した。
これらのコロニーの二本鎖複製型ｐＮＡｆＩＩ：Ｅｃｏ
Ｒ１で消化し、Ｓ構造遺伝子を含む６７８塩基対断片を
分離した。この塩基配列を第２図に示す。
Ｒ１で消化し、Ｓ構造遺伝子を含む６７８塩基対断片を
分離した。この塩基配列を第２図に示す。
表
ＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＧ／ｌ；Ｃ；’Ｌ”（ｉ表２
（続き）
−終止コドン
ＳおよびｐｒｅＳ２構造遺伝子の分離後、該遺伝子はプ
ラスミドあるいは直鎖状部位特異的挿入ベクターなどの
適当なメチロトロフィック酵母ベクターに挿入される。
ラスミドあるいは直鎖状部位特異的挿入ベクターなどの
適当なメチロトロフィック酵母ベクターに挿入される。
本発明の実施に推奨されるベクターはピキア属に適する
ものであり、最も望ましいのはピキア・パストリスに適
合するものである。
ものであり、最も望ましいのはピキア・パストリスに適
合するものである。
プラスミドは以前から組換えＤＮＡ技術で使用されてき
た基本的な要素の一つである。プラスミドは微生物中に
見いだされる染色体外の環状二本鎖ＤＮＡである。プラ
スミドは細胞あたり１コピーあるいは多コピーで存在す
ることが見いだされている。プラスミドにはプラスミド
の複製に関する情報、すなわち細菌の複製のための複製
開始点が含まれている。形質転換された細胞中のプラス
ミドを形質で選択する手段となる一つ以上の情報もグラ
スミド上にコードされている。抗生物質耐性遺伝子ある
いは宿主に欠損している生化学的経路を相補する遺伝子
などの形質マーカーあるいは選択マーカーにより、形質
転換された家主細胞クローンが認識１選択されて維持さ
れることができる。
た基本的な要素の一つである。プラスミドは微生物中に
見いだされる染色体外の環状二本鎖ＤＮＡである。プラ
スミドは細胞あたり１コピーあるいは多コピーで存在す
ることが見いだされている。プラスミドにはプラスミド
の複製に関する情報、すなわち細菌の複製のための複製
開始点が含まれている。形質転換された細胞中のプラス
ミドを形質で選択する手段となる一つ以上の情報もグラ
スミド上にコードされている。抗生物質耐性遺伝子ある
いは宿主に欠損している生化学的経路を相補する遺伝子
などの形質マーカーあるいは選択マーカーにより、形質
転換された家主細胞クローンが認識１選択されて維持さ
れることができる。
メチロトロフィヴク酵母でｐｒｅＳ２あるいハＳ構造遺
伝子を発現させるためには、該遺伝子は使用可能な様式
で３′制御配列および６′終止配列に連結されていなけ
ればならず、これはベクターを介して宿主に挿入される
発現カセットな構成する。
伝子を発現させるためには、該遺伝子は使用可能な様式
で３′制御配列および６′終止配列に連結されていなけ
ればならず、これはベクターを介して宿主に挿入される
発現カセットな構成する。
以下の語句は、明確化のためにここで定義するものであ
る。
る。
使用可能な様式で連結−ｍ−要素がその機能を実行する
ために配置された位置関係な意味する。
ために配置された位置関係な意味する。
制御領域−ｍ−多様な刺激に反応し％ｍＲＮＡ転写率に
影響するＤＮＡ配配列、 ６′終止配列−−−ボリアデニル化を行なわせる配列な
どの、ｍＲＮＡの安定化に働く終止コドンの６′側の塩
基配配列、 °宿主適合性”とは、宿主内で通常の機能が働くような
ピキア由来の制御配列および３′終止配列などのＤＮＡ
配列を意味する。
影響するＤＮＡ配配列、 ６′終止配列−−−ボリアデニル化を行なわせる配列な
どの、ｍＲＮＡの安定化に働く終止コドンの６′側の塩
基配配列、 °宿主適合性”とは、宿主内で通常の機能が働くような
ピキア由来の制御配列および３′終止配列などのＤＮＡ
配列を意味する。
本発明の実施には、ヨーロッパ出願番号８６１１４７０
０．７号に記載されたりｖ−、グ（Ｏｒｅｇｇ）の直鎖
状部位特異的組込みベクターなどの組込みベクターが望
ましい。これは現在は、出版されたヨーロッパ出願２２
６７５２号（フィリップス・ペトロレウム社）として公
表されている。このようなベクターは少なくとも１）第
一の挿入可能ＤＮＡ断片：２）選択可能マーカー遺伝子
：および６）第二の挿入可能ＤＮＡ断片の該配置された
配列を含む。
０．７号に記載されたりｖ−、グ（Ｏｒｅｇｇ）の直鎖
状部位特異的組込みベクターなどの組込みベクターが望
ましい。これは現在は、出版されたヨーロッパ出願２２
６７５２号（フィリップス・ペトロレウム社）として公
表されている。このようなベクターは少なくとも１）第
一の挿入可能ＤＮＡ断片：２）選択可能マーカー遺伝子
：および６）第二の挿入可能ＤＮＡ断片の該配置された
配列を含む。
挿入可能ＤＮＡ断片はそれぞれ少なくとも約２００ ｂ
ｐであり、宿主のゲノムＤＮＡの一部と相同性のあるヌ
クレオチド配列を有する。直鎖状組込みベクターの多様
な要素は、発現カセット及び選択可能マーカー遺伝子が
第一の挿入ＯＴｔ止ＤＮＡ断片の３′末端と第二の挿入
可能ＤＮＡ断片の５′末端め間に位置するような直鎖状
ＤＮＡ断片を形成するように順に配置されろ。第一の挿
入可能ＤＮＡ断片および第二の挿入可能ＤＮＡ断片は互
いに。
ｐであり、宿主のゲノムＤＮＡの一部と相同性のあるヌ
クレオチド配列を有する。直鎖状組込みベクターの多様
な要素は、発現カセット及び選択可能マーカー遺伝子が
第一の挿入ＯＴｔ止ＤＮＡ断片の３′末端と第二の挿入
可能ＤＮＡ断片の５′末端め間に位置するような直鎖状
ＤＮＡ断片を形成するように順に配置されろ。第一の挿
入可能ＤＮＡ断片および第二の挿入可能ＤＮＡ断片は互
いに。
元来のゲノム上におけろ向きと同じ向きで該順に並べら
れた直鎖状断片上に並べられる。
れた直鎖状断片上に並べられる。
第一および第二の挿入可能ＤＮＡ断片とし℃有用なヌク
レオチド配列は、ゲノムの修飾が起こる元来のゲノム部
位の分断された部分と相同なヌクレオチド配列である。
レオチド配列は、ゲノムの修飾が起こる元来のゲノム部
位の分断された部分と相同なヌクレオチド配列である。
従って１例えば、ゲノム修飾がアルコールオキシダーゼ
遺伝子座で起こる場合には、用いられる第−及び第二の
挿入可能ＤＮＡ断片はアルコールオキシダーゼ遺伝子座
の分断された部分と相同な配列となる。本発明によるゲ
ノム修飾を行なうためには、二つの挿入可能ＤＮＡ断片
が元のゲノムに存在するのと同じ相対的向きで、直鎖状
断片中に互いに位置しなければならない。第一および第
二の挿入可能ＤＮＡ断片として使用可能なヌクレオチド
配列の例は、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸｌ ）遺
伝子、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＨＡＳｉ ）
遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子からなる群から選択された
ヌクレオチド配列である。ＡＯＸ１遺伝子、ＤＨＡＳｉ
遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子は１９８５
年１０月２９日に出願されたヨーロッパ特許出願８５１
１３７３７゜２号、現在は公開されたヨーロッパ特許出
願０１８３０７１号（フイリツプス・ベトロレウム社）
に含まれている。
遺伝子座で起こる場合には、用いられる第−及び第二の
挿入可能ＤＮＡ断片はアルコールオキシダーゼ遺伝子座
の分断された部分と相同な配列となる。本発明によるゲ
ノム修飾を行なうためには、二つの挿入可能ＤＮＡ断片
が元のゲノムに存在するのと同じ相対的向きで、直鎖状
断片中に互いに位置しなければならない。第一および第
二の挿入可能ＤＮＡ断片として使用可能なヌクレオチド
配列の例は、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸｌ ）遺
伝子、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＨＡＳｉ ）
遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子からなる群から選択された
ヌクレオチド配列である。ＡＯＸ１遺伝子、ＤＨＡＳｉ
遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子は１９８５
年１０月２９日に出願されたヨーロッパ特許出願８５１
１３７３７゜２号、現在は公開されたヨーロッパ特許出
願０１８３０７１号（フイリツプス・ベトロレウム社）
に含まれている。
第一の挿入可能ＤＮＡ断片を工発現カセットで使用され
る制御領域を含む使用可能な制御領域を含んでいる。発
現カセットの制御領域として第一の挿入可能ＤＮＡ断片
を使用することは１本発明の望ましい態様である。第４
図はカセットの制御領域として第一の挿入ＯＴ能ＤＮＡ
断片を用いたベクターの模式図である。
る制御領域を含む使用可能な制御領域を含んでいる。発
現カセットの制御領域として第一の挿入可能ＤＮＡ断片
を使用することは１本発明の望ましい態様である。第４
図はカセットの制御領域として第一の挿入ＯＴ能ＤＮＡ
断片を用いたベクターの模式図である。
さらに、第９図に示されているように、挿入部位および
６′終止配列は第一の挿入可能ＤＮＡ断片の３′側に接
して位置する。直鎖状部位特異的挿入ベクターのこの構
造は、適合性のある６′終止配列の付加を必要とするこ
となく構造遺伝子の挿入に適した部位を与えるというさ
らなる長所がある。
６′終止配列は第一の挿入可能ＤＮＡ断片の３′側に接
して位置する。直鎖状部位特異的挿入ベクターのこの構
造は、適合性のある６′終止配列の付加を必要とするこ
となく構造遺伝子の挿入に適した部位を与えるというさ
らなる長所がある。
また、宿主株の形質転換に使用される少なくとも一つの
選択可能マーカー遺伝子がＤＮＡに含まれていることも
必要である。これにより、形質転換されたＤＮＡが導入
されたこれらの菌の選択および分離が容易になる。マー
カー遺伝子は宿主が持っていない形質的特徴１例えば形
質転換されていない細胞では特異的アミノ酸生合成経路
で欠損している特定のアミノ酸産生能の回復あるいは抗
生物質耐性などを与える〇 選択可能マーカー遺伝子の例は、ピキア・パストリスお
よびサヴカロミセスーセレビジエ由来のＨＩＳ４遺伝子
およびＡＲＧ４遺伝子、サッカロミセス・セレビジエ由
来のインベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２）、あるいは大腸
菌転移可能因子Ｔｎ６０１またはＴ ｎ９０３由来のネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群
から選択される。
選択可能マーカー遺伝子がＤＮＡに含まれていることも
必要である。これにより、形質転換されたＤＮＡが導入
されたこれらの菌の選択および分離が容易になる。マー
カー遺伝子は宿主が持っていない形質的特徴１例えば形
質転換されていない細胞では特異的アミノ酸生合成経路
で欠損している特定のアミノ酸産生能の回復あるいは抗
生物質耐性などを与える〇 選択可能マーカー遺伝子の例は、ピキア・パストリスお
よびサヴカロミセスーセレビジエ由来のＨＩＳ４遺伝子
およびＡＲＧ４遺伝子、サッカロミセス・セレビジエ由
来のインベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２）、あるいは大腸
菌転移可能因子Ｔｎ６０１またはＴ ｎ９０３由来のネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群
から選択される。
例えば、細菌プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤ
ＮＡなどのさらなるＤＮＡ配列も本発明の実施で用いら
れるベクターに含められることは、本分野の通常の技術
に熟達した者に認識されるであろう。このような配列に
より、これらのベクターの細菌宿主に於ける増幅および
維持が可能になる。
ＮＡなどのさらなるＤＮＡ配列も本発明の実施で用いら
れるベクターに含められることは、本分野の通常の技術
に熟達した者に認識されるであろう。このような配列に
より、これらのベクターの細菌宿主に於ける増幅および
維持が可能になる。
第一の挿入ＤＮＡ断片が制御領域を含まない場合には、
使用可能な発現カセットを得るためには適当な制御領域
を使用可能な様式で該構造遺伝子に連結させて挿入する
ことが必要となる。同様に。
使用可能な発現カセットを得るためには適当な制御領域
を使用可能な様式で該構造遺伝子に連結させて挿入する
ことが必要となる。同様に。
３′終止配列は挿入部位に与えられていない場合には、
発現カセットを完全にするために、６′終止配列を使用
ｏＴ能な様式で構造遺伝子に連結されて挿入することが
必要である。
発現カセットを完全にするために、６′終止配列を使用
ｏＴ能な様式で構造遺伝子に連結されて挿入することが
必要である。
本分野の通常の技術に熟達した者は、解析されていてメ
チロトロフィヴク酵母と関連して使用できる多数の制御
領域に気づくであろう、制御領域の例としては、サッカ
ロミセス・セレビジエから分離された酸ホスファターゼ
、ガラクトキナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チ
トクロームＣ５α接合因子およびグリセルアルデヒド６
リン酸デヒドロゲナーゼの制御領域；ピキア・パストリ
スから分離された第一アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ
ｌ）、ジヒドロキシアセトノシンターゼ（ＤＨＡＳｌ）
、Ｐ４Ｏの制御領域および８丁８４制御領域などからな
る群から選択される酵母制御領域を金石が、これに制限
されろものではない。本発明の実施に用いる望ましい制
御領域は現在のところＡＯＸｌ、ＤＨＡＳ１、Ｐ２Ｏか
らなる群から選択される制御領域のような、メタノール
含有培地に反応する能力によって特徴づけられるもので
あり、１８９５年１０月２９日に出願されたヨーロッパ
特許用８８５１１３７３７．２号に開示されており、現
在は公開されたヨーロッパ特許出願０１８３０７１号と
して開示されている。
チロトロフィヴク酵母と関連して使用できる多数の制御
領域に気づくであろう、制御領域の例としては、サッカ
ロミセス・セレビジエから分離された酸ホスファターゼ
、ガラクトキナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チ
トクロームＣ５α接合因子およびグリセルアルデヒド６
リン酸デヒドロゲナーゼの制御領域；ピキア・パストリ
スから分離された第一アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ
ｌ）、ジヒドロキシアセトノシンターゼ（ＤＨＡＳｌ）
、Ｐ４Ｏの制御領域および８丁８４制御領域などからな
る群から選択される酵母制御領域を金石が、これに制限
されろものではない。本発明の実施に用いる望ましい制
御領域は現在のところＡＯＸｌ、ＤＨＡＳ１、Ｐ２Ｏか
らなる群から選択される制御領域のような、メタノール
含有培地に反応する能力によって特徴づけられるもので
あり、１８９５年１０月２９日に出願されたヨーロッパ
特許用８８５１１３７３７．２号に開示されており、現
在は公開されたヨーロッパ特許出願０１８３０７１号と
して開示されている。
本発明の実施に最も推奨されろ制御領域はＡＯＸ１制御
領域である。
領域である。
６′終止配列は上述のように発現力セクトあるいはベク
ターの一部として使用され得る。６′終止配列は構造遺
伝子と使用可能な様式で連結すると該遺伝子にコードさ
れるメツセンジャーＲＮＡの終止、ポリアデニル化、お
よび／あるいは安定化に働く。本発明の実施のための６
′終止配列の典型的な由来のいくつかの例としては、サ
ッカロミセス・セレビジエハンセヌラ１ポリモルファ
（Ｈａｎｓｅｎｕ、ｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ） 、
およびピキアの６′終止配列が含まれるが、これに制限
されろものではない。望ま遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子
の３′終終止列からなる群から選択されるようなピキア
・パストリス由来のものである。特に望ましいのはＡＯ
Ｘｉ遺伝子の６′終終止列である。
ターの一部として使用され得る。６′終止配列は構造遺
伝子と使用可能な様式で連結すると該遺伝子にコードさ
れるメツセンジャーＲＮＡの終止、ポリアデニル化、お
よび／あるいは安定化に働く。本発明の実施のための６
′終止配列の典型的な由来のいくつかの例としては、サ
ッカロミセス・セレビジエハンセヌラ１ポリモルファ
（Ｈａｎｓｅｎｕ、ｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ） 、
およびピキアの６′終止配列が含まれるが、これに制限
されろものではない。望ま遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子
の３′終終止列からなる群から選択されるようなピキア
・パストリス由来のものである。特に望ましいのはＡＯ
Ｘｉ遺伝子の６′終終止列である。
本分野の通常の技術に熟達した者は、細菌性プラスミド
ＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡなどのＤＮＡ配列も
本発明の実施に使用するベクターに付加できることを認
識するであろう。このような配列は細菌宿主内でのこれ
らのベクターの増幅および維持を可能にする。
ＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡなどのＤＮＡ配列も
本発明の実施に使用するベクターに付加できることを認
識するであろう。このような配列は細菌宿主内でのこれ
らのベクターの増幅および維持を可能にする。
別の適当なベクターは、少なくとも１）挿入可能ＤＮＡ
断片、２）選択可能マーカー遺伝子。
断片、２）選択可能マーカー遺伝子。
３）発現カセット、および任意に４）別の挿入可能ＤＮ
Ａ断片が配置された配列からなる組込みベクターである
。組込みベクターの要素は、一つの挿入可能ＤＮＡ断片
しか必要としない点を除いて直鎖状部位特異的組込みベ
クターで用いられたものと同等であるが１組込みベクタ
ーは相同性組換えにより℃ベクター全長が組込まれると
考えられている。望ましいものは第４図に示すような環
状組込み可能ベクターである５本発明の実施のためには
、第９図に示す構造のＢｇｌｌ断片のような直鎖状形質
転換ベクターおよび第４図の環状の組込み可能ベクター
な用いることが現在のところ望ましい。
Ａ断片が配置された配列からなる組込みベクターである
。組込みベクターの要素は、一つの挿入可能ＤＮＡ断片
しか必要としない点を除いて直鎖状部位特異的組込みベ
クターで用いられたものと同等であるが１組込みベクタ
ーは相同性組換えにより℃ベクター全長が組込まれると
考えられている。望ましいものは第４図に示すような環
状組込み可能ベクターである５本発明の実施のためには
、第９図に示す構造のＢｇｌｌ断片のような直鎖状形質
転換ベクターおよび第４図の環状の組込み可能ベクター
な用いることが現在のところ望ましい。
適当なベクターへのＳおよびｐｒｅＳ２ｗｔ造遺伝子の
挿入は１選択されたベクターを適当な部位で切断し、ベ
クター内に存在したＳあるいはｐｒｅＳ２構造遺伝子を
含む少なくとも一つの使用可能な発現カセットが得られ
るような適当な方法によって行なわれる。
挿入は１選択されたベクターを適当な部位で切断し、ベ
クター内に存在したＳあるいはｐｒｅＳ２構造遺伝子を
含む少なくとも一つの使用可能な発現カセットが得られ
るような適当な方法によって行なわれる。
ＳあるいはｐｒｅＳ２構造遺伝子の連結反応は。
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いるなどの適当な連結反応
技術によって行なわれる。
技術によって行なわれる。
ＳあるいはｐｒｅＳ２構造遺伝子とベクターの連結反応
混合液の最初の選択、増殖および任意の増幅は、大腸菌
などの細菌宿主に混合液を形質転換する事によって行な
５のが望ましい。適当な大腸菌形質転換法は本分野では
よく知られている。さらに、ベクターの細菌宿主内での
維持に必要な選択マーカーおよび細菌複製開始点も本分
野では既知である。
混合液の最初の選択、増殖および任意の増幅は、大腸菌
などの細菌宿主に混合液を形質転換する事によって行な
５のが望ましい。適当な大腸菌形質転換法は本分野では
よく知られている。さらに、ベクターの細菌宿主内での
維持に必要な選択マーカーおよび細菌複製開始点も本分
野では既知である。
発現系におけるＳあるいはｐｒｅＳ２構造遺伝子をふく
む目的のプラスミドの分離および／あるいは精製は宿主
ＤＮＡからグラスミドＤＮＡを分離する適当な方法で行
なわれる。
む目的のプラスミドの分離および／あるいは精製は宿主
ＤＮＡからグラスミドＤＮＡを分離する適当な方法で行
なわれる。
同様に、連結によって形成されたベクターは増幅後にＳ
あるいはｐｒｅＳ２遺伝子の存在およびその制御領域と
３′終終止列に使用可能な様式で連結していることを確
実にするために確認を行なうことが望ましい。これは、
エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動あるいはエンド
ヌクレアーゼ消化−ブザ／ハイブリダイゼーションなど
の多様な技術によって行なうことができるが、これらに
制限されるものではない。
あるいはｐｒｅＳ２遺伝子の存在およびその制御領域と
３′終終止列に使用可能な様式で連結していることを確
実にするために確認を行なうことが望ましい。これは、
エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動あるいはエンド
ヌクレアーゼ消化−ブザ／ハイブリダイゼーションなど
の多様な技術によって行なうことができるが、これらに
制限されるものではない。
本発明の実施のためには少なくとも二つの異なる適合性
発現カセットが宿主細胞に導入されなければならない。
発現カセットが宿主細胞に導入されなければならない。
二つの異なる発現カセットを宿主細胞に挿入するだめの
方法としては、一つのベクター（ウィルス性、プラスミ
ド、あるいは直鎖状部位特異的組込み）上に機能する二
つの発現カセットを載せておき、そのベクターで宿主を
形質転換するなどのいくつかの方法かある。少なくとも
二つの異なる発現カセッ）（ＳおよびｐｒｅＳ２）で宿
主を形質転換する別の方法は、一つのベクターはＳ発現
カセットを含み、別のベクターはｐｒｅ３２発現カセッ
Ｉｆ含んでいるような二つの異なるベクターで宿主を形
質転換することである。二つの異なるベクターでの形質
転換（二重形質転換）は、同時形質転換（−回の形質転
換で二つのベクターを導入する）あるいは段階的に（一
つのベクターで宿主を形質転換し、続いてその形質転換
体宿主ａ胞な別のベクターで第二の形質転換を行なう）
行なわれる。現在のところ、二重段階的形質転換が好ま
しい形質転換法である。
方法としては、一つのベクター（ウィルス性、プラスミ
ド、あるいは直鎖状部位特異的組込み）上に機能する二
つの発現カセットを載せておき、そのベクターで宿主を
形質転換するなどのいくつかの方法かある。少なくとも
二つの異なる発現カセッ）（ＳおよびｐｒｅＳ２）で宿
主を形質転換する別の方法は、一つのベクターはＳ発現
カセットを含み、別のベクターはｐｒｅ３２発現カセッ
Ｉｆ含んでいるような二つの異なるベクターで宿主を形
質転換することである。二つの異なるベクターでの形質
転換（二重形質転換）は、同時形質転換（−回の形質転
換で二つのベクターを導入する）あるいは段階的に（一
つのベクターで宿主を形質転換し、続いてその形質転換
体宿主ａ胞な別のベクターで第二の形質転換を行なう）
行なわれる。現在のところ、二重段階的形質転換が好ま
しい形質転換法である。
プラスミドあるいは直鎖状ベクターの酵母宿主細胞への
形質転換は、ヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ ）他、ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７５．（１
９７８）１９２９ ；伊藤他、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、 １５３ 、（１９８３）１６３；クレーｔグ（Ｃｒ
ｅｇｇ ）他、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ。
形質転換は、ヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ ）他、ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７５．（１
９７８）１９２９ ；伊藤他、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、 １５３ 、（１９８３）１６３；クレーｔグ（Ｃｒ
ｅｇｇ ）他、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ。
５ （１９８５）３３７６； あるいはスリークリシ
ュナ（５ｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ）他、Ｇ３ｎ８，５９
（１９８７）１１５などの方法を含む適当な形質転換法
によっ１行なうことができるが、これらに制限されるも
のではない。本発明の実施に望ましいものは、クレヴグ
の形質転換法である。本発明の態様の一つの実施には、
過剰の直鎖状ベクターを使用し、サザンハイプリダイゼ
ーションによっ℃多数の挿入について選択を行なうこと
が望ましい。
ュナ（５ｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ）他、Ｇ３ｎ８，５９
（１９８７）１１５などの方法を含む適当な形質転換法
によっ１行なうことができるが、これらに制限されるも
のではない。本発明の実施に望ましいものは、クレヴグ
の形質転換法である。本発明の態様の一つの実施には、
過剰の直鎖状ベクターを使用し、サザンハイプリダイゼ
ーションによっ℃多数の挿入について選択を行なうこと
が望ましい。
形質転換のための酵母宿主は適当なメチロトロフィック
酵母全てである。メチロトロフィック酵母はハンセヌラ
（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ ） 、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ） 。
酵母全てである。メチロトロフィック酵母はハンセヌラ
（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ ） 、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ） 。
ピキア、サツカロミセス、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌ。
上ジＡ）およびロドトｋ ラ（Ｒｈｏｄｎｔｏｒｕｌａ
）からなる属から選択されるメタノール上で増殖可能
な酵母を含むが、それに制限されるものではない。
）からなる属から選択されるメタノール上で増殖可能
な酵母を含むが、それに制限されるものではない。
このクラスの酵母の例である特異的な種のリストは、Ｃ
，７ｙト＝ −（Ａｎｔｈｏｎｙ ）、Ｔｈｅ ＢｉＯ
−ｃｈｅｍｉ８ｔｒｙ Ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐ
ｈｓ、 ２６９（１９８２） に示されている。現在望
ましいものは、栄養要求性ピキア・パストリス（，５１
１５（１９８４年８月６１日に米国農務省北部リサーチ
ラボラトリーズに寄託されたＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１
）、 あるいはＰＰＦＩ（米国農務省北部リサーチラ
ボラトリーズに寄託されたＮＲＲＬ １８０１７）な
どのピキア属のメチロトロフィック酵母である。栄養要
求性メチロトロフィック酵母はまた、その選択の容易さ
のために本発明の実施に適している。野性型メチロトロ
フィック酵母株は、５ｕｃ２をピキア・パストリスの形
質転換にもちいて蔗糖上で増殖可能とすることあるいは
Ｇ４１８Ｒ遺伝子などの抗生物質耐性マーカーを用いる
など、適当な形質転換マーカー遺伝子が選択されれば同
様に効果的に使用されると考えられる。
，７ｙト＝ −（Ａｎｔｈｏｎｙ ）、Ｔｈｅ ＢｉＯ
−ｃｈｅｍｉ８ｔｒｙ Ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐ
ｈｓ、 ２６９（１９８２） に示されている。現在望
ましいものは、栄養要求性ピキア・パストリス（，５１
１５（１９８４年８月６１日に米国農務省北部リサーチ
ラボラトリーズに寄託されたＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１
）、 あるいはＰＰＦＩ（米国農務省北部リサーチラ
ボラトリーズに寄託されたＮＲＲＬ １８０１７）な
どのピキア属のメチロトロフィック酵母である。栄養要
求性メチロトロフィック酵母はまた、その選択の容易さ
のために本発明の実施に適している。野性型メチロトロ
フィック酵母株は、５ｕｃ２をピキア・パストリスの形
質転換にもちいて蔗糖上で増殖可能とすることあるいは
Ｇ４１８Ｒ遺伝子などの抗生物質耐性マーカーを用いる
など、適当な形質転換マーカー遺伝子が選択されれば同
様に効果的に使用されると考えられる。
本発明の実施のためには、宿主のＳおよびｐｒｅＳ２で
の安定な形質転換な選択するために二つの選択マーカー
を組み合わせて用いることが現在のところ望ましい。し
たがって、二つの異なる選択マーカーを二つの異なるベ
クターに適用した場合にそれぞれのマーカーが独立に選
択できるような宿主とベクターの組合せを用いることは
本発明の実施に有利である。このような宿主とベクター
の組合せの一つは、ＰＰＦｉ（ＨＩＳ４．ＡＲＧ３）と
ベクターｐＡＯ８０４（ＨＩＳ４マーカー）およびｐＡ
Ｏ８０４（ＡＲＧ４ｆｆ−カー＞（１）使用であ７：ｒ
。別の可能な組合せは、一つの経路のみに欠損のある栄
養要求性とその欠損を相補する遺伝子と、抗生物質耐性
遺伝子あるいは５ＵＣ２などの新しい形質を引き起こす
遺伝子との組合せである。
の安定な形質転換な選択するために二つの選択マーカー
を組み合わせて用いることが現在のところ望ましい。し
たがって、二つの異なる選択マーカーを二つの異なるベ
クターに適用した場合にそれぞれのマーカーが独立に選
択できるような宿主とベクターの組合せを用いることは
本発明の実施に有利である。このような宿主とベクター
の組合せの一つは、ＰＰＦｉ（ＨＩＳ４．ＡＲＧ３）と
ベクターｐＡＯ８０４（ＨＩＳ４マーカー）およびｐＡ
Ｏ８０４（ＡＲＧ４ｆｆ−カー＞（１）使用であ７：ｒ
。別の可能な組合せは、一つの経路のみに欠損のある栄
養要求性とその欠損を相補する遺伝子と、抗生物質耐性
遺伝子あるいは５ＵＣ２などの新しい形質を引き起こす
遺伝子との組合せである。
形質転換されたメチロトロフィック酵母細胞は、形質転
換後の栄養要求性であった細胞を要求される生化学的産
物（該細胞の栄養要求性による）の非存在下で培養する
こと、にしい形質の検出（１メｌ；’ ／−ルー スｏ
−（ｍｅｔｈａｎｏｌ ｓｌｏｗ）″）による選択、
あるいは形質転換体に含まれ℃いる耐性遺伝子が存在し
なけれは酵母に対して毒性を持つ抗生物質の存在下で培
養すること馨含む適当な技術を用いて選択することかで
きろが、これに制限されるものではない。
換後の栄養要求性であった細胞を要求される生化学的産
物（該細胞の栄養要求性による）の非存在下で培養する
こと、にしい形質の検出（１メｌ；’ ／−ルー スｏ
−（ｍｅｔｈａｎｏｌ ｓｌｏｗ）″）による選択、
あるいは形質転換体に含まれ℃いる耐性遺伝子が存在し
なけれは酵母に対して毒性を持つ抗生物質の存在下で培
養すること馨含む適当な技術を用いて選択することかで
きろが、これに制限されるものではない。
分離されたメチロトロフィック酵母形質転換体は、振と
５フラスコ発酵、高密度発酵あるいはフレラグ他、Ｈｉ
ｇｈ−Ｌｅｖｅｌ ＥｘｐｒｅＳｓｉｏｎ ａｎｄＥｆ
’ｆ’１Ｃｉ６ｎｔ ＡｓｓｅｍｂｌｙＯｆ Ｈｅｐａ
ｔｉｔｉｓ Ｂｓｕｒｔ’ａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｌｎ
ｉｎ ｔｈｅ Ｍ８ｔｈｙｌＯｔｒＯｐｈ−ｉｃ Ｙｅ
ａｓｔ、 Ｐｉｃｈｉａ Ｐａ５ｔｏｒｉｓ、 ５ Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７９（１９８７）に示
された方法などの適当な発酵法によって培養する。
５フラスコ発酵、高密度発酵あるいはフレラグ他、Ｈｉ
ｇｈ−Ｌｅｖｅｌ ＥｘｐｒｅＳｓｉｏｎ ａｎｄＥｆ
’ｆ’１Ｃｉ６ｎｔ ＡｓｓｅｍｂｌｙＯｆ Ｈｅｐａ
ｔｉｔｉｓ Ｂｓｕｒｔ’ａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｌｎ
ｉｎ ｔｈｅ Ｍ８ｔｈｙｌＯｔｒＯｐｈ−ｉｃ Ｙｅ
ａｓｔ、 Ｐｉｃｈｉａ Ｐａ５ｔｏｒｉｓ、 ５ Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７９（１９８７）に示
された方法などの適当な発酵法によって培養する。
発現は用いろ制御領域に応じた方法によって行なう。メ
タノール反応性制御領域を使用することが望ましく、そ
の場合には発現誘導は栄養培地中の該形質転換体細胞を
用いる制御領域に適したアルコールにさらすことによっ
て行なうつ抗原性粒子は、ビーズ破砕した後に細胞の残
渣を除くｄ）に十分な遠心を行なうなどの標準的な方法
な用いて、十分な時間誘導を行なった形質転換体細胞を
破壊して精製されていない状態で回収される。本分野の
通常の技術に熟達した者は、上記の一般的な抽出法ある
いはさらなる精製法に代わる非細胞宿主生物から均質で
ないタンパク質を抽出することができろ多数の方法に気
付くであろう。
タノール反応性制御領域を使用することが望ましく、そ
の場合には発現誘導は栄養培地中の該形質転換体細胞を
用いる制御領域に適したアルコールにさらすことによっ
て行なうつ抗原性粒子は、ビーズ破砕した後に細胞の残
渣を除くｄ）に十分な遠心を行なうなどの標準的な方法
な用いて、十分な時間誘導を行なった形質転換体細胞を
破壊して精製されていない状態で回収される。本分野の
通常の技術に熟達した者は、上記の一般的な抽出法ある
いはさらなる精製法に代わる非細胞宿主生物から均質で
ないタンパク質を抽出することができろ多数の方法に気
付くであろう。
本発明の実施に推奨される精製法は１９８８年４月１６
日にフレラグらによって出願された出願、代理人事項番
号３２３４２ＵＳに開示されている、本発明の実施のた
めにそこに示された望ましい精製法は、緩衝化したカオ
トロピック化合物の存在下で形質転換本細胞を溶解させ
ること、溶解によって得られた上清から脂質および混在
するタンパク質を沈澱させること、上溝を一過すること
、保持された物質なシリカで処理すること、ｐＨが６〜
８の範囲の緩衝液でシリカに吸着したＢ型肝炎表面抗原
から混在するタンパク質を洗い出すこと、０．５〜８モ
ルの尿素を含むｐＨ９，５〜１１の緩衝化した溶出液で
シリカから抗原を溶出させること、得られた抗原を含む
両分をゲル濾過にかけ、その後に抗原を含む両分を陰イ
オン交換クロマトグラフィーにかけることを含む。
日にフレラグらによって出願された出願、代理人事項番
号３２３４２ＵＳに開示されている、本発明の実施のた
めにそこに示された望ましい精製法は、緩衝化したカオ
トロピック化合物の存在下で形質転換本細胞を溶解させ
ること、溶解によって得られた上清から脂質および混在
するタンパク質を沈澱させること、上溝を一過すること
、保持された物質なシリカで処理すること、ｐＨが６〜
８の範囲の緩衝液でシリカに吸着したＢ型肝炎表面抗原
から混在するタンパク質を洗い出すこと、０．５〜８モ
ルの尿素を含むｐＨ９，５〜１１の緩衝化した溶出液で
シリカから抗原を溶出させること、得られた抗原を含む
両分をゲル濾過にかけ、その後に抗原を含む両分を陰イ
オン交換クロマトグラフィーにかけることを含む。
以下の実施例は本発明の実施をさらに例示するだめのも
のであるが、制限を与えるものではない。
のであるが、制限を与えるものではない。
（実施例）
実施例に関連した一般的な情報：
菌株
ピキア・パストリスＧ５１１５（ｈｉｓ４）ＮＲＲＬＹ
−１５８５１が本実施例で用いた宿主酵母体であろう ピキア−バストリスＰＰＦ１（ａｒｇ４ ｈｉｓ４）
Ｎｌ”ｔＲＬ Ｙ−１８０１７゜ 大腸菌ＭＣ１０６１ＮＲＲＬ １８０１６（米国農務
省北部リサーチラポラ） ＩＪ−ズに寄託された）。
−１５８５１が本実施例で用いた宿主酵母体であろう ピキア−バストリスＰＰＦ１（ａｒｇ４ ｈｉｓ４）
Ｎｌ”ｔＲＬ Ｙ−１８０１７゜ 大腸菌ＭＣ１０６１ＮＲＲＬ １８０１６（米国農務
省北部リサーチラポラ） ＩＪ−ズに寄託された）。
大腸菌ＪＭ１Ｑ３ Δ（ｌａｃ ｐｒｏ） ｔｈｉ
ｒｅｓＬ（ｓｔｒ Ａ）ｓｕｐＥ ｅｎｄＡ ５ｂｃＢ
ｈｓｄＲ。
ｒｅｓＬ（ｓｔｒ Ａ）ｓｕｐＥ ｅｎｄＡ ５ｂｃＢ
ｈｓｄＲ。
培地、−
ＹＰＤ、１リツトル ２０ｇ 酵母抽出物２０ｇ
ペプトン ２０ｇ デキストロース ＬＢ培地、１リツトル ５．０ｇ＃母抽母御出物イフコ
社） １０．０ｇ トリプトン （デイフコ社） ＴＥ緩衝液 ＰＥＧ溶液 溶液Ａ 溶液Ｂ ５、Ｏｇ Ｎａ１１ ０．０１ Ｍ （ｐＨ７，４） トリス緩衝液中 １．０ｍＭ ＥＤＴＡ ２０％ ポリエチレングリ コール−６６５０ １０ｍＭ ０ａｌｌ□ １０ｍＭ）リス−ＨＣ１ （１）Ｈ７，４） ・・・・・・−過滅菌 ０．２Ｍ）リス−ＨＣＩ （ｐＨ７，５） Ｑ、１Ｍ Ｍｇ（Ｅｌ□ Ｑ、５Ｍ ＮａＣ１ ０，０１Ｍ ジテオスレイト ール（ＤＴＴ） ０．２Ｍ トリス−ＨＣＩ （ｐＨ７，５） ［１，１ＭＭｇｃ１□ ０．１ＭＤＴＴ ２０Ｘ ８８０ ４．４ｇ ＮａＯＨ ７，４ｇ Ｎａ２ＥＤＴＡ ２７、６ ｇ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２０２ｉ［１ｇＮａ
Ｃ１ 一−−−−−ＮａＯＨでｐＨを７．５〜８．０に合わせ
る ・・・・・・Ｈ２Ｃで１リツトルとする１０Ｘ トラン
スファー緩衝液 ５、Ｑｇ ＮａＣ１ ９６，８ｇ トリズマベース ９７４ｇ グリシン Ｈ２Ｃで１リツトルとする （実施例１） ベクターｐＴＢＯ４の構築 プラスミドＡＭ６は第６図に示されたＨＢＶゲノムに由
来するものであり、ｐＢ８３２２プラスミドが２６位の
ＢａｍＨ１部位に挿入されている。
ペプトン ２０ｇ デキストロース ＬＢ培地、１リツトル ５．０ｇ＃母抽母御出物イフコ
社） １０．０ｇ トリプトン （デイフコ社） ＴＥ緩衝液 ＰＥＧ溶液 溶液Ａ 溶液Ｂ ５、Ｏｇ Ｎａ１１ ０．０１ Ｍ （ｐＨ７，４） トリス緩衝液中 １．０ｍＭ ＥＤＴＡ ２０％ ポリエチレングリ コール−６６５０ １０ｍＭ ０ａｌｌ□ １０ｍＭ）リス−ＨＣ１ （１）Ｈ７，４） ・・・・・・−過滅菌 ０．２Ｍ）リス−ＨＣＩ （ｐＨ７，５） Ｑ、１Ｍ Ｍｇ（Ｅｌ□ Ｑ、５Ｍ ＮａＣ１ ０，０１Ｍ ジテオスレイト ール（ＤＴＴ） ０．２Ｍ トリス−ＨＣＩ （ｐＨ７，５） ［１，１ＭＭｇｃ１□ ０．１ＭＤＴＴ ２０Ｘ ８８０ ４．４ｇ ＮａＯＨ ７，４ｇ Ｎａ２ＥＤＴＡ ２７、６ ｇ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２０２ｉ［１ｇＮａ
Ｃ１ 一−−−−−ＮａＯＨでｐＨを７．５〜８．０に合わせ
る ・・・・・・Ｈ２Ｃで１リツトルとする１０Ｘ トラン
スファー緩衝液 ５、Ｑｇ ＮａＣ１ ９６，８ｇ トリズマベース ９７４ｇ グリシン Ｈ２Ｃで１リツトルとする （実施例１） ベクターｐＴＢＯ４の構築 プラスミドＡＭ６は第６図に示されたＨＢＶゲノムに由
来するものであり、ｐＢ８３２２プラスミドが２６位の
ＢａｍＨ１部位に挿入されている。
ベクターｐＴＢＯ４はＢ型肝炎表面抗原のｐｒｅＳ２型
２８１アミノ酸をコードする遺伝子を含む。該遺伝子は
６つの部分で構成された：すなわち、構造遺伝子のＣ末
端７５％、１６アミノ酸をコードするＮ末端リンカ−１
および残りの中央部である。
２８１アミノ酸をコードする遺伝子を含む。該遺伝子は
６つの部分で構成された：すなわち、構造遺伝子のＣ末
端７５％、１６アミノ酸をコードするＮ末端リンカ−１
および残りの中央部である。
ｐｒｅＳ２遺伝子、ａｄｗ血清型を含むプラスミドＡＭ
６はここで用いたｐｒｅＳ２遺伝子のＣ末端部分および
中央部の供給源となったものである。塩基配列はバＶ７
ズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ）他、ＩＣＮ−ＵＣ：
ＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒ
ｕｓＧｅｎｅｔｉｃｓ、ｐ、５７−７０（１９８０）に
示され℃おり、以下の改変を受けている： 元の塩基配列 ＡＴＧ−ＣＲＡＧ−ＴＧＧ−ＡＡＴ−Ｔ
ＣＣ変異塩基配列 ＡＴＧ−ＣＡＧ−ＴＧＣ：ｒ−ＡＡ
Ｃ−ＴＯＯＡ、ｐｒ８ｓ２０Ｃ末端部分 （全ての制限酵素はベーリンガーマンハイム社から入手
したものであり、販売元の指示に従って使用した。、） Ｃ末端部分はＤｒａｌで消化することによりプラスミド
ＡＭ６（第１図）から分離した。、Ｄｒａｌは二カ所で
ＨＢｖゲノムを切断し、その一つは表面抗原の最後のア
ミノ酸のコドンの位置である。その末端はウシ腸アルカ
リホスファターゼを用いて反応体積３０μｔで処理して
脱リン酸化した（５０ｍＭ Ｔｒ ｓ Ｓ −Ｃ（１４
）ｐ Ｈ９０−１ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１００μＭ Ｚ
ｎＣｌ２−１ｍＭスペルミジン中、１Ｕの酵素で６７℃
、１時間）。完全な消化産物をフェノール抽出し、エタ
ノール沈澱を行なった（マニアティス（Ｍａｎ ｉａ
ｔｉｓ ）他）。シアンエチルホスホルアミダイト法で
アプライド・バイオシステム・モデル６８０ＡのＤＮＡ
合成機によってオクタマーの５ｊｕｌリンカ−（ＡＡＧ
ＧＣＣＴＴ）を合成した。
６はここで用いたｐｒｅＳ２遺伝子のＣ末端部分および
中央部の供給源となったものである。塩基配列はバＶ７
ズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ）他、ＩＣＮ−ＵＣ：
ＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒ
ｕｓＧｅｎｅｔｉｃｓ、ｐ、５７−７０（１９８０）に
示され℃おり、以下の改変を受けている： 元の塩基配列 ＡＴＧ−ＣＲＡＧ−ＴＧＧ−ＡＡＴ−Ｔ
ＣＣ変異塩基配列 ＡＴＧ−ＣＡＧ−ＴＧＣ：ｒ−ＡＡ
Ｃ−ＴＯＯＡ、ｐｒ８ｓ２０Ｃ末端部分 （全ての制限酵素はベーリンガーマンハイム社から入手
したものであり、販売元の指示に従って使用した。、） Ｃ末端部分はＤｒａｌで消化することによりプラスミド
ＡＭ６（第１図）から分離した。、Ｄｒａｌは二カ所で
ＨＢｖゲノムを切断し、その一つは表面抗原の最後のア
ミノ酸のコドンの位置である。その末端はウシ腸アルカ
リホスファターゼを用いて反応体積３０μｔで処理して
脱リン酸化した（５０ｍＭ Ｔｒ ｓ Ｓ −Ｃ（１４
）ｐ Ｈ９０−１ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１００μＭ Ｚ
ｎＣｌ２−１ｍＭスペルミジン中、１Ｕの酵素で６７℃
、１時間）。完全な消化産物をフェノール抽出し、エタ
ノール沈澱を行なった（マニアティス（Ｍａｎ ｉａ
ｔｉｓ ）他）。シアンエチルホスホルアミダイト法で
アプライド・バイオシステム・モデル６８０ＡのＤＮＡ
合成機によってオクタマーの５ｊｕｌリンカ−（ＡＡＧ
ＧＣＣＴＴ）を合成した。
１μｇの５ｊｕｌリンカ−を蒸留水に溶解した。
１０ｎｇのアリコートを採り、７ＱｍＭ Ｔｒｉｓ−
０（１４）ｐＨ７，６，１０ｍＭ ＭｇＣ１□、５ｍ
Ｍ ジチオトレイトール、１ｍＭＡＴＰおよび１０ユニ
ツトのポリヌクレオチドキナーゼを含む５０μｔの反応
溶液中で６７℃で６０分間処理してリン酸でラベルした
。リンカ−溶液を９０℃に加熱して酵素反応を停止させ
、ゆっくり室温まで冷却し℃二本鎖のＤＮＡ形成を行な
わせた。該５ｔｕｌ＋Ｊンカーを上述のｐｒａｌ消化産
物に加えて、以下のようにＴ ４１７ガーゼで連結させ
た。反応は、６．６ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ（１４）ｐＨ７，
６，５ｍＭ ＭｇＣ１□、５ｍＭジチオトレイトール
、１ｍＭＡＴＰおよび１ワイスユニツトのＴ４リガーゼ
を含む１０μｔの反応液中で２６℃で１時間行なった。
０（１４）ｐＨ７，６，１０ｍＭ ＭｇＣ１□、５ｍ
Ｍ ジチオトレイトール、１ｍＭＡＴＰおよび１０ユニ
ツトのポリヌクレオチドキナーゼを含む５０μｔの反応
溶液中で６７℃で６０分間処理してリン酸でラベルした
。リンカ−溶液を９０℃に加熱して酵素反応を停止させ
、ゆっくり室温まで冷却し℃二本鎖のＤＮＡ形成を行な
わせた。該５ｔｕｌ＋Ｊンカーを上述のｐｒａｌ消化産
物に加えて、以下のようにＴ ４１７ガーゼで連結させ
た。反応は、６．６ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ（１４）ｐＨ７，
６，５ｍＭ ＭｇＣ１□、５ｍＭジチオトレイトール
、１ｍＭＡＴＰおよび１ワイスユニツトのＴ４リガーゼ
を含む１０μｔの反応液中で２６℃で１時間行なった。
連結反応はフェノール抽出で停止させ、続いてエタノー
ル沈澱を行なった。５ｔｕｌ制限酵素による消化を５０
Ｕ以上の酵素を用いて一晩行い、５ｔｕｌリンカ−のマ
ルチマーを除いた。Ｄｒａｌ消化産物および５ｔｕｌリ
ンカ−が結合したものはＤｒａｌ消化によって除去され
た翻訳終止コドンを回復した。
ル沈澱を行なった。５ｔｕｌ制限酵素による消化を５０
Ｕ以上の酵素を用いて一晩行い、５ｔｕｌリンカ−のマ
ルチマーを除いた。Ｄｒａｌ消化産物および５ｔｕｌリ
ンカ−が結合したものはＤｒａｌ消化によって除去され
た翻訳終止コドンを回復した。
５ｔｕｌリンカ−を付加したＤｒａｌ断片をＸｂａｌで
消化し、約６００ ｂｐの目的のＳｔｕ ｌ ／Ｘｂａ
１断片を得た；これは０．８％調製用アガロースゲル
から分離した。この断片は該遺伝子のＣ末端７５％を含
んでおり、Ｘｂａｌと５ｊｕｌで消化して上述のように
脱リン酸化したベクターｐｙＭ４（ｌ第２図）にクロー
ニングした。（ｐＹＭ４はプラスミドｐＹＭ３［］をＣ
１ａ ｌ で消化し、末端を再度連結させることによ
って得られる。ｐＹＭ３Ｑは米国イリノイ州ペオリアの
米国農務省北部リサーチセンターに受託番号ＮＲＲＬ
Ｂ−１５８９０とシテ寄託されている大腸菌宿主から
得られる。”）ｐＹＭ４の５．７ｋｂ制限酵素消化断片
は０．８％調製用アガロースゲルから分離した。ベクタ
ーｐＹＭ４は単に便利な制限酵素部位のために使用した
ものである。
消化し、約６００ ｂｐの目的のＳｔｕ ｌ ／Ｘｂａ
１断片を得た；これは０．８％調製用アガロースゲル
から分離した。この断片は該遺伝子のＣ末端７５％を含
んでおり、Ｘｂａｌと５ｊｕｌで消化して上述のように
脱リン酸化したベクターｐｙＭ４（ｌ第２図）にクロー
ニングした。（ｐＹＭ４はプラスミドｐＹＭ３［］をＣ
１ａ ｌ で消化し、末端を再度連結させることによ
って得られる。ｐＹＭ３Ｑは米国イリノイ州ペオリアの
米国農務省北部リサーチセンターに受託番号ＮＲＲＬ
Ｂ−１５８９０とシテ寄託されている大腸菌宿主から
得られる。”）ｐＹＭ４の５．７ｋｂ制限酵素消化断片
は０．８％調製用アガロースゲルから分離した。ベクタ
ーｐＹＭ４は単に便利な制限酵素部位のために使用した
ものである。
５０１ｇのベクターおよび５００ｎｇの挿入断片を５Ｑ
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ７，４，１０ｍＭＭｇＣ
１□、１０ ｍＭジテオトレイｒ−ル、１ｍＭスペルミ
ジン、 １ｍＭＡＴＰおよび１ワイスユニツトのＴ ４
１Ｊガーゼを含む１０μｔの反応液中で２３℃で１時間
連結させた。連結反応液を直接、大腸菌ＭＣ１０６１コ
ンピテント細胞の形質転換に使用してアンピシリン耐性
で選択した。大腸菌ＭＣ１０６１株に’！受託番号ＩＲ
Ｌ−１８０１６として米国イリノイ州ペオリアの米国農
務省北部リサーチセンターから入手可能である。ＭＣ１
０６１は以下の遺伝子型を有する： Ｆｔ−４，ａｒａ
、 Ｄｌ ３９．ａ（ｌａｃＩＰＯＺＹ）Ｘ７４ ｇ
ａｌｋ ｇａｌＵ ｈｓｒｈｓｍｆ−ＨｒｐｓＬ Δ
（ａｒａＡＲＧＩｃ １ｅｕ）７６９７゜ＭＣ：１０６
１は以下のようにし℃形質転換に対してコンピテントと
した。大腸［ＭＣ１０６１の対数増殖中期の培養液（５
０ｍ／りをデーモア Ｉ ＥＣＤＰＲ６００遠心機で４
℃で５分間３０００ ｒ’９ｍで遠心して閑な回収し、
ｌＱｍＭのＮａＣ１で洗浄した。
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ７，４，１０ｍＭＭｇＣ
１□、１０ ｍＭジテオトレイｒ−ル、１ｍＭスペルミ
ジン、 １ｍＭＡＴＰおよび１ワイスユニツトのＴ ４
１Ｊガーゼを含む１０μｔの反応液中で２３℃で１時間
連結させた。連結反応液を直接、大腸菌ＭＣ１０６１コ
ンピテント細胞の形質転換に使用してアンピシリン耐性
で選択した。大腸菌ＭＣ１０６１株に’！受託番号ＩＲ
Ｌ−１８０１６として米国イリノイ州ペオリアの米国農
務省北部リサーチセンターから入手可能である。ＭＣ１
０６１は以下の遺伝子型を有する： Ｆｔ−４，ａｒａ
、 Ｄｌ ３９．ａ（ｌａｃＩＰＯＺＹ）Ｘ７４ ｇ
ａｌｋ ｇａｌＵ ｈｓｒｈｓｍｆ−ＨｒｐｓＬ Δ
（ａｒａＡＲＧＩｃ １ｅｕ）７６９７゜ＭＣ：１０６
１は以下のようにし℃形質転換に対してコンピテントと
した。大腸［ＭＣ１０６１の対数増殖中期の培養液（５
０ｍ／りをデーモア Ｉ ＥＣＤＰＲ６００遠心機で４
℃で５分間３０００ ｒ’９ｍで遠心して閑な回収し、
ｌＱｍＭのＮａＣ１で洗浄した。
培養液を２５ｍ１の５０ｍＭｃａｃ１２（Ｃ再懸濁し。
０°Ｃで６０分間装いた。細胞を上述のように遠心し、
２ｒｎｌの５ Ｑ ｍｌ Ｇａｅｌ□に再懸濁した。形
質転換には、１００μｔのコンピテント細胞懸濁液に連
結反応液を加え、氷上で０℃で１５分間静置し、３７℃
で５分間ヒートショックをかけた後に２５℃で５分間イ
ンキュベートした。細胞を直接５０μｔｅａｌアンピシ
リンを含むＬＢ寒天プレートにまいた。プレートな６７
℃で１０〜１６時間インキュベートした。得られたコロ
ニーを回収し。
２ｒｎｌの５ Ｑ ｍｌ Ｇａｅｌ□に再懸濁した。形
質転換には、１００μｔのコンピテント細胞懸濁液に連
結反応液を加え、氷上で０℃で１５分間静置し、３７℃
で５分間ヒートショックをかけた後に２５℃で５分間イ
ンキュベートした。細胞を直接５０μｔｅａｌアンピシ
リンを含むＬＢ寒天プレートにまいた。プレートな６７
℃で１０〜１６時間インキュベートした。得られたコロ
ニーを回収し。
制限酵素による消化で解析した。細胞を５０μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含むＬ培地５ｍｊ中で６７℃で５時間培
養し、ＤＮＡをバーンボイＡ （Ｂｊｒｎｂｏｉｍ）と
ドリー（Ｄｏｌｙ）、（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７：１５１３（１９７９）） の
方法で調製した。
アンピシリンを含むＬ培地５ｍｊ中で６７℃で５時間培
養し、ＤＮＡをバーンボイＡ （Ｂｊｒｎｂｏｉｍ）と
ドリー（Ｄｏｌｙ）、（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７：１５１３（１９７９）） の
方法で調製した。
ミニブレツブＤＮＡをＢａｍＨｌおよびｘｂａｌで消化
した。ｌ、 ５ ｋｂ Ｘｂａ ｌ ／ＢａｍＨＩ
断片が得られた培養液を挿入断片を有するものと見なし
て。
した。ｌ、 ５ ｋｂ Ｘｂａ ｌ ／ＢａｍＨＩ
断片が得られた培養液を挿入断片を有するものと見なし
て。
一つの培養液について上述のように大量ＤＮＡ調製を行
い、さらに塩化セシウム・エチジウムブロマイド勾配で
バンディングさせて精製した。このクローンをｐＨ８ｌ
と命名した。
い、さらに塩化セシウム・エチジウムブロマイド勾配で
バンディングさせて精製した。このクローンをｐＨ８ｌ
と命名した。
プラスミドｐＨ５ｉを５ｔｕｌ で消化し、上述のよう
に脱リン酸化し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行
なった。上述のように合成したＥＣ０Ｒ１リンカ−（Ｇ
ＧＡＡＴＴ（、Ｃ）をリン酸化し、自己アニーリングさ
せ、該平滑末端を有するＤＮＡと連結させた。過剰なリ
ンカ−はＥｃｏＲｌで一晩消化して除き、続いて該ＤＮ
ＡをＸｂａｌで消化してフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱を行なった。
に脱リン酸化し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行
なった。上述のように合成したＥＣ０Ｒ１リンカ−（Ｇ
ＧＡＡＴＴ（、Ｃ）をリン酸化し、自己アニーリングさ
せ、該平滑末端を有するＤＮＡと連結させた。過剰なリ
ンカ−はＥｃｏＲｌで一晩消化して除き、続いて該ＤＮ
ＡをＸｂａｌで消化してフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱を行なった。
目的の６００１）ｐ Ｘｂａｌ−ＥＣＯＲＩ断片とベ
クターの５８２ ｂｐ断片（Ｘｂａ ｌ −ＥｃｏＲｌ
）を含むダブレヴトを１．０％調製用ゲル電気泳動に
よって分離した。これらの断片（５００ｎｇ）＆上述の
ようにＸｂａｌ −ＥｃｏＲｌで消化して脱リン酸化し
たｐＵ０１８（５０ｎｇ）に連結させ、上述のようにＭ
Ｃ１６０１の形質転換に用いてアンピシリン耐性に関し
て選択した。ミニプレツブＤＮＡ’！−制限酵素で消化
したものを、二つの断片のうちクローニングされた断片
の決定に用いた。目的としない断片ｋｓ Ｃｌａ Ｉ
Ｂ（１を持ち、Ｃ１ａｌ／Ｘｂａｌ 二重消化産物は約
５６０ ｂｐと２４００ｂｐの断片を生じるが、正しい
断片ではＣ１ａ ｌ ／Ｘｂａ ｌ 消化により直鎖
状の３ｋｂの断片を与える。候補となったも）に’！
ＥｃｏＲｌ オヨびＸｂａｌ で消化し−（６００ｂ
ｐと２４００１）１）の断片が得られた。このようなり
ローンの一つを大量に精製し、 ｐＨ３２−Ｂ と命
名した。これは完全なｐｒｅＳ２遺伝子のＣ末端領域の
最後のコドンの後にＥｃｏＲ１部位？有する。
クターの５８２ ｂｐ断片（Ｘｂａ ｌ −ＥｃｏＲｌ
）を含むダブレヴトを１．０％調製用ゲル電気泳動に
よって分離した。これらの断片（５００ｎｇ）＆上述の
ようにＸｂａｌ −ＥｃｏＲｌで消化して脱リン酸化し
たｐＵ０１８（５０ｎｇ）に連結させ、上述のようにＭ
Ｃ１６０１の形質転換に用いてアンピシリン耐性に関し
て選択した。ミニプレツブＤＮＡ’！−制限酵素で消化
したものを、二つの断片のうちクローニングされた断片
の決定に用いた。目的としない断片ｋｓ Ｃｌａ Ｉ
Ｂ（１を持ち、Ｃ１ａｌ／Ｘｂａｌ 二重消化産物は約
５６０ ｂｐと２４００ｂｐの断片を生じるが、正しい
断片ではＣ１ａ ｌ ／Ｘｂａ ｌ 消化により直鎖
状の３ｋｂの断片を与える。候補となったも）に’！
ＥｃｏＲｌ オヨびＸｂａｌ で消化し−（６００ｂ
ｐと２４００１）１）の断片が得られた。このようなり
ローンの一つを大量に精製し、 ｐＨ３２−Ｂ と命
名した。これは完全なｐｒｅＳ２遺伝子のＣ末端領域の
最後のコドンの後にＥｃｏＲ１部位？有する。
Ｂ、ｐｒｅＳ２遺伝子の中央部
ｐｒｅＳ２遺伝子の中央部は以下のようにしてクローニ
ングした。プラスミドＡＭ６をＸｂａｌおよ０’ Ｂａ
ｍＨｌで消化し、２５０ ｂｐのＩｈ１片を０．８％調
製用アガロースゲルから分離した。この断片（５０ｎｇ
）を上述のように、ＸｂａｌとＢａｍＨｌで消化し℃脱
リン酸化した５ｎｇのｐＵｃ１８に連結した。連結反応
液は上述のように大腸菌ＭＯ１０６１株の形質転換に使
用し アンピシリン耐性で選択した。ミニブレツブＤＮ
ＡをＢａｍＨｌで消化し。
ングした。プラスミドＡＭ６をＸｂａｌおよ０’ Ｂａ
ｍＨｌで消化し、２５０ ｂｐのＩｈ１片を０．８％調
製用アガロースゲルから分離した。この断片（５０ｎｇ
）を上述のように、ＸｂａｌとＢａｍＨｌで消化し℃脱
リン酸化した５ｎｇのｐＵｃ１８に連結した。連結反応
液は上述のように大腸菌ＭＯ１０６１株の形質転換に使
用し アンピシリン耐性で選択した。ミニブレツブＤＮ
ＡをＢａｍＨｌで消化し。
２．７ｋｂの直鎖状断片を含むものを選択した。そのよ
うなものの一つを大量に培養して上述のようにＤＮＡを
調製、精製した。このクローンをｐＰＳｌと命名した。
うなものの一つを大量に培養して上述のようにＤＮＡを
調製、精製した。このクローンをｐＰＳｌと命名した。
該クローンをＥｃｏＲｌとＢａｍＨｌで消化し、ベクタ
ーのバンドな０，８％調製用アガロースゲル電気泳動で
分離し、精製した。このベクターに以下のリン酸化した
二本鎖合成オリゴヌクレオチドを上述のように連結させ
た：３’ ＧＴＴＡＧＧＣＡＧＡＣＣ，ＴＣＣＴＡＧ
５’連結反応液は大腸菌ＭＣ１０６１の形質転換に
使用し、アンピシリン耐性で選択した。ミニブレツブＤ
ＮＡをＰｓｔｌ消化で解析した。２５０ｂｐのＰｓｔｌ
断片を含むクローンの一つな選び、ＤＮＡの大量調製を
行い、プラスミド１）ＰＳ２を分離した。
ーのバンドな０，８％調製用アガロースゲル電気泳動で
分離し、精製した。このベクターに以下のリン酸化した
二本鎖合成オリゴヌクレオチドを上述のように連結させ
た：３’ ＧＴＴＡＧＧＣＡＧＡＣＣ，ＴＣＣＴＡＧ
５’連結反応液は大腸菌ＭＣ１０６１の形質転換に
使用し、アンピシリン耐性で選択した。ミニブレツブＤ
ＮＡをＰｓｔｌ消化で解析した。２５０ｂｐのＰｓｔｌ
断片を含むクローンの一つな選び、ＤＮＡの大量調製を
行い、プラスミド１）ＰＳ２を分離した。
ＥＣ０Ｒ１リンカ−および最初の１６アミノ酸をコード
する配列を含むＮ末端領域を上述のように合成した以下
の配列からなる合成オリゴヌクレオチドから生成した： Ｈｉｎｄｌｌｌ ＥＣｊＱＲｌ ５’ ＡＧＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＴ（、ｅ
ＡＡｃＴｃｃ３／ ＡＣＴＴＡＡＧＴＡＣＧＴＯＡＣ
ＣＴＴＧＡＣＧ５ｔｌ Ａｃ’ｒＧｃｃ’ｒ’ｒｃｃａｃｃＡＡＡｃ’ｒｃ’ｒ
ｅｃＡＴＧＡＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧＡＧ ５
’、この断片はＨｉｎｄｌおよびＰｓｔｌ末端を含み。
する配列を含むＮ末端領域を上述のように合成した以下
の配列からなる合成オリゴヌクレオチドから生成した： Ｈｉｎｄｌｌｌ ＥＣｊＱＲｌ ５’ ＡＧＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＴ（、ｅ
ＡＡｃＴｃｃ３／ ＡＣＴＴＡＡＧＴＡＣＧＴＯＡＣ
ＣＴＴＧＡＣＧ５ｔｌ Ａｃ’ｒＧｃｃ’ｒ’ｒｃｃａｃｃＡＡＡｃ’ｒｃ’ｒ
ｅｃＡＴＧＡＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧＡＧ ５
’、この断片はＨｉｎｄｌおよびＰｓｔｌ末端を含み。
ＡＴＧの前にＥｃｏＲ１部位を持つ。ベクターに１゜倍
過剰のオリゴヌクレオチドを連結させることによってこ
の配列をＨｉｎｄ鳳とｐｔｔ １ で消化して脱リン酸
化したｐＵＧ１８にクローニングし、形質転換体を小さ
なＥｃｏＲ１部位の存在（〜７５ｂｐ）によって解析し
た。このようなりローンをｐＴＢ。
過剰のオリゴヌクレオチドを連結させることによってこ
の配列をＨｉｎｄ鳳とｐｔｔ １ で消化して脱リン酸
化したｐＵＧ１８にクローニングし、形質転換体を小さ
なＥｃｏＲ１部位の存在（〜７５ｂｐ）によって解析し
た。このようなりローンをｐＴＢ。
−２Ａと命名した。
遺伝子の中央部はベクターｐＴＢＯ−２ＡをＰｓｔＩと
Ｘｂａ ｌで消化することによって付加した：挿入断片
ｔｔｐｐｓ２由来２５Ｑ ｂｐ Ｐｓｔｌ−Ｘｂａｌ
断片を用いた。形質転換体は３００ ｂｐ以上のＥＯＯ
Ｒ１断片および２９０ ｂｐｆ）Ｘｂａ ｌ／Ｈｉｎｄ
層断片の存在によって解析した。正しい挿入断片を持つ
ものをｐＴＢｏ−３と名付けた。完全なｐｒｅＳ２遺伝
子は、ｐＴＢｏ−３由来のＨｉｎｄｌ／Ｘｂａｌ断片を
Ｘｂａｌ／Ｈｉｎｄｌ消化ｐＨ８２８に挿入することに
よって得た。アンピシリン耐性形質転換体は上述のよう
に８２５ ｂｐ ＥｃｏＲｌ 断片の存在によって
解析した。この構造を持つプラスミドをｐＴＢｏ４と命
名した。
Ｘｂａ ｌで消化することによって付加した：挿入断片
ｔｔｐｐｓ２由来２５Ｑ ｂｐ Ｐｓｔｌ−Ｘｂａｌ
断片を用いた。形質転換体は３００ ｂｐ以上のＥＯＯ
Ｒ１断片および２９０ ｂｐｆ）Ｘｂａ ｌ／Ｈｉｎｄ
層断片の存在によって解析した。正しい挿入断片を持つ
ものをｐＴＢｏ−３と名付けた。完全なｐｒｅＳ２遺伝
子は、ｐＴＢｏ−３由来のＨｉｎｄｌ／Ｘｂａｌ断片を
Ｘｂａｌ／Ｈｉｎｄｌ消化ｐＨ８２８に挿入することに
よって得た。アンピシリン耐性形質転換体は上述のよう
に８２５ ｂｐ ＥｃｏＲｌ 断片の存在によって
解析した。この構造を持つプラスミドをｐＴＢｏ４と命
名した。
（実施例ＩＩ）
ベクターｐＴＢＯ５Ａの構築
ｐｒｅＳ ２をコードする遺伝子を含むベクターを。
ベクターｐＡＯ８０４およびｐＴＢｏ４ （それぞれ実
施例Ｖおよび実施例！由来）から構築した。２μｇのｐ
ＡＯ８０４を上述のようにＥＣ０Ｒ１で消化し、３０μ
ｔの反応液中でアルカリホスファターゼで処理した（
５ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉｍ−Ｃ１ｐＨ９，０，１ｍＭＭｇ
Ｃ１□、１００ ｕ Ｍ ＺｎＣ１２−１ｍＭ ｘベル
ミジン中１Ｕの酵素で３７℃、１時間）。ｐＴａ０４は
ＥＣ０Ｒ１で消化し、ｐｒｅＳ２遺伝子をコードする８
２５ ｂｐ断片を得た。この断片を０．８％アガロー
スを用いて調製用アガロースゲル電気泳動で精製した。
施例Ｖおよび実施例！由来）から構築した。２μｇのｐ
ＡＯ８０４を上述のようにＥＣ０Ｒ１で消化し、３０μ
ｔの反応液中でアルカリホスファターゼで処理した（
５ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉｍ−Ｃ１ｐＨ９，０，１ｍＭＭｇ
Ｃ１□、１００ ｕ Ｍ ＺｎＣ１２−１ｍＭ ｘベル
ミジン中１Ｕの酵素で３７℃、１時間）。ｐＴａ０４は
ＥＣ０Ｒ１で消化し、ｐｒｅＳ２遺伝子をコードする８
２５ ｂｐ断片を得た。この断片を０．８％アガロー
スを用いて調製用アガロースゲル電気泳動で精製した。
該断片５００ ｎｇとｐＡＯ８０４を５０ｎｇを実施例
Ｉに示した方法で連結した。得られたベクターを実施例
Ｉで示した方法でＭＣ１０６１の形質転換に使用し、ア
ンピシリン耐性で選択した。
Ｉに示した方法で連結した。得られたベクターを実施例
Ｉで示した方法でＭＣ１０６１の形質転換に使用し、ア
ンピシリン耐性で選択した。
ＤＮＡはバーンボイムとドリー（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｌ
ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７ ： １５１３（１９７９
））の方法で分離し、ＰＳｔｌ消化で解析した。２．ｉ
ｋｂのＰｓｔｌ断片を含むクローンが正しい向きで挿入
断片を有するものであるとして、ｐＴＢＯ５Ａ と命
名した。
ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７ ： １５１３（１９７９
））の方法で分離し、ＰＳｔｌ消化で解析した。２．ｉ
ｋｂのＰｓｔｌ断片を含むクローンが正しい向きで挿入
断片を有するものであるとして、ｐＴＢＯ５Ａ と命
名した。
（実施例量）
１）ＴＢＯ４７テンプレートの構築
１μｇの二本鎖ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（Ｗ施ｆｌＪ１
より）をＥＣ０Ｒ１で消化し、３０μ４の反応体積でウ
シ腸アルカリホスファターゼ処理（５０ｍＭ）リス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ９，０，１ｍＭ ＭｇＣ１□、 １００ｕ
Ｍ ＺｎＣ１□、１ ｍＭスペルミジ／中、ＩＵの酵
素で３７℃、１時間）により脱リン酸化した。
より）をＥＣ０Ｒ１で消化し、３０μ４の反応体積でウ
シ腸アルカリホスファターゼ処理（５０ｍＭ）リス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ９，０，１ｍＭ ＭｇＣ１□、 １００ｕ
Ｍ ＺｎＣ１□、１ ｍＭスペルミジ／中、ＩＵの酵
素で３７℃、１時間）により脱リン酸化した。
ｐｒｅＳ２遺伝子ヲ含ｔｒ８２５ ｂｐ ＥｃｏＲｌ
断片’ｒ：ｐＴＢＯ４（実施例Ｉ参照）からＥＣ０ＲＩ
消化後電気泳動し、０６８％調製用アガロースゲルから
分離した。ｓ ｏ ｎｇのｍ１３ｍｐ１８ベクターと５
００ ｎｇのＥＣ０Ｒ１挿入断片を以下のようにしてＴ
４ ＤＮＡリガーゼで連結した。反応は、６．６Ｍ）リ
ス−Ｃ１゜ｐＨ７６，５ｍＭ ＭｇＧ１２ 、５ ｍＭ
ジテオスレイトール、ｉｍＭＡＴＰおよび１ワイスユニ
ツトのＴ４リガーゼを含む１０μｔの反応液中、２３℃
で１時間行なった。
断片’ｒ：ｐＴＢＯ４（実施例Ｉ参照）からＥＣ０ＲＩ
消化後電気泳動し、０６８％調製用アガロースゲルから
分離した。ｓ ｏ ｎｇのｍ１３ｍｐ１８ベクターと５
００ ｎｇのＥＣ０Ｒ１挿入断片を以下のようにしてＴ
４ ＤＮＡリガーゼで連結した。反応は、６．６Ｍ）リ
ス−Ｃ１゜ｐＨ７６，５ｍＭ ＭｇＧ１２ 、５ ｍＭ
ジテオスレイトール、ｉｍＭＡＴＰおよび１ワイスユニ
ツトのＴ４リガーゼを含む１０μｔの反応液中、２３℃
で１時間行なった。
次に、連結反応液を、以下に述べる方法でコンピテント
とした大腸菌ＪＭ１０３の形質転換に使用した。大腸＠
ＪＭＩ０３細胞の対数増殖中期の培養液（５０ｍｌ＞を
デー％７ＩＥＣＤＰＲ６００臨床用遠心機で４℃、３０
００ ｒｐｍで５分間遠心して集菌し、ｌ ＱｍＭ Ｎ
ａ１ｌで洗浄した。２５−の５０ ｍＭＣａＣ１□に再
懸濁し、０℃で６０分間装いた。細胞を上述のように遠
心し、２ｍｌの５０ ｍＭ Ｇａｅｌ□に再度懸濁した
。
とした大腸菌ＪＭ１０３の形質転換に使用した。大腸＠
ＪＭＩ０３細胞の対数増殖中期の培養液（５０ｍｌ＞を
デー％７ＩＥＣＤＰＲ６００臨床用遠心機で４℃、３０
００ ｒｐｍで５分間遠心して集菌し、ｌ ＱｍＭ Ｎ
ａ１ｌで洗浄した。２５−の５０ ｍＭＣａＣ１□に再
懸濁し、０℃で６０分間装いた。細胞を上述のように遠
心し、２ｍｌの５０ ｍＭ Ｇａｅｌ□に再度懸濁した
。
形質転換を行なうには、連結反応液７に１００μｔのコ
ンピテント細胞懸濁液に加え、氷上０℃で１５分間置き
、６７℃で５分間ヒートショックをかけ。
ンピテント細胞懸濁液に加え、氷上０℃で１５分間置き
、６７℃で５分間ヒートショックをかけ。
２６℃で５分間インキュベートした。細胞をＩＰＴＧと
Ｘ−ｇａｌｆ！：含む軟寒天と混合してＬＢ培地上に広
ケ、６７℃で一晩インキユベートし、該プレート上の透
明なプラークな選択した。
Ｘ−ｇａｌｆ！：含む軟寒天と混合してＬＢ培地上に広
ケ、６７℃で一晩インキユベートし、該プレート上の透
明なプラークな選択した。
どのプラークが挿入断片を正しい向きで含んでいるかを
決定するために、二本鎖ＤＮＡを調製し、ＥＣ０Ｒ１と
Ｘｂａｌ消化断片の分離を行なった。
決定するために、二本鎖ＤＮＡを調製し、ＥＣ０Ｒ１と
Ｘｂａｌ消化断片の分離を行なった。
Ｍ１３ユニバーサルプライマーの近傍に挿入断片の開始
メチオニンが存在するようなものが得られ、挿入断片の
アンチセンス鎖を含む詩聖を作成した。
メチオニンが存在するようなものが得られ、挿入断片の
アンチセンス鎖を含む詩聖を作成した。
これなｐＴＢＯ４７と名付けた。
（実施例■）
ｐｒｅＳ２の最初の５５アミノ酸なコードする１６５ｂ
ｐを欠失させることにより、ＨＢｓＡｇの２２６アミノ
酸ｍ（Ｓ型）をコードするＤＮＡ配列を作成した。これ
は１次に示すオリゴヌクレオチドプライマーを用いてｐ
ＴＢＯ４７（実施例Ｉより）のＭ１３プライマー特異的
欠失ミエータジエネシスを行なうことにより℃実施した
。
ｐを欠失させることにより、ＨＢｓＡｇの２２６アミノ
酸ｍ（Ｓ型）をコードするＤＮＡ配列を作成した。これ
は１次に示すオリゴヌクレオチドプライマーを用いてｐ
ＴＢＯ４７（実施例Ｉより）のＭ１３プライマー特異的
欠失ミエータジエネシスを行なうことにより℃実施した
。
ｃｏＲ１
５’ＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣ人■社
ＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＧ ３’ このオリゴヌクレオチドはシアノエチルホスホルアミダ
イト法を用いたアブライドバイヲシステムズＤＮＡ合成
機モデル６８０Ａを用いて合成した。
ＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＧ ３’ このオリゴヌクレオチドはシアノエチルホスホルアミダ
イト法を用いたアブライドバイヲシステムズＤＮＡ合成
機モデル６８０Ａを用いて合成した。
ミュータジェネシスは以下のようにして行なった。
２ｒｎｌのＬＢ培地中で約７時間インキュベートしたポ
ジティブなプラークの大量ミニブレヴプを行なった。２
５１／のり、Ｂ培地に、新しく増殖させたＪＭ１０３
２５０μｔを加えた。培養液を１時間培養し、７時間目
のプラーク培養液１００μｔｙ添加した。培養液を一晩
培養した。培養液をソルノ（−ル（５Ｏｒｖａｌｌ ）
ＲＧ−５Ｂ ｏ−ター５Ｓ３４で１０．０００ ｒｐ
ｍで１０分間、２回遠心して上清をきれいにした。３．
５ ｔｕｌの２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ Ｎａ１ｌを培養
液に加え、４℃で５時装置いた。培養液な上述のように
１０分間遠心した。上清を捨℃、ペレットを２ｍｌのＴ
Ｅ緩衝液に再懸濁した。ペレットを次にフェノール（Ｔ
Ｅで平衡化）で抽出し。
ジティブなプラークの大量ミニブレヴプを行なった。２
５１／のり、Ｂ培地に、新しく増殖させたＪＭ１０３
２５０μｔを加えた。培養液を１時間培養し、７時間目
のプラーク培養液１００μｔｙ添加した。培養液を一晩
培養した。培養液をソルノ（−ル（５Ｏｒｖａｌｌ ）
ＲＧ−５Ｂ ｏ−ター５Ｓ３４で１０．０００ ｒｐ
ｍで１０分間、２回遠心して上清をきれいにした。３．
５ ｔｕｌの２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ Ｎａ１ｌを培養
液に加え、４℃で５時装置いた。培養液な上述のように
１０分間遠心した。上清を捨℃、ペレットを２ｍｌのＴ
Ｅ緩衝液に再懸濁した。ペレットを次にフェノール（Ｔ
Ｅで平衡化）で抽出し。
フェノール／クロロホルムで一回抽出し、ＧＨＣＩ３で
２回抽出し、エーテルで一回抽出した。８ＭＬｉＣ１を
最終濃度が０．８Ｍとなるように加えた。
２回抽出し、エーテルで一回抽出した。８ＭＬｉＣ１を
最終濃度が０．８Ｍとなるように加えた。
６倍量のエタノールな加え、溶液を一晩２０℃で置いて
存在するＤＮＡを沈澱させた。次に、溶液を上述のよう
にｉｏ、ｏｏｏｒｐｍで１０分間遠心し、７０％エタノ
ールでリンスした。沈澱を１５（ＬｃｔｔのＩＱｍＭ）
リス−Ｃ（１４）ｐＨ７４ｖｃ再懸濁した。
存在するＤＮＡを沈澱させた。次に、溶液を上述のよう
にｉｏ、ｏｏｏｒｐｍで１０分間遠心し、７０％エタノ
ールでリンスした。沈澱を１５（ＬｃｔｔのＩＱｍＭ）
リス−Ｃ（１４）ｐＨ７４ｖｃ再懸濁した。
１ｐｍｏｌｅの組換え体Ｍ１３テンプレートを２０ｐｍ
ｏｌｅのオリゴヌクレオチドプライマーおよび１μｔの
溶液Ａと混合した。最終体積１ａｐｔとなるようにｄＨ
２０を加えた。 試料を６５℃で５分間インキュベート
し１次に、６０分間かけて温度を６７℃に下げた。
ｏｌｅのオリゴヌクレオチドプライマーおよび１μｔの
溶液Ａと混合した。最終体積１ａｐｔとなるようにｄＨ
２０を加えた。 試料を６５℃で５分間インキュベート
し１次に、６０分間かけて温度を６７℃に下げた。
以下のものを試料に添加し、１５℃で少なくとも４〜６
時間インキュベートした： 溶液Ｂ １μｔ Ｉ ＱｍＭ ｄＡＴＰ １ μｔＩＱｍＭ ｃ
ｌＧＴＰ １ｐｔ １０ｍＭ ｄＧＴＰ １ｐｌ− ｉＱｍＭ ｄＴＴＰ １μｔ ５Ｕ／μｔ クレノー ２μｔ ｄＨ２０６μｔ ２０μＬ 次に試料をｄＨ２ｏで１：４０に希釈した。５μｔをＪ
Ｍ１０３コンピテント細１ｔｉ１６テユープ（各２００
μｔ）の形質転換に使用した。形質転換したＪＭ１０３
細胞を軟寒天に混合し、ＬＢ培地上にブレーティングし
た。続いてポジティブなプラークをフィルターハイブリ
ダイゼーションで選択した。
時間インキュベートした： 溶液Ｂ １μｔ Ｉ ＱｍＭ ｄＡＴＰ １ μｔＩＱｍＭ ｃ
ｌＧＴＰ １ｐｔ １０ｍＭ ｄＧＴＰ １ｐｌ− ｉＱｍＭ ｄＴＴＰ １μｔ ５Ｕ／μｔ クレノー ２μｔ ｄＨ２０６μｔ ２０μＬ 次に試料をｄＨ２ｏで１：４０に希釈した。５μｔをＪ
Ｍ１０３コンピテント細１ｔｉ１６テユープ（各２００
μｔ）の形質転換に使用した。形質転換したＪＭ１０３
細胞を軟寒天に混合し、ＬＢ培地上にブレーティングし
た。続いてポジティブなプラークをフィルターハイブリ
ダイゼーションで選択した。
オリゴヌクレオチドプライマーに相補性のあるハイプリ
ダイゼーシヲングローブを上述のように合成シタ。この
グローブ１５ｐｍｏｌｅを総体積２５μを中、６５℃で
１０分間インキュベートした。
ダイゼーシヲングローブを上述のように合成シタ。この
グローブ１５ｐｍｏｌｅを総体積２５μを中、６５℃で
１０分間インキュベートした。
６μｔの１０×キナーゼ緩衝液（マニアティス他）。
ｉ ｐｔ（ｆ） ｉ ［ｌ ｕＭ ＡＴＰ、および１μ
ｔのポリヌクレオチドキナーゼ（１００ｕ／μｔ）を加
えた。
ｔのポリヌクレオチドキナーゼ（１００ｕ／μｔ）を加
えた。
試料を６７℃で１時間インキュベートし、Ｇ−５０セフ
アデツクスカラムにかけた、カラムから溶出された最初
のピークを回収した。
アデツクスカラムにかけた、カラムから溶出された最初
のピークを回収した。
ニトロセルロースフィルターを形質転ｍグｖ−ト上に５
〜１０分間置分間向きを決定して、上述のプローブを用
いたハイブリダイゼーションのためのフィルターを調製
した。次に、フィルターをプレートから剥し、裏側を溶
液の上面に載せて変性溶液（１，５Ｍ Ｎａ１ｌ、
０，５Ｎ ＮａＯＨ）上に浮かべて３分間層いた。′フ
ィルターを変性溶液中に５分間浸し１次に中和溶液（Ｉ
Ｍ Ｔｒ １ｓ−Ｃ（１４）ｐＨ８、ｌ、５Ｍ
ＮａＣ１）に移して５分間層いた。
〜１０分間置分間向きを決定して、上述のプローブを用
いたハイブリダイゼーションのためのフィルターを調製
した。次に、フィルターをプレートから剥し、裏側を溶
液の上面に載せて変性溶液（１，５Ｍ Ｎａ１ｌ、
０，５Ｎ ＮａＯＨ）上に浮かべて３分間層いた。′フ
ィルターを変性溶液中に５分間浸し１次に中和溶液（Ｉ
Ｍ Ｔｒ １ｓ−Ｃ（１４）ｐＨ８、ｌ、５Ｍ
ＮａＣ１）に移して５分間層いた。
中和したフィルターな続い１２ｘｓｓｃ （１ｘＳＳＣ
は、１５０ｍＭ ＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸ナトリ
ウム）に移し、５分間層いた。フィルターを風乾し、真
空下、８０℃で１時間ペイクした。５ｄのハイプリダイ
ゼーシコン緩衝液、１０Ｘデンハルト溶１（１ｘデンハ
ルト溶液は、０．０２％フィコール。
は、１５０ｍＭ ＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸ナトリ
ウム）に移し、５分間層いた。フィルターを風乾し、真
空下、８０℃で１時間ペイクした。５ｄのハイプリダイ
ゼーシコン緩衝液、１０Ｘデンハルト溶１（１ｘデンハ
ルト溶液は、０．０２％フィコール。
０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％クシ血清
アルブミン）、０．０５％ＳＤＳ、および５ ｘ ５Ｓ
ＲＥの入った密閉したプラスチックバッグ内で６５℃で
１時間フィルターのプレハイプリダイゼーシ嘗ンを行な
った。緩衝液を５ｄ／フイルターの新しいハイブリダイ
ゼーション緩衝液と交換した。あらかじめ調製した放射
性活性相補オリゴヌクレオチドをまず６５℃で５分間イ
ンキュベートし１次に十分なプローブを１ ｘ １０’
ｃｐｍｉｒｒｔｔとなるようにフィルターを含む新し
いハイブリダイゼータ１ン緩衝液に加えた。ノ・イブリ
ダイゼーシ冒ンは、該プローブの計算した融解温度より
５℃低い温度で４時間行なった。
アルブミン）、０．０５％ＳＤＳ、および５ ｘ ５Ｓ
ＲＥの入った密閉したプラスチックバッグ内で６５℃で
１時間フィルターのプレハイプリダイゼーシ嘗ンを行な
った。緩衝液を５ｄ／フイルターの新しいハイブリダイ
ゼーション緩衝液と交換した。あらかじめ調製した放射
性活性相補オリゴヌクレオチドをまず６５℃で５分間イ
ンキュベートし１次に十分なプローブを１ ｘ １０’
ｃｐｍｉｒｒｔｔとなるようにフィルターを含む新し
いハイブリダイゼータ１ン緩衝液に加えた。ノ・イブリ
ダイゼーシ冒ンは、該プローブの計算した融解温度より
５℃低い温度で４時間行なった。
次に、フィルターを６ｘＳＳＣで室温で１０分間、３回
洗浄した。最後にフィルターをノ〜イブリダイゼーショ
ン温度で６ｘＳＳＣで洗浄した。フィルターを３ＭＭホ
ワグトマン濾紙上に置いて乾かし、−晩フィルムに感光
させた（向きの目印をつけておく）０３個のポジティブ
なプラークな拾い、独立に２ｍｌのＬＢ培地で３７℃で
５時間培養した。
洗浄した。最後にフィルターをノ〜イブリダイゼーショ
ン温度で６ｘＳＳＣで洗浄した。フィルターを３ＭＭホ
ワグトマン濾紙上に置いて乾かし、−晩フィルムに感光
させた（向きの目印をつけておく）０３個のポジティブ
なプラークな拾い、独立に２ｍｌのＬＢ培地で３７℃で
５時間培養した。
これらの各プラーク上でミニテンプレート調製２行なっ
た。プラーク培養ｇ１ｍｌ’ｌエッペンドルフチューブ
に写し、工ヴペンドルフモデル５４１４遠心機で５分間
遠心した。上清８００μｔを１回収し、２００μｔの２
０％ＰＥＧ−２，５Ｍ Ｎａ１ｌをそれに加えた。上
清を室温で１０分間インキエベートし、エッペンドルフ
遠心機で１０分間遠心した。
た。プラーク培養ｇ１ｍｌ’ｌエッペンドルフチューブ
に写し、工ヴペンドルフモデル５４１４遠心機で５分間
遠心した。上清８００μｔを１回収し、２００μｔの２
０％ＰＥＧ−２，５Ｍ Ｎａ１ｌをそれに加えた。上
清を室温で１０分間インキエベートし、エッペンドルフ
遠心機で１０分間遠心した。
上清を吸引で除き、ペレフトを２００μｔのＴＥ（１Ｑ
ｍＭ ’ｒｒｉｓ−ａ１． ｐＨ７，４： １ ｍＭ
ＥＤＴＡ）に再懸濁した。再懸濁したベレットをフェ
ノール／クロロホルム抽出し、Ｌｉｏｌｄｌ度が０．８
ＭとなるまでＬｉＣ１溶液を加えて上側の水層中のテン
ブレー）ＤＮＡを沈澱させた。２−〜６倍量のエタノー
ルを加え、ドライアイス上に５分間おいて試料な沈澱さ
せた。沈澱物な上述のように１０分間遠心して落とした
。最終体積をＴＥで１５０．αｔとした。
ｍＭ ’ｒｒｉｓ−ａ１． ｐＨ７，４： １ ｍＭ
ＥＤＴＡ）に再懸濁した。再懸濁したベレットをフェ
ノール／クロロホルム抽出し、Ｌｉｏｌｄｌ度が０．８
ＭとなるまでＬｉＣ１溶液を加えて上側の水層中のテン
ブレー）ＤＮＡを沈澱させた。２−〜６倍量のエタノー
ルを加え、ドライアイス上に５分間おいて試料な沈澱さ
せた。沈澱物な上述のように１０分間遠心して落とした
。最終体積をＴＥで１５０．αｔとした。
２００／ＡｔのＪＭＩ０３コンピテント細胞を回収した
ＤＮＡで形質転換した。単離したファージＤＮＡを１７
１０希釈したもの１μｔを形質転換に使用した。形質転
換混合液をブレーティングし。
ＤＮＡで形質転換した。単離したファージＤＮＡを１７
１０希釈したもの１μｔを形質転換に使用した。形質転
換混合液をブレーティングし。
上述のようにオリゴヌクレオチドでプラークの選択を行
なった。
なった。
２ｍｌのＬＢ培地で約７時間培養したポジティブなグロ
ーブについて大量ミニプレツブを行なった。
ーブについて大量ミニプレツブを行なった。
２５ｍのＬＢ培地に２５０μｔの新しく培養したＪＭＩ
０３細胞を植えた。培養液を１時間培養１−。
０３細胞を植えた。培養液を１時間培養１−。
プラークの７時間培養液１００μｔを植えた。培養液を
一晩培養し、上清をきれいにするために５Ｓ３４０−タ
ーを用いてンルパールＲＣ−５Ｂで１０分間１０．００
０ ｒｐｍｓで２回遠心した。 ３．５ｍｊ！の２０％
ＰＥＣ／２．５Ｍ ＮａＣ１を培養液に加えて４℃で５
時間インキュベートした。培養液を杏度上述のように１
０分間遠心した。上清を捨て、ベレットを２ｒｎｌのＴ
Ｅ緩衝液に再懸濁した。ベレットを次にフェノールで抽
出し、ＴＥで緩衝化し、フェノール／クロロホルムで一
度抽出、 ＣＨＣｌ□で２回抽出し℃エーテルで１回抽
出した。、８ＭＬｉＣ１を最終濃度が０．８Ｍとなるよ
うに添加した。
一晩培養し、上清をきれいにするために５Ｓ３４０−タ
ーを用いてンルパールＲＣ−５Ｂで１０分間１０．００
０ ｒｐｍｓで２回遠心した。 ３．５ｍｊ！の２０％
ＰＥＣ／２．５Ｍ ＮａＣ１を培養液に加えて４℃で５
時間インキュベートした。培養液を杏度上述のように１
０分間遠心した。上清を捨て、ベレットを２ｒｎｌのＴ
Ｅ緩衝液に再懸濁した。ベレットを次にフェノールで抽
出し、ＴＥで緩衝化し、フェノール／クロロホルムで一
度抽出、 ＣＨＣｌ□で２回抽出し℃エーテルで１回抽
出した。、８ＭＬｉＣ１を最終濃度が０．８Ｍとなるよ
うに添加した。
６倍量のエタノールを加え、溶液を一晩放置し℃存在す
るＤＮＡを沈澱させた。溶液を上述のように１０．００
Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、７０％エタノールでリン
スした。沈澱を１５０μｔのＩＱｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７
，４）に再懸濁した。
るＤＮＡを沈澱させた。溶液を上述のように１０．００
Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、７０％エタノールでリン
スした。沈澱を１５０μｔのＩＱｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７
，４）に再懸濁した。
ポジティブなコロニーをコロニーノ・イブリダイゼーシ
冒ン（グＡ／ ７ Ｘ ｐイン （Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ
）とホグネス（ＨＯｇ１６ＳＳ ）、ＰＮＡＳ ７２
．３９６１（１９７５）） で同定し、正しい変異を
もつＭ１３構造な見いだすためにジデオキシ法で塩基配
列決定ヲ行なった。マニアナイス他のアルカリ法な用い
てＲＦ ＤＮＡｐｔ回収した。６７８ ｂｐのＥｃｏＲ
１断片を０．８％調製用アガロースゲルからｐＡＯ８０
４およびｐＡＯ８１１（それぞれ実施例Ｖ、実施例■参
照）にサブクローニングした。大腸＠ＭＧ１０６１細ｂ
’を実施例１で述べたようなこれら二つのベクターの何
れかで形質転換した。適当な方向でＤＮＡを含む形質転
換はＤＮＡミンプレクプのＸｂａｌ消化で同定した（こ
れも実施例Ｉに前述）。ｐへ〇８０４由来の形質転換体
のひとつをｐＴＢＯ６： ｐＡＯ８１１由来の形質転換
体ｆＪＩ：ｐＨ８６と呼ぶ。
冒ン（グＡ／ ７ Ｘ ｐイン （Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ
）とホグネス（ＨＯｇ１６ＳＳ ）、ＰＮＡＳ ７２
．３９６１（１９７５）） で同定し、正しい変異を
もつＭ１３構造な見いだすためにジデオキシ法で塩基配
列決定ヲ行なった。マニアナイス他のアルカリ法な用い
てＲＦ ＤＮＡｐｔ回収した。６７８ ｂｐのＥｃｏＲ
１断片を０．８％調製用アガロースゲルからｐＡＯ８０
４およびｐＡＯ８１１（それぞれ実施例Ｖ、実施例■参
照）にサブクローニングした。大腸＠ＭＧ１０６１細ｂ
’を実施例１で述べたようなこれら二つのベクターの何
れかで形質転換した。適当な方向でＤＮＡを含む形質転
換はＤＮＡミンプレクプのＸｂａｌ消化で同定した（こ
れも実施例Ｉに前述）。ｐへ〇８０４由来の形質転換体
のひとつをｐＴＢＯ６： ｐＡＯ８１１由来の形質転換
体ｆＪＩ：ｐＨ８６と呼ぶ。
（実施例Ｖ）
ｐＡＯ８０３およびｐＡＯ８０４の構築ｐＡＯ８０４は
、ピキア・パストリスのＡＯＸＩ位に部位特異的遺伝子
破壊が可能なベクターである。
、ピキア・パストリスのＡＯＸＩ位に部位特異的遺伝子
破壊が可能なベクターである。
これは、いくつかの要素を含んでいる：単独のＥＣ０Ｒ
１によって分断されるＡＯＸ１プロモーターおよび転写
ターミテーター：ビキア・バストリス野生型株１（ＩＳ
Ａ遺伝子；転写ターミネータ−の下流のＡＯＸ１遺伝子
座の６′末端から分離したＤＮＡのゲノム断片：細菌宿
主内で選択および複製に必要な塩基配配列、要素の順番
は、ベクターの制限酵素消化によって５発現カセット、
ゲノムの連続する部位に相同性のある末端を持つ選択マ
ーカーを含むＤＮＡ断片が切り出されるように配列され
℃おり、形質転換の際に染色体に安定に挿入される。
１によって分断されるＡＯＸ１プロモーターおよび転写
ターミテーター：ビキア・バストリス野生型株１（ＩＳ
Ａ遺伝子；転写ターミネータ−の下流のＡＯＸ１遺伝子
座の６′末端から分離したＤＮＡのゲノム断片：細菌宿
主内で選択および複製に必要な塩基配配列、要素の順番
は、ベクターの制限酵素消化によって５発現カセット、
ゲノムの連続する部位に相同性のある末端を持つ選択マ
ーカーを含むＤＮＡ断片が切り出されるように配列され
℃おり、形質転換の際に染色体に安定に挿入される。
ｐＡＯ８１］４は、１９８５年１０月２２日に米国農務
省の北部リサーチラボラトリーズに寄託されているＢを
肝炎表面抗原発現プラスミドｐＢｓＡｅ工５Ｉ（ＮＲＲ
Ｌ １８０２１）の誘導体である。これは以下の修触
を含むｐＢＲ３２２を基にしたプラスミドに連結したも
のである。ｐＢＲ３２２をＥＯＯＲＩで消化し、フェノ
ール抽出とエタノール沈澱を行なった。末端をクレノー
ポリメラーゼな用い℃フィル・インした。ＥｃｏＲｌで
消化したＩ）ＢＲ３２２２ｐｇを５０ ｍＭ Ｔｒ １
ｓ−Ｃ（１４）ｐＨ７，２、ｉＱｍＭＭｇＳＯ４、１０
０ｕＭ ジチオスレイトール、５０ｐｇ／ｄウシ血清
アルプミ７．１００ｕＭ ｄＡＴＰ。
省の北部リサーチラボラトリーズに寄託されているＢを
肝炎表面抗原発現プラスミドｐＢｓＡｅ工５Ｉ（ＮＲＲ
Ｌ １８０２１）の誘導体である。これは以下の修触
を含むｐＢＲ３２２を基にしたプラスミドに連結したも
のである。ｐＢＲ３２２をＥＯＯＲＩで消化し、フェノ
ール抽出とエタノール沈澱を行なった。末端をクレノー
ポリメラーゼな用い℃フィル・インした。ＥｃｏＲｌで
消化したＩ）ＢＲ３２２２ｐｇを５０ ｍＭ Ｔｒ １
ｓ−Ｃ（１４）ｐＨ７，２、ｉＱｍＭＭｇＳＯ４、１０
０ｕＭ ジチオスレイトール、５０ｐｇ／ｄウシ血清
アルプミ７．１００ｕＭ ｄＡＴＰ。
Ｉ Ｑ Ｑ ｕＭ ｄＴＴＰ、および１ユニツトのクレ
ノーポリメラーゼを含む２５μｔの反応体積中、室温で
１５分間インキュベートした。フェノール抽出とエタノ
ール沈澱後、ＤＮＡを連結させ工再度プラスミドにし、
連結反応液を大腸１１Ｍｃ１０６１の形質転換に用いた
。形質転換体はＥｃｏＲ１部位がナイコト、およびＰｓ
ｔｌ、、Ｐｖｕｌ、および５ａｌｌなどの消化部位が存
在することによって選択した。このプラスミドを１）Ｂ
Ｒ３２２−Ｆｉｌと名付けた。
ノーポリメラーゼを含む２５μｔの反応体積中、室温で
１５分間インキュベートした。フェノール抽出とエタノ
ール沈澱後、ＤＮＡを連結させ工再度プラスミドにし、
連結反応液を大腸１１Ｍｃ１０６１の形質転換に用いた
。形質転換体はＥｃｏＲ１部位がナイコト、およびＰｓ
ｔｌ、、Ｐｖｕｌ、および５ａｌｌなどの消化部位が存
在することによって選択した。このプラスミドを１）Ｂ
Ｒ３２２−Ｆｉｌと名付けた。
ＢｇｌＱ部位なＰｖｕ１１部位に導入することにより、
このプラスミドをさらに改変した。プラスミドをＰｖｕ
ｌｉで消化し、リン酸化したＢｇｌ １１リンカ−（
ＧＡＧＡＴＣＴＣ）を平滑末端連結反応で加えた。
このプラスミドをさらに改変した。プラスミドをＰｖｕ
ｌｉで消化し、リン酸化したＢｇｌ １１リンカ−（
ＧＡＧＡＴＣＴＣ）を平滑末端連結反応で加えた。
過剰のリンカ−は、Ｂｇｌｌで一晩消化して除き、プラ
スミドはＴ４ＤＮＡリガーゼで再度環状にした。連結反
応液はアンピシリン耐性について大腸１１１ＭＧ１０６
１の形質転換に用いた。形質転換体はＢｇｌｌによる消
化でＢｇ１１部位の存在を示すこと、およびＳａｌ Ｉ
／ＢｇｌＩｔ消化でＢｇｌ １ 部位がｐｖｕ１１部
位のあった位置に存在することを確認することによっ℃
解析した。このプラスミドをｐＢＲ３２！ Ｂｇｌ Ｉ
Ｉ −Ｒ１と名付けた。
スミドはＴ４ＤＮＡリガーゼで再度環状にした。連結反
応液はアンピシリン耐性について大腸１１１ＭＧ１０６
１の形質転換に用いた。形質転換体はＢｇｌｌによる消
化でＢｇ１１部位の存在を示すこと、およびＳａｌ Ｉ
／ＢｇｌＩｔ消化でＢｇｌ １ 部位がｐｖｕ１１部
位のあった位置に存在することを確認することによっ℃
解析した。このプラスミドをｐＢＲ３２！ Ｂｇｌ Ｉ
Ｉ −Ｒ１と名付けた。
ｐＡＯ８０４および１）ＡＯ８１１はｐＢＳＡＧＩ５Ｉ
か１−、ＤＮＡ断片ヲ分離し、それをｐＢＲ３２２８ｇ
１４−Ｒ１につなぐことによって作成された。ＡＯＸｉ
座位の６′標的部分を７００ ｂｐのＢｇｌ ＩＩ ／
Ｘｈ。
か１−、ＤＮＡ断片ヲ分離し、それをｐＢＲ３２２８ｇ
１４−Ｒ１につなぐことによって作成された。ＡＯＸｉ
座位の６′標的部分を７００ ｂｐのＢｇｌ ＩＩ ／
Ｘｈ。
Ｉ断片としてｐＢＳＡＧＩ５Ｉから分離し、その５０ｎ
ｇをＳａｌ ｌとＢｇｌ［１で消化した親プラスミド５
ｎｇに連結した。連結反応液を大腸菌ＭＣ１０６１の形
質転換に使用し、アンピシリン耐性で選択した。形質転
換体は、実施例１で述べたようにミニプレツブＤＮＡの
ＢａｍＨ１／Ｂｇｌ［１消化にヨツ”Ｃ約９００ ｂｐ
断片か見られることによって解析した。このような形質
転換体をひとつ選び、ＤＮＡを大量に精製した。このよ
うなプラスミミドをｐＡＯ８０１とした。
ｇをＳａｌ ｌとＢｇｌ［１で消化した親プラスミド５
ｎｇに連結した。連結反応液を大腸菌ＭＣ１０６１の形
質転換に使用し、アンピシリン耐性で選択した。形質転
換体は、実施例１で述べたようにミニプレツブＤＮＡの
ＢａｍＨ１／Ｂｇｌ［１消化にヨツ”Ｃ約９００ ｂｐ
断片か見られることによって解析した。このような形質
転換体をひとつ選び、ＤＮＡを大量に精製した。このよ
うなプラスミミドをｐＡＯ８０１とした。
プラスミドｐＢｓＡＧＩ５ＩをＣ１ａ ｌで消化シ、プ
ロモーター−遺伝子−ターミネーター発現カセットを分
離した。２μｇのｐＡＯ８０１なＣａｌ ｌで消化し、
３ｏｐｔの反応体積（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
９ｇ、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１００ｕＭＺｎＣ１，１
ｍＭ スペルミジン中、１ユニツトノ酵素で３７℃で
１時間）中でアルカリホスファターゼ処理を行なった。
ロモーター−遺伝子−ターミネーター発現カセットを分
離した。２μｇのｐＡＯ８０１なＣａｌ ｌで消化し、
３ｏｐｔの反応体積（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
９ｇ、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１００ｕＭＺｎＣ１，１
ｍＭ スペルミジン中、１ユニツトノ酵素で３７℃で
１時間）中でアルカリホスファターゼ処理を行なった。
ｓｏｎｇのＣ１ａ ｌ断片′ｌｊ！：５ｎｇのｐＡＯ８
０１ベクターに連結させ、連結反応液を大腸ｓＭｃｉｏ
６ｉの形質転換に用いアンピシリン耐性にした。これら
のコロニーをＢｇｌ ｌ で消化して該断片が挿入さ
れていることおよび２．３および２．７ｋｂの断片が獲
られることにより正しい向きであることを確認した。こ
の一つの形質転換体をｐＡＯ８０２と名付けた。
０１ベクターに連結させ、連結反応液を大腸ｓＭｃｉｏ
６ｉの形質転換に用いアンピシリン耐性にした。これら
のコロニーをＢｇｌ ｌ で消化して該断片が挿入さ
れていることおよび２．３および２．７ｋｂの断片が獲
られることにより正しい向きであることを確認した。こ
の一つの形質転換体をｐＡＯ８０２と名付けた。
プラスミドｐＡＯ８０２をＢ型肝炎表面抗原遺伝子の３
′末端の唯一の５ｔｕｌ部位で消化した。
′末端の唯一の５ｔｕｌ部位で消化した。
ＥｃｏＲｌリンカ−をリン酸化、アニーリングし。
５ｔｕｌで消化したプラスミドに連結させた。過剰のリ
ンカ−をＥＣＯＲｌで一晩消化することにより除去した
。ＩＣ０ＲＩ消化によってＨＢｓＡｇ構造遺伝子の５′
末端も切断され、遺伝子が切り出される。再連結反応の
際に、プロモーターと転写ターミネータ−を唯一のＥｃ
ｏＲｌクローニング部位に結合させた。アンピシリン耐
性形質転換体は。
ンカ−をＥＣＯＲｌで一晩消化することにより除去した
。ＩＣ０ＲＩ消化によってＨＢｓＡｇ構造遺伝子の５′
末端も切断され、遺伝子が切り出される。再連結反応の
際に、プロモーターと転写ターミネータ−を唯一のＥｃ
ｏＲｌクローニング部位に結合させた。アンピシリン耐
性形質転換体は。
またＢｇｌｌ消化によつ℃解析し、正しい断片（２，３
ｋｂ、 ２．１ ｋｂ ）を持つ形質転換体検定してｐ
ＡＯ８０３とした。
ｋｂ、 ２．１ ｋｂ ）を持つ形質転換体検定してｐ
ＡＯ８０３とした。
プラスミドｐＡＯ８０３をＢａｍＨＩ で消化し、ｐ
ＹＭｌ Ｏ（第８図） 由来ノ２．７ ｋｂ Ｂｇｌ
ｌ 断片を調製用アガロースゲル電気泳動によって分離
し、ＢａｍＨｌで消化して脱リン酸化したｐＡＯ８Ｑ３
に連結した。（ｐＹＭｌｏは２９５９が破壊されたＢａ
ｍＨｌを有するｐＹＪ３０（ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９
０米国農務省北部リサーチラボラトリーズに寄託）の訪
導本である）。形質転換体はｚ４ｋｂ断片を与えるＸｂ
ａ１部位の存在と、Ｂｇｌ ［１の消化による２、３ｋ
ｌ）と５，１ｋｔ）断片により℃解析した。 このプラ
スミドをｐＡＯ８０４と名付けた。
ＹＭｌ Ｏ（第８図） 由来ノ２．７ ｋｂ Ｂｇｌ
ｌ 断片を調製用アガロースゲル電気泳動によって分離
し、ＢａｍＨｌで消化して脱リン酸化したｐＡＯ８Ｑ３
に連結した。（ｐＹＭｌｏは２９５９が破壊されたＢａ
ｍＨｌを有するｐＹＪ３０（ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９
０米国農務省北部リサーチラボラトリーズに寄託）の訪
導本である）。形質転換体はｚ４ｋｂ断片を与えるＸｂ
ａ１部位の存在と、Ｂｇｌ ［１の消化による２、３ｋ
ｌ）と５，１ｋｔ）断片により℃解析した。 このプラ
スミドをｐＡＯ８０４と名付けた。
（実施例■）
ピキア）ｌＩｓ４遺伝子のかわりにサヴカロミセスＡＲ
Ｇ４遺伝子を含む第二の関連プラスミドも構築した。Ａ
Ｒ（，４遺伝子の一つの可能な供給源は。
Ｇ４遺伝子を含む第二の関連プラスミドも構築した。Ａ
Ｒ（，４遺伝子の一つの可能な供給源は。
ｐＹＭ２５、大腸菌宿主中プラスミドＮＲＲＬ Ｂ−
ｉｓｏｉ５中のプラスミドから得られる２、ＱｋｂＨｐ
ａ ｌ断片である。この株は米国イリノイ州ペオリアの
米国農務省北部リサーチセンターから入手可能である。
ｉｓｏｉ５中のプラスミドから得られる２、ＱｋｂＨｐ
ａ ｌ断片である。この株は米国イリノイ州ペオリアの
米国農務省北部リサーチセンターから入手可能である。
該断片は０．８％調製用アガロースゲルから精製した。
ｓ ｏ ｏ ｎｇの断片をｓｏｎｇのＢａｍＨＩ で消
化してフィル・インしたｐＡＯ８０３（実施例Ｖ参照）
と連結させた。連結反応液を大腸菌ＭＣ１０６１の形質
転換に使用し、アンピシリン耐性で選択した。形質転換
に！Ｂｇｌ［消化で解析し、正しい挿入断片はアガロー
スゲル電気泳動で確認した。このプラスミド１ｋｐＡＯ
８１１と名付けた。
化してフィル・インしたｐＡＯ８０３（実施例Ｖ参照）
と連結させた。連結反応液を大腸菌ＭＣ１０６１の形質
転換に使用し、アンピシリン耐性で選択した。形質転換
に！Ｂｇｌ［消化で解析し、正しい挿入断片はアガロー
スゲル電気泳動で確認した。このプラスミド１ｋｐＡＯ
８１１と名付けた。
（実施例■）
１０６細胞／ｄな５ｄのＹＰＤで３０℃で一晩培養し、
デーモンＩＥＣＤＰＲ６００臨床用遠心機で３００ Ｏ
ｒｐｍで５分間遠心した。ペレットを０．５ｄの１Ｍソ
ルビトール、０．１−の０．５Ｍ ＥＤＴＡ。
デーモンＩＥＣＤＰＲ６００臨床用遠心機で３００ Ｏ
ｒｐｍで５分間遠心した。ペレットを０．５ｄの１Ｍソ
ルビトール、０．１−の０．５Ｍ ＥＤＴＡ。
ｐＨ７，５に再懸濁し、１．５ｄの微量遠心テエーブに
試料を移した。０．０２１ｕｔの２．５■／ｒ１１ｔザ
イモリエース６０，０００（マイルス・ラボラドリース
）を加え、試料を３７℃で６０分間インキュベートした
。細胞を高速で１分間遠心して５ Ｑ ｍＭ ＴｒｉＳ
−Ｃ１，ｐＨ７４および２０ｍＭ ＥＤＴＡＫ再度懸
濁した。０．０５ ｍｌの１０％ＳＯ３を加え、試料を
混合し６５℃で６０分間インキュベートした。
試料を移した。０．０２１ｕｔの２．５■／ｒ１１ｔザ
イモリエース６０，０００（マイルス・ラボラドリース
）を加え、試料を３７℃で６０分間インキュベートした
。細胞を高速で１分間遠心して５ Ｑ ｍＭ ＴｒｉＳ
−Ｃ１，ｐＨ７４および２０ｍＭ ＥＤＴＡＫ再度懸
濁した。０．０５ ｍｌの１０％ＳＯ３を加え、試料を
混合し６５℃で６０分間インキュベートした。
０．２Ｍの５Ｍ酢酸カリウムを添加し、試料を氷上で６
０分間おいた。試料を再度高速で５分間遠心した。
０分間おいた。試料を再度高速で５分間遠心した。
上清を新しい１．５１ｎｔ微量遠心チエープにうつし、
室温で等量のインプロパツールを加えた。試料を混会し
、室温で５分間静置し、つぎに高速で非常に短時間（１
０秒）遠心テエープ内で遠心した。
室温で等量のインプロパツールを加えた。試料を混会し
、室温で５分間静置し、つぎに高速で非常に短時間（１
０秒）遠心テエープ内で遠心した。
上清を捨ててペレットを風乾した。ペレットを０、３
ｍｌのＩ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ（１４）ｐＨ７，４
および１ｍＭＥＤＴＡに再懸濁し、１５μｔの１〜／ａ
ｔの膵臓ＲＮａＳ６溶液を添加し、試料を６７℃で３０
分間インキュベートした。０．０３ ａｔの３Ｍ酢酸ナ
トリウムを加え、試料な混合し、０，２ｄのインプロパ
ツールを加えたつ試料を高速で遠心してＤＮＡのペレッ
ト化な行なった。上清を捨て、ペレットな乾燥さセ”Ｃ
０，１＝ ０．３ｍ＜７） １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＯＩｐＨ７，４、および１ｍＭ ＥＤＴＡＩＣ再ＭｆＵ
、り。
ｍｌのＩ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ（１４）ｐＨ７，４
および１ｍＭＥＤＴＡに再懸濁し、１５μｔの１〜／ａ
ｔの膵臓ＲＮａＳ６溶液を添加し、試料を６７℃で３０
分間インキュベートした。０．０３ ａｔの３Ｍ酢酸ナ
トリウムを加え、試料な混合し、０，２ｄのインプロパ
ツールを加えたつ試料を高速で遠心してＤＮＡのペレッ
ト化な行なった。上清を捨て、ペレットな乾燥さセ”Ｃ
０，１＝ ０．３ｍ＜７） １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＯＩｐＨ７，４、および１ｍＭ ＥＤＴＡＩＣ再ＭｆＵ
、り。
（注意： ＤＮＡを制限酵素反応に使用する前に、高速
で１５分間遠心して、消化を阻害するインヒビターの可
能性のある不溶性物質を除いた）。
で１５分間遠心して、消化を阻害するインヒビターの可
能性のある不溶性物質を除いた）。
（実施例■）
Ｂ型肝炎表面抗原（７）Ｓ （ｐ２４）およびｐｒｅＳ
２（ｐ３１）をコードする発現カセットを含む二つの混
合粒子株を以下のように構築した。クレヴグＣＣｒｆ３
ｇｇ）他、Ｂ ｔ ｏ／’ｒｅｃｈｎｏ１ｏｇｙ ５
＊ ４７９（１９８７）のスフェロプラスト形質転換法
を用いて、１μｇのまだ切断していないｐＨＢ６でピキ
ア・パストリスＰＰＦ１ （ａｒｇ４ ｈｉｓ４）を
形質転換した。（ｐＨ８６は実施例ＩＶおよび実施例■
１に示したＳ遺伝子を含むｐＡＯ８１１のサブクローン
である）。
２（ｐ３１）をコードする発現カセットを含む二つの混
合粒子株を以下のように構築した。クレヴグＣＣｒｆ３
ｇｇ）他、Ｂ ｔ ｏ／’ｒｅｃｈｎｏ１ｏｇｙ ５
＊ ４７９（１９８７）のスフェロプラスト形質転換法
を用いて、１μｇのまだ切断していないｐＨＢ６でピキ
ア・パストリスＰＰＦ１ （ａｒｇ４ ｈｉｓ４）を
形質転換した。（ｐＨ８６は実施例ＩＶおよび実施例■
１に示したＳ遺伝子を含むｐＡＯ８１１のサブクローン
である）。
アルギニン非要求比を示す形質転換ｆＩＩ−はヒスチジ
ンを含む最少培地状で再生させ、以下のようにして挿入
部位に関してスクリーニングを行なった。
ンを含む最少培地状で再生させ、以下のようにして挿入
部位に関してスクリーニングを行なった。
これらの形質転換体および野生型ピキア・パストリスの
ＤＮＡを実施例■に示すように調製し。
ＤＮＡを実施例■に示すように調製し。
ＥｃｏＲｌで消化し、０，８％アガロースゲル電気泳勧
に掻ケた。これらのＤＮＡのサザンプロット（マニアテ
ィス他）を行い、ＡＯＸ１’ｌＩ異的プローブ（ｐＰＧ
４．ＯＮＲＲＬ＃ １５８６８ ＮＲＲＬ １５８
６８は米国農務省北部リサーチラボラトリーズに寄託さ
れた）あるいはＨＩＳ４特異的グローブ（ｐＹＭ４）と
ハゴプリダイズさせた。ｐＹＭ４は実施例Ｉに述べられ
ている。挿入部位は、野生型株と与えられた形質転換体
のハイブリダイゼーションパターンを比較することによ
り決定させた。野生型株のバンドの大きさのいかなる変
化もその位置への挿入の証拠となる。ＡＯＸｉ遺伝子座
の５′末端への挿入が行なわれ、さらに野生型二遺伝子
およびＨＩＳ４変異な含む形質転換体をＰＰＦ１／ｐＨ
８６と名付けた。
に掻ケた。これらのＤＮＡのサザンプロット（マニアテ
ィス他）を行い、ＡＯＸ１’ｌＩ異的プローブ（ｐＰＧ
４．ＯＮＲＲＬ＃ １５８６８ ＮＲＲＬ １５８
６８は米国農務省北部リサーチラボラトリーズに寄託さ
れた）あるいはＨＩＳ４特異的グローブ（ｐＹＭ４）と
ハゴプリダイズさせた。ｐＹＭ４は実施例Ｉに述べられ
ている。挿入部位は、野生型株と与えられた形質転換体
のハイブリダイゼーションパターンを比較することによ
り決定させた。野生型株のバンドの大きさのいかなる変
化もその位置への挿入の証拠となる。ＡＯＸｉ遺伝子座
の５′末端への挿入が行なわれ、さらに野生型二遺伝子
およびＨＩＳ４変異な含む形質転換体をＰＰＦ１／ｐＨ
８６と名付けた。
この株は上述のようにＢｇｌ ［消化ｐＴＢＯ５Ａ（実
施例Ｕより）での形質転換に用いられた。ヒスチジン非
要求性を示す形質転換体を最少培地上で再生させ、ＡＯ
Ｘ１遺伝子座への挿入を示唆する“メタノール・スロー
” （Ｍｕｔ−）形質で選択した５表現型のスクリーニ
ングは以下のように行なった。
施例Ｕより）での形質転換に用いられた。ヒスチジン非
要求性を示す形質転換体を最少培地上で再生させ、ＡＯ
Ｘ１遺伝子座への挿入を示唆する“メタノール・スロー
” （Ｍｕｔ−）形質で選択した５表現型のスクリーニ
ングは以下のように行なった。
形質転換体はプレートの表面から掻き取り、滅菌水存在
下で低出力で１５秒間ソニケーションをかけた。次に、
Ａａｅｗ＝０．１まで連続的に希釈し、グリセロール
を炭素源として含む最少培地に２枚ずつ１０−３および
１０−４希釈でブレーティングし。
下で低出力で１５秒間ソニケーションをかけた。次に、
Ａａｅｗ＝０．１まで連続的に希釈し、グリセロール
を炭素源として含む最少培地に２枚ずつ１０−３および
１０−４希釈でブレーティングし。
６０℃で２〜３日インキュベートした。つぎに、気゛層
中に１００μＬのメタノールを加えた最少培地上にこれ
らのレプリカブレーティングを行なった。６０℃で２４
時間のインキュページ目ン後、１０〜２０％の形質転換
体はメタノール上では他の形質転換体よりも遅く増殖す
ることが見いだされた。これらの増殖の遅いコロニーを
１０個選択してさらに解析を行なった。これらはグリセ
ロールを含む最少培地から捨い、実施例■に示すように
振と５フラスコで培養し、実施例ＸＩに示すような２２
ｎｍ様粒子活性を調べるアヴセイを行なった。形質転
換体は、上述のようにｐＨ８６に関して解析した。得ら
れた株の一つをＰ ＰＦ １ ／ｐＴＢＯ１２−１と名
づけ、これはｐ２４とｐ３１の双方を１コピ一発現した
。
中に１００μＬのメタノールを加えた最少培地上にこれ
らのレプリカブレーティングを行なった。６０℃で２４
時間のインキュページ目ン後、１０〜２０％の形質転換
体はメタノール上では他の形質転換体よりも遅く増殖す
ることが見いだされた。これらの増殖の遅いコロニーを
１０個選択してさらに解析を行なった。これらはグリセ
ロールを含む最少培地から捨い、実施例■に示すように
振と５フラスコで培養し、実施例ＸＩに示すような２２
ｎｍ様粒子活性を調べるアヴセイを行なった。形質転
換体は、上述のようにｐＨ８６に関して解析した。得ら
れた株の一つをＰ ＰＦ １ ／ｐＴＢＯ１２−１と名
づけ、これはｐ２４とｐ３１の双方を１コピ一発現した
。
ｐｒｅＳ２発現カセ発現カセットー挿入された別の株も
同定された。これはＰＰＦＩ／ｐＴＢＯ１２−２と名づ
け、ｐｒｅＳ２遺伝子を２コピーとＳ遺伝子を１コピ一
発現した。
同定された。これはＰＰＦＩ／ｐＴＢＯ１２−２と名づ
け、ｐｒｅＳ２遺伝子を２コピーとＳ遺伝子を１コピ一
発現した。
粒子発現レベルは表３に示す。
表３
〜１５０−２００
〜１５０−２００
さらに１部分的に精製したタンプくり質のＳＤＳ／ＰＡ
ＧＥ分析および銀染色から、ｐ２４とｐ３１ の双方
の存在が示唆された。
ＧＥ分析および銀染色から、ｐ２４とｐ３１ の双方
の存在が示唆された。
（実施例■）
振とうフラスコ発現実験
発酵に先立ち１発現レベルを確実にするために全ての株
を以下のように振と５フラスコ内で培養した。通常、形
質転換体は、２〜５％グリセロールを含む０．６７％酵
母窒息ペースに植え、３０”Ｃで一晩対数増殖後期まで
培養した。細胞を、デーモンＩＥＣＤＰＲ６００臨床用
遠心機を用い℃３０００ｒｐｍで５分間遠心して集菌し
た。ペレットを滅菌水で２回洗浄し、０．５Ａ６よ、ユ
ニット／ａｔの濃度で１％メタノールを含むリン酸緩衝
化０．６７％ＹＮＢにＭえて、６０℃で穏やかに振とう
しながら４〜６日間培養した。複数回、５０Ａ６゜卆ニ
ットのアリコートを取り、−２０℃で保存した。
を以下のように振と５フラスコ内で培養した。通常、形
質転換体は、２〜５％グリセロールを含む０．６７％酵
母窒息ペースに植え、３０”Ｃで一晩対数増殖後期まで
培養した。細胞を、デーモンＩＥＣＤＰＲ６００臨床用
遠心機を用い℃３０００ｒｐｍで５分間遠心して集菌し
た。ペレットを滅菌水で２回洗浄し、０．５Ａ６よ、ユ
ニット／ａｔの濃度で１％メタノールを含むリン酸緩衝
化０．６７％ＹＮＢにＭえて、６０℃で穏やかに振とう
しながら４〜６日間培養した。複数回、５０Ａ６゜卆ニ
ットのアリコートを取り、−２０℃で保存した。
タンパク質をこれらのアリコートから調製し。
ＡＵＳＲＩＡ（実施例ＸＩ参照）およびウェスタンプロ
フト解析（トービｙ （Ｔｏｗｂ ｉ ｎ ）他、ＰＮ
ＡＳ７６．４３５０．（１９７９））に使用した。抗体
％；、カルビオケム社のロット＃７０２１０６を、ｉ：
ｉｏｏ。
フト解析（トービｙ （Ｔｏｗｂ ｉ ｎ ）他、ＰＮ
ＡＳ７６．４３５０．（１９７９））に使用した。抗体
％；、カルビオケム社のロット＃７０２１０６を、ｉ：
ｉｏｏ。
希釈で使用した。細胞のアリコー）−（１００Ａ６．０
ユニツト）Ｙｌ ３Ｘ１００ｍポロシリケイト培養チュ
ーブに写し、２０倍量の溶解緩衝液（０，５ＭＮａＣ１
，Ｑ、ｉ％ トリトｙｘ−１００（ｗ／ｖ）、Ｉ Ｍフ
グ化フェニルメチルスフオニル、およびｉＱｍＭリン醗
ナトジナトリウム７．５）中で、ソルバールモデｖＲｃ
−５Ｂで４℃、１２．００Ｏｒｐｍで遠心シテ２回洗浄
した。細胞試料を０．５ｇの酸で洗浄したグラスビーズ
（０，５ａｌｌ）およびＱ、３５ａｇの溶解緩衝液で再
懸濁して、ポルテックスを用いて最大速度で１分間隔で
８回撹拌した。撹拌の間には少なくとも１分間混合液を
氷上で冷やした。溶解が完全に終わった後、破砕した細
胞溶液な除き、グラスビーズな０．３５ ｍｌの溶解緩
衝液で洗った。二つの溶液を併せてツルバールＲｅ−５
Ｂで４℃。
ユニツト）Ｙｌ ３Ｘ１００ｍポロシリケイト培養チュ
ーブに写し、２０倍量の溶解緩衝液（０，５ＭＮａＣ１
，Ｑ、ｉ％ トリトｙｘ−１００（ｗ／ｖ）、Ｉ Ｍフ
グ化フェニルメチルスフオニル、およびｉＱｍＭリン醗
ナトジナトリウム７．５）中で、ソルバールモデｖＲｃ
−５Ｂで４℃、１２．００Ｏｒｐｍで遠心シテ２回洗浄
した。細胞試料を０．５ｇの酸で洗浄したグラスビーズ
（０，５ａｌｌ）およびＱ、３５ａｇの溶解緩衝液で再
懸濁して、ポルテックスを用いて最大速度で１分間隔で
８回撹拌した。撹拌の間には少なくとも１分間混合液を
氷上で冷やした。溶解が完全に終わった後、破砕した細
胞溶液な除き、グラスビーズな０．３５ ｍｌの溶解緩
衝液で洗った。二つの溶液を併せてツルバールＲｅ−５
Ｂで４℃。
１３．００ Ｏｒｐｍで遠心して細胞残渣を除去した。
蛋白試料を次にＡＵＳＲＩＡおよびウェスタンプロット
解析でアッセイした。蛋白濃度はＴＣＡ沈澱沈澱−ロー
リで決定した。
解析でアッセイした。蛋白濃度はＴＣＡ沈澱沈澱−ロー
リで決定した。
（実施例Ｘ）
発酵発現解析
発酵は以下のように行なった。フエルンバツノ１フラス
コ・中の５００ｍ／の酵母窒素ベース（ＶＮＢ）＋２％
グリセロールに種培養液あるいは最少グルコースプレー
ト培地からの細胞を植えた。（プレートハ検出される株
の低下なしに数カ月維持できる。） ２００ ｒｐｍで
６０℃で１口振とうした後。
コ・中の５００ｍ／の酵母窒素ベース（ＶＮＢ）＋２％
グリセロールに種培養液あるいは最少グルコースプレー
ト培地からの細胞を植えた。（プレートハ検出される株
の低下なしに数カ月維持できる。） ２００ ｒｐｍで
６０℃で１口振とうした後。
４８０ｇ グリセロール、４０ＩＩｇビオチン、および
４０ｄ）レース塩溶液（表５）を含む１５リツトルの最
少培地（表４）に植えた。ファーメンタ−はグリセロー
ルが使いきられるまで（約２４時間）パッチモードで培
養液な培養する間、６０℃ｐＨ５，５９＜維持させた。
４０ｄ）レース塩溶液（表５）を含む１５リツトルの最
少培地（表４）に植えた。ファーメンタ−はグリセロー
ルが使いきられるまで（約２４時間）パッチモードで培
養液な培養する間、６０℃ｐＨ５，５９＜維持させた。
ｐＨはＮＨ３ガスを加えることによって調節した。グリ
セロールの涸渇はＣＯ２発生の急激な減少および溶解し
た酸素の急激な上昇（あるいは酸素取り込み速度の減少
）によって観察された。メタノール添加は１８ｍ１／ｈ
ｒからはじめてファーメンタ−のレベルを一〇、５％Ｍ
ｅＯＨまでにし、このレベルに維持させた。 流加速度
は実際のメタノール消費速度に基づいて合わせた。トレ
ース塩の２０ｍ／アリコートを約２日おきにメタノール
消費速度を維持するために加えた。ＨＢｓＡｇのレベル
はメタノールを与えて約７〜８日間増加した。
セロールの涸渇はＣＯ２発生の急激な減少および溶解し
た酸素の急激な上昇（あるいは酸素取り込み速度の減少
）によって観察された。メタノール添加は１８ｍ１／ｈ
ｒからはじめてファーメンタ−のレベルを一〇、５％Ｍ
ｅＯＨまでにし、このレベルに維持させた。 流加速度
は実際のメタノール消費速度に基づいて合わせた。トレ
ース塩の２０ｍ／アリコートを約２日おきにメタノール
消費速度を維持するために加えた。ＨＢｓＡｇのレベル
はメタノールを与えて約７〜８日間増加した。
表４ 培地組成（７，５リツトル）
（実施例ＸＩ）
４８０ｇ グリセロール
４０〜 ビオチン
１３４ｍ１ ８３ＰＯ４（８５％）５．８？
ＣａＳＯ４−２Ｈ２０９２） Ｈ２Ｓ
Ｏ４ ７５Ｐ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０２１？
ＫＯＨ 表５ １Ｍ１ トレース塩溶液 硫酸第二銅・５ＨＯＯ，０６ ヨウ化カリウム ０．０８ 硫酸マンガン・８２０ ０．３０ モリブデン識ナトリウム ０．２０ ホウ酸 ０．０２ 硫酸亜鉛・８２０ ２．００ 塩化第二鉄・ＨＯ４，８ 硫゛酸 ５．００ｍｊ／リッ
トルアポ、）ＡＵＳＲＩＡア、セイキットなピキア産生
系で合成されたＨＢｓＡｇ量の測定に用いた。キットに
含まれている抗体はＨＢｓＡｇ粒子に結合し、ＨＢｓＡ
ｇモノマーには結合しない。すべて希釈はリン酸緩衝化
生理食塩水、ｐＨ７，４中、１．０％ＢＳＡ、０．０２
％Ｎａアジドで行なった。 以下で行なった方法は実質
的にキットの指示に示されたものである。標準曲線は以
下のように作成した。
ＣａＳＯ４−２Ｈ２０９２） Ｈ２Ｓ
Ｏ４ ７５Ｐ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０２１？
ＫＯＨ 表５ １Ｍ１ トレース塩溶液 硫酸第二銅・５ＨＯＯ，０６ ヨウ化カリウム ０．０８ 硫酸マンガン・８２０ ０．３０ モリブデン識ナトリウム ０．２０ ホウ酸 ０．０２ 硫酸亜鉛・８２０ ２．００ 塩化第二鉄・ＨＯ４，８ 硫゛酸 ５．００ｍｊ／リッ
トルアポ、）ＡＵＳＲＩＡア、セイキットなピキア産生
系で合成されたＨＢｓＡｇ量の測定に用いた。キットに
含まれている抗体はＨＢｓＡｇ粒子に結合し、ＨＢｓＡ
ｇモノマーには結合しない。すべて希釈はリン酸緩衝化
生理食塩水、ｐＨ７，４中、１．０％ＢＳＡ、０．０２
％Ｎａアジドで行なった。 以下で行なった方法は実質
的にキットの指示に示されたものである。標準曲線は以
下のように作成した。
ｉ４ Ｎｏｎｅ
５−６ ０．１
７−８ ０．２
９−１０ ０．５
１１−１２ １．０
１３−１４ ２．０
１５−１６ ３．。
１７−１８ ４．０
ＮＳＢ ｎｏｎｅ
ｎｏｎｅ
２００緩衝液のみ
微量タイターデイツシュのウェルは次のようにラベルし
た。
た。
ＡＡ ＢＢ ＧＯＤＤ
５ １７ １８ １９ ２０以下同様
各ウエルにまずビーズを、次に緩衝液加え、最後に標準
（ポジティブコントロール）あるいは希釈した試料を加
えた。未知のものはシグナルが標準曲線の範囲内になる
ように希釈した。試料濃度の１１９ ／ ｙｘｌの見積
は、典型的には用いた希釈を得るためには０．０２で割
った。通常１００μ乙の試料を１００μｔの緩衝液が入
っているウェルに加えた。
各ウエルにまずビーズを、次に緩衝液加え、最後に標準
（ポジティブコントロール）あるいは希釈した試料を加
えた。未知のものはシグナルが標準曲線の範囲内になる
ように希釈した。試料濃度の１１９ ／ ｙｘｌの見積
は、典型的には用いた希釈を得るためには０．０２で割
った。通常１００μ乙の試料を１００μｔの緩衝液が入
っているウェルに加えた。
ウェルは蓋をしてトレイをベンチトップに対し℃軽くた
たいた。試料を一晩室温でインキ島ベートして最大の結
合効率を得た。翌朝各ウェルをアボット・ラプスのペン
タウォッシュシステムｌｆ１いて脱イオン水で４回洗浄
した。２００μｔの１２５Ｉ抗−ＨＢｓを各ウェルに加
え、トレイを軽くたたき、４５℃のウォーターバスで１
時間インキュベートした。ビーズを上述のように洗浄し
て、カウントした。未知試料の濃度は標準曲線から決定
した。
たいた。試料を一晩室温でインキ島ベートして最大の結
合効率を得た。翌朝各ウェルをアボット・ラプスのペン
タウォッシュシステムｌｆ１いて脱イオン水で４回洗浄
した。２００μｔの１２５Ｉ抗−ＨＢｓを各ウェルに加
え、トレイを軽くたたき、４５℃のウォーターバスで１
時間インキュベートした。ビーズを上述のように洗浄し
て、カウントした。未知試料の濃度は標準曲線から決定
した。
第１図は、１位にＥｃｏＲ１部位がないｐＢ Ｒ３２２
由来プラスミドであるｐＡＯ８０１の模式図である。 第２図は、 ｐＡＯ８０１由来の１ラスミドｐＡＱ８０
２の模式図である。 第６図は、ｐＡＯ８０２由来プラスミドであるｐＡＯ８
０３の模式図である。 第４図は、プラスミドｐＡ０８０３由来のｐＡＯ８１１
の模式図である。 第５Ａ図は、プラスミドｐＡＯ８０１および１０８０２
の構造の模式図である。 第５Ｂ図は、プラスミドｐＡＯ８０３およびｐＡＯ８１
１の構造の模式図である。 第６図は、ＨＢＶ血清型ａｄｗのｐｒｅＳ２遺伝子を含
むＨＢＶの模式図である。 第７図は、ＢａｍＨ１部位に挿入されたピキア・パスト
リスＨＩＳ４遺伝子を含むｐＢＲ３２２由来プラスミド
であるｐＹＭ４の模式図である。 第８図は、プラスミドｐＹＭＩＱの模式図である。 第９図は時計回りにＢｇｌ［１からＢｇｌｌまでの断片
に直鎖状部位特異的組込みベクターを含むプラスミドｐ
ＡＯ８０４の模式図である。 ＦＩＧ。 コＯｏＯ ご互の？’Ｉ３Ｃ内言に変更なしン Ｆｌに。 ＦＩＧ。 Ｉ Ｘ巴８ 工 ＦＩＧ。 ＦＩＧ。 ［３７］５１
由来プラスミドであるｐＡＯ８０１の模式図である。 第２図は、 ｐＡＯ８０１由来の１ラスミドｐＡＱ８０
２の模式図である。 第６図は、ｐＡＯ８０２由来プラスミドであるｐＡＯ８
０３の模式図である。 第４図は、プラスミドｐＡ０８０３由来のｐＡＯ８１１
の模式図である。 第５Ａ図は、プラスミドｐＡＯ８０１および１０８０２
の構造の模式図である。 第５Ｂ図は、プラスミドｐＡＯ８０３およびｐＡＯ８１
１の構造の模式図である。 第６図は、ＨＢＶ血清型ａｄｗのｐｒｅＳ２遺伝子を含
むＨＢＶの模式図である。 第７図は、ＢａｍＨ１部位に挿入されたピキア・パスト
リスＨＩＳ４遺伝子を含むｐＢＲ３２２由来プラスミド
であるｐＹＭ４の模式図である。 第８図は、プラスミドｐＹＭＩＱの模式図である。 第９図は時計回りにＢｇｌ［１からＢｇｌｌまでの断片
に直鎖状部位特異的組込みベクターを含むプラスミドｐ
ＡＯ８０４の模式図である。 ＦＩＧ。 コＯｏＯ ご互の？’Ｉ３Ｃ内言に変更なしン Ｆｌに。 ＦＩＧ。 Ｉ Ｘ巴８ 工 ＦＩＧ。 ＦＩＧ。 ［３７］５１
Claims (22)
- （１）ａ）使用可能な様式で制御領域および３′終止配
列と連結したＳの構造遺伝子を含む少なくとも一つの発
現カセット；および 使用可能な様式で制御領域および３′終止配列と連結し
たｐｒｅＳ＿２の構造遺伝子を含む少なくとも一つの発
現カセットでメチロトロフィック酵母を形質転換するこ
と；および、その後に ｂ）得られた形質転換体酵母株を該ＨＢＶウィルス粒子
が産生される適当な条件下で培養すること からなる実質的にＳおよびｐｒｅＳ＿２タンパク質から
なる抗原性ＨＢＶ粒子の生産方法。 - （２）該形質転換がプラスミドあるいは直鎖状部位特異
的組込みベクターからなる群から選択される少なくとも
一つのベクターで行なわれるものである、特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - （３）該ベクターが組込みされるものである、特許請求
の範囲第２項記載の方法。 - （４）ａ）ｉ）第一の挿入可能ＤＮＡ断片、 ｉｉ）使用可能な様式で制御領域および３′終止配列と
連結したｐｒｅＳ＿２の構造遺伝子を含む少なくとも一
つの発現カセット、および、マーカー遺伝子、および、 ｉｉｉ）第二の挿入可能ＤＮＡ断片、 の一連の配置を含み、要素（ｉｉ）のマーカー遺伝子と
カセットの順番が交換可能である第一の直鎖状部位特異
的組込みベクター；並びに ｂ）ｉ）少なくとも一つの挿入可能ＤＮＡ断片、および ｉｉ）使用可能な様式で制御領域および３′終止配列と
連結したＳの構造遺伝子を含む少なくとも一つの発現カ
セット、およびマーカー遺伝子、 を含み、要素（ｉｉ）のマーカー遺伝子とカセットの順
番が交換可能である第二の組込みベクター、が用いられ
る特許請求の範囲第３項記載の方法。 - （５）該挿入可能ＤＮＡ断片がピキア・パストリス（￥
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）から分離された遺
伝子のＤＮＡ配列由来であり、￥ＡＯＸ１￥、ｐ４０、
￥ＤＨＡＳ￥および￥ＨＩＳ４￥からなる群から選択さ
れるものである特許請求の範囲第４項記載の方法。 - （６）少なくとも一つの発現カセットが ａ）ピキア・パストリスから分離された￥ＡＯＸ１￥、
ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥、サッカロミセス・セレビジエ（
￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
￥）から分離された酸ホスファターゼ、ガラクトキナー
ゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チトクロームｃ、α
接合因子、およびグリセルアルデヒド３′−リン酸デヒ
ドロゲナーゼからなる群から選択され、使用可能な様式
で下記ｂ）に連結している制御領域、 ｂ）使用可能な様式で下記ｃ）に連結しているｐｒｅＳ
＿２の構造遺伝子、および ｃ）￥ＡＯＸ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥
遺伝子、および￥ＨＩＳ４￥遺伝子から分離された３′
終止配列からなる群から選択されるピキア・パストリス
由来の３′終止配列 からなる、特許請求の範囲第４項あるいは第５項記載の
方法。 - （７）少なくとも一つの発現カセットが ａ）ピキア・パストリスから分離された￥ＡＯＸ１￥、
ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥、サッカロミセス・セレビジエ（
￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
￥）から分離された酸ホスファターゼ、ガラクトキナー
ゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チトクロームｃ、α
接合因子、およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒド
ロゲナーゼからなる群から選択され、使用可能な様式で
下記ｂ）に連結している制御領域、 ｂ）使用可能な様式で下記ｃ）に連結しているＳの構造
遺伝子、および ｃ）￥ＡＯＸ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥
遺伝子、および￥ＨＩＳ４￥遺伝子から分離された３′
終止配列からなる群から選択されるピキア・パストリス
由来の３′終止配列 からなる、特許請求の範囲第４項、第５項あるいは第６
項記載の方法。 - （８）該マーカー遺伝子がピキア・パストリスから分離
された￥ＨＩＳ４￥および￥ＡＲＣ４￥、サッカロミセ
ス・セレビジエから分離された￥ＳＵＣ２￥、および￥
Ｔｎ９０３￥および￥Ｔｎ６０１￥のネオマイシン遺伝
子からなる群から選択される、特許請求の範囲第４項〜
第７項記載の方法。 - （９）該マーカー遺伝子が独立に選択される特許請求の
範囲第８項記載の方法。 - （１０）該ｐｒｅＳ＿２構造遺伝子を含むベクターが ａ）ピキア・パストリスから分離された約１キロベース
の￥ＡＯＸ１￥５′制御領域であり、使用可能な様式で
下記ｂ）に連結している第一の挿入可能ＤＮＡ断片、 ｂ）使用可能な様式で下記ｃ）に連結しているｐｒｅＳ
＿２の構造遺伝子、 ｃ）下記ｄ）に連結している、ピキア・パストリスから
分離された￥ＡＯＸ１￥の３′、終止配列、 ｄ）下記ｅ）に連結している、ピキア・パストリスから
分離された￥ＨＩＳ４￥であるマーカー遺伝子、および ｅ）約０．６５キロベースの３′￥ＡＯＸ１￥終止配列
である第二の挿入可能ＤＮＡ断片からなる、特許請求の
範囲第４項〜第９項のいずれか１項記載の方法。 - （１１）該Ｓ構造遺伝子を含むベクターが ａ）ピキア・パストリスから分離された約１キロベース
の￥ＡＯＸ１￥５′制御領域であり、使用可能な様式で
下記ｂ）に連結している挿入可能ＤＮＡ断片、 ｂ）使用可能な様式で下記ｃ）に連結しているＳの構造
遺伝子、 ｃ）下記ｄ）に連結している、ピキア・パストリスから
分離された￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、 ｄ）下記ｅ）に連結している、サッカロミセス・セレビ
ジエから分離されたＡＲＧ４であるマーカー遺伝子、お
よび ｅ）約０．６５キロベースの３′ＡＯＸ１終止配列であ
る挿入可能ＤＮＡ断片からなる、特許請求の範囲第４項
〜第１０項のいずれか１項記載の方法。 - （１２）ａ）ピキア・パストリスから分離された約１キ
ロベースの長さの￥ＡＯＸ１￥５′の機能し得る制御領
域であり、使用可能な様式で下記ｂ）に連結している少
なくとも一つの挿入可能ＤＮＡ断片、 ｂ）使用可能な様式で下記ｃ）に連結しているＳの構造
遺伝子、 ｃ）下記ｄ）に連結している、ピキア・パストリスから
分離された￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、ｄ）下記ｅ）
に連結している、ピキア・パストリスから分離された￥
ＡＲＧ￥４であるマーカー遺伝子、および ｅ）約０．６５キロベースの３′￥ＡＯＸ１￥終止配列
である第二の挿入可能ＤＮＡ断片からなる組込みベクタ
ー。 - （１３）使用可能な様式で３′終止配列に連結したｐｒ
ｅＳ＿２の構造遺伝子に使用可能な様式で連結している
制御領域からなる少なくとも一つの発現カセットおよび
使用可能な様式で３′終止配列に連結したＳの構造遺伝
子に使用可能な様式で連結している制御領域からなる少
なくとも一つの発現カセットで形質転換したメチロトロ
フィック酵母。 - （１４）該酵母がピキア・パストリスである特許請求の
範囲第１３項記載のメチロトロフィツク酵母。 - （１５）該酵母がピキア・パストリスＰＰＦ１株である
特許請求の範囲第１４項記載のメチロトロフィック酵母
。 - （１６）（ａ）ｉ）第一の挿入可能ＤＮＡ断片、 ｉｉ）使用可能な様式で下記ｉｉｉ）と連結している、
マーカー遺伝子およびｐｒｅＳ＿２の構造遺伝子を含む
少なくとも一つのピキア適合性発現カセット、 ｉｉｉ）ピキア・パストリスから分離された￥ＡＯＸ１
￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝子、および
￥ＨＩＳ４￥遺伝子由来の３′終止配列からなる群から
選択された３′終止配列、および ｉｖ）第二の挿入可能ＤＮＡ断片の一連の配置で構成さ
れ、要素ｉｉ）のマーカー遺伝子およびカセットの順番
が交換可能な少なくとも一つの直鎖状部位特異的組込み
ベクター；並びに（ｂ）ｉ）少なくとも一つの挿入可能
ＤＮＡ断片、 ｉｉ）使用可能な様式で下記ｉｉｉ）と連結している、
マーカー遺伝子およびＳの構造遺伝子を含む少なくとも
一つのピキア適合性発現カセット、および ｉｉｉ）ピキア・パストリスから分離された￥ＡＯＸ１
￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝子、および
￥ＨＩＳ４￥遺伝子由来の３′終止配列からなる群から
選択された３′終止配列、 を含み、要素ｉｉ）のマーカー遺伝子およびカセットの
順番が交換可能な少なくとも一つの直鎖状部位特異的組
込みベクターで形質転換されている特許請求の範囲第１
５項記載のピキア・パストリスＰＰＦ１株。 - （１７）ベクターが ａ）下記ｂ）に使用可能な様式で連結している、ピキア
・パストリスから分離された約１キロベースの￥ＡＯＸ
１￥５′制御領域である第一の挿入可能ＤＮＡ断片、 ｂ）下記ｃ）に使用可能な様式で連結しているｐｒｅＳ
＿２の構造遺伝子、 ｃ）下記ｄ）に連結しているピキア・パストリスから分
離された￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、ｄ）下記ｅ）に
連結しているピキア・パストリスから分離された￥ＨＩ
Ｓ４￥であるマーカー遺伝子、および ｅ）約０．６５キロベースの￥ＡＯＸ１￥３′終止配列
である第二の挿入可能ＤＮＡ断片を含むものである、特
許請求の範囲第１６項記載のｐｒｅＳ＿２構造遺伝子を
含んでいる直鎖状部位特異的組込みベクター。 - （１８）ベクターが ａ）下記ｂ）に使用可能な様式で連結している、ピキア
・パストリスから分離された約１キロベースの￥ＡＯＸ
１￥５′制御領域である第一の挿入可能ＤＮＡ断片、 ｂ）下記ｃ）に使用可能な様式で連結しているＳの構造
遺伝子、 ｃ）下記ｄ）に連結しているピキア・パストリスから分
離された￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、 ｄ）下記ｅ）に連結しているサッカロミセス・セレビジ
エから分離された￥ＡＲＧ４￥であるマーカー遺伝子、
および ｅ）約０．６５キロベースの￥ＡＯＸ１￥３′終止配列
である第二の挿入可能ＤＮＡ断片を含むものである特許
請求の範囲第１６項記載のＳ構造遺伝子を含んでいる直
鎖状部位特異的組込みベクター。 - （１９）ピキア・パストリスＰＰＦ１／ｐＴＢＯ１２−
１。 - （２０）該ＰＰＦ１株が１コピー以上の該直鎖状部位特
異的組込みベクターで形質転換されている特許請求の範
囲第１６項記載の形質転換されたピキア・パストリスＧ
Ｓ１１５株。 - （２１）ピキア・パストリスＰＰＦ１／ｐＴＢＯ１２−
２。 - （２２）特許請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１
項記載の方法によって産生された抗原性ＨＢＶ粒子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US19371488A | 1988-05-13 | 1988-05-13 | |
| US193714 | 1988-05-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0227990A true JPH0227990A (ja) | 1990-01-30 |
| JP2614314B2 JP2614314B2 (ja) | 1997-05-28 |
Family
ID=22714736
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1121313A Expired - Fee Related JP2614314B2 (ja) | 1988-05-13 | 1989-05-15 | メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ＳおよびｐｒｅＳ▲下２▼タンパク質の発現 |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5670630A (ja) |
| EP (1) | EP0341746B1 (ja) |
| JP (1) | JP2614314B2 (ja) |
| KR (1) | KR100193701B1 (ja) |
| CN (1) | CN1038668A (ja) |
| AT (1) | ATE151109T1 (ja) |
| AU (1) | AU618596B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340617C (ja) |
| DD (1) | DD285373A5 (ja) |
| DE (1) | DE68927921T2 (ja) |
| DK (1) | DK235289A (ja) |
| ES (1) | ES2101676T3 (ja) |
| FI (2) | FI104639B (ja) |
| GR (1) | GR3023985T3 (ja) |
| HU (1) | HU207532B (ja) |
| IE (1) | IE81158B1 (ja) |
| IL (1) | IL90161A0 (ja) |
| IN (1) | IN171696B (ja) |
| MX (1) | MX26715A (ja) |
| NO (1) | NO300465B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ228948A (ja) |
| PL (1) | PL161997B1 (ja) |
| PT (1) | PT90553A (ja) |
| YU (1) | YU98689A (ja) |
| ZA (1) | ZA893440B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06205681A (ja) * | 1992-08-07 | 1994-07-26 | Phillips Petroleum Co | メチロトローフ酵母におけるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）昆虫毒の産生 |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5032516A (en) * | 1985-10-25 | 1991-07-16 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
| PL168787B1 (pl) * | 1989-08-03 | 1996-04-30 | Smithkline Beecham Biolog | Sposób wytwarzania czastki kompozytowej PL |
| GB9007416D0 (en) * | 1990-04-02 | 1990-05-30 | Wellcome Found | Expression of heterologous protein in yeast |
| US6197548B1 (en) | 1990-04-02 | 2001-03-06 | Medeva Pharma Limited | Transformed Pichia expressing the pertactin antigen |
| EP0521348A1 (en) * | 1991-06-18 | 1993-01-07 | Korea Institute Of Science And Technology | Chimeric antibody with specificity for hepatitis B virus pre-S2 surface antigen and cell line producing same |
| LT3988B (en) | 1992-02-17 | 1996-06-25 | Fermentas Biotech Inst | Recombinant plasmides pfs19, pfps2-48 and pjlfds1 codingsynthesis of human hepatite b of surfice virus antigenes, methods fof producing thereof |
| GB9402832D0 (en) * | 1994-02-15 | 1994-04-06 | Smith Kline Beecham Biolog S A | Novel process |
| US5716808A (en) * | 1995-11-09 | 1998-02-10 | Zymogenetics, Inc. | Genetic engineering of pichia methanolica |
| US5955349A (en) * | 1996-08-26 | 1999-09-21 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica |
| AU1158297A (en) * | 1995-11-09 | 1997-05-29 | Zymogenetics Inc. | Production of gad65 in methylotrophic yeast |
| MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
| AU2005287383B2 (en) * | 2004-05-25 | 2011-09-22 | Chimeros, Inc. | Self-assembling nanoparticle drug delivery system |
| CN1704475A (zh) * | 2004-05-31 | 2005-12-07 | 成都生物制品研究所 | 羧端含前s2免疫决定簇的乙肝表面抗原融合基因及蛋白质 |
| JP2008507266A (ja) * | 2004-07-22 | 2008-03-13 | グライコフィ， インコーポレイテッド | ピチアにおける異種遺伝子発現のためのリンゴ酸シンターゼ調節配列 |
| CN100381171C (zh) * | 2004-12-30 | 2008-04-16 | 成都生物制品研究所 | 含前s1、前s2和s抗原决定簇的乙肝表面抗原复合颗粒 |
| JP2009533350A (ja) * | 2006-04-07 | 2009-09-17 | キメロス， インコーポレイテッド | Ｂ細胞悪性疾患を処置するための組成物および方法 |
| US20090226525A1 (en) * | 2007-04-09 | 2009-09-10 | Chimeros Inc. | Self-assembling nanoparticle drug delivery system |
| WO2010120874A2 (en) | 2009-04-14 | 2010-10-21 | Chimeros, Inc. | Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same |
| JP2014527072A (ja) | 2011-09-09 | 2014-10-09 | バイオメド リアルティー， エル．ピー． | ウイルスタンパク質の集合を制御するための方法および組成物 |
| JP6517143B2 (ja) | 2012-10-23 | 2019-05-22 | ツールゲン インコーポレイテッド | 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5877823A (ja) * | 1981-08-04 | 1983-05-11 | ザ リージエンツ オブ ザ ユニヴアーシテイ オブ カリフオルニア | 酵母ｂ型肝炎表面抗原粒子及びワクチン |
| JPS6143991A (ja) * | 1984-07-11 | 1986-03-03 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原およびその製造法 |
| JPS62190085A (ja) * | 1985-11-26 | 1987-08-20 | リサーチ コーポレイション テクノロジィズ，インコーポレイテッド | Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原の酵母による製造法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| JPS62236496A (ja) * | 1986-04-07 | 1987-10-16 | Green Cross Corp:The | ＨＢｓＡｇの製造方法 |
| US4963483A (en) * | 1987-10-13 | 1990-10-16 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| NZ228774A (en) * | 1988-04-25 | 1991-05-28 | Phillips Petroleum Co | Hbv particles containing pres 2 proteins and recombinant processes for their production in yeast cells |
-
1989
- 1989-05-02 IL IL90161A patent/IL90161A0/xx unknown
- 1989-05-02 NZ NZ228948A patent/NZ228948A/en unknown
- 1989-05-09 ZA ZA893440A patent/ZA893440B/xx unknown
- 1989-05-11 KR KR1019890006430A patent/KR100193701B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-05-11 NO NO891921A patent/NO300465B1/no not_active IP Right Cessation
- 1989-05-11 HU HU892372A patent/HU207532B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-05-12 MX MX2671589A patent/MX26715A/es unknown
- 1989-05-12 DE DE68927921T patent/DE68927921T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-12 EP EP89108632A patent/EP0341746B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-12 PT PT90553A patent/PT90553A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-05-12 IE IE156389A patent/IE81158B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-05-12 YU YU98689A patent/YU98689A/sh unknown
- 1989-05-12 FI FI892312A patent/FI104639B/fi active IP Right Grant
- 1989-05-12 AU AU34734/89A patent/AU618596B2/en not_active Expired
- 1989-05-12 ES ES89108632T patent/ES2101676T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-12 AT AT89108632T patent/ATE151109T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-12 PL PL89279426A patent/PL161997B1/pl unknown
- 1989-05-12 DK DK235289A patent/DK235289A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-05-12 DD DD89328581A patent/DD285373A5/de unknown
- 1989-05-13 CN CN89103330A patent/CN1038668A/zh active Pending
- 1989-05-15 CA CA000599724A patent/CA1340617C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-15 JP JP1121313A patent/JP2614314B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-22 IN IN388/CAL/89A patent/IN171696B/en unknown
-
1995
- 1995-06-06 US US08/467,345 patent/US5670630A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-06 US US08/467,660 patent/US5650296A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-07-02 GR GR970401639T patent/GR3023985T3/el unknown
-
1999
- 1999-11-29 FI FI992546A patent/FI107265B/fi not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5877823A (ja) * | 1981-08-04 | 1983-05-11 | ザ リージエンツ オブ ザ ユニヴアーシテイ オブ カリフオルニア | 酵母ｂ型肝炎表面抗原粒子及びワクチン |
| JPS6143991A (ja) * | 1984-07-11 | 1986-03-03 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原およびその製造法 |
| JPS62190085A (ja) * | 1985-11-26 | 1987-08-20 | リサーチ コーポレイション テクノロジィズ，インコーポレイテッド | Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原の酵母による製造法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06205681A (ja) * | 1992-08-07 | 1994-07-26 | Phillips Petroleum Co | メチロトローフ酵母におけるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）昆虫毒の産生 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0227990A (ja) | メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ＳおよびＰｒｅＳ↓２タンパク質の発現 | |
| EP0072318B1 (en) | Synthesis of human virus antigens by yeast | |
| US5133961A (en) | Vaccines comprising yeast-derived hepatits b virus polypeptides | |
| US4769238A (en) | Synthesis of human virus antigens by yeast | |
| EP0105149B1 (en) | Recombinant plasmid containing hepatitis b virus gene, yeast transformed with said recombinant plasmid, and production of hepatitis b virus surface antigen | |
| JP2615027B2 (ja) | 外来遺伝子の転写を制御するための方法及びハイブリッドプロモーター | |
| JPH0284176A (ja) | メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ｐｒｅＳ↓２タンパク質の発現 | |
| PL168408B1 (pl) | Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL | |
| EP0251460B1 (en) | Method for producing hepatitis b virus core antigen (hbcag) in yeast | |
| WO1994001132A1 (en) | VACCINE COMPRISING MIXED preS1+preS2+S AND CORE PARTICLE | |
| EP0340806B1 (en) | Synthesis of human virus antigens by yeast | |
| CA1273883A (en) | Recombinant dna material comprising bovine growth hormone nucleotide sequence | |
| EP0339569A2 (en) | Expression of the HIV 24 KDA GAG protein in methylotrophic yeasts | |
| EP0277770A1 (en) | Alpha-mating factor promoter is modified by deleting pre-pro secretory leader sequence | |
| IE903178L (en) | Synthesis of human virus antigens by yeast | |
| JPS61282078A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａ、形質転換動物細胞およびｂ型肝炎ウイルス蛋白質の製法 | |
| JPH0777557B2 (ja) | Ｐ３１修飾蛋白質をコードするｄｎａ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |