JPS61282078A - Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａ、形質転換動物細胞およびｂ型肝炎ウイルス蛋白質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野］ 本発明は大腸菌シラスミドＤＮＡよシ誘導されたシャト
ルベクター中にＢ型肝炎ウィルスの遺伝子を組込んだ新
規な組換えＤＮＡに関し、またかかる組換えＤＮＡによ
シ形質転換を行なったアフリカミドリザルのベロ細胞に
関し、更にそれを用いたＢ型肝炎ウィルス蛋白質の製法
に関する。さらに詳しくは、本発明は大腸菌と動物細胞
の双方で増殖し得るいわゆるシャトルベクターを用い、
これにＢ型肝炎ウィルス（以下、ＨＢＶと略す）の遺伝
子をλ偏置列に組込んだ組換えＤＮＡを得、これをベロ
細胞に導入させて形質転換ベロ細胞とし、この細胞を培
養してＨＢＶ個有のプロモーターの支配下にＨＢＶ蛋白
質を生産、収集する方法に関する。

（従来の技術とその問題点） Ｂ型ウィルス肝炎（血清肝炎）は主として血液を介して
感染する疾患で一過性感染のほかに持続性感染のあるこ
とが特徴である。持続性感染の場合には徐々に重症の肝
臓障害、初期癌から死亡へ々漸時進行する。特にアジア
およびアフリカ諸国における人口の多数は持続性感染者
であって、この病気を広い範囲に伝染させるという危険
な潜在性を有している。Ｂ型肝炎感染からの完全な回復
を期待できることもあるが治療薬が無く大抵の場合、完
全治癒が困難である。そこでこの疾患には予防策を講じ
ることが重要でアシ、そのためにはＨＢＶ表面抗原（以
下、ＨＢｓ抗原またはＨＢｓＡｇ　’！たは単にＳ抗原
と略す］から成るワクチンが最も有効であると考えられ
ている。しかしながらＨＢＶはヒトとチンパンジーのみ
にしか感染せず、しかも培養細胞への感染の試みも成功
していない。

このような事情からＨＢｓＡｇの供給源としてはキ清に
よらず、組換えＤＮＡ技術を用いて細菌、特に　　　□
゛ヤリアー血清に頼るしか無く肝炎ワクチンの量産に限
界がある。この対策としてＨＢｓＡｇ　ｆヒト血大腸菌
にＨＢＶのコード遺伝子を導入し、ＨＢｓＡｇを生産し
ようとする試みはすでに提案されている。

（特開昭３７−４０９−タ１号；特開昭ｒｒ−タ０！ｒ
／７号公報ン。

近年、組換えＤＮＡ技術を用いて、真菌の一種である酵
母によってＨＢｓＡｇを生産させる手段も開発されてい
る〔例えば特開昭！ター３／７タタ号〕。

しかし、酵母細胞を用いる場合には、患者血清中に見出
されるＨＢｓＡｇと同様にグリコジル化され、天然に産
生される動物性蛋白質に一層近縁の糖質および脂質が結
合され九ＨＢｓＡｇの生産は不可能である。酵母宿主に
おいては、動物細胞と同じレベルの洗練された工程によ
る産生機能をもたないからである。さらにこのような形
質転換された酵母細胞においては培養液中にその産生物
を放出するに当って、人間に望ましくない物質の放出を
伴うことがあるので、目的のＨＢｓＡｇ蛋白質の回収お
よび精製法が著しく困難である。

また、組換えＤＮＡ技術を用いて動物細胞を形質転換さ
せ、かかる形質転換動物細胞によるＨＢｓＡｇの産生を
行なう試みが提案されている。（例えば特開昭ｊ７−３
２７ｒ≠号；特開昭ｓｒ−タタ！号；特開昭５ｒ−ｓｔ
ｔｒｚ号；特開昭ｊ１−１５Ｐ弘！２７号；特開昭ｊタ
ー３６６り２号公報）。

特に特開昭夕ざ−１６６１５号公報には、ベロ細胞の利
用可能性が示唆されてはあるけれども、現在までに帰属
性が認められておらずしかも現に他のヒト用ワクチンの
生産に実用されて来たベロ細胞を用いるＨＢＶ蛋白質の
生産の具体的な例は従来全くない。

（問題点を解決する手段） 本発明者らはこのような背景のもとに新しい形質転換動
物細胞を用いてＨＢＶ蛋白質の量産を図るべく種々研究
を重ねた結果、大腸菌と動物細胞の双方で増殖し得る大
腸菌プラスミド由来の組換えＤＮＡをシャトルベクター
として用い、このベクターにＨＢＶ遺伝子のＢＢｙＩ　
ＨＩ開裂片のλ偏置列に連結した連結片を、所望ならば
大腸菌由来ネオマイシン耐性遺伝子と共に、組込んだ新
規な組換えＤＮＡを作製することに成功し、しかもこれ
が所望の安定したＨＢＶ蛋白質産生能力を獲得した形質
転換ベロ細胞の取得に適すること、前記の新規な組換え
ＤＮＡがこの形質転換ベロ細胞中に安定に存続すること
、またかかる形質転換ベロ細胞を用いることによってヒ
ト血清由来のＨＢＶ蛋白質と同等の生物学的、並びに物
理学的、化学的性質を有するＨＢＶ蛋白質を生産し得る
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。

従って、第１の本発明の要旨とするところは、大腸菌と
動物細胞の双方で増殖し得るシャトルベクターのＢａｍ
ＨＩ開裂部位の間に、Ｂｉ［ｎＨＩ開裂部位でλ偏置列
に連結されたＢ型肝炎ウィルス遺伝子のｌａｍＨＩ開裂
片の２個を組込んでなることを特徴とする、新規な組換
えＤＮＡにある。

本発明者が得た知見として重要な点は、ＨＢＶ遺伝子の
ｌｌｈｍ　ＨＩ開裂片を２個直列に連結した連結（Ｉｎ
前記シャトルベクターのＢａｍ　ＨＩ開裂部位に挿入し
て得られた組換えＤＮＡは以下に掲げる利点を有するこ
とである。即ちＨＢＶＤＮＡは本来環状を形成しており
、各遺伝子は連結したり、重複したりして構成されてい
る。このようなりＮＡを一カ所で、例えばＢａｍＨＩ開
裂部位で切断してベクターに組込んだ際、この８Ｍ１Ｈ
工切断部位に遺伝子発現に必要な情報が存在している場
合にはこの部位に関連する遺伝子の発現が完全に行なわ
れにくくなる懸念があるはずである。しかるに、そのＢ
ｔｍＨＩ切断部位の所で最少λ個直列に連結された場合
には、すなわちＢａｍＨＩ部位で一旦切断した後に、同
じＢａｍＨＩ部位で再び２個のＢｙＩ　ＨＩ開裂片を直
列接続させてなる連結片においてはｓ　ＢｊＪｎＨＩ切
断部位は完全に又は実質的に完全に修復されているはず
であり、上記の懸念は解消され、ＨＢＶ遺伝子のどの部
位にも支障は起きないと考えられる。一方、ｌａｍＨＩ
開裂片の３個以上での連結では、組換えプラスミド自体
が不安定となり、調製も使用も難しくなると考えられる
。

更に、第１の本発明の組換えＤＮＡにおいては、ＨＢ　
Ｖ遺伝子のＢＪＪＩＩ　ＨＩ開裂片が使用されているの
で、この１１ｊＬ０１Ｈ工開裂片の内部でＨＢＶ遺伝子
のＳ抗原遺伝子の上流にプレーＳ遺伝子が存在しており
、従ってか＼る開裂片を含む第１の本発明の組換えＤＮ
Ａで形質転換された４０細胞は、　ＨＢｓＡｇのみなら
ず、ＨＢＶのＨＢａＡｇ遺伝子の上流に存在するプレー
Ｓ遺伝子をも同時に発現して、プレー８を伴なったＨＢ
　ｓＡｇも産生し得ることが特色でおる。このプレーＳ
遺伝子のコービする蛋白はＨＢＶが肝嘘を攻撃する際肝
臓表面上にあるポリアルブミンに結合するためのレセプ
ターとされている。このことから、ＷＩＪｌの本発明の
組換えＤＮＡを用いると、プレーＳワクチンぞ生産する
ことが可能でちゃ、プレー８ワクチンがあればＨＢｖ感
染の第一段階を特異的に阻止できると考えられている。

Ｈｌの本発明に係る組換えＤＮＡの好ましい具体例とし
ては、本発明者が後述の実施例１の方法で創製してｐｓ
ＶＮＨ２と命名し且つ添付図面の第１図に制限酵素切断
地図で示した組換えプラスミドがある。この組換えシラ
スミドｐ８ＶＮＨ＝は、後に詳述する方法で作製された
ものであシ、全体の大きさが／／、０キロペースペアで
あシ、大腸菌プラスミＰｐＢＲＪコλ由来の断片（２，
３キロペースペア）と、サル発癌ウィルスＳｖ≠０ＤＮ
Ａの複製開始部（３弘Ｊペースペア〕と、大腸菌由来の
プラスミドｐＫＯ７から切り出されたネオマイシン耐性
遺伝子領域を含む部分Ｎｍｒ（／、ｒ≠！キロペースペ
ア〕とｓ　！ＬｔｍＨＩ切断部位で直列に連結されたＨ
ＢＶ遺伝子（３，２キロペースペア、プレーＳ遺伝子も
含有している）の２個の連結片とを含み、添付図面の第
１図に示された制限酵素切断地図を示すものである。こ
の組換えプラスミ）１ｐＳｖＮＨユは、ベロ細胞に導入
されると、形質転換されたベロ細胞はＨＢＶ蛋白質の生
産能を積取し、しかもその形質転換ベロ細胞を／コ０代
継代培養した後も細胞中にＨＢＶ遺伝子が安定に存続し
、従ってＨＢＶ蛋白質生産能を低減せずに持続するとい
う顕著に優れた特性を示す。

この組換えシラスミドｐｓＶＮＨＪを導入された大腸菌
形質変換法ＫＭＢＪ　Ｊ　Ｏ＆は、昭和５０年弘月ＪＯ
日以来、工業技術院、微生物工業技術研究所に微工研珈
寄第１２００号（ＦＩＲＭ　Ｐ　−４２００）として寄
託されである。

更に、第λの本発明によると、大腸菌と動物細胞の双方
で増殖し得るシャトルベクターのＢａｍ　ＨＩ開裂部位
の間に、シュＨＩ開裂部位でλ側面列に連結されたＢ型
肝炎ウィルス遺伝子のＢａｍＨＩ開裂片の２個を組込ん
でなる組換えＤＮＡ１、導入されて形質転換されたこと
を特徴とする、形質転換ベロ（Ｖｅｒｏ）ｉ胞が提供さ
れる。

また、第３の発明によると、大腸菌と動物細胞の双方で
増殖し得るシャトルベクターのＢａｍＨＩ開裂部位の間
に、１１ａｍＨＩ開裂部位でλ側面列に連結されたＢ型
肝炎ウィルス遺伝子のＢａｍＨＩ開裂片の２個を組込ん
でなる組換えＤＮＡ１＆：、導入されて形質転換された
形質転換ベロ細胞を動物細胞培養培地中で培養させ、そ
あ培養物中にＢ型肝炎ウィルスの表百抗原　プレＳ付表
面抗原並びにＨＢｅ抗原蛋白質を産生させ、それを収集
することを特徴とする、Ｂ型肝炎ウィルス蛋白質の製法
を提供する。

この第３の本発明の方法によると、ＨＢＶ蛋白質として
、ＨＢｓＡｇのみならずプレＳ付表面抗原（以下ｐｒｅ
ｓ　＋　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇと略すこともある）及びＨＢ
ｅ抗原（以下、ＨＢｅ抗原はＨＢｅＡｇ又は単にｅ抗原
ということもある）も産生じ得ることが特色である。

以下に、第１の本発明の組換えＤＮＡ、第２の本発８Ａ
Ｋよる形質転換ベロ細胞、および第３−＋＋ｇ−？の本
発明によるＨＢＶ蛋白質の製法についてさらに詳細に説
明する。

（１）　　ＨＢＶ遺伝子 第１の本発明による組換えＤＮＡの作製に用いられるＨ
ＢＶ遺伝子は日本や東南アジアなどで多く見られるサブ
タイプａｄｒのものを大腸菌によシクローニングさせて
得られたＨＢＶＤＮＡである。このＨＢＶＤＮＡは次の
ようＫして調製される。まずＨＢｓＡｇ　　ｔ−保有す
るヒト血液中に含まれるディン（Ｄａｎｅ）粒子と呼ば
れるウィルス粒子を後記するように調製する。このＨＢ
ＶＤＮＡは３２００塩基対（以下、ｂｐと略す）を有す
る環状２本鎖構造をとっているが、通常ＤＮＡ全体の７
！チ〜ｒｏｃｋの領域は７本鎖である。そのため遺伝子
のクローニングを行なうに先立って１本鎖部分をＨＢＶ
に含まれるエンビジナスＤＮＡポリメラーゼを利用して
コ本積に修復する。このあとＤＮＡを抽出し、これを適
当な制限酵素によって開裂してから、大腸菌のシラスミ
ドに組込みクローニングを行なう。このａｄｒタイプの
ＨＢＶＤＮＡは制限酵素ル工および！１ａＪＩＤＨＩ認
識部位を各々／個所ずつ有しており、大腸菌でのＨＢＶ
ゲノムのクローニングのためには通常これら認識部位の
いずれかが利用されて大腸菌、゛ プラスミドに組込まれる。

クローニングしたＨＢＶＤＮＡを大腸菌内で増幅したの
ち、通常はさらに適当な制限酵素で処理して所定の断片
として後述のプラスミドの構築に供するが、このよりな
ＨＢＶＤＮＡの大腸菌内クローニングは例えば特開昭！
ター３１７タタ公報に記載される公知の手法で実施でき
る。

（コ）　シャトルベクター 第１の本発明の組換えＤＮＡの作製に用いられるシャト
ルベクターは、例えば０ｏｌＦＸ／に由来する大腸菌プ
ラスミドにＳｖμ０ＤＮＡの複製開始部位を挿入したも
のであって、大腸菌と動物細胞の双方で増殖し得るシャ
トルベクターであシ得る。このように大腸菌プラスミド
に挿入されるＳ　Ｖ　＃　ＯＤＮＡはサルに感染してガ
ンを惹起するウィルスの一種で哨乳動物のガンウィルス
としてよく研究されている公知のウィルスＤＮＡである
。本発明においては、このようなりｖ４Ａｏの複製開始
部位（一般に８Ｖ４’００ｒｌと略称される）約ｊ　！
　Ｏｂｐのみを大腸菌プラスミドに挿入したシャトルベ
クターを用いるのが好ましい。かかる組換えＤＮＡより
なるシャトルベクターは大腸菌およびベロ細胞のような
動物細胞の両方で増殖でき、本発明で所望の組換えＤＮ
Ａを作製するのに適する。

第１の本発明に用いるシャトルベクターでは、更に動物
細胞内での複製阻害部分を欠損させておくことが好まし
い。例えば、そのようなシャトルベクターの一例として
は、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２コから動物細胞に毒性
の部分、即ち動物細胞内での複製阻害部分（／　４４２
　＆　ｂｐ−コ０島ｂｐ）を除き、しかもＳＶφ１１７
ＤＮＡの複製開始部分（ｊ１７／ｂｐ〜２７０　ｂｐの
３≠２　ｂｐ）のみを挿入した公知の組換えプラスミド
Ｉ）Ｌ−／が挙げられる（ＯｋａｙａｍａＡＢｅｒｇ著
「モレキュラー・アンド・セルラー・）々イオロジイ（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ）Ｊ　３　。

２１０−２に’？（１９１３）ｆ参照）。コノベクター
１）Ｌ−／は添付の第１図の地図の一部領域に示す構造
を有し、大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐
性遺伝子（Ａｐｒ）を有している。このようなシャトル
ベクターは、これをＨＢＶ遺伝子と結合させて、所望の
組換えＤＮＡを調製する場合には適当な制限酵素、例え
ばＢａｍＨＩやＸＩＬＯＩなどで処理して開裂した断片
として用いられる。

（３）第１の本発明による組換えＤＮＡ（ＨＢＶ遺伝遺
伝子発現プラスコドン築 前記シャトルベクターを制限酵素Ｌｕｎ　ＨＩで処理し
て得られるＤＮＡ断片と、ＨＢＶ遺伝子を含む一■開裂
断片とを混合して、適当な条件下でＤＮＡリガーゼを用
いた結合反応に付すことによって所望の組換えＤＮＡが
得られる。

本発明において所望する組換えＤＮＡプラスミドはシャ
トルベクター／分子に対しＨＢＶＤＮＡが２分子直列に
連結されて該ベクターのｆｌａｍ　ＨＩ認識部位で挿入
された組換えＤＮＡであり、これの調製にはベクター１
分子に対し、ＨＢＶＤＮＡ／〜数分子の比率で両者を混
合して結合反応を行ない、混成した組換えＤＮＡを、制
限酵素による切断ツリー／で調べることによって所望の
聾の組換えＤＮＡを確認し、こうして容易に収得できる
。

第１の本発明によるＨＢＶ遺伝子を組込んだ組換えＤＮ
Ａは、動物細胞を形質転換させる際に選択マーカーとし
て利用されるネオマイシン耐性遺伝子を含有するのが好
ましい、適当なネオマイシン耐性遺伝子（ト）ｍつはＴ
ｎ　ｊ由来の公知のプラスミドｐＫＯ７（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｍ　
、　Ｌ７Ｊ　。

ｔよ。／！Ｐ７り）から制限酵素狙１１１１［とＢａｍ
ＨＩで処理、切り出して得られる約／、ＪＫｂｐの断片
である。この断片（Ｎｍ’）は第１の本発明の組換えＤ
ＮＡ中にＨＢＶＤＮＡと一諸に組込むこともできるが、
或いは別途に別個のシャトルベクターにネオマイシン耐
性遺伝子（Ｎｍｒ）を組込んだ独立の選択マーカー−プ
ラスミド（例えば後述のプラスミドｐ８ＶＮＰ）として
構築して、第１の本発明による組換えＤＮＡと混合して
用いてベロ細胞に導入したシすることもできる。このよ
うにネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｍ’）を組込んだ独立
の選択マーカー・シラスミドは、第１の本発明による組
換えＤＮＡがすでにそれ自体の中に゛Ｎｍ’ジーンを組
込んでいても、並行して４０細胞に導入することもでき
る。

悴）ベロ細胞の形質転換による第λの本発明の形質転換
４０細胞の作製 前記のＨＢＶＤＮＡ　ｔ−組込んだ組換えＤＮＡは、こ
れをベロ細胞に作用させて培養することによシベロ細胞
の形質転換を行うと、第λの本発明による形質転換ベロ
細胞が得られる。このベロ細胞の形質転換は遺伝子操作
技術上公知の動物細胞の形質転換法で、例えば特開昭ｊ
ター３６６２を号に開示される手法で実施できる。この
場合、ＨＢＶＤＮＡを組込んだ組換えＤＮＡに予めネオ
マイシン耐性遺伝子を組込んである場合には、その組換
えＤＮＡを単独で、また組込んでいない場合にはネオマ
イシン耐性遺伝子の含まれているプラスミドと併用して
ベロ細胞に作用させる。

次にベロ細胞の形質転換の好ましい操作法について、具
体的に述べる。

ベロ細胞をＩＯ％牛脂児血清を含むダルベツコ改良イー
グル培地（以下、ＤＭＥと略す、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ。

Ｒ＆　Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｇ著「）々イロロジイ（Ｖ　
ｉ　ｒ　ｏ　Ｉ　ｏ　ｇＹ　）、＋３２ｔ、ｌりｊり）
にて培養し、これに、　ＨＢ■Ｎ人組込み済みの組換え
ＤＮＡと、ネオマイシン耐性遺伝子含有の選択マーカー
・プラスミドとをリン酸カルシウム溶液中に混合した溶
液を加えてｌ−２１１時間培養する。さらに培地を交換
して２４ｃｍ、４ｃ１時間培養した後、ジエネテシン（
Ｇｅｎｅｔｌｃｌｎ、以下、Ｑ４Ａ／ｒと略す］を≠０
０μｆ／ｄの濃度に加えたＤＭＥで置換し、同じ薬剤を
含む培地で３〜４ｃ日毎に培地交換しながら培養を続け
ると、所望の形質転換ベロ細胞を得る。この場合、出発
ベロ細胞はｃｙｉｉｒに感受性であるが、ネオマイシン
耐性遺伝子を導入された細胞は（ＪＩＡ／Ｉ耐性細胞と
して生き残）、含Ｇ≠／ｒ培地で生育するため上記の所
望の形質転換ベロ細胞のみが選択的に得られる。

（よ）第３の本発明の方法による形質転換ベロ細胞の培
養および）（ＢＶ蛋白質の生産 前記の方法で得られた形質転換ベロ細胞を動物細胞培養
技術上の常法に従って培養することによって生育細胞内
に大量のＨＢＶ蛋白質、即ちＳ抗原のみならずプレＳ付
Ｓ抗原及びｅ抗原蛋白質が産生され、培地中に放出され
る。培地としては、牛胎児血清が好ましく用いられ、こ
の血清量は１〜”％（ｖ／ｖ）の範囲で変えることがで
きる。また、無血清培地で代替することもできる。

本発明の方法においては、通常、Ｓ抗原、プレＳ付Ｓ抗
原並びにｅ抗原などの蛋白質が混合して産生されるが、
これらの蛋白質は超遠心による分画や、抗体を用いたア
フィニティーカラムなトノ常法によって分離精製される
。

上記の本発明の方法で得られるＨＢＶ蛋白質は免疫学的
にヒト血清から得られるものと全く同一であ〕、ヒト血
清によるものと同様にして）（ＢＶ用ワクチン又は診断
用試薬として利用し得る。

つぎに実施例を挙げて本発明の組換えり、Ｎ　Ａの調製
、形質転換ベロ細胞、ＨＢＶ蛋白質の生産についてさら
に具体的に説明する。

寒星ｆｉ−／ （１）　　ＨＢＶＤＮＡ　０ｉｌｌ製 （１）　　ウィルスＤＮＡの調製 ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原共に陽性の供血者（血清型ａｄ
ｒ　）からのヒト血漿１３人分のプール、１０００　ｒ
ｄを４４℃で１０１００００ｒｐ久保田Ｒ人ｉｓ）、２
０分間遠心し、不溶物を除去した。上清をペックマン！
０．　／ローターでμ℃にてλｊ０００ｒｐｍ、２０時
間遠心して沈査をＪＯＷｔの緩衝液Ａ（７０ｍＭトリス
塩酸、ｐＨ７，！、０．／ＭＮａ０１．／ｍＭＥＤＴＡ
、）に溶解させた。！’０１ｄ容の遠７Ｃ？管に底部か
ら１０１４．４ＣＯ％、３０ｑＡ及び２０％（ｗ／ｖ）
の甲に緩衝浪人に溶解した蔗糖液を各１０Ｗｄ、ずつ重
層した頂部に先の試料１０ｒｎｔを重層し、ペックマン
５ｗ−２７０−ターにて≠℃で２≠００Ｏｒｐｍ、／１
時間遠心した。３−ずつに分画し、後述する方法でウィ
ルス粒子内のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定し、ウィル
ス粒子を含む両分を集めた。このプールを緩衝液ＡＫて
約２倍に希釈した後、ペックマンｔｏ、ｉローターでｐ
℃にて２！０００ｒｐｍ、２０時間遠心して沈査をｊ＠
ｇの緩衝浪人に溶解した。この溶液にメトリズアミド（
ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ　）を加えて屈折率を／、≠λ
１０に調整した。底部から屈折率１．弘１３−２．１．
３１４０．及び／、　Ｊ　Ａｊ　Ｏに調整したメトリズ
アミド溶液（緩衝浪人に溶解）を各１ｒｎｔずつ重層し
たｊｗＩｔ容遠心管の最下層に先の溶液をシリンジで注
ぎ込みペックマン６！ローターでφ℃、釘ｏｏｏ　ｒ　
ｐｍ　。

／７．１時間遠心分離を行なった。０．２−ずつ分画し
て、前記と同様の方法によ〕ウィルス粒子を含む両分を
集めた。のちの操作を容易にするために、このＨＢＶ粒
子について、ＨＢＶのもつＤＮ人ポリメラーゼによる反
応を以下のように行なった。即ち、１０ｍＭトリス塩酸
（ｐｉ（７，４’入２０　ｍＭＭ　ｇ　０１２．３ｍＭ
ジチオスレイトール、／チノニデットｐｕｏ、（ＮＰ’
ＩＯ％８ｈｅ１１社製）、それぞれ１００μＭのｄｏ’
Ｉ’Ｐ　（デオキシシチジントリホスフェート）、ｄＧ
ＴＰ（デオキシグアノシントリホス７エート）、ｄＴＴ
Ｐ（７’オキシチミジントリホスフエート）及び２０μ
ＭＣｊＨ：］ｄＡ’ｒＰ（デオキシアデノシントリホス
フェ−トンの混合液にウィルス粒子懸濁液を加え全量ｆ
ｔ／ｍ！、として３７℃にて≠時間反応を行なった。

これにキャリアーとして酵母トランスファーＲＮ人を１
００μｆ加え、次いでＤＮＡに強く結合している蛋白質
を消化するために終濃度／ｍＷ／ｍＡになるようにプロ
テイナーゼＫ　（Ｓｉｇｍａ社！りを加えて３７℃で３
０分間インキュベートした。終了後、終濃度がそれぞれ
１％、／−０ｍＭになるように８ＤＳ及びコーメルカプ
トエタノールを加え３７℃で／時間インキエベートした
。次いで終濃度ｏ、ｉｔ’４〕４ｈコシルを加えた後、
ＴＥ（／　ＯｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７、≠、／　ｍＭ
ＥＤＴＡ）飽和フェノールで常法に従つて除蛋白質を行
ない、エタノール沈殿させた。得られる沈査をｉｏｏμ
ｔのＴＢに溶解後、ＴＦＳで充填したセファデックス（
）−１００によるゲル濾過を行なって素通りする両分を
集め、これに３０μｔの酵母トランスファーＲＮＡを加
えて、再度エタノール沈殿した。得られる沈査はＨＢＶ
ＤＮＡであり、これを水に溶かして保存した。

１ｉ）　　Ｈｓ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａのクローン化前記（１
）の方法で調製された環状二本鎖のＨＢＶＤＮＡを下記
のように公知のプラスミドｐＢＲ３−２−２をベクター
としてクローン化する。

即ち、前記（１）で得たＨＢＶＤＮＡｌｏｏ　μｆｆＡ
ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７，７）、Ａ　ｍＭＭ　ｇ　Ｏ
ｔ２、／ｊＯｍＭＮｎＯＬの混液−２０μＬ中にて３０
単位の制限＃素１皿ＨＩによシ３７℃、μ時間処理した
後、ＴＥ飽和フェノールコＯＯμＬにて抽出し、次いで
エーテル抽出後、その水層に２０μＶの酵母トランスフ
ァーＲＮＡ。

２．５倍容量の冷エタノールを加えてＥ１２ＬＨＩ開裂
ＤＮＡを沈殿させた。この混液を一７０℃で２時間保持
したのち、ｉｒｏｏｏｒｐｍにて、ｉｏ分間遠心分離シ
テ沈殿するＨＢＶＤＮＡのＬｕｎ　ＨＩ開裂ＤＮＡを回
収した。分離した沈査（］ｌｌａｍＨＩ開裂ＤＮ人）を
ＴＢｊｒｒＬに溶解させた二次いでこのＨＢＶＤＮＡと
等モル量のプラスミドルＢａ３２−２を前記と同様の手
法にて制限酵素Ｌｕｎ　ＨＩ　を作用させることにより
開裂させた。得られたプラスミドｐＢＲｊ１２ＤＮＡの
ＩｈｉｍＨＩ開裂ＤＮ人鎖と、上記の如くして得られた
ＨＢＶＤＮＡのＪ３ｊＪｌｎ　ＨＩ開裂ＤＮ人鎖との両
者を混合してｊ　ＯｍＭ　）リス塩酸（ｐＨ７，４’　
）、／　ＯｍＭＭｇ”２．１０ｍＭジチオスレイトール
、ｉｏｏμｆ／ｍｌ牛血清アルブミン、０．ｊｍＭＡＴ
Ｐを含む１０μｔの反応液中でＴ４’ＤＮＡＩＪが−ゼ
を参℃、を時間作用させて結合反応させた。この反応混
合液を前記と同様にして頭次フェノール及びエーテル抽
出、更にエタノール沈殿を付すると、得られた沈査は、
プ、ラスミドｐＢＲＪ２コＤＮＡのＪ３ＪＪ２１ＨＩ開
裂ＤＮ人鎖とＨＢＶＤＮＡのＬａＪＨ工開裂ＤＮ人鎖と
の結合反応生成物（混成状態である）である。・これを
ＴＢｉｏμを中に溶解させて保存した。

大腸菌ＨＢｉ　Ｏ／の培養液を「メソッド・・イン・エ
ンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）Ｊ　ｌａ　１巻、３２６−３３／頁に記載の
方法で処理、調製された菌液０．／ｍｌに対して、上記
アニールされたＤＮＡ調製物（即ち、前記の結合反応生
成物として得られた組換えＤＮＡ）１０μｔを加えてよ
く混合させ、０℃で≠θ分間時々混合しながら放置した
後、弘２℃、２分間加温した。次いで弘ｍＡのＬ培地（
トリゾトンｌチ、酵母エキス０．ｊチ、食塩’５ｓｐｌ
−１７，０）を加えて更に１時間、３７℃で加温する。

この間に、大腸菌ＨＢ／　０　／細胞は上記の組換えＤ
ＮＡを取り込んで形質転換したものが生成された。

このように処理された菌液をアンピシリン２ｊμｆ／ｍ
Ａを添加し九り寒天平板上に塗沫して３７℃で一夜培養
した。出現したコロニーを１個ずつツマ楊子で釣り上げ
、テトラサイクリン（１０μｆ／ｎＬ）及びアンピシリ
ン（コ！μｆ／ｎＬ）を含むＬ寒天平板上にそれぞれ対
応させて塗沫し、アンピシリン上でのみ増殖したコロニ
ーを選択する。シラスミＰ１）ＢＲＪ　Ｊ　Ｊはアンピ
シリン耐性遺伝子をテトラサイクリン耐性遺伝子を有し
ているがテトラサイクリン耐性遺伝子中にあるｆｌａｍ
、ＨＩ部位にＨＢＶＤＮＡが挿入されたことにより、テ
トラサイクリン耐性が消失するので、上記の組換えＤＮ
Ａを取シ込んで形質転換された大腸菌細胞はテトラサイ
クリン耐性を示さないのでテトラサイクリン含有培地で
は死滅する。このようにして選択されたコロニーはｐＢ
ＲＪ２２ＤＮＡ−ＨＢＶＤＮＡという組換えＤＮＡを保
持している。このように選択されたコロニー数個を用い
て「人ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ＠ｔｒｙ
ＪムＬ４１／りＪ（／りＩＩ）に記載される方法に従っ
てプ　−ラスミドを調製した。

こうして得られたプラスミドはｐＢＲＪ２２　ＤＮＡ−
ＨＢ　Ｖ　Ｄ　ＮＡ　（ＪｌａｍＨＩ部位で相互に結合
したもの）の組換えＤＮＡ（以下、ｐＨＢＲ／　０ｊＤ
Ｎ人と称する）である。これのｊθμ２を前記のＢａｍ
ＨＩ反応条件下で処理し、この反応液をｏ、ｔ＠アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、エチジウムプロミドで染色後
３．２キロペースペアのＨＢＶＤＮＡをゲルごと切シ出
す。このゲル断片を透析チューブにＴＥと共に入れ、電
気泳動槽中でＤＮＡ　ｆ：ＴＥ中に溶出させた後、ＴＥ
浴溶液みを取り出し、ＴＥＥ和フェノール、ＴＥ飽飽和
−ブタノールで顆次抽出してアガロースとエチジウムプ
ロミドを除去する。水層を２−ブタノールで濃縮した後
、エタノール沈殿させると、沈殿物としてｌ！μｆのＨ
ＢＶＤＮＡ−ＢａｍＨＩ開裂断片が得られた。

−）　シャトルベクター（プラスミドｐＬ／ＤＮ人のＸ
ＪＬＱ　Ｉ　％Ｌｕｎ　ＨＩ開裂断片）　ノ処理、調ａ
前述したプラスミドｐ　Ｌ　／　（ｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　ａｎｄＯｅｌｌｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＪ−４
（コ）コｔｏ、２ｒり参照）７０μｆを４　ｍＭ　）リ
ス塩酸（ｐＨ７，ｊ　）　、　／ｊＯｍＭＮａＯｔ％Ａ
　ｍＭＭｇＯＬ２．７　ｍＭ　ｊ−メルカプトエタノー
ル、０．０　／　％　（ｖ／ｖ）　ト　リ　トｙＸ−１
００の混合液ｊＯμＬ中にて制限酵素ＸｈｏＩ　／　を
単位を加え、３７℃で６時間反応させた。この混合反応
液を等量のフェノール・クロロホルム（／　：／容量比
］にて抽出し、次いでエーテル抽出後、その水層にｌ１
ｆｌ量の一２０チ酢酸ナトリウム（ｐＨｊ−Ｊ）を加え
、更にその混合液のＪＪ倍容量の冷エタノールを加えた
。この混合液を一７０℃で１時間保持したのち、２！０
００ｒｐｍにて２１．５′分遠心して沈殿するＤＮＡ（
シラスミドｌ）Ｌ　／のＤＮＡのＸｈｏＩ開裂断片）を
回収した。

このようにして分離した沈査のＤＮＡを−ｏｏｍＭヘペ
ス（Ｎ−コーヒドロキシビペラジンーＮ−コーエタンス
ルホン酸）ＣｐＨ＆−１）、１０ｍＭＭｇ０２２．１０
ｍＭジチオスレイトール、Ｏ，コｍＭｄＡＴＰ、　ｄＧ
ＴＰ。

ｄＴＴＰ％ｄＯＴＰの混合液１００μを中にてクレノー
断片７．ｊ単位を加え、７３℃で１．５時間反応させる
と、制限酵素ＸｈｏＩによって開裂されたＤＮＡの末端
部位が修復し、平滑末端になった。この反応溶液を前記
と同様にしてフェノール・クロロホルム抽出、エーテル
処理及びエタノール沈殿に付した。

このようにして得られた沈査のＤＮＡ’ｉ４０ｍＭ）リ
ス塩酸（ｐＨ７，タン、／　ｊ　ＯｍＭＮａＯＬ　％４
ｍＭＭｇ０Ｌ２の混合液中ｊＯμｔにて制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ　／　ｊ単位加え、３７℃で４時間反応させた。こ
の反応液をＯ，タチアガロースゲル電気泳動させ且つ実
施例１（／ｌの最終段階に記載したＨＢＶＤＮＡ−Ｂａ
ｍＨＩ開裂断片の単離法と同じ要領で処理することによ
ｆｉ　、ｕ、ｒキロペースペアの大きさをもつｐＬ−／
　ＤＮＡの幻」Ｉ　、ｊＬａｍＨＩ開裂断片を得た。こ
れはシャトルベクターとしての機能をもつＤＮＡである
。

（３）　　プラスミドｐＫＯ７からネオマイシン耐性遺
伝子領域ＤＮＡの調製 プラスミドｐＫＣ！７の３００μｔを７ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ７−７）、Ｔｏ　ＯｍＭＮａＯＬ、　７ｍＭＭｇ
０ｔ２．、ｏ、ｉｍＷ／ｍＡ牛血清アルブミンの混合液
ｉｏｏμを中にて制限酵素ＨＩｎｄ１［４４０単位を加
え、３７℃で６時間反応させた。この反応液をフェノー
ル・クロロホルム（／：／）混液で抽出し、水層をエー
テル抽出し、次いでエタノールで沈殿させた。その沈査
として得られたｐＫ○７ＤＮＡの旦ｕｕ、Ｉ［［開裂断
片全、２００ｍＭヘペス（ｐＨ４，ｒ）、／　ＯｍＭＮ
ａＯＬ２、／　ＯｍＭジチオスレイトール、　０．２　
ｍＭｄＡＴＰ　＠ｄＧＴＰ’ｄＴＴＰ　−ｄＯＴＰの混
合液コ００μを中にてクレノー断片／Ｊ単位を加え７３
℃で、２，５時間反応させ、制限酵素ＬＬｎ　ｄ　ＩＩ
Ｉによって開裂されたＤＮＡの末端部位を修復し平滑末
端とした。この反応溶液をフェノール・クロロホルム（
／：／）混液で抽出、エーテル抽出及びエタノール沈殿
を行ないＤＮＡの沈査を得た。この沈査を６０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７，り入／　ｊ　ＯｍＭＮａｏｔ％Ａ　ｍ
ＭＮａＯＬ２の混合液／　ｔ　Ｏμを中にて制限酵素Ｂ
ＭＪＨＩ≠Ｏ単位を加え、３７℃で６時間反応させる。

この反応液をｏ、ｒｑｂアガロースゲル電気泳動法及び
実施例１（１）の最終段階に記載されたＤＮＡ断片の単
離方法に付すことにより、ネオマイシン耐性遺伝子領域
を含む／、Ｉ≠ｊキロペースペアのＤＮＡ断片（第１図
の地図でＮｍｒの部分を構成する）を得た。

（リ　シャトルベクターヘネオマイシン耐性遺伝子（Ｎ
ｍｒ）の組込み 前項（２）で得られたｐＬ−／プラスミドＤＮＡのＱＩ
・ｊｌａｍ　ＨＩ開裂断片ｌμ？と、前項（３）でネオ
マイシン耐性遺伝子全含むＤＮＡ断片として得られたｐ
ＫＯ７プラスミドＤＮ人のＨｉｎｄｌ［・！Ｌ！ＪＬＨ
Ｉ開裂断片ｌμ２とを、！　ＯｍＭ　）リス塩酸（ｐＨ
７，７）の混合液−２０μを中にてＴ４ＤＮＡリガーゼ
により、７３℃でＩＯ暇反応させて結合させた。この反
応溶液に最終濃度がｏ、ｉＭとなるように０ａＯ６２ｉ
加え、さらに大腸菌ＨＢ／　０　／株のコ／ピア’ント
セル（ｒ　ＭｅｔｈｏｄｓＩｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
Ｊ　”　、３２　Ａ−３２１％／りｒ　ｏ）１００μｔ
を加え水中で１時間保持したのち、≠Ｊ’Ｃで４分間反
応させた。この菌液にＬ培地ｊ　ｍＡを加え３７℃で１
時間インキュベートした。この菌液をカナマイシン（１
０μｆ／ｍＡ　）含有のＬ寒天平板とアンピシリン（２
よμｆ／ｍＡ　）含有のＬ寒天平板で／、２時間培養後
、寒天平板に出現するコロニーの中からカナマイシンと
アンピシリンの両方で生育可能なコロニーを選択した（
ネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドは、カナマ
イシン中で生゛育可能）。これらのコロニー（クロー７
）ｔ−各々アンピシリンを含むＬ培地で培養後ＪＰＩａ
ｓｍｉｄＪＬミ、ｌター３６、（ｌりｒ≠）に記載され
る方法に従い種々な組成のプラスミドを抽出した。こ　
　　　□れらを種々の制限酵素（ＬシＨＩ、１１１ｍ、
Ｌｕりにてその切断パターンを分析することによシ、そ
れら各種組成のプラスミドのなかから、シャトルベクタ
ーｐＬ−／にネオマイシン耐性遺伝子が挿入された組換
えＤＮＡを得た。これをｐｓＶＫＯ７と命名した。

（ｊ）　　ＨＢＶＤＮＡ−ｐ８ＶＫＯ７組換えＤＮＡ０
調製実施例／　（／Ｈｉｉ）の方法で中間生成物として
得られた前記のｐＨＢＲ／　Ｏｊ　ＤＮＡは、制限酵素
ＢａｍＨＩで開裂したＨＢＶＤＮＡｔ”　ｐ　Ｂ　ＲＪ
　Ｊ　２　ＯＬａｕｏＨＩ開裂部位に挿入した組換えＤ
ＮＡプラスミドである。このプラスミドｐＨＢＲ／　０
　！の、２００　ｐｔｆ　ｔ　ＯｍＭ）リス塩酸（ｐＨ
７、り）、／　ｊ　ＯｍＭＮａＯＡ、６　ｍＭＮａＯＬ
２の混合液コ００μを中にて制限酵素ＬＬｍＨＩ≠Ｏ単
位を加え、３７℃で４時間反応させた。この反応液を実
施例／　（／Ｈ１ｌ）の後段の方法と同様にしてｏ、ｒ
チアガロ−スゲルミ気泳動法によ５、ｊ、Ｊキロベース
ペアのＨＢＶＤＮＡを分離した。前項（りで得られたｐ
ｓＶＫＯ７も前記のＢａｍＨＩ反応条件下で処理し、こ
の反応液を前記と同様０５り慢アガロースゲル電気泳動
によＦ）　、　ｐ８ＶＫＯ７ＬＩｕｏＨＩ開裂断片を調
製した。

上記の如くして得られたＨＢＶＤＮＡ　ＬＬｍＨＩ開裂
断片−μ？及びｐ８ＶＫＯ７ＬｔｍＨＩ開裂断片／　ｆ
ｉｔを−含む混合液３０μＬｔ−ＴｉＤＮＡリガーゼに
より１１℃で１０時間反応させ両者の断片を結合させた
。得られた反応液を用いて大腸菌ＨＢ／　０７株を前記
の実施例１（りの方法と同様の方法にて形質転換させ、
アンピシリン（２７μｆ／ｍＬ）含有のＬ寒天平板上で
１２時間培養後、寒天平板上に出現したコロニー（クロ
ーン）を採取した。これらのクローンを各々アンピシリ
ンを含むＬ培地にて培養後、前記の方法によシブラスミ
ドを抽出した。種々の制限酵素（ＪＬｔｍＨＩ、工ＬＣ
ＩＩ、１ム五■）にてそのプラスミドの切断ノゼターン
を分析することＫよシ、これら各種プラスミドのなかか
ら、　　９８ＶＫＯ７ＤＮＡの１個に対し１（ＢＶＤＮ
人の２個が直列に連結した形で挿入された第１の本発明
による組換えＤＮＡプラスミドを取得した。このシラス
ミド’Ｉｆ：　ｐｓＶＮＨ２と命名した。このプラスミ
ドｐ８ＶＮＨ２，の制限酵素切断地図は添付図面の第１
図に示す。なお、このプラスミド９８ＶＮＨ２，を導入
、形質転換された大腸菌は微工研菌寄第ｊコ００号とし
て寄託されである。

（６）選択マーカーとして用いるためのプラスミドの作
製 動物培！細胞内でネオマイクン耐性遺伝子が効率良く発
現し、種々の形質を有する細胞の集合体から形質転換細
胞を容易に選択することができるようにするために、以
下に述べるように、前項（４ｃ）で得られた組換えプラ
スミド９８ＴＫＯ７中に含まれるネオマイシン耐性遺伝
子の下流Ｋ　８Ｖｌ’　０由来のポＩＪ　Ａシグナルの
ＤＮＡ断片を挿入することによシ、ネオマイシン耐性（
口細抱の選別用の選択マーカーΦプラスミドを作製した
。

ｐ８ＶＫＯ７の弘θＯｐｆをｔ　ＯｍＭ　）リス塩酸（
ｐＨ７、り）、／　ｊ　ＯｍＭＮａＯＡ　、　６　ｍＭ
ＮａＯＬ２の混合液Ｊ　００　ｍｔ中にて制限酵素し−
１１Ｏ単位を加え、３７℃で６時間反応させた。この反
応溶液を順次等量のフェノール・クロロホルム（／：／
容量比）及びエーテル抽出後、エタノール沈殿に付した
。

次いでこのＬｔｍＨＩ部位開裂ｐ８ＶＫＯ７ＤＮＡ断片
を制限酵素圧Ｌｏｆｆｌｌｌｌで処理することになるが
、この断片にはＬ二ｄ切断部位がコケ所存在する丸めに
穏やかな条件で処理し、完全にλケ所とも切断されない
ように注意した。上記で得られたｐｓＶ’ＫＯ７ＤＮ人
断片のＪ　！　Ｏｐｆを７ｍＭ）リス塩酸（ｐ）ｉ７．
ｊ入Ａ　ＯｍＭＮａＯｔ、７　ｍＭＮａＯＬ２．０．　
／　ｍｆ／ｍＡウシ血清アルブミンの混合液！００μを
中にて制限酵素Ｈ１ｎｄｍｊＯ単位を加え、３７℃で６
時間反応させた。この反応溶液を上記と同様の溶媒処理
を施した後、０．タチアガロースゲル電気泳動によって
精製し、コ、ｌキロペースペアのＤＮＡ断片（ｐ８ＶＫ
Ｏ７ＬｔｍＨＩ　・ＨＩ　ｎｄＩ［ＤＮＡ断片）を収得
した。このＤＮＡ断片はＳＶ≠ＯのＤＮＡ複数開始起点
及びＢｙ４ｃｏ初期プロモーターの下流にネオマイシン
耐性遺伝子が結合されたものである。−万、公知のプラ
スミドｐＯＤＶ−／　（ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ
　０ｅｌｌｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＪ↓、２１１０−
２１２参照ンを以下の処理で開裂しベクターＤＮＡとし
た。ｐＯＤＶ−／の２００　ｆｉ？′１に７ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７，ｊ）、Ａ　ＯｍＭＮａＯＬ、　７ｍＭＭ
ｇ０２２．０、／ｍ□を牛血清アルブミンの混合液２０
０μＬ中にて、制限酵素ＨＩｎｄｍ弘Ｏ単位を加え、３
７℃で６時間反応させた。この反応溶液を上記と同様に
溶媒抽出しエタノール沈殿に付した。この沈査ＤＮＡを
Ａ　ＯｍＭ　）リス塩酸（ｐＨ７，タン、／ｊＯｍＭＮ
ａ０１．４ｍＭ　Ｍｇ０Ｌ２の混合溶液／　ｒ　Ｏｌｉ
ｔ中にて制限酵素Ｂ　ａ　ｍＨ−Ｉを弘θ単位加え、３
７℃で６時間反応させた。この反応溶液をそのままＯ，
タチアガロースゲル電気泳動を行ない、２．６キロペー
スペ７（７）ＤＮＡ断片（ｐＯＤＶ−／　且辷ＢＩＩＩ
　！ＬＬＡＩＨＩ　ＤＮＡ断片］を回収し、このベクタ
ーＤＮＡ　Ｋ、は５ｙ４Ａｏ由来のボｖｈシグナル領域
が含まれている。次いでｐ８ＶＫＯ７ＪＬｔｍＨＩ咄上
−１１［ＤＮＡ断片とｐＯＤＶ／且ムｕＬＩ［［ＢＬＩ
ＩＨＩ　ＤＮＡ断片の各／　１１ｆずつをｐｏｎＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７−２）、／　ＯｍＭＭｇＯＬ２、−２０
ｍＭジチオスレイトール、／　ｍＭＡＴＰの混合液２０
μ沖にて％Ｔ４　リガーゼにより両ＤＮ人断片の連結反
応を行なった。この反応液を用いて前記と同様の方法に
よって大腸菌１（１３／　０７株を形質転換させ、カナ
マイシン（ｊＯμｆ／ｍＬ）及びアンピシリン（コ！μ
ｆ／ｍＡ）をそれぞれ含有するＬ寒天平板上に塗抹し、
これらの双方で出現したコロニーを採取した。これらの
クローン化された各コロニーのうちいくつかを選んでプ
ラスミＦＤを抽出し、制限酵素且ムｕＬ−ｍ及びＬａＪ
ｎＨＩによって処理されて得られる切断パターンを分析
し、目的とするプラスミド、即ちｐＣＤｖ／にネオマイ
シン耐性遺伝子及びその下流にポＩＪ　Ａシグナルが挿
入された組換えプラスミドを得、これをｐｓＶＮＰと命
名した。このプラスミドは大腸菌及び動物培養細胞での
シャトルベクターで、しかもネオマイシン耐性遺伝子が
双方の宿主中で発現できる。シラスミドｐ８ＶＮＰは≠
７００ｂｐの大きさをもち、その遺伝子配置図は添付図
面の第２図に示すとう）である。

８２８７号（ＦＥＢＭ　Ｐ−８２８７）として寄託され
である。

遣１」」 （１）　　ベロ細胞の形質転換 下記の溶液を調製する。

人液：０．コｒ　Ｍ　Ｎａ　０１　、　／　！　ｍＭ　
Ｎａ　２ＨＰＯ４、よＯｍＭヘペス（ｐＨ７，／）から
成る溶液／、０ｍ１ Ｂ液：実施例／　（ｊ）で得られた組換えＤＮＡである
ｐ８ＶＮＨ２ｏ　４ｃＯａｆＪ−１実施例／　（４）　
テ得られた組換えＤＮＡであるｐｓＶＮＰ　のコμｆを
０．／　ｍＭＢＤＴ人、／、ＯｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ
ｆ、Ｏ）から成る溶液ｏ、ｙｍｔニ溶かし、ｊ、　！　
Ｍ　Ｏａ　Ｏｔ　２を０，１ｍｔを加えた混合液 上記Ｂ液を攪拌しながらこれに人液をゆっくシ滴下し、
加え終ってから室温に３０分間放置した。

このＤＮＡ−リン酸カルシウム懸濁液□、！ｍＡを、前
日に継代したベロ細胞（米国、ＡＴＯＯから入手し　−
たもの）（約／、ＯＸ　／　０”　Ｏｅ　ｌ　ｌ　ｓ／
６０ｍｍ　ｄｉｓｈｊｍ４］に添加し、！ｔｓｃｏ２．
３７℃で１６時間培養した。

ＤＭＦｉ　（牛胎児血清１０９６を含む］を交換後、更
にコ参時間培賽し、次いでＧ−≠／　ｆｆ（≠００μｆ
／ｒｒＬ）を含むＤＭＥに交換し約３遇 ベロ細胞（ｐ８ＶＮＨ−２とｐｓｖＮＭとの両者が導入
されて形質転換された細砲株）を分離し、これを第２の
本発明による所望の形質転換ベロ細胞として得た。

二良１０乙１ 本例は第３の本発明の方法によるＨＢＶ蛋白質の生産を
例示するものである。

実施例−で得られた形質転換ベロ細胞ＣＧ−４Ａｉｒ耐
性）を／　Ｄ　％　（　ｖ／マン牛脂児血清を含むＤＭ
Ｅで培養し、その培養上清についてＨＢｓＡｇ及びＨＢ
ｅＡｇ検出用キット（アゼット社製〕を用いて、それぞ
れの生産性を測定した。

直径ｔｃｍのプラスチックシャーレに２．０ｘ１０５個
の細胞をｊ　ｍＡの上記ＤＭＥと共に接種し、３７℃で
００２７ラン器中において培養した。毎日培地を交換し
ながら７日１回培養液中に産生された（ＢｓＡｇ及びＨ
ＢｓＡｇ量を測定した結果を次の表−７に示す。

表−７ 他方、細胞接種後培地の交換無しに３日目から、培養液
中と細胞内のＨＢｓＡｇ生産量を夫々に上記と同じ方法
でしらべた結果を表−λに示す。使用培地をＩＯ％牛脂
児血清にし九場合（表２−ａ）と、合成の血清代替品（
ＪＯチ）にした場合と（表２−ｂ）について調べた。

表コーｂ 牛胎児血清培地を用いて３〜４ｃ日に１回培地を交換し
ながら前記の形質転換ベロ細胞を培養して！θ日日間わ
たってＨＢｓＡｇ及びＨＢ　ｅ　Ａ　ｇの生産量の変化
をしらべた結果を表３に示す。この培養開始時における
細胞の世代数は、１日１回の分裂回数として計算すると
、約２０伏目であシ、表３の結果から少なくとも７０代
にわたって安定にＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの生産が可
能であることがわかった。

培養６日目に得られた上記の培養液を集めて１１０００
０　ｒｐｍ　（Ｈｉｔａｃｈｌ　、　ＲＰ　Ａ　ｊ　Ｔ
ローター）　、ｔｉ℃、にてＩｔ時間遠心分離して濃縮
したのち、塩化セシウム平衡密度勾配遠心を行なった〔
１０ｍＭトリス塩酸（、ｐ）Ｉ　７．す、／　ｊ　Ｏｍ
ＭＮａＯｔ、　７ｍＭ　ＢＤＴＡ。

／、　２１ｆ／ｍＡ塩化セシウム、＋０００Ｏｒｐｍ、
６２時間ｔ／！’ｒ：、、ＦＬＰｔタＴローター〕。得
られた画分にっきＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの有無を調
べたところＨＢｓＡｇは７．２０〜／、２ｒ　ｆ／ｃｒ
ｒＩ３、ＨＢｅＡｇは／、２〜／、　／４’ｆ／ａｍ’
及び／、ＪＯ〜／、Ｊ！　９７ｃｍ３の密度（それぞれ
存在することがわかった。

次に上記培養液ｉｚｏμｔと家兎抗ＨＢ＠λｇ（Ｈλｔ
ｉｔｅｒ　／　：　、２７　）　／　ｊ　ＯＡｔと室温
で７２時間反応−後、／ｊ０００ｒｐｍ、３０分間遠心
させ、その沈査を酢酸ウラニル染色して電子顕微鏡端察
すると、同様の処理を施したヒト血清由来のＨＢｓＡｇ
粒子と同様の直径２２　ｎｍの球形及び管状粒子の凝集
像の他に直径約Ａ　Ｏｎｍ位までの種々の大きさの球形
粒子も散在しているのが認められた。但し、ヒト血清中
に見られるようなディン粒子は認められなかった。

上記、塩化セシウム平衡密度勾配遠心によって得られた
１、λ〜／、２ｊ？／ａｍ’の密度の両分をｉ、ｉ３％
ポリアクリルアミドゲル”電気泳動法を行なってシルバ
ースティンで染色したところ分子量約ｊ　Ｊ　０００．
３１．０００及びｕｚｏｏｏのバンドが検出されたが、
分子量からこれらの／々ンドの一つ又は全一てはプレー
ＳとＨＢｓＡｇとの融合蛋白質と考えられた。また、こ
れらの蛋白質の混合物についてプレーＳ部分を勢か否か
をノゼーオキシグーゼ結合ポリアルブミンを用い九公知
のｇＸ、１８人法によってプレーＳ部分を直接定量する
ことによって確認した。このＥＬＩＳＡ法は陽性対照（
ｅＡｇ（ト）血清〕と陰性対照（ｅＡｂ（＋）血清ンと
を用いてプレーＳ部分を特異的に定食が可能となるよう
に設定されている。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＢＶＤＮＡの断片がλ個直列に挿入された本
発明による組換えＤＮＡ（ｐ８ＶＮＨ２）の制限酵素切
断地図を示す。第２図はｐ８ＶＮＨコのベロ細胞への導
入の際に同時に加えた選択マーカー用のプラスミ）′（
ｐｓＶＮＰ）の遺伝子配置図を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　大腸菌と動物細胞の双方で増殖し得るシャトルベク
   ターの￥Ｂａｍ￥Ｈ I 開裂部位の間に、￥Ｂａｍ￥Ｈ
   I 開裂部位で２個直列に連結されたＢ型肝炎ウィルス
   遺伝子の￥Ｂａｍ￥Ｈ I 開裂片の２個を組込んである
   ことを特徴とする新規な組換えＤＮＡ。 ２　大腸菌と動物細胞の双方で増殖し得るシャトルベク
   ターの￥Ｂａｍ￥Ｈ I 開裂部位の間に、￥Ｂａｍ￥Ｈ
   I 開裂部位で２個直列に連結されたＢ型肝炎ウィルス
   遺伝子の￥Ｂａｍ￥Ｈ I 開裂片の２個を組込んでなる
   組換えＤＮＡを、導入されて形質転換されたことを特徴
   とする、形質転換ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞。 ３　大腸菌と動物細胞の双方で増殖し得るシャトルベク
   ターの￥Ｂａｍ￥Ｈ I 開裂部位の間に、￥Ｂａｍ￥Ｈ
   I 開裂部位で２個直列に連結されたＢ型肝炎ウィルス
   遺伝子の￥Ｂａｍ￥Ｈ I 開裂片の２個を組込んでなる
   組換えＤＮＡを、導入されて形質転換された形質転換ベ
   ロ細胞を動物細胞培養培地中で培養して、その培養物中
   に、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原、プレＳ付表面抗原並
   びにＨＢｅ抗原の蛋白質を産生させ、それを収集するこ
   とを特徴とするＢ型肝炎ウィルス蛋白質の製法。 ４　形質転換ベロ細胞を継代培養させて、Ｂ型肝炎ウィ
   ルスの表面抗原、プレＳ付表面抗原並びにｅ抗原の蛋白
   質の産生を継続させる特許請求の範囲第３項に記載の方
   法。