JP3315689B2 - 治療的機能を有するアルブミンの誘導体 - Google Patents

治療的機能を有するアルブミンの誘導体

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はある種のウイルス性疾患や癌の治療用薬剤の
構築にアルブミン誘導体を用いることを含むものであ
る。さらに正確に言えば、本発明はウイルスに対するレ
セプターの活性領域、ウイルスに結合できる分子の活性
領域、ウイルスに結合した免疫グロブリンのFcフラグメ
ントを認識できる分子の活性領域、発病プロセスに介在
するリガンドに結合できる分子の活性領域、のいずれか
とアルブミンまたはアルブミンの変異体をカップルさせ
たハイブリッド高分子を含むものである。以下、アルブ
ミン誘導体あるいはアルブミン変異体という用語は、ア
ルブミンの同形体をコードする遺伝子を遺伝子操作法に
より修飾（変異、欠失、および／または挿入）して得ら
れた長い血漿中半減期を有するすべての蛋白質、および
そのような遺伝子でコードされた蛋白質をin vitroで修
飾して得られた長い血漿中半減期を有するすべての高分
子のことを言うものである。このようなアルブミン誘導
体はアルブミン誘導体上に存在する結合サイトに、ウイ
ルス、またはウイルスに結合した免疫グロブリンが高い
親和性を有するので抗ウイルス治療における医薬品とし
て用いることができる。またリガンド（例、成長因
子）、特にトランスフォーム表現形（プロトオンコジー
ン）と相関して増幅するある種の膜レセプターと結び付
くリガンドがアルブミン誘導体上に存在する結合サイト
に親和性があることによりある種の癌の治療における医
薬品として用いることができる。以下の記載においては
機能的に治療性のあるアルブミン誘導体はすべて抗ウイ
ルス性のハイブリッド高分子、抗癌性ハイブリッド高分
子、あるいは単にハイブリッド高分子の一般名で呼ぶこ
とを了解されたい。
詳細には本発明は化学的あるいは遺伝学的手法により
少なくとも２つの異なる機能をカップルさせることを特
徴とする新規な治療剤の取得から成る： （ｉ）安定な血漿中運搬体としての機能：アルブミン変
異体、特にはヒト血清アルブミン（HSA）がこの機能を
与える。HSAをコードする遺伝子は高度に多形性であっ
て30以上の異なる対立遺伝形質が報告されている（L.R.
Weitkampら、Ann.Hum.Genet.37巻219−226ページ（197
3））。このアルブミン分子の３次元構造はＸ線回折に
より特定されており（D.C.Carterら、Science 244巻11
95−1198ページ、（1989））、血漿蛋白中もっとも大量
に存在する蛋白であり（ヒトでは40g/L）、血漿中半減
期が長く（ヒトでは14−20日、Waldmann T.A.,“アルブ
ミンの構造と機能およびその利用"Reseboar V.M.編Perg
amon Press,Oxford（1977）255−275ページ）、なかん
ずく酵素機能がないという利点があり治療的に大量に使
用できるため、安定な運搬体機能を提供するものとして
選ばれた。
（ii）抗ウイルスあるいは抗癌性の治療機能：抗ウイル
ス性機能はウイルスを特異的に結合する あるいはウイルス−免疫グロブリン複合体を結合する として働く。たとえば、ウイルスが宿主細胞で繁殖する
ために通常用いるレセプターの全部あるいは一部が、あ
るいはこのようなウイルスに高い親和力で結合してin v
ivoで抗ウイルス剤として作用できる分子が、この抗ウ
イルス機能を与えることができる。また、ウイルスと複
合化した免疫グロブリンを認識する能力のあるレセプタ
ーの全部または１部分、または生体中で抗ウイルス剤と
しての利用を可能とするのに十分高い親和性で複合体と
結合する能力のあるあらゆる分子も抗ウイルス機能を与
えることが出来る。抗癌機能は発癌プロセスに関わるリ
ガンド、とりわけ成長因子に結合する として働き、細胞の原癌遺伝子の全部あるいは一部、ま
たはこのようなリガンドに高い親和力で結合してin viv
o抗癌剤として作用できる分子がこの結合機能を与え
る。
（iii）例えばウイルスの感染をin vivoで阻止するのを
補助するので、治療機能の局所的高濃度が必要とされる
場合は、治療活性のあるハイブリッド分子ができれば重
複する形で２つあるいはそれ以上が重合することが可能
になる第３の機能を付加することが出来る。例えばこの
ような機能は「ロイシン ジッパー」モチーフ（W.H.La
ndschulzら、サイエンス 240巻、1759−1764ページ（1
988））あるいはHIV−１ウイルスゲノムでコードされる
tat遺伝子産物の領域（A.D.Frankelら、サイエンス 24
0巻、70−74ページ（1988）、A.D.Frankelら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.85巻、6297−6300ページ（1988））のよう
なある種の蛋白質のホモダイマー化に必要な蛋白領域に
より付与されることができる。本発明においては血漿中
輸送機能、治療機能、潜在的な重合機能が遺伝子工学の
手法を用いて同一の巨大分子中に組み込まれている。
本発明の目標の１つは、ある種のウイルス性疾患たと
えば後天性免疫不全症候群（AIDS）と戦うのに有用なHS
Aのヒブリッド高分子を得ることである。もう１つの目
標は、ある種の原癌遺伝子ｃ−rebB−２のように遺伝子
増幅およびまたは過剰発現を伴う癌（K.Sembaら、Proc.
Natl.Acad.Sci USA.,82巻6497−6501（1985）、D.J.Sal
monら、サイエンス235巻177−182ページ（1987）、M.H.
Krausら、EMBO J.6巻605−610ページ）治療に有用なHSA
ハイブリッド巨大分子を得ることである。
HIV−１ウイルスはヒトの後天性免疫不全症候群の原
因となるレトロウイルスの１とつである。このウイルス
については過去５年間にわたり詳しく研究されてきいて
る。基礎的な発見の１つはCD4（T4）分子のHIV−１ウイ
ルスのレセプターとしての役割の解明に関するものであ
る（A.G.Dalgleishら、ネーチャー312巻763−767ページ
（1984）、D.Klatzmannら、ネーチャー312巻767−768ペ
ージ（1986））。ウイルス−レセプター間の相互作用は
ウイルスのエンベロープ蛋白（gp120）がCD4分子に高度
に特異的に結合して起こる（McDougalら、231巻382−38
5ページ（1986））。T4分子あるいはそれに対する抗体
をHIV−１ウイルスに対する治療剤として利用すること
を請求範囲とする特許はこのHIVウイルスとある種のＴ
細胞との相互作用に基づいて居る（フランス特許出願FR
2 570278）。
ヒトCD4をコードする遺伝子配列をクローン化し、最
初にその配列を決定したのはMaddonらであり（Cell42巻
93−104ページ（1985））、その配列を修正したのはLit
tmannらである（Cell55巻541ページ（1988））。CD4分
子は免疫グロブリンのスーパーファミリーの一員であ
り、免疫グロブリンのＨ鎖可変領域と実質的に相同なV1
N末端を有する（P.J.Maddonら、Cell 42巻93−104ペ
ージ1985年）、CD4をコードする遺伝子を用いたin vitr
o DNA組み替えを含む実験はCD4遺伝子産物がHIV−１ウ
イルスの主要レセプターであることを明確に立証した
（P.J.Maddonら、Cell 47巻 333−348ページ1986
年）。この遺伝子の配列とその抗HIV−１治療剤として
の利用については国際特許出願WO 88凹013 040 A1中
で論じている。
DNA組み替え技術によりCD4遺伝子を操作することによ
り第１世代のin vitroで抗ウイルス活性を示すことがで
きる可溶性の変異体（D.H.Smithら、サイエンス238巻17
04−1707ページ、1987年、A.Trauneckerら、ネーチャー
331巻84−86ページ 1988年、R.A.Fischerら、ネーチャ
ー331巻、76−78ページ 1988年、R.E.Husseyら、ネー
チャー331巻78−81ページ1988年、K.C.Deenら、ネーチ
ャー331巻82−84ページ1988年）、同じくin vivoで抗ウ
イルス活性を示すことが出来る変異体（M.Watanabeら、
ネーチャー337巻267−270ページ巻1989年）の生産が可
能になった。全例において種々のin vivo動物実験（ウ
サギ、サル）および臨床第１相試験においてＣ末端の２
つの領域が欠失しているCD4分子からなる第１世代可溶
性CD4変異体は極めて短い半減期を示した：ウサギでは
約15分（Caponら、ネーチャー337巻、525−531ページ、
1989年）、一方、可溶性第１世代CD4をアカゲザルに筋
肉投与すると50％は６時間は生体内利用可能であった
（Watanabeら、ネーチャー337巻267−270ページ、1989
年）。さらに60例のAIDSあるいはARC（エイズ関連症候
群）を発症した患者に対し臨床第１相試験を行なった結
果、ジェネンティック社の製品の半減期は60分（静脈内
投与）から９時間（筋肉内投与）までの範囲にあった
（AIDS/HIV実験的処置案内書、AmFAR,1989年５月）。明
らかにこのようにin vivoで安定性の乏しいことは治療
剤として大きなハンディキャップになる。実際血漿中有
効な濃度を得るには、コストがかさみ患者にとっても不
便である注射を繰り返すか、灌流により投与することが
必要になる。したがってずっと長いin vivo半減期を特
徴とするCD4誘導体を見出すことが特に重要となる。
HIV−ウイルスと相互作用するCD4分子の部分はＮ末
端、特にV1ドメインにある（E.A.Bergerら、Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.85巻2357−2361ページ1987年）。HIV−
１感染した患者のうち有意な割合で（約10％）CD4レセ
プターに対する免疫反応を起こしレセプターの細胞の外
に出た部分のＣ末端に対する抗体をつくることが観察さ
れている（C.Thiriartら、AIDS ２巻 345−352ページ
1988年、V.chamsら、AIDS ２巻 353−361ページ1988
年）。よって、本発明の好ましい実施態様においてはCD
4分子中ウイルス結合能のあるV1,V1V2だけが安定な輸送
機能を有するアルブミン誘導体との融合に用いられる。
免疫グロブリン間に見られる相同性に基づき、いくつか
の研究室においてCD4分子と別のタイプの免疫グロブリ
ンとの間の遺伝子融合を行ない、in vitroで抗ウイルス
活性のあるハイブリッド免疫グロブリンを作り出した
（D.J.Caponら、ネーチャー337巻525−531ページ 1989
年;A.Trauneckerら、ネーチャー339巻68−70ページ1989
年；国際特許出願WO89 02922も参照のこと）。しかし
ながら、ヒトにおいてはCD16抗原であるFcγIIIレセプ
ター（IgGのFc領域に対するタイプ３レセプター、J.C.U
nkeless ＆ C.Jacquillat,J.Immunol.Meth.100 235−2
41 1987）がHIV−１ウイルスの内部取り込みに関与し
ている（J.Homsy et al.,Science 244 1357−1360 19
89）ということは、in vivoにおけるウイルスの繁殖に
おいてこれらのレセプターが果たす役割の重要性を示唆
するものである。最近クローン化されたレセプター（D.
Simmons ＆ B.Seed,Nature333 568−570 1988）はおも
にマクロファージ、多核細胞、顆粒細胞の膜に局在して
いるがCD16レセプターはCD4とは対照的に血漿中に溶け
た形でも存在している（D.Khayat et al.,J.Immunol.13
2 2496−2501 1984;D.Khayat et al.,J.Immunol.Met
h.100 235−241 1984）。膜に存在するCD16レセプター
は、HIV−１ウイルスが抗体の助けを借りてマクロファ
ージに感染して侵入する第２のルートであることに留意
すべきである（J.Homsy et al.,Science 244 p1357−
1360 1989。標的細胞の表面に存在するFcレセプター
（たとえばCD16レセプター）とウイルス粒子に対する抗
体のFc領域が関与する感染プロセスはADE（Antibody De
pendent Enhancement抗体依存性促進）と名付けられ、
これまでフラビウイルス（flavivirus）（J.S.M.Peiris
et al.,Nature 289 p189−191 1981）およびビスナ
メディヒツジウイルス（Visna Maedi ovine virus）
（E.Jolly et al.,J.Viol.63 p1811−1813 1989）に
関して報告されている。その他のFcレセプターがIgGに
ついて（例、FcγR IおよびFcγR II）、またその他の
免疫グロブリンのクラスについても報告されており、AD
E現象もモノクローナル抗体3G8で認識されるレセプター
のような他のタイプのFcレセプターを含むことが知られ
ている（J.Homsy et al.,Science 244 p1357−1360 19
89）。よって、免疫グロブリンと、HIV−１のようなウ
イルスが通常宿主内で繁殖するために用いるレセプター
の全部あるいは一部との融合にのみ依存する抗ウイルス
性巨大分子の有効性について疑問が生じて来る。実際、
そのような分子上に機能性のFcフラグメントが存在する
とある種の細胞のタイプにおいてはウイルスの感染を補
助することが出来た。高い治療用濃度で用いることので
きるCD4誘導体をえることも重要である。
細菌蛋白質のMalEとCD4を含む別のキメラ構造体が研
究されている（J.M.Clement et al.,C.R.Acad.Sci Pari
s 308 series III p401−406 1989）。このような融
合によって、特にハイブリッド蛋白質の生産および／ま
たは精製に関してMalE蛋白質の特性を利用することがで
きる。さらに、CD4分子と細菌毒素の遺伝子融合の構築
について報告されている（V.K.Chaudhary et al.,Natur
e 335 p369−372 1988）。これらの例ではヒトの治
療という点で細菌蛋白質を含む遺伝子融合を利用するこ
とが疑問視される。
ウイルス、特にHIV−１ウイルスを含むレンチウイル
スの繁殖におけるADE現象の役割が見出されたことは、
免疫グロブリンとウイルスを結合できる分子間での融合
のみに立脚した抗AIDウイルスワクチンと治療剤の開発
の双方に代わりうるものを探索することを正当化する。
これが本発明に記載された抗AID治療薬剤がHIV−１ウイ
ルスがin vivoの繁殖に直接・間接に用いるレセプター
の全部あるいは一部と、酵素活性がなく、Fcフラグメン
トを持たない安定な血漿蛋白質との融合に立脚している
理由である。
特に本発明はヒトアルブミン変異体とHIV−１ウイル
スの結合サイトとを主に遺伝子工学的にカップリングさ
せることに関するものである。このようなヒト血漿アル
ブミン由来ハイブリッド巨大分子は１つまたは数個のCD
4レセプターの変異体（in vitroのDNA組み替え技術（突
然変異、欠失、および／または付加）によりHIV−１ウ
イルスと標的細胞との特異的な相互作用に関わっている
CDレセプターのＮ−末端領域を修飾したもの）が存在す
ることが特徴である。このようなハイブリッド分子は血
漿中を回遊しながら抗ウイルス活性を有する安定なオト
リの役を果すもので、通称CD4−HSAと命名される。本発
明のもう１つの目的は、ヒト血清アルブミン変異体と、
HIV−１を含むウイルスの内部取り込みに関わるCD16の
変異体とのカップリングに関するものであり（通称HSA
−CD16）、一般的には、アルブミンの変異体と、ある種
のウイルス（特にレンチウイルス）のADE現象に対応す
る細胞のレセプターを模倣することができる分子をカッ
プリングさせることである。
本発明の原則はヒトあるいは動物のウイルスが宿主生
物中で繁殖するために直接・間接に利用する他のレセプ
ターにも適用できるものである。例えば： １ 細胞内接着分子（ICAM−１）；これはヒト−ライノ
ウイルスHRV 14のレセプターであることが示されている
（J.M.Greve,Cell 56 p839−847 1989;D.E.staunton e
t al.,Cell 56 p849−853 1989）。
２ 最近クローン化されたポリオウイルスレセプター
（Mendelsohn et al.,Cell 56 p855−865 1989）。
３ エプスタイン−バーウイルス（EBV）のヒト細胞に
おけるレセプターである補体C3Dのレセプター（J.D.fin
geroth et al.,Proc.Natol.Acad.Sci.USA 81 p4510−4
514 1984）。このウイルスはヒトにおいて感染性単核
症を引き起こし、ある種のリンパ腫の原因である。
４ 最近第17染色体上にマップされたヒトＴ細胞白血病
ウイルスHTLV−ＩおよびHTLV−IIのレセプター（M.A.So
mmerfelt et al.,Science 242 p1557−1559 1988）。
これらのウイルスは成人Ｔ細胞白血病および熱帯痙性不
全麻痺（HTLV−Ｉ）およびtricholeucocytic白血病（HT
LV−II）の原因となる。
５ マウスの第５染色体上にマップされ（Oie et al.,N
ature 274 p60−62 1978）最近クローン化された（Al
britton et al.,Cell 57 659−666 1989）、ecotrop
icマウス白血病ウイルスMuLV−Ｅのレセプター。
本発明のもう１つの目的は抗癌活性を有する安定なハ
イブリッド高分子の開発である。これはアルブミン変異
体と成長因子と結合できる分子をカップリングさせて得
られる。この成長因子はある種の病態においては対応す
る膜の原癌遺伝子の増幅に伴って標的細胞との相互作用
でトランスフォーム表現型を誘発する。このようなレセ
プターの例はチロシンキナーゼ活性を有するレセプター
群で（Y.Yarden ＆ A.Urlich,Biochemistry 27 p3113
−3119 1988）、もっとも良く知られたものは上皮細胞
成長因子（EGF）のレセプターと、コロニー刺激因子（C
SF−１）のレセプターで、それぞれ原癌遺伝子ｃ−erbB
−１（J.Downsard et al.,Nature 307 p521−527 19
84）およびｃ−fms（C.J.Sherr et al.,Cell 41 p665
−676 1985）によってコードされている。このような
レセプターの別の例はヒトインシュリンレセプター（HI
R）、血小板由来成長因子（PDGF）レセプター、インシ
ュリン様成長因子Ｉ（IGF−１）レセプターおよびもっ
とも良く知られてるのが、ｃ−erbB−２原癌遺伝子で、
その染色体上の増幅および／または過剰発現がある種の
ヒトの癌、なかでも乳癌と厳密な相関性があることが示
されている（D.J.Slamon et al.,Science 235 p177−
182 1987;M.H.Kraus et al.,EMBO J.6 p605−610 19
87）。さらに本発明で提示された原理は他のレセプタ
ー、たとえばインターロイキン６（IL6）レセプターに
も等しく適用できる。このIL−６レセプターはin vitro
で腎カルシノーマ細胞中のオートクリン因子であること
が示されている（S.Miki et al.,FEBS Lett.,250 p607
−610 1989）。
上に述べたように、興味を持たれるハイブリッド高分
子は実質的に好ましくは蛋白性であり、それゆえ遺伝子
工学技術により創製することが出来る。これらの高分子
を得るのに好ましい方法は、高分子を発現するベクター
で形質転換、トランスフェクション、または感染された
細胞を培養することである。蛋白質の分泌のためには特
に酵母、なかでもKluyveromyces属を形質転換できるベ
クターが用いられる。このようなシステムは大量の高分
子をその成熟形で生産し、この成熟形は培地中に分泌さ
れ、精製を容易にする。それゆえハイブリッド高分子の
発現と生産の好ましい方法はKluyveromyces属の酵母を
発現ベクターで形質転換することからなる。このベクタ
ーは染色体外レプリコンpKD1に由来し、このpKD1はK.ma
rxianus var.drosophilarumから分離された。これらの
酵母中でもK.marxianus（変種のlactis,drosophilarum,
marxianusを含み、これ以後K.lactis,K.drosophilarum,
K.fragilisと呼ぶ）は一般に安定な形でこれらのベクタ
ーを複製でき、さらに「G.R.A.S.（Generally Recogni
zed As Safe一般に安全と認められる）生物」のリスト
に載っているという利点がある。特に興味をもたれる酵
母は、該ハイブリッドを高レベルで分泌することを可能
にする発現カセットと選択用マーカーが挿入された、プ
ラスミドpKD1に由来するプラスミドを安定に複製できる
Kluyveromycesの工業用菌株を含む。
Kluyveromycesについては３タイプのクローニングベ
クターが報告されている： ｉ）Kluyveromycesゲノムと相同な配列を有し、細胞内
に導入された後にin vivoの組み替えによりKluyveromyc
esの染色体に組み込まれる、組込み型ベクター（国際特
許出願WO83/04050）。頻度が低く効果的な選択用マーカ
ーが必要とされる組込みは、これらのベクターが細胞中
での自律増殖を可能にする配列を有さない場合に得られ
る。このシステムの利点は形質転換された菌株の安定性
であり、これらの菌株が組み込まれた配列を保持する選
択圧を必要とせず、通常の栄養培地に生育出来ることを
意味する。欠点は組み込まれた遺伝子が細胞当たり非常
に少ないコピー数しか存在しないということで、これら
はしばしば異種蛋白質の生産レベルが低いという結果に
なる。
ii）KluyvverumycesのDNAに由来する自律性複製配列（A
RS Autonomously Replicating Sequences）を有する増
殖性ベクター（S.Das ＆ C.P.Hollenberg Current Gene
tics 6 p123−128 1982;国際特許出願WO83/04050）。
しかしながら、これらのベクターは有糸分裂の際の分離
が均等ではないため選択圧の下でも高い頻度で失われる
ことになり、さほど興味の対象とはならない。
iii）K.lacatisから分離された線状キラープラスミド
（L.delouvencourt,J.Bacateriol.154 p737−742 198
5,欧州特許出願EP095 896 A1,07.12.1983公開）、あ
るいはK.drosophilarumから分離された環状プラスミドp
KDI（X.J.Chen et al.,Nucl.Acid Res.14 p4471−4480
1986;C.Falcone et al.,Plasmid 15 p248−252 1
986;欧州特許出願EP0 241 435 A2,1987年10月14日公
開）のどちらかの、酵母に本来存在するプラスミド由来
の自律増殖性のプラスミド。線状キラープラスミドのレ
プリコンを有するベクターは特別な栄養培地を必要と
し、選択圧の下でも15世代分裂すると40−99％が失われ
てしまう（欧州特許出願EP 0 095 986 A1,1983）ため、
異種蛋白質の大量生産に利用するには限界がある。欧州
特許出願EP 0 241 435 A2に記載されたプラスミドpKD1
もまた非常に不安定で、もっとも性能のよいベクター
（p3）でも非選択性の生育条件下では６世代後には約79
％が失われてしまう。
本発明の目的の１つは、全pKD1プラスミドに由来する
プラスミドを構築し利用することに関するものである。
このような構築物は欧州特許出願EP 0 241 435 A2明
細書記載のプラスミドよりも顕著に高い安定性を有する
ことを特徴とする。これら新規のベクターは非選択性生
育条件下で50世代経過後も80％以上が安定に保持されて
いることが本発明では示される。
本発明中で用いられるベクターの高い安定性はプラス
ミドpKD1の特性をフルに利用することで得られた。複製
開始点を別にして、この染色体外レプリコンシステムは
各346塩基の長さの２つの逆方向繰り返し配列と、その
発現がプラスミドの安定性とコピー数に必須である遺伝
子A,B,およびＣをコードする３つのオープンリーディン
グフレームを有する。構造的にプラスミドpKD1と関連の
あるS.cerevisiaeの２μプラスミド（X.J.Chen et al.,
Nucl.Acids Res.14 p4471−4480 1986）とのアナロジ
ーから、遺伝子ＢおよびＣによってコードされる蛋白質
は恐らく有糸分裂の際のプラスミド分配に関わってお
り、場所特異的リコンビナーゼ（FLP）をコードする遺
伝子Ａを負に制御する役割を果していると考えられる。
S.cerevisiaeの２μプラスミドの逆方向反復塩基配列間
のFLPによる組み替えは細胞当たりのプラスミドコピー
数の自律調節機構の基礎をなすことが示されている。す
なわち、コピー数が少なくなり遺伝子Ａのレプレッサー
である遺伝子ＢおよびＣの産物の量が十分でなくなると
FLPリコンビナーゼが誘導され、プラスミドがローリン
グサークルモデルにより複製され、細胞当たり50コピー
にまで増幅する（A.B.Futcher,Yeast4 p27−40 198
8）。
欧州特許出願EP 0 241 435 A2明細書記載のベクタ
ーは上述したK.drosophilarumのpKD1プラスミドの構造
的特性を有さず、すなわちベクターA15はpLD1の完全構
造を持たず、ベクターP1とP3はＡ遺伝子が中断されてい
る。したがって残りのpKD1プラスミドの自律的複製シス
テムが破壊されている。対照的に本発明で用いられたpK
D1プラスミド由来の構造は逆方向反復塩基配列と遺伝子
Ａ、Ｂ、Ｃのオープンリーディングフレームの構造的統
一性を保持しており、結果として顕著に高いプラスミド
の安定性と治療活性のあるハイブリッド高分子の分泌レ
ベルが高くなっている。
発現カセットはハイブリッド高分子をコードする遺伝
子の発現をコントロールする転写開始領域（プロモータ
ー）を含む。プロモーターの選択は使用する宿主により
異なる。これらのプロモーターはサッカロミセスあるい
はクルベロミセスタイプの酵母の遺伝子から得られる。
たとえばグリセロリン酸キナーゼ（LGK），グリセロア
ルデヒドオ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GPD），クル
ベロミセスのラクターゼ（LAC4）、エノラーゼ（FN
O）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）,S.cerevisia
eの酸性フォスファターゼ（PH05）などである。これら
のコントロール領域は、in vitro部位特異的突然変異
誘発、追加のコントロールエレメントあるいは合成配列
の導入、元のコントロールエレメントの欠失または置換
などにより修飾することが出来る。例を挙げると、転写
調節エレメント、いわゆる高等真核細胞における「エン
ハンサー」、他の酵母のプロモーター（S.cerevisiaeの
GAL1およびGAL2プロモーターやK.lacatisのLAC4プロモ
ーター）に由来する酵母の「上流活性化配列（UA
S）」、さらにはパピローマウイルスのE2トランスアク
チベーターのようなウイルスのトランスアクチベーター
が認識する遺伝子のエンハンサーも、酵母培養の増殖期
とハイブリッド高分子をコードする遺伝子の発現時期を
分離することが出来るハイブリッドプロモーターの作成
に用いることが出来る。ハイブリッド高分子をコードす
る配列の前には、蛋白質を分泌経路に導く役目をするシ
グナル配列を置く。このシグナル配列はアルブミンの本
来のＮ−末端領域（プレプロ領域）から得られる、ある
いは性ホルモンやキラー蛋白のような酵母の分泌蛋白を
コードする遺伝子からも得られる。あるいは、合成配列
および“プレ”と“プロ”領域の間のあらゆる組み合わ
せを含むいわゆる「医薬的に重要な蛋白質」の分泌を増
加させることが知られているすべての配列から得ること
ができる。成熟形で分泌されるべきハイブリッド高分子
をコードする配列とシグナル配列の連結部は、酵母のエ
ンドプロテアーゼの切断部に相当する。たとえばLys-2
−Arg-1またはArg-2−Arg-1タイプの１組の塩基性アミ
ノ酸は、S.cerevisiaeのKEX2遺伝子あるいはK.latisのK
EX1遺伝子でコードされるプロテアーゼの認識部位であ
る（X.J.Chen et al.,J.Basic Microbial.28 p211−22
0 1988;M.Wesolowski−Louvel et al.,yeast ４ p71
−81 1988）。実際S.cerevisiaeのKEX2遺伝子産物はin
vitroで正常なアルブミンの“プロ”配列を切断するが
プロアルブミン“Christchurch"に相当する配列（ここ
では塩基アミノ酸のペアがArg-2−Glu-1に変異してい
る）は切断しない（I.C,Bathurst et al.,Science 235
p348−350 1987）。
発現カセットに加え、ベクターは１つあるいは数個
の、形質転換された宿主を選択するためのマーカーを含
む。このようなマーカーは、酵母のURA3遺伝子、あるい
はゲネチシン（geneticin）耐性（G418）のような抗生
物質耐性を与えるマーカー、あるいは重金属のような毒
性物質に対する耐性遺伝子を含む。これらの耐性遺伝子
は所定の宿主での発現が起こるよう適切な転写および翻
訳シグナルのコントロール下に置かれる。
発現カセットと選択用マーカーからなる組合わせ体は
直接酵母を形質転換するか、染色体外で複製可能なベク
ターに挿入することが出来る。先の場合、宿主染色体の
存在する領域に相同な配列を組合わせ体に融合させるこ
とが好ましい。これらの配列は発現カセットと選択用マ
ーカーのそれぞれの部位に位置させて、組合わせ体が宿
主染色体に組み込まれる頻度を増大させる。発現カセッ
トが複製能のあるベクターに挿入される場合は好ましい
複製システムはクルイベロミセスについてはもともとK.
drosophilarumから分離されたプラスミドpKD1、サッカ
ロミセスの場合は２μプラスミド由来のものである。発
現ベクターは上述の複製システムの全部または１部を含
むことができ、あるいは２μプラスミド由来のエレメン
トとpKD1プラスミド由来のエレメントを結合することが
出来る。
クルイベロミセス属の酵母における発現が望まれる場
合、好ましい構築物はpKD1プラスミドの全配列を含む物
である。特に好ましい構築物はpKD1に外来配列を挿入す
る場所が、Sac I（Sst I）サイトとMSt IIサイトの間に
ある197bpの領域にあるか、あるいはこのプラスミドのS
ph Iサイトにあるものである。これは宿主細胞中での複
製システムの高い安定性を可能にする。
発現プラスミドはEscherichia coliのような細菌宿
主と酵母間のシャトルベクターの形をとることも出来
る、この場合、細菌宿主中で機能する複製の開始点と選
択用マーカーが必要となる。発現ベクター特異的な制限
切断部位を、細菌配列の横に来るように置くことが出来
る。このことにより制限切断で細菌配列を除いてからベ
クターを再度連結して酵母を形質転換することが出来
る。その結果、高いプラスミドコピー数とプラスミドの
安定性の増加がもたらされる。酵母においては稀で一般
に発現プラスミドには存在しないので、 （Not I）のような制限部位は特に便利である。
上述のように構築された発現ベクターは文献に記載さ
れた古典的な手法により酵母中に導入される。形質転換
細胞を選択した後、ハイブリッド高分子を発現している
細胞を適当な選択培地に植菌し、問題の蛋白質を細胞外
培地中に分泌する能力があるかどうかについてテストす
る。蛋白質の回収は連続培養においては細胞増殖中に、
バッチ培養においては増殖期の終に行なうことができ
る。本発明の目的であるハイブリッドタンパクは培養上
清からその分子的特性と医薬的活性を念頭に置いた方法
により精製される。
本発明はこのような高分子を発現するベクターで形質
転換、トランスフェクト、あるいは感染された細胞に関
するとともに、ここに述べられたハイブリッド高分子を
治療、特にエイズの治療と予防に応用することにも関す
るものである。
以下に記載する実施例と図は本発明の特質と利点のい
くつかを示すものである。
実施例 一般的クローニング技術 プラスミドDNAのプレパラティブ抽出、塩化セシウム
勾配下におけるプラスミドDNAの遠心、アガロースおよ
びポリアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるDN
A断片の精製、フェノールまたはフェノール／クロロホ
ルムによるタンパク質の抽出、塩存在下エタノールまた
はイソプロパノールによるDNAの沈降、大腸菌の形質転
換等のような分子生物学の典型的方法については文献中
で豊富に記載されており〔マニアティスT.ら、“分子ク
ローニング，実験マニュアル",コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー，コールドスプリング・ハーバ
ー，ニューヨーク,1982年（Maniatis T.et al.,“Molec
ular Cloning,a Laboratory Manual",Cold Spring Harb
or Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1982）；オー
スベルF.M.ら（編集），“分子生物学における現プロト
コール",ジョン・ウィリー＆サンズ，ニューヨーク,198
7年（Ausubel F.M.et al.（eds），“Current Protocol
s in Molecular Biology",John Wiley ＆ Sons,New Yor
k,1987）〕、ここでは繰返さない。
制限酵素はニューイングランド・バイオラブス（バイ
オラブス）〔New England Biolabs（Biolabs）〕、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ（BRL）〔Bethesda Re
search Laboratories〕またはアマーシャム（Amersha
m）から供給され、製造業者の推奨法に従い用いられ
る。
プラスミドpBR322、pUC8、pUC19およびファージM13mp
8、M13mp18は市販品（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ）である。
結合のため、製造業者の推奨法に従いアガロース（通
常0.8％）またはポリアクリルアミド（通常10％）ゲル
でサイズにより分離し、電気溶出で精製し、フェノール
またはフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール
で沈降させ、しかる後DNA断片はT4DNAリガーゼ（バイオ
ラブス）在下でインキュベートする。
５′末端の補充は製造業者の推奨法に従い大腸菌DNA
ポリメラーゼＩのクレノウ断片（バイオラブス）を用い
て行う。３′突出末端の除去は製造業者から勧められる
ようにT4DNAポリメラーゼ（バイオラブス）存在下で行
う。５′突出末端の切断はS1ヌクレアーゼによる限定処
理で行う。
インビトロ部位特定変異誘発はアマーシャム製キット
を用いてテーラー（Taylor）ら〔ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、第13巻、19
85年、第8749−8764頁〕により開発された方法に従い行
う。
PCR法〔ポリメラーゼ触媒鎖反応、セイキR.K.（Saiki
R.K.）ら、サイエンス（Science）、第230巻、1985
年、第1350−1354年；ムリスK.B.（Mullis K.B.）およ
びファルーナF.A.（Faloona F.A.）、メソッズ・イン・
エンザイモロジー（Methods in Enzymology），第155
巻、1987年、第335−350頁〕によるDNA断片の酵素増幅
は製造業者の説明書に従い“DNA熱サイクラー”〔パー
キン・エルマー・シータス（Perkin Elmer Cetus）〕で
行う。
ヌクレオチド配列決定はサンガー（Sanger）ら〔プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンスUSA（Proceeding of National Academy of S
cience USA）、第74巻、1977年、第5463−5467頁〕によ
り開発された方法に従いアマーシャムキットを用いて行
う。
外来DNAによるK.ラクティス（K.lactis）の形質転換
およびK.ラクティスからのプラスミドDNAの精製につい
ては本明細書に記載されている。
他に指摘のない限り、用いられる細菌株は大腸菌MC10
60（lac IPOZYA,X74,gal U,gal K,str Ar）または大腸
菌TG1（lac,pro A,B,supE,thi,hsd D5/F'traD36,proA+B
+,lac Iq,lac Z,M15）である。
用いられたすべての酵母株は出芽酵母の一族で、特に
クルイベロミセス属の株である。これら酵母の例は本明
細書で示されている。K.ラクチスMW98−8C株（α,ura
A,arg,lys,K+,pKD1o）が多く用いられた。この株のサン
プルはバーン（Baarn）（オランダ）のセントラールビ
ュロー・ブール・シメルクルツレン（Centraalbureau v
oor Schimmelkulturen）（CBS）に1988年９月16日付で
登録No.CBS579.88として寄託された。
実施例1:HIV−１ウイルスのレセプターのV1V2ドメイン
を有するMst II/Hind III−Sma I制限断片の組立て V1V2ドメイン（V1およびV2はCD4分子の最初の２つの
Ｎ末端ドメインを表す）に相当するMst II−Sma I制限
断片を下記方法に従い酵素増幅（PCR）技術で作成し
た：多量のCD4レセプターを発現するリンパ芽球細胞系C
EM13をそのレセプターについてコードするメッセンジャ
ーRNA源として用いた。全RNAは元来カタラ（Cathala）
ら（DNA,第４巻,1983年，第329−335頁）により記載さ
れたようにグアニジウムチオシアネートによる抽出でこ
の系の細胞３×108から最初に精製し、しかる後この方
法で得られたRNA50μｇをアマーシャムキットおよびプ
ライマーとしてオリゴデオキシヌクレオチドXo127（第
１図）を用いる相補的DNA（cDNA）合成用のマトリック
スとして用いた。得られたcDNAは第１図で示されるよう
なオリゴデオキシヌクレオチドXo126およびXo127各１μ
ｇをプライマーとして用いハイブリッド形成温度62℃で
PCR技術による30サイクルの酵素増幅に付した。増幅さ
れた断片を予め脱リン酸化されたM13mp8のSma I部位に
直接組込んでクローニングし、ベクターM13/CD4を得
る。このベクターは、それ自体がCD4分子のV1V2ドメイ
ンを含むMst II−Sma I断片を生じることができる制限
断片Mst II−Sma Iを含む中間組み立て体であって、こ
の断片のヌクレオチド配列は第２図で示されている。
実施例2:プレプロHSA用発現カセットの組立て E.2.1.プレプロHSAをコードするプラスミドpXL869の組
立て プレプロHSAのATG翻訳開始コドンを含むプラスミドpX
L322〔ラッタM.（Latta M.）ら、バイオ／テクノロジー
（Bio/Technology）、第５巻、1987年、第1309−1314
頁〕のNde I部位を下記方法でオリゴデオキシヌクレオ
チド特定変異誘発によりHind III部位に変換した：プレ
プロHSA遺伝子の５′末端を有するpXL322のHind III−B
gl II断片をベクターM13mp18に組込んでクローニング
し、オリゴデオキシヌクレオチド （Hind III部位は下線がひかれ、プレプロHSAのATGコド
ンは太字で示されている）で変異誘発したが、この変異
誘発工程後に得られたファージはプラスミドpXL855であ
って、その制限地図は第３図で示されている。ヌクレオ
チド配列の確認後、プレプロHSAに関する完全コード配
列は変異誘発ファージの複製形から得られてプレプロHS
AのＮ末端領域についてコードするHind III−Pvu II断
片とHSAのＣ末端を有するプラスミドpXL322のPvu II−H
ind III断片との結合によって再組立てし、それによっ
て完全プレプロHSA遺伝子についてコードするHind III
断片を得た。このHind III断片はその3'末端に61bp非翻
訳領域も有しているが、プラスミドpUC8の対応部位に組
込んでクローニングし、プラスミドpXL869（第３図）を
得た。
E.2.2.S.セレビシアエのPGKプロモーターのコントロー
ル下で発現されるプレプロHSA用発現カセットの組立て プラスミドpYG12はS.セレビシアエのPGK遺伝子のプロ
モーター領域（1.5kb）およびターミネーター領域（0.4
kb）を有する1.9kb Sal I−BamH I制限断片を含んでい
る（第４図）。この断片はATG翻訳開始コドンとTAA翻訳
終結コドンの30コドン上流に位置するBgl II部位との間
の領域からなる構造遺伝子に相当する1.2kb断片が欠失
されたゲノムHind III断片〔メラーJ.（Mellor J.）
ら、ジーン（Gene）、第24巻、1983年、第１−14頁〕か
ら得られる。次いで1.9kb断片に隣接するHind III部位
を合成オリゴデオキシヌクレオチドで破壊し、各々PGK
遺伝子のプロモーター領域の上流および転写ターミネー
ターの下流に存在するSal IおよびBamH I部位で置き換
えた。次いで唯一のHind III部位をプロモーターおよび
ターミネーター領域の接合部で部位特定変異誘発により
導入したが、この唯一のHind III部位（太字で示され
る）に隣接する配列は下記のとおりである： プラスミドpYG208はプラスミドpYG12の唯一BamH I部
位への合成アダプター の挿入によって得られる中間組立て体であり、それによ
ってプラスミドpYG208はSal I制限断片の形でS.セレビ
シアエのPGK遺伝子のプロモーターおよびターミネータ
ーを取り出すことを可能にしている（第４図）。
プレプロHSAについてコードするHind III断片を電気
溶出でプラスミドpXL869から精製し、“適正な”向きで
（PGKプロモーターのすぐ下流にアルブミンプレプロ領
域のＮ末端を有する向きとして規定される）プラスミド
pYG208のHind III部位に組込んでクローニングし、プラ
スミドpYG210を得た。第４図で示されるように、プラス
ミドpYG210は発現カセット（PGKプロモーター／プレプ
ロHSA/PGKターミネーター）を有するSal I制限断片源で
ある。
E.2.3.発現カセットの最適化 高度発現遺伝子のATG翻訳開始コドンのすぐ上流に位
置するヌクレオチド配列はかかる高レベルの発現に適合
した構造的特徴を有する〔コザックM.（Kozak M.）、マ
イクロバイオロジカル・レビュー（Microbiological Re
view）、第47巻、1983年；第１−45頁；ハミルトンR.
（Hamilton R.）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、第15巻、1987年、第3581−3593頁〕。S.セレビシア
エのPGKプロモーターの−25位（ATG開始コドンを基準に
して）における部位特定変異誘発によるHind III部位の
導入は欧州特許出願第89/10480号明細書で記載されてい
る。
加えて、Hind III−BstE IIアダプターを形成するオ
リゴデオキシヌクレオチドSq451およびSq452の利用法は
同一文献で記載されており、PGK遺伝子のATG開始コドン
に先立つ21ヌクレオチドとそれに続くプレプロHSAにつ
いてコードする遺伝子から構成されるHind III制限断片
の作成を可能にする。かかる発現カセットのATGコドン
に先立つヌクレオチド配列は下記のとおりである（S.セ
レビシアエのPGKプロモーターに存在するヌクレオチド
配列には下線がひかれている）： 実施例3:プレプロHSAとCD4レセプターのV1V2ドメインと
の枠内融合 ハイブリッド分子プレプロHSA−V1V2の枠内組立てに
用いられるクローニング方法は第５〜９図で説明されて
いる。プラスミドpYG11はプレプロHSAについてコードす
るHind III断片がプラスミドpXL869から精製されプラス
ミドpYG12のHind III部位に組込まれてクローニングさ
れた中間組立て体である（第５図）。プラスミドpYG18
の組立ては第６図で示されているが、このプラスミドは
プラスミドpYG11から精製された発現カセット（PGKプロ
モーター／プレプロHSA/PGKターミネーター）について
コードするSal I−BamH I断片がプラスミドpIC20R〔マ
ーシュF.（Marsh F.）ら、ジーン、第32巻、1984年、第
481−485頁〕の対応部位に組込まれてクローニングされ
たものに相当する。
実施例１で記載したように得られたCD4レセプターのV
1V2ドメインを有するMst II−Sma I制限断片を同一酵素
で切断されたプラスミドpYG18に組込んでクローニング
し、組換えプラスミドpYG303を得たが、その制限地図は
第７図で示されている。したがって、プラスミドpYG303
は完全プレプロHSA遺伝子しかる後CD4レセプターのV1V2
ドメインの枠内融合に相当するHind III断片を有してお
り、第８図ではこの断片のヌクレオチド配列について示
している。次いでこの断片をプラスミドpYG208のHind I
II部位に組込んでクローニングし、プラスミドpYG208中
プレプロHSA−V1V2遺伝子についてコードするこの断片
を適正な向きで挿入することによりプラスミドpYG306を
得たが、その制限地図は第９図で示されている。プラス
ミドpYG306は発現カセット（PGKプロモーター／プレプ
ロHSA−V1V2/PGKターミネーター）を含むSal I制限断片
を含む。
実施例4:レプリコンpKD1由来安定クローニングベクター
の組立て E.4.1.プラスミドpKD1の単離および精製 プラスミドpKD1は下記プロトコールに従いK.ドロソフ
ィラルム（K.drosophilarum）株UCD51−130（カリフォ
ルニア州95616,デービスのカリフォルニア大学U.C.D.コ
レクション）から精製した:YPD培地（１％酵母エキス、
２％バクス−ペプトン、２％グルコース）中の１培養
物を遠心し、洗浄し、1.2Mソルビトール溶液に再懸濁
し、細胞をチモリアーゼ（300μg/m）、25mM EDTA、
50mMリン酸およびβ−メルカプトエタノール（１μg/m
）の存在下でスフェロプラストに変えた。1.2Mソルビ
トール溶液で洗浄後、原培養物250mに相当するスフェ
ロブラストを1.2Mソルビトール2.5mに再懸濁し、それ
に同容量の緩衝液（25mMトリスHCl、pH8.0;50mMグルコ
ース;10mM EDTA）を加えた。下記ステップは〔バーンボ
イムH.C.（Birnboim H.C.）およびドリーJ.C.（Doly J.
C.）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第７巻、19
79年、第1513−1523頁〕で既に記載されたアルカリ溶解
プロトコールに相当する。DNAを塩化セシウム勾配等密
度遠心で精製する。
E.4.2.プラスミドpCXJ1の組立て 中間組立て体pUC−URA3（第10図）は下記のようにプ
ラスミドpUC19の唯一のNar I部位に挿入されたS.セレビ
シアエのURA3遺伝子を有する1.1kb断片からなる:URA3遺
伝子についてコードするHind III断片をプラスミドpG63
のHind III切断で精製し〔ガーボードC.（Gerbaud C.）
ら、カレント・ゲネティクス（Current Genetics）、第
３巻、1981年、第173−180頁〕、その断片を大腸菌DNA
ポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理してブラント末端
を形成し、電気溶出で精製し、Nar Iで開裂されかつ大
腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理されたプ
ラスミドpUC19に挿入した。
プラスミドpCXJ1（第11図）は下記のようにpUC−URA3
の唯一のAat II部位に挿入されたプラスミドpKD1の完全
配列を有する：プラスミドpKD1をEcoR Iによる開裂で直
鎖化し、しかる後大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ
断片でブラント末端化させた。次いでこの断片をAat II
で切断されかつT4 DNAポリメラーゼでブラント末端化さ
れたプラスミドpUC−URA3と結合させた。ブラント末端
化Aat II部位にブラント末端化EcoR I断片が挿入される
と２つのEcoR I部位が再構成される。EcoR I部位は遺伝
子A,BおよびＣの外側並びにpKD1の逆方向反復の外側に
位置するため、EcoR I部位におけるプラスミドpKD1の直
鎖化はプラスミド安定性およびコピー数にとって必要な
いずれの遺伝子をも不活性化しないことに留意すべきで
ある。事実、プラスミドpCXJ1は高頻度でK.ラクチスura
A ciroを形質転換し、70〜100コピー／細胞に増幅さ
れ、選択圧力の非存在下安定な状態で維持される。プラ
スミドpUC−URA3で運搬される複製開始点のせいで、プ
ラスミドpCXJ1は大腸菌内でも複製することができ、こ
のため大腸菌とクルイベロミセス属のいくつかの酵母、
特にK.ラクチス、K.フラギリスおよびK.ドロソフィラル
ムとの間で特に有用なシャトルベクターを形成する。し
かしながら、クルイベロミセスの形質転換用ベクターと
してpCXJ1を用いることができるのは染色体uraA変異を
起している栄養素要求株に限定されたままである。
E.4.3.K.ラクチスのキラープラスミドのORF1とトランス
ポゾンTn903の細菌遺伝子aph〔3'〕−Ｉの産物との枠内
融合体の組立て プラスミドpKan707は野生型酵母で用いられるベクタ
ーとして組立てた。このプラスミドは酵母プロモーター
のコントロール下で発現される3'−アミノグリコシドホ
スホトランスフェラーゼ（APH）をコードする細菌トラ
ンスポゾンTn903のaph〔3'〕−Ｉ遺伝子をプラスミドpC
XJ1のSal Iへの挿入することによって得た。
第一ステップにおいて、aph〔3'〕−Ｉ遺伝子の細菌
転写シグナルを下記のようにK.ラクチスのキラープラス
ミドk1から単離されたPk1プロモーターで置き換えた：
プラスミドk1の1.5kb Sca I−Pst I断片をベクターpBR3
22の対応部位に組込んでクローニングし、プラスミドpK
1−PS1535−６を得た（第12図）。この1.5kb断片はプラ
スミドk1で運搬される第一オープン読取り枠（ORF1）の
5'領域および約220bp上流を有している〔ソーF.（Sor
F.）およびフクハラH.,カレント・ゲネティクス、第９
巻、1985年、第147−155頁〕。精製されたSca I−Pst I
断片は、Sca I部位がプラスミドk1の末端からわずか22
ヌクレオチドに位置するためおそらくORF1の完全プロモ
ーター領域を有しているであろう（ソーF.ら、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ、第11巻、1983年、第5037−
5044頁）。Dde IによるpK1−PS1535−６の切断で、Sca
I部位に近い方の末端にpBR322からの17bpおよびもう一
方の末端にORF1の最初の11コドンを含んだ266b断片を得
る。
プラスミドpUC−Kan1はTn903のaph〔3'〕−Ｉ遺伝子
を有する1.25kb EcoR I断片〔カナマイシン耐性遺伝子
ブロック（Kanamycin Resistance Gene Block TM）、フ
ァルマシア（Pharmacia）〕をプラスミドpUC19のEcoR I
部位に挿入することによって得られる中間組立て体であ
る（第13図）。プラスミドpK1−PS1535−６からの266bp
Dde I断片を大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片
で処理し、ポリアクリルアミドゲルにおける電気溶出で
精製し、しかる後S1ヌクレアーゼで処理してブラント末
端を形成させたプラスミドpUC−Kan1のXho I部位に挿入
し、プラスミドpUC−Kan202を得た（第13図）。このク
ローニング方法でプラスミドk1のORF1遺伝子とTn903のa
ph〔3'〕−Ｉ遺伝子のＮ末端との枠内融合耐を得る：そ
の融合でaph〔3'〕−Ｉ遺伝子産物の最初の11アミノ酸
はORF1の最初の11アミノ酸で置き換えられたが、このハ
イブリッド遺伝子の発現はK.ラクチスプロモーターのコ
ントロール下にある。融合タンパク質ORF1−APHの開始
コドン周囲のヌクレオチド配列は下記のとおりである
（ORF1に由来するコドンには下線がひいてあり、APHか
らの最初のコドンはイタリック体である）： E.4.4.K.ラクチスにおけるプラスミドpKan707の組立て
および安定性 プラスミドpCXJ1をHind IIIで開裂し、大腸菌DNAポリ
メラーゼＩのクレノウ断片で処理し、しかる後プラスミ
ドpUC−Kan202由来K.ラクチスPk1プロモーターのコント
ロール下で発現されるORF1−APH融合体についてコード
する1.2kbSac I−Hinc II断片と結合させた。得られた
プラスミド（pKan707、第14図）はK.ラクチス株でG418
〔ゲネチシン（Geneticin）、GIBCO、ニューヨーク州グ
ランドアイランド〕に対する非常に高レベルの耐性（＞
2.5g/）を付与し、レプリコンpKD1の機能的組込みの
おかげでK.ラクティス株ciroを形質転換することがで
き、70〜100コピー／細胞に増幅させることができ、選
択圧力の非存在下で安定的に維持することができる（第
15図）。この高安定性は、クルイベロミセスの産業用株
を形質転換しうる優性マーカーの存在と結びついて、プ
ラスミドpKan707をクルイベロミセス属酵母におけるタ
ンパク質発現の高性能ベクターとしている。
実施例5:発現プラスミドpYG221B（プレプロHSA）および
pYG308B（プレプロHSA−V1V2）の組立て S.セレビシアエのPGKプロモーターのコントロール下
で発現されるハイブリッドタンパク質プレプロHSA−V1V
2についてコードするSal I制限断片を対応酵素で切断さ
れたプラスミドpYG306から電気溶出で精製し、しかる後
プラスミドpKan707のSal I部位に組込んでクローニング
し、プラスミドpYG308AおよびpYG308Bを得たが、これら
はベクターpKan707に関するSal I断片の向きのみで区別
される。プラスミドpYG308Bの制限地図は第16図で示さ
れている。
プラスミドpYG221BはプレプロHSA単独をコードするコ
ントロール用組立て体である；このプラスミドはプラス
ミドpYG308B（プレプロHSA−V1V2）の場合と同様に組立
てた:PGKプロモーターのコントロール下で発現されるプ
レプロHSAをコードするSal I断片をプラスミドpYG210か
ら精製し、プラスミドpKan707のSal I部位に組込んでク
ローニングし、プラスミドpYG221Bを得た（第17図）。
プラスミドpYG221B（プレプロHSA）およびpYG308B（プ
レプロHSA−V1V2）はそのベクターに関して同一向きのS
al I発現カセットを有し、PGKターミネーターのすぐ上
流に位置するMst II−Hind III断片の差異を除いて厳密
には同遺伝子型である。プラスミドpYG221B（プレプロH
SA）中におけるMst II−Hind III断片のヌクレオチド配
列は下記のとおりである（プレプロHSA遺伝子に関する
翻訳停止コドンは太字である）： プラスミドpYG308BのMst II−Hind III断片のヌクレオ
チド配列は第２図で示されたMst II−Sma I断片の配列
中に含まれている。
実施例6:酵母の形質転換 クルイベロミセス属の酵母、特にK.ラクチス株MW98−
8Cの形質転換は下記のように全細胞を酢酸リチウムで処
理することにより行った〔イトーH.ら、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology、第1
53巻、1983年、第163−168頁〕。細胞をシェーカーフラ
スコ内のYPD培地50m中28℃で光学密度0.6〜0.8に達す
るまで増殖させ、次いでそれらを低速遠心で回収し、無
菌TE（pH7.4の10mMトリスHCl:1mM EDTA）で洗浄し、酢
酸リチウム（TE中0.1M）３〜4mに再懸濁して２×108
細胞/mの細胞密度とし、しかる後適度の攪拌下30℃で
１時間インキュベートした。得られたコンピテント細胞
懸濁液の一部0.1mを最終濃度35％のポリエチレングリ
コール〔PEG4000,シグマ（Sigma）〕およびDNA存在下30
℃で１時間インキュベートした。42℃で５分間の熱ショ
ック後、細胞を２回洗浄し、無菌水0.2mに再懸濁し、
YPD2m中28℃で16時間インキュベートし、プロモータ
ーPk1のコントロール下で発現されるORF1−APH融合タン
パク質の表現型発現を行わせた。得られた細胞懸濁液20
0μをYPD選択プレート（G418、200μg/m）上にぬり
広げた。プレートを28℃でインキュベートしたところ、
形質転換株は２〜３日間の増殖後に出現した。
実施例7:クルイベロミセス属酵母によるアルブミンおよ
びその変異体の分泌 G418を加えた栄養豊富培地上での選択後、組換えクロ
ーンをアルブミンの成熟形またはハイブリッドタンパク
質HSA−V1V2を分泌しうるそれらの能力に関して試験し
た。プラスミドpYG221B（プレプロHSA）またはpYG308B
（プレプロHSA−V1V2）で形質転換されたMW98−8C株に
相当するあるクローンを選択性液体豊栄養培地中28℃で
インキュベートした。培養上澄を細胞が定常期に達した
ときに遠心で調製し、20℃で30分間60％エタノール沈降
で濃縮した。上澄は8.5％ポリアクリルアミドゲルによ
る電気泳動後、ゲルの直接クマシーブルー染色（第18
図、パネルＡ）または一次抗体としてウサギポリクロー
ナル抗HSA血清（第18図、パネルＢ）もしくはウサギポ
リクローナル抗CD4血清（第18図、パネルＣ）を用いる
免疫ブロットのいずれかで試験した。免疫ブロット実験
の場合には、最初ニトロセルロースフィルターを特異的
ウサギ抗体の存在下でインキュベートし、しかる後数回
洗浄し、ビオチン処理ヤギ抗ウサギIg血清と共にインキ
ュベートし、しかる後ベクタスタイン（Vectastain）
〔フランス、コンピエーヌのバイオシスS.A.（Biosys
S.A.）〕製“ABC"キットを用いアビジン−ペルオキシダ
ーゼ錯体の存在下でインキュベートした。次いで免疫反
応をキット推奨法に従い過酸化水素水存在下ジアミノ−
3,3′−ベンジジンテトラクロリデート〔プロラボ（Pro
labo）〕の添加で行った。第18図で示された結果は、ハ
イブリッドタンパク質HSA−V1V2が抗HSA抗体および抗CD
4抗体の双方で認識されるが、一方HSAは抗HSA抗体での
み認識されることを立証している。
実施例8:分泌産物の精製および分子的特徴 プラスミドpYG221B（プレプロHSA）およびpYG308B
（プレプロHSA−V1V2）で形質転換されたK.ラクチス株M
W98−8Cの培養上澄のエタノール沈降後、ペレットをpH
8.0の50mMトリスHCl緩衝液に再溶解した。HSA−CD4およ
びHSAタンパク質をトリスアクリル−ブルー（Trisacryl
−Blue）（IBF）でのアフィニティクロマトグラフィー
により精製した。イオン交換クロマトグラフィーによる
追加精製も必要であれば行ってよい。溶出後、タンパク
質含有分画を合わせ、水に対して透析し、特徴付ける前
に凍結乾燥した。K.ラクチス株MW98−8Cで分泌されるハ
イブリッドタンパク質の配列決定〔アプライド・バイオ
システム（AppliedBiosystem）〕ではアルブミンの予想
Ｎ末端配列（Asp−Ala−His・・・）を示したが、これ
はタンパク質の適正な成熟を立証している。
等電点はHSA−V1V2タンパク質の場合5.5およびHSAの
場合4.8であることが等電点電気泳動で測定された。
HSA−V1V2タンパク質はヒトCD4に対するモノクローナ
ルマウス抗体OKT4AおよびLeu3A並びにポリクローナル抗
HSA血清（第19図）で認識され、ELISA法（酵素結合免疫
ソルベントアッセイ、第20図）で試験することができ
る。これら２実験で用いられるペルオキシダーゼ用基質
は2,2′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−
６−スルホン酸）二アンモニウム塩（ABTS）〔スイスの
フルカ（Fluka）〕である。
実施例9:HSA−CD4変異体の抗ウイルス性の特徴 実施例７および８のようにプラスミドpYG221B（プレ
プロHSA）およびpYG308B（プレプロHSA−V1V2）で各々
形質転換されたK.ラクチス株MW98−8Cの培養上澄から精
製されたHSA−V1V2融合体およびアルブミン（陰性コン
トロール）に相当するタンパク質をインビトロで抗ウイ
ルス活性について試験し、CHO（チャイニーズハムスタ
ー卵巣）細胞から精製された完全可溶性CD4分子と比較
した。タンパク質濃度はモル濃度で表し、ポリアクリル
アミドゲル中の電気泳動移動しかる後硝酸銀染色の後に
おける各タンパク質の連続希釈倍率の比較および溶液中
でタンパク質を測定する方法の双方で測定した。
第21図は、HSA−V1V2融合体が可溶相中におけるCD4レ
セプターへのウイルス糖タンパク質gp160（gp120の非開
裂前駆体）の結合をインビトロで阻害しうることを示し
ている。この実験では、ELISAプレートを精製された組
換えCD4で覆い、様々な量のCD4、アルブミンまたはハイ
ブリッドタンパク質HSA−V1V2と共にプレインキュベー
トされた組換えgp160（125fmol）と一緒にインキュベー
トした。次いでCD4へのgp160の残留結合をマウスモノク
ローナル抗gp160（110.4）の連続添加しかる後ペルオキ
シダーゼに結合されたマウス抗体に対するヤギ血清の結
合によって行った。過酸化水素水存在下における発色性
基質（オルトフェニルジアレニン）の添加後、光学密度
を492nmで測定した。第21図で報告された結果は、ハイ
ブリッドタンパク質HSA−V1V2で完全CD4分子に相当する
陽性コントロールとは区別しえない程度に可溶相中でCD
4へのgp160の結合を阻害しうることを立証している。逆
に、アルブミン分子はこの点でほぼ完全に不活性であ
る。この実験では、ハイブリッドタンパク質による阻害
が完全CD4レセプターに類似したコンホメーションおよ
びアクセシビリティを有するV1V2ドメインの存在に起因
することを示している。
第22図は、HSA−V1V2ハイブリッドがCD4レセプターを
膜上に発現した細胞におけるHIV−１ウイルスの結合を
インビトロで阻害しうることを示している。この実験に
おいて、多量のCD4レセプターを発現する細胞系（リン
パ芽球細胞系CEM13）をHSA−V1V2（10.7μｇ）、HSA
（7.5μｇ）またはCHO細胞から精製された組換え完全CD
4（５μｇ）116pmolと共にプレインキュベートされた熱
不活性化ウイルス粒子２μｇと一緒にインキュベートし
た。細胞膜への不活性化ウイルス粒子の結合はマウスモ
ノクローナル抗gp120抗体およびフィコエリトリンで標
識されたヤギ抗マウスIgG血清の連続インキュベートに
より示された。陰性コントロールはこれら２抗体と共に
連続的にインキュベートされた細胞系CEM13に相当す
る。ケイ光は細胞選別機で測定し（第22図、パネル
Ａ）、結果は柱状グラフの形で示されている（第22図、
パネルＢ）。この実験では、HSA−V1V2タンパク質がCEM
13細胞へのHIV−１ウイルスの結合をほぼ完全に阻害し
うることを示している。更に、この阻害は完全CD4分子
の場合よりもやや高いが、これはその付着性について知
られるアルブミンが標的細胞へのウイルスの結合を非特
異的かつ低効率で阻害しうるという事実から説明するこ
とができる。
HSA−CD4タンパク質は細胞培養で許容細胞のウイルス
感染も阻害することができる。この阻害はキットELAVIA
−AG1〔ジアグノスチクス・パスツール（Diagnostics P
asteur）〕またはキットp24−ELISA〔デュポン（Dupon
t）〕を用いてウイルス抗原（ウイルスp24）の産生に関
し調べるかあるいはシュワルツ（Schwartz）ら〔エイズ
・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルシス
（Aids Research and Human Retroviruses）、第４巻、
1988年、第441−448頁〕の技術で逆転写酵素活性を調べ
ることにより測定した。実験プロトコールは下記のとお
りであった：最終濃度Ｘの対象産物を全容量1mの培地
（10％牛胎児血清、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニ
シリン−ストレプトマイシン−ネオマイシン含有RPMI16
40）中で、ウイルスHIV−１の単離株LAV−Bru1で感染さ
れたCEM13細胞の上清（1/250、1/2500および1/25000希
釈）と共に最初プレインキュベートした。次いで混合物
を５×105許容細胞（例えば、MT2、CEM13またはH9）の
ペレット上に移し、感染が起きるよう37℃で２時間管内
でインキュベートした。感染は完全培地100μ中104細
胞／ウェルで微量滴定プレート上でも行わせることもで
きた。試験すべき産物と共にプレインキュベートされた
容量100μのウイルスしかる後５×濃度で産物50μ
を加えた。次いで細胞をRPMI1640 5mで２回洗浄し、
2.5×105細胞/mの密度で培地に再懸濁した。次いでこ
の懸濁物100μを既に２×濃度で産物100μを含有す
る微量滴定プレートの各ウェルに分配し、プレートを５
％CO2含有湿気雰囲気下37℃でインキュベートした。異
なる日（３、４、６、８、10、12、14、16、19、21およ
び25日目）に上澄100μを取出し、p24ウイルス産生お
よび逆転写酵素活性について調べた。次いで細胞を前記
のように再懸濁し、細胞生死判別試験（MTT）用に微量
滴定プレート上に分配した。原プレートに残った50μ
に濃度Ｘで試験すべき産物を含有した培地200μを加
え、次のサンプリングまで感染を進行させた。細胞生死
判別試験のため0.2μｍフィルターで濾過された5mg/m
のMTT10μを各ウェルに加え、プレートを５％CO2含有
湿気雰囲気下37℃で４時間インキュベートした。次いで
各ウェルにイソプロパノール/0.04N HCl混合物150μ
を加え、ホルマザン結晶を再懸濁させた。520〜570nmに
おける光学密度をタイターテック（Titertek）プレート
リーダーで測定したが、この測定値は細胞生死を反映し
ている（シュワルツら、エイズ・リサーチ・アンド・ヒ
ューマン・レトロウイルシス、第４巻、1988年、第441
〜448頁）。
第23図は逆転写酵素活性で測定されるような細胞培養
物（細胞系CEM13）における感染力の阻害例について示
している。これはHSA−V1V2ハイブリッドが可溶性CD4分
子と同程度にHIV−１ウイルスの感染力を低下させうる
ことを立証している。
実施例10:インビボにおけるハイブリッドタンパク質の
安定性 第一世代可溶性CD4はウサギで20分間の半減期を有す
ることが示された〔キャポンD.J.（Capon D.J.）ら、ネ
ーチャー、第337巻、1989年、第525−531頁〕。したが
って、我々はHSA−CD4ハイブリッドのウサギにおける半
減期を酵母から産生されかつHSA−CD4と同様の方法で精
製された組換えHSAおよび可溶性CD4と比較した。これら
の実験では、少なくとも２匹の体重2.5〜2.8kgの雄性NZ
W（Hy/Cr）ウサギを各産物について用いた。ウサギを温
度18.5〜20.5℃および湿度45〜65％に維持された13時間
光／日の室内で飼育した。各産物は耳の末端静脈から10
秒間にわたる１回の注入で投与した。同モル量の各産
物、即ち生理血清1m中CD4 250μg/ウサギ、HSA400μ
g/ウサギまたはHSA−CD4 500μg/ウサギを注入した。
血液サンプル３〜4mを採取し、ヘパリンリチウムと混
合し、3500rpmで15分間遠心し、次いでサンプルを３分
割し、−20℃で急速凍結し、しかる後ELISA法で試験し
た。CD4が注入されたウサギからは血液サンプルを注入
前（To）、しかる後注入後５分間、10分間、20分間、30
分間、１時間、２時間、４時間および８時間目に採取し
た。HSA−CD4またはHSAが注入されたウサギからは血液
サンプルを注入前To、注入後30分間、１時間、２時間、
４時間、８時間、24時間、32時間、48時間、56時間、72
時間、80時間、96時間、104時間および168時間目に採取
した。
CD4分子のアッセイはHSA−CD4ハイブリッドタンパク
質で予め覆われたダイナテック（Dynatech）M129B微量
滴定プレート上で行った。次いでCD4または試験すべき
サンプルの濃度を増加させながらマウスモノクローナル
抗体OKT4A〔オルト−ジアグノスティック（Ortho−Diag
nostic）、1/1000希釈〕の存在下で加え、プレートのイ
ンキュベートおよび洗浄後、抗体OKT4Aの残留結合はベ
ルオキシダーゼに結合されたマウスIgGに対する抗体
〔ノルジック（Nordic）、1/1000希釈〕の添加により示
された。測定はペルオキシダーゼ基質AB＋Ｓ（フルカ）
の存在下OD405nmで行う。
組換えHSAのアッセイは抗HSA血清（シグマRef.AO65
9、1/1000希釈）で予め覆われたダイナテックM129B微量
滴定プレート上で行った:HSAまたは測定すべきサンプル
に関し濃度を増加させながら加え、しかる後ペルオキシ
ダーゼに結合された抗HSA血清（ノルジック、1/1000希
釈）を加えた。測定は前記のようにOD405nmで行った。
２つの異なるアッセイ、即ち組換えHSAの場合と同様
の方法を用いるHSA部分単独に関するアッセイまたはCD4
部分に関するアッセイと合わせたHSA部分に関するアッ
セイのいずれかをHSA−CD4ハイブリッドについて行っ
た。後者のケースでは、微量滴定プレートを最初抗HSA
血清（シグマRef.AO659、1/1000希釈）で覆い、しかる
後試験すべきサンプルと共にインキュベートした。次い
でCD4に対するマウスモノクローナル抗体Leu3Aしかる後
ペルオキシダーゼに結合されたマウス抗体に対する抗体
（ノルジック、1/1000希釈）を加えた。測定は前記のよ
うに405nmで行った。
これらアッセイの各々に関する曲線は第24図で示され
ている。これら結果の解釈からウサギにおける各産物の
薬物動態学的特徴について評価しうる。各産物に関して
測定された半減期は下記のとおりである： CD4 :0.25±0.1h HSA :47±6h HSA−CD4:34±4h これらの結果は下記点について強調している： 1/ アルブミンへのCD4のカップリングは、排出半減期
が140倍高まることから生物中でCD4の安定性に関し有意
の増加を示す。
2/ HSA−CD4ハイブリッドの排出半減期はHSAの場合に
匹敵する。
3/ CD4のクリアランスは約3m/min/kgであり、一方HS
AおよびHSA−CD4の場合は約0.02m/min/kgである。
4/ CD4に関するアッセイではgp120の結合部位に近いエ
ピトープを認識するLeu3Aモノクローナル抗体を用いる
ことから、HSA−CD4ハイブリッドのCD4部分は明らかに
活性コンホメーションを留めている（即ち、gp120と結
合しうる）〔サテントゥQ.J.（Sattentau Q.J.）ら、サ
イエンス、第234巻、1986年、第1120−1123頁；ピータ
ーソンA.（Peterson A.）およびシードB.（Seed B.）、
セル、第54巻、1988年、第65−72頁〕。更にHSA−CD4ハ
イブリッドに関する２つの独立したアッセイ法では本質
的に同様の結果を示したが、これはCD4部分がインビボ
で優先的に分解されないことを示唆している。
HSAおよびHSA−CD4の分布容量は血液区画の場合に近
く、したがってその産物の分布が細胞外区画に限られて
いることを示唆していることは注目すべきである。
実施例11:タイプHSA−CD4の全体的組立て E.11.1. HSAのプレプロ領域の末端におけるAha IIおよ
びBgl II部位の導入 Aha II制限部位の導入はプラスミドpYG232およびオリ
ゴデオキシヌクレオチドSq1187を用いて部位特異的変異
誘発により行い、プラスミドpYG364を得た。プラスミド
pYG232はプレプロHSAについてコードするHind III断片
をベクターM13mp9に組込んでクローニングすることによ
り得た。オリゴデオキシヌクレオチドSq1187の配列は下
記のとおりである（Aha II部位は太字である）： Aha II部位の形成で成熟HSAのＮ末端のタンパク質配列
を修飾しないことに留意すべきである。プラスミドpYG3
64の組立て方は第25図で示されている。
プラスミドpYG233はオリゴデオキシヌクレオチドSq64
8を用いたプラスミドpYG232の部位特異的変異誘発後に
同様の方法で得られた（HSAのプレプロ領域の末端に位
置するアミノ酸対Arg−Argについて特定するコドンは太
字であり、Bgl II部位には下線がひいてある）： この制限部位の形成でHSAのプレプロ領域のタンパク質
配列を変えることはない。逆に、成熟タンパク質の最初
のアミノ酸はアスパラギン酸からセリンに変わり、した
がってプラスミドpYG233はそのＮ末端で修正された成熟
HSAについてコードしている（HSA＊、第25図）。
E.11.2.CD 4レセプターの上流におけるHSAのプレプロ領
域の導入 CD4レセプターのV1V2ドメインの上流におけるHSAのプ
レプロ領域の導入を部位特異的変異誘発により行い、第
26および27図で示されるプラスミドpYG347を得た。プラ
スミドpYG231（第26図）はHSAに関する発現カセット
（S.セレビシエの酵母プロモーター／プレプロHSA/PGK
ターミネーター）を有するSal I断片が組込まれてクロ
ーニングされたpUCタイプレプリコンに相当する中間組
立て体である。プラスミドpYG234はプラスミドpYG231と
同遺伝子型であるが、但しオリゴデオキシヌクレオチド
Sq648がインビトロ変異誘発を行うために用いられた
（E.11.1.）。
プラスミドpYG347はオリゴデオキシヌクレオチドSq10
92によるプラスミドpYG332の部位特異的変異誘発で得た
が（第27図）、その配列は下記のとおりである（HSA配
列はイタリック体であり、CD4配列は太字である： したがって、プラスミドpYG347はS.セレビシアエのPG
K遺伝子のATGコドンに先立つ21ヌクレオチド、ATG翻訳
開始コドン、およびHSAのプレプロ領域（LPHSA）すぐ後
のCD4レセプターのV1V2ドメインから構成されるHind II
I断片を有している。
E.11.3. CD4レセプターのV1ドメインの末端におけるAha
II部位の導入 CD4レセプターのV1ドメインの末端におけるAha II部
位の導入はオリゴデオキシヌクレオチドSq1185およびプ
ラスミドpYG347の誘導体を用いて部位特異的変異誘発に
より行い（pYG368、第28図）、プラスミドpYG362を得
た。オリゴデオキシヌクレオチドSq1185の配列は下記の
とおりである（Aha II部位は太字で示されている）： したがって、プラスミドpYG362は実施例E.11.2.に従
いS.セレビシアエのPGK遺伝子のATGコドンに先立つ21ヌ
クレオチドしかる後CD4レセプターのV1ドメインに融合
されたHSAプレプロ領域のコード配列から構成されるHin
d III−Aha II断片を有している。ここで示された実施
例のような融合でCD4レセプターのV1ドメインは106アミ
ノ酸を有し、HIV−１ウイルス糖タンパク質gp120の機能
的結合部位を含んでいる。
E.11.4. CD4レセプターのV2ドメインの末端におけるAha
II部位の導入 CD4レセプターのV2ドメインの末端におけるAha II部
位の導入はオリゴデオキシヌクレオチドSq1186およびプ
ラスミドpYG368を用いて部位特異的変異誘発により行
い、プラスミドpYG363得た（第28図）。オリゴデオキシ
ヌクレオチドSq1186の配列は下記のとおりである（Aha
II部位は太字で示されている）： したがって、プラスミドpYG363はS.セレビシアエのPGK
遺伝子のATGコドンに先立つ21ヌクレオチドしかる後CD4
レセプターのV1V2ドメインに融合されたHSAプレプロ領
域に関するコード配列から構成されるHind III−Aha II
断片を有している。この特定融合で、V1V2ドメインは17
9アミノ酸を含んでいる。
プラスミドpYG363の他の変異体はCD4レセプターのV2
ドメインにおいて異なる位置でAha IIを導入するため部
位特異的変異誘発により得た。特に第28図で示されたプ
ラスミドpYG511はV2ドメインの166−167位置にアミノ酸
対Lys−Lysを有さないが、これは用いられた下記オリゴ
デオキシヌクレオチドSq1252に起因する（Aha II部位は
太字で示されている）： E.11.5.タイプV1−HSAの全体的組立て 前記実施例で記載されたプラスミドから（HSAのシグ
ナル配列に融合された）HIV−１ウイルスのレセプター
がHSAの前に位置するハイブリッドタンパク質について
コードしたHind III制限断片を形成することができる。
例えば、プラスミドpYG362およびpYG364は各々Hind III
−Aha II断片（CD4レセプターのV1ドメインへのHSAプレ
プロ領域の融合）およびAha II−Nco I断片（実施例E.1
1.1.のように得られた成熟HSAのＮ末端領域）の供給源
である。Hind IIIおよびKpn Iで切断されたプラスミドp
YG18のアナログ中におけるこれらの断片とNco I−Kpn I
断片（HSAのＣ末端領域およびS.セレビシアエのPGK遺伝
子のターミネーター）との結合で、その構造が第29図に
示されたプラスミドpYG371を得る。このプラスミドにお
いて、HSAプレプロ領域に融合されたハイブリッドタン
パク質V1−HSAについてコードする遺伝子は酵母中で機
能性の発現カセットに組込んでクローニングする。次い
でこのカセットは酵母中で選択されうる複製ベクター、
例えばベクターpKan707に組込んでクローニングするこ
とができ、発現プラスミドpYG373Bを形成する（第30
図）。
E.11.6.タイプV1V2−HSAの全体的組立て タイプV1V2−HSAのハイブリッドタンパク質は下記方
法で得た：第一ステップにおいて、プラスミドpYG511
（第28図）およびpYG374（第29図）は各々制限断片Bgl
II−Aha II（HSAプレプロ領域およびCD4レセプターのV1
V2ドメインの融合）およびAha II−Kpn I（E.12.2.で例
示されるような成熟HSAおよびCD4レセプターのV1V2ドメ
インの枠内融合）の供給源であった。pBluescript II S
K（＋）ベクターのクロラムフェニコール耐性誘導体
〔プラスミドpSCBK（＋）、ストラタジェン（Stratagen
e）〕中におけるこれら断片の結合でプラスミドpYG537
を得る（第31図）。このプラスミドはE.11.2.で例示さ
れるようにHSAのシグナルペプチドと枠内で融合された
ハイブリッド二価分子CD4−HSA−CD4についてコードす
るHind III断片を含んでいる。次いでHSAのプレプロ領
域と枠内で融合されたハイブリッドタンパク質V1V2−HS
AについてコードするHind III断片を含むプラスミドpYG
547をプラスミドpYG371のPst I−Kpn I断片によるpYG53
7のPst I−Kpn I断片の置き換えによって誘導した。プ
ラスミドpYG547に存在するHind III断片は例えばクルイ
ベロミセス属酵母内で複製するベクター中でクローニン
グされる機能性酵母プロモーターのコントロール下で発
現させることができる。一例は発現プラスミドpYG560で
あって、その構造および制限地図は第32図で示されてい
る。この具体例で用いられるベクターpYG105は、Hind I
II部位が部位特異的変異誘発（オリゴデオキシヌクレオ
チドSq1053、 で破壊されかつURA3遺伝子についてコードするSal I−S
ac I断片がプロモーター、ターミネーターおよび唯一の
Hind III部位からなるカセットを有するSal I−Sac I断
片で置き換えられたプラスミドpKan707に相当する。
実施例12:二価ハイブリッドタンパク質複合体 E.12.1. CD4レセプターのV1ドメインの下流における停
止コドンの導入 慣用的技術によればHIV−１ウイルス糖タンパク質gp1
20の結合に関与するCD4レセプターのドメインの下流に
おいて翻訳停止コドンの導入が可能である。例えば、す
ぐ後にHind III部位のあるTAAコドンはCD4レセプターの
V1ドメインの下流に部位特異的変異誘発で導入された。
特に、TAAコドンはオリゴデオキシヌクレオチドSq1034
およびマトリックスとしてプラスミドM13−CD4に類似し
たプラスミドを用いCD4レセプターの106位におけるアミ
ノ酸（Thr106）の直後におかれた。オリゴデオキシヌク
レオチドSq1034の配列は下記のとおりである（停止コド
ンおよびHind III部位は太字である）： E.12.2.タイプCD4−HSA−CD4の組立て タイプCD4−HSAの全体的組立てについて例示する実施
例E.11.5.およびE.11.6.で記載されたプラスミドからタ
イプCD4−HSA−CD4の二価組立て体を容易に形成するこ
とができる。プラスミドpYG374（V1−HSA−V1V2）また
はpYG375（V1−HSA−V1）はこれら全体的組立て体の２
つについて示している：例えば、HSAの最後のアミノ酸
についてコードするプラスミドpYG371の小さなMst II−
Hind III断片はCD4レセプターのV1V2ドメイン（プラス
ミドpYG374、第29図）またはV1ドメイン単独（プラスミ
ドpYG375、第29図）に融合されたHSAの最後の３アミノ
酸についてコードするMst II−Hind III断片で置き換え
ることができる。このような二価ハイブリッドタンパク
質についてコードする遺伝子は例えばクルイベロミセス
属の酵母内で複製する機能性酵母プロモーターのコント
ロール下で発現させることができる。このような発現プ
ラスミドの例は、厳密にはプラスミドpYG373B（V1−HS
A）と同遺伝子型であるが但し構造遺伝子がHind III断
片中でコードされているプラスミドpYG380B（V1−HSA−
V1V2）およびpYG381B（V1−HSA−V1）である。ここで記
載された二価ハイブリッドタンパク質はそれらの一価相
当物に匹敵するレベルで発現されるが、これはインビボ
で遺伝子組換えに起因する反復配列の組換えが非常に弱
いレベルであることを示している（第33図）。
タイプV1V2−HSA−V1V2の二価ハイブリッドタンパク
質についてコードするHind III断片の組立ては既に第31
図（プラスミドpYG537）で記載されている。タイプCD4
−HSA−CD4のかかる二価ハイブリッドタンパク質につい
てコードする遺伝子は例えばクルイベロミセス属の酵母
内で複製するベクター中の機能性酵母プロモーターのコ
ントロール下で発現させることができる。このような発
現プラスミドは第32図で記載された方法（プラスミドpY
G560に類似したプラスミドに組込まれたHind III断片の
クローニング）によって得られる。
E.12.3.二量化ドメインの導入 アルブミンから誘導されかつHIV−１ウイルス用に１
または数個の結合部位を有する所定ハイブリッドタンパ
ク質の場合には、捕捉されたウイルス粒子を凝集させう
る二量化機能をもったポリペプチドを含有させることが
望ましい。かかる二量化機能の例はある転写調節タンパ
ク質（JUN,FOS・・・）中に存在する“ロイシン・ジッ
パー（Leucine Zipper）（LZ）ドメインである。特に、
PCR技術により下記オリゴデオキシヌクレオチドおよび
マトリックスとしてプラスミドpTS301〔細菌タンパク質
LexAおよびJUNのLZ間の枠内融合についてコードする;T.
シュミッツ（T.Schmidt）およびM.シュナー（M.Schna
r）、未公表結果〕を用いることで例えばJUNのLZについ
てコードするBgl II−Aha II断片を得ることができる
（Bgl IIおよびAha II部位には下線がひいてある）： このBgl II−Aha II断片（第34図）は実施例E.11の１
つで示されるAha II−Hind III断片およびプラスミドpY
G233のHind III−Bgl II断片（HSAプレプロ領域、第25
図）に結合させることができ、HSAのシグナル配列に融
合されたタイプLZ−HSA−CD4のハイブリッドタンパク質
についてコードするHind III断片を得る。酵母分泌経路
の遷移過程でこれらの分子について可能な二量化を防止
するためには、ホモダイマーを形成しえないLZドメイン
を利用することが望ましい。このケースではFOSの“ロ
イシン・ジッパー”が好ましく、その場合に二量化はこ
れらのタンパク質がJUNのLZを有する他のハイブリッド
タンパク質の存在下におかれたときに生じるであろう。
タイプLZ−CD4−HSAまたはLZ−CD4−HSA−CD4のハイ
ブリッドタンパク質についてコードする遺伝子を組立て
うるよう慎重に選択された制限部位の導入も慣用的イン
ビトロ変異誘発技術またはPCRを用いると可能である。
実施例13:CD4およびHSA部分間におけるヒンジ領域の遺
伝子工学 E.13.1.Bal31エキソヌクレアーゼを用いる方法 CD4部分がHSAの天然Mst II部位におけるMst II−Hind
III断片上に位置したHSA−CD4ハイブリッドタンパク質
に関する発現プラスミド（例えば、プラスミドpYG308
B）で形質転換されたMW98−8C株から分泌されたタンパ
ク質を分析した。第35図はアルブミン標準と同時移動す
る少なくとも２種の開裂産物の存在について示している
が（パネル２）、これらは成熟HSA N末端配列を有して
おり、ヒトCD4に対するポリクローナル抗体を用いた場
合に検出されない（パネル２および３）。これらの開裂
産物は酵母分泌経路の遷移中に、おそらくK.ラクチスの
KEX1酵素〔その遺伝子がクローニングされかつ配列決定
されたS.セレビシアエのエンドプロテアーゼYAP3と類似
した特異性のある他のプロテアーゼ（イーゲル・ミタニ
M.（Egel−Mitani M.）ら、イースト、第６巻、1990
年、第127−137頁）〕によって形成されることが示され
ている。したがって、HSAおよびCD4部分間におけるヒン
ジ領域のペプチド環境は下記方法に従い様々な鎖長のHS
A N末端領域へのCD4分子（またはHIV−１のgp120タンパ
ク質を結合することができるその変異体の１つ）の融合
によって特に修飾された：プラスミドpYG400はHind III
断片上におけるATGコドン上流のヌクレオチド配列に関
して最適化されたプレプロHSA遺伝子を有する中間プラ
スミドである。このプラスミドをその唯一のMst II部位
で直鎖化し、Bal31エキソヌクレアーゼで部分的に切断
した。この酵素の不活性化後、反応混合物を大腸菌DNA
ポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、しかる後共に
BamH I部位前にMst II部位を有した合成アダプターを形
成する等モル混合物のオリゴデオキシヌクレオチドSq14
62（５′−GATCCCCTAAGG−３′）およびSq1463（５′−
CCTTAGGG−３′）の存在下で結合に付した。結合後、反
応混合物をHind IIIおよびBamH Iで切断し、サイズ0.7
〜2.0kbの断片を電気溶出で分離し、同一酵素で切断さ
れたM13mp19ベクターに組込んでクローニングした。そ
の約1/3がIPTGおよびXGALの存在下で青色を示す106溶解
プラークをこうして得た。次いで青色のファージクロー
ンを配列決定したが、ほとんどの場合においてHSA N末
端部分およびβ−ガラクトシダーゼ間で枠内融合を有し
ていた。したがってこれらの複合遺伝子はHSAのＮ末端
部分を有するHind III−Mst II断片を含んでいる。第36
図はHSAのＣ末端2/3におけるいくつかの例について示し
ている。次いでこれらの断片をCD4部分（例えば、第２
図のV1V2ドメインまたはV1ドメイン単独）に相当するMs
t II−Hind III断片と結合させ、HSA部分が様々な鎖長
であるタイプHSA−CD4のハイブリッドタンパク質につい
てコードするHind III断片を得た。次いでこれらの制限
断片を酵母プロモーターおよびターミネーターをもつ発
現カセットに適正な向きで組込んでクローニングし、ア
センブリーを酵母内に導入した。培養物の増殖後、ハイ
ブリッドタンパク質HSA−CD4は培地中で得ることがで
き、これらのうちあるハイブリッドはヒンジ領域におい
てタンパク質分解開裂に対し高耐性を有している（第35
図）。
E.13.2.二塩基性アミノ酸対の変異 二塩基性アミノ酸対に特異的なエンドプロテアーゼに
よる開裂を防止するもう１つの方法はHSAおよびCD4部分
間のヒンジ領域の範囲（第37図）またはCD4およびHSA間
のヒンジ領域の範囲においてこれらの部位を抑制するこ
とである。例えば、プラスミドpYG308Bでコードされる
ハイブリッドタンパク質HSA−V1V2中に存在するヒンジ
領域は第37図（パネル１）で示されており、HSAのＣ末
端におけるLys−Lys対およびCD4のV1ドメインのＮ末端
における２つのかかる対の存在について示している。部
位特異的変異誘発を用いた場合には、これらの潜在的エ
ンドプロテアーゼ開裂部位は例えばマトリックスとして
プラスミドM13−ompA−CD4並びに下記オリゴデオキシヌ
クレオチドSq1090およびSq1091（グルタミンについて特
定するコドンは太字である）を用いて各対の第二リジン
をグルタミンに変換することにより抑制しうる〔リスラ
ーJ.L.（Risler J.L.）ら、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー、第204巻、1988年、第1019−102
9頁〕： プラスミドM13−ompA−CD4はPCRでV1ドメインの上流
のPCRによって形成されたMst II部位を用いて、大腸菌
のompA遺伝子のシグナル配列がCD4レセプターに枠内で
融合されたプラスミドM13−CD4の誘導体である（実施例
１）。
E.13.3.合成ヒンジ領域の導入 HSAに融合されたCD4部分とHIV−１ウイルスのgp120タ
ンパク質との最適相互作用を促進させるためには、ハイ
ブリッドタンパク質HSA−CD4の構築ブロックを形成する
２つのタンパク質部分に正確な間隔をあけることが望ま
しい。例えば、成熟HSAのアミノ酸572から582の間に部
位特異的変異誘発でトロポニンＣの断片を導入してHSA
及びCD4部分の間に合成ヒンジ領域を形成することがで
きる（第37図、パネル３）。この具体例において、結合
ペプチドはマトリックスとして組換えM13ファージ（HSA
のＣ末端部分およびCD4レセプターのＣ末端部分間の枠
内融合についてコードするPst I−Sac I断片を有する）
および下記オリゴデオキシヌクレオチドSq 1445を用い
て部位特定変異誘発により導入した： 同様の技術によってもHSAおよびCD4部分間におけるこ
のような合成ヒンジ領域の導入が可能である（結合ペプ
チド、第38図、パネル３）。
実施例14:異なるプロモーターのコントロール下におけ
るハイブリッドタンパク質の発現 高レベルで細胞から分泌される所定タンパク質に関し
ては、発現レベルが細胞生存と適合しない閾値が存在す
る。したがって、分泌タンパク質、その発現をコントロ
ールするために用いられるプロモーターおよび遺伝子バ
ックグラウンドの最も効率的かつ最も安価な産生用に最
適なある組合せが存在する。このため、様々なプロモー
ターのコントロール下で本発明の目的であるハイブリッ
ドタンパク質を発現しうることが重要である。これらの
タンパク質についてコードする複合遺伝子は、酵母内で
複製するベクターの機能性発現カセットのHind III部位
に適正な向きで組込んでクローニングすることができる
Hind III制限断片上に通常存在している。発現カセット
は望ましい発現レベルに応じてハイブリッドタンパク質
の構造的または調節された発現をさせるプロモーターを
含むことができる。これらの特徴をもつプラスミドの例
としてはプラスミドpYG105（K.ラクチスのLAC4プロモー
ター、第32図）、プラスミドpYG106（S.セレビシアエの
PGKプロモーター）またはプラスミドpYG536（S.セレビ
シアエのPHO5プロモーター）等がある。加えて、強く調
節されるプロモーターのUAS領域が加えられたハイブリ
ッドプロモーター、例えばプラスミドpYG44（PGK/LACハ
イブリッド、欧州特許出願第89/10480号）、PGK373B（P
GK/GALハイブリッド）、pYG258（PHO5/LACハイブリッ
ド）等も使用可能である。
【図面の簡単な説明】
図中に示されたプラスミドの模式図は一定尺度で描かれ
てはいない。構築に必要な制限酵素切断部位のみを示し
てある。 図1:Mst IIおよびHind III−Sma I切断部位を創製する
ために用いられたオリゴヌクレオチド、それぞれCD4分
子のV1V2ドメインの上流と下流に位置する。 図2:Mst II−Sma I制限断片のヌクレオチド配列でCD4の
HIV−１ウイルスレセプターのV1とV2ドメインを含む。M
st II,Hind IIIおよびSma Iの認識部位は下線を引いて
ある。 図3:プレプロ−HSAをコードするプラスミドpXL869の構
築。 図4:プラスミドpYG208およびpYG210の構築。 図5:プラスミドpYG11の構築。 図6:プラスミドpYG18の構築。 図7:プラスミドpYG3030の制限地図。 図8:融合蛋白プレプロ−HSA−V1V2をコードするHind II
I断片のヌクレオチド配列。黒い矢印はHSAのプレとプロ
領域の終点を示す。Mst II切断箇所は下線をしてある。 図9:プラスミドpYG306の制限地図。 図10:プラスミドpUC−URA3の構築。 図11:プラスミドpCXJ1の構築。 図12:プラスミドpK1−PS1535−６の構築。 図13:プラスミドpUC−Kan1とpUC−Kan202の構築。 図14:プラスミドpKan707の構築。 図15:MW98−8C中のプラスミドpKan707の非選択性温度に
おける安定性。 図16:プラスミドpYG308Bの構築。 図17:プラスミドpYG221Bの構築。 図18:pYG221B（プレプロHSA）とpYG308B（プレプロHSA
−V1V2）で形質転換したMW98−8C株を４日間培養して培
地中に分泌された物質の特定。 A. 8.5％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動下のち
コマジーブルーで染色。標準分子量物質（レーン１）、
プラスミドpYG308Bで形質転換した培養の300μに相当
する上清（レーン２）、プラスミドpYG221Bで形質転換
した培養の100μに相当する上清（レーン３）、HSAの
500ng（レーン４） B. 分泌物を8.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動し
た後ニトロセルロース膜に移し、ヒトに対する１次抗体
を用いて免疫学的性質を決定。250ngの標準HSA（レーン
１）、プラスミドpYG308Bで形質転換した培養100μに
相当する上清（レーン２）、プラスミドpYG221Bで形質
転換した培養の10μに相当する上清（レーン３） C. HSAに対する抗体の替わりにCD4に対するポリクロー
ナル抗体を用いた以外はＢと全く同一。 図19:マウスモノクローナル抗体によるHSA−V1V2蛋白の
滴定：パネルＡ−Leu3Aマウスモノクローナル抗体（Bec
ton Dickinson,Mountain View,California、USA），パ
ネルＢ−OKT4Aマウスモノクローナル抗体（Ortho Diagn
ostic Systems,Raritan,New Jersey,USA）、パネルＣ−
ペルオキシダーゼに結合させたポリクローナルヤギ抗体
HSA血清（Nordic,Tilurg,オランダ）。Leu3AおよびOKT4
A抗体を使用した後、パーオキシダーゼを結合させたウ
サギ抗マウス２次抗体（Nordic）を用いた。パネルA,B,
Cで用いた３種の１次抗体の滴定曲線は、発色性のペル
オキシダーゼの基質（ABTS,Fluka,スイス）を添加した
後、405nmにおける吸光度を測定して求めた。縦軸:OD40
5mn、横軸：使用した１次抗体の希釈係数。 図20:ELIZAサンドイッチ法によるHSA−V1V2タンパクの
アッセイ：〔パネルＡ〕ウサギポリクローナル抗HSA
（シグマ）/HSA−V1V2/マウスモノクローナル抗体Leu3A
（Beckton Dickinson），〔パネルＢ〕ポリクローナル
抗HSA（Sigma）/HSA−V1V2/マウスモノクローナル抗体O
LT4A（Ortho Diagnostic Systems）。各抗体をHSA−V1V
2とインキュベートした後、ペルオキシダーゼ（Nordi
c）を結合したウサギ抗マウス二次抗体を加えた。滴定
曲線はペルオキシダーゼの基質であるABTSを加えた後40
5nmでの吸光度を測定して求めた。縦軸:OD405mn、横軸:
HSA−V1V2の濃度（μg/m）。 図21:液相に置ける組み替え体gp160蛋白質（transgene,
Strasbourg,フランス）125フェムトモル（10-15モル）
によるCD4結合の阻害。492nmにおける吸光度を縦軸にと
り（数値２はこの系における飽和吸光度である）、HSA
（コントロール）,HSA−CD4,溶解性CD4を横軸に表わし
てある（ピコモル蛋白質）。 図22:不活性化HIV−１ウイルスが細胞株CEM13に結合す
ることに対する阻害。 （Ａ）細胞の蛍光でソートした細胞数の予備的分析。縦
軸は細胞数、横軸は蛍光強度（対数目盛）。 （Ｂ）細胞の蛍光でソートした細胞数のヒストグラム。
カラム1:ネガティブコントロール、カラム2:HIV−１ウ
イルス、カラム3:116ピコモルのCD4の組替え体タンパク
とインキュベートしたHIV−１ウイルス、カラム4:116ピ
コモルのHSA−V1V2とインキュベートしたHIV−１ウイル
ス、カラム5:116ピコモルのHSAとインキュベートしたHI
V−１ウイルス。 図23:細胞培養における感染の阻害。感染後19日後のCEM
13細胞の逆転写酵素の活性を測定した。活性はマイクロ
タイター上で、以下のプロトコールにしたがって行なっ
た。各ウエルには、感染後経時的にサンプリングした50
μの培養上清に、緩衝液Ａ（0.5M KC1,50mMDDT,0.5％
トリトンＸ−100）10μ，ついで緩衝液Ｂ（5mM EDTA
（0.5Mトリス−HCl pH7.8）10μ、0.5M MgCL21μ,
3H−dTTP3μ、ポリ−rAオリゴdT（500D/m）10μ,
H2O16μ）40μを加えた。プレートは37℃で１時間
インキュベートした後20μの緩衝液Ｃ（60％TCA中12m
M Na2P2O7）を加え４℃で15分間インキュベートした。
生成した沈殿はスカトロン（Skatron）セルハーベスタ
ーを用いてスカトロンフィルターを通過させ、緩衝液Ｄ
（５％TCA12mM Na4P2O7）で洗浄した。フィルターは80
℃で15分間乾燥し、放射活性をシンチレーションカウン
ターで測定した。各点について３個の独立のサンプルを
試験した。 図24:CD4、HSAおよびHSA−CD4のin vivo濃度の時間変
化。 図25:プラスミドpYG232,pYG233,およびpYG364の構築。 図26:プラスミドpYG234の構築。 図27:プラスミドpYG332およびpYG347の構築。 図28:プラスミドpYG362,pYG363,およびpYG511の構築。 図29:プラスミドpYG371、pYG347,およびpYG375の制限地
図。 図30:発現プラスミドpYG373Bの制限地図。 図31:プラスミドpYG537の構築。 図32:発現プラスミドpYG560の構築。 図33:ハイブリッドタンパクの細胞内（K.lactis MW98−
8C株）発現： レーンb:ハイブリッドタンパクHSA−V1（プラスミドpYG
366B） レーンc:ハイブリッドタンパクV1−HSA（プラスミドpYG
373B） レーンd:ハイブリッドタンパクV1−HSA−V1V2（プラス
ミドpYG380B） レーンe:ハイブリッドタンパクV1−HSA−V1（プラスミ
ドpYG381B） レーンf:ハイブリッドタンパクHSA−V1V2（プラスミドp
YG308B） HSAに対するポリクローナルウサギ血清を１次抗体とし
て用いウエスタンブロット法により検出した。どの場合
も不溶性画分の蛋白10μｇを用いた。 図34:ハイブリッドタンパクHSA−CD4中へのｃ−jun（Bg
l II−Aha IIフラグメント）のロイシンジッパーの導
入。 図35:CD4レセプターのV1V2ドメインにカップルさせた末
端切除形HSAの変異体の、MW98−8C株における分泌。 パネル１−コマジーブルー染色。各レーンは定常期初期
の培養上清400μに相当するものをのせた。 レーンａ 分子量マーカー レーンｂ コントロールベクターpKan707で形質転換し
た菌株 レーンｃ HSA標準品 レーンｄ 発現プラスミドpYG308Bで形質転換した菌株
（HSA585−V1V2） レーンｅ 発現プラスミドpYG334Bで形質転換した菌株
（HSA312−V1V2） レーンｆ 発現プラスミドpYG335Bで形質転換した菌株
（HSA300−V1V2） パネル２−ウサギポリクローナル抗HSAを用いたウエス
タンブロット検出。各レーンは定常期初期の培養上清の
100μに相当するものをのせた。 レーンａ ビオチン化分子量マーカー（バイオラッド） レーンｂ コントロールベクターpKan707で形質転換し
た菌株 レーンff HSA標準品 レーンｃ 発現プラスミドpYG308Bで形質転換した菌株
（HSA585−V1V2） レーンｄ 発現プラスミドpYG334Bで形質転換した菌株
（HSA312−V1V2） レーンｅ 発現プラスミドpYG335Bで形質転換した菌株
（HSA300−V1V2） パネル３ ウサギポリクローナル抗HSAを用いたウエス
タンブロット検出。パネル２と同じ説明。 図36: パネルａ−HSA中の欠失に相当するHind III（−25）−M
st II制限断片のいくつかの代表例。アミノ酸の位置
（成熟HSAにしたがって番号付け）はかっこ内に示して
ある。 パネルｂ−欠失体の１つ（クローンYP63,アミノ酸495に
おいてリンカーを挿入）におけるMst IIサイトの詳細な
位置。 図37:HSA分子とCD4分子の間のヒンジ領域の例。分泌経
路に関わるエンドプロテアーゼの標的となりうるアミノ
酸のペアは四角で囲ってある。 パネル１−タンパクHSA585−CD4ヒンジ領域 パネル２−HSAのＣ末端部分のBa131の欠失により得られ
るHSABa131−CD4タンパクのヒンジ領域（この例におい
てはCD4部分の始まりに位置するLys−Lysペアは実施例
E.13.2.に示したように部位特異的変異誘発により修飾
されている）。 パネル３−ポリペプチド（この場合トロポニンＣの断
片）を挿入して得られたヒンジ領域。オリゴデオキシヌ
クレオチドSq1445を用いた部位特異的変異誘発により得
られた。 パネル４−HSAとCD4部分の間のヒンジ領域の一般的構
造。 図38: パネル１−特に発現プラスミドpYG373B,pYG380B,pYG381
B,pYG560に存在するHSAとCD4のあいだの枠内融合の構造 パネル1a−分泌経路に含まれるエンドプロテアーゼの潜
在的な標的であるアミノ酸ペアは四角で囲んである。 パネル1b−これらのアミノ酸ペアを、該ペアがもはや前
記プロテアーゼの標的にならないように各ペアの第２の
リジンを変異させることによって修飾することが出来
る。 パネル２−ハイブリッドタンパクV1−HSA（パネル2a）
またはV1V2−HSA（パネル2bおよび2c）に特に存在するC
D4とHSA部分との間のヒンジ領域の例 パネル３−CD4とHSA部分との間のヒンジ領域の一般的構
造。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 フィリップ イレル フランス国．75003 パリ，リュ デュ フォレ，８‐10 (72)発明者 ダヴィッド クラッツマン フランス国．75013 パリ，リュ デュ タージ，11 (72)発明者 ディディエール ランデ フランス国．75003 パリ，アヴェニュ ー ディタリー，83 (72)発明者 ジャン―フランソワ メヨー フランス国．92260 フォントネー オ ローゼ，テール ブールヴァール ド ラ レプブリーク，21 (72)発明者 パトリス イエー フランス国．75005 パリ，バ．ベ，リ ュ リヌ，13 (56)参考文献 欧州特許出願公開314317（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 19/00 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】レセプターの活性ドメインがアルブミンま
    たはアルブミンの変異体に共有結合していることを特徴
    とするハイブリッド高分子であって、該レセプターの活
    性ドメインは、免疫グロブリンと複合体を形成した感染
    性ビリオンの取り込みに介在するレセプターの活性ドメ
    インであるか、または発ガン過程に介在する因子のレセ
    プターの活性ドメインであるか、またはHIV1のCD4分子
    のV1もしくはV1V2ドメインである、ハイブリッド高分
    子。
  2. 【請求項２】共有結合がペプチド結合である、請求項１
    記載のハイブリッド高分子。
  3. 【請求項３】レセプターの活性ドメインがFCγR III型
    レセプターの活性ドメインである、請求項１記載のハイ
    ブリッド高分子。
  4. 【請求項４】レセプターの活性ドメインがCD16レセプタ
    ーの活性ドメインである、請求項３記載のハイブリッド
    高分子。
  5. 【請求項５】レセプターの活性ドメインがチロシンキナ
    ーゼ型レセプターの活性ドメインである、請求項１記載
    のハイブリッド高分子。
  6. 【請求項６】レセプターの活性ドメインがプロトオンコ
    ジーンｃ−erbB2レセプターの活性ドメインである、請
    求項５記載のハイブリッド高分子。
  7. 【請求項７】使用されるアルブミンがヒト由来であるこ
    とを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載のハ
    イブリッド高分子。
  8. 【請求項８】あるレセプターの活性ドメインを複数有す
    ることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載
    のハイブリッド高分子。
  9. 【請求項９】アルブミンまたはアルブミンの変異体がＮ
    −末端側に存在している、請求項１から８のいずれかに
    記載のハイブリッド高分子。
  10. 【請求項１０】あるレセプターの活性ドメインの局所的
    濃度を増大させるためにダイマー化または重合化機能が
    組み入れられている、請求項９に記載のハイブリッド高
    分子。
  11. 【請求項１１】レセプターの活性ドメインとアルブミン
    もしくはアルブミンの変異体との間に蛋白質分解開裂部
    位がないことを特徴とする、請求項１から10のいずれか
    に記載のハイブリッド高分子。
  12. 【請求項１２】ハイブリッド高分子を発現するベクター
    により形質転換され、トランスフェクトされ、あるいは
    感染された細胞を培養することによって得られることを
    特徴とする、請求項１から11のいずれかに記載のハイブ
    リッド高分子。
  13. 【請求項１３】形質転換細胞が酵母である、請求項12記
    載のハイブリッド高分子。
  14. 【請求項１４】酵母がクルイベロミセス（Kluyveromyce
    s）属の１種である、請求項13記載のハイブリッド高分
    子。
  15. 【請求項１５】ベクターが遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、複製基
    点、逆方向反復配列が保存されたプラスミドpKD1に由来
    する発現ベクターである、請求項13記載のハイブリッド
    高分子。
  16. 【請求項１６】ヒトアルブミンもしくはアルブミン変異
    体とCD4分子のV1ドメインからなるハイブリッド高分子
    をからなる、エイズの治療または予防用医薬。
  17. 【請求項１７】ヒトアルブミンもしくはアルブミン変異
    体とCD4分子のV1V2ドメインからなるハイブリッド高分
    子からなるエイズの治療または予防用医薬。
  18. 【請求項１８】請求項１から15に記載の高分子を発現す
    るベクターにより、形質転換、トランスフェクト、ある
    いは感染されている細胞。
  19. 【請求項１９】細胞が酵母である、請求項18記載の細
    胞。
  20. 【請求項２０】酵母がクルイベロミセス属であることを
    特徴とする、請求項19記載の細胞。
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