PT94892B - Processo para a preparacao de derivados de albumina com funcoes terapeutica - Google Patents

Description

A presente invenção envolve a utilização de derivados da albumina no fabrico de agentes terapêuticos que podem ser usados no tratamento de certas doenças víricas e de certos cancros. Mais precisamente, esta invenção envolve macromoléculas híbridas caracterizadas pelo facto de transportarem ou o domínio activo de um receptor para um vírus, ou o domínio activo de uma molécula que se pode ligar a um vírus, ou o domínio activo de uma molécula capaz de reconhecer o fragmento Fc da ligação de imunoglobulinas a um vírus, ou o domínio activo de uma molécula capaz de se ligar a um ligando que intervenha num processo patológico, acoplado à albumina ou a uma variante de albumina. No texto que se segue, os termos derivados de albumina ou variantes de albumina designam todas as proteínas com um grande semi-tempo de vida plasmática obtidas pela modificação (mutação, eliminação e/ou adição) através de técnicas de engenharia genética de um gene que codifica um determinado isomorfo de albumina, bem como todas as macromoléculas com um grande semi-tempo de vida plasmática obtidas por modificação in vitro da proteína codificada por esses genes. Esses derivados de albumina podem ser usados como produtos farmacêuticos para o tratamento antivírico, devido ã sua grande

afinidade para um vírus ou para uma imunoglobulina ligada a um vírus devida à presença de um local ou um fragmento de fixação electiva presente no derivado de albumina. Podem ser usados como produtos farmacêuticos no tratamento de certos cancros devido à afinidade de um ligando, por exemplo um factor de crescimento, para um local de fixação presente no derivado da albumina, especialmente quando esse ligando estiver associado a um receptor de membrana particular cuja amplificação se correlaciona com a transformação do fenotipo (proto-oncogénese). Há que compreender que no texto que se segue todos os derivados de albumina terapeuticamente funcionais e funcionantes são designados indiferentemente pelo termo genérico de macromoléculas híbridas com função antivírica ou macromoléculas híbridas com função anticancerígena, ou simplesmente por macromoléculas híbridas.

Em particular, a presente invenção consiste na obtenção de novos agentes terapêuticos caraeterizados pelo acoplamento, através de técnicas de engenharia genética ou química, de pelo menos duas funções distintas :

(’i) uma de transportador plasmático estável cuja função ê assegurada pela variante da albumina, e em particular pela sero-albumina humana (SAH). Os genes que codificam a estrutura da SAH são altamente polimórficos e mais de 30 alelos geneticamente diferentes foram já identificados (Weitkamp L.R. e outros; Ann. Hum. Genet.; 37; 1973; P.219-226). A molécula da albumina, cuja //

estrutura tridimensional foi caracterizada por difracção por raio X (Cárter D.C. e outros; Science; 244; 1989; P. 1195-1198), foi escolhida para facultar a função de transportador estável porque é a proteína plasmãtica mais abundante (40 g por litro no homem), tem um tempo de semi-vida plasmãtica alto (14-20 dias em humanos, Waldmann T.A.; in Albumin Structure, Function and Uses, Rosenoer V.M. et al. (eds), Pergamon Press, Oxford, (1977) 255-275) e acima de tudo porque tem a vantagem de ser desprovida de função enzimática, assim permitindo a sua utilização terapêutica em altas doses.

(ii) uma função terapêutica antivírica ou anticancerígena. A função antivírica destina-se a servir como falso alvo para uma capacidade de ligação específica de um vírus ou como chamariz e faz a ligação para um complexo vírus-imunoglobulina. Por exemplo, a função antivírica pode ser conseguida por a totalidade ou por parte de um receptor específico normalmente usado por um vírus para a sua propagação no organismo hospedeiro, ou por alguma molécula capaz de se ligar a esse vírus com uma afinidade suficientemente alta para permitir a sua utilização in vivo como agente antivírico. A função antivírica pode também ser conseguida pela totalidade ou por parte de um receptor capaz de reconhecer as imunoglobulinas complexadas com um vírus, ou por qualquer molécula capaz de se ligar a esses complexos com uma afinidade suficientemente alta para permitir a sua utilização in vivo como um agente antivírico. A função anticancerígena destina-se a servir de

-4chamariz e falso receptor para a ligaçao de um ligando e em particular de um factor de crescimento implicado no processo oncogénico, e é conseguida pela totalidade ou por parte de um proto-oncogene celular, ou por qualquer molécula capaz de se ligar a esse ligando com uma afinidade suficientemente alta para permitir a sua utilização in vivo como agente anticancerígeno.

(iii) Nos casos em que uma alta concentração local da função terapêutica ou das funções terapêuticas é desejável, por exemplo porque ela aumenta sinérgicamente a inibição da infectividade de um vírus in vivo, uma terceira função que permita a dimerização ou a pôlimerização das moléculas híbridas terapêutica mente activas, pode ser acrescentada, possivelmente de uma maneira redundante. Por exemplo, esse tipo de função pode ser facultada por uma estrutura do tipo ziper leucina (Landschulz W.H. e outros; Science; 240; 1988; P. 1759-1764), ou por um domínio proteico que se sabe ser necessário para a homodimerização de certas proteínas como sucede com o domínio do produto do gene tat codificado pelo genoma vlrico HIV-1 (Frankel A.D. et al., Science 240 (1988) 70-73; Frankel A.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988) 6297-6300).

Na presente invenção, a função de transportador plasmático, a função terapêutica e a função potencial de pôlimerização, encontram-se integradas na mesma macromolécula usando técnicas de engenharia genética.

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Um dos objectivos da presente invenção consiste na obtenção de macromoléculas híbridas derivadas da SAH que podem ser úteis na luta contra certas doenças causadas por vírus, como sucede no Síndroma da Imunodeficiência Adquirida (SIDA). Outro objectivo consiste na obtenção de derivados híbridos macromoléculares da SAH úteis no tratamento de certos cancros, nomeadamente aqueles cancros associados â amplificação genómica e/ou â hiper-expressão de proto-oncogenes humanos, como sucede com o proto-oncogene c-erbB-2 (Semba K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA. 82 (1985) 6497-6501; Slamon D.J. et al., Science 235 (1987) 177-182; Kraus M.H. et al., EMBO J. 6 (1987) 605-610).

O vírus HIV-1 é um dos retrovírus responsáveis pelo Síndroma da Imonodeficiência Adquirida no homem. Este vírus foi bem estudado ao longo dos últimos cinco anos; uma descoberta fundamental diz respeito â elucidação do papel da molécula CD4 (T4) como receptor do vírus HIV-1 (Dalgleish A.G. et al., Nature 312 (1984) 763-767; Klatzmann D. et al., Nature 312 (1984) 767-768). A interaçao vírus-receptor ocorre através da ligaçao altamente específica do invólucro vírico proteico (gpl20) â molécula CD4 (McDougal e outros; Science; 231; 1986; p. 382-385). A descoberta desta interaeçao entre o vírus HIV-1 e certos linfócitos T foi a base de uma patente que reivindica a utilização da molécula T4 e dos seus anticorpos como agentes terapêuticos contra o vírus HIV-1 (Pedido de Patente Francesa FR 2 570 278).

A clonagem e a primeira versão da sequência que codifica o gene humano CD4 foi descrita por Maddon e outros (Cell; 42 1985; p. 93-104) e uma versão corrigida por Littmann e outros (Cell”; 55; 1988 p. 541) : a molécula CD4 é um membro da super-família das imunoglobulinas e especificamente ela contém um domínio N-terminal VI que é substancialmente homólogo ao domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina (Maddon P.J.e outros; Cell; 42; 1985; p. 93-104). Experiências envolvendo a recombinação de ADN in vitro, utilizando o gene que codifica a molécula CD4, facultaram a prova definitiva de que o produto do gene CD4 é o principal receptor do vírus HIV-1 (Maddon P.J. e outros; Cell; 47; 1986; p. 333-348). A sequência deste gene bem como a sua utilização como agente terapêutico anti-HIV-1 encontram-se ambos discutidos no Pedido de Patente Internacional WO 88 013 040 Al.

A manipulação do gene CD4 por técnicas de recombinação do ADN facultou uma série de variantes solúveis da primeira geração capazes de acção antivírica in vitro (Smith D.H. et al., Science 238 (1987) 1704-1707; Traunecker A. et al., Nature 331 (1988) 84-86; Fischer R.A. et al., Nature 331 (1988) 76-78; Hussey R.E. et al., Nature 331 (1988) 78-81; Deen K.C. et al., Nature 331 (1988) 82-84), e in vivo (Watanabe M. et al., Nature 337 (1989) 267-270). Em todos os casos, foi observado durante vários ensaios in vivo feitos em animais (coelho, macaco) bem como durante os ensaios clínicos de fase I, que a primeira geração solúvel da variante CD4 consistindo na molécula CD4 com falta dos dois / V

-7domínios da região do terminal C, tem um tempo de semi-vida extremamente curto : cerca de 15 minutos no coelho (Caponeoutros Nature; 337; 1989; p. 535-531), enquanto 50 Z da primeira geração solúvel de CD4 administrada intramuscularmente aos macacos Rhesus permaneceu biodisponível durante 6 horas (Watanabe e outros; Nature; 337; 1989; p. 267-270). Além disso, os ensaios clínicos de Fase 1 realizados em 60 doentes com SIDA ou CRS (Complexo Relacionado com SIDA) indicaram que o tempo de semi-vida do produto Genentech variou entre 60 minutos (administração intravenosa e 9 horas (administração intramuscular) (SIDA/HIV Anuário de Tratamento Experimental AIDS/HIV Experimental Treatment Directory, AmFar, Maio 1989). É evidente que uma estabilidade in vivo tão fraca constitui, num agente terapêutico, uma desvantagem considerável. Com efeito, injecções repetidas do produto, que são caras e incomodas para o doente, ou a administração do produto por perfusão, tornam-se assim necessárias para atingir concentrações eficazes no plasma. É portanto especialmente importante que se encontrem derivados da molécula CD4 caracterizados por um tempo de semi-vida in vivo muito mais alto.

A parte da molécula CD4 que interage com o vírus HIV-1 foi localizada na região do terminal N, e em particular no domínio VI (Berger E.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1987) 2357-2361). Verificou-se que uma proporção significativa (cerca de 10Z) das pessoas infectadas com o vírus HIV-1 desenvolvem uma resposta imune contra o receptor CD4, com anticorpos dirigidos

8Λ ί

contra a região do terminal C da parte extra-celular do receptor (Thirirat C. et al., AIDS 2 (1988) 345-352; Chams V. et al., AIDS 2 (1988) 353-361). Portanto, de acordo com uma das materializações preferenciais da presente invenção apenas os domínios VI ou V1V2 do terminal N da molécula CD4, que transportam consigo ou que possuem actividade de recepção e ligação ao vírus, serão usados na fusão com a função de transporte estável derivada da albumina.

Com base na homologia observada no domínio variável das imunoglobulinas, vários laboratórios construiram fusões genéticas entre a molécula CD4 e diversos tipos imunoglobulinas, gerando imunoglobulinas híbridas com acção antivírica in vitro (Capon D.J. e outros; Nature; 337; 1989; p. 525-531; Traunecker A. e outros; Nature; 339; 1989; p. 68-70; ver também Pedido de Patente Internacional WO 89 02922). No entanto, o envolvimento do receptor Fc RIII (receptor do tipo 3 para a região Fc das IgG), que no homem é o antigene CD16 (Unkeless J.C. e Jacquillat C., J.; Immunol. Meth.; 100; 1987, p. 235-241), na interiorização intracelular do vírus HIV-1 (Homsy J. e outros; Science; 244; 1989 p. 1357-1360) sugere um papel importante para esses receptores na propagação vírica in vivo. 0 receptor, que foi recentemente reproduzido (Simmons D. and Seed B., Nature 333 (1988) 568-570), localiza-se essencialmente nas membranas dos macrófagos, das células polinucleares e dos granulócitos, mas em contraste com o CD4, o receptor CD16 também existe em estádio solúvel no soro (Kbayat D. et al., J. Immunol, 132 (1984)

2496-2501 : Khavat D. et al., J. Immunol. Meth. 100 (1987)

9ί.

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235-241. Há que notar que o receptor membranário CD16 é usado como uma segunda via para a entrada pelo vírus HIV-1 para infectar os macrófagos, devido à presença de anticorpos facilitantes (Homsy J. et al., Science 244 (1989) 1357-1360). Este processo de infecção que envolve um receptor Fc à superfície das células alvo (por exemplo o receptor CD16), e a região Fc dos anticorpos dirigidos contra o virion, é chamado SDA (Sinergismo Dependente de Anticorpos); também se descreveram processos semelhantes para o flavivírus (Peiris J.S.M. et al., Nature 289 (1981) 189-191) e para o lentivírus ovino Visna-Maedi (Jolly P.E. et al., J. Virol. 63 (1989) 1811-1813). Outros receptores Fc foram também descritos para as IgG (Fc RI e FC RII por exemplo) bem como para outras classes de iminoglobulinas, e o fenómeno SDA também envolve outros tipos de receptores Fc como os que são reconhecidos pelos anticorpos monoclonais 3G8 (Homsy J. et al., Science 244 (1989) 1357-1360; Takeda A. et al., Science 242 (1988) 580-583). Pode-se deste modo pôr dúvidas quanto ã eficácia das macromoléculas híbridas antivíricas que dependem unicamente das fusões entre imunoglobulinas e a totalidade ou parte de um receptor normalmente usado por um vírus como o HIV-1 para a sua propagação no hospedeiro; com efeito, a presença de um fragmento Fc funcional em moléculas desse género poderia na verdade facilitar a infecção virica de certos tipos celulares. Também é importante obter derivados CD4 que possam ser usados em concentrações terapêuticas elevadas.

Estudaram-se também diferentes tipos de construção quimérica envolvendo a proteína bacteriana MalE e a molécula CD4 (Clément J.M. et al., C.R. Acad. Sei. Paris 308, series III (1989) 401-406). Uma fusão desse tipo permite que se tire vantagem das propriedades da proteína MalE, particularmente as que dizem respeito â produção e/ou â purificação de proteína híbrida. Por outro lado, a construção de uma fusão genética entre a molécula CD4 e a toxina bacteriana também foi descrita (Chaudhary V.K. et al., Nature 335 (1988) 369-372). Nestes casos, a utilização de uma fusão genética envolvendo uma proteína bacteriana para usos terapêuticos em humanos pode ser posta em questão.

A descoberta do papel do fenómeno SDA na propagação de certos vírus, em particular no caso dos lentivlrus incluindo o HIV-1, justifica a procura de alternativas tanto para a produção de vacinas anti-SIDA, e para a produção de agentes terapêuticos baseados unicamente na fusão entre imunoglobulinas e moléculas capazes de se ligarem ao vírus. Isto é que explica que os agentes terapêuticos anti-SIDA descritos na presente invenção sejam baseados na fusão da totalidade ou de parte de um receptor usado directa ou indirectamente pelo vírus HIV-1 para a sua propagação in vivo, com uma proteína plasmãtica estável, desprovida de actividade enzimãtica, ou a que falta o fragmento Fc.

Em particular, a presente invenção diz respeito ao acoplamento, essencialmente por engenharia genética, de variantes da _ζ11.-/ f

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X albumina humana com um local de ligação para o vírus HIV-1. Essas macromoléculas híbridas derivadas da albumina sérica humana caracterizam-se pela presença de um ou mais variantes do receptor CD4 conseguidos pela modificação do domínio do terminal N do receptor CD4 essencialmente por técnicas de recombinação do ADN in vitro (mutação, eliminação, e/ou adição), que se encontra implicado na interacção especifica do vírus HIV-1 com as suas células alvo. Essas macromoléculas híbridas circulantes no plasma representam falsos receptores ou chamarizes com função antivírica. e serão designadas pelo termo genérico SAH-CD4. Outro objectivo desta invenção diz respeito ao acoplamento de variantes da albumina humana com variantes da molécula CD16, que está implicada com a interiorização intracelular de vírus incluindo o vírus HIV-1 (que serão designados pelo termo genérico SAH-CD16), e em geral o acoplamento de variantes de albumina com moléculas capazes de simular os receptores celulares responsáveis pelo fenómeno SDA de certos virus, e em particular dos lentivírus.

Os princípios da presente invenção podem também ser aplicados a outros receptores usados directa ou indirectamente por vírus humanos ou animais para a sua propagação no organismo hospedeiro. Por exemplo :

1/ a molécula 1 de adesão intercelular (MAIC-1), que se demonstrou ser o receptor do rinovírus humano HRV14 (Greve J.M. et al., Cell 56 (1989) 839-847; Staunton D.E. et al., Cell 56 (1989) 849-853);

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2/ ο receptor do poliovírus, recentemente reproduzido por Mendelsohn e outros (Cell; 56; 1989; p. 855-865);

3/ o receptor do factor C3D do complemento que é o receptor para o vírus Epstein-Barr (VEB) nas células humanas (Fingeroth J.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 4510-4514), sendo este vírus responsável pela mononucleose infecciosa e certos linfomas do homem;

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4/ os receptores para os vírus da leucemia de células T humanas HTLV-I e HTLV-II, recentemente localizados no cromossoma 17 (Sommerfelt M.A. et al., Science 242 (1988) 1557-1559), sendo estes vírus responsáveis pela leucemia das células T no adulto bem como pela paraparesia espástica tropical (HTLV-I) e pela leucemia tricoleucocítica (HTLV-II);

5/ o receptor do vírus da leucemia murina ecotrópica MuLV-E, localizado no cromossoma 5 do rato por Oie e outros (Nature; 274; 1978, p. 60-62) e recentemente replicado por Albritton e outros (”Cell; 5J7; 1989; p. 659-666).

Outro objectivo da presente invenção diz respeito ao desenvolvimento de macromoléculas híbridas estáveis com uma função anti-cancerígena, obtidas pelo acoplamento de variantes da albumina com moléculas capazes de se ligar a factores de crescimento que, em certas patologias associadas à amplificação

-13dos proto-oncogenes membranosos correspondentes, podem interagir com as suas células alvo e induzir um fenotipo transformado. Um exemplo desses receptores é a classe de receptores com aetividade tirosina quinase (Yarden Y. and Ulrich A., Biochemistry 27 (1988) 3113-3119), sendo os mais conhecidos desses receptores o do factor de crescimento epidérmico (FCE) e o factor I de estimulação do crescimento das colónias (FECC-I), respectivamente codificados pelos proto-oncogenes c-esbB-1 (Downward J. et al., Nature 307 (1984) 521-527) e c-fms (Sherr C.J. et al., Cell 41 (1985) 665-676). Outro exemplo desses receptores inclui o receptor humano da insulina (RHI), o factor de crescimento derivado das plaquetas (FCDP), o receptor do factor I de crescimento semelhante ã insulina (FCI-I), e mais notoriamente o proto-oncogene c-erbB-2, cuja amplificação genómica e/ou hiperexpressão foi demonstrado estar estritamente correlacionada com certos cancros humanos, em particular com o cancro da mama (Slamon D.J. et al., Science 235 (1987) 177-182; Kraus M.H. et al., EMBO J.j5 (12987) 605-610). Por outro lado, os princípios em que se baseia a presente invenção podem também ser aplicados a outros receptores, por exemplo o receptor da interleucina 6 (IL-6), que se demonstrou ser in vitro um factor autocrino no carcinoma de células renais (Miki S. et al., FEBS Lett., 250 (1989) 607-610).

Conforme indicado anteriormente, as macromoléculas híbridas de maior interesse são preferencialmente de natureza substancial-14mente proteica e podem por esse motivo ser geradas por técnicas de engenharia genética. A maneira preferencial de obter essas macromoléculas consiste na cultura de células transformadas, transfectadas, ou infectadas por vectores expressando a macromolécula. Em particular, os vectores da expressão capazes de transformar os fungos, especialmente do género Kluyveromyces, serão usados para a secreção de proteínas. Um sistema desse género permite a produção de grandes quantidades da molécula híbrida de forma madura, que então é segregada para dentro do meio de cultura, tornando assim fácil a sua purificação.

método preferido para a expressão e a secreção das macromoléculas híbridas consiste portanto na transformação de fungos do gênero Kluyveromyces por vectores de expressão derivados do replicon extracromossómico pKDl, inicialmente isolado do K. marxianus var. drosophilarum. Estes fungos, e em particular o K. marxianus (incluindo as variedades lactis, drosophilarum e marxianus que são a partir de agora designadas respectivamente como K. lactis, K. drosophilarum e K. fraquilis), são geralmente capazes de replicar estes vectores de forma estável e possuem a vantagem suplementar de estarem incluídos na lista dos organismos G.R.C.S. ou seja (Organismos Geralmente Reconhecidos Como Seguros). Os fungos de maior interesse incluem as estirpes industriais de Kluyveromyces capazes de replicação estável do referido plasmídio derivado do piasmídio pKDl no qual foi inserido um marcador selectivo bem como uma cassete da

-15./ expressão que permite a secreção da macromolécula híbrida em causa, a grandes ritmos de produção.

Três de vectores de clonagem foram descritos para a Kluyveromyces :

i) Vectores integrativos contendo sequências homólogas das regiões do genoma do Kluyveromyces que, depois de serem introduzidos nas células, são integrados nos cromossomas do Kluyveromyces por recombinação in vivo (Pedido de Patente Internacional WO 83/04050). A integração, que constitui um evento raro que necessita de um marcador de seleccão eficiente, é obtida quando estes vectores não contêm sequências que permitam uma replicação autónoma na célula. A vantagem deste sistema consiste na estabilidade das estirpes transformadas, significando que elas podem ser cultivadas num meio nutritivo normal sem a necessidade da pressão selectiva para manter as sequências integradas. A desvantagem, no entanto, é que os genes integrados estão presentes em apenas um pequeno número de cópias por célula, o que frequentemente resulta num baixo nível de produção da proteína heteróloga.

ii) Os vectores de replicação que contêm Sequências Autonomamente Replicáveis (SAR) derivadas do ADN cromossómico do Kluyveromyces (Das S. and Hollenberg G.P., Current Genetics 6_ (1982) 123-128; Pedido de Patente Internacional WO 83/04050).

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Todavia estes vectores são dotados apenas de interesse moderado, dado que a sua segregação na divisão mitótica das células não é homogénea, o que resulta na sua perda das células com grande frequência mesmo quando estes estão sob pressão selectiva.

iii) Os vectores de replicação derivadosde;plasmídios fúngicos que ocorrenTnaturalmente, seja do plasmídio linear letal Kl isolado do K. lactis (de Louvencourt L. et al., J. Bacteriol. 154 (1983) 737-742; Pedido de Patente de Invenção Europeia EP 0 095 986 Al, publicado em 07.12.1983), ou do plasmídio circular pKDl isolado do K. drosophiíarum (Chen X.J. et al.,

Nucl. Acids Res. 14 (1986) 4471-4480; Falcone C. et al., Plasmid 15 (1986) 248-252; Pedido de Patente de Invenção Europeia EP 0 241 435 A2, publicado em 14.10.1987). Os vectores que contêm réplicas derivadas do plasmídio letal linear necessitam de um meio nutritivo especial, e perdem-se em 40 a 99% das células depois de apenas 15 gerações, mesmo a uma pressão de selecção selectiva (Pedido de Patente de Invenção Europeia EP 0 095 986 Al, 1983), o que limita o seu uso para a produção em massa de proteínas beterólogas. Os vectores derivados do plasmídio pKDl descritos na Pedido de Patente de Invenção Europeia EP 0 241 435 A2 são também muito instáveis uma vez que o mais eficaz dos vectores (P3) se perde em aproximadamente 70% das células, apenas após seis gerações, em condições de crescimento não selectivas.

Um objectivo da presente diz respeito ã utilização de certas construções de plasmídios derivadas do plasmidio pKDl inteiro; essas construções possuem uma estabilidade significativamente maior e essas características são mencionadas no Pedido de Patente de Invenção Europeia EP 0 241 435 A2. Será demonstrada na presente invenção que estes novos vectores se mantêm na forma estável em mais de 80% das células após 50 gerações em condições de crescimento não selectivas.

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A alta estabilidade dos vectores usados na presente invenção obteve-se explorando completamente as características do plasmidio pKDl. Para além de uma origem de replicação, este sistema de réplica extracromossómica possui duas estruturas de sequência invertida, cada uma com 346 nucleõtidos de comprimento, e três quadros de leitura aberta que codificam para os genes A, B e C, cuja expressão é crucial para a estabilidade do plasmidio e um elevado número de cópias. Por analogia com o plasmidio de 2 do S. cerevisiae, que estã estruturalmente aparentado com o plasmidio pKDl (Chen X.J. et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986) 4471-4480), as proteínas codificadas pelos genes B e G estão provavelmente envolvidas no fraccionamento do plasmidio durante a divisão celular mitótica, e podem desempenhar um papel na regulação negativa do gene A que codifica a recombinase específica do sítio (FLP). Também se demonstrou que a recombinação mediada pelo FLP entre as sequências invertidas do plasmidio de 2 A do S. cerevisiae é a base de um mecanismo de

autoregulação do número de cópias do plasmidio por célula : quando o número de cópias se torna demasiado baixo para permitir a produção de quantidades suficientes dos produtos do gene B e C, que actuam como repressores do gene A, a recombinase FLP é induzida e o plasmidio replica-se de acordo com um modelo do tipo do círculo que rola, que amplifica o número de cópias para cerca de 50 cópias por célula (Futcher A.B., Yeast (1988) 27-40).

Os vectores publicados no Pedido de Patente de Invenção Europeia EP 0 241 435 A2 não possuem as características estruturais, antes mencionadas, do plasmidio pKDl do K. drosophilarum: o vector A15 não transporta a sequência completa do pKDl, e os vectores Pl e P3 transportam um gene A interrompido, e por esse motivo destroem a replicação autoregulada do sistema do plasmidio pKDl residente. Em contraste, as construções derivadas do pKDl usadas na presente invenção mantêm a integridade estrutural das sequências de nucleotídeos invertidas e dos quadros de leitura aberta A, B e C, resultando numa estabilidade notoriamente mais alta do plasmidio bem como num nível de secreção aumentado das macromoléculas híbridas terapeuticamente activas.

A cassete de expressão inclui uma região de iniciação de transcrição (promotor) que controla a expressão da codificação genética da macromolécula híbrida. A escolha dos promotores varia de acordo com o hospedeiro usado no caso específico. Esses promotores derivam dos genes dos fungos tipo Saccharomyces ou

-19Kluyveromyces, como por exemplo os genes que codificam para a fosfoglicerato quinase (FGK), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD), a lactase do Kluyveromyces (LAC4), as enolases (ENO), as desidrogenases alcoólicas (ADH), a fosfatase ácida do

S. cerevisiae (PHO5), etc... Estas regiões de controlo podem ser modificadas, por exemplo in vitro por mutagénese dirigida a sítios específicos, por introdução de elementos de controlo adicional ou de sequências sintéticas, ou por eliminações ou substituições dos elementos de controlo originais. Por exemplo, os elementos que regulam a transcrição, designados como melhoradores ou amplificadores dos eucariotes mais altos e as sequências da activação a montante (SAM) dos fungos, originadas a partir de outros promotores fúngicos, tais como os promotores do S. cerevisiae GALl e GAL10 ou o promotor LAC4 do K. lactis, ou até os amplificadores de genes reconhecidos por transactivadores víricos como o trasactivador E2 do vírus do papiloma, podem ser usados para construir promotores híbridos que permitem que a fase de crescimento de uma cultura de fungos seja separada da fase de expressão da codificação gênica da macromolécula híbrida. A cassete de expressão usada na presente invenção também inclui a transcrição e a tradução da região terminal que actua funcionalmente no hospedeiro escolhido e que está posicionada no terminal 3' da sequência que codifica a estrutura da macromolécula híbrida.

A sequência que codifica a macromolécula híbrida será precedida por uma sequência de sinal que serve para dirigir as proteínas para a via metabólica secretória. Esta sequência de sinal pode derivar-se da região N-terminal natural da albumina (a região prepro), ou pode ser obtida dos genes de fungos que codifiquem para proteínas segregadas, tais como as feromonas sexuais ou as toxinas letais, ou pode ser derivada de qualquer sequência que se saiba ser capaz de aumentar a secreção das proteínas ditas de interesse farmacêutico, incluindo as sequências sintéticas e todas as combinações que se façam entre regiões pré e pro.

A junção entre a sequência de sinal e a sequência que codifica a macromolécula híbrida que deverá ser segregada em forma madura corresponde a um sítio de clivagem de uma endoprotease fúngica, por exemplo um par de aminoácidos básicos do tipo

-2 -1 -2 -1 *

Lys -Arg ou Arg -Arg correspondendo ao sítio de reconhecimento da protease codificada pelo gene KEX2 do S. cerevisiae ou ao gene KEXi do K. lactis (Chen X.J. et al., J. Basic Microbiol. 28 (1988) 211-220; Wésolowski-Louvel M. et al., Yeast 4_ (1988) 71-81). De facto, o produto do gene KEX2 do S. cerevisiae cliva a sequência normal pro da albumina in vitro mas não cliva a sequência correspondendo à pró-albumina Christchurch em que o par dos aminoácidos básicos foi objecto de mutaçao para Arg -Glu 1 (Bathurst I.C. e outros;Science; 235; 1987; p. 348-350).

/-21Por outro lado, além da cassete de expressão, o vector incluirá um ou vários marcadores que permitam a selecção do hospedeiro transformado. Esses marcadores incluem o gene URA3 dos fungos, ou marcadores que conferem resistência aos antibióticos como a geneticina (G418), ou qualquer outro composto tóxico como certos iões metálicos. Estes genes de resistência serão colocados sob o controlo dos sinais de transcrição e translação apropriados de maneira a que se consiga a sua expressão num hospedeiro determinado.

conjunto que consiste na cassete de expressão e no marcador seleccionável pode ser usado para transformar directamente o fungo ou pode ser inserido num vector de replicação extracromossómico. No primeiro caso, as sequências homólogas de regiões presentes nos cromossomas do hospedeiro serão preferêncialmente fundidas na estrutura referida atrás. Estas sequências serão colocadas de cada lado da cassete de expressão e do marcador seleccionável de modo a aumentar a frequência de integreção do conjunto no cromossoma do hospedeiro por recombinação in vivo. No caso da cassete de expressão ser inserida num vector de replicação, o sistema de replicação preferido para o Kluyveroromyces é o derivado do plasmídio pKDl inicialmente isolado a partir do K. drosophilarum, enquanto o sistema de replicação preferido para o Saccharomyces é o que deriva do plasmídio 2 jí . 0 vector de expressão pode conter a totalidade ou só parte dos sistemas de replicação citados ou pode combinar /2έΪΕ.

esses com elementos derivados do plasmídio pKDl bem como com elementos derivados do plasmídio 2 .

Quando se pretende obter a expressão em fungos do género Kluyveromyces, as construções preferidas são as que contêm a sequência inteira do plasmídio pKDl. Em especial, as construções preferidas são aquelas em que o sítio da inserção das sequências estranhas no pKDl se localiza na região 197bp que se situa entre o sítio Saci (SstI) e o sítio MstII ou, alternativamente, no sítio Sphl deste plasmídio, o que permite uma alta estabilidade dos sistemas de replicação nas células hospedeiras.

Os plasmídios da expressão podem também tomar a forma de vectores de vai-vem entre um hospedeiro bacteriano como a Escherichia coli e os fungos; neste caso, será necessária uma origem da replicação e um marcador seleccionãvel que funcionem na célula bacteriana hospedeira. Também é possível posicionar sítios de restrição que são únicos na expressão do vector de tal modo que eles se coloquem nos flancos das sequências bacterianas Isto permite que as sequências bacterianas sejam eliminadas por clivagem de restrição, e que o vector seja religado antes da transformação do fungo, o que pode resultar num número mais elevado de cópias do plasmídio e uma estabilidade do plasmídio aumentada. Certos sitios de restrição como os 5'-GGCCNNNNNGGCC-3 (Sfil) ou 5'-GCGGCCGC-3' (Notl) são particuiarmente convenientes e eficazes pelo facto de serem muito raros nos fungos e em geral, .-23fc

V,,

L <?.

estarem ausentes dos plasmrdios de expressão.

Os vectores de expressão construídos como acima se descreveu são introduzidos nos fungos de acordo com as técnicas clássicas descritas na literatura. Depois da selecção das células transformadas, as células que expressam a macromolécula híbrida com interesse são inoculadas nos meios selectivos apropriados e então testadas quanto à sua capacidade de segregar a proteína em causa para o meio extracelular. A colheita da proteína pode ser feita durante o crescimento celular organizado em culturas continuas, ou no fim da fase de crescimento das culturas feitas em lotes. As proteínas híbridas que são objecto da presente invenção são então purificadas a partir do sobrenadante da cultura por métodos que tem em consideração as suas características moleculares e as actividades farmacológicas.

A presente invenção também diz respeito â aplicação terapêutica das macromoléculas híbridas aqui descritas, nomeadamente no que se refere ao tratamento e à prevenção da SIDA, bem como ãs células que são transformadas, transfectadas ou infectadas por vectores que expressam essas macromoléculas.

Os exemplos que se seguem bem como as figuras anexas evidenciam algumas das características e das vantagens da presente invenção.

-24DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Os diagramas dos plasmídios ilustrados nas figuras não são desenhados â escala, indicando-se apenas os locais ou sítios de restrição importantes para as construções que são determinantes.

Figura 1: Oligodesoxinucleótidos usados para gerar os sítios de restrição MstII e HindIII-Smal, situados respectivamente a montante e a jusante dos domínios V1V2 da molécula CD4.

Figura 2:

Sequência nucleotídica do fragmento de restrição MstII-Smal incluindo os domínios VI e V2 do receptor CD4 do vírus HIV-1. Os locais de reconhe cimento para MstII, HindIII e Smal estão sublinhados.

Figura 3:

Construção do plasmídio pXL869 que codifica a estrutura do prepro-SAH.

Figura 4:

Construção dos plasmídios pYG208 e pYG210

Figura 5:

Construção do plasmídio pYGil,

Figura 6:

Construção do plasmídio pYG18

-25// // rf ^{’ .¾

Figura 7:	Mapa das restrições do plasmídio pYG303.
Figura 8:	Sequência nucleotídica do fragmento da restrição HindIII que codifica a proteína de fusão prepro- -SAH-V1V2. As flechas negras indicam o fim das regiões pré e pro da SAH. 0 sítio MstII estã sublinhado.
Figura 9:	Mapa das restrições do plasmídio pYG306.
Figura 10:	Construção do plasmídio pUC-URA3.
Figura 11:	Construção do plasmídio pGXJl.
Figura 12:	Construção do plasmídio pkl-PS1535-6.
Figura 13:	Construção dos plasmídios pUC-kanl e pUC-kan202.
Figura 14:	Construção do plasmídio pKan707.
Figura 15:	Curva de estabilidade do plasmídio pKan707 na estirpe MW98-8C em condições de crescimento não selectivas.
Figura 16:	Construção do plasmídio pYG308B.

¢,-26Figura 17: Construção do plasmídio pYG221B.

Figura 18: Caracterização do material segregado após 4 dias de cultura pela estirpe MW98-8C transformada pelos plasmídios pYG221B (prepro-SAH) e pYG308B (prepro-SAH-VlV2). A, Coloração Coomassie após migração electroforética em gel de poliacrilamida a 8,5%. Os padrões de peso molecular (coluna 1); equivalente em sobrenadante a 300 /¹ da cultura transformada pelo plasmídio pYG308B (coluna 2); equivalente em sobrenadante a 100 yil da cultura transformada pelo plasmídio pYG22lB (coluna 3); 500 ng de SAH (coluna 4). B, caracterização imunológica do material segregado sujeito a uma migração electroforética em gel de poliacrilamida a 8,5%, seguida pela transferência para uma membrana de nitrocelulose e a utilização de anticorpos primários dirigidos contra a albumina humana: 250 ng de padrão de SAH (coluna 1); equivalente em sobrenadante a 100 yjil da cultura transformada pelo plasmídio pYG308B (coluna 2); equivalente em sobrenadante a 10 y*.l da cultura transformada pelo plasmídio pYG22lB (coluna 3).

C, exactamente como em B excepto no facto de se usarem anticorpos policlonais dirigidos contra a molécula CD4 em vez dos anticorpos dirigidos contra a SAH.

πjr

Figura 19

Titulação da proteína SAH-V1V2 (1 y/g/ml) por anticorpos monoclonais do rato Leu3A (Becton Dickinson, Mountain View, Califórnia, U.S.A.) (painel A), por anticorpos monoclonais do rato 0KT4A (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, New Jersey, USA) (painel B) ou por anti-SAH policlonal de cabra acoplado a peroxidase (Nordic, Tilburg, Holanda) (painel C). Depois de se usarem os anticorpos Leu3A e 0KT4A, recorreu-se a um anticorpo secundário anti-rato do coelho acoplado à peroxidase (Nordic). As curvas de titulação para os três anticorpos primários usados nas partes A, B e C foram determinadas medindo a densidade óptica a 405 nm depois da adição de um substracto de peroxidase cromatogénico (ABTS, Fluka, Suiça). Ordenadas: OD a 405 nm, abscissa: factor de diluição do anticorpo primário utilizado.

J

Figura 20: Determinação da proteína SAH-V1V2 pelo método do sandwich ELISA: o anti-SAH policlonal de coelho (Sigma) / SAH-V1V2 / anticorpo monoclonal de rato Leu3A (Becton Dickinson) (painel A), ou o anti-SAH policlonal de coelho (Sigma) / SAH-V1V2 / anticorpo monoclonal de rato 0KT4A (Ortho Diagnostic Systems) (painel B). Após a incubação

28/

de cada anticorpo com a proteína SAH-V1V2, um anticorpo secundário anti-rato do coelho ligado a uma peroxidase (Nordik) é acrescentado. As curvas de titulação foram determinadas medindo-se a densidade õptica a 405 nm após a adição do substracto ABTS da peroxidase. Ordenadas: OD a 405 nm; abscissa: concentração da SAH-V1V2 em

J

Figura 21: Inibição em fase solúvel da ligação ao CD4 pelas

125 femtomoles da proteína recombinante gpl60 (Transgene, Estrasburgo, França). A densidade óptica a 492 nm é representada em ordenadas (o valor 2 é a densidade óptica de saturação do sistema) e as quantidades de SAH (controlo), SAH-CD4, e o CD4 solúvel estão ilustradas e representadas na abscissa (picomoles de proteína)

Figura 22: Inibição da ligação do vírus HIV-1 inactivado â linha celular CEM13. A, análise preliminar das populações celulares isoladas em função da sua fluorescência. Ordenadas: número de células; abscissa: intensidade da fluorescência (escala logarítmica). B, histograma das populações celulares isoladas em função da sua fluorescência Coluna 1, controlo negativo; Coluna 2, vírus

29HIV-1; Coluna 3, vírus HIV-1 pré-incubado com 116 picomoles de proteína recombinante CD4; Coluna 4, vírus HIV-1 pré-incubado com 116 picomoles de

SAH-V1V2; Coluna 5, vírus HIV-1 pré-incubado com

116 picomoles de SAH,

Figura 23: Inibição da infecção em cultura celular. Actividade da transcriptase inversa medida durante 19 dias apõs a infecção de células CEM13. As determi. nações foram realizadas em placas de microtitulação de acordo com o seguinte protocolo: em cada buraco 10 yil do Tampão A (KC1 0,5 M, DTT 50 mM Triton X-100 a 0,5%) e então acrescentaram-se 40 yul de Tampão B (10 y*l de EDTA 5 mM em Tris-HC1 0,5 M pH 7,8, 1 ^1 (MgCl₂ 0,5 M, 3 yul de ^H-dTTP, 10 yUl de poli rA-oligodT a 5 OD/ml, ynl de H₂O) a 50 yu.1 de sobrenadante da cultura recolhidos a diferentes horas apõs a infecção. Fez-se a incubação das placas durante 1 hora a 37°C e acrescentaram-se 20 ^*1 de Tampão C (Na^^Oy 120 mM em TCA a 60%) e continuou-se a incubação durante 15 minutos a 4°C. Passaram-se os precipitados formados através de filtros Skatron utilizando um retentor de células Skatron e lavaram-se com o Tampão D Na^P₂Oy 12 mM em TCA a 5%). Secaram-se os filtros

30A’

	durante 15 minutos a 80°C e mediu-se a radio- actividade num contador de cintilação. Analisaram-se três amostras independentes em cada ponto.
Figura 24:	Alterações nas concentrações in vivo do CD4, do SAH e do SAH-CD4 ao longo do tempo.
Figura 25:	Construção dos plasmídios pYG232, pYG233 e pYG364
J Figura 26:	Construção do plasmídio pYG234.
Figura 27:	Construção dos plasmídios pYG332 e pYG347.
Figura 28:	Construção dos plasmídios pYG362, pYG363 e pYG511
Figura 29:	Mapa das restrições dos plasmídios pYG37l, pYG374 e pYG375.
Figura 30:	Mapa das restrições do plasmídio da expressão pYG373B.
Figura 31:	Construção do plasmídio pYG537.
Figura 32:	Construção do plasmídio da expressão pYG560.
Figura 33:	Expressão intracelular das proteínas híbridas

/-31SAH-V1 (plasmídio pYG366B; coluna b), Vl-SAH (plasmídio pYG373B; coluna c), V1-SAH-V1V2 (plasmídio pYG380B; coluna d), V1-SAH-V1 (plasmídio pYG381B; coluna e) e SAH-V1V2 (plasmídio pYG308B; coluna f) no K. lactis estirpe MW98-8C. A detecção foi levada a cabo pelo método do Western Blot usando soro de coelbo policlonal dirigido contra a SAH como anticorpo primário.

^ug de proteína da fracção insolúvel foram carregados em cada caso.

Figura 34:

Introdução do Leucine Zipper do c-jun (fragmento BglII-Ahall) numa proteína híbrida SAH-CD4.

Figura 35: Secreção na estirpe MW98-8C de variantes de SAH truncadas e acopladas aos domínios V1V2 do receptor CD4. Quadro 1: Coloração pelo azul Coomassie. Cada coluna estava carregada com o equivalente a 400 jn 1 do sobrenadante da cultura da fase estacionária precoce. Marcadores de peso molecular (coluna a), estirpe transformada pelo vector de controlo pKan707 (coluna b), o padrão da SAH (coluna c), estirpe transformada por plasmídios de expressão pYG308B (SAH5g^-VlV2, coluna d), pYG334B (SAH312-VIV2, coluna e) e pYG335B (SAHg0Q-VlV2, coluna f). Quadro 2:

Detecção pelo método do Western Blot utilizando anti-SAH policlonal de coelho. Cada coluna foi carregada com o equivalente a 100 ytl de sobrenadante da cultura da fase estacionaria precoce. Marcadores biotinilados do peso molecular (Bio-Rad, coluna a), estirpe transformada pelo vector de controlo pKan707 (coluna b), o padrão SAH (coluna f), estirpe transformada por plasmídios de expressão pYG308B (SAH^g^-VlV2), coluna

c), pYG334B (SAH₃₁₂-V1V2, coluna d), e pYG335B (SAH₃qq-V1V2, coluna e). Quadro 3; Detecção pelo método Western Blot utilizando um soro anti-CD4 policlonal de coelho; mesma legenda que no quadro 2.

Figura 36: Quadro A: representação de diversos fragmentos de restrição HindiII (-25)-MstII correspondendo a eliminações na SAH. Posições de aminoácidos (numerados de acordo com a SAH madura) indicados entre parênteses. Quadro b: detalhes da posição do sítio MstII num dos eliminados (clone YP63, ligante de inserção no aminoácido 495).

Exemplos das regiões de charneira entre as moléculas de SAH e CD4. Os pares de aminoácidos que são os alvos potenciais das endoproteases

Figura 37

-33Ρ¹’ envolvidas na via secretória estão emoldurados por rectangulos. Quadro 1: região charneira da proteína SAH^g^-CD4. Quadro 2: região charneira das proteínas SAHg_a^g^-CD4 obtidas por eliminação do Bal31 da porção C-terminal da SAH (nesta representação os pares Lys-Lys situados no começo da molécula CD4 foram modificados por mutagenese direccional, em relação ao local, tal como foi exemplificado em E.13.2.). Quadro 3: região charneira obtida pela inserção de um polipeptido (aqui em evidência um fragmento da troponina C), obtido por mutagenese direccionada a um local específico usando um oligodesoxinucleotido Sql445. Quadro 4: estrutura geral da região charneira entre as moléculas SAH e CD4.

Figura 38: Quadro 1: estrutura da fusão feita dentro do quadro entre a região prepro da SAH e o receptor CD4, que se encontra nomeadamente nos plasmídios de expressão pYG373B, pYG380B, pYG381B e pYG560. Quadro 1 a: os pares de aminoácidos que são os alvos potências das endoptroteases envolvidas na via secretória estão emoldurados. Quadro 1 b: Estes pares de aminoácidos podem ser modificados através da mutação da segunda lisina de cada par de tal modo que o par jã não seja um alvo para

-34/ /essas endoproteases. Quadro 2: Exemplos das regiões charneira entre as moléculas CD4 e SAH presentes nomeadamente nas proteínas híbridas VI-SAH (Quadro 2 a) ou V1V2-SAH (Quadros 2 b e 2 c). Quadro 3: estrutura geral da região charneira entre as moléculas GD4 e SAH.

EXEMPLOS

J

TÉCNICAS GERAIS DE CLONAGEM

Os métodos clássicos da biologia molecular tais como as extracçÕes preparativas do ADN de plasmídios a centrifugação do ADN de plasmídios em gradientes de cloreto de césio, agarose e electroforese em gel de poliacrilamida, a purificação de fragmentos de ADN por electroeluição, a extracção de proteínas por fenol ou fenol/clorofõrmio, a precipitação do ADN na presença de sal por etanol ou isopropanol, a transformação da Escherichia coli etc... foram abundantemente descritos na literatura (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1982; Ausubel F.M. et al., (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Niley & Sons, New York, 1987), e não serão objecto de reiteração aqui.

Os enzimas de restrição são fornecidos pelos New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham e são usados de acordo com as recomendações fornecidas pelo fabricante.

Os plasmídios pBR322, pUC8, pUC19 e os fagos M13mp8 e M13mpl8 são de origem comercial (Bethesda Research Laboratories).

Para as ligações, separam-se os fragmentos de ADN de acordo com o seu tamanho em geles de agarose (geralmente a 0,8%) ou poliacrilamida (em geral a 10%), purificados por electroeluição, extraídos com fenol ou fenol/clorofórmio, precipitados com etanol e então incubados na presença da ADN ligase T4 (Biolabs), de acordo com as recomendações do respectivo fabricante.

preenchimento dos terminais 5' é levado a cabo usando os fragmentos Klenow da ADN polimerase I do E. coli (Biolabs) de acordo com as instruções do respectivo fabricante. A destruição dos terminais 3' protuberantes êlevada a cabo na presença da ADN polimerase T4 (Biolabs) de acordo com as recomendações do respectivo fabricante. A digestão dos terminais protuberantes 5' ê levada a cabo por tratamento limitado com a Sl nuclease.

A mutagenese dirigida a um sítio realiza-se in vitro e é feita de acordo com o método desenvolvido por Taylor e outros (Nucleic Acids Res.; 13; 1985 p. 8749-8764) usando o kit

PIP' -36/ // •τ..., distribuído pelo Amersham.

A amplificação enzimãtica de fragmentos de ADN pela técnica RCP (Reacção em Cadeia Catalisada por Polimerases, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. and Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350) é levada a cabo num reciclador térmico de ADN (Perkin Elmer Cetus) de acordo com as especificações do respectivo fabricante.

J

A sequênciaçao de nucleõtidos é levada a cabo de acordo com o método desenvolvido por Sanger e outros (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463-5467) usando o kit da Amersham.

A transformação do K. lactis com ADN estranho bem como a purificação do plasmidio de ADN de K, lactis estão descritos no testo.

A menos que se indique de modo contrário, as estirpes bacterianas usadas são o E. coli MC1060 (lacIPOZYA, X74, galU, galK, strA^r), ou E. coli TG1 (lac, proA,B, supE, thi, hsdD5 /

F¹traD36, proA~*~B~*~, lacl% lacZ, M15).

Todas as estirpes de fungos utilizadas são membros da família dos fungos que ramificam e em particular do género Kluyveromyces. Exemplos destes fungos são dados no texto. A estirpe de K. lactis MW98-8C ((/, uraA, arg, lys, K⁺, pKDl⁰) foi ί

/^37- frequentemente utilizada uma amostra desta estirpe foi depositada em 16 de Setembro de 1988 no Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) em Baarn (Olanda) sob o número de registo CBS 579.88.

EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DE UM FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO MSTII/HINDIIISMAI TRANSPORTANDO OS DOMlNIOS V1V2 DO RECEPTOR DO VlRUS HIV-1.

Um fragmento de restrição MstII-Smal correspondente aos domínios V1V2 (em que VI e V2 designam os primeiros dois domínios N-terminais da molécula CD4) foi gerado pela técnica da amplificação enzimática (RCP) de acordo com a seguinte estratégia : a linha celular linfoblástica CEM13, que expressa grandes quantidades do receptor CD4, foi usada como a fonte dos ARN mensageiro que codifica a estrutura do receptor. 0 ARN total foi primeiraO mente purificado a partir de 3 x 10 células desta estirpe celular por extracção com tiocianato de guanídio como originalmente descrito por Cathala e outros (ADN; 4j 1983; p. 329-335); 50 yig do ARN preparado desta maneira serviram então de matriz para a síntese do ADN complementar (cADN) usando o kit Amersham e o oligodesoxinucleótido Xol27 como iniciador (Figura 1). 0 cADN resultante foi submetido a 30 ciclos de amplificação enzimática pela técnica RCP a uma temperatura de hibridização de 62°C, usando 1 yjig de cada oligodesoxinucleótido Xol26 e Xol27 como iniciador, tal como se mostra na figura 1. O fragmento amplificado foi directamente objecto de clonagem para o sítio Smal do M13mp8

-38 .¾ que tinha sido previamente desfosforilado, de modo a gerar o vector M13/CD4. Este vector é uma construção intermediária que contem o fragmento de restrição MstII-Smal que por si só constitui a fonte do fragmento MstII-HindIII que transporte os domínios V1V2 da molécula de CD4; a sequência nucleotídica deste fragmento está ilustrada na figura 2.

EXEMPLO 2: CONSTRUÇÃO DA CASSETE DE EXPRESSÃO PARA 0 PREPRO-SAH.

J

E.2.i. Construção do Plasmídio pXL869 que codifica a estrutura do prepro-SAH.

sítio Ndel do plasmídio pXL322 (Latta M. e outros; Bio/ Technology 5/, 1987, p. 1309-1314) incluindo o codão de iniciação de tradução ATG do prepro-SAH foi modificado até se tornar numa estrutura ou sítio HindIII por mutagenese dirigida a oligodesoxinocleótidos usando a seguinte estratégia ; o fragmento HindiII-BglII do pXL322 que contem a extremidade 5' do gene prepro-SAH foi clonado no vector Ml3mpl8 e objecto de mutagenese com o oligodesoxinucleótido 5'-ATCTAAGGAAATACAAGCTT-ATGAAGTGGGT-3¹ (o sítio HindIII está sublinhado e o codão ATG da prepro-SAH está ilustrado em letras a negrito); o fago obtido através desta etapa de mutagenese é o plasmídio pXL855 cujo mapa de restrições está ilustrado na figura 3. Após se verificar a sequência do nucleótido, a sequência de codificação completa para o prepro-SAH foi reconstituída por ligação do fragmento HindiII-PvulI derivado βϊ.....

-39da forma replicativa do fago que tinha sofrido a mutagenese e que codifica a estrutura da região N-terminal do prepro-SAH, com o fragmento PvuII-HindIII do plasmídio pXL322 que contem o terminal C da SAH, desse modo gerando um fragmento HindIII que codifica a estrutura completa do gene prepro-SAH. Este fragmento HindIII, que também contem uma região não traduzida de 61 bp na sua extremidade 3', foi clonado para o sitio correspondente do plasmídio pUC8 de modo a gerar o plasmídio pXL869 (figura 3).

J

E.2.2. Construção das cassetes de expressão para o prepro -SAH expresso sob o controlo do promotor PGK do S. serevisiae.

plasmídio pYG12 contem um fragmento de restrição de 1,9 kb SalI-BamHI que transporta a região do promotor (1,5 kb) e a região do terminador (0,4 kb) do gene PGK da S. serevisiae (figura 4). Este fragmento deriva de um fragmento HindIII genómico (Mellor J. e outros; Gene”; 24; 1983; p. 1-14) no qual se procedeu à eliminação de um fragmento de 1,2 kb correspondendo ao gene estrutural, de modo a incluir uma região entre o codão de iniciação de translação ATG e o sítio Bglll situado 30 codões a montante do codão de terminação da translação TAA. Os sítios HindIII que se encontram nos flancos do fragmento de 1,9 kb foram então destruídos usando oligodesoxinucleótidos sintéticos e substituídos por um sítio Sall e um sítio BamHI respectivamente a montante da região do promotor e a jusante do terminador de transcrição do gene PGK. Um sítio HindIII único foi então

-40introduzido por mutagenese dirigida a um sítio específico na junção das regiões do promotor e do terminador; a sequência que se encontra nos flancos deste sitio HindIII único (ilustrado em letras a negrito) é a seguinte :

5’ -TAAAAACAAAAGATCCCCAAGCTTGGGGATCTCCCATGTCTCTÁCT-3' plasmídio pYG208 é uma construção intermediária gerada pela inserção do adaptador sintético BamHI/sall/BamHI (5'-GATCCG TCGACG-3') no sítio único BamHI do plasmídio pYG12; o plasmídio pYG208 deste modo permite a remoção do promotor e do terminador do gene PGK da S. cerevisiae sob a forma de um fragmento de restrição Sall (figura 4).

fragmento HindIII que codifica a estrutura da prepro-SAH foi purificado a partir do plasmídio pXL869 por electroeluição e objecto de clonagem com a orientação própria (definida como a orientação que coloca o terminal N da região prepro da albumina imediatamente a jusante do promotor PGK) de modo a que entrando no sítio HindIII do plasmídio pYH208 se gera o plasmídio pYG210. Tal como se indica na figura 4, o plasmídio pYG210 é a fonte de um fragmento de restrição Sall que transporta a cassete de expressão (promotor PGK/prepro-SAH/terminador PGK).

E.2.3. Optimização da cassete de expressão.

A sequência de nucleótidos localizada imediatamente a

41montante do codão de iniciação da tradução ATG de genes altamente expressados possui características estruturais compatíveis com níveis de expressão tão elevados como esses (Kozak Μ., Microbiol. Rev. 47 (1983) 1-45; Hamilton R. et al., Nucl. Acid. Res. 15 (1987) 3581-3593). A introdução de um sítio HindIII por mutagenese dirigida ao sítio na posição 25 (relativamente ao codão de iniciação ATG) do promotor PGK do S. serevisiae está descrita no Pedido de Patente de Invenção Europeia EP NQ. 89 10480.

J

Por outro lado, a utilização dos oligodesoxinocleótidos Sq451 e Sq452 que formam um adaptador HindiII-BstEII estã descrita no mesmo documento e permite a produção de um fragmento de restrição HindIII composto por 21 nucleótidos que procedem o codão iniciador ATG do gene PGK, seguido pelo gene que codifica a estrutura prepro-SAH. A sequência de nucleótidos que procede o codão ATG dessa cassete de expressão é a seguinte (a sequência de nucleótidos que se encontra presente no promotor PGK do S. sereviciae estã sublinhada a seguir) :

5'-AAGCTTTACAAGAAATATAAAAACAATG-3'.

EXEMPLO 3: FUSÃO DENTRO DO QUADRO DO PREPRO-SAH COM OS

DOMÍNIOS V1V2 DO RECEPTOR CD4.

A estratégia de clonagem utilizada para a construção dentro do quadro da molécula híbrida prepro-SAH-V1V2 encontra-se ilustrada nas figuras 5 a 9. 0’plasmídio pYGll é uma construção

42ί intermêdia na qual o fragmento HindIII que codifica a estrutura prepro-SAH foi purificado a partir do plasmídio pXL869 e objecto de clonagem para dentro do sítio HindIII do plasmídio pYG12 (figura 5). A construção do plasmídio pYG18 encontra-se representada na figura 6; este plasmídio corresponde ao fragmento salI-BamHI que codifica a cassete de expressão (promotor PGK/ prepro-SAH/terminadorPGK) purificada a partir do plasmídio pYGll e objecto de clonagem nos sítios correspondentes do plasmídio pIC20R (March F. e outros, Gene”; 32; 1984; p. 481-485).

fragmento de restrição MstII-Smal que transporta os domínios V1V2 do receptor CD4, obtido tal como se descreveu no exemplo 1, foi objecto de clonagem para dentro da estrutura do plasmídio pYG18 cortado pelos mesmos enzimas de modo a.gerar um plasmídio recombinante pYG303 cujo mapa de restrições está ilustrado na figura 7. 0 plasmídio pYG303 por conseguinte transporta um fragmento HindIII que corresponde à fusão dentro do quadro da totalidade do gene prepro-SAH seguido pelos domínios V1V2 do receptor CD4. A figura 8 ilustra esta sequência de nucleótidos deste fragmento. Este fragmento foi então objecto de clonagem para o sítio HindIII do plasmídio pYG208: a inserção deste fragmento, que codifica a estrutura do gene prepro-SAH-VlV2, segundo a orientação adequada para o interior da estrutura do plasmídio pYG208, gera o plasmídio pYG306 cujo mapa de restrições se encontra ilustrado na figura 9. 0 plasmídio pYG306 transporta um fragmento de restrição Sall que contem a cassete de espressão

-43(promotor PGK/prepro-SAH-VlV2/terminador PGK).

EXEMPLO 4: CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE CLONAGEM ESTÁVEIS

DERIVADOS DO REPLICÃO pKDl.

E.4.1 Isolamento e purificação do plasmídio pKDl.

plasmídio pKDl foi purificado a partir da estirpe UCD 51-130 de K. drosophilarum (Colecção U.C.D. Universidade da Califórnia. Davis. CA 95616) de acordo com o seguinte protocolo:

litro de cultura em meio YPD (1% de extracto de levedura, 2% de Bacto-peptona, 2^ de glucose) foi centrifugado, lavado, e ressuspendido numa solução de Sorbitol 1,2 M e as células foram transformadas em esferoplastos na presença de zimoliase (300yng/ml), EDTA 25 mM, fosfato 50 mM e -mercaptoetanol (1 yig/ml). Depois de uma lavagem numa solução de sorbitol 1,2 M, os esferoplastos que correspondiam a 250 ml da cultura original foram objecto de nova suspensão em 2,5 ml de sorbitol 1,2 M aos quais se acrescentou o mesmo volume de tampão (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; glucose 50 mM; EDTA 10 mM). As seguintes etapas correspondem ao protocolo da lise alcalina já descrita (Birnboim H.C. and Doly J.C., Nucleic Acids Res. 2 (1979) 1513-1523). 0 ADN é purificado por centrifugação isopicnica num gradiente de cloreto de césio.

E.4.2 Construção do plasmídio pCXJl.

A construção intermediária pUC-URA3 (figura 10) consiste num fragmento de 1,1 kb que contem o gene URA3 do S. cerevisiae inserido no sítio único Narl do plasmídio pUC19 da maneira seguinte: o fragmento HindIII que codifica a estrutura do gene URA3 foi purificado por digestão de HindIII do plasmídio pG63 (Gerbaud C. et al., Curr. Genet. 2 (1981) 173-180); tratou-se o fragmento com o fragmento Klenow da polimerase I de ADN do E. coli para gerar terminais arredondados, purificado por electroeluição, e inserido no plasmídio pUC19 que tinha sido clivado por Narl e tratado com o fragmento Klenow da polimerase I de ADN da E. coli.

plasmídio pCXJl (figura 11) contem a sequência completa do plasmídio pKDl inserido no sítio único Aatll do pUC-URA3 da seguinte maneira: o plasmídio pKDl foi tornado linear por clivagem com EcoRI, e então submetido a um arredondamento dos terminais com o fragmento Klenow da polimerase I de ADN do E. coli. Este fragmento foi então ligado ao plasmídio pUC-URA3 que tinha sido cortado pela Aatll e arredondado nos seus terminais com a polimerase de ADN T4: a clonagem do fragmento EcoRI de terminais arredondados num sítio Aatll de terminais arredondados reconstitui dois sítios EcoRI. Deve notar-se que a linearização do plasmídio pKDl no sítio EcoRI não inactiva qualquer dos genes necessários para a estabilidade do plasmídio ou para o número de cópias, uma vez que o sítio EcoRI está localizado fora dos genes

A, B e C, e fora das sequências de repetição invertidas do pKDl.

De facto, o plasmídio pCXJi transforma o K. lactis uraA cir° a alta frequência, é amplificado até 70 a 100 cópias por células, e ê mantido sob forma estável na ausência de pressão selectiva. Devido à origem da replicação levada a cabo pelo plasmídio pUC-URA3, o plasmídio pCXJi também pode replicar-se na E. coli, e deste modo constitui um vector de vai-e-vem particularmente útil entre a E. coli e diversos fungos do gênero Kluyveromyces, em particular o K. lactis, o K. fragilis e o K. drosophílarum. Todavia, a utilização do pCXJi como um vector para a transformação de Kluyveromyces mantem-se limitada ãs estirpes auxotróficas que transportam uma mutação cromossómica uraA.

E.4.3. Construção de uma fusão dentro do quadro entre ORF1 do plasmídio letal do K. lactis e o produto do gene bacteriano aph[3']-I do transposão Tn903.

plasmídio pKan707 foi construído como um vector para ser usado em fungos de tipo selvagem. Este plasmídio foi gerado pela inserção do gene aph[3¹]-I do transposão bacteriano Tn903 que codifica a estrutura da fosfotransferase 3'-aminoglicosídica (APH), expressa sob o controlo de um promotor fúngico, para dentro da estrutura do Sall do plasmídio pCXJi.

Na primeira etapa, os sinais de transcrição bacteriana do gene aph[3']-I foram substituídos pelo promotor isolado a partir do plasmídio letal kl do K. lactis da seguinte forma; o

ζ fragmento de 1,5 kb Scal-PstI do plasmídio kl foi objecto de clonagem para os sítios correspondentes do vector pBR322, para gerar o plasmídio pkl-PS1535-6 (figura 12): este fragmento de

1,5 kb contem a região 5' do primeiro quadro de leitura aberta (0RF1) transportado pelo plasmídio kl bem como uma estrutura a montante aproximadamente de 220 bp (Sor F. and Fukuhara H., Curr. Genet. J9 (1985) 147-155). 0 fragmento purificado Scal-PstI provavelmente contem a totalidade da região promotora do ORF1, uma vez que o locus ou sítio Seal se situa a apenas 22 necleótidos a partir da extremidade do plasmídio kl (Sor F. and al., Nucl. Acids. Res. 11 (1983) 5037-5044). A digestão do pkl-PSl536-6 pelo Ddel geram um fragmento de 266 bp que contem 17 bp do pBR322 na extremidade próxima do locus Seal, e os primeiros 11 codões do ORF1 na outra extremidade.

plasmídio pUC-kanl é uma construção intermédia obtida por inserção do fragmento de 1,25 kb EcoRI que transporta o gene aph[3’]-I do Tn903 (Bloco TM do Gene da Resistência à Canamicina, Pharmacia), para o sítio EcoRI do plasmídio pUCÍ9 (figura 13).

O fragmento de 266 bp Ddel do plasmídio pkl-PS1535-6 foi tratado com o fragmento klenow da polimerase I de ADN da E. coli purificado por electroeluição num gel de poliacrilamida, e então inserido no sítio Xhol do plasmídio pUC-kaní tratado pela nuclease SI de modo a gerar terminais arredondados; isto gerou o plasmídio pUC-kan202 (figura 13). Esta estratégia de clonagem dá origem a uma fusão no quadro do gene ORF1 do plasmídio kl com

* .% a extremidade do N-terminal do gene aph[3¹]-I do Tn903: na fusão, os primeiros 11 aminoácidos do produto do gene aph[3¹]-I foram substituídos pelos primeiros 11 aminoácidos do 0RF1, e a expressão deste gene bíbrido está sob o controlo de um promotor do K. lactis. A sequência nucleotídica que envolve o codão de iniciação da proteína de fusão 0RF1-APH é a seguinte (os codões originários da 0RF1 estão sublinhados, e os primeiros codões do APH estão apresentados em itálico):

5’-TTACATTATTAATTTAAAA ATG GAT TTC AAA GAT AAG

GGT TTA AAT GAT CTA AGG CCG CGA TTA AAT TCC AAC...-3’

E.4.4. Construção e estabilidade do plasmídio pKan707 no K. lactis.

plasmídio pCXJl foi clivado por HindiII, tratado com o fragmento Klenow da polimerase I, de ADN da E. coli e então ligado com o fragmento Scal-HindII de 1,2 kb que codifica a fusão 0RF1-APH expressa sob controlo do promotor P^ do K. lactis derivado do plasmídio pUC-Kan202. 0 plasmídio resultante (pKan707, figura 14) confere níveis muito altos de resistência â G418 (Geneticin, GIBCO, Grand Island, N.Y.) nas estirpes de K. lactis ( > 2,5 g/1), é capaz de induzir a transformação de estirpes K. lactis cir° graças à integridade funcional do replicador pKDl, pode ser amplificado até 70 a 100 cópias por célula, e pode ser estavelmente mantido na ausência de pressão selectiva (figura 15). esta alta estabilidade, associada à presença de um marcador dominante que

-48Ρ*permite a transformação das estirpes industriais de Kluyveromyces tornam o plasmídio pKan707 um vector de alto rendimento na expressão de proteínas em fungos do género Kluyveromyces.

EXEMPLO 5: CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDIOS DE EXPRESSÃO pYG221B (PREPRO-SAH) E pYG308B (PREPRO-SAH-V1V2).

fragmento de restrição Sall que codifica a estrutura da proteína híbrida prepro-SAH-VlV2 expressa sob o controlo do promotor PGK do S. cerevisiae foi purificado por electroeluição a partir do plasmídio pYG306 cortado pelo enzima correspondente e foi então objecto de clonagem para o sítio Sall do plasmídio pKan707, de modo a gerar os plasmídios pYG308A e pYG308B que se distinguem um do outro apenas pela orientação do fragmento Sall em relação ao vector pKan707. 0 mapa das restrições do plasmídio pYG308B estã ilustrado na figura 16.

plasmídio pYG22lB é uma construção de controlo que codifica a estrutura da prepro-SAH apenas; este plasmídio foi construído por um método semelhante ao utilizado para o plasmídio pYG308B (prepro-SAH-VlV2): o fragmento Sall que codifica o prepro-SAH expresso sob controlo do promotor PGK foi purificado do plasmídio pYG210 e objecto de clonagem para dentro do sítio Sall do plasmídio pKan707 de modo a gerar-se o plasmídio pYG221B (figura 17). Os plasmídios pYG221B (prepro-SAH) e pYG308B (prepro-SAH-VlV2) possuem a mesma orientação das cassetes de

49expressão Sall em relação ao vector e são estritamente isogénicos excepto no que se refere â diferença do fragmento MstII-HindIII que se encontra localizado imediatamente a montante do terminador PGK. A sequência nucleotídica do fragmento MstII-HindIII no plasmídio pYG221B (prepro-SAH) é a seguinte (o codão de paragem da translação para o gene prepro-SAH encontra-se representado em caracteres a negrito):

5'-CCTTAGGCTTATAACATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTA

CCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAGCTT-3'

A sequência nucleotídica do fragmento MstII-HindIII do plasmídio pYG308B encontra-se incluído na sequência do fragmento MstII-Smal ilustrado na figura 2.

EXEMPLO 6: TRANSFORMAÇÃO DE FUNGOS.

A transformação de fungos do gênero Kluyveromyces, e em particular a transformação da estirpe MW98-8G do K. lactis, foi levada a cabo graças ao tratamento de células inteiras com acetato de lítio (Ito H. et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168), adaptada da seguinte maneira. As células foram cultivadas em balões próprios para agitação em 50 ml de meio YPD a 28°C, até chegarem a uma densidade óptica de 0,6-0,8, tendo nesse momento sido recolhidas por centrifugação a baixa velocidade, lavadas em TE esterilizado (Tris HC1 10 mM pH 7,4;

EDTA 1 mM, ressuspendidas em 3 a 4 ml de acetato de lítio <50./ //' /

(0,1 M em TE) para se poder obter uma densidade de células de

Q _ cerca de 2 x 10° células/ml, e então incubadas durante 1 hora a 30°C sob agitação moderada. Aliquotas de 0,1 ml da suspensão dar resultante das células competentes foram incubadas durante 1 hora a 30°C na presença de ADN e polietileno-glicol (PEG^qqq, Sigma) a uma concentração final de 35%. Depois de um choque térmico de 5 minutos a 42°C, as células foram lavadas duas vezes, ressuspendidas em 0,2 ml de água esterilizada e incubadas durante 16 horas a 28°G em 2 ml de YPD de modo a permitir a expressão fenotípica da proteína de fusão ORF1-APH expressa sob o controlo do promotor Ρ^,ρ 200 y^l da suspensão celular daí resultante foram espalhados em placas YPD selectivas (G418, 200 ytg/ml). Incubaram-se essas placas a 28°C e os produtos de transformação apareceram após 2 ou 3 dias de crescimento.

EXEMPLO 7: SECREÇÃO DA ALBUMINA E DAS SUAS VARIANTES POR FUNGOS

DO GÉNERO KLUYVEROMYCES.

Após a selecção em meios ricos suplementados com G418, ensaiaram-se os clones recombinantes quanto à sua capacidade de segregar a forma madura da albumina ou a proteína híbrida SAH-V1V2. Certos clones correspondiam a estirpes MW98-8C transformadas pelos plasmídios pYG221B (prepro-SAH) ou pYG308B prepro-SAH-V1V2) e foram incubadas em meios selectivos ricos em líquido a 28°C. Os sobrenadantes das culturas foram preparados por centrifugação quando as células atingiram a fase estacionária,

-51f e então concentrados por precipitação com etanol a 60% durante 30 minutos a 20°C. Ensaiaram-se os sobrenadantes após electroforese através de geles de poliacrilamida a 8,5%, ou por coloração directa com Coomassie azul do gel (figura 18, quadro A), ou por imuno-adsorção que utiliza como anticorpo primário um soro anti-SAH policlonal de coelho (figura 18, quadro B) ou um soro anti-CD4 policlonal de coelho (figura 18, quadro C). Para as experiências de imuno-adsorção incubou-se previamente o filtro de nitrocelulose na presença de anticorpos de coelho específicos e então lavou-se várias vezes, incubando-se depois com um soro de cabra biotinilado contra as Ig do coelho, e então incubado na presença de um complexo avidina-peroxidase que utiliza o kit ABC distribuído pela Vectastain (Biosys S.A., Compiègne,

França). A reacção imunológica foi então revelada pela adição de tetracloridrato de diamino-3,3'-benzidina (Prolabo) na presença de ãgua oxigenada, de acordo com as recomendações do kit citado. Os resultados estão ilustrados na figura 18 e demonstram que a proteína híbrida SAH-V1V2 é reconhecida por ambos os anticorpos anti-SAH e anti-CD4, enquanto que a SAH apenas é reconhecida pelos anticorpos anti-SAH.

EXEMPLO 8: PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS PRODUTOS

SEGREGADOS.

Após precipitação por etanol dos sobrenadantes das culturas correspondendo á estirpe MW98-8C do K. lactis transformados

pelos plasmídios pYG221B (prepro-SAH) e pYG308B (prepro-SAH-V1V2), o precipitado foi ressolubilizado em tampão Tris-HCl 50 mM, a pH 8,0. Purificaram-se as proteínas SAH-CD4 e SAH por cromatografia de afinidade em Azul de Trisacrilo (1BF). Uma purificação adicional por cromatografia de troca de iões pode ser levada a cabo se necessário. Após eluição, as fracções que contêm proteínas foram combinadas, dialisadas contra água e liofilizadas antes de serem caracterizadas. A sequenciação (Applied Biosystem) da proteína bíbrida segregada pela estirpe MW98-8C do K. lactis revelou a sequência N-terminal da albumina (Asp-Ala-His...) esperada, demonstrando uma maturação adequada da proteína.

ponto isoelêctrico foi determinado por isoelectrofocalização e verificou-se ser de 5,5 para a proteína SAH-V1V2 e de 4,8 para a SAH.

A proteína SAH-V1V2 é reconhecida pelos anticorpos 0KT4A monoclonais de rato e LeuA3 dirigidos contra o CD4 humano, bem como por soro anti-SAH policlonal (figura 19) e pode ser objecto de ensaio e doseamento por método ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay [Ensaio por Imuno-absorção Ligado a Enzimas], figura 20). O substrato para a peroxidase utilizado nestas duas experimentações é o sal de diaménio de 2,2’-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) (Fluka, Suiça).

-53/

EXEMPLO 9:

CARACTERIZAÇÃO DAS PROPRIEDADES ANTIVÍRICAS DAS

r.....’ z ·.

VARIANTES SAH-CD4.

As proteínas que correspondem â albumina (controlo negativo) e ao produto de fusão SAH-V1V2 purificado dos sobrenadantes de cultura da estirpe MW98-8C do K, lactis transformado respectivamente pelos plasmídios pYG22lB (prepro-SAH) e pYG308B (prepro-SAH-V1V2) como nos exemplos 7 e 8, foram ensaiados in vitro quanto à sua actividade antivírica e comparados com a molécula CD4 solúvel completa, purificada a partir de células CHO (Chinese Hamster Ovary). As concentrações de proteínas estão expressas em molaridade e foram determinadas tanto pelos métodos que medem proteínas em solução como por comparação de diluições sucessivas de cada proteína após migração electroforêtica em geles de poliacrilamida seguidas por coloração com nitrato de prata.

A figura 21 mostra que a fusão SAH-V1V2 é capaz de inibir in vitro a ligação da glicoproteína vírica gpl60 (percursor não clivado da gpl20) ao receptor CD4 na fase solúvel. Nesta experimentação as placas ELISA foram cobertas com CD4 recombinante purificado e incubadas com gpl60 (125 femtomoles) recombinante, tendo sido previamente incubadas com quantidades variáveis de CD4, albumina, ou proteína híbrida SAH-V1V2. A ligação residual de gpl60 ao GD4 foi então revelada por manobras sucessivas de adição de anti-soro monoclonal anti-gpl60 (110,4), seguida da f-5hligação de soro de cabra ligado a peroxidase e dirigido contra os anticorpos do rato. Após a adição de um substrato cromogénico (ortofenildialenina) na presença de água oxigenada, mediu-se a densidade óptica a 492 nm. Os resultados, indicados na figura 21 demonstram que a proteína híbrida SAH-V1V2 é capaz de inibir a ligação das gpl60 ao CD4 na fase solúvel, de maneira que é impossível distinguir do controlo positivo correspondendo à molécula CD4 na sua totalidade. Em contraste, a molécula de albumina é quase completamente inactiva em relação a esta actividade. Esta experimentação indica que a inibição pela proteína híbrida se deve à presença dos domínios V1V2 numa confor mação e numa acessibilidade semelhante â que se encontra no receptor CD4 completo.

A figura 22 mostra que a molécula híbrida SAH-V1V2 é capaz de inibir a ligação in vitro do vírus HIV-1 às células que expressam o receptor CD4 nas suas membranas. Nesta experimentação uma linha celular que expressa grandes quantidades do receptor CD4 (linha celular linfoblástica CEM13) foi incubada com 2 ^/ug de partículas víricas inactivadas pelo calor que tinham sido pré-incubadas com 116 picomoles de SAH-V1V2 (10,7 y*g), ou SAH (7,5 yUg), ou CD4 total purificado de origem recombinante extraído de células CHO (5 y*g). A ligação das partículas víricas inactivadas, âs membranas celulares, foi posta em evidência por incubações sucessivas de anticorpo anti-gpl20 monoclonal de rato e soro IgG anti-rato de cabra marcado com ficoeritrina. 0

controlo negativo corresponde à linha celular CEM13 incubada sucessivamente com esses dois anticorpos. Mediu-se a fluorescência com um separador de células (figura 22, quadro A) e os resultados estão apresentados sob a forma de um histograma (figura 22, quadro B). Esta experiência mostra que a proteína SAH-V1V2 é capaz de inibir a ligação do vírus HIV-1 às células GEM13 quase completamente. Além disso, esta inibição é levemente superior àquela que se encontra com a molécula CD4 completa; isto pode ser explicado pelo facto da albumina, conhecida pelas suas propriedades adesivas, ser capaz de inibir a ligação do vírus âs células alvo de maneira não específica e com uma eficiência baixa.

A proteína SAH-CD4 é também capaz de inibir a infecção vírica de células permissivas em cultura celular. Esta inibição foi avaliada ou por medição da produção de antigenes víricos (p24 de origem vírica) usando o kit ELAVIA-AGl (Diagnostics Pasteur), ou o kit p24-ELISA (Dupont) ou pela medição da actividade da transcriptase inversa graças à técnica de Schwartz e outros (Aids Research e Human Retroviruses k (1988) 441-448) .

Este protocolo experimental foi o seguinte: o produto de interesse numa concentração final X foi primeiro pré-incubado com sobrenadantes de células CEM13 infectadas por agentes infectantes LAV-Brul obtidos a partir do vírus HIV-1 (diluição,(í/250 1/2500 e 1/25000) num volume total de 1 ml de meio de cultura (RPMI 1640 contendo 10% de soro de vitela fetal, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina-neomicina). A mistura foi

56F.....i então transferida para um núcleo de 5 x 10^J células permissivas (por exemplo MT2, CEM13 ou H9) e incubado em tubos durante 2boras a 37°C de modo a que a infecção pudesse ocorrer. A infecção podia também ser levada a cabo em placas de microtitulação com 10^ células por cada buraco em 100 y*l de meio completo. Um volume de 100 ^1 do vírus que tinba sido previamente incubado com o produto a ser ensaiado era então acrescentado, seguido de 50 yul do produto a 5X essa concentração. Lavou-se então as células duas vezes com 5 ml de RPMI 1640 e fez-se uma nova suspensão em meio de cultura a uma densidade de 2,5 x 10^ células/ml. Recolhiam-se então 100 y*l desta suspensão para cada tubo das placas de microtitulação que jã continham 100 ^»1 do produto a duas vezes a concentração, e incubaram-se as placas a 37°C numa atmosfera húmida contendo 5% de CC^. Em diferentes dias (D3-D4-D6-D8-D10-D12-D14-D16-D19-D21 e D25), eliminou-se 100 y«l do sobrenadante e mediu-se a produção virica de p24 bem como a actividade de transcriptase inversa. Fez-se uma nova suspensão das células e distribuíram-se em placas de microtitulação para avaliação da viabilidade celular (MTT) tal como se descreveu previamente. Aos 50 yul que ficaram nas placas originais, acrescentavam-se 200 yUl do meio de cultura que continha o produto a ser ensaiado â concentração X, e a infecção era permitida até à nova amostragem. No que respeita ao ensaio da viabilidade celular, acrescentou-se 10 yxl de MTT a 5 mg/ml de filtrados através de filtros de 0,2 yxm a cada orifício e incubaram-se as placas durante 4 horas a 37°C em atmosfera húmida contendo 5% de CC^. Então acrescentou-se

-57PF» /' · a cada orifício 150 JaI duma mistura de isopropanol/HCl 0,04 N, e os cristais de Formazan ressuspendidos. Mediu-se a densidade óptica de 520 até 570 nm com um leitor de placas Titertek; esta medida corresponde â viabilidade celular (Schwartz et al., Aids Research and Human Retroviruses 4_ (1988) 441-448).

A figura 23 mostra um exemplo da inibição da infectividade na cultura celular (linha celular CEM13) tal como se pode medir pela actividade da sua transcriptase inversa. Isto demonstra que a molécula híbrida SAH-V1V2 á capaz de reduzir a infectividade do vírus HIV-1 da mesma maneira e com a mesma intensidade que a molécula CD4 solúvel.

EXEMPLO 10: ESTABILIDADE DAS PROTEÍNAS HÍBRIDAS IN VIVO:

Foi demonstrado que a primeira geração do CD4 solúvel é dotada de um semi-período de vida de 20 minutos no coelho (Capon

D.J. et al., Nature 337 (1989) 525-531). Por esse motivo decidiu-se comparar o semi-período de vida no coelho da molécula híbrida SAH-CD4 ao da molécula de GD4 solúvel e ao da SAH recombinante produzida em fungos e purificada da mesma maneira que a molécula SAH-CD4. Nestas experimentações, pelo menos dois coelhos machos NZW(Hy/Cr) com um peso que oscilava entre 2,5 e 2,8 kg foram usados para cada produto. Os coelhos eram conservados numa sala mantida â temperatura de 18,5 a 20,5°C, e a humidade era de 45 a 65%, com 13 horas de luz por dia. Adminis58F· a

trou-se cada produto por uma única injecção que demorava 10 segundos na veia marginal da orelha do coelho. Injectou-se a mesma quantidade molar de cada produto: 250 y»g de CD4 por coelho, 400 /4g de SAH por coelho ou 500 /g de SAH-CD4 por coelho, em 1 ml de soro fisiológico. Recolheu-se amostras de sangue de três a quatro ml, misturou-se com heparinato de lítio e centrifugou-se durante 15 minutos a 3500 rpm; dividiram-se as amostras em três fracções, rapidamente congeladas a -20°C, e então titularam-se pelo método ELISA. Reeolheram-se amostras de sangue extraídas aos coelhos injectados com CD4 antes da injecção (To) e depois após 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas e 8 horas após a injecção. Amostras de sangue tiradas aos coelhos injectados com o SAH-CD4 ou SAH foram extraídas no To, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, horas, 32 horas, 48 horas, 56 horas, 72 horas, 80 horas, 96 horas, 104 horas e 168 horas após injecção.

As titulações das concentrações da molécula CD4 foram levadas a cabo em placas de microtitulação Dinatech M129B previamente cobertas com a proteína híbrida SAH-CD4. Concentrações gradualmente crescentes de CD4 ou as amostras que deviam ser tituladas foram então acrescentadas na presença de anticorpo monoclonal de rato OKT4A (Ortho-Diagnostic, diluição 1/1000); após a incubação e a lavagem das placas, a ligação residual do anticorpo OKDT4A foi posta em evidência pela adição de anticorpos ligados à peroxidase (Nordic, diluição 1/1000) e dirigida contra _Γ59/ ί

''' ϊ V.

a IgG de rato. As medições foram feitas a DO 405 nm na presença do substrato da peroxidase ABTS (Fluka).

Os ensaios da SAH recombinante realizaram-se em placas de microtitulação Dynatech M129B previamente cobertas com soro anti-SAH (Sigma Ref. AO659, diluição a 1/1000); concentrações crescentes de SAH ou as amostras a ser medidas eram então acrescentadas, seguidas da adição de soro anti-SAH ligado a peroxidase (Nordik, diluição a 1/1000). As medições foram feitas a DO 405 nm como acima se disse.

Fizeram-se dois ensaios diferentes para a molécula híbrida SAH-CD4; ou o ensaio para a molécula SAH isolada, usando os mesmos métodos que para a SAH recombinante, ou um ensaio da molécula SAH acoplada com um ensaio para a molécula CD4. Neste último caso, as placas de microtitulação eram primeiro cobertas com um soro anti-SAH (Sigma Ref. AO659, diluição a 1/1000), e então incubadas com as amostras a titular. 0 anticorpo Leu3A monoclonal de rato dirigido contra o CD4 era então acrescentado, seguido de anticorpos acoplados â peroxidase (Nordik, diluição 1/1000) e dirigidos contra os anticorpos de rato. As medições eram feitas a 405 nm tal como se descreveu acima.

As curvas de cada um destes ensaios estão ilustradas na figura 24. A interpretação destes resultados permite a avaliação das características farmacocinéticas de cada produto no coelho.

0Os semi-períodos de vida medidos para cada produto são os seguintes :

CD4:

0,25 + 0,1 h

SAH:

SAH-CD4 + 6 h + 4 h

Estes resultados sublinham os seguintes pontos :

J

1/ 0 acoplamento da CD4 â albumina permite um aumento significativo da estabilidade da CD4 no organismo dado que o semi-período de vida de eliminação ê aumentado 140 vezes.

2/ 0 semi-período de vida de eliminação do produto híbrido SAH-CD4 é comparável ao da SAH.

3/ A libertação expressa em volume de sangue limpo da CD4 é aproximadamente de 3 ml/min./kg enquanto o da SAH e o da SAH-CD4 são aproximadamente de 0,02 mi/min./kg.

4/ A parte CD4 do produto híbrido SAH-CD4 aparentemente retem uma conformação activa (isto e, capaz de se ligar ao gpl20) dado que o ensaio para o CD4 envolve o anticorpo monoclonal Leu3A que reconhece um epitopo próximo do local de ligação da gpl20 (Sattentau Q.J. et al., Science 234 (1986) 1120-1123; Peterson A. and Seed B., Cell 54 (1988) 65-72). Por outro lado, os dois /-61/ y

ί métodos de ensaio independentes do produto híbrido SAH-CD4 dão essencialmente o mesmo resultado, o que sugere que a molécula de CD4 não é preferencialmente degradada in vivo.

Vale a pena notar que o volume de distribuição da SAH e o da SAH-GD4 estão próximos do que a concentração sanguínea permite deduzir, e por esse motivo sugerem uma distribuição do produto limitada ao compartimento extracelular.

J

EXEMPLO 11: CONSTRUÇÕES GENÉRICAS DO TIPO SAH-CD4.

E.ll.l. Introdução dos sítios Ahall e BglII na parte terminal da região prepro da SAH.

A introdução do sítio de restrição Ahall foi levada a cabo por mutagenese dirigida ao sítio realizada com o auxílio do plasmídio pYG232 e pelo oligodesoxinucleótido Sqll87, de modo a gerar o plasmídio pYG364. 0 plasmídio pYG232 foi obtido através da clonagem do fragmento HindiII que codifica a estrutura prepro-SAH para dentro do vector M13 mp9. A sequência do oligodesoxinucleótido Sqll87 é a seguinte (o sítio Ahall encontra-se representado em letras a negrito):

5'-GTGTTTCGTGGAGACGCCCACAAGAGTGAGG-3'.

Há que notar que a criação do sítio Ahall não modifica a sequência de proteínas da região terminal N de moléculas SAH

-62/

Sf maduras. A construção do plasmídio pYG364 está posta em evidência na figura 25.

plasmídio pYG233 foi obtido de maneira análoga, após mutagenese dirigida a sítio do plasmídio pYG232 usando o oligodesoxinucleótido Sq648 (os codões que especificam o par de aminoácidos Arg-Arg situados no topo da região prepro-SAH estão escritos com letras a negrito, e o sítio bGilI está sublinhado na sequência a seguir):

5'-GGTGTGTTTCGTAGATCTGCACACAAGAGTGAGG-3'

A criação deste sítio de restrição não muda a sequência da proteína da região prepro da SAH. Pelo contrário, o primeiro aminoácido da proteína, sob uma forma madura, encontra-se tocado e deixando de ser um aspartato passou a ser uma serina; o plasmídio pYG233 por esse motivo codifica uma estrutura madura da SAH modificada no seu terminal N (SAH*, figura 25).

E.11.2. Introdução da região prepro da SAH a montante do receptor GD4.

A introdução da região prepro da SAH a montante dos domínios V1V2 do receptor CD4 foi levada a cabo por uma mutagénese dirigida a sítio de modo a gerar-se o plasmídio pYG347 tal como se ilustra nas figuras 26 e 27. 0 plasmídio pYG231 (figura 26) é uma construção intermediária que corresponde a um replicon /63y |F'* tipo pUC no qual se procedeu â clonagem de um fragmento Sall que transporta a cassete de expressão da SAH (promotor de fungo/ prepro-SAH/terminador PGK do S. sereviciae). 0 plasmídio pYG234 é isogénico em relação ao plasmídio pYG231 excepto no que se refere ao oligodesoxinucleótido Sq648 que foi usado para levar a cabo a mutagénese in vitro (E.ll.l.).

plasmídio pYG347 foi obtido por mutagénese dirigida ao sítio do plasmídio pYG332 com o oligodesoxinucleótido Sql092 (figura 27) cuja sequência ê ilustrada a seguir (a sequência SAH encontra-se em itálico e a sequência CD4 em tipo carregado (negrito)):

5'-CCAGGGGTGTGTTTCGTCGAAAGAAAGTGGTGCTGGGC-3' plasmídio pYG347 portanto transporta um fragmento HindIII composto de 21 nucleótidos que precedem o codão ATG do gene PGK do S. sereviciae, o codão de iniciação de translação ATG, e a região prepro-SAH (LPg^) imediatamente seguidos pelos domínios V1V2 do receptor CD4.

E.11.3. Introdução do sítio Ahall na parte terminal do domínio VI do receptor CD4.

A introdução de um sítio Ahall na região terminal do domínio VI do receptor CD4 foi levada a cabo por mutagénese dirigida a um sítio graças à utilização do oligodesoxinucleótido

Γ......» ?64,/

Sqll85 eauma estrutura derivada do plasmídio pYG347 (pYG368, figura 28), de modo a gerar-se o plasmídio pYG362. A sequência do oligodesoxinucleôtido Sqll85 ê a seguinte (encontrando-se o sítio

Ahall em letras a negrito):

5'-CCAACTCTGACACCGACGCCCACCTGCTTCAGG-3'.

plasmídio pYG362 transporta portanto um fragmento HindlII-Ahall composto de 21 nucleótidos que precedem o codão ATG do gene PGK do S. cerevisiae seguido pela sequência que codifica a estrutura da região prepro da SAH fundida com o domínio VI do receptor CD4, de acordo com o exemplo E.11.2.: Numa fusão como a que é dada neste exemplo, o domínio VI do receptor CD4 transporta 106 aminoácidos e inclui o sítio que leva a ligação funcional da glicoproteína vírica gpl20 do vírus HIV-1.

E.11.4. Introdução de um sitio Ahall na parte terminai do domínio V2 do receptor CD4.

A introdução de um sítio Ahall na parte terminal do domínio V2 do receptor CD4 foi levada a cabo por mutagénese dirigida a um sítio graças ao uso do oligodesoxinucleôtido Sqll86 e ao plasmídio pYG368, de modo a gerar o plasmídio pYG363 (figura 28). A sequência do oligodesoxinucleôtido Sqll86 é (encontrando-se o sítio Ahall representado em letras a negrito):

5'-GCTAGCTTTCGACGCGGGGGGAATTCG-3'.

-65// in Λ* plasmídio pYG363 transporta portanto consigo um fragmento HindIII-Ahall composto por 21 nucleótidos que precedem o codão ATG do gene PGK do S. cerevisiae seguidos da sequência que codifica a estrutura da região prepro da SAH fundida com os domínios V1V2 do receptor CD4. Nesta fusão particular, os domínios V1V2 contêm 179 aminoácidos.

Geraram-se outras variantes do plasmídio pYG363 por mutagenese dirigida a um sítio de maneira a que se introduzisse o segmento ou sítio Ahall em diferentes locais do domínio V2 do receptor CD4. Em particular, o plasmídio pYG511, ilustrado na figura 28, não contem o par de aminoácidos Lys-Lys nas posições 166-167 do domínio V2; isto deve-se ao facto de se ter usado um oligodesoxinucleótido Sql252; (o sítio Ahall en.contra-se representado com letras a negrito):

5'-GCAGAACCAGAAGGACGCCAAGGTGGAGTTC-3’.

E.11.5. Construções genéricas do tipo Vl-SAH.

J

Os plasmídios descritos nos exemplos precedentes permitem que se gerem fragmentos de restrição HindIII que codificam as estruturas de proteínas híbridas em que o receptor do vírus HIV-1 (fundido com a sequência de sinal da SAH) precede a SAH. Por exemplo, os plasmídios pYG362 e pYG364 são respectivamente a fonte do fragmento HindIII-Ahall (fusão da região prepro da SAH com o domínio VI do receptor CD4) e do fragmento Ahall-Ncol

-6 6ι (região de terminal N de estrutura de SAH madura obtida como no exemplo E.ll.l.). A ligação destes fragmentos com o fragmento Ncol-Kpnl (região C-terminal da SAH e terminador do gene PGK do

S. cereviciae) numa estrutura análoga do plasmidio pYG18 cortado por Hindlíl e Kpnl dã origem ao plasmidio pYG371 cuja estrutura se encontra ilustrada na figura 29. Neste plasmidio, o gene que codifica a estrutura da proteína híbrida Vl-SAH fundida â região prepro da SAH é objecto de clonagem para dentro da estrutura da cassete de expressão funcional nos fungos. Esta cassete pode então ser objecto de clonagem para dentro da estrutura de um vector de replicação que pode ser seleccionado em fungos, por exemplo o vector pKan707, que dã origem a um plasmidio de expressão pYG373B (figura 30).

E.11.6. Construções genéricas do tipo V1V2-SAH.

As proteínas híbridas do tipo V1V2-SAH foram obtidas pela estratégia seguinte: numa primeira etapa, os plasmídios pYG511 (figura 28) e pYG374 (figura 29) foram utilizados respectivamente como fonte dos fragmentos de restrição BqlII-Ahall (fusão da região prepro da SAH e dos domínios V1V2 do receptor CD4) e AhaII-ΚρηΙ (fusão dentro do quadro feita entre a SAH de estrutura madura e os domínios V1V2 do receptor GD4 tal como se encontra exemplificada em E.12.2.). A ligação destes fragmentos numa estrutura derivada do vector pBluescript II SK(+) resistente ao cloranfenicol (plasmidio pSCBK(+), Stratagene) dá origem ao »67plasmídio pYG537 (figura 31). Este plasmídio contem um fragmento HindIII que codifica a estrutura da molécula híbrida bivalente CD4-SAH-CD4 fundida dentro no mesmo quadro com o pêptido de sinal da SAH tal como se ilustra em E.11.2.. 0 plasmídio pYG547 que contem o fragmento HindIII que codifica a estrutura da proteína híbrida V1V2-SAH fundida no mesmo quadro ou na mesma moldura com a região prepro da SAH, foi então derivada pela substituição do fragmento PstI-Kpnl do pYG537 pelo fragmento PstI-Kpnl do plasmídio pYG371. 0 fragmento HindIII transportado pelo plasmídio pYG547 pode então ser expresso sob o controlo de um promotor fúngico funcional que tenha sido objecto de uma clonagem para a estrutura de um vector que desencadeie a replicação, por exemplo, em fungos do género Kluyveromyces. Um exemplo de tal eventualidade e a expressão do plasmídio pYG560 cuja estrutura e mapa de restrições se encontram ilustrados na figura 32. 0 vector pYG105 que foi utilizado neste particular exemplo corresponde ao plasmídio pKan707 cujo sítio ou fragmento HindIII foi objecto de destruição por mutagénese dirigida a sítio (oligodesoxinucleótido Sql053, 5'-GAAATGCATAAGCTCTTGCCATTCTCACCG-3') e cujo fragmento SalII-SacI que codifica a estrutura da gene URA3 foi substituído por um fragmento SalI-SacI que transporta a cassete constituída por um promotor, um terminador e um único sítio HindIII.

EXEMPLO 12: COMPLEXOS PROTEICOS HlBRIDOS BIVALENTES.

E.12.1. Introdução de um codão de passagem ou terminação a jusante do domínio VI do receptor CD4.

.-6 8/

As técnicas convencionais permitem a introdução de um codão que termina a translação a jusante do domínio do receptor CD4 que ê responsável pela ligação da glicoproteína gpl20 de origem vírica do HIV-1. Por exemplo, introduziu-se um codão TAA, imediatamente seguido por um sítio HindiII, por mutagénese específica de sítio ou dirigida a local ou fragmento a jusante do domínio VI do receptor CD4. Em particular, colocou-se o codão TAA imediatamente após o aminoácido na posição 106 do receptor CD4 (Thr °) graças à utilização do oligodesoxinucleótido Sql034 e a um plasmídio análogo ao plasmídio M13-CD4 que serviu de matriz. A sequência do oligodesoxinucleótido Sql034 é a seguinte (estando o codão de paragem da translação e o fragmento HindIII representados com letras a negrito).

5'-ACTGCGAACTCTGACACCTAAAAGCTTGGATCCCACCTGCTTCAGGGGCAG-3'

E.12.2. Construções do tipo CD4-SAH-CD4.

Os plasmídios descritos nos exemplos E.11.5. e E.11.6. que exemplificam as construções genéricas do tipo CD4-SAH permitem uma fãcil produção de construções bivalentes do tipo CD4-SAH-CD4. Os plasmídios pYG374 (V1-SAH-V1V2) ou pYG375 (Vl-SAH-Vl) ilustram duas dessas construções genéricas: por exemplo, o pequeno fragmento MstII-HindIII do plasmídio pYG371 que codifica a estrutura dos últimos aminoácidos da SAH pode ser substituído por um fragmente MstII-HindIII que codifica a estrutura dos três últimos aminoácidos da SAH fundidos com os domínios V1V2 do

-69/ receptor CD4 (plasmídio pYG374, figura 29), ou com o domínio VI isolado (plasmídio pYG375, figura 29). Os genes que codificam a estrutura de tais proteínas híbridas bivalentes podem então ser expressos sob o controlo de um promotor funcional de origem fúngica que promove a replicação, por exemplo, em fungos do género Kluyveromyces. Exemplos de plasmídios de expressão desse tipo são os plasmídios pYG380B (V1-SAH-V1V2) e pYG381B (Vl-SAH-Vl) que são estruturas estritamente isogênicas da do plasmídio pYG373B (Vl-SAH) excepto no que se refere ao genes estruturais que estão codificados nos fragmentos HindIII. As proteínas híbridas bivalentes aqui descritas são expressas em níveis ou concentrações comparáveis ãs das que se encontram para os seus equivalentes monovalentes, indicando um fraco nível de recombinação destas sequências repetitivas resultantes da recombinação genética in vivo (figura 33).

A construção dos fragmentos HindIII que codificam as estruturas das proteínas híbridas bivalentes do tipo V1V2-SAH-V1V2 já foi objecto de descrição na figura 31 (plasmídio pYG537). Os genes que codificam as estruturas de tais proteínas híbridas bivalentes do tipo CD4-SAH-CD4 podem então ser expressos sob o controlo de um promotor fúngico funcional inserido num vector que promova a replicação, por exemplo, em fungos do género Kluyveromyces. Tais plasmídios de expressão são produzidos por uma estratégia descrita na figura 32 (clonagem de um fragmento HindIII para dentro da estrutura de plasmídios análogos ao plasmídio pYG560).

-Ί Οff ν

Ε.12.3. Introdução de um domínio de dimerização.

Para uma determinada proteína híbrida derivada da albumina ou que transporte um dos vários locais ou fragmentos de ligação do vírus HIV-1, pode ser desejável a inclusão de um polipéptido que confira uma função de dimerização à estrutura, o que permite a aglomeração das partículas víricas que foram objecto de captura Uma função de dimerização desse tipo é o chamado domínio do Fecho ecláire de leucina (LZ) que se encontra em certas proteínas reguladoras da transcrição (JUN, FOS...). Em particular é possível produzir um fragmento BqlII-AhalI que codifica, por exemplo, a estrutura do LZ do JUN, pela técnica PCR graças ao uso dos oligodesoxinucleótidos seguintes e do piasmídio pTS301 (que codifica a estrutura de uma fusão no mesmo quadro entre a proteína bacteriana LexA e o fragmento LZ da estrutura JUN, segundo T. Schmidt e M. Schnar, resultados não publicados) como matriz (estando os fragmentos BqlII e Ahall sublinhados na estrutura a seguir discriminada):

5'-GGTAGGTCGTGTGGACGCCAGATCTTTGGAAAGAATTGCCCGTCTGGAAG-3'

5'-CTGCAGGTTAGGCGTCGCCAACCAGTTGCTTCAGCTGTGC-3'

Este fragmento BqlII-AhalI (figura 34) pode ser objecto de ligação ao fragmento HindlII-BglII do piasmídio pYG233 (região prepro da SAH, figura 25) e o fragmento Ahall-HindiII tal como se mostra num dos exemplos E.ll. de modo a gerar-se um fragmento HindiII que codifica a estrutura das proteínas híbridas do tipo

71Ζ

( ·<5»_λ !«Ί.

LZ-SAH-CD4, fundido com a sequência de sinal da SAH. Para evitar a dimerização possível destas moléculas durante o seu trânsito através da cadeia secretória do fungo, pode ser desejável recorrer ao domínio LZ que não pode formar homodímeros. Neste caso, o Fecho ecláir de leucina (Leucine Zipper) do FOZ ê preferível; a dimerização poderia então resultar quando essas proteínas são postas na presença de outras proteína híbridas que transportem o fragmento LZ da estrutura JUN.

J

A introdução de sítios de restrição cuidadosamente seleccionados que permite a construção de genes que codifiquem as estruturas das proteínas híbridas do tipo LZ-CD4-SAH ou LZ-CD4-SAH-CD4 é também possível recorrendo âs técnicas de mutagenese in vitro convencional ou âs de PGR.

EXEMPLO 13: ENGENHARIA GENÉTICA DA REGIÃO DE CHARNEIRA ENTRE

AS MOLÉCULAS DO CD4 OU DA SAH.

E.13.1. Estratégia que recorre â isonuclease Bal31.

As proteínas segregadas por uma estirpe MW98-8C transformada por plasmídios de expressão que controlam as proteínas híbridas SAH-CD4 em que a molécula CD4 é transportada num fragmento MstllHindlII no sítio ou locus natural MstII da SAH (plasmídio pYG308B por exemplo), foram analisadas. A figura 35 demonstra a presença de pelo menos dois produtos de clivagem que migram em conjunto

-7 2com o padrão de albumina (quadro 2), que tem uma sequência N-terminal da SAH de estrutura madura e que não são detectáveis com os anticorpos policlonais dirigidos contra o CD4 humano (quadro 2 e 3). Demonstra-se que estes produtos de clivagem são produzidos durante o trânsito através da via metabólica secretaria das fungos, provavelmente pelo enzima KEX1 do K. lactis (ou outra protease com uma especificidade análoga ã da endoprotease YAP3 do S. cerevisiae cujo gene foi objecto de clonagem e de sequenciação (Egel-Mitani M. e outros Yeast (1990) 127-137)).

Portanto, o ambiente peptídico da região que serve de charneira entre as moléculas de SAH e de CD4 foi objecto de modificação, nomeadamente pela fusão da molécula de CD4 (ou de uma das suas variantes capazes de se ligar à proteína gpl20 do HIV-1) a regiões N-terminais da SAH de comprimento variável, de acordo com a seguinte estratégia: o plasmídio pYG400 é um plasmídio intermediário que transporta o gene prepro-SAH, optimizado em relação à sequência nucleotídica a montante do codão ATG, no fragmento HindIII. Este plasmídio foi linearizado no seu sítio único MstII e parcialmente digerido pela exonuclease Bal31. Depois da inactivação deste enzima, tratou-se a mistura que foi objecto desta reacção com o fragmento Klenow da polimerase de ADN do E. coli e então submeteu-se â ligação na presença de uma mistura equimolar de oligodesoxinucleótidos Sql462 (5'-GATCCCTAAGG-3') e Sql463 (5’-CCTTAGGG-3') que em conjunto formam um adaptador sintético que contém um sítio MstII que procede o sítio BamHI.

Após a ligação, o meio de cultura onde ocorre a reacção foi >73í?

/ .¾ objecto de digestão com HindIII e BamHI e fragmentos de 0,7 e 2,0 qb de tamanho foram separados por electroeluição e objecto de clonagem para dentro da estrutura do vector Ml3 mpl9 cortado pelos mesmos enzimas. Obtiveram-se 10° placas líticas das quais aproximadamente um terço revelaram uma cor azul na presença de IPTG e XGAL. Os clones de fagos que permaneceram azuis foram então objecto de sequenciação e, na maior parte dos casos, continham o objecto de uma fusão na mesma moldura realizada entre a molécula N-terminal de SAH e a β-galactosidase. Estes genes compósitos portanto continham fragmentos HindIII-MstII que transportavam secções da região N-terminal da SAH; a figura 36 ilustra vários exemplos entre os quais se contam os dois terços do C-terminal da SAH. Estes fragmentos foram então objecto de ligação com um fragmento MstII-HindIII correspondendo à molécula de CD4 (por exemplo os domínios V1V2 da figura 2 ou o domínio VI isoladamente), que dão origem a fragmentos HindIII que codificam a estrutura das proteínas híbridas do tipo SAH-CD4 em que a molécula de SAH é de comprimento variável. Estes fragmentos de restrição foram então objecto de clonagem segundo a orientação adequada para dentro da estrutura da cassete de expressão de modo a transportar um promotor e um terminador fúngicos, eo conjunto ou estrutura foi então introduzido dentro de fungos. Depois do crescimento da cultura assim obtida, podem obter-se as proteínas híbridas SAH-CD4 a partir do meio de cultura; alguns destes híbridos têm uma resistência aumentada à clivagem proteolítica na região de charneira entre as duas partes (figura 35).

/7 47 ·; .¾

E.13.2. Mutação de pares de aminoácidos dibãsicos.

Outra maneira de evitar a clivagem por endoproteases com especificidade para os pares de aminoácidos dibãsicos consiste em suprimir esses fragmentos na área da região de charneira entre as moléculas da SAH e da CD4 (figura 37), ou uma área da região de charneira entre a CD4 e a SAH (figura 38). Como exemplo disso, a região de charneira na proteína híbrida SAH-V1V2 cuja estrutura é codificada pelo plasmídio pYG308B encontra-se representada na figura 37 (quadro 1) e acentua a presença de um par Lys-Lys na região C-terminal da SAH e de outros dois pares desse tipo na região N-terminal do domínio VI da GD4. Usando mutagénese dirigida especificamente a um sítio, estas zonas de clivagem endoproteásica potencial podem ser suprimidas pela mudança da segunda lisina em cada par substituindo-a por uma glutamina (Risler J.L et al., J. Mol. Biol. 204 (1988) 1019-1029) por exemplo graças à utilização do plasmídio M13-ompA-CD4 que serve de matriz e aos oligodesoxinucleótidos Sql090 e Sql091 (os codões que especificam a glutamina encontram-se representados na estrutura a seguir com as letras a negrito):

5'-GTGCTGGGCAAACAAGGGGATACAG-3’

5’-GGCTTAAAGCAAGTGGTGCTG-3' plasmídio M13-ompA-CD4 ê uma estrutura derivada do plasmídio M13-CD4 no qual a sequência de sinal do gene ompA do E. coli foi objecto de fusão dentro do mesmo quadro para dentro /7 5* &

da estrutura do receptor CD4 usando um fragmento MstII obtido por PCR a montante do domínio VI (exemplo 1).

E.13.3 Introdução de uma região de charneira sintética.

Com o intuito de promover uma interacção óptima entre as moléculas de CD4 fundidas com a SAH e a proteína gpl20 do vírus HIV-1, pode suceder que seja desejável espaçar correctamente as ) duas moléculas de proteína que formam os blocos elementares da proteína híbrida SAH-CD4. Por exemplo, uma região de charneira sintética pode então ser criada entre as moléculas de SAH e de CD4 por mutagenese dirigida a um fragmento de modo a introduzir o fragmento da troponina C entre os aminoácidos 572 e 582 da SAH de estrutura madura (figura 37, quadro 3). Neste particular exemplo, introduziu-se o péptido de junção graças a uma mutagenese dirigida a um fragmento, graças ao uso de um fago M13 recombinante (que transportava um fragmento PstI-SacI que codifica a estrutura de fusão dentro do mesmo quadro entre a região C-terminal da SAH e a parte C-terminal do receptor CD4) como matriz e o oligodesoxi. nucleótido Sql445:

5’-TGCTTTGCCGAGGAGGGTAAGGAAGACGCTAAGGGTAAGTCTGAAGAAGAAGCCTTAGGCTTAAAGAAA-3'.

Técnicas semelhantes também permitem que se faça a introdução de regiões de charneira sintéticas de estrutura semelhante entre as moléculas de SAH e de CD4 (péptido de junção, figura 38, quadro 3).

-7 6EXEMPLO 14: A EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS HÍBRIDAS SOB O CONTROLO

DE DIFERENTES PROMOTORES.

Para uma determinada proteína segregada por células a nível ou concentração elevada, existe um limiar acima do qual o nível de expressão é incompatível com a sobrevivência da célula. Daí decorre existirem certas combinações da proteína segregada, do promotor utilizado para controlar á sua expressão e do universo ) genético que são óptimos para a mais eficiente e a menos onerosa de todas as produções. É por esse motivo importante que seja possível expressar as proteínas híbridas que são o objecto da presente invenção, sob o controlo de vários promotores. Os genes compósitos que codificam as estruturas dessas proteínas são em geral transportados por fragmentos de restrição HindiII que podem ser objecto de clonagem com a orientação mais adequada para dentro da estrutura de um fragmento HindiII de uma cassete de expressão funcional de vectores que se replicam em fungos. A cassete de expressão pode conter promotores que permitam a expressão constitutiva ou regulada da proteína híbrida, dependendo isso do nível de expressão que se deseja. Exemplos de plasmídios com essas características incluem o plasmldio pYGlO5 (promotor Lac4 do K. iactis, figura 32), o plasmldio pYG106 (promotor PGK do S. cerevisiae) ou o plasmldio pYG536 (promotor PH05 do S. cerevisiae) etc.... Há a acrescentar, por outro lado, que se podem utilizar promotores híbridos em que as regiões UAS de promotores que são objecto de regulação fina foram acrescentados à estrutura, «

/ como sucede com os promotores híbridos transportados pelos plasmídios pYG44 (híbrido PGK/LAC, Pedido de Patente de Invenção Europeia NQ. 89 10480), o plasmídio pYG373B (híbrido PGK/GAL), o plasmídio pYG258 (híbrido PGO/LAC) etc....

Claims (22)

1. NOVAS REIVINDICAÇÕES 1 A 23

   1. - Processo para a preparação de uma macromolécula hí brida, caracterizado pelo facto de se acoplar o domínio activo de um receptor para um determinado vírus, ou o domínio activo de uma molécula que se pode ligar ao vírus ou o domínio activo de um receptor de um ligando que intervém num processo patológico, ã albumina ou a uma variante de albumina.
2. 2. - Prccessc de acordo ccm a reivindicação 1, caracterizado peio factc de o receptor ser um receptor de membrana.

   Λ
3. 3.- Processo de acordo com as reivindicações racterizado pelo facto de a macromolécula obtida ser mente proteica.

   1 e 2, casubstancial
4. 4.- Processo de acordo com as reivindicações 1 caracterizado pelo facto de a ligação ser covalente.
5. 5.- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de a ligação covalente ser efectuada por uma ligação peptídica.
6. 6.- Processo de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo facto de o domínio activo do receptor ser o domínio activo de um receptor normalmente utilizado por um vírus para a sua propagação no organismo hospedeiro.
7. 7,- Processo de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de o domínio activo do receptor ser o domínio activo de um receptor que intervém na interiorização de vi rices infecciosos que integram complexos formados com imunoglobu liras.
8. 8.- Processo de acordo com a reivindicação 7, c pelo facto de o domínio activo do receptor ser o o de um receptor do tipo Fc y RIII.

   caracteridomínio àc

   -809. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o domínio activo do receptor ser o domínio ac tivo do receptor CD16.
9. 10. - Processo de acordo com as reivindicações 1, 2, 3,

   4 ou 5, caracterizado pelo facto de o domínio activo do receptor ser o domínio activo de um receptor de um factor que intervém num processo oncogénico.
10. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o domínio activo do receptor ser o domínio activo de um receptor do tipo tirosina quinase.
11. 12. - Processo de acordo com.a ...reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o domínio activo do receptor ser o domínio activo da proto-oncogene-c-erbB-2.
12. 13. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo facto de a albumina utilizada ser de origem humana.
13. 14. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 1 a 6, caracterizado pelo facto de o receptor ser toda ou parte da molécula CD4 utilizada pelo vírus HIV-1 para a sua propagação no organismo hosnedeiro, incluindo todas as variações ar

    -81tificiais da região da interacção com o vírus que possui uma afi nidade molecular para o vírus superior â normal.
14. 15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o receptor ser composto pelos domínios e

    V_o da molécula CD4. z
15. 16. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 15, caracterizado por a macromolécula obtida conter mais do que um domínio activo do receptor ou da molécula susceptível de ligação ao ligante.
16. 17. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo facto de a albumina ou variante de albumina estar localizada na extremidade N-terminal.
17. 18, - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de se incorporar uma função de polimerização ou dimerização para permitir um acréscimo na concentração local do domínio activo do receptor do vírus ou do receptor do ligante associado com o processo oncogénico.
18. 19.- Processo de acordo com as reivindicações 1 a 18, ca racterizado pelo facto de a macromolécula estar isenta de sítio de clivagem proteolítica entre o domínio activo do receptor ou da molécula susceptível de ligação aos referidos ligantes e alhu mina ou variante de albumina.
19. 20. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo facto de as células que foram transformadas, transfectadas ou infectadas por um vector que exprime a referida molécula serem cultivadas.
20. 21. - Processo de acordn com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de a célula transformada ser uma levedura.
21. 22. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de a levedura ser uma estirpe do género Kluvveromyces.

    J
22. 23. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o vector ser um vector de expressão derivado de plasmídeo pKDl no qual os genes A, B e C, a origem de replicação e as repetições inversas foram conservadas.