RS62689B1

RS62689B1 - Dizajn stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu

Info

Publication number: RS62689B1
Application number: RS20211512A
Authority: RS
Inventors: Von Kreudenstein Thomas Spreter; Surjit Bhimarao Dixit; Eric Escobar-Cabrera; David Kai Yuen Poon; Paula Irene Lario
Original assignee: Zymeworks Inc
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2012-11-02
Publication date: 2021-12-31
Also published as: US20130195849A1; CN109897103A; AU2017245451B9; US20200087414A1; US9988460B2; CY1124872T1; BR112014010580B1; AU2017245451A1; US20180030150A1; EP2773671B1; PL2773671T3; DK2773671T3; HRP20211773T1; US10457742B2; AU2012332021B8; KR102052774B1; CA2854233C; US9732155B2; CN104080811B; RU2018142832A

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetna objava generalno obezbeđuje polipeptidne heterodimere, njihove kompozicije, i postupke za pravljenje i upotrebu takvih polipeptidnih heterodimera. Specifičnije, predmetni pronalazak se odnosi na termostabilna multispecifična, uključujući bispecifična, antitela koja sadrže heterodimerni Fc domen.

Pozadina pronalaska

[0002] Bispecifični terapeutici su molekuli zasnovani na antitelima koji mogu istovremeno da vezuju dva odvojena i različita cilja ili različite epitope istog antigena. Bispecifična antitela se sastoje od entiteta zasnovanih na domenu imunoglobulina i pokušavaju da strukturno i funkcionalno oponašaju komponente molekula antitela. Jedna upotreba bispecifičnih antitela bila je preusmeravanje citotoksičnih imunskih efektorskih ćelija za poboljšano ubijanje tumorskih ćelija, kao što je pomoću ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC). U ovom kontekstu, jedan krak bispecifičnog antitela vezuje antigen na tumorskoj ćeliji, i drugi vezuje determinantu eksprimiranu na efektorskim ćelijama. Umrežavanjem tumorskih i efektorskih ćelija, bispecifično antitelo ne samo da dovodi efektorske ćelije u blizinu tumorskih ćelija, već istovremeno pokreće njihovu aktivaciju, što dovodi do efikasnog ubijanja tumorskih ćelija. Bispecifična antitela su takođe upotrebljavana za obogaćivanje hemio- ili radioterapijskih agenasa u tumorskim tkivima kako bi se minimalizovali štetni efekti na normalno tkivo. U ovom okruženju, jedan krak bispecifičnog antitela vezuje antigen eksprimiran na ćeliji koja je ciljana za uništenje, i drugi krak isporučuje hemioterapijski lek, radioizotop, ili toksin. Idući izvan bispecifika, postoji potreba za proteinskim terapeuticima da bi postigli svoju efikasnost ciljanim delovanjem na više modaliteta istovremeno. Takvi kompleksni i novi biološki efekti mogu se postići sa proteinskim terapeuticima dizajniranjem višeciljnog vezivanja i multifunkcionalnih aspekata u proteinu.

[0003] Potrebna je robusna skela koja obezbeđuje okvir za fuzionisanje drugih funkcionalnih bojevih glava ili domena koji vezuju ciljne proteine kako bi se dizajnirali ovi multifunkcionalni i terapeutici za višeciljno vezivanje. Idealno, skela ne bi trebalo da obezbedi samo okvir već i da učini dostupnim niz drugih terapijski relevantnih i vrednih svojstava dizajniranom terapeutiku. Glavna prepreka u opštem razvoju bispecifičnih i multifunkcionalnih terapeutika zasnovanih na antitelu bila je teškoća proizvodnje materijala dovoljnog kvaliteta i kvantiteta i za pretkliničke i kliničke studije. U struci ostaje potreba za polipeptidnim konstruktima koji sadrže pojedinačne varijabilne domene kao domene za vezivanje proteina koji su povezani sa varijantnim Fc regionom, pri čemu navedeni varijantni Fc sadrži CH3 domene, koji su modifikovani da selektuju heterodimere sa povećanom stabilnošću i čistoćom.

SAŽETAK PRONALASKA

[0004] Obezbeđen je u skladu sa jednim aspektom pronalaska izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji sadrži modifikovani heterodimerni CH3 domen, navedeni modifikovani CH3 domen sadrži:

prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom;

pri čemu prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije na pozicijama L351, F405 i Y407, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije na pozicijama T366, K392 i T394 u poređenju sa CH3 domenom sekvence teškog lanca IgG1 kao što je izneto u Tabeli B, pri čemu amino-kiselinska supstitucija na poziciji L351 je L351Y, amino-kiselinska supstitucija na poziciji F405 je F405A, amino-kiselinska supstitucija na poziciji Y407 je Y407V, amino-kiselinska supstitucija na poziciji T366 je T366I ili T366L, aminokiselinska supstitucija na poziciji K392 je K392L ili K392M, i amino-kiselinska supstitucija na poziciji T394 je T394W; dodatno pri čemu najmanje jedan od prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom sadrži T350V supstituciju; dodatno pri čemu heterodimerni CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje 74 °C i čistoću od najmanje 95%;

dodatno pri čemu je heteromultimerni Fc konstrukt zasnovan na humanom imunoglobulinu tipa G1 (IgG1); i

dodatno pri čemu je numerisanje amino-kiselinskih ostataka u skladu sa EU indeksom kao što je izneto u Kabatu.

[0005] U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A, i Y407V, i navedeni drugi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366L, K392M, i T394W. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A, i Y407V, i navedeni drugi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366L, K392L, i T394W. U dodatnom primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A, i Y407V, i navedeni drugi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I, K392M, i T394W. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A, i Y407V, i navedeni drugi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I, K392L, i T394W. U određenim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom je polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji S400. U dodatnom primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži modifikaciju S400Z, pri čemu je Z odabrana od pozitivno naelektrisane amino-kiseline i negativno naelektrisane aminokiseline. U nekim primerima izvođenja, pozitivno naelektrisana amino-kiselina je lizin ili arginin, i negativno naelektrisana amino-kiselina je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina. U određenim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od S400E i S400R. U nekim primerima izvođenja obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom je polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji N390. U nekim primerima izvođenja, modifikacija N390 je N390Z, pri čemu je Z odabrana od pozitivno naelektrisane amino-kiseline i negativno naelektrisane amino-kiseline. U primeru izvođenja, N390Z je N390R. U određenim primerima izvođenja izolovanog heteromultimernog Fc konstrukta koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom je polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju S400E, i navedeni drugi polipeptid sa CH3 domenom je polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži aminokiselinsku modifikaciju N390R. U nekim primerima izvođenja izolovanog heteromultimernog Fc konstrukta koji je ovde opisan, svaki od prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom je polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom, jedan navedeni polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju Q347R i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju K360E.

[0006] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji sadrži modifikovani heterodimerni CH3 domen, navedeni modifikovani CH3 domen sadrži: prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje tri amino-kiselinske modifikacije u poređenju sa polipeptidom sa CH3 domenom divljeg tipa, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje tri amino-kiselinske modifikacije u poređenju sa polipeptidom sa CH3 domenom divljeg tipa; pri čemu najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju K392J pri čemu je J odabrana od L, I; pri čemu navedeni prvi i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom prvenstveno formiraju heterodimerni CH3 domen sa temperaturom topljenja (Tm) od najmanje oko 74 °C i čistoćom od najmanje 95%; i pri čemu najmanje jedna amino-kiselinska modifikacija nije amino-kiselina koja je na interfejsu između navedenog prvog i navedenog drugog polipeptida sa CH3 domenom. Ovde je opisan heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži najmanje jednu T350X modifikaciju, gde je X prirodna ili neprirodna amino-kiselina odabrana od valina, izoleucina, leucina, metionina, i njihovih derivata ili varijanti. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži najmanje jednu T350V modifikaciju. U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C ili više. U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima Tm od oko 77 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domen ima Tm od oko 80 °C ili više. Ovde je opisan izolovani heteromultimerni Fc konstrukt pri čemu je najmanje jedan polipeptid sa CH3 domenom polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju najmanje jednog od K409 i T411. Ovde je takođe opisan izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji sadrži najmanje jednu od K409F, T411E i T411D. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan pri čemu je najmanje jedan polipeptid sa CH3 domenom polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju D399. U nekim primerima izvođenja, amino-kiselinska modifikacija D399 je najmanje jedna od D399R i D399K.

[0007] U jednom aspektu je opisan izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji sadrži modifikovani heterodimerni CH3 domen, navedeni modifikovani CH3 domen sadrži: prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje tri amino-kiselinske modifikacije u poređenju sa polipeptidom sa CH3 domenom divljeg tipa, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje tri amino-kiselinske modifikacije u poređenju sa polipeptidom sa CH3 domenom divljeg tipa; pri čemu najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju K392J pri čemu je J odabrana od L, I ili amino-kiseline čija zapremina bočnog lanca nije značajno veća od zapremine bočnog lanca K; pri čemu navedeni prvi i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom prvenstveno formiraju heterodimerni CH3 domen sa temperaturom topljenja (Tm) od najmanje oko 74 °C i čistoćom od najmanje 95%; i pri čemu najmanje jedna amino-kiselinska modifikacija nije amino-kiselina koja je na interfejsu između navedenog prvog i navedenog drugog polipeptida sa CH3 domenom. U određenim primerima izvođenja je heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži najmanje jednu T350X modifikaciju, pri čemu je X prirodna ili neprirodna amino-kiselina odabrana od valina, izoleucina, leucina, metionina, i njihovih derivata ili varijanti. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži najmanje jednu T350V modifikaciju. U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C ili više. U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima Tm od oko 77 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domen ima Tm od oko 80 °C ili više. U određenim primerima izvođenja izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu je prvi polipeptid sa CH3 domenom polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od K409F, T411E i T411D, i drugi polipeptid sa CH3 domenom je polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od Y407A, Y407I, Y407V, D399R i D399K. U nekim primerima izvođenja je bilo koji od izolovanih heteromultimernih Fc konstrukata koji su ovde opisani, koji dodatno sadrže prvi modifikovani CH3 domen koji sadrži jednu od amino-kiselinskih modifikacija T366V, T366I, T366A, T366M, i T366L; i drugi modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju L351Y. U nekim primerima izvođenja je bilo koji od izolovanih heteromultimernih Fc konstrukata koji su ovde opisani, koji dodatno sadrže prvi modifikovani CH3 domen koji sadrži jednu od aminokiselinskih modifikacija K392L ili K392E; i drugi modifikovani CH3 domen koji sadrži jednu od amino-kiselinskih modifikacija S400R ili S400V.

[0008] Ovde je opisan izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom, pri čemu svaki polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži najmanje četiri amino-kiselinske mutacije, pri čemu najmanje jedan od navedenog prvog i navedenog drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom sadrži mutaciju odabranu od N390Z i S400Z, pri čemu je Z odabrana od pozitivno naelektrisane aminokiseline i negativno naelektrisane amino-kiseline, i pri čemu navedeni prvi i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom prvenstveno formiraju heterodimerni CH3 domen sa temperaturom topljenja (Tm) od najmanje oko 70 °C i čistoćom od najmanje 90%. Kao što je ovde opisano, izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, može da sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na pozicijama F405 i Y407 i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji T394. U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji L351. U određenim aspektima izolovanog heteromultimera koji je ovde opisan, navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži modifikaciju najmanje jedne od pozicija T366 i K392. U nekim aspektima izolovanog heteromultimera koji je ovde opisan, modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C i formira se sa čistoćom od najmanje oko 95%. U određenim primerima izvođenja je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, najmanje jedan polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije najmanje jednog od N390R, S400E i S400R. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, jedan od navedenog prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije pozicije 347 i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji 360. U određenim primerima izvođenja je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T350V. U specifičnim primerima izvođenja je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od L351Y, F405A i Y407V; i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od T366L, T366I, K392L, K392M i T394W. Ovde je opisan izolovani heteromultimer, prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na pozicijama D399 i Y407, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na pozicijama K409 i T411. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži aminokiselinsku modifikaciju na poziciji L351, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na poziciji T366 i K392. U specifičnim primerima izvođenja su izolovani heteromultimeri koji su ovde opisani, najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T350V. U određenim primerima izvođenja su izolovani heteromultimeri koji su ovde opisani, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C ili više i formira se sa čistoćom od najmanje oko 95%. Ovde su opisani izolovani heteromultimerni Fc konstrukti, navedeni prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije odabrane od L351Y, D399R, D399K, S400D, S400E, S400R, S400K, Y407A, i Y407V; i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije odabrane od T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392I, K392D, K392E, K409F, K409W, K411D i T411E.

[0009] Ovde je opisan izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom, pri čemu svaki polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži najmanje tri amino-kiselinske mutacije, pri čemu jedan od navedenog prvog i navedenog drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom sadrži mutaciju odabranu od T411E i T411D, i pri čemu navedeni prvi i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom prvenstveno formiraju heterodimerni CH3 domen sa temperaturom topljenja (Tm) od najmanje oko 70 °C i čistoćom od najmanje 90%. U primeru izvođenja je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt pri čemu navedeni prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na pozicijama F405 i Y407 i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji T394. U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji L351. U određenim aspektima, je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži modifikaciju najmanje jedne od pozicija T366 i K392. U nekim aspektima, je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C i formira se sa čistoćom od najmanje oko 95%. U određenim aspektima, je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, najmanje jedan polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije najmanje jednog od N390R, S400E i S400R. U nekim aspektima je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, jedan od navedenog prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije pozicije 347 i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji 360. U određenim aspektima je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži aminokiselinsku modifikaciju T350V. U specifičnim aspektima je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od L351Y, F405A i Y407V; i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od T366L, T366I, K392L, K392M i T394W. U određenim aspektima ovde je opisan izolovani heteromultimer, prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na pozicijama D399 i Y407, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na pozicijama K409 i T411. U nekim aspektima je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji L351, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na poziciji T366 i K392. U specifičnim aspektima su izolovani heteromultimeri koji su ovde opisani, najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T350V. U određenim aspektima su izolovani heteromultimeri koji su ovde opisani, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C ili više i formira se sa čistoćom od najmanje oko 95%. U određenim aspektima obezbeđeni su izolovani heteromultimerni Fc konstrukti koji su ovde opisani, navedeni prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije odabrane od L351Y, D399R, D399K, S400D, S400E, S400R, S400K, Y407A, i Y407V; i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije odabrane od T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392I, K392D, K392E, K409F, K409W, K411D i T411E.

[0010] Ovde je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt iz pronalaska, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I, K392M i T394W.

[0011] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt iz pronalaska, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I, K392L i T394W.

[0012] U određenom aspektu je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt iz pronalaska, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366L, K392M i T394W.

[0013] U nekim aspektima je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt iz pronalaska, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366L, K392L i T394W.

[0014] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt iz pronalaska, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, L351Y, F405A i Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži aminokiselinske modifikacije T350V, T366L, K392L i T394W.

[0015] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt iz pronalaska, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, L351Y, S400R, F405A, Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, T366L, K392M i T394W.

[0016] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt iz pronalaska, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, L351Y, S400E, F405A, Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, T366L, N390R, K392M i T394W.

1

[0017] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt iz pronalaska, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, L351Y, F405A, Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži aminokiselinske modifikacije T350V, T366L, K392L i T394W.

[0018] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366V, K392L, K409F i T411E; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, D399R, i Y407A.

[0019] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366V, K392L, K409F i T411E; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, D399R, S400R i Y407A.

[0020] U skladu sa jednim aspektom koji je ovde opisan, obezbeđen je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera, pri čemu heterodimerni Fc region dodatno sadrži varijantni CH2 domen koji sadrži najmanje jednu asimetričnu amino-kiselinsku modifikaciju za promovisanje selektivnog vezivanja Fcgama receptora. U jednom aspektu, varijantni CH2 domen selektivno vezuje Fcgama IIIa receptor u poređenju sa CH2 domenom divljeg tipa. U jednom aspektu, modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 70 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C. U nekim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 80 °C.

[0021] U drugom aspektu je obezbeđen izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži aminokiselinske mutacije, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 70°C ili više, i pri čemu navedeni modifikovani CH3 domen rezultuje formiranjem heterodimernog Fc regiona sa povećanom stabilnošću u poređenju sa CH3 domenom koji ne sadrži amino-kiselinske mutacije. U jednom primeru izvođenja, heterodimerni Fc region ne sadrži dodatnu disulfidnu vezu u CH3 domenu u odnosu na Fc region divljeg tipa. U alternativnom primeru izvođenja, heterodimerni Fc region sadrži najmanje jednu dodatnu disulfidnu vezu u modifikovanom CH3 domenu u odnosu na Fc region divljeg tipa, pod uslovom da je temperatura topljenja (Tm) od oko 70 °C ili više u odsustvu dodatne disulfidne veze. U sledećem primeru izvođenja, heterodimerni Fc region sadrži najmanje jednu dodatnu disulfidnu vezu u modifikovanom CH3 domenu u odnosu na Fc region divljeg tipa, i pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 77,5 °C ili više.

[0022] U jednom primeru izvođenja obezbeđen je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 74 °C ili više i heterodimerni Fc region se formira sa čistoćom od oko 95% ili više ili se heterodimerni Fc region formira sa čistoćom od oko 98% ili više.

[0023] Takođe je u određenim primerima izvođenja obezbeđen izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži jednu ili više amino-kiselinskih mutacija koje rezultuju formiranjem heterodimernog Fc regiona sa povećanom stabilnošću u poređenju sa CH3 domenom koji ne sadrži navedenu jednu ili više amino-kiselinskih mutacija, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 74 °C ili više. U sledećem aspektu koji je ovde opisan, heterodimerni Fc region se formira u rastvoru sa čistoćom od oko 98% ili više, i Tm oko 73 °C ili pri čemu se heterodimerni Fc region formira sa čistoćom od oko 90% ili više, i Tm oko 75 °C.

[0024] U određenim primerima izvođenja obezbeđen je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi i drugi polipeptid sa CH3 domenom, pri čemu najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T350V. U određenim primerima izvođenja obezbeđen je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T350V i drugi polipeptid sa CH3 domenom koji takođe sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T350V. U određenim aspektima je opisan izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y i Y407A i drugi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366A i K409F. U jednom aspektu, prvi polipeptid sa CH3 domenom ili drugi polipeptid sa CH3 domenom sadrži dodatnu aminokiselinsku modifikaciju na poziciji T411, D399, S400, F405, N390, ili K392. Aminokiselinska modifikacija na poziciji T411 je odabrana od T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ili T411W. Amino-kiselinska modifikacija na poziciji D399 je odabrana od D399R, D399W, D399Y ili D399K. Amino-kiselinska modifikacija na poziciji S400 je odabrana od S400E, S400D, S400R, ili S400K. Amino-kiselinska modifikacija na poziciji F405 je odabrana od F405I, F405M, F405T, F405S, F405V ili F405W. Amino-kiselinska modifikacija na poziciji N390 je odabrana od N390R, N390K ili N390D. Amino-kiselinska modifikacija na poziciji K392 je odabrana od K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ili K392E.

[0025] U određenim aspektima opisan je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V i L351Y i drugi polipeptid sa CH3 domenom koji takođe sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V i L351Y.

[0026] U određenim aspektima opisan je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju Y407A i drugi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366A i K409F. U jednom aspektu, prvi polipeptid sa CH3 domenom ili drugi polipeptid sa CH3 domenom sadrži dodatne amino-kiselinske modifikacije K392E, T411E, D399R i S400R. U sledećem aspektu, prvi polipeptid sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju D399R, S400R i Y407A, i drugi polipeptid sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T366A, K409F, K392E i T411E. U dodatnom aspektu, modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 74 °C ili više, i heterodimer ima čistoću od oko 95% ili više.

[0027] U određenim aspektima opisan je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na pozicijama L351 i amino-kiselinsku modifikaciju Y407A i drugi polipeptid sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji T366 i amino-kiselinsku modifikaciju K409F. U jednom aspektu amino-kiselinska modifikacija na poziciji L351 je odabrana od L351Y, L351I, L351D, L351R ili L351F. U drugom aspektu, amino-kiselinska modifikacija na poziciji Y407 je odabrana od Y407A, Y407V ili Y407S. U još jednom aspektu amino-kiselinska modifikacija na poziciji T366 je odabrana od T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V ili T366W. U jednom aspektu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 75° C ili više, i heterodimer ima čistoću od oko 90% ili više.

[0028] U određenim aspektima opisan je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji F405 i amino-kiselinske modifikacije L351Y

1

i Y407V i drugi polipeptid sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T394W. U jednom aspektu prvi polipeptid sa CH3 domenom ili drugi polipeptid sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na pozicijama K392, T411, T366, L368 ili S400. Aminokiselinska modifikacija na poziciji F405 je F405A, F405I, F405M, F405T, F405S, F405V ili F405W. Amino-kiselinska modifikacija na poziciji K392 je K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ili K392E. Amino-kiselinska modifikacija na poziciji T411 je T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ili T411W. Amino-kiselinska modifikacija na poziciji S400 je S400E, S400D, S400R ili S400K. Amino-kiselinska modifikacija na poziciji T366 je T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V ili T366W. Amino-kiselinska modifikacija na poziciji L368 je L368D, L368R, L368T, L368M, L368V, L368F, L368S i L368A.

[0029] U sledećem primeru izvođenja obezbeđen je izolovani heteromultimer iz pronalaska koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V i drugi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T394W. U jednom aspektu, drugi polipeptid sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T366L ili T366I.

[0030] U određenim aspektima opisan je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu od amino-kiselinskih modifikacija Y349C, F405A i Y407V i drugi polipeptid sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I, K392M i T394W.

[0031] U određenim aspektima opisan je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V i drugi polipeptid sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinske modifikacije K392M i T394W, i jednu od T366L i T366I.

[0032] U određenim aspektima opisan je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije F405A i Y407V i drugi polipeptid sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinske modifikacije T366L i T394W.

[0033] U određenim aspektima opisan je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije F405A i Y407V i drugi polipeptid sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I i T394W.

[0034] U određenim primerima izvođenja heteromultimera obezbeđeno je bispecifično antitelo ili multispecifično antitelo.

[0035] U sledećem primeru izvođenja obezbeđena je kompozicija koja sadrži heteromultimer iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0036] U sledećem primeru izvođenja obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira heteromultimer iz pronalaska.

[0037] U određenim primerima izvođenja obezbeđen je heteromultimer, pri čemu heteromultimer sadrži najmanje jedno terapijsko antitelo. U jednom aspektu terapijsko antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od abagovomaba, adalimumaba, alemtuzumaba, aurograba, bapineuzumaba, baziliksimaba, belimumaba, bevacizumaba, briakinumaba, kanakinumaba, katumaksomaba, certolizumab pegola, cetuksimaba, daklizumaba, denozumaba, efalizumaba, galiksimaba, gemtuzumab ozogamicina, golimumaba, ibritumomab tiuksetana, infliksimaba, ipilimumaba, lumiliksimaba, mepolizumaba, motavizumaba, muromonaba, mikograba, natalizumaba, nimotuzumaba, okrelizumaba, ofatumumaba, omalizumaba, palivizumaba, panitumumaba, pertuzumaba, ranibizumaba, reslizumaba, rituksimaba, teplizumaba, tocilizumaba/atlizumaba, tozitumomaba, trastuzumaba, ProxiniumTM, RencarexTM, ustekinumaba, i zalutumumaba.

[0038] U sledećem primeru izvođenja heteromultimera iz pronalaska obezbeđen je postupak lečenja kancera kod pacijenta koji ima kancer okarakterisan kancerskim antigenom, navedeni postupak sadrži primenu navedenom pacijentu terapijski efikasne količine heteromultimera.

[0039] U sledećem primeru izvođenja heteromultimera iz pronalaska obezbeđen je postupak lečenja imunskih poremećaja kod pacijenta koji ima imunski poremećaj okarakterisan imunskim antigenom, navedeni postupak sadrži primenu navedenom pacijentu terapijski efikasne količine heteromultimera.

[0040] U određenim aspektima, modifikovani Fc region koji se koristi u heteromultimernim konstruktima koji su ovde opisani sadrži imunoglobuline tipa G na primer imunoglobuline koji su definisani kao imunoglobilini klase 2 (IgG2) ili imunoglobulini klase 3 (IgG3). U nekim aspektima, modifikovani Fc region koji se koristi u heteromultimernim konstruktima koji su ovde opisani sadrži imunoglobulin M, ili IgM. U nekim aspektima, modifikovani Fc region koji se koristi u heteromultimernim konstruktima koji su ovde opisani sadrži imunoglobulin A, ili IgA. U nekim aspektima, modifikovani Fc region koji se koristi u heteromultimernim konstruktima koji su ovde opisani sadrži imunoglobulin D, ili IgD. U nekim aspektima, modifikovani Fc region koji se koristi u heteromultimernim konstruktima koji su ovde opisani sadrži imunoglobulin E, ili IgE. U određenim aspektima, modifikovani Fc region koji se koristi u heteromultimernim konstruktima koji su ovde opisani sadrži sve

1

slučajeve izotipova imunoglobulina G, na primer imunoglobuline koji su definisani kao imunoglobilini klase 1 (IgG1), klase 2 (IgG2), klase 3 (IgG3) ili klase 4 (IgG4).

KRATAK OPIS SLIKA

[0041]

Slika 1 je grafička 3-D struktura antitela divljeg tipa koja pokazuje regione CH3 (gore), CH2 (sredina) i region receptora. Pravougaonik istačkanom linijom na levoj strani je proširen na desnu stranu i pokazuje dva regiona, Region 1 i Region 2, ciljne oblasti CH3;

Slika 2 je grafički 3-D prikaz koji pokazuje ostatak divljeg tipa na poziciji 368;

Slika 3 je grafički 3-D prikaz Regiona 1 koji pokazuje mutiranu poziciju 368;

Slika 4 je grafički 3-D prikaz dodatnih mutacija u Regionu 2;

Slika 5 je tabela in silico proračuna za rezultat sukoba, razliku površine interfejsa, razliku pakovanja, razliku elektrostatičke energije i ukupan "rezultat afiniteta" za prve tri varijante AZ1, AZ2 i AZ3;

Slika 6 pokazuje grafičku 3-D sliku koja pokazuje varijante AZ2 i AZ3, koje su "sagrađene na" varijanti AZ1;

Slika 7 pokazuje grafičke 3-D prikaze AZ2 i AZ3 varijanti;

Slika 8 pokazuje tabelu kao na Slici 5 ali za AZ1, AZ2 i AZ3 heterodimere, i potencijalne homodimere. Rezultat afiniteta nije pokazan za homodimere, pošto nije relevantan;

Slika 9 je grafički prikaz 3-D prikaza divljeg tipa (levo) i mutiranog AZ4 (desno);

1

Slika 10 je tabela kao na Slici 5 koja pokazuje in silico proračune za AZ4 heterodimer i potencijalne homodimere;

Slika 11 je grafički prikaz CH3 varijanti AZ5 (levo) i AZ6 (desno);

Slika 12 je tabela kao što je opisano za Sliku 5 koja pokazuje in silico podatke za AZ4, AZ5 i AZ6;

Slika 13 je grafički 3-D prikaz antitela sa leve strane, sa crtežom mogućnosti karakteristika vezivanja na regionu receptora upotrebom heterodimernog pristupa;

Slika 14 je šematski prikaz IgG molekula;

Slika 15 pokazuje višestruko poravnanje sekvenci Fcγ receptora. ID Genebank/Uniprot sekvence: FcγRIIA (sp P12318), FcγRIIB (sp P31994), FcγRIIC (gi 126116592), FcγRIIIA (sp P08637), FcγRIIIB (sp 075015);

Slika 16 je šematski prikaz kristalne strukture Fc-FcγRIIIb kompleksa [PDB ID: 1T83, Radaev & Sun]. Uočen je 1:1 kompleks Fc i Fcγ receptora sa asimetričnim kontaktom između dva lanca Fc i FcγR;

Slika 17 pokazuje šemu multifunkcionalnih molekula zasnovanih na skeli asimetričnog Fc formiranog od heterodimernih varijanti koje su ovde opisane: Skela asimetričnog Fc i Asimetrični Fc-monomerni IgG krak;

Slika 18 pokazuje šemu multifunkcionalnih molekula zasnovanih na skeli asimetričnog Fc formiranog od heterodimernih varijanti koje su ovde opisane: Asimetrični Fcmonospecifični IgG kraci i Asimetrični Fc - bispecifični IgG kraci (zajednički laki lanac);

Slika 19 pokazuje ilustraciju multifunkcionalnih molekula zasnovanih na skeli asimetričnog Fc formiranog od heterodimernih varijanti koje su ovde opisane. Asimetrični Fc-bispecifični IgG kraci i funkcionalni molekul kao što je toksin;

1

Slika 20 ilustruje multifunkcionalne molekule zasnovane na skeli asimetričnog Fc formiranog od heterodimernih varijanti koje su ovde opisane: Asimetrični Fcpojedinačni scFv krak i Asimetrični Fc- bispecifični scFv kraci;

Slika 21 ilustruje alternativne multifunkcionalne molekule zasnovane na skeli asimetričnog Fc formiranog od heterodimernih varijanti koje su ovde opisane: Asimetrični Fc-trispecifični scFv kraci i Asimetrični Fc-tetraspecifični scFv kraci.

Slika 22 pokazuje da asimetrični dizajn mutacija na jednoj strani Fc za bolju FcγR selektivnost introdukuje produktivnu stranu za FcγR interakcije i neproduktivnu stranu sa interakcijama nalik divljem tipu. Mutacije na neproduktivnoj strani Fc mogu biti introdukovane kako bi se blokirale interakcije sa FcR i pristrasna polarnost Fc tako da interaguje samo na produktivnoj strani.

Slika 23 pokazuje amino-kiselinsku sekvencu za humani IgG1 divljeg tipa.

Slika 24 pokazuje iterativni proces dizajna heterodimernog Fc, kombinujući strategije pozitivnog i negativnog dizajna kao što je detaljno opisano u nastavku.

Slike 25A-25C pokazuju in vitro test koji je upotrebljen za određivanje čistoće heterodimera. Test se zasniva na skeli monospecifičnog antitela pune dužine sa dva Fc teška lanca različite molekulske težine; Teški lanac A ima C-terminusnu His oznaku (His) i teški lanac B C-terminusnu mRFP oznaku koja se može isecati (RFP). Dva teška lanca A (His) i B (RFP) se eksprimiraju u različitim relativnim odnosima zajedno sa fiksnom količinom lakog lanca, što dovodi do 3 moguće vrste dimera sa različitim molekulskim težinama: a) Homodimer lanac A(His)/lanac A (His) (∼150 kDa); b) Heterodimer lanac A (His)/lanac B (RFP) (∼175 kDa); c) Homodimer lanac B (RFP)/lanac B (RFP) (∼200 kDa). Posle ekspresije, kao što je opisano u Primeru 2, odnos heterodimera naspram dva homodimera određen je pomoću SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima, što omogućava razdvajanje 3 vrste dimera po molekulskoj težini. SDS-PAGE gelovi su obojeni sa Coomassie Brilliant Blue. Slika 25A: Testirane varijante su bile WT lanac A (His) sam; WT lanac B (RFP) sam; WT lanac A (His) plus lanac B (RFP) sami; Kontrola 1 lanac A (His) plus lanac B (RFP), za koji je prijavljena čistoća heterodimera od >95%. Kompozicija dimernih traka je verifikovana pomoću

1

Western blota sa antitelima usmerenim prema IgG-Fc (anti-Fc), mRFP oznaci (antimRFP) i His oznaci (anti-His), kao što je gore ilustrovano. SDS-PAGE pokazuje jednu traku za His/His homodimer, dvostruku traku za His/RFP heterodimer i više traka za RFP homodimer. Više traka su artefakt mRFP oznake i potvrđeno je da ne utiču na fizička svojstva Fc heterodimera. Slika 25B: SDS-PAGE test je validiran sa publikovanim Fc heterodimernim varijantama Kontrola 1-4 kao kontrolama, videti Tabelu A. Varijante su eksprimirane sa različitim relativnim odnosima lanca A (His) naspram lanca B (RFP): Specifično, odnos 1:3 je ekvivalentan odnosu LC, HC_His, HC_mRFP od 25%, 10%, 65%; odnos 1:1 od 25%, 20%, 55% i odnos 3:1 od 25%, 40%, 35% respektivno (prividna 1:1 ekspresija lanca A (His) prema lancu B (RFP) je određeno da je blizu 20%/55% (His/RFP) za WT Fc). Slika 25C pokazuje SDS-PAGE test pod neredukcionim uslovima za određivanje čistoće heterodimera Skela 1 varijanti. Fc varijante su eksprimirane sa različitim relativnim odnosima lanca A (His) naspram lanca B (RFP) i analizirane pomoću SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima kao što je opisano na Slici 2. Specifično, odnos 1:3 je ekvivalentan odnosu LC, HC_His, HC_mRFP od 25%, 10%, 65%; odnos 1:1 od 25%, 20%, 55% i odnos 3:1 od 25%, 40%, 35% respektivno (prividna 1:1 ekspresija lanca A (His) prema lancu B (RFP) je određeno da je blizu 20%/55% (His/RFP) za WT Fc).

Slike 26A-26B pokazuju heterodimerne Fc varijante eksprimirane sa specifičnim odnosom lanca A (His) naspram lanca B (RFP) (videti Tabelu 2), prečišćene afinitetnom hromatografijom sa proteinom A i analizirane pomoću SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima kao što je opisano na Slikama 25A-25C. Slika 26A ilustruje klasifikaciju heterodimera zasnovanu na čistoći koja je uočena vizuelnom inspekcijom rezultata SDS-PAGE. Za poređenje na gel je stavljena ekvivalentna količina proteinom A prečišćenog proizvoda. Ova definicija čistoće zasnovana na SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima potvrđena je pomoću LC/MS na odabranim varijantama (videti Sliku 28). Slika 26B obezbeđuje primere rezultata SDS-PAGE odabranih heterodimernih varijanti prečišćenih proteinom A (AZ94, AZ86, AZ70, AZ33 i AZ34).

Slike 27A-27B ilustruju DSC analize za određivanje temperature topljenja heterodimernog CH3-CH3 domena formiranog od stane heterodimernih varijanti koje su ovde opisane. Za određivanje temperatura topljenja upotrebljena su dva nezavisna postupka. Slika 27A obezbeđuje termograme prilagođene na 4 nezavisne ne-2-stanja

1

tranzicije i optimizovane da daju vrednosti za CH2 i Fab tranzicije bliske prijavljenim literaturnim vrednostima za Herceptin od ∼72 °C (CH2) i ∼82 °C (Fab). Slika 27B pokazuje da su normalizovani i korigovani za početne vrednosti termogrami za heterodimerne varijante oduzeti od WT da daju pozitivan i negativan pik razlike samo za CH3 tranziciju.

Slika 28 ilustruje LC/MS analizu primera varijante AZ70 kao što je opisano u primeru 2. Naznačene su očekivane (računati prosek) mase za glikozilovani heterodimer i homodimere. Region konzistentan sa masom heterodimera sadrži glavne pikove koji odgovaraju gubitku glicina (-57 Da) i dodavanju 1 ili 2 heksoze (+162 Da i 324 Da, respektivno). Čistoća heterodimera je klasifikovana kao >90% ukoliko nema značajnih pikova koji odgovaraju bilo kom od homodimera.

Slike 29A-29D pokazuju CH3 interfejs na Sl.29A WT Fc; Sl.29B AZ6; Sl.29C AZ33; Sl. 29D AZ19. Sveobuhvatna in silico analiza, kao što je opisano u odeljku sa detaljnim opisom, i poređenje varijanti sa WT ukazala je da je jedan od razloga za nižu nego WT stabilnost inicijalnog AZ33 heterodimera gubitak interakcije u jezgru/pakovanja Y407 i T366. Inicijalni AZ33 pokazuje neoptimalno pakovanje na ovom hidrofobnom jezgru kao što je ilustrovano na Sl.29B, što sugeriše da bi optimizacija ovog regiona, posebno na poziciji T366 poboljšala stabilnost AZ33. Ovo je ilustrovano na Sl.29C i Sl.29D sa T366I i T366L. Eksperimentalni podaci koreliraju sa ovom strukturnom analizom i pokazuju da T366L daje najveće poboljšanje u Tm. Videti Primer 5.

Slika 30 ilustruje korisnost i važnost analize konformacione dinamike, koja je prikazana na inicijalnoj Skela 1 varijanti AZ8. Struktura posle in silico mutageneze (konformacija okosnice bliska WT) je superponirana sa reprezentativnom strukturom 50 ns simulacijske analize molekulske dinamike. Slika naglašava veliku konformacionu razliku u regionu petlje D399-S400 AZ8 varijante naspram WT, što zauzvrat izlaže hidrofobno jezgro rastvaraču i uzrokuje smanjenu stabilnost AZ8 heterodimera.

Slike 31A-31C ilustruju kako su informacije iz sveobuhvatne in silico analize i MD simulacije upotrebljene u opisanoj strategiji pozitivnog dizajna. Kao što je ilustrovano na Slici 30, jedan od razloga za nižu nego WT stabilnost AZ8 je oslabljena interakcija petlje 399-400 do 409, koja je uglavnom usled gubitka F405 interakcija pakovanja

2

(videti poređenje Sl. 31A (WT) naspram Sl. 31B (AZ8)). Jedna od strategija pozitivnog dizajna bila je optimizacija hidrofobnog pakovanja površine, kako bi se stabilizovala konformacija petlje 399-400. Ovo je postignuto K392M mutacijom koja je ilustrovana na Sl. 31C. Sl. 31C predstavlja heterodimer AZ33, koji ima Tm od 74 ° naspram 68 ° inicijalne varijante AZ8 negativnog dizajna.

Slike 32A-32B ilustruju dinamiku Fc molekula uočenu upotrebom analize glavnih komponenti strukonje molekulske dinamike. Sl. 32A pokazuje trag okosnice Fc strukture kao referencu. Sl. 32B i C predstavljaju prekrivanje dinamike uočene duž najbolja 2 glavna načina kretanja u Fc strukturi. CH2 domeni lanca A i B pokazuju značajno kretanje otvaranja/zatvaranja jedan u odnosu na drugi, dok su CH3 domeni relativno kruti. Mutacije na CH3 interfejsu utiču na relativnu fleksibilnost i dinamiku ovog kretanja otvaranje/zatvaranje u CH2 domenima.

Slike 33A-33C ilustruju pakovanje hidrofobnog jezgra dve Skela-2 varijante naspram WT Sl. 33A WT Fc; Sl. 33B AZ63; i Sl. 33C AZ70. Sveobuhvatna in silico analiza inicijalne Skela-2 varijante sugeriše da je gubitak interakcija Y407-T366 u WT jezgru jedan od razloga za nižu nego WT stabilnost za inicijalne Skela-2 varijante. Gubitak Y407-T366 je delimično kompenzovan K409F mutacijama, ali kao što je ilustrovano na Sl. 33B, posebno T366A mutacija ostavlja šupljinu u hidrofobnom jezgru, što destabilizuje varijantu naspram WT. Ciljno delovanje na ovo hidrofobno jezgro dodatnim mutacijama T366V_L351Y, kao što je pokazano pomoću Fc varijante AZ70 na Sl.33C, pokazalo se uspešnim; AZ70 ima eksperimentalno određenu Tm od 75,5 °C. Videti Tabelu 4 i Primer 6.

Slike 34A-34C ilustruju interakcije petlje 399-400 dve Skela-2 varijante naspram WT:

Sl. 34A WT Fc; Sl. 34B AZ63; i Sl. 34C AZ94. Sveobuhvatna in silico analiza inicijalne Skela-2 varijante sugeriše da gubitak WT sonog mosta K409-D399 (Sl. 34A) usled mutacije K409F i stoga nezadovoljnog D399 (Sl. 34B) uzrokuje ꞌotvorenijuꞌ konformaciju petlje 399-400. Ovo dodatno dovodi do veće izloženosti hidrofobnog jezgra rastvaraču i dodatne destabilizacije varijante naspram WT. Jedna od strategija korišćenih za stabilizaciju 399-400 petlje i kompenzaciju gubitka K409-D399 interakcije bio je dizajn dodatnih sonih mostova D399R-T411E i S400R-K392E kao što je ilustrovano na Sl.34C za varijantu AZ94. Eksperimentalni podaci su pokazali čistoću >95% i Tm od 74 °C. Videti Tabelu 4 i Primer 6. Dodatno, iako AZ94 ima znatno veću čistoću i stabilnost u poređenju sa inicijalnom Skela-2 varijantom (čistoća <90%, Tm 71°C), mutacije hidrofobnog jezgra AZ94 su manje poželjne od 'najboljih' mutacija hidrofobnog jezgra identifikovanih u varijanti AZ70 (Slika 33). Pošto su mutacije u hidrofobnom jezgru u AZ70 (T366V_L351Y) udaljene od mutacija sonog mosta u AZ94 u petlji 399-400, očekuje se da kombinacija amino-kiselinskih mutacija u AZ70 i dodatnih mutacija u AZ94 ima višu temperaturu topljenja nego AZ70 ili AZ94. Ova kombinacija se može testirati kao što je opisano u Primerima 1-4.

Slika 35 ilustruje konstantu asocijacije (Ka(M<-1>)) homodimernog IgG1 Fc, heterodimerne varijante het1 (Kontrola 1): A:Y349C_T366S_L368A_Y407V/B:S354C_T366W i het2 (Kontrola 4): A:K409D_K392D/B:D399K_D356K vezivanja za šest Fcgama receptora. Heterodimerne Fc varijante imaju tendenciju da pokazuju blago izmenjeno vezivanje za Fcgama receptore u poređenju sa IgG1 Fc divljeg tipa. Videti Primer 7.

Slika 36A pokazuje relativnu jačinu vezivanja IgG1 Fc divljeg tipa i njegovih različitih homodimernih i asimetričnih mutantnih oblika za IIbF, IIBY i IIaR receptore, na osnovu jačine vezivanja divljeg tipa kao reference. (Homo Fc S267D) označava jačinu vezivanja homodimernog Fc sa S267D mutacijom na oba lanca. (Het Fc asym S267D) označava jačinu vezivanja heterodimernog Fc sa S267D mutacijom introdukovanom u jedan od dva lanca u Fc. Saopšten je prosek jačine vezivanja dobijen introdukovanjem mutacije na bilo koji od dva Fc lanca. Introdukcija ove mutacije na jednom lancu redukovala je jačinu vezivanja na otprilike polovinu jačine uočene za istu mutaciju na homodimerni način. (Het Fc asym S267D asym E269K) označava jačinu vezivanja heterodimernog Fc sa S267D i E269K mutacijama introdukovanim na asimetričan način na jednom od dva Fc lanca. E269K mutacija blokira interakciju FcgR na jednoj od strana Fc i može sama da smanji jačinu vezivanja za otprilike polovinu onoga što je uočeno za asimetričnu S267D varijantu (Het Fc+S267D). Het Fc ovde se sastoji od CH3 mutacija kao što je naznačeno za varijantu het2 (Kontrola 4) na Slici 35.

Slika 36B pokazuje konstantu asocijacije (Ka(M<-1>)) različitih Fc i njihovih varijanti sa određenim brojem FcgRIIa, FcgRIIb i FcgRIIIa alotipova. Ka za IgG1 Fc divljeg tipa sa različitim Fcg receptorima predstavljena je kao kolone sa horizontalnim osenčenjem.

Barovi sa vertikalnim osenčenjem (homodimer baza2) predstavljaju Ka homodimernog Fc sa mutacijama S239D/D265S/I332E/S298A. Kolone sa zakošenim osenčenjem predstavljaju Ka heterodimernog Fc sa asimetričnim mutacijama A:S239D/D265S/I332E/E269K i B:S239D/D265S/S298A u CH2 domenu. Introdukcijom asimetričnih mutacija može se postići povećana selektivnost između IIIa i IIa/IIb receptora. Heterodimerni Fc ovde se sastoji od CH3 mutacija kao što je naznačeno za varijantu het2 (Kontrola 4) na Slici 35.

Slika 36C pokazuje konstantu asocijacije (Ka (M<-1>)) za IgG1 divljeg tipa i tri druge varijante koje uključuju homodimerne ili asimetrične mutacije u CH2 domenu Fc regiona. Ka za Fc divljeg tipa predstavljena je u koloni osenčenoj ukrštenim linijama. Ka za Fc varijante sa baznom mutacijom S239D/K326E/A330L/I332E/S298A introdukovanom na homodimerni način (homodimer baza1) na oba lanca Fc pokazana je sa kolonom sa zakošenim obrascem. Introdukcija srodnih mutacija na asimetričan način u lance A i B heterodimernog Fc (hetero baza1) pokazana je horizontalnim linijama. Kolona sa vertikalnim osenčenim linijama predstavlja asimetričnu varijantu uključujući E269K mutaciju (hetero baza 1+PD). Heterodimerni Fc ovde se sastoji od CH3 mutacija kao što je naznačeno za varijantu het2 (Kontrola 4) na Slici 35.

Slika 37 - Tabela 6 je lista varijanti CH3 domena zasnovanih na trećoj fazi dizajna kao što je opisano u Primeru 5 za Skelu 1.

Slika 38 - Tabela 7 je lista modifikovanih CH3 domena zasnovanih na trećoj fazi dizajna kao što je opisano u Primeru 6 za Skelu 2.

Slike 39A-39B ilustruju određivanje čistoće varijanti bez C-terminusnih oznaka upotrebom LC/MS. Sl. 39A pokazuje LC/MS sprektre jedne reprezentativne varijante (AZ162: L351Y_F405A_Y407V / T366L_K392L_T394W). Varijanta je eksprimirana prolaznom koekspresijom kao što je opisano u Primerima upotrebom 3 različita odnosa Teški lanac-A prema Teški lanac-B od 1:1,5 (AZ133-1), 1:1 (AZ133-2) i 1,5:1 (AZ133-3). Uzorci su prečišćeni i deglikozilovani sa Endo S tokom 1 sata na 37 °C. Pre MS analize, uzorci su injektirani na Poros R2 kolonu i eluirani u gradijentu sa 20-90% ACN, 0,2% FA za 3 minuta. Pik LC kolone je analiziran sa LTQ-Orbitrap XL masenim spektrometrom (napon konusa: 50 V' tubno sočivo: 215 V; FT rezolucija: 7,500) i

2

integrisan sa Promass softverom za generisanje profila molekulske težine. Sl. 39B pokazuje LC/MS sprektre uzorka Kontrola 2, koji predstavlja varijantu izbočine-uudubljenje (Knobs-into-Holes). Varijanta je eksprimirana prolaznom koekspresijom kao što je opisano u Primerima upotrebom 3 različita odnosa Teški lanac-A prema Teški lanac-B od 1:1,5 (Kontrola 2-1), 1:1 (Kontrola 2-2) i 1,5:1 (Kontrola 2-3). Uzorci su prečišćeni i deglikozilovani sa Endo S tokom 1 sata na 37 °C. Pre MS analize, uzorci su injektirani na Poros R2 kolonu i eluirani u gradijentu sa 20-90% ACN, 0,2% FA za 3 minuta. Pik LC kolone je analiziran sa LTQ-Orbitrap XL masenim spektrometrom (napon konusa: 50 V' tubno sočivo: 215 V; FT rezolucija: 7,500) i integrisan sa Promass softverom za generisanje profila molekulske težine.

Slike 40A-40B Bispecifično vezivanje je demonstrirano upotrebom Fc heterodimer anti-HER2 i anti-HER3 scFv fuzionisanih na N-terminus lanca-A i lanca-B Fc heterodimera. Rezultujuće varijante, bispecifična HER2/HER3 varijanta i dve monovalentnemonospecifične HER2, HER3 varijante ilustrovane su na Slici 40-A (lanac-A tamno sivom; lanac-B svetlije sivom). Slika 40-B demonstrira test bispecifičnog vezivanja.

Slika 41 ilustruje računarski model koji upoređuje IgG1 Fc divljeg tipa i AZ3003. Računarski model za AZ3002 je isti kao i za AZ3003 na poziciji T350. Tabela sumira odabrane heterodimerne varijante i stabilizujući efekat T350V mutacije na CH3 temperaturu topljenja. Na slici je pokazano da su heterodimerne varijante eksprimirane i prečišćene kao što je opisano u Primeru 11. DSC je izvedena kao što je detaljno opisano u Primeru 3 i LC/MS kvantifikacija je izvedena kao što je detaljno opisano u Primeru 11.

Slika 42 ilustruje poređenje kristalne strukture i predviđenog modela vodećeg heterodimera. Mutirani ostaci interfejsa (naznačeni u tabeli) su istaknuti u animiranom prikazu.

Slika 43 prikazuje analizu obrasca glikozilacije prečišćenog vodećeg heterodimera.

Slika 44 ilustruje rezultate procene prinudne degradacije prečišćenog vodećeg heterodimera.

Slika 45 prikazuje šemu procesa prečišćavanja antitela po industrijskom standardu.

Slika 46 prikazuje Sažetak procene nizvodnog prečišćavanja AZ3003 heterodimerne varijante koji pokazuje prinose i izdvajanje u koracima (videti Primer 15 za detalje). Heterodimer je proizveden u 10 l prolazno CHO kao što je detaljno opisano u Primeru 11.

DETALJAN OPIS

[0042] Ovde su obezbeđeni modifikovani CH3 domeni koji sadrže specifične aminokiselinske modifikacije za promovisanje formiranja heteromultimera. U jednom primeru izvođenja, modifikovani CH3 domeni sadrže specifične amino-kiselinske modifikacije za promovisanje formiranja heterodimera (videti, na primer Tabele 1.1-1.3). Opisani u određenim aspektima, modifikovani CH3 domeni sadrže specifične amino-kiselinske modifikacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću (videti, na primer Tabelu 4, Tabelu 6 i Tabelu 7). Stabilnost se meri kao temperatura topljenja (Tm) CH3 domena i povećana stabilnost označava Tm od oko 74 °C ili više. CH3 domeni formiraju deo Fc regiona heteromultimernog, multispecifičnog antitela. Ovde su obezbeđeni u jednom primeru izvođenja heteromultimeri koji sadrže heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera, pri čemu su modifikovani CH3 domeni odabrani od varijanti nabrojanih u Tabeli 1.

[0043] Amino-kiselinske modifikacije koje se koriste za generisanje modifikovanog CH3 domena uključuju, ali nisu ograničene na, amino-kiselinske insercije, delecije, supstitucije, i rearanžmane. Modifikacije CH3 domena i modifikovani CH3 domeni se ovde zajednički označavaju kao "CH3 modifikacije", "modifikovani CH3 domeni", "modifikovani CH3 domeni" ili "CH3 varijante". U određenim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domeni su inkorporisani u molekul po izboru. U skladu sa tim, u jednom primeru izvođenja obezbeđeni su molekuli, na primer polipeptidi, kao što su imunoglobulini (npr. antitela) i drugi vezujući proteini, koji sadrže Fc region (kao što se ovde upotrebljava "Fc region" i slični termini obuhvataju bilo koji domen konstantnog regiona teškog lanca koji se sastoji od najmanje dela CH3 domena) koji inkorporiču modifikovani CH3 domen. Molekuli koji sadrže Fc regione koji sadrže modifikovani CH3 domen (npr. CH3 domen koji sadrži jednu ili više amino-kiselinskih insercija, delecija, supstitucija, ili rearanžmana) su ovde označeni kao "Fc

2

varijante", "heterodimeri" ili "heteromultimeri". Predmetne Fc varijante sadrže CH3 domen koji je asimetrično modifikovan da generiše heterodimerne Fc varijante ili regione. Fc region se sastoji od dva polipeptida konstantnog domena teškog lanca - lanca A i lanca B, koji se mogu upotrebljavati naizmenično pod uslovom da svaki Fc region sadrži jedan lanac A i jedan lanac B polipeptid. Amino-kiselinske modifikacije se introdukuju u CH3 na asimetričan način što rezultuje heterodimerom kada dva modifikovana CH3 domena formiraju Fc varijantu (videti, npr. Tabelu 1). Kao što se ovde upotrebljava, asimetrične amino-kiselinske modifikacije su bilo koje modifikacije u kojima se amino-kiselina na specifičnoj poziciji na jednom polipeptidu (npr. "lanac A") razlikuje od amino-kiseline na drugom polipeptidu (npr. "lanac B") na istoj poziciji heterodimera ili Fc varijante. Ovo može biti rezultat modifikacije samo jedne od dve amino-kiseline ili modifikacije obe amino-kiseline u dve različite aminokiseline iz lanca A i lanca B Fc varijante. Podrazumeva se da modifikovani CH3 domeni sadrže jednu ili više asimetričnih amino-kiselinskih modifikacija.

[0044] Amino-kiselina koja je na interfejsu između prvog i navedenog drugog polipeptida sa CH3 domenom je bilo koja amino-kiselina na prvom ili drugom polipeptidu sa CH3 domenom koja interaguje sa amino-kiselinom na drugom polipeptidu sa CH3 domenom što rezultuje formiranjem dimernog CH3 domena. Amino-kiselina koja nije na interfejsu između prvog i navedenog drugog polipeptida sa CH3 domenom je bilo koja amino-kiselina na prvom ili drugom polipeptidu sa CH3 domenom koja ne interaguje sa amino-kiselinom na drugom polipeptidu sa CH3 domenom. U ovde opisanim primerima izvođenja, modifikovana aminokiselina koja nije na interfejsu između prvog i navedenog drugog polipeptida sa CH3 domenom je bilo koja amino-kiselina na prvom ili drugom polipeptidu sa CH3 domenom koja pošto je modifikovana kao što je ovde opisano, ne interaguje sa amino-kiselinom na drugom polipeptidu sa CH3 domenom. Na primer, u određenim primerima izvođenja koji su ovde opisani, obezbeđene su modifikacije amino-kiselinske pozicije T350. Kao što je demonstrirano kristalnom strukturom obezbeđenom u Primeru 12 i pokazanom na Slici 42, T350 nije uključen u interakcije između dva polipeptida sa CH3 domenom. Pokazano je da bilo kakve modifikacije T350 imaju zanemarljiv uticaj na formiranje CH3 dimera, kao što su opisali Carter et al. Biochemistry 1998, 37, 9266. U heteromultimernim Fc konstruktima koji su ovde opisani, viđeno je da modifikacije na pozicijama T350 imaju neočekivani stabilizujući efekat na varijantne CH3 domene uprkos tome što nisu direktno uključene u formiranje samog CH3 dimera. Na primer, varijante koje sadrže najmanje jednu T350X modifikaciju, pri čemu je X prirodna ili neprirodna amino-kiselina odabrana od valina, izoleucina, leucina, metionina, i njihovih derivata ili varijanti formiraju veoma stabilne

2

varijantne CH3 domene. U nekim primerima izvođenja koji su ovde opisani su izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži najmanje jednu T350V modifikaciju. U određenim primerima izvođenja, prvi i drugi varijantni polipeptidi sa CH3 domenom sadrže T350V modifikaciju koja daje neočekivanu stabilnost varijantnom CH3 domenu u poređenju sa odgovarajućim CH3 domenom koji ne sadrži modifikaciju.

[0045] U predmetnom opisu, bilo koji opseg koncentracije, opseg procenta, opseg odnosa, ili opseg celih brojeva treba razumeti da uključuje vrednost bilo kog celog broja unutar navedenog opsega i, kada je prikladno, njihove frakcije (kao što je jedna desetina i stoti deo celog broja), osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Kao što se ovde upotrebljava, "oko" znači ±10% od naznačenog opsega, vrednosti, sekvence, ili strukture, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Treba razumeti da neodređeni članovi kao što se ovde upotrebljavaju označavaju "jednu ili više" od nabrojanih komponenti osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili diktirano kontekstom. Upotrebu alternative (npr. "ili") treba razumeti da znači jednu, obe ili bilo koju njihovu kombinaciju alternativa. Kao što se ovde upotrebljava, termini "uključuju" i "sadrže" se upotrebljavaju sinonimno. Pored toga, treba razumeti da su pojedinačni jednolančani polipeptidi ili heterodimeri poreklom iz različitih kombinacija struktura i supstituenata (npr. modifikovani CH3 domeni) koji su ovde opisani objavljeni u predmetnoj prijavi u istoj meri kao da je svaki jednolančani polipeptid ili heterodimer iznet pojedinačno. Stoga, odabir posebnih komponenti za formiranje pojedinačnih jednolančanih polipeptida ili heterodimera je unutar obima predmetne objave.

[0046] "Prvi polipeptid" je bilo koji polipeptid koji treba da bude pridružen sa drugim polipeptidom, koji se ovde takođe označava kao "lanac A". Prvi i drugi polipeptid se sastaju na "interfejsu". "Drugi polipeptid" je bilo koji polipeptid koji treba da bude pridružen sa prvim polipeptidom putem "interfejsa", koji se ovde takođe označava kao "lanac B". "Interfejs" sadrži one "kontaktne" amino-kiselinske ostatke u prvom polipeptidu koji interaguju sa jednim ili više "kontaktnih" amino-kiselinskih ostataka u interfejsu drugog polipeptida. Kao što se ovde upotrebljava, interfejs sadrži CH3 domen Fc regiona koji je poželjno poreklom iz IgG antitela i najpoželjnije humanog IgG1 antitela.

[0047] Kao što se ovde upotrebljava, "izolovani" heteromultimer označava heteromultimer koji je identifikovan i odvojen i/ili izdvojen iz komponente njegovog prirodnog okruženja ćelijske kulture. Kontaminirajuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostičku ili terapijsku upotrebu heteromultimera, i mogu uključivati enzime, hormone, i druge proteinske ili neproteinske rastvorljive supstance.

2

[0048] Amino-kiselina sa zapreminom bočnog lanca "neznatno većom" od prve aminokiseline je bilo koja amino-kiselina koja ima zapreminu bočnog lanca ne više od 20Å<3>veću od prve amino-kiseline na osnovu vrednosti zapremine bočnog lanca iz A. A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24: 107-123, 1972. U određenim primerima izvođenja, zapremina nije više od 10Å<3>veća od prve amino-kiseline. U nekim primerima izvođenja, zapremina nije više od 5Å<3>veća od prve amino-kiseline. Na primer, u određenim primerima izvođenja koji su ovde opisani, su mutacije lizina (K) kao što je K392J pri čemu je J odabrana od L, I.

[0049] Varijantni Fc heterodimeri su generalno prečišćeni do suštinske homogenosti. Fraze "suštinski homogen", "suštinski homogeni oblik" i "suštinska homogenost" se upotrebljavaju da ukažu na to da je proizvod suštinski lišen nusproizvoda koji potiču od neželjenih kombinacija polipeptida (npr. homodimeri). Izražena u smislu čistoće, suštinska homogenost znači da količina nusproizvoda ne prelazi 10%, i poželjno je ispod 5%, poželjnije ispod 1%, najpoželjnije ispod 0,5%, pri čemu su procenti po težini.

[0050] Svaki od termina koji razumeju oni koji se bave tehnologijom antitela dobija značenje koje je stečeno u ovoj struci, osim ukoliko je ovde izričito drugačije definisano. Poznato je da antitela imaju varijabilne regione, region zgloba, i konstantne domene. Struktura i funkcija imunoglobulina pregledno su prikazani, na primer, u Harlow et al, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).

[0051] Dizajn varijantnih Fc heterodimera iz homodimera divljeg tipa je ilustrovan konceptom pozitivnog i negativnog dizajna u kontekstu proteinskog projektovanja balansiranjem stabilnosti naspram specifičnosti, pri čemu se mutacije introdukuju sa ciljem pokretanja formiranja heterodimera pre nego formiranja homodimera kada se polipeptidi eksprimiraju u uslovima ćelijske kulture. Strategije negativnog dizajna maksimalizuju nepovoljne interakcije za formiranje homodimera, bilo introdukovanjem glomaznih bočnih lanaca na jednom lancu i malih bočnih lanaca na suprotnom, na primer strategijom izbočineu-udubljenja koju je razvio Genentech (Ridgway JB, Presta LG, Carter P. 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng.1996 Jul;9(7):617-21; Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J Mol Biol.

270(1):26-35 (1997)), ili elektrostatičkim projektovanjem koje dovodi do odbijanja formiranja homodimera, na primer, strategija elektrostatičkog upravljanja koju je razvio Amgen (Gunaskekaran K, et al. Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG. JBC 285 (25): 19637-19646 (2010)). U ova dva primera, asimetrične tačkaste mutacije negativnog dizajna

2

introdukovane su u CH3 domen divljeg tipa kako bi se pokrenulo formiranje heterodimera. Do danas su upotrebljavane samo strategije negativnog dizajna za razvoj Fc heterodimera. Publikovani rezultati pokazuju da heterodimeri dizajnirani upotrebom samo pristupa negativnog dizajna dovode do visoke specifičnosti sa >95% heterodimera, ali značajno destabilizuju kompleks (Supra). Ovi heterodimeri negativnog dizajna poseduju temperaturu topljenja modifikovanog CH3 domena od 69 °C ili nižu, bez dodatnih disulfidnih veza u poređenju sa divljim tipom. Videti Tabelu A u nastavku.

Tabela A: Publikovana Fc heterodimerna antitela.

2

[0052] Nasuprot negativnom dizajnu, opštem konceptu koji se upotrebljava za projektovanje proteina je pozitivan dizajn. U ovom slučaju amino-kiselinske modifikacije se introdukuju u polipeptide kako bi se maksimalizovale povoljne interakcije unutar ili između proteina. Ova strategija pretpostavlja da će pri introdukovanju višestrukih mutacija koje specifično stabilizuju željeni heterodimer zanemarujući efekat na homodimere, neto efekat biti bolja specifičnost za željene heterodimer interakcije u odnosu na homodimere, i samim tim i veća specifičnost heterodimera. Podrazumeva se u kontekstu projektovanja proteina da strategije pozitivnog dizajna optimizuju stabilnost željenih interakcija proteina, ali retko postižu >90% specifičnosti (Havranek JJ & Harbury PB. Automated design of specificity in molecular recognition. Nat Struct Biol.10(1):45-52 (2003); Bolon DN, Grant RA, Baker TA, Sauer RT. Specificity versus stability in computational protein design. Proc Natl Acad Sci USA.

6;102(36):12724-9 (2005); Huang PS, Love JJ, Mayo SL. A de novo designed protein protein interface Protein Sci. 16(12):2770-4 (2007)). Pre ove objave strategije pozitivnog dizajna nisu upotrebljavane za dizajniranje Fc heterodimera pošto je više pažnje posvećeno specifičnosti u poređenju sa stabilnošću za proizvodnju i razvoj terapijskih antitela. Pored toga, teško je predvideti korisne mutacije pozitivnog dizajna. Druge metodologije za poboljšanje stabilnosti, kao što su dodatne disulfidne veze, pokušane su zarad poboljšanja stabilnosti u Fc heterodimerima sa ograničenim uspehom u poboljšanju molekula. (Videti Tabelu A). Ovo može biti zato što su sve projektovane disulfidne veze Fc CH3 domena izložene rastvaraču, što rezultuje kratkim životnim vekom disulfidne veze i prema tome značajnim uticajem na dugoročnu stabilnost heterodimera - naročito kada projektovani CH3 domen ima Tm manju od 70 °C bez dodatne disulfidne veze (kao u Kontroli 4 koja ima Tm od 69 °C bez disulfida (videti Kontrolu 2). Predviđeno je da se druge metodologije za poboljšanje stabilnosti, kao što su disulfidne veze, takođe mogu upotrebljavati sa predmetnim Fc varijantama, pod uslovom da je unutrašnja stabilnost (merena kao temperatura topljenja) CH3 domena 70 °C ili više bez disulfidne veze, posebno kada je unutrašnja stabilnost (merena kao temperatura topljenja) CH3 domena 72 °C ili više bez disulfidne veze.

[0053] Prema tome, mi ovde objavljujemo novi postupak za dizajniranje Fc heterodimera koji rezultuje formiranjem i stabilnih i visoko specifičnih heterodimera. Ovaj postupak dizajniranja kombinuje strategije i negativnog i pozitivnog dizajna zajedno sa strukturnim i tehnikama projektovanja proteina vođenim računarskim modelovanjem. Ovaj moćni postupak nam je omogućio da dizajniramo nove kombinacije mutacija u IgG1 CH3 domenu pri čemu su upotrebom samo standardnih uslova ćelijske kulture formirani heterodimeri sa više od 90% čistoće u poređenju sa homodimerima i rezultujući heterodimeri su imali temperaturu topljenja od 70 °C ili više. U primernim aspektima, Fc varijantni heterodimeri imaju temperaturu topljenja od 73 °C ili više i čistoću veću od 98%. U drugim primernim aspektima, Fc varijantni heterodimeri imaju temperaturu topljenja od 75 °C ili više i čistoću veću od 90%. U određenim primerima izvođenja heterodimernih Fc varijanti koje su ovde opisane, Fc varijantni heterodimeri imaju temperaturu topljenja od 77 °C ili više i čistoću veću od 98%. U nekim primerima izvođenja heterodimernih Fc varijanti koje su ovde opisane, Fc varijantni heterodimeri imaju temperaturu topljenja od 78 °C ili više i čistoću veću od 98%. U određenim primerima izvođenja heterodimernih Fc varijanti koje su ovde opisane, Fc varijantni heterodimeri imaju temperaturu topljenja od 79 °C ili više i čistoću veću od 98%. U određenim primerima izvođenja heterodimernih Fc varijanti koje su ovde opisane, Fc varijantni heterodimeri imaju temperaturu topljenja od 80 °C ili više i čistoću veću od 98%. U određenim primerima izvođenja heterodimernih Fc varijanti koje su ovde opisane, Fc varijantni heterodimeri imaju temperaturu topljenja od 81 °C ili više i čistoću veću od 98%.

[0054] U određenim primerima izvođenja, obezbeđen je izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od 74 °C ili više. Kao što se ovde upotrebljava, "povećana stabilnost" ili "stabilni heterodimer", označava modifikovani CH3 domen, u formiranju heterodimera, sa temperaturom topljenja od oko 70 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, "povećana stabilnost" ili "stabilni heterodimer", označava modifikovani CH3 domen, u formiranju heterodimera, sa temperaturom topljenja od oko 74 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, "povećana stabilnost" ili "stabilni heterodimer", označava modifikovani CH3 domen, u formiranju

1

heterodimera, sa temperaturom topljenja od oko 75 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, "povećana stabilnost" ili "stabilni heterodimer", označava modifikovani CH3 domen, u formiranju heterodimera, sa temperaturom topljenja od oko 76 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, "povećana stabilnost" ili "stabilni heterodimer" označava modifikovani CH3 domen, u formiranju heterodimera, sa temperaturom topljenja od oko 78 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, "povećana stabilnost" ili "stabilni heterodimer", označava modifikovani CH3 domen, u formiranju heterodimera, sa temperaturom topljenja od oko 79 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, "povećana stabilnost" ili "stabilni heterodimer", označava modifikovani CH3 domen, u formiranju heterodimera, sa temperaturom topljenja od oko 80 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, "povećana stabilnost" ili "stabilni heterodimer", označava modifikovani CH3 domen, u formiranju heterodimera, sa temperaturom topljenja od oko 81 °C ili više. Pored toga, podrazumeva se da termin "promoviše formiranje heterodimera" ovde označava aminokiselinske mutacije u CH3 domenu koje rezultuju formiranjem više od 90% heterodimera u poređenju sa formiranjem homodimera.

[0055] U dodatnom primeru izvođenja, ova povećana stabilnost je u odsustvu dodatne disulfidne veze. Specifično, povećana stabilnost je u odsustvu dodatne disulfidne veze u CH3 domenu. U jednom primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen ne sadrži dodatnu disulfidnu vezu u poređenju sa CH3 domenom divljeg tipa. U alternativnom primeru izvođenja, modifikovani CH3 sadrži najmanje jednu disulfidnu vezu u poređenju sa CH3 domenom divljeg tipa, pod uslovom da modifikovani CH3 ima temperaturu topljenja od 70 °C ili više u odsustvu disulfidne veze. U jednom primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži najmanje jednu disulfidnu vezu u poređenju sa CH3 domenom divljeg tipa, i modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 77,5 °C ili više. U primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži najmanje jednu disulfidnu vezu u poređenju sa CH3 domenom divljeg tipa, i modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 78 °C ili više. U sledećem primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži najmanje jednu disulfidnu vezu u poređenju sa CH3 domenom divljeg tipa, i modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) višu od oko 78 °C, ili višu od oko 78,5 °C, ili višu od oko 79 °C, ili višu od oko 79,5 °C, ili višu od oko 80 °C, ili višu od oko 80,5 °C, ili višu od oko 81°C, ili višu od oko 81,5 °C, ili višu od oko 82 °C, ili višu od oko 82,5 °C, ili višu od oko 83 °C.

[0056] U jednom primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja višu od oko 74 °C, ili višu od oko 74,5 °C, ili višu od oko 75 °C, ili višu od oko 75,5 °C, ili višu od oko 76 °C, ili višu od oko 76,5 °C, ili višu od oko 77 °C, ili višu od oko 77,5 °C, ili

2

višu od oko 78 °C, ili višu od oko 78,5 °C, ili višu od oko 79 °C, ili višu od oko 79,5 °C, ili višu od oko 80 °C, ili višu od oko 80,5 °C, ili višu od oko 81 °C, ili višu od oko 81,5 °C, ili višu od oko 82 °C, ili višu od oko 82,5 °C, ili višu od oko 83 °C. U sledećem primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja od oko 74 °C, ili oko 74,5 °C, ili oko 75 °C, ili oko 75,5 °C, ili oko 76 °C, ili oko 76,5 °C, ili oko 77 °C, ili oko 77,5 °C, ili oko 78 °C, ili oko 78,5 °C, ili oko 79 °C, ili oko 79,5 °C, ili oko 80 °C, ili oko 80,5 °C, ili oko 81 °C . U još jednom primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja od oko 74 °C do oko 81 °C, ili oko 74,5 °C do oko 81 °C, ili oko 75 °C do oko 81 °C, ili oko 75,5 °C do oko 81 °C, ili 76 °C do oko 81 °C, ili oko 76,5 °C do oko 81 °C, ili oko 77 °C do oko 81 °C, ili oko 77,5 °C do oko 81 °C, ili oko 78 °C do oko 81 °C, ili oko 78,5 °C do oko 82 °C, ili oko 79 °C do oko 81 °C. U još jednom primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja od oko 74 °C do oko 76 °C.

[0057] Pored poboljšane stabilnosti, heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera. Razume se da su ove amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera u poređenju sa formiranjem homodimera. Ovo formiranje heterodimera u poređenju sa formiranjem homodimera se ovde zajedno označava kao "čistoća" ili "specifičnost" ili "čistoća heterodimera" ili "specifičnost heterodimera". Podrazumeva se da čistoća heterodimera označava procenat formiranog željenog heterodimera u poređenju sa vrstama homodimera formiranim u rastvoru pod standardnim uslovima ćelijske kulture pre selektivnog prečišćavanja vrsta heterodimera. Na primer, čistoća heterodimera od 90% ukazuje da je 90% vrsta dimera u rastvoru željeni heterodimer. U jednom primeru izvođenja, Fc varijantni heterodimeri imaju čistoću veću od oko 95%, ili veću od oko 96%, ili veću od oko 97%, ili veću od oko 98%, ili veću od oko 99%. U sledećem primeru izvođenja, Fc varijantni heterodimeri imaju čistoću od oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, ili oko 100%.

[0058] U specifičnom primeru izvođenja, izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) višu od oko 74 °C, ili višu od oko 75 °C, ili višu od oko 76 °C, ili višu od oko 77 °C, ili višu od oko 78 °C, ili višu od oko 79 °C, ili višu od oko 80 °C ili višu od oko 81 °C. U dodatnom aspektu, modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja od 74 °C ili višu, i rezultujući Fc varijantni heterodimer ima čistoću veću od oko 95%, ili veću od oko 96%, ili veću od oko 97%, ili veću od oko 98%, ili veću od oko 99%.

[0059] Kako bismo dizajnirali ove Fc varijante sa poboljšanom stabilnošću i čistoćom, koristili smo iterativni proces računarskog dizajna i eksperimentalnog pregleda kako bismo odabrali najuspešnije kombinacije strategija pozitivnog i negativnog dizajna (videti Sliku 24).

[0060] Specifično, u inicijalnoj fazi dizajniranja napravljeni su različiti Fc varijantni heterodimeri negativnog dizajna i testirani na ekspresiju i stabilnost kao što je opisano u Primerima 1-3. Inicijalna faza dizajniranja uključivala je Fc varijantne heterodimere AZ1-AZ16 (videti Tabelu 1). Iz ovog inicijalnog skupa Fc varijantnih heterodimera negativnog dizajna, za koje se očekivalo da imaju nisku stabilnost (npr. Tm manju od 71 °C), za dodatni razvoj odabrani su Fc varijantni heterodimeri sa čistoćom većom od 90% i temperaturom topljenja od oko 68 °C ili više. Ovo je uključivalo Fc varijantne heterodimere AZ6, AZ8 i AZ15. U drugoj fazi dizajniranja, ovi odabrani Fc varijantni heterodimeri dodatno su modifikovani kako bi obezbedili stabilnost i čistoću upotrebom strategija pozitivnog dizajna nakon detaljne računarske i strukturne analize. Odabrani Fc varijantni heterodimeri (AZ6, AZ8, i AZ15) analizirani su računarskim postupcima i sveobuhvatnom analizom strukture i funkcije kako bi se identifikovali strukturni razlozi zbog kojih su ove Fc varijante imale nižu stabilnost od Fc homodimera divljeg tipa, koja je 81 °C za IgG1. Videti Tabelu 4 za listu Fc varijantnih heterodimera i Tm vrednosti.

[0061] Računarski alati i analiza strukture i funkcije uključivali su, ali nisu bili ograničeni na analizu molekulske dinamike (MD), prepakivanje bočnog lanca/okosnice, potencijal baze znanja (KBP), analizu šupljina i (hidrofobnog) pakovanja (LJ, CCSD, SASA, dSASA (ugljenik/ceo-atom)), elektrostatičke-GB proračune, i analizu kuplovanja. (Videti Sliku 24 za pregled računarske strategije).

[0062] Aspekt pristupa projektovanja proteina oslanjao se na kombinovanje strukturnih informacija za Fc IgG protein dobijenih iz rendgenske kristalografije sa računarskim modelovanjem i simulacijom divljeg tipa i varijantnih oblika CH3 domena. Ovo nam je omogućilo da steknemo nove strukturne i fizičko-hemijske uvide o potencijalnoj ulozi pojedinačnih amino-kiselina i njihovom kooperativnom delovanju. Ovi strukturni i fizičkohemijski uvidi, dobijeni iz višestrukih modifikovanih CH3 domena, zajedno sa rezultujućim empirijskim podacima koji se odnose na njihovu stabilnost i čistoću pomogli su nam da razvijemo razumevanje odnosa između čistoće i stabilnosti Fc heterodimera u poređenju sa Fc homodimera i simuliranim strukturnim modelima. Kako bismo izvršili naše simulacije, počeli smo izgradnjom potpunih i realističnih modela i rafinisanjem kvaliteta Fc strukture IgG1

4

antitela divljeg tipa. Proteinske strukture poreklom iz rendgenske kristalografije imaju nedostatak u detaljima u vezi sa određenim svojstvima proteina u vodenom medijumu pod fiziološkim uslovima i naše procedure prečišćavanja su se bavile ovim ograničenjima. One uključuju izgradnju nedostajućih regiona proteinske strukture, često fleksibilnih delova proteina kao što su petlje i neki bočni lanci ostataka, procenu i definisanje protonacionih stanja neutralnih i naelektrisanih ostataka i postavljanje potencijalnih funkcionalno relevantnih molekula vode pridruženih sa proteinom.

[0063] Algoritmi molekulske dinamike (MD) su jedan alat koji smo upotrebljavali, simulirajući proteinsku strukturu, da procenimo unutrašnju dinamičku prirodu Fc homodimera i modifikovanih CH3 domena u vodenom okruženju. Simulacije molekulske dinamike prate dinamičku trajektoriju molekula koja je rezultat kretanja koja proističu iz interakcija i sila koje deluju između svih atomskih entiteta u proteinu i njegovog lokalnog okruženja, u ovom slučaju atoma koji čine Fc i okolnih molekula vode. Nakon simulacija molekulske dinamike, analizirani su različiti aspekti trajektorija kako bi se stekao uvid u strukturne i dinamičke karakteristike Fc homodimera i varijantnih Fc heterodimera, koje smo upotrebljavali da identifikujemo specifične amino-kiselinske mutacije kako bismo poboljšali i čistoću i stabilnost molekula.

[0064] Prema tome, generisane MD trajektorije su proučavane upotrebom postupaka kao što je analiza glavnih komponenti kako bi se otkrili unutrašnji niskofrekventni modovi kretanja u Fc strukturi. Ovo daje uvid u potencijalna konformaciona podstanja proteina (videti Sliku 32). Dok se kritične protein-protein interakcije između lanca A i B u Fc regionu dešavaju na interfejsu CH3 domena, naše simulacije su ukazale da ovaj interfejs deluje kao zglob u kretanju koje uključuje "otvaranje" i "zatvaranje" N-terminusnih krajeva CH2 domena jednog u odnosu na drugi. CH2 domen interaguje sa FcgR na ovom kraju kao što se vidi na Slici 16. Stoga, iako ne želimo da budemo vezani teorijom, izgleda da introdukcija amino-kiselinskih mutacija na CH3 interfejsu utiče na veličinu i prirodu pokreta otvoreno/zatvoreno na N-terminusnom kraju Fc i prema tome kako Fc interaguje sa FcgR. Videti Primer 4 i Tabelu 5.

[0065] Generisane MD trajektorije su takođe proučavane kako bi se odredila mutabilnost pozicija specifičnih amino-kiselinskih ostataka u Fc strukturi na osnovu profilisanja njihove fleksibilnosti i analize njihovog okruženja. Ovaj algoritam nam je omogućio da identifikujemo ostatke koji bi mogli da utiču na strukturu i funkciju proteina, pružajući jedinstven uvid u karakteristike ostataka i mutabilnost za naredne faze dizajniranja modifikovanih CH3 domena. Ova analiza nam je takođe omogućila da uporedimo više simulacija, i procenimo mutabilnost na osnovu odstupanja nakon profilisanja.

[0066] Generisane MD trajektorije su takođe proučavane kako bi se odredila kretanja korelisanih ostataka u proteinu i formiranje mreža ostataka kao rezultat kuplovanja između njih. Pronalaženje dinamičkih korelacija i mreža ostataka unutar Fc strukture je kritičan korak u razumevanju proteina kao dinamičkog entiteta i za razvoj uvida u efekte mutacija na distalnim mestima. Videti, npr. Primer 6.

[0067] Stoga, detaljno smo proučavali uticaj mutacija na lokalno okruženje mesta mutacije. Formiranje dobro upakovanog jezgra na CH3 interfejsu između lanca A i B je kritično za spontano sparivanje dva lanca u stabilnoj Fc strukturi. Dobro pakovanje je rezultat jake strukturne komplementarnosti između interagujućih molekulskih partnera, zajedno sa povoljnim interakcijama između kontaktnih grupa. Povoljne interakcije su rezultat bilo zakopanih hidrofobnih kontakata koji su dobro uklonjeni od izlaganja rastvaraču i/ili od formiranja komplementarnih elektrostatičkih kontakata između hidrofilnih polarnih grupa. Ovi hidrofobni i hidrofilni kontakti imaju entropski i entalpijski doprinos slobodnoj energiji formiranja dimera na CH3 interfejsu. Koristimo različite algoritme da precizno modelujemo pakovanje na CH3 interfejsu između lanca A i lanca B i naknadno procenjujemo termodinamička svojstva interfejsa ocenjivanjem brojnih relevantnih fizičko-hemijskih svojstava.

[0068] Koristili smo brojne postupke pakovanja proteina uključujući fleksibilne okosnice kako bismo optimizovali i pripremili strukture modela za veliki broj varijanti koje smo računarski pregledali. Nakon pakovanja procenili smo brojne uslove uključujući kontaktnu gustinu, rezultat sukoba, vodonične veze, hidrofobnost i elektrostatiku. Upotreba modela solvatacije nam je omogućila da se preciznije pozabavimo efektom okruženja rastvarača i kontrastiramo razlike u slobodnoj energiji nakon mutacije specifičnih pozicija u proteinu kako bi se izmenili tipovi ostataka. Kontaktna gustina i rezultat sukoba obezbeđuju meru komplementarnosti, kritični aspekt efikasnog pakovanja proteina. Ove procedure pregleda su zasnovane na primeni potencijala zasnovanih na znanju ili šema analize kuplovanja koje se oslanjaju na proračune energije i entropije interakcije ostataka u paru.

[0069] Ova sveobuhvatna in silico analiza pružila je detaljno razumevanje razlika svake Fc varijante u poređenju sa divljim tipom u odnosu na ključna mesta (hotspots) interfejsa, mesta asimetrije, šupljine i slabo upakovane regione, strukturnu dinamiku pojedinačnih mesta i mesta lokalnog odvijanja. Ovi kombinovani rezultati opisane računarske analize identifikovali su specifične ostatke, sekvence/strukturne motive i šupljine koji nisu optimizovani i u kombinaciji su odgovorni za nižu stabilnost (npr. Tm od 68 °C) i/ili nižu specifičnost od <90% čistoće. U drugoj fazi dizajniranja upotrebili smo ciljani pozitivni dizajn kako bismo se specifično pozabavili ovom hipotezom pomoću dodatnih tačkastih mutacija i testirali ih in silico projektovanjem upotrebljavajući prethodno opisanu metodologiju i analizu (videti Sliku 24). Fc varijantni heterodimeri dizajnirani da poboljšaju stabilnost i čistoću za svaki ciljani dizajn u drugoj fazi (Fc varijantni heterodimeri AZ17-AZ101) eksperimentalno su validirani za ekspresiju i stabilnost kao što je opisano u Primerima 1-4.

[0070] U jednom primernom primeru izvođenja, CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid (koji se ovde takođe označavaju kao Lanac A i Lanac B) pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A, i Y407V i pri čemu drugi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I , K392M i T394W. U sledećem primeru izvođenja, prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, S400E, F405A i Y407V i drugi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I, N390R, K392M i T394W.

[0071] Ovaj iterativni proces računarske analize strukture i funkcije, ciljanog projektovanja i eksperimentalne validacije upotrebljen je za dizajniranje preostalih Fc varijanti nabrojanih u Tabeli 1 u narednim fazama dizajniranja i rezultovao je Fc varijantnim heterodimerima sa čistoćom većom od 90% i povećanom stabilnošću sa temperaturom topljenja CH3 domena višom od 70 °C.

[0072] Iz prve i druge faze dizajniranja identifikovane su dve skele jezgra, Skela 1 i Skela 2, pri čemu su dodatne amino-kiselinske modifikacije introdukovane u ove skele kako bi se fino podesila čistoća i stabilnost Fc varijantnih heterodimera. Videti Primer 5 za detaljan opis razvoja Skele 1 uključujući AZ8, AZ17-62 i varijante nabrojane u Tabeli 6. Videti Primer 6 za detaljan opis razvoja Skele 2 uključujući AZ15 i AZ63-101 i varijante nabrojane u Tabeli 7.

[0073] Mutacije jezgra Skele 1 sadrže L351Y_F405A_Y407V/T394W. Skela 1a sadrži amino-kiselinske mutacije T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V i Skela 1b sadrži aminokiselinske mutacije T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V. Videti Primer 5.

[0074] U određenim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid (koji se ovde takođe označavaju kao Lanac A i Lanac B) pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V i drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku modifikaciju T394W. U jednom aspektu modifikovani CH3 domen dodatno sadrži tačkaste mutacije na pozicijama F405 i/ili K392. Ove mutacije na poziciji K392 uključuju, ali nisu ograničene na, K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ili K392E. Ove mutacije na poziciji F405 uključuju, ali nisu ograničene na, F405I, F405M, F405S, F405S, F405V ili F405W. U sledećem aspektu, modifikovani CH3 domen dodatno sadrži tačkaste mutacije na pozicijama T411 i/ili S400. Ove mutacije na poziciji T411 uključuju, ali nisu ograničene na, T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ili T411W. Ove mutacije na poziciji S400 uključuju, ali nisu ograničene na, S400E, S400D, S400R ili S400K. U još jednom primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V i drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku modifikaciju T394W, pri čemu prvi i/ili drugi polipeptid sadrži dodatne aminokiselinske modifikacije na pozicijama T366 i/ili L368. Ove mutacije na poziciji T366 uključuju, ali nisu ograničene na, T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V ili T366W. U primernom primeru izvođenja, amino-kiselinska modifikacija na poziciji T366 je T366I. U drugom primernom primeru izvođenja, amino-kiselinska modifikacija na poziciji T366 je T366L. Mutacije na poziciji L368 uključuju, ali nisu ograničene na, L368D, L368R, L368T, L368M, L368V, L368F, L368S i L368A.

[0075] U određenim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid (koji se ovde takođe označavaju kao Lanac A i Lanac B) pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V i drugi polipeptid sadrži aminokiselinske modifikacije T366L i T394W. U sledećem primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V i drugi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I i T394W.

[0076] U određenim drugim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid (koji se ovde takođe označavaju kao Lanac A i Lanac B) pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V i drugi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije T366L, K392M i T394W. U sledećem primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V i drugi polipeptid sadrži aminokiselinske modifikacije T366I, K392M i T394W.

[0077] U još jednom primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid (koji se ovde takođe označavaju kao Lanac A i Lanac B) pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije F405A i Y407V i drugi polipeptid sadrži aminokiselinske modifikacije T366L, K392M i T394W. U sledećem primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije F405A i Y407V i drugi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I, K392M i T394W.

[0078] U određenim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid (koji se ovde takođe označavaju kao Lanac A i Lanac B) pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije F405A i Y407V i drugi polipeptid sadrži aminokiselinske modifikacije T366L i T394W. U sledećem primeru izvođenja, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije F405A i Y407V i drugi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I i T394W.

[0079] U primernom primeru izvođenja, ovde su obezbeđeni izolovani heteromultimeri koji sadrže heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 74 °C ili više. U sledećem primeru izvođenja, ovde su obezbeđeni izolovani heteromultimeri koji sadrže heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 74 °C ili više i heterodimer ima čistoću od oko 98% ili veću.

[0080] U određenim primerima izvođenja, izolovani heteromultimer koji sadrži heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) veću od 70 °C i modifikovani CH3 domeni su odabrani iz Tabele 6.

[0081] Mutacije jezgra Skele 2 sadrže L351Y_Y407A/T366A_K409F. Skela 2a sadrži aminokiselinske mutacije L351Y_Y407A/T366V_K409F i Skela 2b sadrži amino-kiselinske mutacije Y407A/T366A_K409F. Videti Primer 6.

[0082] U određenim aspektima koji su ovde opisani, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid (koji se ovde takođe označavaju kao Lanac A i Lanac B) pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y i Y407A i drugi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije T366A i K409F. U jednom aspektu modifikovani CH3 domen dodatno sadrži tačkaste mutacije na pozicijama T366, L351 i Y407. Ove mutacije na poziciji T366 uključuju, ali nisu ograničene na, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V ili T366W. U specifičnom primeru izvođenja, mutacija na poziciji T366 je T366V. Mutacije na poziciji L351 uključuju, ali nisu ograničene na, L351I, L351D, L351R ili L351F. Mutacije na poziciji Y407 uključuju, ali nisu ograničene na, Y407V ili Y407S. Videti, CH3 varijante AZ63-AZ70 u Tabeli 1 i Tabeli 4 i Primeru 6.

[0083] U jednom aspektu, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid (koji se ovde takođe označavaju kao Lanac A i Lanac B) pri čemu prvi polipeptid sadrži aminokiselinske modifikacije L351Y i Y407A i drugi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije T366V i K409F.

[0084] U jednom primernom aspektu koji je ovde opisan su izolovani heteromultimeri koji sadrže heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 75,5 °C ili više. U sledećem primeru izvođenja, ovde su obezbeđeni izolovani heteromultimeri koji sadrže heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 75 °C ili više i heterodimer ima čistoću od oko 90% ili veću.

[0085] U drugim određenim aspektima, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid (koji se ovde takođe označavaju kao Lanac A i Lanac B) pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y i Y407A i drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku modifikaciju T366A i K409F, pri čemu modifikovani CH3 domen sadrži jednu ili više amino-kiselinskih modifikacija na pozicijama T411, D399, S400, F405, N390, i/ili K392. Ove mutacije na poziciji D399 uključuju, ali nisu ograničene na, D399R, D399W, D399Y ili D399K. Mutacije na poziciji T411 uključuju, ali nisu ograničene na, T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ili T411W. Mutacije na poziciji S400 uključuju, ali nisu ograničene na, S400E, S400D, S400R ili S400K. Mutacije na poziciji F405 uključuju, ali nisu ograničene na, F405I, F405M, F405S, F405S, F405V ili F405W. Mutacije na poziciji N390 uključuju, ali nisu ograničene na, N390R, N390K ili N390D. Mutacije na poziciji K392 uključuju, ali nisu ograničene na, K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ili K392E. Videti, CH3 varijante AZ71-101 u Tabeli 1 i Tabeli 4 i Primeru 6.

[0086] U aspektu, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid (koji se ovde takođe označavaju kao Lanac A i Lanac B) pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinsku modifikaciju Y407A i drugi polipeptid sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T366A i K409F. U jednom aspektu, ovaj modifikovani CH3 domen dodatno sadrži amino-kiselinske modifikacije K392E, T411E, D399R i S400R. U dodatnom aspektu, modifikovani CH3 domen sadrži prvi i drugi polipeptid pri čemu prvi polipeptid sadrži amino-kiselinsku modifikaciju D399R, S400R i Y407A i drugi polipeptid sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T366A, K409F, K392E i T411E.

[0087] U primernom aspektu, ovde su obezbeđeni izolovani heteromultimeri koji sadrže heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen

4

koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 74 °C ili više. U sledećem primeru izvođenja, ovde su obezbeđeni izolovani heteromultimeri koji sadrže heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od oko 74 °C ili više i heterodimer ima čistoću od oko 95% ili veću.

[0088] U određenim aspektima koji su ovde opisani su izolovani heteromultimeri koji sadrže heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) veću od 70 °C i modifikovani CH3 domeni su odabrani iz Tabele 7.

[0089] Štaviše, ovaj novi postupak dizajniranja Fc varijantnih heterodimera sa poboljšanom stabilnošću i čistoćom može se primeniti na druge klase i izotipove Fc regiona. U određenim primerima izvođenja, Fc region je Fc region humanog IgG. U dodatnim primerima izvođenja, Fc region humanog IgG je Fc region humanog IgG1.

�

� Tabela 1.2: Amino-kiselinske modifikacije CH3 domena za generisanje Fc varijantnih heterodimera. DSC temperatura topljenja CH3 domena je procenjena kao što je pokazano na Slikama 29A-29B i opisano u Primerima.

4

Tabela 1.3: Amino-kiselinske modifikacije CH3 domena za generisanje Fc varijantnih heterodimera. Kd u tabeli ispod određena je kao što je opisano u Primerima i na Slici 35

4

[0090] Fc region kao što je ovde definisano sadrži CH3 domen ili njegov fragment, i može dodatno da sadrži jedan ili više dodatnih domena konstantnog regiona, ili njihovih

1

fragmenata, uključujući zglob, CH1, ili CH2. Podrazumeva se da je numerisanje Fc aminokiselinskih ostataka ono prema EU indeksu kao u Kabat et al., 1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va. "EU indeks kao što je izneto u Kabatu" označava numerisanje prema EU indeksu humanog IgG1 Kabat antitela. Radi praktičnosti, Tabela B obezbeđuje amino-kiseline numerisane u skladu sa EU indeksom kao što je izneto u Kabatu za CH2 i CH3 domen iz humanog IgG1.

Tabela B

2

[0091] U skladu sa jednim aspektom pronalaska obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji sadrži modifikovani heterodimerni CH3 domen, navedeni modifikovani CH3 domen koji sadrži: prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje tri amino-kiselinske modifikacije u poređenju sa polipeptidom sa CH3 domenom divljeg tipa, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje tri amino-kiselinske modifikacije u poređenju sa polipeptidom sa CH3 domenom divljeg tipa; pri čemu najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju K392J pri čemu je J odabrana od L, I; pri čemu navedeni prvi i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom prvenstveno formiraju heterodimerni CH3 domen sa temperaturom topljenja (Tm) od najmanje oko 74 °C i čistoćom od najmanje 95%; i pri čemu najmanje jedna amino-kiselinska modifikacija nije amino-kiselina koja je na interfejsu između navedenog prvog i navedenog drugog polipeptida sa CH3 domenom. U određenim primerima izvođenja heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži najmanje jednu T350X modifikaciju, pri čemu je X prirodna ili neprirodna amino-kiselina odabrana od valina, izoleucina, leucina, metionina, i njihovih derivata ili varijanti. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži najmanje jednu T350V modifikaciju. U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C ili više. U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima Tm od oko 77°C ili više. U određenim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domen ima Tm od oko 80°C ili više. U određenim aspektima je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu je najmanje jedan polipeptid sa CH3 domenom polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju najmanje jednog od L351, F405, i Y407. U nekim aspektima je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, pri čemu je najmanje jedan polipeptid sa CH3 domenom polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji dodatno sadrži

4

amino-kiselinsku modifikaciju T366. U određenim aspektima je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu je prvi polipeptid sa CH3 domenom polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na pozicijama L351, F405, i Y407, i drugi polipeptid sa CH3 domenom je polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na pozicijama T366, K392, i T394. U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A, i Y407V, i navedeni drugi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366L, K392M, i T394W. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A, i Y407V, i navedeni drugi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366L, K392L, i T394W. U dodatnom primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A, i Y407V, i navedeni drugi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I, K392M, i T394W. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A, i Y407V, i navedeni drugi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I, K392L, i T394W. U određenim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu je najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži aminokiselinsku modifikaciju na poziciji S400. U dodatnom primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži modifikaciju S400Z, pri čemu je Z odabrana od pozitivno naelektrisane amino-kiseline i negativno naelektrisane aminokiseline. U nekim primerima izvođenja, pozitivno naelektrisana amino-kiselina je lizin ili arginin i negativno naelektrisana amino-kiselina je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina. U određenim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od S400E i S400R. U nekim primerima izvođenja obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu je najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji N390. U nekim primerima izvođenja, modifikacija N390 je N390Z, pri čemu je Z odabrana od pozitivno naelektrisane amino-kiseline i negativno naelektrisane amino-kiseline. U primeru izvođenja, N390Z je N390R. U određenim primerima izvođenja izolovanog heteromultimernog Fc konstrukta koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa CH3 domenom je polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju S400E i navedeni drugi polipeptid sa CH3 domenom je polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži aminokiselinsku modifikaciju N390R. U nekim primerima izvođenja izolovanog heteromultimernog Fc konstrukta koji je ovde opisan, svaki od prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom je polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom, jedan navedeni polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju Q347R i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju K360E.

[0092] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji sadrži modifikovani heterodimerni CH3 domen, navedeni modifikovani CH3 domen koji sadrži: prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje tri amino-kiselinske modifikacije u poređenju sa polipeptidom sa CH3 domenom divljeg tipa, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje tri amino-kiselinske modifikacije u poređenju sa polipeptidom sa CH3 domenom divljeg tipa; pri čemu najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju K392J pri čemu je J odabrana od L, I; pri čemu navedeni prvi i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom prvenstveno formiraju heterodimerni CH3 domen sa temperaturom topljenja (Tm) od najmanje oko 74 °C i čistoćom od najmanje 95%; i pri čemu najmanje jedna amino-kiselinska modifikacija nije amino-kiselina koja je na interfejsu između navedenog prvog i navedenog drugog polipeptida sa CH3 domenom. U određenim aspektima je heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži najmanje jednu T350X modifikaciju, pri čemu je X prirodna ili neprirodna amino-kiselina odabrana od valina, izoleucina, leucina, metionina, i njihovih derivata ili varijanti. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži najmanje jednu T350V modifikaciju. U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C ili više. U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima Tm od oko 77 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domen ima Tm od oko 80°C ili više. U jednom aspektu je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu je najmanje jedan polipeptid sa CH3 domenom polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju najmanje jednog od K409 i T411. U određenim aspektima je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži najmanje jednu od K409F, T411E i T411D. U nekim aspektima je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu je najmanje jedan polipeptid sa CH3 domenom polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju D399. U nekim aspektima, amino-kiselinska modifikacija D399 je najmanje jedna od D399R i D399K.

[0093] U jednom aspektu koji je ovde opisan obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji sadrži modifikovani heterodimerni CH3 domen, navedeni modifikovani CH3 domen koji sadrži: prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje tri amino-kiselinske modifikacije u poređenju sa polipeptidom sa CH3 domenom divljeg tipa, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje tri amino-kiselinske modifikacije u poređenju sa polipeptidom sa CH3 domenom divljeg tipa; pri čemu najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju K392J pri čemu je J odabrana od L, I; pri čemu navedeni prvi i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom prvenstveno formiraju heterodimerni CH3 domen sa temperaturom topljenja (Tm) od najmanje oko 74 °C i čistoćom od najmanje 95%; i pri čemu najmanje jedna amino-kiselinska modifikacija nije amino-kiselina koja je na interfejsu između navedenog prvog i navedenog drugog polipeptida sa CH3 domenom. U određenim aspektima je heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži najmanje jednu T350X modifikaciju, pri čemu je X prirodna ili neprirodna amino-kiselina odabrana od valina, izoleucina, leucina, metionina, i njihovih derivata ili varijanti. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, koji sadrži najmanje jednu T350V modifikaciju. U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C ili više. U primeru izvođenja je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima Tm od oko 77 °C ili više. U određenim primerima izvođenja, modifikovani CH3 domen ima Tm od oko 80 °C ili više. U određenim aspektima izolovanog heteromultimernog Fc konstrukta koji je ovde opisan, pri čemu je prvi polipeptid sa CH3 domenom polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od K409F, T411E i T411D, i drugi polipeptid sa CH3 domenom je polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od Y407A, Y407I, Y407V, D399R i D399K. U nekim aspektima je bilo koji od izolovanih heteromultimernih Fc konstrukata koji su ovde opisani, koji dodatno sadrže prvi modifikovani CH3 domen koji sadrži jednu od amino-kiselinskih modifikacija T366V, T366I, T366A, T366M, i T366L; i drugi modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju L351Y. U nekim aspektima je bilo koji od izolovanih heteromultimernih Fc konstrukata koji su ovde opisani, koji sadrži prvi modifikovani CH3 domen koji sadrži jednu od amino-kiselinskih modifikacija K392L ili K392E; i drugi modifikovani CH3 domen koji sadrži jednu od amino-kiselinskih modifikacija S400R ili S400V.

[0094] Ovde je opisan izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom, svaki polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje četiri amino-kiselinske mutacije, pri čemu najmanje jedan od navedenog prvog i navedenog drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom sadrži mutaciju odabranu od N390Z i S400Z, pri čemu je Z odabrana od pozitivno naelektrisane amino-kiseline i negativno naelektrisane amino-kiseline, i pri čemu navedeni prvi i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom prvenstveno formiraju heterodimerni CH3 domen sa temperaturom topljenja (Tm) od najmanje oko 70 °C i čistoćom od najmanje 90%. U aspektu je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, pri čemu navedeni prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na pozicijama F405 i Y407 i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji T394. U aspektu je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji L351. U određenim aspektima, je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži modifikaciju najmanje jedne od pozicija T366 i K392. U nekim primerima izvođenja, je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C i formira se sa čistoćom od najmanje oko 95%. U određenim aspektima, je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, najmanje jedan polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije najmanje jednu od N390R, S400E i S400R. U nekim aspektima je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, jedan od navedenog prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije pozicije 347 i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji 360. U određenim primerima izvođenja je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T350V. U specifičnim primerima izvođenja je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od L351Y, F405A i Y407V; i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od T366L, T366I, K392L, K392M i T394W. U određenim aspektima koji su ovde opisani je izolovani heteromultimer, prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na pozicijama D399 i Y407, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na pozicijama K409 i T411. U nekim aspektima je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži aminokiselinsku modifikaciju na poziciji L351, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na poziciji T366 i K392. U specifičnim primerima izvođenja su izolovani heteromultimeri koji su ovde opisani, najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T350V. U određenim primerima izvođenja su izolovani heteromultimeri koji su ovde opisani, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C ili više i formira se sa čistoćom od najmanje oko 95%. U određenim aspektima obezbeđeni su izolovani heteromultimerni Fc konstrukti koji su ovde opisani, navedeni prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije odabrane od L351Y, D399R, D399K, S400D, S400E, S400R, S400K, Y407A, i Y407V; i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije odabrane od T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392I, K392D, K392E, K409F, K409W, T411D i T411E.

[0095] Ovde je opisan izolovani heteromultimerni Fc konstrukt koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom, svaki polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje tri amino-kiselinske mutacije, pri čemu jedan od navedenog prvog i navedenog drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom sadrži mutaciju odabranu od T411E i T411D, i pri čemu navedeni prvi i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom prvenstveno formiraju heterodimerni CH3 domen sa temperaturom topljenja (Tm) od najmanje oko 70 °C i čistoćom od najmanje 90%. U primeru izvođenja je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt pri čemu navedeni prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na pozicijama F405 i Y407 i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji T394. U primeru izvođenja je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji L351. U određenim primerima izvođenja, je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži modifikaciju najmanje jedne od pozicija T366 i K392. U nekim primerima izvođenja, je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C i formira se sa čistoćom od najmanje oko 95%. U određenim primerima izvođenja, je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, najmanje jedan polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije najmanje jednu od N390R, S400E i S400R. U nekim aspektima je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, jedan od navedenog prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije pozicije 347 i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji 360. U određenim primerima izvođenja je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju T350V. U specifičnim primerima izvođenja je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, navedeni prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od L351Y, F405A i Y407V; i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinsku modifikaciju odabranu od T366L, T366I, K392L, K392M i T394W. U određenim aspektima koji su ovde opisani je izolovani heteromultimer, prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži aminokiselinske modifikacije na pozicijama D399 i Y407, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na pozicijama K409 i T411. U nekim primerima izvođenja je izolovani heteromultimer koji je ovde opisan, prvi polipeptid sa CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinsku modifikaciju na poziciji L351, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije na poziciji T366 i K392. U specifičnim primerima izvođenja su izolovani heteromultimeri koji su ovde opisani, najmanje jedan od navedenih prvog i drugog polipeptida sa CH3 domenom koji sadrži aminokiselinsku modifikaciju T350V. U određenim primerima izvođenja su izolovani heteromultimeri koji su ovde opisani, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje oko 75 °C ili više i formira se sa čistoćom od najmanje oko 95%. U određenim aspektima obezbeđeni su izolovani heteromultimerni Fc konstrukti koji su ovde opisani, navedeni prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži aminokiselinske modifikacije odabrane od L351Y, D399R, D399K, S400D, S400E, S400R, S400K, Y407A, i Y407V; i navedeni drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije odabrane od T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392I, K392D, K392E, K409F, K409W, T411D i T411E.

[0096] Ovde je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži aminokiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I, K392M i T394W.

[0097] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366I, K392L i T394W.

[0098] U određenom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366L, K392M i T394W.

[0099] U nekim aspektima obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366L, K392L i T394W.

[0100] U aspektu je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, L351Y, F405A i Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, T366L, K392L i T394W.

[0101] U aspektu je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, L351Y, S400R, F405A, Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, T366L, K392M i T394W.

[0102] U aspektu je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, L351Y, S400E, F405A, Y407V; i drugi

1

polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, T366L, N390R, K392M i T394W.

[0103] U aspektu je obezbeđen izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, L351Y, F405A, Y407V; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T350V, T366L, K392L i T394W.

[0104] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366V, K392L, K409F i T411E; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, D399R, i Y407A.

[0105] U jednom aspektu obezbeđen je izolovani heteromultimerni Fc konstrukt, koji sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije T366V, K392LE K409F i T411E; i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koji sadrži amino-kiselinske modifikacije L351Y, D399R, S400R i Y407A.

[0106] U određenim primerima izvođenja, Fc varijanta sadrži CH2 domen. U nekim primerima izvođenja, CH2 domen je varijantni CH2 domen. U nekim primerima izvođenja, varijantni CH2 domeni sadrže asimetrične amino-kiselinske supstitucije u prvom i/ili drugom polipeptidnom lancu. U nekim primerima izvođenja, heteromultimer sadrži asimetrične amino-kiselinske supstitucije u CH2 domenu tako da se jedan lanac navedenog heteromultimera selektivno vezuje za Fc receptor.

[0107] U određenim primerima izvođenja, heteromultimer se selektivno vezuje za Fc receptor. U nekim primerima izvođenja, Fc receptor je član porodice Fcγ receptora. U nekim primerima izvođenja, receptor je odabran od FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa i FcγRIIIb. U jednom primeru izvođenja, CH2 domen sadrži asimetrične amino-kiselinske modifikacije koje promovišu selektivno vezivanje za Fcgama receptore.

[0108] U nekim primerima izvođenja, heteromultimer se selektivno vezuje za FcγRIIIa. U nekim primerima izvođenja, heteromultimer sadrži asimetrične amino-kiselinske supstitucije odabrane od S267D, K392D i K409D. U nekim primerima izvođenja, heteromultimer se selektivno vezuje za FcγRIIa. U nekim primerima izvođenja, heteromultimer sadrži asimetrične amino-kiselinske supstitucije odabrane od S239D, K326E, A330L i I332E. U nekim primerima izvođenja, heteromultimer se selektivno vezuje za FcγRIIb. U nekim

2

primerima izvođenja, heteromultimer sadrži asimetrične amino-kiselinske supstitucije odabrane od S239D, D265S, E269K i I332E. U nekim primerima izvođenja, heteromultimer se selektivno vezuje za FcγRIIIa i FcγRIIa. U nekim primerima izvođenja, heteromultimer sadrži asimetrične amino-kiselinske supstitucije odabrane od S239D, D265S, i S298A. U nekim primerima izvođenja, heteromultimer se selektivno vezuje za FcγRIIIa i FcγRIIb. U nekim primerima izvođenja, heteromultimer sadrži asimetrične amino-kiselinske supstitucije odabrane od S239D, S298A, K326E, A330L i I332E. U nekim primerima izvođenja, heteromultimer se selektivno vezuje za FcγRIIa i FcγRIIb. U nekim primerima izvođenja, heteromultimer sadrži asimetrične amino-kiselinske supstitucije odabrane od S239D, D265S, S298A i I332E.

[0109] U određenim primerima izvođenja obezbeđen je postupak dizajniranja multifunkcionalnih terapeutika koji sadrže heteromultimer koji je ovde opisan. U nekim primerima izvođenja obezbeđen je postupak dizajniranja bifunkcionalnih terapeutika koji sadrže varijantni Fc heterodimer. U nekim primerima izvođenja obezbeđen je postupak za dizajniranje asimetričnih mutacija u CH2 domenu varijantnog Fc heterodimera dobijenog mutacijama u CH3 domenu. U nekim primerima izvođenja obezbeđen je postupak za dizajniranje selektivnosti za različite Fc gama receptore na osnovu mutacija u asimetričnom Fc. U određenim primerima izvođenja obezbeđen je postupak za dizajniranje mutacija koje utiču na vezivanje Fc gama receptora za jednu stranu Fc molekula. U određenim primerima izvođenja obezbeđen je postupak za dizajniranje pokretača polarnosti koji utiču na Fcγ receptore kako bi interagovali sa samo jednom stranom asimetrične Fc skele heteromultimera koji je ovde opisan.

[0110] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je polipeptid koji sadrži mutacije u CH2 domenu asimetričnog Fc koje dovode do preferencijalnih profila selektivnosti Fc gama receptora. U nekim primerima izvođenja mutacije u CH3 domenu dovode do preferencijalnog formiranja heterodimernog Fc. U određenim primerima izvođenja je postupak za dizajniranje bispecifičnih terapijskih entiteta zasnovanih na asimetričnom Fc koji je ovde opisan. U određenim primerima izvođenja je postupak za dizajniranje multispecifičnih terapijskih entiteta zasnovanih na asimetričnom Fc koji je ovde opisan.

[0111] Monoklonalna antitela kao što je IgG su simetrični molekuli koji se sastoje od dva ekvivalentna teška i dva laka polipeptidna lanca (Slika 14), od kojih svaki sadrži više strukturnih domena imunoglobulina (Ig). IgG klasa mAb postoji u jednoj od četiri izoforme, IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4. Teški lanac se sastoji od četiri (VH, CH1, CH2 i CH3) i laki lanac od dva (VL i CL) Ig domena, respektivno. VH i CH1 domeni iz svakog od teških lanaca kombinuju se sa VL i CL domenima lakog lanca kako bi se formirala dva Fab ("fragment antigen vezujuća") kraka mAb. CH3 i CH2 domeni dva teška lanca interaguju putem proteinprotein kontakata preko CH3 domena i glikozilacije u CH2 domenima kako bi se formirao homodimerni Fc ("fragment koji se može kristalizovati") region. Linker region između CH1 i CH2 domena antitela čini region zgloba molekula antitela. Osim što povezuje Fab i Fc regione mAb, zglob takođe održava disulfidne veze duž dva teška lanca i drži ih zajedno. Broj amino-kiselina i disulfidnih veza u regionu zgloba značajno se razlikuje među četiri izotipa IgG. Obrazac glikozilacije u IgG molekulima može biti značajno raznolik, oko 30 različitih ugljenohidratnih grupa je uočeno u IgG molekulima [Arnold J.N.; Wormald M.R.; Sim R.B.; Rudd P.M. i Dwek R.A. (2007) Annual Reviews of Immunology 25, 21-50].

[0112] Simetrična priroda strukture monoklonalnih antitela rezultuje time da oba Fab kraka imaju svoju sposobnost vezivanja antigena afinitetno sazrelu da prepozna isti epitop. Na drugom kraju, Fc deo molekula antitela je uključen u interakcije sa različitim molekulima receptora na imunskim ili "efektorskim" ćelijama, i neke od ovih interakcija su odgovorne za posredovanje u efektorskim funkcijama kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP) i aktivacija komplementa. Generalno, efektorska funkcija uključuje imunske odgovore koji dovode do neutralizacije i eliminacije patogena ili toksina, aktivacije komplementa, i fagocitnog odgovora humoralnog imunskog sistema. Molekuli Fcγ receptora (FcγR) na efektorskim ćelijama kontaktiraju sa Fc aktiviranog IgG antitela uključenog u integralni antitelo-antigen imunski kompleks kako bi posredovali i regulisali efektorski odgovor. Optimizacija interakcije proteinskih terapijskih agenasa zasnovanih na monoklonalnim antitelima na ove Fcγ receptore može dovesti do poboljšanja efikasnosti ovih kandidata za lek.

[0113] Kod ljudi postoje tri poznate klase FcγR sa dodatnim polimorfnim tipovima unutar svake klase. Poznato je da Fc u IgG1 molekulu vezuje FcγRI (CD64) sa konstantama disocijacije u nanomolarnom opsegu, dok se FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16) vezivanje dešava u mikromolarnom opsegu [Bruhns P.; Iannascoli B.; England P.; Mancardi D.A.; Fernandez N.; Jorieux S. i Daeron M. (2009) Blood 113: 3716-25]. FcγRI receptori sa visokim afinitetom mogu da vezuju IgG u monomernim oblicima, dok receptori FcγRII i FcγRIII sa niskim afinitetom mogu da vezuju samo antigen-antitelo imunske komplekse ili IgG agregate kao rezultat efekata avidnosti. Različiti IgG oblici imaju različite afinitete za različite FcγR; posebno, IgG1 i IgG3 pokazuju jaču aktivnost. Fcγ receptori su vanćelijski domeni transmembranskih proteina i poseduju citoplazmatske domene koji su uključeni u regulisanje signalnih puteva unutar ćelije. Kada se grupišu na površini imunske ćelije pri

4

pridruživanju sa imunskim kompleksima posredovanim antitelom, u zavisnosti od prirode signalnih jedinica povezanih sa FcγR na citoplazmatskom kraju ovih receptora ćelijske površine, ovi molekuli regulišu efektorski odgovor [Nimmerjahn F. i Ravetch J.V. (2008) Nature Immu Rev 8(1):34-47].

[0114] Na nivou humanih hromozoma, tri gena kodiraju FcγRI (FcγRIA, FcγRIB, FcγRIC) i FcγRII (FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC) i dva gena kodiraju FcγRIII (FcγRIIIA, FcγRIIIB). Među humanim Fcγ receptorima koji vezuju IgG, pokazano je da su FcγRIA, FcγRIC i FcγRIIIA, tipovi pridruženi membrani sa zajedničkim signal adaptorskim proteinom γ-lanca koji sadrži citoplazmatski aktivacioni motiv imunoreceptora zasnovan na tirozinu (ITAM) koji dovodi do aktivacije efektorske funkcije. FcγRIIA i FcγRIIC takođe sadrže citoplazmatski ITAM, ali bez zajedničkog signal adaptorskog proteina γ-lanca. U isto vreme, FcγRIIB je povezan za inhibitorni motiv imunoreceptora zasnovan na tirozinu (ITIM). Aktivacija FcγRIIB koja rezultuje ITIM fosforilacijom dovodi do inhibicije aktivirajuće signalne kaskade. FcγRIIIB, iako nema nijedan od imuno-modulatornih citoplazmatskih repova zasnovanih na tirozinu, ima GPI (glikozil-fosfatidil-inozitol) sidro i pokazano je da doprinosi aktivaciji nekih granulocita u prisustvu FcγRIIA.

Tabela C: Karakteristike Fcγ receptora

[0115] Dok je funkcionalna uloga ITAM i ITIM motiva i pridruženih receptorskih molekula poznata, priroda i mehanizmi modulacije signalizacije u kombinaciji nisu u potpunosti shvaćeni, naročito kada se kombinuju sa aktivnošću receptora ćelijske površine domaćina ili drugih imunskih ćelija i adaptorskih molekula (npr. BCR, CD22, CD45 itd.) uključenih u transdukciju signala. U ovom kontekstu, dizajn molekula nalik na Fc koji mogu da interaguju sa ovim Fcγ receptorima sa izuzetnim profilima selektivnosti je dragocena skela u bilo kom pokušaju da se razvije i modulira efekat takvih receptorskih molekula sa suptilnim regulatornim aktivnostima.

[0116] U kontekstu dizajniranja molekula antitela koji mogu da razlikuju FcγR, napor je komplikovan činjenicom da vanćelijski Fc vezujući delovi FcγRII i FcγRIII tipova receptora pokazuju visoku sličnost sekvence (Slika 15), što se može pripisati barem delimično predačkoj segmentnoj duplikaciji. Dva glavna tipa FcγRII receptora, A i B, imaju 69% identičnosti sekvence, dok FcγRIIA i FcγRIIIA pokazuju oko 44% identičnosti sekvence. FcγRIIB i FcγRIIC se razlikuju samo po 2 ostatka u vanćelijskom regionu, iako su značajno različiti u unutarćelijskom regionu, primetno je prisustvo ITIM i ITAM motiva respektivno. Kao rezultat toga može se očekivati da bi se terapijski molekuli antitela koji su potrebni za vezivanje jednog receptora takođe potencijalno vezali za druge klase receptora, što bi moglo rezultovati neplaniranim terapijskim efektima.

[0117] Dodatno komplikuje stvari to što svaka od klasa receptora predstavlja višestruke polimorfizme pojedinačnih nukleotida (SNP) i varijacije broja kopija (CNV). Rezultujuća raznovrsnost receptora različito utiče na njihov afinitet prema IgG i mehanizam njihovog delovanja. Ove genetičke varijacije mogu uticati na afinitet određenih IgG podklasa za Fcγ receptore, menjati nizvodne efektorske događaje ili uticati na mehanizme koji menjaju nivoe ekspresije receptora što dovodi do funkcionalno relevantnih fenotipova, nefunkcionalnih ili funkcionalno nepoznatih varijanti receptora (Bournazos S.; Woof J.M.; Hart S.P. i Dransfield I. (2009) Clinical and Experimental Immunology 157(2):244-54). Oni potencijalno dovode do kompleksnih efekata, menjajući ravnotežu između aktivirajuće i inhibitorne signalizacije receptora, što rezultuje kreiranjem fenotipova podložnih bolesti.

[0118] Neke od ovih alelnih varijacija su nabrojane u Tabeli C. Primetno, R131 varijanta u FcγRIIa ima visok odgovor na IgG1, dok alternativne H131 varijante pokazuju efikasnije interakcije sa IgG2 i IgG3. U slučaju FcγRIIIa, donori homozigotni za V na poziciji 158 pokazuju povećanu aktivnost NK ćelija u poređenju sa homozigotnim F/F158 pojedincima usled većeg afiniteta prethodnog alotipa za humani IgG1, IgG3 i IgG4. Alelne varijante NA1 i NA2 FcγRIIIb su rezultat supstitucije četiri amino-kiseline što zauzvrat dovodi do razlika u glikozilaciji receptora. NA1 alel prezentuje pojačano vezivanje i fagocitozu imunskog kompleksa od strane neutrofila. FcγRIIB ima dve poznate alelne varijante, 232I i 232T. Poznato je da je 232T varijanta jako oštećena u svojoj negativnoj regulatornoj aktivnosti. Saopštene su učestalosti FcγR polimorfizama i njihove povezanosti sa različitin odgovorom na infekcije ili predispozicijom na bolesnna stanja kao što su sistemski ertemski lupus (SLE), reumatoidni artritis (RA), vaskulitis, imunski posredovana trombocitička purpura (ITP), mijastenija gravis, multipla skleroza (MS), i imuno neuropatije (Gilen-Bareov (Guillian-Barre) sindrom (GBS)).

[0119] Demonstrirana je varijacija broja kopija u lokusu FcγR gena, posebno za FcγRIIIB, FcγRIIc i FcγRIIIA, i uočena je dodatna korelacija ovih razlika sa ekspresijom ovih receptora na površini ćelije. Nasuprot tome, FcγRIIa i FcγRIIb ne pokazuju varijaciju broja kopija gena. Mali broj kopija FcγRIIIb je zapravo povezan sa glomerulonefritisom kod autoimunske bolesti sistemskog eritemskog lupusa (SLE) [Aitman TJ et al. (2006) Nature16;439(7078):851-5]. Ovo je posebno interesantno s obzirom na činjenicu da nesignalni GPI modul vezuje FcγRIIIb receptor. Može se pretpostaviti da bi prisustvo ovih FcγRIIIb receptora moglo potencijalno delovati kao kompetitivni inhibitori Fc interakcija sa drugim signalnim FcγR. Efekat varijacije broja kopija u FcγRIIc je takođe naročito interesantan. C/T SNP na poziciji 202 u FcγRIIc konvertuje ostatak glutamina u stop kodon prevenirajući generisanje funkcionalnog proteina. Funkcionalni otvoreni okvir čitanja FcγRIIc se eksprimira kod 9% zdravih pojedinaca (bela populacija) i postoji značajna prekomerna zastupljenost (19%) alela u ITP populaciji što implicira predispoziciju ovih fenotipova za ITP [Breunis WB et al. (2008) Blood 111(3):1029-38]. Demonstrirano je da je kod pojedinaca koji eksprimiraju funkcionalni FcγRIIc na NK ćelijama, postignuta ADCC posredovana ovim receptorima u većoj meri nego FcγRIIIa. Takve složenosti pridružene sa ovim polimorfizmima i genetičkim varijacijama naglašavaju potrebu za personalizovanim strategijama lečenja koje zahtevaju visoko prilagođene terapeutike.

[0120] Različite efektorske ćelije se razlikuju po prezentaciji ovih Fcγ receptora, kao i po svojoj humoralnoj i tkivnoj distribuciji, stoga doprinoseći varijacijama u njihovom mehanizmu aktivacije i delovanja [Tabela D]. Podešavanje selektivnosti terapijskih antitela ka prepoznavanju specifičnih FcγR tipova i modulisanje uticaja određenih klasa efektorskih ćelija, dovodi do optimizacije efektorskog mehanizma za određena bolesmna stanja. Ovo ima za cilj da selektivno aktivira ili inhibira specifične efektorske modalitete, u zavisnosti od bolesnog stanja koje se leči.

Tabela D: Ćelijska distribucija FcγR

[0121] Pored toga, FcγR se takođe eksprimiraju u folikulo-dendritskim ćelijama, endotelskim ćelijama, mikroglijskim ćelijama, osteoklastima i mezangijskim ćelijama. Trenutno, funkcionalni značaj ekspresije FcγR na ovim drugim ćelijama nije poznat.

[0122] FcγRI sa visokim afinitetom sastoji se od tri domena C-tipa imunoglobulin superfamilije (IgSF), dok se FcγRII i FcγRIII sa niskim afinitetom sastoje od po dva domena C-tipa IgSF. Struktura proteina receptora FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa i FcγRIIIb rešena je pomoću kristalografije. Dva IgSF domena u ovim strukturama su postavljena 50-55 stepeni jedan u odnosu na drugi i povezani su zgobom.

[0123] Javno dostupna struktura Fc-FcγR kokompleksa je struktura Fc-FcγRIIIb sistema i FcγR geometrija u kompleksu se održava veoma blizu onoj uočenoj u apo stanju proteina [Sondermann P.; Huber R.; Oosthuizen V. i Jacob U. (2000) Nature 406, 267-273.; Radaev S.; Motyaka S.; Fridman W.; Sautes-Fridman C. i Sun P.D. (2001) J Biol Chem 276, 16469-16477; Sondermann P. et al. Biochem Soc Trans. 2002 Aug; 30(4):481-6; Sondermann P, Oosthuizen V. Immunol Lett. 2002 Jun 3;82(1-2):51-6; Radaev S, Sun P. Mol Immunol.

2002. May; 38(14):1073-83.][Slika 16]. Jaka sličnost sekvence i strukture između receptora čine osnovu uporednih modela Fc vezanog za druge receptore. S druge strane, sličnost sekvence i strukture između ovih receptorskih molekula takođe čini izazovnim dizajn Fc sa izuzetnom selektivnošću između receptora i njihovih različitih izotipova.

[0124] Pre strukturne procene Fc-FcγR kompleksa na osnovu kristalografije, bilo je pitanja da li 2-struka osa simetrije u Fc molekulu znači dva potencijalna vezujuća mesta i efektivnu 2:1 stehiometriju za Fc-FcγR pridruživanje. Strukturne studije Fc-FcγR interakcija zasnovane na nuklearnoj magnetnoj rezonanci (NMR) ukazuju da vezivanje Fc za jedan FcγR na jednoj strani molekula indukuje konformacionu promenu koja sprečava vezivanje drugog FcγR molekula za Fc istog molekula antitela [Kato K. et al (2000) J Mol Biol. 295(2):213-24]. Geometrija dostupnog kokristalnog kompleksa Fc-FcγRIIIb potvrđuje pridruženost FcγR sa Fc u asimetričnoj orijentaciji sa 1:1 stehiometrijom. Kao što je pokazano na Slici 16, FcγR se vezuje za žljeb na jednom kraju Fc molekula koji je u obliku potkovice, i u kontaktu je sa CH2 domenima iz oba lanca.

[0125] Alanin skenirajuća mutageneza [Shields RL et al. (2001) JBC 276(9): 6591-604] obezbeđuje uvid u ostatke Fc koji se sučeljavaju sa različitim tipovima receptora i stoga su uključeni u Fc-FcγR interakciju i prepoznavanje. Tradicionalno, optimizacija terapijskih antitela je bila fokusirana oko mutacija koje pokazuju povećano vezivanje za aktivirajuće receptore FcγRIII [S.A.D. patent br. 6,737,056] ili smanjeni afinitet za FcγRIIb [US2009/0010920A1]. U svim ovim alternativnim varijantama, mutacije se introdukuju istovremeno u oba lanca.

[0126] Monoklonalna antitela često ispoljavaju svoju terapijsku aktivnost indukujući prostornu lokalizaciju cilja i efektorskih imunskih ćelija. Prirodno antitelo posreduje u tome tako što stupa u interakciju sa ciljem upotrebljavajući svoje Fab domene i efektorskom ćelijom upotrebljavajući Fc domen. Ona mogu da blisko pozicioniraju imunski kompleks u odnosu na efektorsku ćeliju tako da se može indukovati ćelijski posredovani odgovor. Efekti avidnosti potrebni za FcγR signalizacije, koji potiču od formiranja imunskih komplekasa koji uključuju ciljno delovanje na jedan cilj od strane više molekula antitela, je sledeći primer značaja prostorno-vremenske organizacije u imunskom delovanju.

[0127] Takođe postoji prostorno-vremenski aspekt ćelijske signalizacije koja se indukuje kao deo efektorske aktivnosti mAb molekula. Ćelijska signalizacija kao što je ona zasnovana na aktivaciji FcγR molekula uključuje lokalizaciju relevantnih receptorskih molekula unutar regiona membranskog domena koji su označeni kao lipidni splavovi. Lipidni splavovi su obogaćeni glikosfingolipidom i holesterolom i nekoliko klasa uzvodnih prenosnika signala uključujući Src porodicu kinaza. Nakon stimulacije ćelije regrutuju se različiti signalni molekuli, adapterski proteini i signalne kinaze kao i fosfataze. Molekulsko asembliranje u lipidnim splavovima je važno za transdukciju signala.

[0128] Strategija neprirodnog dizajna, koja kombinuje različite specifičnosti antigena i povećanu avidnost kako bi se obezbedila bolja svojstva vezivanja je osnova bispecifičnog terapijskog dizajna. Bispecifična antitela ili drugi oblici bispecifičnih ili multifunkcionalnih proteinskih terapeutika dizajnirani su da posreduju u interakcijama između cilja i različitih efektorskih ćelija [Müller & Kontermann (2010) BioDrugs 24(2):89-98]. Multispecifični terapijski molekuli su projektovani da preusmere pomoćne T-ćelije ili druge imunske efektorske ćelije prema specifičnim ciljnim ćelijama.

[0129] U sledećem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na postupak za identifikaciju Fc varijantnih polipeptida in silico zasnovano na izračunatim afinitetima vezivanja za FcγRIIa, FcγRIIb i/ili FcγRIIIa. U sledećem primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži izračunavanje in silico elektrostatike, solvatacije, pakovanja, gustine pakovanja, vezivanja vodonika, i entropijskih efekata navedenih Fc varijantnih polipeptida. U još jednom primeru izvođenja, postupak iz trenutnog pronalaska dodatno uključuje konstruisanje Fc varijantnih polipeptida i ekspresiju navedenih polipeptida u kontekstu terapijskog antitela i dodatno ekspresiju navedenog antitela u ćelijama sisara. U još jednom primeru izvođenja, postupak trenutnog pronalaska sadrži konstruisanje Fc varijantnih polipeptida identifikovanih in silico pomoću mutageneze usmerene na mesto, mutageneze zasnovane na PCR, mutageneze kasete ili de novo sinteze.

[0130] Faktori uzeti u obzir u dizajnu sintetičke Fc skele uključuju in silico proračune za sterično odbijanje, promenu ukopane površine interfejsa, relativnu kontaktnu gustinu, relativnu solvataciju i elektrostatički efekat. Sve ove matrice upotrebljene su da bi se došlo do rezultata afiniteta.

[0131] U jednom aspektu, ova prijava opisuje molekulski dizajn za postizanje izuzetnih profila selektivnosti FcγR putem dizajna asimetrične skele izgrađene na heterodimernom Fc. Ova skela omogućava asimetrične mutacije u CH2 domenu kako bi se postigli različiti novi profili selektivnosti. Dodatno, skela ima inherentne odlike za projektovanje multifunkcionalnih (bi, tri, tetra ili penta funkcionalnih) terapijskih molekula.

[0132] U određenim primerima izvođenja, asimetrična skela je optimizovana za svojstva vezivanja zavisna od pH za neonatalni Fc receptor (FcRn) kako bi se omogućilo bolje recikliranje molekula i poboljšao njegov poluživot i povezana farmakokinetička svojstva.

[0133] Asimetrična skela se može optimizovati za vezivanje za funkcionalno relevantne alotipove FcγRI receptora. FcγRI je istaknuti marker na makrofagima koji su uključeni u hronične inflamatorne poremećaje kao što su reumatoidni artritis, atopijski dermatitis, psorijaza i niz pulmonarnih bolesti.

[0134] Asimetrična skela se može optimizovati za vezivanje proteina A. Vezivanje proteina A se često koristi za odvajanje i prečišćavanje molekula antitela. Mutacije se mogu introdukovati u asimetričnu skelu kako bi se izbegla agregacija terapeutika tokom skladištenja.

[0135] Prema tome, posebno se smatra da Fc varijante iz pronalaska mogu sadržati između ostalog jednu ili više dodatnih supstitucija amino-kiselinskih ostataka, mutacija i/ili modifikacija koje rezuluju antitelom sa poželjnim karakteristikama uključujući ali ne ograničavajući se na: produženi poluživot u serumu, povećanje afiniteta vezivanja, redukovanu imunogenost, povećanu proizvodnju, pojačanu ili redukovanu ADCC ili CDC aktivnost, izmenjenu glikozilaciju i/ili disulfidne veze i modifikovanu specifičnost vezivanja.

[0136] Smatra se da Fc varijante iz pronalaska mogu imati druge izmenjene karakteristike uključujući povećane in vivo poluživote (npr. poluživote u serumu) kod sisara; posebno kod ljudi, povećanu stabilnost in vivo (npr. poluživote u serumu) i/ili in vitro (npr. vek trajanja) i/ili povećanu temperaturu topljenja (Tm), u odnosu na uporedivi molekul. U jednom primeru izvođenja, Fc varijanta iz pronalaska ima in vivo poluživot duži od 15 dana, duži od 20 dana, duži od 25 dana, duži od 30 dana, duži od 35 dana, duži od 40 dana, duži od 45 dana, duži od

1

2 meseca, duži od 3 meseca, duži od 4 meseca, ili duži od 5 meseci. U sledećem primeru izvođenja, Fc varijanta iz pronalaska ima in vitro poluživot (npr. tečna ili praškasta formulacija) duži od 15 dana, duži od 30 dana, duži od 2 meseca, duži od 3 meseca, duži od 6 meseci, ili duži od 12 meseci, ili duži od 24 meseca, ili duži od 36 meseci, ili duži od 60 meseci.

[0137] Onaj sa iskustvom u ovoj struci takođe će podrazumevati da Fc varijante iz pronalaska mogu imati izmenjenu imunogenost kada se primene subjektu. U skladu sa tim, smatra se da je modifikovani CH3 domen, koji minimalizuje imunogenost Fc varijante, generalno poželjniji za terapijske primene.

[0138] Fc varijante iz predmetnog pronalaska mogu se kombinovati sa drugim Fc modifikacijama, uključujući ali ne ograničavajući se na modifikacije koje menjaju efektorsku funkciju. Pronalazak obuhvata kombinovanje Fc varijante iz pronalaska sa drugim Fc modifikacijama kako bi se obezbedila aditivna, sinergistička, ili nova svojstva u antitelima ili Fc fuzionim proteinima.

[0139] Takve modifikacije mogu biti u domenima zgloba, CH1, ili CH2, (ili CH3 pod uslovom da ne menjaju negativno svojstva stabilnosti i čistoće prisutnih modifikovanih CH3 domena) ili u njihovoj kombinaciji. Smatra se da Fc varijante iz pronalaska poboljšavaju svojstva modifikacije sa kojom su kombinovane. Na primer, ukoliko se Fc varijanta iz pronalaska kombinuje sa mutantom za koji se zna da se vezuje za FcγRIIIA sa većim afinitetom od uporedivog molekula koji sadrži Fc region divljeg tipa; kombinacija sa mutantom iz pronalaska rezultuje višestrukim povećanjem FcγRIIIA afiniteta.

[0140] U jednom primeru izvođenja, Fc varijante iz predmetnog pronalaska mogu se kombinovati sa drugim poznatim Fc varijantama kao što su one objavljene u Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al, 1996, Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); S.A.D. patentima br. 5,624,821; 5,885,573; 6,194,551; S.A.D. patentnim prijavama br. 60/601,634 i 60/608,852; PCT publikacijama br. WO 00/42072 i WO 99/58572.

2

[0141] Onaj sa iskustvom u struci će razumeti da Fc varijante iz pronalaska mogu imati izmenjena svojstva vezivanja Fc liganda (npr. FcγR, C1q) (primeri svojstava vezivanja uključuju ali nisu ograničeni na, specifičnost vezivanja, ravnotežnu konstantu disocijacije (KD), stope disocijacije i asocijacije (Koffi Konrespektivno), afinitet vezivanja i/ili avidnost) i da su određene izmene manje ili više poželjne. U struci je dobro poznato da je ravnotežna konstanta disocijacije (KD) definisana kao koff/kon. Generalno se podrazumeva da je vezujući molekul (npr. i antitelo) sa niskom KDpoželjniji od vezujućeg molekula (npr. i antitela) sa visokom KD. Međutim, u nekim slučajevima konili koffvrednost može biti relevantnija od KDvrednosti. Onaj sa iskustvom u struci može da odredi koji je kinetički parametar najvažniji za datu primenu antitela. Na primer, modifikovani CH3 i/ili CH2 koji poboljšavaju vezivanje Fc za jedan ili više pozitivnih regulatora (npr. FcγRIIIA) dok ostavljaju nepromenjeno ili čak redukuju vezivanje Fc za negativni regulator FcγRIIB bili bi korisniji za povećanje ADCC aktivnosti. Alternativno, modifikovani CH3 i/ili CH2 koji su redukovali vezivanje za jedan ili više pozitivnih regulatora i/ili pojačali vezivanje za FcγRIIB bi bili korisni za redukovanje ADCC aktivnosti. U skladu sa tim, odnos afiniteta vezivanja (npr. ravnotežne konstante disocijacije (KD)) može da ukaže da li je ADCC aktivnost Fc varijante poboljšana ili smanjena. Na primer smanjenje odnosa FcγRIIIA/FcγRIIB ravnotežnih konstanti disocijacije (KD) će korelisati sa poboljšanom ADCC aktivnošću, dok će povećanje odnosa korelisati sa smanjenjem ADCC aktivnosti.

[0142] Kao deo karakterizacije Fc varijanti, one su testirane na njihov afinitet vezivanja za FcγRIIIA (CD16a) i FcγRIIB (CD32b) saopšten kao odnos u poređenju sa IgG1 divljeg tipa. (Videti Primer 4 i Tabelu 5). U ovom slučaju bilo je moguće proceniti uticaj mutacija CH3 domena na vezivanje za ove aktivirajuće i inhibitorne Fc receptore. U jednom primeru izvođenja, ovde su obezbeđeni izolovani heteromultimeri koji sadrže heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži aminokiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) višu od 70 °C, pri čemu je vezivanje heterodimera za CD16a približno isto u poređenju sa homodimerom divljeg tipa. U određenim primerima izvođenja, vezivanje heterodimera za CD16a je povećano u poređenju sa homodimerom divljeg tipa. U alternativnom primeru izvođenja, vezivanje heterodimera za CD16a je redukovano u poređenju sa homodimerom divljeg tipa.

[0143] U određenim primerima izvođenja, ovde su obezbeđeni izolovani heteromultimeri koji sadrže heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) višu od 74 °C, pri čemu je vezivanje heterodimera za CD32b približno isto u poređenju sa homodimerom divljeg tipa. U određenim primerima izvođenja, vezivanje heterodimera za CD32b je povećano u poređenju sa homodimerom divljeg tipa. U alternativnom primeru izvođenja, vezivanje heterodimera za CD32b je redukovano u poređenju sa homodimerom divljeg tipa.

[0144] Onaj sa iskustvom u struci će razumeti da umesto saopštavanja KDvezivanja CD16a i CD32b kao odnosa Fc varijante prema homodimeru divljeg tipa, KDse može saopštiti kao odnos vezivanja Fc varijante za CD16a i vezivanja Fc varijante za CD32b (podaci nisu pokazani). Ovaj odnos bi obezbedio indikaciju mutacije modifikovanog CH3 domena na ADCC, bilo nepromenjenu, povećanu do smanjenu u poređenju sa divljim tipom, što je detaljnije opisano u nastavku.

[0145] Afiniteti i svojstva vezivanja Fc varijanti iz pronalaska za FcγR se inicijalno određuju upotrebom in vitro testova (biohemijski ili imunološki zasnovani testovi) poznatih u struci za određivanje Fc-FcγR interakcija, tj. specifičnog vezivanja Fc regiona za FcγR uključujući ali ne ograničavajući se na ELISA test, test površinske plazmonske rezonance, testove imunoprecipitacije (videti odeljak pod naslovom "Karakterizacija i funkcionalni testovi" infra) i druge postupke kao što su testovi indirektnog vezivanja, testovi kompetitivne inhibicije, fluorescentno rezonantni energetski transfer (FRET), gel elektroforeza i hromatografija (npr. gel filtracija). Ovi i drugi postupci mogu da koriste obeleživač na jednoj ili više komponenti koje se ispituju i/ili koriste različite postupke detekcije uključujući ali ne ograničavajući se na hromogene, fluorescentne, luminescentne, ili izotopske obeleživače. Detaljan opis afiniteta i kinetike vezivanja može se pronaći u Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), koji se fokusira na interakcije antitelo-imunogen.

[0146] Smatra se da se svojstva vezivanja molekula iz pronalaska takođe karakterišu in vitro funkcionalnim testovima za određivanje jedne ili više funkcija FcγR medijatora efektorskih ćelija (videti odeljak pod naslovom "Karakterizacija i funkcionalni testovi" infra). U određenim primerima izvođenja, molekuli iz pronalaska imaju slična svojstva vezivanja u in vivo modelima (kao što su oni koji su ovde opisani i objavljeni) kao oni u in vitro testovima. Međutim, predmetni pronalazak ne isključuje molekule iz pronalaska koji ne pokazuju željeni fenotip u in vitro testovima, ali pokazuju željeni fenotip in vivo.

[0147] Pronalazak obuhvata Fc varijante koje vezuju FcγRIIIA (CD16a) sa povećanim afinitetom, u odnosu na uporedivi molekul. U specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante iz pronalaska vezuju FcγRIIIA sa povećanim afinitetom i vezuju FcγRIIB (CD32b) sa afinitetom

4

vezivanja koji je bilo nepromenjen ili redukovan, u odnosu na uporedivi molekul. U još jednom primeru izvođenja, Fc varijante iz pronalaska imaju odnos FcγRIIIA/FcγRIIB ravnotežnih konstanti disocijacije (KD) koji je smanjen u odnosu na uporedivi molekul.

[0148] Takođe obuhvaćene predmetnim pronalaskom su Fc varijante koje vezuju FcγRIIIA (CD16a) sa smanjenim afinitetom, u odnosu na uporedivi molekul. U specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante iz pronalaska vezuju FcγRIIIA sa smanjenim afinitetom, u odnosu na uporedivi molekul i vezuju FcγRIIB sa afinitetom vezivanja koji je nepromenjen ili povećan, u odnosu na uporedivi molekul.

[0149] U jednom primeru izvođenja, Fc varijante se vezuju sa povećanim afinitetom za FcγRIIIA. U specifičnom primeru izvođenja, navedene Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIIA koji je najmanje 2 struko, ili najmanje 3 struko, ili najmanje 5 struko, ili najmanje 7 struko, ili najmanje 10 struko, ili najmanje 20 struko, ili najmanje 30 struko, ili najmanje 40 struko, ili najmanje 50 struko, ili najmanje 60 struko, ili najmanje 70 struko, ili najmanje 80 struko, ili najmanje 90 struko, ili najmanje 100 struko, ili najmanje 200 struko veći nego onaj kod uporedivog molekula. U drugim primerima izvođenja, Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIIA koji je povećan za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60% ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul.

[0150] U sledećem primeru izvođenja, Fc varijanta ima ravnotežnu konstantu disocijacije (KD) za Fc ligand (npr. FcγR, C1q) koja je smanjena između oko 2 struko i 10 struko, ili između oko 5 struko i 50 struko, ili između oko 25 struko i 250 struko, ili između oko 100 struko i 500 struko, ili između oko 250 struko i 1000 struko u odnosu na uporedivi molekul.

[0151] U sledećem primeru izvođenja, navedene Fc varijante imaju ravnotežnu konstantu disocijacije (KD) za FcγRIIIA koja je redukovana za najmanje 2 struko, ili najmanje 3 struko, ili najmanje 5 struko, ili najmanje 7 struko, ili najmanje 10 struko, ili najmanje 20 struko, ili najmanje 30 struko, ili najmanje 40 struko, ili najmanje 50 struko, ili najmanje 60 struko, ili najmanje 70 struko, ili najmanje 80 struko, ili najmanje 90 struko, ili najmanje 100 struko, ili najmanje 200 struko, ili najmanje 400 struko, ili najmanje 600 struko, u odnosu na uporedivi molekul. U sledećem primeru izvođenja, Fc varijante imaju ravnotežnu konstantu disocijacije (KD) za FcγRIIIA koja je redukovana za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul.

[0152] U jednom primeru izvođenja, Fc varijanta se vezuje za FcγRIIB sa afinitetom koji je nepromenjen ili redukovan. U specifičnom primeru izvođenja, navedene Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIB koji je nepromenjen ili redukovan za najmanje 1 struko, ili za najmanje 3 struko, ili za najmanje 5 struko, ili za najmanje 10 struko, ili za najmanje 20 struko, ili za najmanje 50 struko, ili za najmanje 100 struko, u odnosu na uporedivi molekul. U drugim primerima izvođenja, Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIB koji je nepromenjen ili redukovan za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul.

[0153] U sledećem primeru izvođenja, Fc varijante imaju ravnotežnu konstantu disocijacije (KD) za FcγRIIB koja je nepromenjena ili povećana za najmanje 2 struko, ili najmanje 3 struko, ili najmanje 5 struko, ili najmanje 7 struko, ili najmanje 10 struko, ili najmanje 20 struko, ili najmanje 30 struko, ili najmanje 40 struko, ili najmanje 50 struko, ili najmanje 60 struko, ili najmanje 70 struko, ili najmanje 80 struko, ili najmanje 90 struko, ili najmanje 100 struko, ili najmanje 200 struko u odnosu na uporedivi molekul. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante imaju ravnotežnu konstantu disocijacije (KD) za FcγRIIB koja je nepromenjena ili povećana za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul.

[0154] U još jednom primeru izvođenja, Fc varijante vezuju FcγRIIIA sa povećanim afinitetom, u odnosu na uporedivi molekul i vezuju FcγRIIB sa afinitetom koji je nepromenjen ili redukovan, u odnosu na uporedivi molekul. U specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIIA koji je povećan za najmanje 1 struko, ili za najmanje 3 struko, ili za najmanje 5 struko, ili za najmanje 10 struko, ili za najmanje 20 struko, ili za najmanje 50 struko, ili za najmanje 100 struko, u odnosu na uporedivi molekul. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIB koji je bilo nepromenjen ili je redukovan za najmanje 2 struko, ili najmanje 3 struko, ili najmanje 5 struko, ili najmanje 7 struko, ili najmanje 10 struko, ili najmanje 20 struko, ili najmanje 50 struko, ili najmanje 100 struko, u odnosu na uporedivi molekul. U drugim primerima izvođenja, Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIIA koji je povećan za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60% ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul i Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIB koji je bilo nepromenjen ili je povećan za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul.

[0155] U još jednom primeru izvođenju, Fc varijante imaju odnos FcγRIIIA/FcγRIIB ravnotežnih konstanti disocijacije (KD) koji je smanjen u odnosu na uporedivi molekul. U specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante imaju odnos FcγRIIIA/FcγRIIB ravnotežnih konstanti disocijacije (KD) koji je smanjen za najmanje 1 struko, ili za najmanje 3 struko, ili za najmanje 5 struko, ili za najmanje 10 struko, ili za najmanje 20 struko, ili za najmanje 50 struko, ili za najmanje 100 struko, u odnosu na uporedivi molekul. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante imaju odnos FcγRIIIA/FcγRIIB ravnotežnih konstanti disocijacije (KD) koji je smanjen za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili na najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul.

[0156] U sledećem primeru izvođenja, Fc varijante vezuju FcγRIIIA sa smanjenim afinitetom, u odnosu na uporedivi molekul. U specifičnom primeru izvođenja, navedene Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIIA koji je redukovan za najmanje 1 struko, ili za najmanje 3 struko, ili za najmanje 5 struko, ili za najmanje 10 struko, ili za najmanje 20 struko, ili za najmanje 50 struko, ili za najmanje 100 struko, u odnosu na uporedivi molekul. U drugim primerima izvođenja, Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIIA koji je smanjen za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60% ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul.

[0157] U još jednom primeru izvođenja, Fc varijante vezuju FcγRIIIA sa smanjenim afinitetom i vezuju FcγRIIB sa afinitetom koji je bilo nepromenjen ili povećan, u odnosu na uporedivi molekul. U specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIIA koji je redukovan za najmanje 1 struko, ili za najmanje 3 struko, ili za najmanje 5 struko, ili za najmanje 10 struko, ili za najmanje 20 struko, ili za najmanje 50 struko, ili za najmanje 100 struko u odnosu na uporedivi molekul. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIB koji je najmanje 2 struko, ili najmanje 3 struko, ili najmanje 5 struko, ili najmanje 7 struko, ili najmanje 10 struko, ili najmanje 20 struko, ili najmanje 50 struko, ili najmanje 100 struko, veći nego onaj kod uporedivog molekula. U drugim primerima izvođenja, Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIIA koji je smanjen za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60% ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul i Fc varijante imaju afinitet za FcγRIIB koji je povećan za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul.

[0158] U još jednom primeru izvođenja, Fc varijante imaju ravnotežnu konstantu disocijacije (KD) za FcγRIIIA koja je povećana za najmanje 1 struko, ili za najmanje 3 struko, ili za najmanje 5 struko ili za najmanje 10 ili za najmanje 20 struko, ili za najmanje 50 struko kada se porede sa onom kod uporedivog molekula. U specifičnom primeru izvođenja, navedene Fc varijante imaju ravnotežnu konstantu disocijacije (KD) za FcγRIIB koja je smanjena najmanje 2 struko, ili najmanje 3 struko, ili najmanje 5 struko, ili najmanje 7 struko, ili najmanje 10 struko, ili najmanje 20 struko, ili najmanje 50 struko ili najmanje 100 struko, u odnosu na uporedivi molekul.

CH2 varijacije za FcγR selektivnost

[0159] Fc-FcγR protein-protein interakcija u ovom kompleksu ukazuje na to da dva lanca u Fc molekulu interaguju sa dva različita mesta na FcγR molekulu. Iako postoji simetrija u dva teška lanca u prirodnim Fc molekulima, lokalno okruženje FcγR oko ostataka na jednom lancu razlikuje se od FcγR ostataka koji okružuju istu poziciju ostatka na suprotnom Fc lancu. Dve pozicije srodne po simetriji interaguju sa različitim odabirom FcγR ostataka.

[0160] S obzirom na asimetriju u povezivanju Fc sa FcγR, istovremene mutacije u lancu A i B molekula Fc ne utiču na interakcije sa FcγR na simetričan način. Kada se introdukuju mutacije za optimizaciju interakcija na jednom lancu Fc sa njegovim lokalnim FcγR okruženjem, u homodimernoj Fc strukturi, odgovarajuća mutacija u drugom lancu može biti povoljna, nepovoljna ili da ne doprinosi potrebnom profilu vezivanja i selektivnosti FcγR.

[0161] Upotrebom pristupa vođenog strukturom i proračunima, asimetrične mutacije su projektovane u dva lanca Fc kako bi se prevazišla ova ograničenja tradicionalnih strategija Fc projektovanja, koje introdukuju iste mutacije na oba lanca Fc. Može se postići bolja selektivnost vezivanja između receptora ukoliko se dva lanca Fc optimizuju nezavisno za pojačano vezivanje za njihovu odgovarajuću stranu molekula receptora.

[0162] Na primer, mutacije na određenoj poziciji na jednom lancu Fc mogu biti dizajnirane da poboljšaju selektivnost prema određenom ostatku, što predstavlja napor pozitivnog dizajna, dok se ista pozicija ostatka može mutirati kako bi nepovoljno interagovala sa svojim lokalnim okruženjem u alternativnom tipu Fcγ receptora, što predstavlja napor negativnog dizajna, čime se postiže bolja selektivnost između dva receptora. U određenim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za dizajniranje asimetričnih amino-kiselinskih modifikacija u CH2 domenu koje selektivno vezuju jedan Fc gama receptor u poređenju sa različitim Fc gama receptorom (npr. selektivno vezuju FcγRIIIa umesto FcγRIIb). U drugim određenim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za dizajniranje asimetričnih amino-kiselinskih modifikacija u CH2 domenu varijantnog Fc heterodimera koji sadrži amino-kiselinske modifikacije u CH3 domenu za promovisanje formiranja heterodimera. U sledećem primeru izvođenja, obezbeđen je postupak za dizajniranje selektivnosti za različite Fc gama receptore na osnovu varijantnog Fc heterodimera koji sadrži asimetrične amino-kiselinske modifikacije u CH2 domenu. U još jednom primeru izvođenja, obezbeđen je postupak za dizajniranje asimetričnih amino-kiselinskih modifikacija koje utiču na vezivanje Fc gama receptora za jednu stranu Fc molekula. U drugim određenim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za dizajniranje pokretača polarnosti koji utiču na Fcgama receptore kako bi interagovali sa samo jednom stranom varijantnog Fc heterodimera koji sadrži asimetrične amino-kiselinske modifikacije u CH2 domenu.

[0163] Asimetrični dizajn mutacija u CH2 domenu može se prilagoditi tako da prepozna FcγR na jednoj strani Fc molekula. Ovo čini produktivnu stranu asimetrične Fc skele, dok suprotna strana prezentuje sklonost interakciji nalik divljem tipu bez dizajniranog profila selektivnosti i može se smatrati neproduktivnom stranom. Strategija negativnog dizajna se može koristiti kako bi se introdukovale mutacije na neproduktivnoj strani kako bi se blokirale FcγR interakcije na ovoj strani asimetrične Fc skele, time će se željene tendencije interakcije forsirati ka Fcγ receptorima.

[0164] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na fuzione polipeptide koji sadrže vezujući domen fuzionisan sa Fc regionom, pri čemu Fc region koji sadrži modifikovani CH3 domen, koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) višu od 70 °C. Posebno se smatra da molekuli koji sadrže heterodimer koji sadrži modifikovani CH3 domen mogu biti generisani postupcima koji su dobro poznati onom sa iskustvom u struci. Ukratko, takvi postupci uključuju ali nisu ograničeni na, kombinovanje varijabilnog regiona ili vezujućeg domena sa željenom specifičnošću (npr. varijabilni region izolovan iz displej faga ili ekspresione biblioteke ili poreklom iz humanog ili ne-humanog antitela ili vezujućeg domena receptora) sa varijantnim Fc heterodimerima. Alternativno, onaj sa iskustvom u struci može da generiše varijantni Fc heterodimer modifikovanjem CH3 domena u Fc regionu molekula koji sadrži Fc region (npr. antitelo).

[0165] U jednom primeru izvođenja, Fc varijante su antitela ili Fc fuzioni proteini. U specifičnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje antitela koja sadrže Fc region koji sadrži modifikovani CH3 domen, koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) višu od 74 °C. Takva antitela uključuju IgG molekule koji prirodno sadrže Fc region koji sadrži CH3 domen koji se može modifikovati da generiše Fc varijantu, ili derivate antitela koji su projektovani da sadrže Fc region koji sadrži modifikovani CH3 domen. Fc varijante iz pronalaska uključuju bilo koji molekul antitela koji vezuje, poželjno, specifično (tj. koji je u kompeticiji sa nespecifičnim vezivanjem kao što je određeno pomoću imunotestova dobro poznatih u struci za ispitivanje specifičnog antigenantitelo vezivanja) antigen koji sadrži Fc region koji inkorporiše modifikovani CH3 domen. Takva antitela uključuju, ali nisu ograničena na, poliklonalna, monoklonalna, monospecifična, bispecifična, multispecifična, humana, humanizovana, himerna antitela, jednolančana antitela, Fab fragmente, F(ab')2fragmente, disulfid-povezani Fv, i fragmente koji sadrže bilo VL ili VH domen ili čak region koji određuje komplementarnost (CDR) koji specifično vezuje antigen, u određenim slučajevima, projektovan da sadrži ili fuzionisan sa varijantnim Fc heterodimerom.

[0166] "Ćelijski-posredovana citotoksičnost zavisna od antitela" ili "ADCC" označava oblik citotoksičnosti u kom sekretovano antitelo vezano za Fc receptore (FcR) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili, i makrofagi) omogućava ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vežu za antigenzaceljujuću ciljnu ćeliju i zatim ubiju ciljnu ćeliju citotoksinima. Specifična IgG antitela sa visokim afinitetom usmerena na površinu ciljnih ćelija "naoružavaju" citotoksične ćelije i apsolutno su neophodna za takvo ubijanje. Liza ciljne ćelije je vanćelijska, zahteva direktan ćelija-ćelija kontakt, i ne uključuje komplement.

[0167] Može se testirati sposobnost bilo kog određenog antitela da posreduje u lizi ciljne ćelije pomoću ADCC. Da bi se procenila ADCC aktivnost, ciljnim ćelijama se dodaje antitelo od interesa u kombinaciji sa imunskim efektorskim ćelijama, koje mogu biti aktivirane antigen antitelo kompleksima što dovodi do citolize ciljne ćelije. Citoliza se generalno detektuje pomoću oslobađanja obeleživača (npr. radioaktivnih supstrata, fluorescentnih boja ili prirodnih unutarćelijskih proteina) iz liziranih ćelija. Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononukleusne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Specifični primeri in vitro ADCC testova su opisani u Wisecarver et al., 1985, 79:277; Bruggemann et al., 1987, J Exp Med 166:1351; Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258:183; Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184:29 i ovde (videti odeljak pod naslovom "Karakterizacija i funkcionalni testovi" infra). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost antitela od interesa može se proceniti in vivo, npr. na životinjskom modelu kao što je onaj koji je objavljen u Clynes et al., 1998, PNAS USA 95:652.

1

[0168] Smatra se da se Fc varijante iz pronalaska karakterišu in vitro funkcionalnim testovima za određivanje jedne ili više funkcija FcγR medijatora efektorskih ćelija. U specifičnim primerima izvođenja, molekuli iz pronalaska imaju slična svojstva vezivanja i funkcije efektorskih ćelija u in vivo modelima (kao što su oni koji su ovde opisani i objavljeni) kao oni u in vitro testovima. Međutim, predmetni pronalazak ne isključuje molekule iz pronalaska koji ne pokazuju željeni fenotip u in vitro testovima, ali pokazuju željeni fenotip in vivo.

[0169] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje Fc varijante sa poboljšanom CDC funkcijom. U jednom primeru izvođenja, Fc varijante imaju povećanu CDC aktivnost. U jednom primeru izvođenja, Fc varijante imaju CDC aktivnost koja je najmanje 2 struko, ili najmanje 3 struko, ili najmanje 5 struko, ili najmanje 10 struko, ili najmanje 50 struko, ili najmanje 100 struko veća nego ona kod uporedivog molekula. U sledećem primeru izvođenja, Fc varijante vezuju C1q sa afinitetom koji je najmanje 2 struko, ili najmanje 3 struko, ili najmanje 5 struko, ili najmanje 7 struko, ili najmanje 10 struko, ili najmanje 20 struko, ili najmanje 50 struko, ili najmanje 100 struko, veći nego onaj kod uporedivog molekula. U još jednom primeru izvođenja, Fc varijante imaju CDC aktivnost koja je povećana za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul. U specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante iz pronalaska vezuju C1q sa povećanim afinitetom; imaju poboljšanu CDC aktivnost i specifično se vezuju za najmanje jedan antigen.

[0170] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje Fc varijante sa redukovanom CDC funkcijom. U jednom primeru izvođenja, Fc varijante imaju redukovanu CDC aktivnost. U jednom primeru izvođenja, Fc varijante imaju CDC aktivnost koja je najmanje 2 struko, ili najmanje 3 struko, ili najmanje 5 struko ili najmanje 10 struko ili najmanje 50 struko ili najmanje 100 struko manja nego ona kod uporedivog molekula. U sledećem primeru izvođenja, Fc varijanta vezuje C1q sa afinitetom koji je redukovan za najmanje 1 struko, ili za najmanje 3 struko, ili za najmanje 5 struko, ili za najmanje 10 struko, ili za najmanje 20 struko, ili za najmanje 50 struko, ili za najmanje 100 struko, u odnosu na uporedivi molekul. U sledećem primeru izvođenja, Fc varijante imaju CDC aktivnost koja je smanjena za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili najmanje 150%, ili najmanje 200%, u odnosu na uporedivi molekul. U specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante se vezuju za C1q sa smanjenim afinitetom imaju redukovanu CDC aktivnost i specifično se vezuju za najmanje jedan antigen.

2

[0171] U nekim primerima izvođenja, Fc varijante sadrže jednu ili više projektovanih glikoformi, tj. ugljenohidratnu kompoziciju koja je kovalentno prikačena za molekul koji sadrži Fc region. Projektovane glikoforme mogu biti korisne za različite svrhe, uključujući ali ne ograničavajući se na poboljšanje ili redukovanje efektorske funkcije. Projektovane glikoforme mogu da se generišu bilo kojim postupkom poznatim onom sa iskustvom u struci, na primer upotrebom projektovanih ili varijantnih ekspresionih sojeva, koekspresijom sa jednim ili više enzima, na primer β(1,4)-N-acetilglukozaminiltransferazom III (GnTI11), ekspresijom molekula koji sadrži Fc region u različitim organizmima ili ćelijskim linijama iz različitih organizama, ili modifikovanjem ugljenog(ih) hidrata pošto je eksprimiran molekul koji sadrži Fc region. Postupci za generisanje projektovanih glikoformi su poznati u struci, i uključuju ali nisu ograničeni na one opisane u Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) S.A.D. pat. br.

6,602,684; S.A.D. ser. br. 10/277,370; S.A.D. ser. br. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ tehnologija (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb™ tehnologija za projektovanje glikozilacije (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Švajcarska). Videti, npr. WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

[0172] Smatra se da Fc varijante uključuju antitela koja sadrže varijabilni region i heterodimerni Fc region, pri čemu heterodimerni Fc region sadrži modifikovani CH3 domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije za promovisanje formiranja heterodimera sa povećanom stabilnošću, pri čemu modifikovani CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) veću od 74 °C. Fc varijante koje su antitela mogu se proizvesti "de novo" kombinovanjem varijabilnog domena, njegovog fragmenta, koji se specifično vezuje za najmanje jedan antigen sa heterodimernim Fc regionom koji sadrži modifikovani CH3 domen. Alternativno, heterodimerne Fc varijante mogu se proizvesti modifikovanjem CH3 domena antitela koje se vezuje za antigen koje sadrži Fc region.

[0173] Antitela iz pronalaska mogu da uključuju ali nisu ograničena na, sintetička antitela, monoklonalna antitela, rekombinantno proizvedena antitela, intratela, monospecifična antitela, multispecifična antitela, bispecifična antitela, humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, sintetička antitela, jednolančana FvFc (scFvFc), jednolančana Fv (scFv) i anti-idiotipska (anti-Id) antitela. Posebno, antitela upotrebljena u postupcima iz predmetnog pronalaska uključuju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina. Molekuli imunoglobulina mogu biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2) ili podklase molekula imunoglobulina.

[0174] Antitela iz pronalaska mogu biti poreklom iz bilo koje životinje uključujući ptice i sisare (npr. čoveka, murina, magarca, ovcu, zeca, kozu, zamorca, kamilu, konja, ili kokošku). U specifičnom primeru izvođenja, antitela su humana ili humanizovana monoklonalna antitela, posebno bispecifična monoklonalna antitela. Kao što se ovde upotrebljava, "humana" antitela uključuju antitela koja imaju amino-kiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i uključuju antitela izolovana iz biblioteka humanih imunoglobulina ili iz miševa koji eksprimiraju antitela iz humanih gena.

[0175] Antitela kao i svi polipeptidi imaju izoelektričnu tačku (pI), koja se generalno definiše kao pH pri kojoj polipeptid nema neto naelektrisanje. U struci je poznato da je solubilnost proteina tipično najniža kada je pH rastvora jednaka izoelektričnoj tački (pI) proteina. Moguće je optimizovati solubilnost promenom broja i lokacije jonizujućih ostataka u antitelu kako bi se podesila pI. Na primer može se manipulisati sa pI polipeptida pravljenjem odgovarajućih amino-kiselinskih supstitucija (npr. supstituisanjem naelektrisane amino-kiseline kao što je lizin, za nenaelektrisani ostatak kao što je alanin). Bez želje da se vezujemo za neku posebnu teoriju, amino-kiselinske supstitucije antitela koje rezultuju promenama pI navedenog antitela mogu poboljšati solubilnost i/ili stabilnost antitela. Onaj sa iskustvom u struci bi razumeo koje bi amino-kiselinske supstitucije bile najprikladnije za određeno antitelo da postigne željenu pI. pI proteina se može odrediti različitim postupcima uključujući ali ne ograničavajući se na, izoelektrično fokusiranje i različite računarske algoritme (videti na primer Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14:1023). U jednom primeru izvođenja, pI Fc varijanti iz pronalaska je između pH 6,2 i pH 8,0. U sledećem primeru izvođenja, pI antitela iz pronalaska je između pH 6,8 i pH 7,4. U jednom primeru izvođenja, supstitucije koje rezultuju promenama pI Fc varijante iz pronalaska neće značajno umanjiti njen afinitet vezivanja za antigen. Smatra se da modifikovani CH3 domen sa povećanom stabilnošću takođe može dovesti do promene pI. U jednom primeru izvođenja, varijantni Fc heterodimeri su specifično odabrani da utiču i na povećanu stabilnost i čistoću, i bilo koju željenu promenu pI.

[0176] Antitela iz pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična, trispecifična ili imaju veću multispecifičnost. Multispecifična antitela mogu specifično da se vezuju za različite epitope željenog ciljnog molekula ili mogu specifično da se vezuju i za ciljni molekul, kao i za heterologni epitop, kao što je heterologni polipeptid ili čvrsti materijal podloge. Videti, npr. Međunarodne publikacije br. WO 94/04690; WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; i

4

WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; S.A.D. patentne br.; 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920 i 5,601,819 i Kostelny et al., 1992, J. Immunol.148:1547).

[0177] Različiti primeri izvođenja multifunkcionalnih ciljno delujućih molekula mogu se dizajnirati na osnovu ove asimetrične skele kao što je pokazano na Slici 20.

[0178] Multispecifična antitela imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita antigena. Dok će takvi molekuli normalno vezati samo dva antigena (tj. bispecifična antitela, BsAb), antitela sa dodatnim specifičnostima kao što su trispecifična antitela su obuhvaćena trenutnim pronalaskom. Primeri BsAb uključuju bez ograničenja one sa jednim krakom usmerenim prema antigenu tumorske ćelije i drugim krakom usmerenim prema citotoksičnom molekulu, ili su oba kraka usmerena prema dva različita antigena tumorske ćelije, ili su oba kraka usmerena prema dva različita solubilna liganda, ili je jedan krak usmeren prema solubilnom ligandu i drugi krak je usmeren prema receptoru ćelijske površine, ili su oba kraka usmerena prema dva različita receptora ćelijske površine. Postupci za pravljenje bispecifičnih antitela su poznati u struci.

[0179] U skladu sa drugačijim pristupom, varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (antitelo-antigen mesta kombinovanja) fuzionisani su sa sekvencama konstantnog domena imunoglobulina. Fuzija može biti sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži najmanje deo regiona zgloba, CH2 i CH3. Smatra se da je prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca prisutan u najmanje jednoj od fuzija. DNK koje kodiraju fuzije teškog lanca imunoglobulina i, ukoliko se želi, laki lanac imunoglobulina, insertuju se u odvojene ekspresione vektore, i kotransfektuju u pogodan organizam domaćin. Ovo obezbeđuje veliku fleksibilnost u prilagođavanju međusobnih proporcija tri polipeptidna fragmenta u primerima izvođenja kada nejednaki odnosi tri polipeptidna lanca upotrebljena u konstrukciji obezbeđuju optimalne prinose. Videti Primer 1 i Tabelu 2. Međutim, moguće je insertovati kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan ekspresioni vektor kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u jednakim odnosima rezultuje visokim prinosima ili kada odnosi nisu od posebnog značaja.

[0180] Bispecifična antitela uključuju umrežena ili "heterokonjugatna" antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može biti kuplovano za avidin, a drugo za biotin. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju ćelije imunskog sistema na neželjene ćelije (S.A.D. pat. br. 4,676,980) i za lečenje HIV infekcije (WO 91/00360, WO 92/200373, i EP 03089). Heterokonjugatna antitela se mogu napraviti upotrebom bilo kog pogodnog postupka umrežavanja. Pogodni agensi za umrežavanje su dobro poznati u struci, i objavljeni su u S.A.D. pat. br.4,676,980, zajedno sa brojnim tehnikama umrežavanja.

[0181] Razmatrana su antitela sa više od dve valence koja inkorporišu modifikovane CH3 domene i rezultirajuće Fc heterodimere iz pronalaska. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Videti, npr. Tutt et al. J. Immunol.147: 60 (1991).

[0182] Antitela iz predmetnog pronalaska takođe obuhvataju ona koja imaju poluživote (npr. poluživote u serumu) kod sisara (npr. čoveka) duže od 15 dana, duže od 20 dana, duže od 25 dana, duže od 30 dana, duže od 35 dana, duže od 40 dana, duže od 45 dana, duže od 2 meseca, duže od 3 meseca, duže od 4 meseca, ili duže od 5 meseci. Povećani poluživoti antitela iz predmetnog pronalaska kod sisara, (npr. čoveka), rezultuju većim serumskim titrom navedenih antitela ili fragmenata antitela kod sisara, i stoga redukuju učestalost primene navedenih antitela ili fragmenata antitela i/ili redukuju koncentraciju navedenih antitela ili fragmenata antitela koji se primenjuju. Antitela koja imaju produženi poluživot in vitro mogu se generisati tehnikama koje su poznate onima sa iskustvom u struci. Na primer, antitela sa produženim poluživotom in vivo mogu se generisati modifikovanjem (npr. supstituisanjem, delecijom ili adicijom) amino-kiselinskih ostataka identifikovanih kao uključenih u interakciju između Fc domena i FcRn receptora (videti, npr. Međunarodne publikacije br. WO 97/34631, WO 04/029207, S.A.D. pat. br. 6,737,056 i S.A.D. patentnu publikaciju br.

2003/0190311).

[0183] U specifičnom primeru izvođenja, varijantni Fc heterodimer koji sadrži modifikovani CH3 domen je multispecifično antitelo (ovde se označava kao antitelo iz pronalaska), antitelo iz pronalaska specifično vezuje antigen od interesa. Posebno antitelo iz pronalaska je bispecifično antitelo. U jednom primeru izvođenja, antitelo iz pronalaska specifično vezuje polipeptidni antigen. U sledećem primeru izvođenja, antitelo iz pronalaska specifično vezuje nepolipeptidni antigen. U još jednom primeru izvođenja, primena antitela iz pronalaska sisaru koji pati od bolesti ili poremećaja može dovesti do terapijske koristi kod tog sisara.

[0184] Praktično bilo koji molekul može biti ciljan od strane i/ili inkorporisan u varijantni Fc heterodimerni konstrukt koji je ovde obezbeđen (npr. antitela, Fc fuzioni proteini) uključujući, ali ne ograničavajući se na, sledeću listu proteina, kao i podjedinica, domena, motiva i epitopa koji pripadaju sledećoj listi proteina: renin; hormon rasta, uključujući humani hormon rasta i goveđi hormon rasta; faktor oslobađanja hormona rasta; paratiroidni hormon; tireostimulirajući hormon; lipoproteini; alfa-1-antitripsin; insulin A-lanac; insulin B-lanac; proinsulin; folikulostimulirajući hormon; kalcitonin; luteinizirajući hormon; glukagon; faktori zgrušavanja kao što su faktor VII, faktor VIIIC, faktor IX, tkivni faktor (TF), i von Vilebrandov (von Willebrands) faktor; faktori protiv zgrušavanja kao što je protein C; atrijalni natriuretički faktor; surfaktant pluća; aktivator plazminogena, kao što je urokinaza ili humani urin ili aktivator plazminogena tkivnog tipa (t-PA); bombesin; trombin; hemopoetski faktor rasta; faktor nekroze tumora -alfa i -beta; enkefalinaza; RANTES (reguliše se aktivacijom eksprimira ga i sekretuje normalna T-ćelija); humani makrofagni inflamatorni protein (MIP-1-alfa); serumski albumin kao što je humani serumski albumin; Milerijan-inhibirajuća supstanca; relaksin A-lanac; relaksin B-lanac; prorelaksin; peptid povezan sa mišjim gonadotropinom; mikrobni protein, kao što je beta-laktamaza; DNaza; IgE; antigen povezan sa citotoksičnim T-limfocitom (CTLA), kao što je CTLA-4; inhibin; aktivin; faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF); receptori za hormone ili faktore rasta kao što su, na primer, EGFR, VEGFR; interferoni kao što su alfa interferon (α-IFN), beta interferon (β-IFN) i gama interferon (γ-IFN); protein A ili D; reumatoidni faktori; neurotrofični faktor kao što je neurotrofični faktor koji je poreklom od kosti (BDNF), neurotrofin-3, -4, -5, ili -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ili NT-6), ili faktor rasta nerva; faktor rasta poreklom iz krvnih pločica (PDGF); faktor rasta fibroblasta kao što su AFGF i PFGF; epidermalni faktor rasta (EGF); transformišući faktor rasta (TGF) kao što su TGF-alfa i TGF-beta, uključujući TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, ili TGF-5; insulinu sličan faktor rasta-I i -II (IGF-I i IGF-II); des (1-3)-IGF-I (IGF-I mozga), proteini koji vezuju insulinu sličan faktor rasta; CD proteini kao što su CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD40, CD40L, CD52, CD63, CD64, CD80 i CD147; eritropoetin; osteoinduktivni faktori; imunotoksini; morfogenetski protein kostiju (BMP); interferon kao što su interferon-alfa, -beta, i -gama; faktori stimulacije kolonija (CSF), kao što su M-CSF, GM-CSF, i G-CSF; interleukini (IL), npr. IL-1 do IL-13; TNFa, superoksid dismutaza; T-ćelijski receptori; površinski proteini membrane; faktor ubrzanja raspada; virusni antigen kao što je, na primer, deo omotača AIDS, npr. gp120; transportni proteini; homing receptori; adresini; regulatorni proteini; molekuli ćelijske adhezije kao što su LFA-1, Mac 1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, ICAM-3 i VCAM, a4/p7 integrin i (Xv/p3 integrin uključujući bilo a ili njegove podjedinice, integrin alfa podjedinice kao što su CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, alfa7, alfa8, alfa9, alphaD, CD11a, CD11b, CD51, CD11c, CD41, alfaIIb, alfaIELb; integrin beta podjedinice kao što su CD29, CD18, CD61, CD104, beta5, beta6, beta7 i beta8; kombinacije integrinskih podjedinica uključujući, ali ne ograničavajući se na, αVβ3, αYβ5 i α4β7; član apoptoznog puta; IgE; antigeni krvne grupe; flk2/flt3 receptor; receptor gojaznosti (OB); mp1 receptor; CTLA-4; protein C; Eph receptor kao što su EphA2, EphA4, EphB2, itd.; humani leukocitni antigen (HLA) kao što je HLA-DR; proteini komplementa kao što su receptor komplementa CR1, C1Rq i drugi faktori komplementa kao što su C3 i C5, glikoproteinski receptor kao što su GpIbα, GPIIb/IIIa i CD200; i fragmenti bilo kog od gore nabrojanih polipeptida.

[0185] Takođe su obezbeđena antitela iz pronalaska koja specifično vezuju kancerske antigene uključujući, ali bez ograničavanja na, ALK receptor (pleiotrofin receptor), pleiotrofin, KS 1/4 pan-karcinom antigen; antigen karcinoma jajnika (CA125); kiseli fosfat prostate; specifični antigen prostate (PSA); antigen povezan sa melanomom p97; antigen melanoma gp75; antigen melanoma velike molekulske težine (HMW-MAA); membranski antigen specifičan za prostatu; karcinoembrionalni antigen (CEA); polimorfni epitelni mucin antigen; antigen globula masti humanog mleka; antigeni povezani sa kolorektalnim tumorom kao što su: CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 i LEA; antigen Burkitovog (Burkitt's) limfoma-38.13; CD19; antigen humanog B-limfoma-CD20; CD33; antigeni specifični za melanom kao što su gangliozid GD2, gangliozid GD3, gangliozid GM2 i gangliozid GM3; tumor-specifičan transplantacioni antigen ćelijske površine (TSTA); virusno indukovani tumorski antigeni uključujući T-antigen, DNK tumorskih virusa i antigene omotača RNK tumorskih virusa; onkofetalni antigen-alfa-fetoprotein kao što su CEA kolona, 5T4 onkofetalni trofoblastni glikoprotein i onkofetalni antigen tumora mokraćne bešike; antigen diferencijacije kao što su antigeni humanog karcinoma pluća L6 i L20; antigeni fibrosarkoma; antigen T ćelije humane leukemije-Gp37; neoglikoprotein; sfingolipidi; antigeni kancera dojke kao što je EGFR (receptor epidermalnog faktora rasta); NY-BR-16; NY-BR-16 i HER2 antigen (p185HER2); polimorfni epitelni mucin (PEM); maligni humani limfocitni antigen-APO-1; antigen diferencijacije kao što je I antigen pronađen u fetalnim eritrocitima; I antigen primarnog endoderma pronađen u eritrocitima odraslih; preimplantacioni embrioni; I(Ma) pronađen kod adenokarcinoma želuca; M18, M39 pronađeni kod epitela dojke; SSEA-1 pronađen u mijeloidnim ćelijama; VEP8; VEP9; Myl; Va4-D5; D156-22 pronađen kod kolorektalnog kancera; TRA-1-85 (krvna grupa H); SCP-1 pronađen kod kancera testisa i jajnika; C14 pronađen kod adenokarcinoma kolona; F3 pronađen kod adenokarcinoma pluća; AH6 pronađen kod kancera želuca; Y hapten; Lej (Lay) pronađen u ćelijama embrionalnog karcinoma; TL5 (krvna grupa A); EGF receptor pronađen u A431 ćelijama; E1serija (krvna grupa B) pronađena kod kancera pankreasa; FC10.2 pronađen u ćelijama embrionalnog karcinoma; antigen adenokarcinoma želuca; CO-514 (krvna grupa Lea) pronađen kod adenokarcinoma; NS-10 pronađen kod adenokarcinoma; CO-43 (krvna grupa Leb); G49 pronađen u EGF receptoru A431 ćelija; MH2 (krvna grupa ALeb/Ley) pronađen kod adenokarcinoma kolona; 19.9 pronađen kod kancera kolona; mucini kancera želuca; T5A7pronađen u mijeloidnim ćelijama; R24pronađen kod melanoma; 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2, i M1:22:25:8 pronađeni u ćelijama embrionalnog karcinoma i SSEA-3 i SSEA-4 pronađeni u embrionima od 4 do 8 ćelija; antigen kožnog T-ćelijskog limfoma; MART-1 antigen; Siali Tn (STn) antigen; antigen kancera kolona NY-CO-45; antigen kancera pluća NY-LU-12 valiant A; antigen adenokarcinoma ART1; antigen paraneoplastično povezanog kancera mozga-testisa (onkoneuronski antigen MA2; paraneoplastični neuronski antigen); neuro-onkološki ventralni antigen 2 (NOVA2); antigen gena 520 hepatocelularnog karcinoma; TUMOR-PRIDRUŽENI ANTIGEN CO-029; tumorpridruženi antigeni MAGE-C1 (kancer/testis antigen CT7), MAGE-B1 (MAGE-XP antigen), MAGE-B2 (DAM6), MAGE-2, MAGE-4-a, MAGE-4-b i MAGE-X2; antigen kancera testisa (NY-EOS-1) i fragmenti bilo kog od prethodno nabrojanih polipeptida.

[0186] U određenim primerima izvođenja, heteromultimer koji je ovde opisan, sadrži najmanje jedno terapijsko antitelo. U nekim primerima izvođenja, terapijsko antitelo vezuje ciljni kancerski antigen. U primeru izvođenja, terapijsko antitelo može biti jedno od izabrano iz grupe koja se sastoji od abagovomaba, adalimumaba, alemtuzumaba, aurograba, bapineuzumaba, baziliksimaba, belimumaba, bevacizumaba, briakinumaba, kanakinumaba, katumaksomaba, certolizumab pegola, cetuksimaba, daklizumaba, denozumaba, efalizumaba, galiksimaba, gemtuzumab ozogamicina, golimumaba, ibritumomab tiuksetana, infliksimaba, ipilimumaba, lumiliksimaba, mepolizumaba, motavizumaba, muromonaba, mikograba, natalizumaba, nimotuzumaba, okrelizumaba, ofatumumaba, omalizumaba, palivizumaba, panitumumaba, pertuzumaba, ranibizumaba, reslizumaba, rituksimaba, teplizumaba, tocilizumaba/atlizumaba, tozitumomaba, trastuzumaba, ProxiniumTM, RencarexTM, ustekinumaba, i zalutumumaba, i bilo kojih drugih antitela.

[0187] Antitela iz pronalaska uključuju derivate koji su modifikovani (tj. pomoću kovalentnog prikačinjanja bilo kog tipa molekula za antitelo tako što je kovalentno prikačeno). Na primer, ali ne kao ograničenje, derivati antitela uključuju antitela koja su modifikovana, npr. pomoću glikozilacije, acetilacije, pegilacije, fosforilacije, amidacije, derivatizacije poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim isecanjem, vezivanjem za ćelijski ligand ili druge proteine, itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može se izvesti poznatim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, specifično hemijsko isecanje, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd. Pored toga, derivat može sadržati jednu ili više ne-klasičnih amino-kiselina.

[0188] Antitela ili njihovi fragmenti sa produženim poluživotima in vivo mogu se generisati prikačinjanjem molekula polimera kao što je polietilenglikol (PEG) velike molekulske težine za antitela ili fragmente antitela. PEG se može prikačiti za antitela ili fragmente antitela sa ili bez multifunkcionalnog linkera ili preko konjugacije PEG specifične za mesto za N- ili C-terminus navedenih antitela ili fragmenata antitela ili putem epsilon-amino grupa prisutnih na lizinskim ostacima. Upotrebljavaće se linearna ili razgranata derivatizacija polimera koja rezultuje minimalnim gubitkom biološke aktivnosti. Stepen konjugacije će se pažljivo pratiti pomoću SDS-PAGE i masene spektrometrije kako bi se osigurala pravilna konjugacija PEG molekula za antitela. Nereagovani PEG se može odvojiti od antitelo-PEG konjugata, na primer, ekskluzionom ili jonoizmenjivačkom hromatografijom.

[0189] Dodatno, antitela se mogu konjugovati za albumin kako bi se antitelo ili fragment antitela učinili stabilnijim in vivo ili imali duži poluživot in vivo. Tehnike su dobro poznate u struci, videti npr. Međunarodne publikacije br. WO 93/15199, WO 93/15200, i WO 01/77137; i Evropski patent br. EP 413,622. Predmetni pronalazak obuhvata upotrebu antitela ili njihovih fragmenata konjugovanih ili fuzionisanih sa jednim ili više delova, uključujući ali ne ograničavajući se na, peptide, polipeptide, proteine, fuzione proteine, molekule nukleinske kiseline, male molekule, mimetičke agense, sintetičke lekove, neorganske molekule, i organske molekule.

[0190] Predmetni pronalazak obuhvata upotrebu antitela ili njihovih fragmenata rekombinantno fuzionisanih ili hemijski konjugovanih (uključujući i kovalentne i nekovalentne konjugacije) za heterologni protein ili polipeptid (ili njihov fragment, na primer, za polipeptid od najmanje 10, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90 ili najmanje 100 amino-kiselina) za generisanje fuzionih proteina. Fuzija ne mora nužno biti direktna, ali se može desiti preko linker sekvenci. Na primer, antitela se mogu upotrebljavati za ciljanje heterolognih polipeptida na određene tipove ćelija, bilo in vitro ili in vivo, fuzionisanjem ili konjugacijom antitela za antitela specifična za određene receptore ćelijske površine. Antitela fuzionisana ili konjugovana za heterologne polipeptide mogu se takođe upotrebljavati u in vitro imunotestovima i postupcima prečišćavanja upotrebom postupaka poznatih u struci. Videti npr. Međunarodnu publikaciju br. WO 93/21232; Evropski patent br. EP 439,095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett.

39:91-99; S.A.D. pat. br. 5,474,981; Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432; i Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452.

[0191] Predmetni pronalazak dodatno uključuje kompozicije koje sadrže heterologne proteine, peptide ili polipeptide fuzionisane ili konjugovane za fragmente antitela. Na primer, heterologni polipeptidi mogu biti fuzionisani ili konjugovani za Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment, F(ab)2fragment, VH domen, VL domen, VH CDR, VL CDR, ili njihov fragment. Postupci za fuzionisanje ili konjugaciju polipeptida za delove antitela su dobro poznati u struci. Videti, npr. S.A.D. patente br. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851 i 5,112,946; Evropske patente br. EP 307,434 i EP 367,166; Međunarodne publikacije br. WO 96/04388 i WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; i Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341.

[0192] Dodatni fuzioni proteini, npr. antitela koja specifično vezuju antigen (npr. supra), mogu se generisati putem tehnika mešanja gena, mešanja motiva, mešanja egzona, i/ili mešanja kodona (zajedno označeno kao "mešanje DNK"). Mešanje DNK se može koristiti da se izmeni aktivnost antitela iz pronalaska ili njihovih fragmenata (npr. antitela ili njihovih fragmenata sa višim afinitetima i nižim stopama disocijacije). Videti, generalno, S.A.D. patente br.5,605,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252 i 5,837,458, i Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol.16(2): 76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; i Lorenco i Blasko, 1998, Biotechniques 24(2): 308-313. Antitela ili njihovi fragmenti, ili kodirana antitela ili njihovi fragmenti, mogu biti izmenjeni podvrgavanjem nasumičnoj mutagenezi greškama-sklonom PCR, nasumičnom insercijom nukleotida ili drugim postupcima pre rekombinacije. Jedan ili više delova polinukleotida koji kodira antitelo ili fragment antitela, koji se delovi specifično vezuju za antigen mogu biti rekombinovani sa jednom ili više komponenti, motiva, sekcija, delova, domena, fragmenata, itd. jednog ili više heterolognih molekula.

[0193] Predmetni pronalazak dodatno obuhvata upotrebu varijantnih Fc heterodimera ili njihovih fragmenata konjugovanih za terapijski agens.

[0194] Antitelo ili njegov fragment mogu biti konjugovani za terapijsku grupu kao što je citotoksin, npr. citostatik ili citocidni agens, terapijski agens ili jon radioaktivnog metala, npr. alfa-emitere. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primeri uključuju ribonukleazu, monometilauristatin E i F, paklitaksel, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, puromicin, epirubicin, i ciklofosfamid i njihove analoge ili homologe. Terapijski agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), agense za alkilovanje (npr. mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BCNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cisdihlorodiamin platina (II) (DDP)

1

cisplatin), antracikline (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), i antimitotičke agense (npr. vinkristin i vinblastin). Opsežnija lista terapijskih grupa može se pronaći u PCT publikacijama WO 03/075957.

[0195] Dodatno, antitelo ili njegov fragment mogu biti konjugovani za terapijski agens ili grupu leka koja modifikuje dati biološki odgovor. Terapijski agensi ili grupe leka ne treba da se tumače kao ograničeni na klasične hemijske terapijske agense. Na primer, grupa leka može biti protein ili polipeptid koji poseduje željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu uključivati, na primer, toksin kao što je abrin, ricin A, onkonazu (ili drugu citotoksičnu RNAzu), egzotoksin pseudomonasa, toksin kolere, ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora, α-interferon, β-interferon, faktor rasta nerva, faktor rasta poreklom iz krvnih pločica, tkivni aktivator plazminogena, apoptotski agens, npr. TNF-α, TNF-β, AIM I (videti Međunarodnu publikaciju br. WO 97/33899), AIM II (videti Međunarodnu publikaciju br. WO 97/34911), Fas ligand (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567) i VEGI (videti Međunarodnu publikaciju br. WO 99/23105), trombotički agens ili antiangiogeni agens, npr. angiostatin ili endostatin; ili, modifikator biološkog odgovora kao što je, na primer, limfokin (npr. interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije kolonije granulocita i makrofaga ("GM-CSF"), i faktor stimulacije kolonije granulocita ("G-CSF")), ili faktor rasta (npr. hormon rasta ("GH")).

[0196] Štaviše, antitelo može biti konjugovano za terapijske grupe kao što su radioaktivni materijali ili makrociklični helatori korisni za konjugovanje radiometalnih jona (videti iznad za primere radioaktivnih materijala). U određenim primerima izvođenja, makrociklični helator je 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-N,N',N",N"-tetrasirćetna kiselina (DOTA) koja se može prikačiti za antitelo putem linker molekula. Takvi linker molekuli su opšte poznati u struci i opisani u Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; i Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol.26:943.

[0197] Postupci za fuzionisanje ili konjugovanje antitela za polipeptidne grupe su poznati u struci. Videti, npr. S.A.D. patente br.5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851 i 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; PCT publikacije WO 96/04388 i WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng et al., 1995, J Immunol 154:5590; i Vil et al., 1992, PNAS USA 89:11337. Fuzija antitela za grupu ne mora nužno da bude direktna, već se može desiti preko linker sekvenci. Takvi linker molekuli su opšte poznati u struci i opisani u Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug

2

Chem 10:553; Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26:943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171.

[0198] Rekombinantna ekspresija Fc varijante, derivata, analoga ili njihovog fragmenta, (npr. antitela ili fuzionog proteina iz pronalaska), zahteva konstrukciju ekspresionog vektora koji sadrži polinukleotid koji kodira Fc varijantu (npr. antitelo ili fuzioni protein). Jednom kada se dobije polinukleotid koji kodira Fc varijantu (npr. antitelo ili fuzioni protein), vektor za proizvodnju Fc varijante (npr. antitela ili fuzionog proteina) može se proizvesti tehnologijom rekombinantne DNK upotrebom tehnika dobro poznatih u struci. Stoga, ovde su opisani postupci za pripremu proteina ekspresijom polinukleotida koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira Fc varijantu (npr. antitelo ili fuzioni protein). Postupci koji su dobro poznati onima sa iskustvom u struci mogu se upotrebljavati za konstruisanje ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuće sekvence Fc varijante (npr. antitela ili fuzionog proteina) i odgovarajuće transkripcione i translacione kontrolne signale. Ovi postupci uključuju, na primer, in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike, i in vivo genetičku rekombinaciju. Pronalazak, stoga, obezbeđuje vektore koji se mogu replicirati koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira Fc varijantu iz pronalaska, operativno povezanu sa promotorom. Takvi vektori mogu uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region molekula antitela (videti, npr. Međunarodnu publikaciju br. WO 86/05807; Međunarodnu publikaciju br. WO 89/01036; i S.A.D. pat. br. 5,122,464 i varijabilni domen antitela, ili polipeptid za generisanje Fc varijante može da se klonira u takav vektor za ekspresiju lanca antitela pune dužine (npr. teškog ili lakog lanca), ili kompletna Fc varijanta koja sadrži fuziju polipeptida koji nije poreklom od antitela i Fc regiona koji inkorporiše barem modifikovani CH3 domen.

[0199] Ekspresioni vektor se prenosi u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama i transfektovane ćelije se zatim kultivišu konvencionalnim tehnikama kako bi se proizvela Fc varijanta iz pronalaska. Stoga, pronalazak uključuje ćelije domaćina koje sadrže polinukleotid koji kodira Fc varijantu iz pronalaska, operativno povezan sa heterolognim promotorom. U specifičnim primerima izvođenja za ekspresiju Fc varijanti koje sadrže dvolančana antitela, vektori koji kodiraju i teške i lake lance mogu biti koeksprimirani u ćeliji domaćinu za ekspresiju celog molekula imunoglobulina, kao što je detaljno opisano u nastavku.

[0200] Različiti domaćin-ekspresioni vektorski sistemi mogu se koristiti za ekspresiju Fc varijanti iz pronalaska (npr. molekula antitela ili fuzionog proteina) (videti, npr. S.A.D. pat. br. 5,807,715). Takvi domaćin-ekspresioni sistemi predstavljaju vehikulume pomoću kojih kodirajuće sekvence od interesa mogu biti proizvedene i naknadno prečišćene, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu, kada se transformišu ili transfektuju sa odgovarajućim nukleotidnim kodirajućim sekvencama, da eksprimiraju Fc varijantu iz pronalaska in situ. Ovo uključuje, ali nije ograničeno na, mikroorganizme kao što su bakterije (npr. E. coli i B. subtilis) transformisane sa rekombinantnom bakteriofagnim DNK, plazmidnim DNK ili kozmidnim DNK ekspresionim vektorima koji sadrže kodirajuće sekvence Fc varijante; kvasac (npr. Saccharomyces Pichia) transformisan sa rekombinantnim ekspresionim vektorima kvasca koji sadrže kodirajuće sekvence Fc varijante; ćelijski sistemi insekata inficirani rekombinantnim ekspresionim vektorima virusa (npr. bakulovirus) koji sadrže kodirajuće sekvence Fc varijante; sistemi biljnih ćelija inficirani rekombinantnim ekspresionim vektorima virusa (npr. virus mozaika karfiola, CaMV; virus mozaika duvana, TMV) ili transformisani sa ekspresionim vektorima rekombinantnog plazmida (npr. Ti plazmid) koji sadrže kodirajuće sekvence Fc varijante; ili sistemi ćelija sisara (npr. COS, CHO, BHK, 293, NS0, i 3T3 ćelije) koji nose rekombinantne ekspresione konstrukte koji sadrže promotore poreklom iz genoma ćelija sisara (npr. promotor metalotioneina) ili iz virusa sisara (npr. adenovirusni kasni promotor; promotor Vaccinia virusa 7,5K). U određenim primerima izvođenja, bakterijske ćelije kao što je Escherichia coli, ili eukariotske ćelije, upotrebljavaju se za ekspresiju Fc varijante, koja je rekombinantno antitelo ili molekuli fuzionog proteina. Na primer, ćelije sisara kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), u kombinaciji sa vektorom kao što je glavni intermedijarni rani genski promotorski element iz humanog citomegalovirusa je efikasan ekspresioni sistem za antitela (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101 i Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). U specifičnom primeru izvođenja, ekspresija nukleotidnih sekvenci koje kodiraju Fc varijantu iz pronalaska (npr. antitelo ili fuzioni protein) regulisana je konstitutivnim promotorom, inducibilnim promotorom ili tkivno specifičnim promotorom.

[0201] U bakterijskim sistemima, veliki broj ekspresionih vektora može biti povoljno odabran u zavisnosti od upotrebe namenjene Fc varijante (npr. antitelo ili fuzioni protein) koja se eksprimira. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina takvog proteina, za generisanje farmaceutskih kompozicija Fc varijante, mogu biti poželjni vektori koji usmeravaju ekspresiju visokih nivoa fuzionih proteinskih proizvoda koji se lako prečišćavaju. Takvi vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, ekspresioni vektor E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), u kome kodirajuća sekvenca Fc varijante može biti ligirana pojedinačno u vektor u okviru sa lac Z kodirajućim regionom tako da se proizvodi lac Z-fuzioni protein; pIN vektori (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res.13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); i slično. pGEX vektori se takođe mogu upotrebljavati za ekspresiju stranih polipeptida kao fuzionih proteina sa glutation 5-

4

transferazom (GST). Generalno, takvi fuzioni proteini su solubilni i lako se mogu prečistiti iz liziranih ćelija adsorpcijom i vezivanjem za matriks glutation agaroznih perlica, nakon čega sledi eluiranje u prisustvu slobodnog glutationa. pGEX vektori su dizajnirani da uključuju mesta isecanja trombin ili faktor Xa proteaze tako da se klonirani ciljni genski proizvod može osloboditi od GST grupe.

[0202] U insekatskom sistemu Autographa californica virus nukleusne poliedroze (AcNPV) upotrebljava se kao vektor za ekspresiju stranih gena. Virus raste u Spodoptera frugiperda ćelijama. Kodirajuća sekvenca Fc varijante (npr. antitela ili fuzionog proteina) može biti klonirana pojedinačno u neesencijalne regione (na primer gen poliedrina) virusa i stavljena pod kontrolu AcNPV promotora (na primer, promotor poliedrina).

[0203] U sisarskim ćelijama domaćina mogu se koristiti brojni ekspresioni sistemi zasnovani na virusima. U slučajevima gde se adenovirus upotrebljava kao ekspresioni vektor, kodirajuća sekvenca Fc varijante (npr. antitela ili fuzionog proteina) od interesa može biti ligirana za kompleks za kontrolu transkripcije/translacije adenovirusa, npr. kasni promotor i tripartitnu lider sekvencu. Ovaj himerni gen se zatim može insertovati u genom adenovirusa in vitro ili in vivo rekombinacijom. Insercija u neesencijalni region virusnog genoma (npr. region E1 ili E3) rezultovaće rekombinantnim virusom koji je vijabilan i sposoban da eksprimira Fc varijantu (npr. antitelo ili fuzioni protein) kod inficiranih domaćina (npr. videti Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359). Specifični inicijacioni signali mogu takođe biti potrebni za efikasnu translaciju insertovanih kodirajućih sekvenci antitela. Ovi signali uključuju ATG inicijacioni kodon i susedne sekvence. Štaviše, inicijacioni kodon mora biti u fazi sa okvirom čitanja željene kodirajuće sekvence kako bi se osigurala translacija celog inserta. Ovi egzogeni translacioni kontrolni signali i inicijacioni kodoni mogu biti različitog porekla, i prirodni i sintetički. Efikasnost ekspresije može biti poboljšana uključivanjem odgovarajućih elemenata pojačivača transkripcije, terminatora transkripcije, itd. (videti, npr. Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol.153:516-544).

[0204] Ekspresija Fc varijante (npr. antitela ili fuzionog proteina) može biti kontrolisana bilo kojim promotorom ili elementom pojačivačem koji je poznat u struci. Promotori koji se mogu upotrebljavati za kontrolu ekspresije gena koji kodira Fc varijantu (npr. antitelo ili fuzioni protein) uključuju, ali nisu ograničeni na, SV40 rani promotorski region (Bernoist i Chambon, 1981, Nature 290:304-310), promotor sadržan u 3' dugom terminusnom ponovku Rous sarkoma virusa (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), promotor timidin kinaze herpesa (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), regulatorne sekvence gena metalotioneina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), promotor tetraciklina (Tet) (Gossen et al., 1995, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547-5551); prokariotske ekspresione vektore kao što su promotor β-laktamaze (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731), ili tac promotor (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl Acad. Sci. USA 80:21-25; videti takođe "Korisni proteini iz rekombinantnih bakterija" u Scientific American, 1980, 242:74-94); ekspresione vektore biljaka koji sadrže region promotora nopalin sintetaze (Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213) ili promotor 35S RNK virusa mozaika karfiola (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), i promotor fotosintetičkog enzima ribuloza bifosfat karboksilaze (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); promotorske elemente iz kvasca ili drugih gljivica kao što su promotor Gal 4, promotor ADC (alkohol dehidrogenaze), promotor PGK (fosfoglicerol kinaza), promotor alkalne fosfataze, i sledeće životinjske regione za kontrolu transkripcije, koji pokazuju tkivnu specifičnost i koji su korišćeni u transgenim životinjama: kontrolni region gena elastaze I koji je aktivan u acinusnim ćelijama pankreasa (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); kontrolni region gena za insulin koji je aktivan u beta ćelijama pankreasa (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), kontrolni region gena imunoglobulina koji je aktivan u limfoidnim ćelijama (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), kontrolni region virusa tumora dojke kod miša koji je aktivan u ćelijama testisa, dojke, limfoidnim ćelijama i mastocitima (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), kontrolni region gena albumina koji je aktivan u jetri (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel.1:268-276), kontrolni region gena alfa-fetoproteina koji je aktivan u jetri (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58; kontrolni region alfa 1-antitripsin gena koji je aktivan u jetri (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), kontrolni region gena beta-globina koji je aktivan u mijeloidnim ćelijama (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94; kontrolni region gena mijelin baznog proteina koji je aktivan u ćelijama oligodendrocitima u mozgu (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); kontrolni region gena lakog lanca-2 miozina koji je aktivan u skeletnim mišićima (Sani, 1985, Nature 314:283-286); neuronsko-specifična enolaza (NSE) koja je aktivna u neuronskim ćelijama (Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80:571-83); kontrolni region gena neurotrofičnog faktora poreklom iz mozga (BDNF) koji je aktivan u neuronskim ćelijama (Tabuchi et al., 1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253:818-823); promotor glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP) koji je aktivan u astrocitima (Gomes et al., 1999, Braz J Med Biol Res 32(5): 619-631; Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80:571-83) i kontrolni region gena gonadotropnog oslobađajućeg hormona koji je aktivan u hipotalamusu (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

[0205] Ekspresioni vektori koji sadrže inserte gena koji kodiraju Fc varijantu iz pronalaska (npr. antitelo ili fuzioni protein) mogu se identifikovati pomoću tri opšta pristupa: (a) hibridizacija nukleinske kiseline, (b) prisustvo ili odsustvo funkcija "marker" gena, i (c) ekspresija insertovanih sekvenci. U prvom pristupu, prisustvo gena koji kodira peptid, polipeptid, protein ili fuzioni protein u ekspresionom vektoru može se detektovati hibridizacijom nukleinske kiseline upotrebom proba koje sadrže sekvence koje su homologne sa insertovanim genom koji kodira peptid, polipeptid, protein ili fuzioni protein, respektivno. U drugom pristupu, rekombinantni vektor/domaćin sistem može se identifikovati i odabrati na osnovu prisustva ili odsustva određenih funkcija "marker" gena (npr. aktivnost timidin kinaze, rezistencija na antibiotike, transformacioni fenotip, formiranje okluzivnog tela u bakulovirusu, itd.) uzrokovanih insertovanjem nukleotidne sekvence koja kodira antitelo ili fuzioni protein u vektoru. Na primer, ukoliko je nukleotidna sekvenca koja kodira Fc varijantu (npr. antitelo ili fuzioni protein) insertovana unutar sekvence marker gena vektora, rekombinanti koji sadrže gen koji kodira insert antitela ili fuzionog proteina mogu se identifikovati po odsustvu funkcija marker gena. U trećem pristupu, rekombinantni ekspresioni vektori mogu se identifikovati testiranjem genskog proizvoda (npr. antitela ili fuzionog proteina) eksprimiranog rekombinantom. Takvi testovi mogu biti zasnovani, na primer, na fizičkim ili funkcionalnim svojstvima fuzionog proteina u in vitro test sistemima, npr. vezivanje sa antibioaktivni molekul antitela.

[0206] Pored toga, može biti odabran soj ćelije domaćina koji modulira ekspresiju insertovanih sekvenci, ili modifikuje i obrađuje genski proizvod na specifičan željeni način. Ekspresija iz određenih promotora može biti povišena u prisustvu određenih inducera; stoga, ekspresija genetički projektovanog fuzionog proteina može da se kontroliše. Štaviše, različite ćelije domaćini imaju karakteristične i specifične mehanizme za translacionu i posttranslacionu obradu i modifikaciju (npr. glikozilacija, fosforilacija proteina). Odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćini mogu se odabrati kako bi se obezbedila željena modifikacija i obrada eksprimiranog stranog proteina. Na primer, ekspresija u bakterijskom sistemu će proizvesti neglikozilovani proizvod i ekspresija u kvascu će proizvesti glikozilovani proizvod. Mogu se upotrebljavati eukariotske ćelije domaćini koje poseduju ćelijsku mašineriju za pravilnu obradu primarnog transkripta (npr. glikozilacija i fosforilacija) genskog proizvoda. Takve sisarske ćelije domaćini uključuju, ali nisu ograničene na, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, NS0, i posebno, neuronske ćelijske linije kao što su, na primer, SK-N-AS, SK-N-FI, SK-N-DZ humani neuroblastomi (Sugimoto et al., 1984, J. Natl. Cancer Inst. 73: 51-57), SK-N-SH humani neuroblastom (Biochim. Biophys. Acta, 1982, 704: 450-460), Daoy humani cerebelarni meduloblastom (He et al., 1992, Cancer Res. 52: 1144-1148) DBTRG-05MG ćelije glioblastoma (Kruse et al., 1992, In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A: 609-614), IMR-32 humani neuroblastom (Cancer Res., 1970, 30: 2110-2118), 1321N1 humani astrocitom (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 4816). MOG-G-CCM humani astrocitom (Br. J. Cancer, 1984, 49: 269), U87MG humani glioblastom-astrocitom (Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1968, 74: 465-486), A172 humani glioblastom (Olopade et al., 1992, Cancer Res.52: 2523-2529), C6 ćelije glioma pacova (Benda et al., 1968, Science 161: 370-371), Neuro-2a mišji neuroblastom (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1970, 65: 129-136), NB41A3 mišji neuroblastom (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1962, 48: 1184-1190), SCP ovčiji horoidni pleksus (Bolin et al., 1994, J. Virol. Methods 48: 211-221), G355-5, PG-4 mačji normalni astrocit (Haapala et al., 1985, J. Virol. 53: 827-833), Mpf mozga feretke (Trowbridge et al., 1982, In Vitro 18: 952-960), i normalne ćelijske linije kao što je, na primer, CTX TNA2 normalnog korteksa mozga pacova (Radany et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6467-6471) kao što su, na primer, CRL7030 i Hs578Bst. Štaviše, različiti ekspresioni sistemi vektor/domaćin mogu uticati na reakcije obrade u različitoj meri.

[0207] Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina sa visokim prinosom, često je poželjna stabilna ekspresija. Na primer, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju Fc varijantu iz pronalaska (npr. antitelo ili fuzioni protein) mogu biti projektovane. Umesto da upotrebljavaju ekspresione vektore koji sadrže virusne oridžine replikacije, ćelije domaćini mogu da se transformišu sa DNK kontrolisanom odgovarajućim ekspresionim kontrolnim elementima (npr. promotor, pojačivač, sekvence, terminatori transkripcije, mesta poliadenilacije, itd.), i selektabilnim markerom. Nakon introdukcije strane DNK, projektovanim ćelijama se može omogućiti da rastu tokom 1-2 dana u obogaćenom medijumu, i zatim se prebacuju na selektivni medijum. Selektabilni marker u rekombinantnom plazmidu daje rezistenciju prema selekciji i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u svoje hromozome i rastu da formiraju fokuse koji se zauzvrat mogu klonirati i proširiti u ćelijskim linijama. Ovaj postupak može povoljno da se upotrebljava za projektovanje ćelijskih linija koje eksprimiraju Fc varijantu koja se specifično vezuje za antigen. Takve projektovane ćelijske linije mogu biti posebno korisne u pregledu i proceni jedinjenja koja utiču na aktivnost Fc varijante (npr. polipeptida ili fuzionog proteina) koja se specifično vezuje za antigen.

[0208] Brojni sistemi selekcije, uključujući, ali ne ograničavajući se na gene timidin kinaze herpes simplex virusa (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaze (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), i adenin fosforiboziltransferaze (Lowy et al., 1980, Cell 22:817) mogu se koristiti u tk-, hgprtili aprt-ćelijama, respektivno. Takođe, rezistencija na antimetabolit može se upotrebljavati kao osnova za selekciju za gene dhfr, koji daje rezistenciju na metotreksat (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, koji daje rezistenciju na mikofenolnu kiselinu (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, koji daje rezistenciju na aminoglikozid G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol.150:1); i higro, koji daje rezistenciju na higromicin (Santerre et al., 1984, Gene 30:147).

[0209] Jednom kada je Fc varijanta (npr. antitelo ili fuzioni protein) iz pronalaska proizvedena pomoću rekombinantne ekspresije, može se prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u struci za prečišćavanje proteina, na primer, hromatografijom (npr. jonoizmenjivačka, afinitetna, posebno afinitetna za specifičan antigen posle proteina A, i hromatografija na koloni za određivanje veličine), centrifugiranje, diferencijalna solubilnost, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina.

[0210] Fc varijanta se generalno izdvaja iz medijuma za kulturu kao sekretovani polipeptid, iako se takođe može izdvojiti iz lizata ćelije domaćina kada se direktno proizvodi bez sekretornog signala. Ukoliko je Fc varijanta vezana za membranu, može se osloboditi sa membrane upotrebom pogodnog rastvora deterdženta (npr. Triton-X 100).

[0211] Kada se Fc varijanta proizvodi u rekombinantnoj ćeliji koja nije humanog porekla, ona je potpuno bez proteina ili polipeptida humanog porekla. Međutim, neophodno je prečistiti Fc varijantu od rekombinantnih ćelijskih proteina ili polipeptida kako bi se dobili preparati koji su suštinski homogeni što se tiče Fc varijante. Kao prvi korak, medijum za kulturu ili lizat se normalno centrifugiraju kako bi se uklonili čestični ćelijski ostaci.

[0212] Fc heterodimeri koji imaju konstantne domene antitela mogu se pogodno prečistiti pomoću hidroksilapatitne hromatografije, gel elektroforeze, dijalize, ili afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja. Druge tehnike za prečišćavanje proteina kao što su frakcionisanje na jonoizmenjivačkoj koloni, precipitacija etanolom, HPLC na reverznim fazama, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparin sefarozi, hromatografija na smoli za anjonsku ili katjonsku izmenu (kao što je kolona poliasparaginske kiseline), hromatofokusiranje, SDS-PAGE, i precipitacija amonijum sulfatom su takođe dostupne u zavisnosti od polipeptida koji treba da se izdvoji.

Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa Fc domena imunoglobulina koji se upotrebljava. Protein A se može upotrebljavati za prečišćavanje Fc regiona imunoglobulina koji su zasnovani na humanim γ1, γ2, ili γ4 teškim lancima (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Protein G se preporučuje za sve mišje izotipove i za humani γ3 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). Matriks za koji je afinitetni ligand prikačen najčešće je agaroza, ali su dostupni i drugi matriksi. Mehanički stabilni matriksi kao što su staklo sa kontrolisanim porama ili poli(stirendivinil)benzen omogućavaju brže stope protoka i kraća vremena obrade nego što se može postići sa agarozom. Uslovi za vezivanje imunoadhezina za protein A ili G afinitetnu kolonu u potpunosti su diktirani karakteristikama Fc domena; odnosno njegove vrste i izotipa. Generalno, kada se izabere odgovarajući ligand, efikasno vezivanje se dešava direktno iz nekondicionirane tečnosti kulture. Vezani varijantni Fc heterodimeri mogu se efikasno eluirati bilo na kiselom pH (na ili iznad 3,0), ili u puferu sa neutralnom pH koji sadrži blago haotropnu so. Ovaj korak afinitetne hromatografije može rezultovati preparatom varijantnog Fc heterodimera koji je >95% čist.

[0213] Nivoi ekspresije Fc varijante (npr. antitela ili fuzionog proteina) mogu se povećati pomoću vektorske amplifikacije (za pregledni prikaz, videti Bebbington i Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)). Na primer, kada se marker u vektorskom sistemu koji eksprimira antitelo ili fuzioni protein može amplifikovati, povećanje nivoa inhibitora prisutnog u kulturi ćelije domaćina će povećati broj kopija marker gena. Pošto je amplifikovani region povezan sa genom antitela, proizvodnja antitela ili fuzionog proteina će se takođe povećati (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol.3:257).

[0214] Ćelija domaćin može biti kotransfektovana sa dva ekspresiona vektora iz pronalaska. Na primer, prvi vektor koji kodira polipeptid poreklom iz teškog lanca i drugi vektor koji kodira polipeptid poreklom iz lakog lanca. Dva vektora mogu da sadrže identične selektabilne markere, koji omogućavaju jednaku ekspresiju polipeptida teškog i lakog lanca. Alternativno, može se upotrebljavati jedan vektor koji kodira, i može da eksprimira, fuzioni protein ili polipeptide i teškog i lakog lanca. Kodirajuće sekvence za fuzioni protein ili teške i lake lance mogu da sadrže cDNA ili genomsku DNK.

Karakterizacija i funkcionalni testovi

1

[0215] Fc varijante (npr. antitela ili fuzioni proteini) iz predmetnog pronalaska mogu se okarakterisati na različite načine. U jednom primeru izvođenja, čistoća varijantnih Fc heterodimera procenjuje se upotrebom tehnika dobro poznatih u struci uključujući, ali ne ograničavajući se na, SDS-PAGE gelove, Western blotove, denzitometriju ili masenu spektrometriju. Stabilnost proteina se može okarakterisati upotrebom niza tehnika, ne ograničavajući se na, ekskluzionu hromatografiju, UV vidljivu i CD spektroskopiju, masenu spektroskopiju, diferencijalno rasipanje svetlosti, test stabilnosti na radnoj ploči, zamrzavanje odmrzavanje u kombinaciji sa drugim tehnikama karakterizacije, diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju, diferencijalnu skenirajuću fluorimetriju, hromatorografiju hidrofobne interakcije, izoelektrično fokusiranje, testove vezivanja receptora ili relativne nivoe ekspresije proteina. U primernom primeru izvođenja, stabilnost varijantnih Fc heterodimera procenjuje se temperaturom topljenja modifikovanog CH3 domena, u poređenju sa CH3 domenom divljeg tipa, upotrebom tehnika dobro poznatih u struci kao što je diferencijalna skenirajuća kalorimetrija ili diferencijalna skenirajuća fluorometrija.

[0216] Fc varijante iz predmetnog pronalaska se takođe mogu testirati na sposobnost da se specifično vežu za ligand, (npr. FcγRIIIA, FcγRIIB, C1q). Takav test se može izvesti u rastvoru (npr. Houghten, Bio/Techniques, 13:412-421, 1992), na perlama (Lam, Nature, 354:82-84, 1991, na čipovima (Fodor, Nature, 364: 555-556, 1993), na bakterijama (S.A.D. pat. br. 5,223,409) na plazmidima (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869, 1992) ili na fagu (Scott i Smith, Science, 249:386-390, 1990; Devlin, Science, 249:404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382, 1990; i Felici, J. Mol. Biol., 222:301-310, 1991). Molekuli za koje je identifikovano da se specifično vezuju za ligand (npr. FcγRIIIA, FcγRIIB, C1q ili za antigen) mogu se zatim testirati na njihov afinitet za ligand.

[0217] Fc varijante iz pronalaska mogu se testirati na specifično vezivanje za molekul kao što je antigen (npr. kancerski antigen i unakrsna reaktivnost sa drugim antigenima) ili ligand (npr. FcγR) bilo kojim postupkom poznatim u struci. Imunotestovi koji se mogu upotrebljavati za analizu specifičnog vezivanja i unakrsne reaktivnosti uključuju, ali nisu ograničeni na, sisteme kompetitivnih i nekompetitivnih testova koji upotrebljavaju tehnike kao što su Western blotovi, radioimunotestovi, ELISA (enzimski imunosorbent test), "sendvič" imunotestovi, testovi imunoprecipitacije, precipitinske reakcije, precipitinske reakcije difuzije na gelu, testovi imunodifuzije, testovi aglutinacije, testovi fiksacije komplementa, imunoradiometrijski testovi, fluorescentni imunotestovi, protein A imunotestovi, da spomenemo samo neke. Takvi

1 1

testovi su rutinski i dobro poznati u struci (videti, npr. Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons, Inc., New York).

[0218] Afinitet vezivanja Fc varijanti iz predmetnog pronalaska za molekul kao što je antigen ili ligand, (npr. FcγR) i stopa disocijacije interakcije može se odrediti testovima kompetitivnog vezivanja. Jedan primer testa kompetitivnog vezivanja je radioimunotest koji sadrži inkubaciju obeleženog liganda, kao što je FcγR (npr. 3H ili 125I sa molekulom od interesa (npr. Fc varijantama iz predmetnog pronalaska) u prisustvu rastućih količina neobeleženog liganda, kao što je FcγR, i detekciju molekula vezanog za obeleženi ligand. Afinitet molekula iz predmetnog pronalaska za ligand i stope disocijacije vezivanja mogu se odrediti iz podataka o zasićenju pomoću Scatchard-ove analize.

[0219] Kinetički parametri Fc varijante se takođe mogu odrediti upotrebom bilo kog testa zasnovanog na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR) koji su poznati u struci (npr. BIAcore kinetička analiza). Za pregledni prikaz tehnologije zasnovane na SPR videti Mullet et al., 2000, Methods 22: 77-91; Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61. Dodatno, bilo koji od SPR instrumenata i postupaka zasnovanih na SPR za merenje protein-protein interakcija opisanih u S.A.D. patentima br.

6,373,577; 6,289,286; 5,322,798; 5,341,215; 6,268,125 razmatrani su u postupcima iz pronalaska.

[0220] Fluorescencijom aktivirano sortiranje ćelija (FACS), upotrebom bilo koje od tehnika poznatih onima sa iskustvom u struci, može se upotrebljavati za karakterizaciju vezivanja Fc varijanti za molekul eksprimiran na površini ćelije (npr. FcγRIIIA, FcγRIIB). Protočni sorteri su sposobni da brzo ispitaju veliki broj pojedinačnih ćelija koje sadrže inserte iz biblioteke (npr. 10-100 miliona ćelija na sat) (Shapiro et al., Practical Flow, Citometry, 1995). Protočni citometri za sortiranje i ispitivanje bioloških ćelija su dobro poznati u struci. Poznati protočni citometri su opisani, na primer, u S.A.D. patentima br. 4,347,935; 5,464,581; 5,483,469; 5,602,039; 5,643,796; i 6,211,477. Drugi poznati protočni citometri su FACS Vantage™ sistem koji proizvodi Becton Dickinson and Company, i COPAS™ sistem koji proizvodi Union Biometrica.

[0221] Fc varijante iz pronalaska mogu se okarakterisati pomoću njihove sposobnosti da posreduju u FcγR-posredovanoj funkciji efektorske ćelije. Primeri funkcija efektorskih ćelija koje se mogu ispitati uključuju, ali nisu ograničeni na, ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), fagocitozu, opsonizaciju, opsonofagocitozu, C1q vezivanje, i ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Može se upotrebljavati

1 2

bilo koji test zasnovan na ćelijama ili bez ćelija koji je poznat onima sa iskustvom u struci za određivanje aktivnosti funkcije efektorske ćelije (Za testove efektorskih ćelija, videti Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol.121: 179-92; Baggiolini et al., 1998 Experientia, 44(10): 841-8; Lehmann et al., 2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown E J. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al., 1990 J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al., 2002 Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al., 1998, Immunity 8:403-411).

[0222] Posebno, Fc varijante iz pronalaska mogu biti testirane na FcγR-posredovanu ADCC aktivnost u efektorskim ćelijama, (npr. ćelije prirodne ubice) upotrebom bilo kog od standardnih postupaka poznatih onima sa iskustvom u struci (videti npr. Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92). Primer testa za određivanje ADCC aktivnosti molekula iz pronalaska zasnovan je na testu oslobađanja 51Cr koji se sastoji od: obeležavanja ciljnih ćelija sa [51Cr]Na2CrO4(ovaj molekul za koji je ćelijska membrana permeabilna uobičajeno se upotrebljava za obeležavanje pošto vezuje citoplazmatske proteine i iako se spontano oslobađa iz ćelija sa sporom kinetikom, oslobađa se masovno nakon nekroze ciljne ćelije); opsonizovanja ciljnih ćelija sa Fc varijantama iz pronalaska; kombinovanja opsonizovanih radioaktivno obeleženih ciljnih ćelija sa efektorskim ćelijama u mikrotitar ploči u odgovarajućem odnosu ciljnih ćelija prema efektorskim ćelijama; inkubiranja smeše ćelija tokom 16-18 sati na 37 °C; sakupljanja supernatanata; i analiziranja radioaktivnosti. Citotoksičnost molekula iz pronalaska se zatim može odrediti, na primer upotrebom sledeće formule: % lize=(eksperimentalan cpm-ciljno curenje cpm)/(liza deterdžentom cpm-ciljno curenje cpm)×100%. Alternativno, % lize=(ADCC-AICC)/(maksimalno oslobađanjespontano oslobađanje). Specifična liza se može izračunati upotrebom formule: specifična liza=% lize sa molekulima iz pronalaska-% lize u odsustvu molekula iz pronalaska. Grafikon se može napraviti variranjem bilo odnosa cilj:efektorska ćelija ili koncentracije antitela.

[0223] Postupci za karakterizaciju sposobnosti Fc varijanti da vezuju C1q i posreduju u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC) dobro su poznati u struci. Na primer, da bi se odredilo C1q vezivanje, može se izvesti ELISA C1q vezivanja. Primer testiranja može sadržati sledeće: ploče za testiranje mogu biti obložene preko noći na 4 °C sa polipeptidnom varijantom ili početnim polipeptidom (kontrola) u puferu za oblaganje. Ploče se zatim mogu oprati i blokirati. Nakon ispiranja, alikvot humanog C1q može se dodati u svaki bunarić i inkubirati tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Nakon dodatnog ispiranja, 100 μl ovčijeg antikomplement C1q peroksidaza konjugovanog antitela može se dodati u svaki bunarić i inkubirati tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploča se ponovo može isprati puferom za ispiranje i 100 μl supstratnog pufera koji sadrži OPD (O-fenilendiamin dihidrohlorid (Sigma))

1

može se dodati u svaki bunarić. Reakciji oksidacije, uočenoj pojavom žute boje, može se omogućiti da se nastavi tokom 30 minuta i zaustaviti dodavanjem 100 μl 4,5 N H2SO4. Apsorbanca se tada može očitati na (492-405) nm.

[0224] Kako bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvesti test citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC), (npr. kao što je opisano u Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods 202:163). Ukratko, različite koncentracije Fc varijante i humanog komplementa mogu se razblažiti puferom. Ćelije koje eksprimiraju antigen za koji se vezuje Fc varijanta mogu se razblažiti do gustine od oko 1×106 ćelija/ml. Smeše Fc varijante, razblaženog humanog komplementa i ćelija koje eksprimiraju antigen mogu se dodati na ploču sa 96 bunarića za kulturu tkiva sa ravnim dnom i ostaviti da inkubiraju tokom 2 h na 37 °C i 5% CO2 kako bi se olakšala komplementom posredovana liza ćelija. 50 μl alamar blue (Accumed International) se zatim može dodati u svaki bunarić i inkubirati preko noći na 37 °C. Apsorbanca se meri upotrebom fluorometra za 96 bunarića sa ekscitacijom na 530 nm i emisijom na 590 nm. Rezultati se mogu izraziti u relativnim jedinicama fluorescencije (RFU). Koncentracije uzorka se mogu izračunati iz standardne krive i procenat aktivnosti, u odnosu na uporedivi molekul (tj. molekul koji sadrži Fc region sa nemodifikovanim ili CH3 domenom divljeg tipa) je saopšten za Fc varijantu od interesa.

[0225] Testovi komplementa mogu se izvesti sa serumom zamorca, zeca ili čoveka. Liza komplementa ciljnih ćelija može se detektovati pomoću praćenja oslobađanja unutarćelijskih enzima kao što je laktat dehidrogenaza (LDH), kao što je opisano u Korzeniewski et al., 1983, Immunol. Methods 64(3): 313-20; i Decker et al., 1988, J. Immunol Methods 115(1): 61-9; ili oslobađanja unutarćelijskog obeleživača kao što je evropijum, hrom 51 ili indijum 111 kojim su ciljne ćelije obeležene.

Postupci

[0226] Predmetni pronalazak obuhvata primenu jedne ili više Fc varijanti iz pronalaska (npr. antitela) životinji, posebno sisaru, specifično čoveku, za preveniranje, lečenje, ili ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, poremećajem, ili infekcijom. Fc varijante iz pronalaska posebno su korisne za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremećaja gde je poželjna izmenjena efikasnost funkcije efektorskih ćelija (npr. ADCC, CDC). Fc varijante i njihove kompozicije posebno su korisne za lečenje ili prevenciju primarne ili metastatske neoplastične bolesti (tj. kancera), i infektivnih bolesti. Molekuli iz pronalaska mogu biti obezbeđeni u farmaceutski prihvatljivim kompozicijama poznatim u struci ili kao što je ovde opisano. Kao

1 4

što je detaljno objašnjeno u nastavku, molekuli iz pronalaska mogu se upotrebljavati u postupcima lečenja ili preveniranja kancera (posebno u pasivnoj imunoterapiji), autoimunskih bolesti, inflamatornih poremećaja ili infektivnih bolesti.

[0227] Fc varijante iz pronalaska se takođe mogu povoljno koristiti u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima poznatim u struci za lečenje ili prevenciju kancera, autoimunske bolesti, inflamatornih poremećaja ili infektivnih bolesti. U specifičnom primeru izvođenja, Fc varijante iz pronalaska mogu se upotrebljavati u kombinaciji sa monoklonalnim ili himernim antitelima, limfokinima, ili hematopoetskim faktorima rasta (kao što su, na primer, IL-2, IL-3 i IL-7), koji, npr. služe za povećanje broja ili aktivnosti efektorskih ćelija koje interaguju sa molekulima i, povećavaju imunski odgovor. Fc varijante iz pronalaska se takođe mogu povoljno koristiti u kombinaciji sa jednim ili više lekova koji se upotrebljavaju za lečenje bolesti, poremećaja, ili infekcije, kao što su, na primer, antikancerski agensi, antiinflamatorni agensi ili antivirusni agensi.

[0228] U skladu sa tim, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za preveniranje, lečenje, ili ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa kancerom i srodnim stanjima primenom jedne ili više Fc varijanti iz pronalaska. Iako nije namenjeno da bude vezana bilo kakvim mehanizmom delovanja, Fc varijanta iz pronalaska koja vezuje FcγRIIIA i/ili FcγRIIA sa većim afinitetom nego uporedivi molekul, i dodatno vezuje FcγRIIB sa nižim afinitetom nego uporedivi molekul, i/ili navedena Fc varijanta ima poboljšanu efektorsku funkciju, npr. ADCC, CDC, fagocitozu, opsonizaciju, itd. rezultovaće selektivnim ciljnim delovanjem i efikasnim uništavanjem ćelija kancera.

[0229] Pronalazak dodatno obuhvata primenu jedne ili više Fc varijanti iz pronalaska u kombinaciji sa drugim terapijama poznatim onima sa iskustvom u struci za lečenje ili prevenciju kancera, uključujući ali ne ograničavajući se na, trenutne standardne i eksperimentalne hemioterapije, hormonske terapije, biološke terapije, imunoterapije, terapije zračenjem, ili operacije. U nekim primerima izvođenja, molekuli iz pronalaska mogu se primenjivati u kombinaciji sa terapijski ili profilaktički efikasnom količinom jednog ili više antikancerskih agenasa, terapijskih antitela ili drugih agenasa poznatih onima sa iskustvom u struci za lečenje i/ili prevenciju kancera. Primeri režima doziranja i terapija koje se mogu upotrebljavati u kombinaciji sa Fc varijantama iz pronalaska su dobro poznati u struci i detaljno su opisani na drugim mestima (videti na primer, PCT publikacije WO 02/070007 i WO 03/075957).

[0230] Kanceri i srodni poremećaji koji se mogu lečiti ili prevenirati postupcima i kompozicijama iz predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće:

1

leukemije, limfome, multiple mijelome, sarkome kostiju i vezivnog tkiva, tumore mozga, kancer dojke, kancer nadbubrežne žlezde, kancer štitne žlezde, kancer pankreasa, kancere hipofize, kancere oka, kancere vagine, kancer vulve, kancere grlića materice, kancere materice, kancere jajnika, kancere jednjaka, kancere želuca, kancere kolona, rektalne kancere, kancere jetre, kancere žučne kese, holangiokarcinome, kancere pluća, kancere testisa, kancere prostate, penal kancere; oralne kancere, kancere pljuvačne žlezde, kancere ždrela, kancere kože, kancere bubrega, kancere mokraćne bešike (za pregledni prikaz takvih poremećaja, videti Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia i Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books USA, Inc., United States of America).

[0231] Pronalazak dodatno razmatra projektovanje bilo kog od antitela poznatih u struci za lečenje i/ili prevenciju kancera i srodnih poremećaja, tako da antitela sadrže Fc region koji inkorporiše modifikovani CH3 domen iz pronalaska.

[0232] U specifičnom primeru izvođenja, molekul iz pronalaska (npr. antitelo koje sadrži varijantni Fc heterodimer inhibira ili redukuje rast primarnog tumora ili metastaze kancerskih ćelija za najmanje 99%, najmanje 95%, najmanje 90%, na najmanje 85%, najmanje 80%, najmanje 75%, najmanje 70%, najmanje 60%, najmanje 50%, najmanje 45%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 35%, najmanje 30%, najmanje 25%, najmanje 20%, ili najmanje 10% u odnosu na rast primarnog tumora ili metastaze u odsustvu navedenog molekula iz pronalaska.

[0233] Predmetni pronalazak obuhvata upotrebu jedne ili više Fc varijanti iz pronalaska za preveniranje, lečenje, ili upravljanje jednim ili više simptoma povezanih sa inflamatornim poremećajem kod subjekta. Iako nije namenjeno da budu vezane bilo kakvim mehanizmom delovanja, Fc varijante sa poboljšanim afinitetom za FcγRIIB će dovesti do prigušenja aktivirajućih receptora i stoga do prigušenja imunskog odgovora i imaju terapijsku efikasnost za lečenje i/ili preveniranje autoimunskog poremećaja. Štaviše, antitela koja vezuju više od jednog cilja, kao što su bispecifična antitela koja sadrže varijantni Fc heterodimer, povezan sa inflamatornim poremećajem mogu obezbediti sinergističke efekte u odnosu na monovalentnu terapiju.

[0234] Pronalazak dodatno obuhvata primenu Fc varijanti iz pronalaska u kombinaciji sa terapijski ili profilaktički efikasnom količinom jednog ili više antiinflamatornih agenasa. Pronalazak takođe obezbeđuje postupke za preveniranje, lečenje, ili upravljanje jednim ili više simptoma povezanih sa autoimunskom bolešću, kojidodatno obuhvataju primenu navedenom subjektu Fc varijante iz pronalaska u kombinaciji sa terapijski ili profilaktički efikasnom

1

količinom jednog ili više imunomodulatornih agenasa. Primeri autoimunskih poremećaja koji se mogu lečiti primenom Fc varijanti iz pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, alopeciju areatu, ankilozni spondilitis, antifosfolipidni sindrom, autoimunsku Adisonovu (Addison's) bolest, autoimunske bolesti nadbubrežne žlezde, autoimunsku hemolitičku anemiju, autoimunski hepatitis, autoimunski ooforitis i orhitis, autoimunsku trombocitopeniju, Behčetovu (Behcet's) bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatiju, celijačni spru-dermatitis, sindrom hroničnog umora i imunološke disfunkcije (CFIDS), hroničnu inflamatornu demijelinizujuću polineuropatiju, Čurg-Strausov (Churg-Strauss) sindrom, cicatrični pemfigoid, CREST sindrom, hladnu aglutininsku bolest, Kronovu (Crohn's) bolest, diskoidni lupus, esencijalnu mešovitu krioglobulinemiju, fibromialgiju-fibromiozitis, glomerulonefritis, Grejvsovu (Graves') bolest, Gilen-Bare, Hašimotov (Hashimoto's) tiroiditis, idiopatsku pulmonarnu fibrozu, idiopatsku trombocitopeniju purpuru (ITP), IgA neuropatiju, juvenilni artritis, lihen planus, lupus eritematozus, Menijerovu (Meniere's) bolest, mešovitu bolest vezivnog tkiva, multipla sklerozu, dijabetes melitus tipa 1 ili imunski posredovani dijabetes melitus, mijasteniju gravis, pemfigus vulgaris, pernicioznu anemiju, poliarteritis nodosa, polihrondritis, poliglandularne sindrome, reumatsku polimijalgiju, polimiozitis i dermatomiozitis, primarnu agamaglobulinemiju, primarnu bilijarnu cirozu, psorijazu, psorijatični artritis, Rajnoov (Raynauld's) fenomen, Rajterov (Reiter's) sindrom, reumatoidni artritis, sarkoidozu, sklerodermu, Sjogrenov (Sjogren's) sindrom, sindrom ukočenog čoveka, sistemski eritematozni lupus, lupus eritematozus, takaiasu arteritis, temporalni arteritis/arteritis gigantskih ćelija, ulcerozni kolitis, uveitis, vaskulitise kao što su dermatitis herpetiformis vaskulitis, vitiligo, i Vegenerovu (Wegener's) granulomatozu. Primeri inflamatornih poremećaja uključuju, ali nisu ograničeni na, astmu, encefilitis, inflamatornu bolest creva, hroničnu opstruktivnu pulmonarnu bolest (COPD), alergijske poremećaje, septički šok, pulmonarnu fibrozu, nediferenciranu spondiloartropatiju, nediferenciranu artropatiju, artritis, inflamatornu osteolizu, i hroničnu inflamaciju koja je rezultat hroničnih virusnih ili bakterijskih infekcija. Neki autoimunski poremećaji su povezani sa inflamatornim stanjem, tako da postoji preklapanje između onoga što se smatra autoimunskim poremećajem i inflamatornog poremećaja. Stoga se neki autoimunski poremećaji takođe mogu okarakterisati kao inflamatorni poremećaji. Primeri inflamatornih poremećaja koji se mogu prevenirati, lečiti ili se njima upravljati u skladu sa postupcima iz pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, astmu, encefilitis, inflamatornu bolest creva, hroničnu opstruktivnu pulmonarnu bolest (COPD), alergijske poremećaje, septički šok, pulmonarnu fibrozu,

1

nediferenciranu spondiloartropatiju, nediferenciranu artropatiju, artritis, inflamatornu osteolizu, i hroničnu inflamaciju koja je rezultat hroničnih virusnih ili bakterijskih infekcija.

[0235] Fc varijante iz pronalaska se takođe mogu upotrebljavati za redukovanje inflamacije koje doživljavaju životinje, posebno sisari, sa inflamatornim poremećajima. U specifičnom primeru izvođenja, Fc iz pronalaska redukuje inflamaciju kod životinje za najmanje 99%, najmanje 95%, najmanje 90%, najmanje 85%, najmanje 80%, najmanje 75%, najmanje 70%, najmanje 60%, najmanje 50%, najmanje 45%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 35%, najmanje 30%, najmanje 25%, najmanje 20%, ili najmanje 10% u odnosu na inflamaciju kod životinje kojoj nije primenjen navedeni molekul.

[0236] Pronalazak dodatno razmatra projektovanje bilo kog od antitela poznatih u struci za lečenje i/ili prevenciju autoimunske bolesti ili inflamatorne bolesti, tako da antitela sadrže varijantni Fc heterodimer iz pronalaska.

[0237] Pronalazak takođe obuhvata postupke za lečenje ili preveniranje infektivne bolesti kod subjekta koji sadrže primenu terapijski ili profilaktički efikasne količine jedne ili više Fc varijanti iz pronalaska. Infektivne bolesti koje se mogu lečiti ili prevenirati Fc varijantama iz pronalaska uzrokovane su infektivnim agensima uključujući ali ne ograničavajući se na viruse, bakterije, gljivice, protozoe, i viruse.

[0238] Virusne bolesti koje se mogu lečiti ili prevenirati upotrebom Fc varijanti iz pronalaska zajedno sa postupcima iz predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na, one uzrokovane hepatitisom tipa A, hepatitisom tipa B, hepatitisom tipa C, infuencom, varičelom, adenovirusom, herpes simpleksom tipa I (HSV-I), herpes simpleksom tipa II (HSV-II), goveđom kugom, rinovirusom, ehovirusom, rotavirusom, respiratornim sincicijalnim virusom, papiloma virusom, papova virusom, citomegalovirusom, ehinovirusom, arbovirusom, huntavirusom, koksaki virusom, virusom zauški, virusom boginja, virusom rubeole, polio virusom, malim boginjama, Epštajn Bar (Epstein Barr) virusom, virusom humane imunodeficijencije tipa I (HIV-I), virusom humane imunodeficijencije tipa II (HIV-II), i agensima virusnih bolesti kao što su virusni meningitis, encefalitis, denga ili male boginje.

[0239] Bakterijske bolesti koje se mogu lečiti ili prevenirati upotrebom Fc varijanti iz pronalaska zajedno sa postupcima iz predmetnog pronalaska, koje su uzrokovane bakterijama uključuju, ali nisu ograničene na, mikobakteriju rikeciju, mikoplazmu, neisseria, S. pneumonia, Borrelia burgdorferi (lajmska bolest), Bacillus antracis (antraks), tetanus, streptokoku, stafilokoku, mikobakteriju, tetanus, pertisus, koleru, kugu, difteriju, hlamidiju, S. aureus i legionelu. Protozoalne bolesti koje se mogu lečiti ili prevenirati upotrebom molekula iz pronalaska zajedno sa postupcima iz predmetnog pronalaska, koje su uzrokovane

1

protozoama uključuju, ali nisu ograničene na, leišmaniju, kokzidiou, tripanozom ili malariju. Parazitske bolesti koje se mogu lečiti ili prevenirati upotrebom molekula iz pronalaska zajedno sa postupcima iz predmetnog pronalaska, koje su uzrokovane parazitima uključuju, ali nisu ograničene na, hlamidiju i rikeciju.

[0240] U nekim primerima izvođenja, Fc varijante iz pronalaska mogu se primeniti u kombinaciji sa terapijski ili profilaktički efikasnom količinom jednog ili dodatnih terapijskih agenasa poznatih onima sa iskustvom u struci za lečenje i/ili prevenciju infektivne bolesti. Pronalazak razmatra upotrebu molekula iz pronalaska u kombinaciji sa drugim molekulima poznatim onima sa iskustvom u struci za lečenje i/ili prevenciju infektivne bolesti uključujući, ali ne ograničavajući se na, antibiotike, antifungalne agense i antivirusne agense.

[0241] Pronalazak obezbeđuje postupke i farmaceutske kompozicije koje sadrže Fc varijante iz pronalaska (npr. antitela, polipeptide). Pronalazak takođe obezbeđuje postupke lečenja, profilakse, i ublažavanja jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, poremećajem ili infekcijom primenom subjektu efikasne količine najmanje jedne Fc varijante iz pronalaska, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jednu Fc varijantu iz pronalaska. U jednom aspektu, Fc varijanta, je suštinski prečišćena (tj. suštinski bez supstanci koje ograničavaju njen efekat ili proizvode neželjene sporedne efekte, što uključuje homodimere i drugi ćelijski materijal). U specifičnom primeru izvođenja, subjekt je životinja, kao što je sisar uključujući neprimate (npr. krave, svinje, konje, mačke, pse, pacove itd.) i primate (npr. majmun kao što je cinomolgus majmun i čovek). U specifičnom primeru izvođenja, subjekt je čovek. U još jednom specifičnom primeru izvođenja, antitelo iz pronalaska je iz iste vrste kao subjekt.

[0242] Put primene kompozicije zavisi od stanja koje se leči. Na primer, intravenska injekcija može biti poželjna za lečenje sistemskog poremećaja kao što je limfni kancer ili tumor koji je metastazirao. Doziranje kompozicija koje se primenjuju može da odredi verzirani stručnjak bez nepotrebnog eksperimentisanja zajedno sa standardnim doza-odgovor studijama. Relevantne okolnosti koje treba uzeti u obzir pri donošenju ovih odluka uključuju stanje ili stanja koja se leče, izbor kompozicije koja će se primeniti, starost, težinu, i odgovor pojedinačnog pacijenta, i ozbiljnost simptoma pacijenta. U zavisnosti od stanja, kompozicija se može primeniti pacijentu oralno, parenteralno, intranazalno, vaginalno, rektalno, lingvalno, sublingvalno, bukalno, intrabukalno i/ili transdermalno.

[0243] U skladu sa tim, kompozicije dizajnirane za oralnu, lingvalnu, sublingvalnu, bukalnu i intrabukalnu primenu mogu se napraviti bez nepotrebnog eksperimentisanja načinima dobro poznatim u struci, na primer, sa inertnim razblaživačem ili sa jestivim nosačem. Kompozicija može biti zatvorena u želatinske kapsule ili komprimovana u tablete. U svrhu oralne terapijske

1

primene, farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu biti inkorporisane sa ekscipijensima i upotrebljene u obliku tableta, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, vafla, žvakaćih guma, i slično.

[0244] Tablete, pilule, kapsule, pastile i slično mogu takođe da sadrže veziva, recipijente, agense za dezintegraciju, lubrikante, agense za zaslađivanje, i/ili agense za aromatizaciju. Neki primeri veziva uključuju mikrokristalnu celulozu, tragakant gumu i želatin. Primeri ekscipijenasa uključuju skrob i laktozu. Neki primeri agenasa za dezintegraciju uključuju alginsku kiselinu, kukuruzni skrob, i slično. Primeri lubrikanata uključuju magnezijum stearat i kalijum stearat. Primer glidanta je koloidni silicijum dioksid. Neki primeri agenasa za zaslađivanje uključuju saharozu, saharin, i slično. Primeri agenasa za aromatizaciju uključuju pepermint, metil salicilat, aromu pomorandže, i slično. Materijali koji se upotrebljavaju za pripremu ovih različitih kompozicija treba da budu farmaceutski čisti i netoksični u upotrebljenim količinama.

[0245] Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu se primenjivati parenteralno, kao što je, na primer, intravenska, intramuskularna, intratekalna i/ili subkutana injekcija. Parenteralna primena se može postići inkorporacijom kompozicija iz predmetnog pronalaska u rastvor ili suspenziju. Takvi rastvori ili suspenzije mogu takođe uključivati sterilne razblaživače, kao što su voda za injekcije, fiziološki rastvor, fiksna ulja, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol i/ili drugi sintetički rastvarači. Parenteralne formulacije mogu takođe uključivati antibakterijske agense, kao što su, na primer, benzil alkohol i/ili metil parabeni, antioksidanse, kao što su, na primer, askorbinska kiselina i/ili natrijum bisulfit, i helatne agense, kao što je EDTA. Mogu se takođe dodati i puferi, kao što su acetati, citrati i fosfati, i agensi za podešavanje toničnosti, kao što su natrijum hlorid i dekstroza. Parenteralni preparat se može zatvoriti u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu i/ili bočice sa više doza od stakla ili plastike. Rektalna primena uključuje primenu kompozicije u rektum i/ili debelo crevo. Ovo se može postići upotrebom supozitorija i/ili klistira. Formulacije supozitorija mogu se napraviti postupcima poznatim u struci. Transdermalna primena uključuje perkutanu apsorpciju kompozicije kroz kožu. Transdermalne formulacije uključuju flastere, masti, kreme, gelove, meleme, i slično. Kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu se primenjivati nazalno pacijentu. Kao što se ovde upotrebljava, nazalno primenjivanje ili nazalna primena uključuje primenjivanje kompozicija na mukozne membrane nosnog prolaza i/ili nosne šupljine pacijenta.

[0246] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu se upotrebljavati u skladu sa postupcima iz pronalaska za preveniranje, lečenje, ili ublažavanje jednog ili više simptoma

11

povezanih sa bolešću, poremećajem, ili infekcijom. Razmatra se da su farmaceutske kompozicije iz pronalaska sterilne i u pogodnom obliku za primenu subjektu.

[0247] U jednom primeru izvođenja, kompozicije iz pronalaska su formulacije bez pirogena koje su suštinski bez endotoksina i/ili srodnih pirogenih supstanci. Endotoksini uključuju toksine koji su zatvoreni unutar mikroorganizma i oslobađaju se kada se mikroorganizmi razlože ili umru. Pirogene supstance takođe uključuju termostabilne supstance koje uzrokuju groznicu (glikoproteine) iz spoljašnje membrane bakterija i drugih mikroorganizama. Obe ove supstance mogu uzrokovati groznicu, hipotenziju i šok ukoliko se primene ljudima. Zbog potencijalnih štetnih efekata, korisno je ukloniti čak i male količine endotoksina iz intravenski primenjenih rastvora farmaceutskih lekova. Uprava za hranu i lekove ("FDA") postavila je gornju granicu od 5 jedinica endotoksina (EU) po dozi po kilogramu telesne težine u jednom jednosatnom periodu za intravenske primene lekova (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1): 223 (2000)). Kada se terapijski proteini primenjuju u količinama od nekoliko stotina ili hiljada miligrama po kilogramu telesne težine, kao što može biti slučaj sa monoklonalnim antitelima, povoljno je ukloniti čak i tragove endotoksina. U specifičnom primeru izvođenja, nivoi endotoksina i pirogena u kompoziciji su manje od 10 EU/mg, ili manje od 5 EU/mg, ili manje od 1 EU/mg, ili manje od 0,1 EU/mg, ili manje od 0,01 EU/ mg, ili manje od 0,001 EU/mg.

[0248] Pronalazak obezbeđuje postupke za preveniranje, lečenje, ili ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, poremećajem, ili infekcijom, navedeni postupak sadrži: (a) primenu subjektu kome je to potrebno doze profilaktički ili terapijski efikasne količine kompozicije koja sadrži jednu ili više Fc varijanti i (b) primenu jedne ili više narednih doza navedenih Fc varijanti, kako bi se održala koncentracija Fc varijante u plazmi na poželjnom nivou (npr. oko 0,1 do oko 100 µg/ml), koja se kontinuirano vezuje za antigen. U specifičnom primeru izvođenja, koncentracija Fc varijante u plazmi održava se na 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml, 25 µg/ml, 30 µg/ml, 35 µg/ml, 40 µg/ml, 45 µg/ml ili 50 µg/ml. U specifičnom primeru izvođenja, navedena efikasna količina Fc varijante koja se primenjuje je između najmanje 1 mg/kg i 8 mg/kg po dozi. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, navedena efikasna količina Fc varijante koja se primenjuje je između najmanje 4 mg/kg i 5 mg/kg po dozi. U još jednom specifičnom primeru izvođenja, navedena efikasna količina Fc varijante koja se primenjuje je između 50 mg i 250 mg po dozi. U još jednom specifičnom primeru izvođenja, navedena efikasna količina Fc varijante koja se primenjuje je između 100 mg i 200 mg po dozi.

[0249] Predmetni pronalazak takođe obuhvata protokole za preveniranje, lečenje, ili ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, poremećajem, ili infekcijom kod kojih se Fc varijanta upotrebljava u kombinaciji sa terapijom (npr. profilaktičkim ili terapijskim agensom) koja nije Fc varijanta i/ili varijantni fuzioni protein. Pronalazak se, delimično, zasniva na prepoznavanju da Fc varijante iz pronalaska potenciraju i sinergizuju sa, poboljšavaju efikasnost, poboljšavaju toleranciju, i/ili redukuju neželjene efekte uzrokovane drugim kancerskim terapijama, uključujući trenutni standard i eksperimentalne hemioterapije. Kombinovane terapije iz pronalaska imaju aditivnu potentnost, aditivni terapijski efekat ili sinergistički efekat. Kombinovane terapije iz pronalaska omogućavaju niže doze terapije (npr. profilaktičkih ili terapijskih agenasa) koje se koriste zajedno sa Fc varijantama za preveniranje, lečenje, ili ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, poremećajem, ili infekcijom i/ili manje čestu primenu takvih profilaktičkih ili terapijskih agenasa subjektu sa bolešću, poremećajem, ili infekcijom kako bi se poboljšao kvalitet života navedenog subjekta i/ili kako bi se postigao profilaktički ili terapijski efekat. Dodatno, kombinovane terapije iz pronalaska redukuju ili izbegavaju neželjene ili nepoželjne sporedne efekte povezane sa primenom trenutnih terapija sa jednim agensom i/ili postojećih kombinovanih terapija, što zauzvrat poboljšava usaglašenost pacijenata sa protokolom lečenja. Brojni molekuli koji se mogu koristiti u kombinaciji sa Fc varijantama iz pronalaska su dobro poznati u struci. Videti na primer, PCT publikacije WO 02/070007; WO 03/075957 i S.A.D. patentnu publikaciju 2005/064514.

[0250] Predmetni pronalazak obezbeđuje komplete koji sadrže jednu ili više Fc varijanti sa izmenjenim afinitetom vezivanja za FcγR i/ili C1q i izmenjenom ADCC i/ili CDC aktivnošću koje se specifično vezuju za antigen konjugovan ili fuzionisan sa agensom koji se može detektovati, terapijskim agensom ili lekom, u jednom ili više kontejnera, za upotrebu u praćenju, dijagnostici, preveniranju, lečenju, ili ublažavanju jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, poremećajem, ili infekcijom.

PRIMERI

[0251] Primeri u nastavku dati su kako bi ilustrovali praksu ovog pronalaska. Oni nisu namenjeni da ograniče ili definišu čitav obim ovog pronalaska.

Primer 1: Generisanje bivalentnih monospecifičnih antitela sa heterodimernim Fc domenima.

[0252] Geni koji kodiraju teške i lake lance antitela konstruisani su putem sinteze gena upotrebom kodona optimizovanih za humanu/sisarsku ekspresiju. Fab sekvence su generisane iz poznatog Her2/neu vezujućeg Ab (Carter P. et al. (1992) Humanization of an anti P185 Her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci 89, 4285) i Fc je bio IgG1 izotip (SEQ ID NO:1). Krajnji genski proizvodi su subklonirani u ekspresioni vektor sisara pTT5 (NRC-BRI, Canada) (Durocher, Y., Perret, S. & Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human HEK293-EBNA1 cells. Nucleic acids research 30, E9 (2002)). Mutacije u CH3 domenu su introdukovane putem mutageneze usmerene na mesto pTT5 templat vektora. Videti Tabelu 1 i Tabelu 6 i Tabelu 7 za listu napravljenih mutacija modifikovanih CH3 domena.

[0253] Kako bi se procenilo formiranje heterodimera i odredio odnos homodimera naspram heterodimerima dva teška lanca heterodimera su dizajnirana sa C-terminusnim produžecima različite veličine (specifično, lanac A sa C-terminusnom His oznakom i lanac B sa C-terminusnom mRFP plus StrepTagII). Ova razlika u molekulskoj težini omogućava diferencijaciju homodimera naspram heterodimera u SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima kao što je ilustrovano na SLICI 25A.

[0254] HEK293 ćelije su transfektovane u fazi eksponencijalnog rasta (1,5 do 2 miliona ćelija/ml) sa vodenim 1mg/ml 25 kDa polietileniminom (PEI, Polysciences) u PEI:DNK odnosu od 2,5:1 (Raymond C. et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods.55(1):44-51 (2011)). Kako bi se odredio optimalni opseg koncentracija za formiranje heterodimera, DNK je transfektovana u tri odvojena odnosa dva teška lanca. Na primer, ovo je urađeno u zapremini kulture od 2 ml i transfekcionoj DNK, koja se sastoji od 5% GFP, 45% DNK sperme lososa, 25% lakog lanca i 25% ukupnih teških lanaca, gde su plazmid teškog lanca A (sa C-terminusnom His oznakom) i plazmid teškog lanca B (sa C-terminusnom StrepTagII plus RFP) na 65%/55%/35% ili 10%/20%/40%) uzorkovani u 3 različita relativna odnosa (lanac_A(His)/lanac_B(mRFP)) od 10%/65%; 20%/55%; 40%/35% (prividni odnos ekspresije 1:1 heterodimera WT_His/WT_mRFP je određen da je blizu DNK odnosu 20%/55%). 4 do 48 sati posle transfekcije u medijumu bez seruma F17 (Gibco), TN1 pepton je dodat do konačne koncentracije od 0,5%. Eksprimirano antitelo je analizirano pomoću SDS-PAGE kako bi se odredio najbolji odnos teškog prema lakom lancu za optimalno formiranje heterodimera (videti Sliku 25B i C).

11

[0255] Odabrani DNK odnos, na primer 50% plazmida lakog lanca, 25% plazmida teškog lanca A, 25% teškog lanca B od AZ33 i AZ34, sa 5% GFP, i 45% DNK sperme lososa upotrebljen je za transfekciju 150 ml ćelijske kulture kao što je prethodno opisano. Transfektovane ćelije su sakupljene posle 5-6 dana sa medijumom za kulturu sakupljenim posle centrifugiranja na 4000 rpm i izbistrene upotrebom filtera od 0,45 µm. Videti Tabelu 2 u nastavku, za listu procenta plazmida lakog i teškog lanca A i B upotrebljenih u testovima povećanja transfekcije za svako od antitela sa CH3 mutacijama generisanim za dodatnu analizu, uključujući određivanje čistoće i temperature topljenja.

Tabela 2:

Primer 2: Prečišćavanje bivalentnih monospecifičnih antitela sa heterodimernim Fc domenima.

[0256] Izbistreni medijum za kulturu je stavljen na MabSelect SuRe (GE Healthcare) protein-A kolonu i ispran sa 10 zapremina kolone PBS pufera na pH 7,2. Antitelo je eluirano sa 10 zapremina kolone citratnog pufera na pH 3,6 sa puliranim frakcijama koje sadrže antitelo neutralizovano sa TRIS na pH 11. Protein je na kraju desalinisan upotrebom Econo-Pac 10DG kolone (Bio-Rad). C-terminusna mRFP oznaka na teškom lancu B je uklonjena inkubacijom antitela sa enterokinazom (NEB) u odnosu 1:10,000 preko noći u PBS na 25 °C. Antitelo je

11

prečišćeno iz smeše gel filtracijom. Za gel filtraciju, 3,5 mg smeše antitela je koncentrovano do 1,5 ml i stavljeno na Sephadex 200 HiLoad 16/600200 pg kolonu (GE Healthcare) putem AKTA Express FPLC pri stopi protoka od 1ml/min. PBS pufer na pH 7,4 je upotrebljen pri stopi protoka od 1 ml/min. Frakcije koje odgovaraju prečišćenom antitelu su sakupljene, koncentrovane do ∼1mg/ml i skladištene na -80 °C.

[0257] Formiranje heterodimera, u poređenju sa homodimerima, je testirano upotrebom SDS-PAGE pod neredukcionim uslovima i masene spektrometrije. Protein A prečišćeno antitelo je stavljeno na 4-12% gradijent SDS-PAGE, neredukcioni gel kako bi se odredio procenat heterodimera formiranih pre tretmana enterokinazom (EK) (videti Sliku 26). Za masenu spektrometriju, svi Trap LC/MS (ESI-TOF) eksperimenti su izvedeni na Agilent 1100 HPLC sistemu koji je povezan sa Waters Q-TOF2 masenim spektrometrom. Pet µg antitela prečišćenog gel filtracijom injektirano je u Protein MicroTrap (1,0 sa 8,0 mm), isprano sa 1% acetonitrilom tokom 8 minuta, gradijentom od 1 do 20% acetonitrila/0,1% mravlja kiselina tokom 2 minuta, zatim eluirano sa 20 do 60% acetonitril/0,1% mravlja kiselina gradijentom tokom 20 minuta. Eluat (30-50 µl/min) je usmeren na spektrometar sa spektrom koji se dobija svake sekunde (m/z 800 do 4.000). (Videti Sliku 28) Za dodatnu analizu odabrane su varijante koje imaju više od 90% heterodimera, sa izuzetkom AZ12 i AZ14 od kojih je svaka imala više od 85% formiranja heterodimera.

Primer 3: Određivanje stabilnosti bivalentnih monospecifičnih antitela sa heterodimernim Fc domenima upotrebom diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC).

[0258] Svi DSC eksperimenti su izvedeni upotrebom GE VP-Capillary instrumenta. Proteini su pufer-izmenjeni u PBS (pH 7,4) i razblaženi do 0,4 do 0,5 mg/ml sa 0,137 ml uliveni u ćeliju za uzorak i mereni stopom skeniranja od 1 °C/min od 20 do 100 °C. Podaci su analizirani upotrebom Origin softvera (GE Healthcare) sa oduzetom pozadinom PBS pufera (videti Sliku 27). Videti Tabelu 3 za listu testiranih varijanti i određenu temperaturu topljenja. Videti Tabelu 4 za listu varijanti sa temperaturom topljenja od 70 °C i više i specifičnim Tm za svaku varijantu.

Tabela 3: Merenja temperature topljenja modifikovanih CH3 domena u IgG1 antitelu koji imaju 90% ili više formiranja heterodimera u poređenju sa formiranjem homodimera

11

Tabela 4: Merenja temperature topljenja odabranih modifikovanih CH3 domena u IgG1 antitelu

Primer 4: Procena FcgamaR vezivanja upotrebom površinske plazmonske rezonance

11

[0259] Svi eksperimenti vezivanja su izvedeni upotrebom BioRad ProteOn XPR36 instrumenta na 25 °C sa 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, i 0,05% Tween 20 na pH 7,4. Rekombinantni HER-2/neu(p185, ErbB-2 (eBiosciences, Inc.)) je uhvaćen na aktiviranom GLM senzorskom čipu injektiranjem 4,0 µg/mL u 10 mM NaOAc (pH 4,5) pri 25 µl/min dok je pribl. 3000 rezonantnih jedinica (RU) imobilisano a preostale aktivne grupe su ugašene. 40 µg/ml prečišćenih anti-HER-2/neu antitela koja sadrže modifikovane CH3 domene indirektno je uhvaćeno na senzorski čip vezivanjem Her-2/neu proteina kada se injektira pri 25 µl/min tokom 240 sekundi (što rezultira približno 500 RU) nakon injekcije pufera za uspostavljanje stabilne početne vrednosti. Koncentracije FcgamaR (CD16a (f alotip) i CD32b) (6000, 2000, 667, 222, i 74,0 nM) su injektirane pri 60 µl/min tokom 120 sekundi sa fazom disocijacije od 180 sekundi kako bi se dobio skup senzograma vezivanja. Rezultantne KDvrednosti su određene iz izotermi vezivanja upotrebom Equilibrium Fit modela sa saopštenim vrednostima kao srednja vrednost tri nezavisna ciklusa. Poređenja su napravljena sa Fc domenom IgG1 divljeg tipa i vezivanje je izraženo kao odnos WT kD prema varijantnom kD (videti Tabelu 5).

Tabela 5: Odnos kD IgG1 divljeg tipa prema antitelu sa modifikovanim CH3 domenom koje se nezavisno vezuje za CD16a i CD32b

11

12

Primer 5: Racionalni dizajn Fc varijanti upotrebom Fc_CH3 projektovanja - Skela 1 (1a i 1b) i razvoj AZ17-62 i AZ133-AZ2438

[0260] Kako bi se dobile AZ varijante sa visokom stabilnošću i čistoćom, korišćene su prethodno opisane strukturne i računarske strategije. (Videti Sliku 24) Na primer, dubinska analiza strukture i funkcije AZ8 obezbedila je detaljno razumevanje za svaku od introdukovanih mutacija u AZ8, L351Y_V397S_F405A_Y407V / K392V_T394W u poređenju sa humanim IgG1 divljeg tipa i ukazala je da su važne mutacije jezgra heterodimera L351Y_F405A_Y407V / T394W, dok V397S, K392V nisu bile relevantne za formiranje heterodimera. Mutacije jezgra (L351Y_F405A_Y407V / T394W) se ovde označavaju kao "Skela 1" mutacije. Analiza je štaviše otkrila da su važna ključna mesta interfejsa koja se gube u odnosu na formiranje homodimera divljeg tipa (WT) interakcije WT-F405-K409, Y407-T366 i pakovanje Y407-Y407 i -F405 (videti Sliku 29). Ovo se odrazilo na pakovanje, šupljinu i MD analizu, koja je pokazala veliku konformacionu razliku u regionu petlje D399-S400-D401 (videti Sliku 30) i pridruženim β-pločama na K370. Ovo je rezultovalo gubitkom međulančanih interakcija K409-D399 (Videti Sliku 30) i slabljenjem jake vodonične veze K370 za E357 (K370 više nije u direktnom kontaktu sa S364 i E357, ali je u potpunosti izložen rastvaraču). U CH3 domenu WT IgG1 ovi regioni privezuju interfejs na obodu štite interakcije jezgra od kompeticije sa većinom rastvarača i povećavaju dinamičku pojavu povoljnih hidrofobnih van der Valsovih (van der Waals) interakcija. Posledica je bila manja zakopana površina AZ8 u poređenju sa WT i veća dostupnost hidrofobnog jezgra rastvaraču. Ovo ukazuje da je najvažniji faktor za nižu stabilnost AZ8 u poređenju sa stabilnošću WT bio a) gubitak WT-F405- K409 interakcija i pakovanje F405, i b) gubitak jake interakcije pakovanja Y407-Y407 i Y407-T366. Videti Sliku 29.

[0261] Kao posledica toga, identifikovali smo ključne ostatke/motive sekvence odgovorne za nisku stabilnost AZ8 u poređenju sa WT. Kako bi se poboljšala stabilnost i specifičnost heterodimera AZ8, naknadni inženjerski napori pozitivnog dizajna su stoga bili specifično fokusirani na stabilizaciju konformacije petlje na pozicijama 399-401 u 'zatvorenijoj' -konformaciji nalik WT (videti Sliku 30) i kompenzaciju za sveukupno blago smanjeno (labavije) pakovanje hidrofobnog jezgra na pozicijama T366 i L368 (videti Sliku 29).

[0262] Kako bi se postigla ova stabilizacija konformacije petlje na pozicijama 399-401, upotrebljen je opisani računarski pristup za procenu naših različitih ideja ciljanog dizajna. Specifično, analizirane su tri različite nezavisne opcije za Fc varijantu AZ8 kako bi se optimizovali identifikovani ključni regioni za poboljšanje stabilnosti. Prvo, vezujući džep blizu pozicija K409 i F405A procenjen je za bolje hidrofobno pakovanje kako bi se i zaštitilo hidrofobno jezgro i stabilizovala konformacija petlje 399-400 (videti Sliku 30). One su uključivale, ali nisu bile ograničene na dodatne tačkaste mutacije na pozicijama F405 i K392. Drugo, procenjene su opcije za poboljšanje elektrostatičkih interakcija pozicija 399-409, kako bi se stabilizovala konformacija petlje 399-400 i zaštitilo hidrofobno jezgro. Ovo je uključivalo, ali nije bilo ograničeno na dodatne tačkaste mutacije na pozicijama T411 i S400. Treće, vezujući džep na pozicijama pakovanja jezgra T366, T394W i L368 procenjen je kako bi se poboljšalo hidrofobno pakovanje jezgra (videti Sliku 29). One su uključivale, ali nisu bile ograničene na dodatne tačkaste mutacije na pozicijama T366 i L368. Različite nezavisne ideje pozitivnog dizajna testirane su in silico i određene dobre varijante upotrebom računarskih alata (AZ17-AZ62) eksperimentalno su potvrđene za ekspresiju i stabilnost kao što je opisano u Primerima 1-4. Videti Tabelu 4 za listu određenih heterodimernih konstrukata zasnovanih na Fc koji sadrže ovu strategiju dizajna, sa temperaturom topljenja od 70 °C ili više.

[0263] Fc varijanta AZ33 je primer razvoja Fc varijante pri čemu je Skela 1 modifikovana što je rezultovalo Skela 1a mutacijama kako bi se poboljšala stabilnost i čistoća. Ova Fc varijanta je dizajnirana na osnovu AZ8 sa ciljem da se poboljša hidrofobno pakovanje na pozicijama 392-394-409 i 366 kako bi se zaštitilo i hidrofobno jezgro i stabilizovala konformacija petlje 399-400. Ova Fc varijanta AZ33 heterodimera ima dve dodatne tačkaste mutacije različite od mutacija jezgra AZ8, K392M i T366I. Mutacije T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V se ovde označavaju kao "Skela 1a" mutacije. Mutacija K392M je dizajnirana da poboljša pakovanje u šupljini blizu pozicija K409 i F405A da zaštiti hidrofobno jezgro i stabilizuje konformaciju petlje 399-400 (videti Sliku 31). T366I je dizajnirana da poboljša hidrofobno pakovanje jezgra i da eliminiše formiranje homodimera T394W lanca (videti Sliku 29). Eksperimentalni podaci za AZ33 pokazali su značajno poboljšanu stabilnost u odnosu na druge Fc varijante negativnog dizajna kao što je AZ8 (Tm 68 °C) pri čemu AZ33 ima Tm od 74 °C i sadržaj heterodimera >98%. (Videti Sliku 25C).

Razvoj Fc varijanti upotrebom Skela 1 mutacija u fazi tri dizajna Fc varijantnih heterodimera

[0264] Iako AZ33 obezbeđuje značajno poboljšanje stabilnosti i specifičnosti (ili čistoće) u odnosu na inicijalnu početnu varijantu AZ8, naša analiza ukazuje da se dodatna poboljšanja stabilnosti Fc varijantnog heterodimera mogu postići dodatnim amino-kiselinskim modifikacijama upotrebom eksperimentalnih podatka AZ33 i prethodno opisanih postupaka dizajniranja. Različite ideje dizajna nezavisno su testirane za ekspresiju i stabilnost, ali nezavisne ideje dizajna su prenosive i najuspešniji heterodimer će sadržati kombinaciju različitih dizajna. Specifično, za optimizaciju pakovanja AZ8 mutacije u šupljini blizu K409-F405A-K392 su procenjene nezavisno od mutacija koje optimizuju pakovanje jezgra na ostacima L366T-L368. Ova dva regiona 366-368 i 409-405-392 su udaljena jedan od drugog i smatraju se nezavisnim. Fc varijanta AZ33 je, na primer, optimizovana za pakovanje na 409-405-392, ali ne na 366-368, pošto su ove mutacije optimizacije posebno procenjivane. Poređenje 366-368 mutacija sugeriše da T366L ima poboljšanu stabilnost u odnosu na T366 i takođe T366I, tačkastu mutaciju koja se upotrebljava u razvoju Fc varijante AZ33. Kao posledica toga, predstavljeni eksperimentalni podaci odmah sugerišu dodatnu optimizaciju

12

AZ33 introdukovanjem T366L umesto T366I, na primer. Prema tome, amino-kiselinske mutacije u CH3 domenu T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V se ovde označavaju kao "Skela 1b" mutacije.

[0265] Na sličan način su analizirani kompletni eksperimentalni podaci kako bi se identifikovale tačkaste mutacije koje se mogu upotrebljavati za dodatno poboljšanje trenutnog Fc varijantnog heterodimera AZ33. Ove identifikovane mutacije su analizirane pomoću prethodno opisanog računarskog pristupa i rangirane kako bi se dobila lista dodatnih Fc varijantnih heterodimera zasnovanih na AZ33 kao što je pokazano u Tabeli 6.

Referentni Primer 6: Racionalni dizajn Fc varijanti upotrebom Fc_CH3 projektovanja -Skela 2 (a i b) i razvoj AZ63-101 i AZ2199-AZ2524

[0266] Kako bi se poboljšala inicijalna faza negativnog dizajna Fc varijante AZ15 za stabilnost i čistoću, korišćene su prethodno opisane strukturne i računarske strategije (videti Sliku 24). Na primer, detaljna analiza strukture i funkcije Fc varijante AZ15 obezbedila je detaljno razumevanje za svaku od introdukovanih mutacija AZ15, L351Y_Y407A / E357L_T366A_K409F_T411N u poređenju sa humanim IgG1 divljeg tipa (WT) i ukazala je da su važne mutacije jezgra heterodimera L351Y_Y407A / T366A_K409F, dok E357L, T411N nisu bile direktno relevantne za formiranje i stabilnost heterodimera. Mutacije jezgra (L351Y_Y407A/ T366A_K409F) se ovde označavaju kao "Skela 2" mutacije. Analiza je dodatno otkrila da su važna ključna mesta interfejsa koja se gube u odnosu na formiranje homodimera divljeg tipa (WT) soni most D399-K409, vodonična veza Y407-T366 i pakovanje Y407-Y407. Detaljna analiza, obezbeđena u nastavku, opisuje kako smo poboljšali stabilnost naše originalne Fc varijante AZ15 i pozicije i amino-kiselinske modifikacije napravljene kako bi se postigle ove Fc varijante sa poboljšanom stabilnošću.

Razvoj Fc varijanti upotrebom Skela 2 mutacija i dodatni razvoj Skela 2a mutacija.

[0267] In silico analiza je ukazala na neoptimalno pakovanje prethodnih Fc varijanti dizajna, kao što su AZ15 mutacije K409F_T366A_Y407A i sveukupno smanjeno pakovanje hidrofobnog jezgra usled gubitka WT-Y407-Y407 interakcija. Ovde opisani heteromultimeri su dizajnirani sa optimalnijim pakovanjem. Neki od napora pozitivnog dizajna koji su ovde opisani bili su fokusirani na tačkaste mutacije kako bi se kompenzovali deficiti pakovanja u inicijalnoj Fc varijanti AZ15. Ciljani ostaci su uključivali pozicije T366, L351, i Y407.

Različite kombinacije ovih su testirane in silico, i najbolje rangirane Fc varijante upotrebom računarskih alata (AZ63-AZ70) eksperimentalno su potvrđene za ekspresiju i stabilnost kao što je opisano u Primerima 1-4.

[0268] Fc varijanta AZ70 je primer razvoja Fc varijante pri čemu je Skela 2 modifikovana što je rezultovalo Skela 2a mutacijama kako bi se poboljšala stabilnost i čistoća. Ova Fc varijanta je dizajnirana na osnovu AZ15 sa ciljem da se postigne bolje pakovanje u hidrofobnom jezgru kao što je prethodno opisano. Fc varijanta AZ70 ima iste Skela 2 mutacije jezgra (L351Y_Y407A/ T366A_K409F) kao što je prethodno opisano osim što je T366 mutiran u T366V umesto u T366A (SLIKA 33). L351Y mutacija poboljšava temperaturu topljenja 366A_409F/407A varijante sa 71,5 °C na 74 °C, i dodatna promena sa 366A na 366V poboljšava Tm na 75,5°C. (Videti AZ63, AZ64 i AZ70 u Tabeli 4, sa Tm od 71,5 °C, 74 °C i 75,5 °C, respektivno) Mutacije jezgra (L351Y_Y407A/ T366V_K409F) se ovde označavaju kao "Skela 2a" mutacije. Eksperimentalni podaci za Fc varijantu AZ70 pokazali su značajno poboljšanu stabilnost u odnosu na inicijalnu Fc varijantu negativnog dizajna AZ15 (Tm 71 °C) pri čemu AZ70 ima Tm od 75,5 °C i sadržaj heterodimera >90% (SLIKA 33 i 27).

Razvoj Fc varijanti upotrebom Skela 2 mutacija i dodatni razvoj Skela 2b mutacija.

[0269] Simulacija molekulske dinamike (MD) i analiza pakovanja pokazali su poželjnu 'otvoreniju' konformaciju petlje 399-400, što je verovatno bilo usled gubitka WT sonog mosta K409-D399. Ovo takođe rezultuje nezadovoljnim D399, koji je zauzvrat preferirao kompenzacionu interakciju sa K392 i indukovao 'otvoreniju' konformaciju petlje. Ova 'otvorenija' konformacija petlje rezultuje sveukupnim smanjenim pakovanjem i većom dostupnošću rastvaraču ostataka interfejsa jezgra CH3 domena, što je zauzvrat značajno destabilizovalo heterodimerni kompleks. Prema tome, jedan od ciljanih napora pozitivnog dizajna bio je povezivanje ove petlje u 'zatvoreniju' konformaciju nalik WT pomoću dodatnih tačkastih mutacija koje kompenzuju gubitak sonog mosta D399-K409 i interakcije pakovanja K409. Ciljani ostaci su uključivali pozicije T411, D399, S400, F405, N390, K392 i njihove kombinacije. Različito pakovanje, hidrofobne i elektrostatičke strategije pozitivnog projektovanja testirane su in silico u odnosu na prethodno navedene pozicije i najbolje rangirane Fc varijante određene upotrebom računarskih alata (AZ71-AZ101) eksperimentalno su potvrđene za ekspresiju i stabilnost kao što je opisano u Primerima 1-4.

[0270] Fc varijanta AZ94 je primer razvoja Fc varijante pri čemu je Skela 2 modifikovana što rezultuje Skela 2b mutacijama zajedno sa dodatnim tačkastim mutacijama kako bi se

12

poboljšala stabilnost i čistoća. Ova Fc varijanta je dizajnirana zasnovano na cilju povezivanja petlje 399-400 u 'zatvoreniju' konformaciju nalik WT i kompenzovanja gubitka D399-K409 sonog mosta kao što je prethodno opisano. Fc varijanta AZ94 ima četiri dodatne tačkaste mutacije na Skeli 2 (L351Y_Y407A/ T366A_K409F) i vraća L351Y na divlji tip L351 ostavljajući (Y407A / T366A_K409F) kao mutacije jezgra za ovu Fc varijantu. Mutacije jezgra Y407A / T366A_K409F se ovde označavaju kao "Skela 2b" mutacije. Četiri dodatne tačkaste mutacije AZ94 su K392E_T411E / D399R_S400R. Mutacije T411E / D399R su projektovane da formiraju dodatni soni most i kompenzuju gubitak K409 / D399 interakcije (SLIKA 34). Pored toga, ovaj soni most je dizajniran da spreči formiranje homodimera tako što ne favorizuje interakcije naelektrisanje-naelektrisanje u oba potencijalna homodimera. Namenjeno je da dodatne mutacije K392E / S400R formiraju još jedan soni most i time dodatno povežu petlju 399_400 u ꞌzatvorenijuꞌ konformaciju nalik WT (SLIKA 34). Eksperimentalni podaci za AZ94 pokazali su poboljšanu stabilnost i čistoću u odnosu na inacijalnu Fc varijantu negativnog dizajna AZ15 (Tm 71 °C, >90% čistoće) pri čemu Fc varijanta AZ94 ima Tm od 74 °C i sadržaj heterodimera ili čistoću >95%.

Razvoj Fc varijanti upotrebom Skela 2 mutacija u fazi tri dizajna Fc varijantnih heterodimera

[0271] Fc varijante AZ70 i AZ94 obezbeđuju značajno poboljšanje stabilnosti i čistoće u odnosu na inicijalne Fc varijante negativnog dizajna kao što je AZ15, ali naša analiza i poređenje AZ70 i AZ94 direktno ukazuju da se mogu napraviti neočekivana poboljšanja stabilnosti Fc varijantnog heterodimera sa dodatnim amino-kiselinskim modifikacijama. Na primer, Fc varijante AZ70 i AZ94 su dizajnirane da ciljaju dva različita neoptimizovana regiona u inicijalnoj varijanti AZ15, što je postignuto poboljšanjem pakovanja u hidrofobnom jezgru i pravljenjem mutacija izvan ostataka interfejsa jezgra što je rezultovalo dodatnim sonim mostovima i vodoničnim vezama za stabilizaciju konformacije petlje na pozicijama 399-401. Dodatne tačkaste mutacije Fc varijanti AZ70 i AZ94 su udaljene jedna od druge i stoga su nezavisne i prenosive na druge Fc varijante dizajnirane oko istih Skela 2 mutacija jezgra, uključujući 2a i 2b mutacije. Specifično, AZ70 nosi samo optimizovane mutacije jezgra L351Y_Y407A / T366A_K409F, ali ne i dodatne sone mostove, dok AZ94 sadrži četiri dodatne elektrostatičke mutacije (K392E_T411E / D399R_S400R), ali ima jednu mutaciju manje u interfejsu hidrofobnog jezgra (Y407A / T366A_K409F). Ove Skela 2b mutacije su manje stabilne od AZ70 (videti, na primer AZ63, koji ima ekvivalentne mutacije jezgra kao

12

AZ94 i Tm od 72 °C), ali su kompenzovane dodavanjem K392E_T411E / D399R_S400R mutacija. Predstavljeni eksperimentalni podaci o stabilnosti i čistoći ukazuju na to da bi kombinovanje mutacija AZ70, koje optimizuju hidrofobno jezgro, i elektrostatičkih mutacija AZ94 trebalo dodatno da poboljša stabilnost i čistoću Fc varijantnog heterodimera. Na sličan način su analizirani kompletni eksperimentalni podaci za Skela 2 Fc varijante (AZ63-101) kako bi se identifikovale tačkaste mutacije koje se mogu upotrebljavati za dodatno poboljšanje Fc varijantnih heterodimera AZ70 i AZ94. Ove identifikovane mutacije su dodatno analizirane pomoću prethodno opisanog računarskog pristupa i rangirane kako bi se dobila lista dodatnih Fc varijantnih heterodimera zasnovanih na AZ70 i AZ94 kao što je pokazano u Tabeli 7.

Primer 7: Efekat heterodimernog CH3 na FcgR vezivanje

[0272] Kao prototipski primer heterodimerne Fc aktivnosti sa FcgR, testirane su dve varijante antitela sa heterodimernim Fc regionom A:K409D_K392D/B:D399K_D356K (Kontrola 1 (het 1 na Slici 35)) i A:Y349C_T366S_L368A_Y407V/B:S354C_T366W (Kontrola 4 (het 2 na Slici 35)) sa Her2 vezujućim Fab kracima u SPR testu opisanom u Primeru 4 za FcgR vezivanje. Kao što je pokazano na Slici 35, uočavamo da oba heterodimerna Fc regiona vezuju različite Fcgama receptore sa istom relativnom jačinom kao Fc region IgG1 divljeg tipa, ali sveukupno, heterodimerni Fc region vezuje svaki od FcgR nešto bolje nego antitelo divljeg tipa. Ovo ukazuje da mutacije na CH3 interfejsu Fc mogu uticati na jačinu vezivanja Fc regiona za Fcgama receptore preko CH2 domena kao što je uočeno u našim simulacijama i analizama molekulske dinamike.

Primer 8: Efekat asimetričnih mutacija u CH2 heterodimernog Fc na FcgR vezivanje

[0273] Poznato je da mutacija serina na poziciji 267 u CH2 domenu Fc regiona u asparaginsku kiselinu (S267D) poboljšava vezivanje za Fcgama IIbF, IIbY & IIaR receptore kada se introdukuje na homodimerni način u dva lanca CH2 domena. Ova mutacija se može introdukovati samo na jedan od CH2 domena u heterodimernom Fc molekulu kako bi se postigla otprilike polovina poboljšanja jačine vezivanja u odnosu na to kada se ova mutacija introdukuje u homodimerni CH2 Fc kao što ukazuju podaci predstavljeni na Slici 36A. S druge strane, E269K mutacija u homodimernom CH2 domenu Fc sprečava vezivanje Fc regiona za FcgR. Predstavljamo šemu za poboljšanu manipulaciju jačinom vezivanja Fc

12

regiona za FcgReceptore pomoću asimetrične introdukcije ovih povoljnih i nepovoljnih mutacija na jedan od dva lanca u CH2 domenu Fc. Introdukcija E269K mutacije na asimetričan način na jedan CH2 lanac u heterodimernom Fc deluje kao pokretač polarnosti blokiranjem vezivanja FcgR na strani gde je prisutan, dok dozvoljava da druga strana Fc interaguje sa FcgR na normalan način. Rezultati iz ovog eksperimenta su predstavljeni na Slici 36A. Mogućnost da se selektivno izmeni jačina vezivanja putem oba lanca Fc na nezavisan način obezbeđuje povećanu mogućnost manipulacije jačinom vezivanja i selektivnošću između Fc i FcgReceptora. Stoga, takav asimetrični dizajn mutacija u CH2 domenu omogućava nam da introdukujemo strategije pozitivnog i negativnog dizajna favorizujući ili nefavorizujući određene modele vezivanja, obezbeđujući veću priliku za introdukovanje selektivnosti.

[0274] U narednom eksperimentu, izmenili smo profil selektivnosti baznog Fc mutanta S239D_D265S_I332E_S298A koji pokazuje povećanu jačinu vezivanja za Fcgama IIIaF i IIIaV receptore dok nastavlja da pokazuje slabije vezivanje za Fcgama IIaR, IIbF i IIbY receptore. Ovo je pokazano na profilu vezivanja pokazanom na Slici 36B. Introdukovanjem asimetričnih mutacija E269K u lanac A i izbegavanjem I332E mutacije u lancu B, u mogućnosti smo da generišemo novi profil vezivanja FcgR koji dodatno slabi vezivanje IIa i IIb receptora i čini Fc specifičnijim za vezivanje IIIa receptora.

[0275] U sledećem primeru pokazanom na Slici 36C, asimetrične mutacije su istaknute u odnosu na homodimerni Fc koji uključuje mutaciju S239D/K326E/A330L/I332E/S298A u CH2 domenu. U odnosu na Fc IgG1 divljeg tipa, ova varijanta pokazuje povećano vezivanje za IIIa receptor ali takođe vezuje IIa i IIb receptore nešto jače nego Fc divljeg tipa. Introdukcija ovih mutacija na asimetričan način A:S239D/K326E/A330L/I332E i B:S298A uz redukovanje IIIa vezivanja, takođe povećava vezivanje IIa/IIb receptora, uz gubitak selektivnosti u procesu. Introdukovanjem asimetrične mutacije E269K u ovu heterodimernu varijantu, tj. A:S239D/K326E/A330L/I332E/E269K i B:S298A, vezivanje IIa/IIb je redukovano na nivoe divljeg tipa. Ovo naglašava činjenicu da upotreba asimetričnih mutacija u CH2 domenu Fc može da obezbedi značajnu priliku da se dizajnira poboljšana FcgamaR selektivnost.

[0276] Reagensi korišćeni u primerima komercijalno su dostupni ili se mogu pripremiti upotrebom komercijalno dostupnih instrumenata, postupaka, ili reagensa poznatih u struci. Prethodni primeri ilustruju različite aspekte pronalaska i praksu postupaka pronalaska.

Primer 9: FcRn vezivanje određeno pomoću SPR.

12

[0277] Vezivanje za FcRn je određeno pomoću SPR u dve različite orijentacije.

1. Protok heterodimerne varijante preko imobilizovanog FcRn: U ovom eksperimentu, površine visoke gustine od približno 5000 RU napravljene su upotrebom standardnog NHS/EDC kuplovanja. 100 nM WT i svake varijante je injektirano u triplikatu pri 50 μl min tokom 120 s sa disocijacijom od 600 s u MES pH6 tekućem puferu.

2. Protok FcRn preko indirektno uhvaćenih heterodimernih varijanti: U ovom SPR eksperimentu, površina kozjeg anti-humanog IgG upotrebljena je za indirektno hvatanje antitela (približno 400 RU svako), nakon čega je usledila injekcija 3-struke serije razblaženja FcRn (6000 nM visoka konc.). Tekući pufer je bio 10 mM MES / 150 mM NaCl / 3,4 mM EDTA / 0,05 Tween20 pri pH6. Nije bilo značajnog vezivanja FcRn za kozju poliklonalnu površinu. Sve varijante pokazuju senzograme slične WT. Tabela 8 ispod pokazuje Kd određenu pomoću indirektne imobilizacije sa protokom FcRn (2.).

Tabela 8: Kd određena pomoću indirektne imobilizacije sa protokom FcRn

12

Primer 10: Bispecifično vezivanje Fc heterodimera koji je ovde opisan

[0278] Bispecifično vezivanje je demonstrirano upotrebom Fc heterodimera sa mutacijama Lanac-A: L351Y_F405A_Y407V, Lanac-B: T366L_K392M_T394W i anti-HER2 i anti-HER3 scFv fuzionisanim na N-terminus lanca-A i lanca-B Fc heterodimera. Rezultujuće varijante bispecifične HER2/HER3 varijante i dve monovalentne-monospecifične HER2, HER3 varijante su ilustrovane na Sl. 40A. Kako bi se testiralo bispecifično vezivanje, opseg doza dve monovalentne varijante (anti-HER2 monovalentna i anti-HER2 monovalentna, ilustrovane na Sl.40A) i bispecifični anti-HER2/HER3 heterodimer je inkubiran sa MALME-M3 ćelijama melanoma nakon čega je usledila FACS analiza za određivanje prividnog afiniteta vezivanja svakog molekula. (Pokazano na Sl.40B) Test sistem je postavljen u skladu sa protokolima opisanim u: "Antitumor activity of a novel bispecific antibody that targets the ErbB2/ErbB3 oncogenic unit and inhibits heregulin-induced activation of ErbB3", McDonagh CF et al., Mol Cancer Ther.11(3):582-93 (2012).

Primer 11: Ekspresija i prečišćavanje bivalentnih monospecifičnih antitela sa heterodimernim Fc domenima i kvantifikacija čistoće pomoću LC/MS

[0279] Heterodimerne varijante AZ133 (A: L351Y/F405A/Y407V, B: T366L/K392M/T394W), AZ138 (A: F405A/Y407V, B: T366L/K392M/T394W), AZ3002 (A: T350V/L351Y/F405A/Y407V, B: T350V/T366L/K392M/T394W), AZ3003 (A: T350V/L351Y/F405A/Y407V, B: T350V/T366L/K392L/T394W), i drugih AZ konstrukata AZ3000-AZ3021 generisane su i prečišćene kao što je opisano u Primerima 1 i 2. Kako bi se procenila robusnost formiranja heterodimera i efekat viška jednog od lanaca heterodimera na čistoću heterodimera, odabrani heterodimeri su prolazno eksprimirani upotrebom 3 različita odnosa DNK dva teška lanca A i B (npr. odnosi A:B=1:1,5; 1:1; 1,5:1).

[0280] Geni koji kodiraju teške i lake lance heterodimera konstruisani su putem sinteze gena upotrebom kodona optimizovanih za humanu/sisarsku ekspresiju, kao što je detaljno opisano u Primeru 1. Fab sekvence su generisane iz poznatog Her2/neu vezujućeg Ab (Carter P. et al. (1992) Humanization of an anti P185 Her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci 89, 4285) i Fc je bio IgG1 izotip (SEQ ID NO:1). Varijanta je eksprimirana prolaznom koekspresijom kao što je opisano u Primerima 1-2 upotrebom 3 različita odnosa teškog lanca-A prema teškom lancu-B od 1:1,5, 1:1 i 1,5:1. Uzorci su prečišćeni protein-A

1

afinitetnom hromatografijom i preparativnom gel filtracijom (videti Primer 2 za detalje). Prečišćeni uzorci su deglikozilovani sa PNGaseF preko noći na 37 °C. Pre MS analize, uzorci su injektirani na Poros R2 kolonu i eluirani u gradijentu sa 20-90% ACN, 0,2% FA u 3 minuta. Pik LC kolone je analiziran sa LTQ-Orbitrap XL masenim spektrometrom (napon konusa: 50 V' tubno sočivo: 215 V; FT rezolucija: 7,500) i integrisan sa Promass softverom za generisanje profila molekulske težine.

[0281] Relativne visine pikova za heterodimer i homodimere su upotrebljene za procenu čistoće heterodimera (videti Sliku 39).

Primer 12: Kristalna struktura heteromultimera AZ3002 i AZ3003.

[0282] Heterodimerni Fc konstrukti AZ3002 i AZ3003 su prolazno eksprimirani u CHO i prečišćeni do homogenosti pomoću pA i SEC. Prečišćeni Fc heterodimeri su kristalizovani na 18 °C posle -24 sata inkubacije putem postupka difuzije pare u obliku viseće kapljice u odnosu od 2:1 iznad rastvora matične tečnosti sastavljene od 5% (zapr./zapr.) etilen glikola, 18% (tež./zapr.) polietilen glikola 3350, i 0,15 M amonijum jodida uz pomoć mikrozasejavanja. Kristali su kriozaštićeni povećanjem koncentracije etilen glikola na 30% (zapr./zapr.) i zatim brzo ohlađeni u tečnom azotu. Podaci o difrakciji sa oba kristala su prikupljeni na 100 K, upotrebom oscilacije od 0,5 stepeni za ukupno 200 stepeni, i obrađeni sa XDS.<1>Struktura AZ3002 je rešena putem molekulske zamene sa Phaser upotrebom PDBID: 2J6E kao upitnog proteina.<2>Struktura AZ3002 je zatim upotrebljena za rešavanje AZ3003 na sličan način. Kako bi se akomodirao perfektan blizanac, recipročni odnos asimetričnog heterodimera prisutnog u kristalografskoj asimetričnoj jedinici (npr. zauzetost molekula A može se podjednako opisati molekulom B i vice versa), dva moguća heterodimerna para, svaki sa 0,5 atomske zauzetosti, modelovana su sa Coot, rafinisana sa Refmac.<3,4>Obrada podataka o difrakciji i statistika rafinisanja strukture prikazani su u Tabeli 9.

1 1

12

[0283] Superponiranje kristalnih struktura je pokazano na Slici 42. Kristalna struktura AZ3002 i AZ3003 heterodimera pokazuje veoma dobru saglasnost sa in silico modelima (RMSD svi atomi=0,706 Å, RMSD okosnica=0,659 Å za CH3 domen) i potvrđuje predviđene konformacije kritičnih ostataka pakovanja jezgra.

Primer 13: Analiza glikozilacije AZ3003

[0284] AZ3003 heterodimer je eksprimiran i prečišćen kao što je opisano u Primeru 11. Glikani su analizirani sa GlykoPrep™ Rapid N-Glycan Preparation sa InstantAB™ (Prozyme) upotrebom standardnog protokola proizvođača.

[0285] Rezultati su pokazani na Slici 43 i ilustruju da AZ3003 ima tipičan obrazac glikozilacije.

Primer 14: Procena stabilnosti AZ3003 u uslovima prisilne degradacije

1

[0286] Stabilnost AZ3003 heterodimera je procenjena pomoću inkubacije u uslovima prisilne degradacije. Stabilnost mAb u uslovima prisilne degradacije može biti dobra procena za dugotrajnost i stabilnost formulacije.

[0287] Prečišćeni uzorak heterodimera (ekspresija i prečišćavanje kao što je opisano u Primeru 11) je koncentrovan do 100 mg/ml bez znakova agregacije. Uzorak je razblažen u odgovarajućem puferu i procenjen u uslovima prisilne degradacije kao što je opisano u Tabeli 10 u nastavku. Tretirani uzorci su analizirani pomoću SDS-PAGE i HPLC-SEC.

[0288] SDS-PAGE je izvedena pod redukcionim (R) i neredukcionim (NR) uslovima sa prefabrikovanim gradijent gelovima kupljenim od LONZA. Proteinske trake su vizuelizovane bojenjem sa Coomassie Brilliant Blue G-250.

[0289] Analitička SEC-HPLC je izvedena upotrebom bilo Phenomenex, BIOSEP-SEC-S4000 ili BioRad Bio-Sil TSK 4000 HPLC kolone pri stopi protoka od 0,8 ml/min sa 10 mM natrijum fosfatom, 0,14 M NaCl, 10% izopropanolom kao tekućim puferom. Ovo je omogućilo kvantifikaciju potencijalno viših i nižih molekulskih sa vrstama.

Tabela 10: Uslovi prisilne degradacije upotrebljeni za degradaciju AZ3003

1 4

[0290] Rezultati su pokazani na Slici 44 i demonstriraju da je AZ3003 heterodimer stabilan i da pokazuje profil stabilnosti koji je u skladu sa profilom mAb industrijskog standarda.

Primer 15: Procena nizvodnog prečišćavanja AZ3003

[0291] Procena proizvodnosti AZ3003 izvedena je kako bi se procenilo ponašanje AZ3003 upotrebom šeme industrijski standardnog procesa prečišćavanja antitela kao što je pokazano na Slici 45. Ovaj proces uključuje platformu u koracima na tri kolone koja sadrži protein A afinitetnu hromatografiju za hvatanje proizvoda, praćenu katjonskoizmenjivačkom (CEX) hromatografijom za uklanjanje agregata, spranog proteina A i HCP i na kraju, anjonskoizmenjivačku (AEX) hromatografiju u protočnom režimu za hvatanje virusa, DNK i negativno naelektrisanih kontaminanata. Ova procena se upotrebljava za identifikaciju potencijalnih problema u proizvodnji (npr. stabilnost procesa, stabilnost proizvoda i kvalitet) sa kandidatom(ima) za lek u ranoj fazi istraživanja/razvoja.

[0292] Tokom procene proizvodnosti, hromatografsko ponašanje, stabilnost proteina i kvalitet proizvoda procenjeni su upotrebom industrijski standardnog procesa prečišćavanja pokazanog na Slici 46. Tabela 11 (u nastavku) navodi glavne kriterijume koji su upotrebljeni za procenu, tj. prinos koraka, sadržaj agregata veće molekulske težine (HMW), i zapremina eluiranja.

1

Koraci sa visokim prinosom i male zapremine eluiranja tokom prečišćavanja ukazuju na stabilan protein koji se dobro ponaša. Praćenje sadržaja HMW i njegovo uklanjanje tokom prečišćavanja je od vitalnog značaja pošto prisustvo proteinskih agregata (HMW vrste) u krajnjem proizvodu može dovesti do smanjene aktivnosti, imunogenih reakcija kod pacijenta, i/ili formiranja čestica tokom roka trajanja farmaceutskog proizvoda. Ekspresija Mab sa minimalnim inicijalnim sadržajem HMW (<4%) je poželjna, pošto će visoki nivoi agregata zahtevati dodatne korake prečišćavanja za uklanjanje, što povećava vreme i troškove proizvodnje.

Tabela 11: Glavni kriterijumi koji se upotrebljavaju za procenu proizvodnosti.

[0293] Standardni industrijski procesi prečišćavanja upotrebljeni su kako bi se proverila stabilnost, hromatografsko ponašanje i kvalitet proizvoda AZ3003.

1.1 Protein A hvatanje

1

[0294] CM koji eksprimira AZ3003 je filtriran na 0,22 µm upotrebom filtera na vrhu boce (PES) iz Millipore i nanet na Mab Select SuRe (1,6 x 25 cm) kolonu ekvilibrisanu sa 5 CV 20 mM Tris-HCl, 0,14 M NaCl, pH 7,5. Posle punjenja, kolona je intenzivno isprana puferom za ekvilibraciju sve dok A280 apsorbanca nije dostigla stabilnu početnu vrednost. AZ3003 je eluiran sa 0,1 M acetatnim puferom, pH 3,6 i odmah titriran do pH 5,2 dodavanjem 1/10 zapremine 1 M tris baze.

[0295] Posle koraka eluiranja, kolona je isprana sa 0,1 M acetatom, pH 3,0. SDS-PAGE analiza pokazuje da je svo Mab vezano za kolonu pošto nije detektovano Mab u koloni FT. Visoko prečišćeno Mab je detektovano u pH 3,6 puferu za eluiranje. Inicijalni korak hvatanja i prečišćavanja upotrebom protein A afinitetne hromatografije daje prinos proizvoda sa >90% čistoće.

1.2 Studija zadržavanja na niskoj pH

[0296] Sledeći korak u nizvodnom procesu je zadržavanje na niskoj pH, koji se izvodi kako bi se inaktivirali virusi. Posle eluiranja sa Protein A kolone, Mab (-10 mg/ml, pH 4,0) je titrirano do pH 3,6 sa 10% sirćetnom kiselinom i inkubirano na RT uz mešanje tokom 90 min. Stabilnost AZ3003 prema tretmanu sa niskom pH je procenjena pomoću SDS-PAGE, SEC-HPLC i merenja zamućenosti na A410 nm. AZ3003 je dobro tolerisao korak zadržavanja na niskoj pH, ne pokazujući promene u SDS-PAGE ili SEC-HPLC. Pored toga, posle 90-min inkubacije nije detektovano povećanje zamućenosti, što ukazuje na odsustvo formiranja nesolubilnih agregata koji mogu biti problematični tokom prečišćavanja (tj. začepljenje filtera i kolona u procesu, gubitak proizvoda). Ovi podaci pokazuju da je AZ30003 stabilan na korak zadržavanja na niskoj pH.

1.3 Katjonskoizmenjivačka hromatografija (CEX)

[0297] CEX je istražena kao drugi korak u procesu prečišćavanja. Procenjene su dve smole: Fractogel EMD SO3 (M) iz Merk/Millipore i SP HP iz GE Lifesciences.

[0298] Fractogel EMD SO3 (M), pH 5,2: Mab Select SuRe pul (35 mg) je titriran do pH 5,2 dodavanjem 10% (zapr./zapr.) 1 M tris baze i zatim, 2 struko razblažen puferom za ekvilibraciju, 20 mM acetatom, pH 5,2. Ovaj pul je nanet na Fractogel EMD SO3 (M) kolonu ekvilibrisanu sa 5 CV 20 mM acetata, pH 5,2. Kolona je isprana puferom za ekvilibraciju sve dok A280 apsorbanca nije dostigla stabilnu početnu vrednost. Mab je eluirano sa kolone sa

1

linearnim gradijentom soli od 0 do 600 mM NaCl, pH 5,2 preko 10 CV. Preostali kontaminanti su uklonjeni sa kolone sa 20 mM acetatom, 1 M NaCl, pH 5,2, nakon čega je usledio tretman sa 1 N NaOH. SDS-PAGE i SEC-HPLC analize izvedene su kako bi se pratili nivoi HMW i njihovo uklanjanje iz glavne frakcije Mab na ovoj koloni. Prinos koraka (na osnovu A280 nm očitavanja) je bio 73%.

[0299] SP HP, pH 5,2: Mab Select SuRe pul (50 mg) je titriran do pH 5,2 dodavanjem 10% (zapr./zapr.) 1 M tris baze, i zatim jednako razblažen puferom za ekvilibraciju, 20 mM acetatom, pH 5,2. Ovaj pul je nanet na SP HP kolonu (1,6 x 2,5 cm/5 ml) ekvilibrisanu sa 5 CV 20 mM acetata, pH 5,2 (Sl.21). Kolona je isprana puferom za ekvilibraciju sve dok A280 apsorbanca nije dostigla stabilnu početnu vrednost. Mab je eluirano sa kolone sa linearnim gradijentom soli od 0 do 600 mM NaCl, pH 5,2 preko 10 CV. Preostali kontamainanti su uklonjeni sa kolone sa 20 mM acetatom, 1 M NaCl, pH 5,2, i zatim sa 1 N NaOH. SDS-PAGE i SEC-HPLC analize izvedene su kako bi se pratili nivoi agregacije i njihovo razdvajanje na ovoj koloni.

[0300] Prinos koraka (na osnovu A280 nm očitavanja) je bio 87%.

1.4 Anjonskoizmenjivačka hromatografija (AEX)

[0301] Anjon-izmenjivači (npr. kvaternarni amin, Q) se široko upotrebljavaju u prečišćavanju monoklonalnih antitela. AEX medijum radi u režimu protoka, pri čemu se Mab pojavljuje u FT dok dozvoljava zadržavanje HCP, DNK, virusa i endotoksina.

[0302] Fractogel SO3 M pul pH 5,2 (25 mg) je titriran do pH 7,0 sa 1 M tris bazom i nanet na 1 ml HiTrap Q FF ekvilibrisanu sa 5 CV 10 mM fosfata, pH 7,0. Kolona je isprana puferom za ekvilibraciju. Međutim, u ovom slučaju nije postignuta stabilna početna vrednost. Kao posledica toga kolona je isprana sa PBS kako bi se eluiralo bilo koje zaostalo vezano Mab. Zatim, kolona je isprana sa 10 mM fosfata, 1 M NaCl, pH 7,0 kako bi se uklonili svi vezani kontaminanti. Ovaj korak zahteva dodatnu optimizaciju kako bi sva Mab frakcija bila prisutna u protoku. Prinos koraka (na osnovu A280 nm očitavanja) bio je 82% sa procenjenom čistoćom >98% pomoću SEC-HPLC.

1.5 SDS-PAGE analiza nizvodnog prečišćavanja

[0303] SDS-PAGE (Sl.35) je izvedena na eluatima iz svakog koraka prečišćavanja kako bi se pratilo uklanjanje kontaminanata tokom procesa i kako bi se procenili kvalitet i čistoća

1

krajnjeg proizvoda. Analiza gela je pokazala očekivani obrazac migracije za Mab pod neredukcionim i redukcionim uslovima. Gel poređenje pulova sa dve CEX smole ne pokazuje veće razlike u profilu proizvoda. Krajnji pulovi iz CEX, CHT i HIC pH 5,0 i pH 7,0 svi izgledaju slično u pogledu čistoće i kontaminirajućih traka.

1.7 Procena čistoće pomoću SEC-HPLC

[0304] Prečišćeni AZ3003 posle koraka hromatografije na tri kolone Protein A; CEX; AEX režim protoka; procenjen je pomoću SEC (isključivanje po veličini)-HPLC pod nativnim uslovima (Slika 46).

[0305] AZ3003 pokazuje jedan pik koji eluira unutar očekivanog regiona od 150 kDa za nativni IgG1. Čistoća je procenjena na >98%.

1.8 Prinosi procesa za prečišćavanje AZ3003

[0306] Prinosi procesa su izračunati za nizvodni proces prečišćavanja i navedeni na Slici 46. Prinosi koraka za AZ3003 bili su tipični za IgG prečišćen upotrebom industrijski standardnog procesa prečišćavanja na tri kolone.

[0307] AZ3003 je uspešno prečišćen iz CM upotrebom industrijski standardnog procesa prečišćavanja (protein A afinitetna smola, CEX, praćeno sa AEX).

[0308] Ovi rezultati su ukazali da je AZ3003 uporediv sa standardnim mAb u ukupnom prinosu izdvajanja (videti Kelley B. Biotechnol. Prog. 2007, 23, 995-1008) i minimalno uočenoj agregaciji. AZ3003 je takođe procenjen u odnosu na zadržavanje na niskoj pH vrednosti & CHT (keramički hidroksiapatit) i HIC (hromatografija hidrofobne interakcije) (Phenyl HP pH 5 i pH 7) uz dobro izdvajanje bez agregata. Slika 46 ilustruje da je vodeći heterodimer uspešno prečišćen iz CM upotrebom industrijski standardnog procesa prečišćavanja (protein A afinitetna smola, CEX, praćeno sa AEX).

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt naznačen time što sadrži modifikovani heterodimerni CH3 domen, modifikovani heterodimerni CH3 domen sadrži:

pri čemu prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama L351, F405 i Y407, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije na pozicijama T366, K392 i T394 u poređenju sa CH3 domenom sekvence teškog lanca IgG1 kao što je izneto u Tabeli B,

pri čemu amino-kiselinska supstitucija na poziciji L351 je L351Y, aminokiselinska supstitucija na poziciji F405 je F405A, amino-kiselinska supstitucija na poziciji Y407 je Y407V, amino-kiselinska supstitucija na poziciji T366 je T366I ili T366L, amino-kiselinska supstitucija na poziciji K392 je K392L ili K392M, i amino-kiselinska supstitucija na poziciji T394 je T394W; dodatno pri čemu najmanje jedan od prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom sadrži T350V supstituciju;

dodatno pri čemu heterodimerni CH3 domen ima temperaturu topljenja (Tm) od najmanje 74 °C i čistoću od najmanje 95%;

2. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što:

a) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije L351Y, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T366L, K392M, i T394W; ili b) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije L351Y, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T366L, K392L, i T394W; ili c) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije L351Y, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T366I, K392M, i T394W; ili d) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije L351Y, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T366I, K392L, i T394W.

3. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačen time što prvi i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom svaki sadrži T350V supstituciju.

4. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što najmanje jedan od prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku supstituciju na poziciji S400, poželjno S400Z, pri čemu je Z pozitivno naelektrisana amino-kiselina ili negativno naelektrisana aminokiselina.

5. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačen time što prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku supstituciju koja je S400E ili S400R.

6. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili 5, naznačen time što najmanje jedan od prvog i drugog polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku supstituciju na poziciji N390, poželjno N390Z, pri čemu je Z pozitivno naelektrisana amino-kiselina ili negativno naelektrisana aminokiselina.

7. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačen time što prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku supstituciju koja je S400E i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku supstituciju koja je N390R.

8. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 7, naznačen time što jedan od polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku supstituciju Q347R i drugi od polipeptida sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinsku supstituciju K360E.

9. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što:

a) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, L351Y, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, T366L, K392M, i T394W; ili

b) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, L351Y, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, T366L, K392L, i T394W; ili

c) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, L351Y, S400R, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, T366L, K392M, i T394W; ili

d) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, L351Y, S400E, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, T366L, N390R, K392M, i T394W; ili

e) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, L351Y, S400E, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, L351Y, T366L, N390R, K392M, i T394W; ili

f) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije Q347R, T350V, L351Y, S400E, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, K360E, T366L, N390R, K392M, i T394W; ili

g) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, L351Y, S400R, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, T366L, N390D, K392M, i T394W; ili

h) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, L351Y, S400R, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, T366L, N390E, K392M, i T394W; ili

i) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, L351Y, S400E, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, T366L, N390R, K392L, i T394W; ili

ili

j) prvi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije Y349C, T350V, L351Y, S400E, F405A, i Y407V, i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom sadrži amino-kiselinske supstitucije T350V, S354C, T366L, N390R, K392M, i T394W.

10. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 9, naznačen time što je heteromultimerni Fc konstrukt terapijsko antitelo koje sadrži varijabilni domen ili njegov fragment, pri čemu varijabilni domen ili njegov fragment specifično vezuju najmanje jedan antigen.

11. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa patentnim zahtevom 10, naznačen time što je najmanje jedan antigen kancerski antigen.

12. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 11, naznačen time što je heteromultimerni Fc konstrukt bispecifično antitelo ili multispecifično antitelo.

13. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 12, naznačen time što je heteromultimerni Fc konstrukt konjugovan za terapijski agens.

14. Kompozicija koja sadrži izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 13 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

15. Sisarska ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 12.

16. In vitro postupak ekspresije izolovanog heteromultimera prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, naznačen time što se prvi i drugi polipeptid sa modifikovanim CH3 domenom koeksprimiraju iz jedne ćelije, poželjno iz sisarske ćelije.

17. Izolovani heteromultimerni Fc konstrukt u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 12 do 13, za upotrebu u lečenju bolesti, poremećaja ili infekcije kod pacijenta kome je to potrebno.