KR20160083949A - Egfr 및/또는 her2를 표적화하는 1가 항원 결합 작제물 및 이의 용도 - Google Patents

Egfr 및/또는 her2를 표적화하는 1가 항원 결합 작제물 및 이의 용도 Download PDF

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피터 윙 유 찬
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자임워크스 인코포레이티드
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Abstract

EGFR 및/또는 HER2를 표적화하는 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 제공된다. 1가 항원 결합 작제물은 중쇄 가변 도메인을 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 항원 결합 폴리펩타이드는 EGFR 및/또는 HER2; 및 이종이합체 Fc 도메인에 특이적으로 결합하며, Fc 도메인은 적어도 2개의 CH3 도메인을 포함하고, Fc 도메인은, 링커와 함께 또는 링커 없이, 항원 결합 폴리펩타이드에 커플링된다. 작제물을 제조하는 방법 및 작제물을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

EGFR 및/또는 HER2를 표적화하는 1가 항원 결합 작제물 및 이의 용도{MONOVALENT ANTIGEN BINDING CONSTRUCTS TARGETING EGFR AND/OR HER2 AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 11월 13일에 출원된 미국 가출원 제61/903,825호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)의 이익을 주장한다.
서열 목록
본원은 EFS 웹을 통해 제출된 서열 목록을 함유하고, 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다. 20XX년 XX월에 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 XXXXXPCT_sequencelisting.txt이고, 크기가 X,XXX,XXX 바이트이다.
인간 표피 성장 인자 수용체(human epidermal growth factor receptor: HER-1 또는 Erb-B1로도 공지됨)는 c-erbB 원암유전자에 의해 코딩된 170kDa의 막관통 수용체이고, 고유 타이로신 키나제 활성을 나타낸다(Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996); Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스 목록 P00533은 EGFR의 서열을 제공한다. 스위스프로트 데이터베이스 목록 번호 P00533-1, P00533-2, P00533-3 및 P00533-4에 의해 확인된 것(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는, EGFR의 아이소폼 및 변이체(예를 들어, 대안적인 RNA 전사체, 절두된 버전, 다형 등)가 또한 존재한다. 표피 성장 인자(epidermal growth factor: EGF), 형질전환 성장 인자-알파(transforming growth factor-alpha: TGF-알파), 암피레굴린, 헤파린 결합 EGF(heparin-binding EGF: hb-EGF), 베타셀룰린 및 에피레굴린을 포함하는 EGFR은 리간드에 결합하는 것으로 공지되어 있다(Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Mendelsohn and Baselga, Oncogene 19:6550-6565 (2000)). EGFR은 세포 증식, 분화, 세포 생존, 아폽토시스, 혈관형성, 분화유도(mitogenesis) 및 전이를 조절하는 신호 전달 경로의 활성화(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 타이로신-키나제 매개 신호 전달 경로를 통해 수많은 세포 과정을 조절한다(Atalay et al, Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003); Tsao and Herbst, Signal 4:4-9 (2003); Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Modjtahedi et al, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)).
EGFR의 과발현은 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 대장, 전립선 및 신장의 암을 포함하는 수많은 인간 악성 병증에서 보고되었다. (Atalay et al, Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003); Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Modjtahedi et al, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). 많은 이 병증에서, EGFR의 과발현은 환자의 불량한 예후와 상관되고 연관된다. (Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Modjtahedi et al, Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). EGFR은, 악성 세포에서보다 일반적으로 더 낮은 수준이지만, 정상 조직, 특히 피부, 간 및 위장관의 상피 조직의 세포에서 또한 발현된다(Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)).
EGFR을 표적화하고 EGFR 신호전달 경로를 차단하는 다양한 전략이 보고되었다. 게피티닙, 에를로티닙 및 CI-1033과 같은 소분자 타이로신 키나제 저해제는 세포내 타이로신 키나제 구역에서 EGFR의 자가 인산화를 차단하여서, 하향 신호전달 사건을 저해한다(Tsao and Herbst, Signal 4:4-9 (2003)). 다른 한편, 단일클론 항체는 EGFR의 세포외 부분을 표적화하고, 이것은 리간드 결합을 차단하고 이에 의해 세포 증식과 같은 하향 사건을 저해한다(Tsao and Herbst, Signal 4:4-9 (2003)).
2개 이상의 상이한 종(예를 들어, 마우스 및 인간)으로부터의 항체의 부분을 포함하는 키메라 항체는 "접합된" 항체에 대한 대안으로 개발되었다. 예를 들어, 미국 특허 제5,891,996호(Mateo de Acosta del Rio 외)는 EGFR에 대한 마우스/인간 키메라 항체인 R3을 기술하였고, 미국 특허 제5,558,864호는 쥣과 항-EGFR MAb 425의 키메라 및 인간화 형태의 생성을 기술하였다. 또한, 얼비툭스(Erbitux)(상표명)는, 다양한 인간 이종이식 모델에서 항종양 효율을 나타내는 것으로 보고된, 키메라 마우스/인간 항-EGFR 단일클론 항체이다(마우스 M225 단일클론 항체에 기초하여, 인간 임상 실험에서 HAMA 반응을 발생시킴). (Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). 얼비툭스(상표명)의 효율은 EGFR 신호전달 경로, 및 가능하게는 항체 의존적 세포 독성(antibody-dependent cellular toxicity: ADCC) 활성의 증가에 의해 조절된 세포 사건의 저해를 포함하는 여러 기전에 기인한다(Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). 얼비툭스(상표명)는 방사선치료와 화학치료의 조합을 포함하여 임상 실험에서 또한 사용되었다 (Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). 압제닉스, 인코포레이션(Abgenix, Inc.)(캘리포니아주 프레몬트)은 암 치료에 대해 ABX-EGF를 개발하였다. ABX-EGF는 완전 인간 항-EGFR 단일클론 항체이다. (Yang et al., Crit. Rev. Oncol./Hematol. 38:17-23 (2001)). 미국 특허 제8,097,436호는 EGFR 표적화 항체의 추가의 예를 제공한다.
항-EGFR 단일클론 항체 및 다른 EGFR 저해제에 의한 치료는 피부 독성의 높은 이환율과 연관된 것으로 공지되어 있고, 이것은 표피, 피지선 및 모발 모낭 상피의 정상 조직에서 EGFR의 발현으로 인한 것으로 생각된다. 가장 흔히 보고된 부작용은 주로 90%까지의 환자에서 보이는 지루성 부위에서 구진 농포형 홍반이고, 이들 중 30%는 의학 중재를 요하도록 충분히 중증이다. 몇몇 경우에, 피부학적 부작용은 항-EGFR 단일클론에 의한 치료가 중지되거나, 감소한 용량으로 계속되거나, 중단될 만큼 충분히 중증이다. (Boone et al, Oncology 72:152-159 (2007)).
본원은 또한 공동 소유 특허 출원 제PCT/CA2011/001238호(2011년 11월 4일 출원), 제PCT/CA2012/050780호(2012년 11월 2일 출원), 제PCT/CA2013/00471호(2013년 5월 10일 출원) 및 제PCT/CA2013/050358호(2013년 5월 8일 출원)(각각의 전체 내용은 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 관한 것이다.
종양을, 링커와 함께 또는 링커 없이, 이종이합체 Fc에 커플링된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공되고, 항원 결합 폴리펩타이드는 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하고, 작제물은 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 B최대로 EGFR에 결합한다.
몇몇 양상에서, Fc는 EU 넘버링에 따라 사슬 A에서 돌연변이 T350V_L351Y_F405A_Y407V, 및 EU 넘버링에 따라 사슬 B에서 돌연변이 T350V_T366L_K392L_T394W를 가지는 이종이합체 인간 IgG1 Fc이고, 항원 결합 폴리펩타이드는 EGFR의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합하고, 대상체는 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 의해 치료된 대상체와 비교하여 상기 치료로부터 피부 독성을 덜 경험하고, 종양은 A431, A549, BT474, CACO2, HCT116, JIMT1, MDA-MB-231, SKOV3, MCF7 또는 SKBR3의 세포주 중 하나 또는 하나 초과의 세포 표면 EGFR의 제2 수준과 동일하거나 이보다 낮은 세포 표면 EGFR의 제1 수준을 발현한다.
몇몇 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 OA-CTX(v4353) 또는 OA-EG2(v1323)이다.
몇몇 양상에서, Fc는 이종이합체 IgG1 Fc이고, Fc는 적어도 2개의 CH3 서열을 포함하고, Fc는, 링커와 함께 또는 링커 없이, 항원 결합 폴리펩타이드에 커플링된다. 몇몇 양상에서, Fc는 EU 넘버링에 따라 사슬 A에서 돌연변이 T350V_L351Y_F405A_Y407V, 및 EU 넘버링에 따라 사슬 B에서 돌연변이 T350V_T366L_K392L_T394W를 가지는 인간 이종이합체 IgG1 Fc이다. 몇몇 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하고, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3은 표 B에 기재된 상응하는 서열이다. 몇몇 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 EGFR의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합한다. 몇몇 양상에서, 작제물은 본 명세서에 기재된 작제물, 예를 들어 단리된 1가 EGFR 결합 작제물이다.
몇몇 양상에서, 1가 EGFR 결합 작제물은 탈푸코실화(afucosylated)된다. 몇몇 양상에서, 1가 EGFR 결합 작제물은 약물에 접합되고, 임의로 약물은 메이탄시노이드 또는 DM1이다. 몇몇 양상에서, 효율이 증가하고 부작용이 감소한 단리된 1가 EGFR 결합 작제물에 의한 대상체의 치료에 대한 시간 기간은 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 의한 치료에 대한 시간 기간보다 길다. 몇몇 양상에서, 종양은 표피 세포 유래 암, 폐암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 유관 유방 관암, 위암, 난소암, HER2+ 암, 교모세포종, 자궁경부암, 신장암, 자궁암 또는 결장암이다.
몇몇 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 종양에서 EGFR에 대한 EGF의 결합을 차단한다. 몇몇 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 종양에서 구성적 EGFR 신호전달을 차단한다. 몇몇 양상에서, 종양과 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 ADCC를 발생시킨다. 몇몇 양상에서, 종양과 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 내재화(internalization)를 발생시킨다.
몇몇 양상에서, 종양은 A431, A549, BT474, CACO2, HCT116, JIMT1, MDA-MB-231, SKOV3, MCF7 또는 SKBR3의 세포주 중 하나 또는 하나 초과의 세포 표면 EGFR의 제2 수준과 동일하거나 이보다 낮은 세포 표면 EGFR의 제1 수준을 발현한다. 몇몇 양상에서, 종양의 샘플은 면역조직화학(immunohistochemistry: IHC) 염색을 이용하여 평가할 때 3+ 이하, 2+ 이하 또는 1+ 이하의 EGFR의 평균 수준을 발현한다. 몇몇 양상에서, 종양은 세포마다 3.5x106 이하, 2.8x106 이하, 1.2x106 이하, 2.4x105 이하, 2.6x105 이하, 또는 4.2x104 이하의 EGFR의 평균을 발현한다.
몇몇 양상에서, 치료는 종양의 수축, 종양의 성장의 저해, 종양의 진행에 대한 시간의 증가, 대상체의 무질환 생존기간의 연장, 전이의 감소, 대상체의 무진행 생존기간의 증가 또는 대상체의 집단의 전체 생존기간의 증가를 발생시킨다.
몇몇 양상에서, 대상체는 작제물의 고정된 용량이 투여되고, EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물의 고정된 용량으로 치료된 대상체와 비교하여 상기 치료로부터 피부 독성을 덜 경험하고, 임의로 고정된 용량은 몰 기준으로 결정된다. 몇몇 양상에서, 대상체의 각질세포의 성장은 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물의 고정된 용량으로 치료된 대상체와 비교하여 작제물의 고정된 용량에 의한 치료 후에 덜 감소하고, 임의로 고정된 용량은 몰 기준으로 결정된다.
몇몇 양상에서, 종양은 트라스투주맙 및/또는 페르투주맙 및/또는 세툭시맙에 내성 또는 불응성이다.
몇몇 양상에서, 대상체는 인간 대상체이다.
몇몇 양상에서, 상기 방법은 추가 물질을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양상에서, 추가 물질은 HER2에 결합한다. 몇몇 양상에서, 추가 물질은 페르투자맙 또는 트라스투자맙이다. 몇몇 양상에서, 1가 EGFR 결합 작제물 및 추가 물질은 동시에 제공된다. 몇몇 양상에서, 1가 EGFR 결합 작제물 및 추가 물질은 별도로 제공된다. 몇몇 양상에서, 추가 물질은 제2의 단리된 항원 결합 작제물이다. 몇몇 양상에서, 제2의 단리된 항원 결합 작제물은 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 결합하거나 특이적으로 결합한다. 몇몇 양상에서, 제2의 단리된 항원 결합 작제물은 HER2의 ECD2 및/또는 ECD4에 결합하거나 특이적으로 결합한다.
몇몇 양상에서, 치료는 종양의 수축, 종양의 성장의 저해, 종양의 진행에 대한 시간의 증가, 대상체의 무질환 생존기간의 연장 또는 대상체의 생존의 증가를 발생시킨다. 몇몇 양상에서, 제2의 단리된 항원 결합 작제물은, 제2의 단리된 항원 결합 작제물의 항원 결합 폴리펩타이드가 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 결합하거나 특이적으로 결합한다는 점을 제외하고는, 본 명세서에 기재된 단리된 1가 EGFR 결합 작제물과 동일하다.
중쇄 가변 도메인을 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 또한 기재되어 있고, 항원 결합 폴리펩타이드는 표피 성장 인자 수용체(EGFR); 및 이종이합체 Fc에 결합하거나 특이적으로 결합하고, Fc는 적어도 2개의 CH3 서열을 포함하고, Fc는, 링커와 함께 또는 링커 없이, 항원 결합 폴리펩타이드에 커플링되고; 1가 항원 결합 작제물은 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 B최대로 EGFR에 선택적으로 결합하고/하거나, 특이적으로 결합하고; 이합체화된 CH3 서열은 약 68℃ 이상의 융점(Tm)을 가진다.
몇몇 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 OA-CTX(v4353) 또는 OA-EG2(v1323)이다.
몇몇 양상에서, 본 명세서에 기재된 작제물에서 1:1의 작제물 대 표적 비율에서 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 대한 B최대의 증가는 포화 농도까지 작제물의 관찰된 평행 상수(Kd)보다 큰 농도에서 관찰된다.
몇몇 양상에서, 단리된 1가 항원 결합 작제물은 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 비해 EGFR에 대한 더 낮은 친화도를 가진다.
몇몇 양상에서, 단리된 1가 항원 결합 작제물은 EGFR의 세포외 도메인 1, 2, 3 또는 4에 위치한 에피토프 또는 EGFR의 세포외 도메인에 결합한다.
몇몇 양상에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 경쇄 가변 도메인, 경쇄 CL1 도메인 및/또는 중쇄 CH1 도메인을 추가로 포함한다. 몇몇 양상에서, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 몇몇 양상에서, 경쇄 CL1 도메인의 아미노산 서열은 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 경쇄 CL1 도메인의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 중쇄 CH1 도메인의 아미노산 서열은 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄 CH1 도메인의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 몇몇 양상에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 Fab 단편, scFv, sdAb, 항원 결합 펩타이드, 또는 항원에 결합할 수 있는 단백질 도메인이다.
몇몇 양상에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 양상에서, 중쇄 폴리펩타이드는 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 폴리펩타이드는 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 경쇄의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 양상에서, 본 명세서에 기재된 작제물은 1.16E-8M 내지 8.51E-10M 이하의 EGFR에 대한 결합 친화도(KD)를 가진다.
몇몇 양상에서, 본 명세서에 기재된 작제물은, EGFR에 결합될 때, 대조군에 비해 A431 세포 성장을 저해하고/하거나, 대조군에 비해 BT-474 세포의 ADCC 매개 표적 세포 용해(%)를 증가시키고/시키거나, EGFR의 내재화를 발생시키고/시키거나, EGFR의 하향조절을 발생시킨다.
몇몇 양상에서, 작제물은 세포에서 EGFR에 대한 결합 시 세포로 내재화된다.
몇몇 양상에서, Fc는 링커에 의해 항원 결합 폴리펩타이드에 융합된다. 몇몇 양상에서, 링커는 폴리펩타이드 링커이다. 몇몇 양상에서, 링커는 IgG1 힌지 구역을 포함한다.
몇몇 양상에서, EGFR은 EGFR 아이소폼 A 또는 EGFRvIII이다.
몇몇 양상에서, 작제물은 적어도 하나의 약물에 접합된다. 몇몇 양상에서, 약물은 메이탄시노이드이다. 몇몇 양상에서, 메이탄시노이드는 DM1이다. 몇몇 양상에서, 메이탄시노이드는 SMCC 링커를 통해 작제물에 접합된다.
몇몇 양상에서, 작제물 또는 항원 결합 폴리펩타이드는 중화이다. 몇몇 양상에서, 작제물 또는 항원 결합 폴리펩타이드는 비중화이다.
몇몇 양상에서, Fc는 인간 Fc이다. 몇몇 양상에서, 인간 Fc는 인간 IgG1 Fc이다.
몇몇 양상에서, 이합체화된 CH3 서열은 약 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77.5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 또는 85℃ 이상의 융점(Tm)을 가진다. 몇몇 양상에서, Fc는 발현될 때 약 75% 초과, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 순도로 형성된 이종이합체이다. 몇몇 양상에서, Fc는 단일 세포를 통해 발현될 때 약 75% 초과, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 순도로 형성된 이종이합체이다.
몇몇 양상에서, 이종이합체 Fc는 CH3 서열 중 적어도 하나에서 하나 이상의 변형을 포함한다. 몇몇 양상에서, 이종이합체 Fc 도메인은 야생형 동종이합체 Fc와 필적하는 안정성으로 이종이합체의 형성을 촉진하는 CH3 서열 중 적어도 하나에서 하나 이상의 변형을 포함한다. 몇몇 양상에서, 이종이합체 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따라 사슬 A에서 돌연변이 T350V_L351Y_F405A_Y407V, 및 EU 넘버링에 따라 사슬 B에서 돌연변이 T350V_T366L_K392L_T394W를 가지는 이종이합체 IgG1 Fc이다.
몇몇 양상에서, 이종이합체 Fc는 적어도 하나의 CH2 도메인을 추가로 포함한다. 몇몇 양상에서, 이종이합체 Fc의 CH2 도메인(들)은 하나 이상의 변형을 포함한다.
몇몇 양상에서, 이종이합체 Fc는 Fc-감마 수용체의 선택적 결합을 촉진하는 하나 이상의 변형을 포함한다.
EGFR에 대한 결합에 대해 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물과 경쟁하는 제2의 단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 또한 기재되어 있고, 임의로 제2의 단리된 1가 항원 결합 작제물은 50% 초과, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%로 임의의 상기 작제물 청구항에 따른 단리된 1가 항원 결합 작제물을 대체한다.
단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 또한 기재되어 있고, 작제물은, 세포가 작제물에 의해 접촉될 때,
a. EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 BT474 세포, HCT116 세포, MDA-MB-234 세포 또는 SKOV3 세포 중 하나 이상에서, FACS에 의해 결정된, 더 높은 세포 표면(B최대),
b. EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 의해 매개된 것과 비교하여 BT-474 세포의 항체 의존적 세포내 세포독성(ADCC)의 증가의 매개, 또는
c. JIMT1 세포의 내재화 중 하나 이상을 특징으로 한다.
단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 또한 기재되어 있고, 작제물은 탈푸코실화되고, 작제물은 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 의해 매개된 것에 비해 A549 세포의 ADCC의 1.9배 증가 및/또는 HCT116 세포의 ADCC의 1.4배 증가를 매개한다.
몇몇 양상에서, 항원 결합 작제물은 적어도 하나의 변형을 포함하고, 변형은 탈푸코실화된다.
본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본 명세서에 또한 기재되어 있다. 몇몇 양상에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드는 cDNA이다.
본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 벡터 또는 일련의 벡터가 본 명세서에 또한 기재되어 있다. 몇몇 양상에서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 비에피솜 포유동물 벡터, 발현 벡터 및 재조합 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 명세서에 기재된 벡터를 포함하는 단리된 세포가 본 명세서에 또한 기재되어 있다. 몇몇 양상에서, 세포는 하이브리도마, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 HEK293 세포이다.
본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 또한 기재되어 있다. 몇몇 양상에서, 상기 조성물은 완충제, 항산화제, 저분자량 분자, 약물, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 지질, 킬레이트화제, 안정화제 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함한다.
몇몇 양상에서, 상기 조성물은 제2의 단리된 항원 결합 작제물을 추가로 포함한다. 몇몇 양상에서, 제2 작제물은 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 몇몇 양상에서, 제2 작제물은 HER2의 세포외 도메인 (ECD)2 및/또는 ECD4에 특이적으로 결합한다. 몇몇 양상에서, 제2 작제물은, 항원 결합 폴리펩타이드가 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다는 점을 제외하고는, 본 명세서에 기재된 단리된 1가 EGFR 결합 작제물과 동일하다.
약제에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 작제물을 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 또한 기재되어 있다. 몇몇 양상에서, 상기 조성물은 암성 병증을 치료하기 위한 용도를 위한 것이다. 몇몇 양상에서, 암성 병증은 EGFR 발현 암, 상피 세포 유래 암, 유방암, HER2 발현 암, 폐암, 삼중 음성 유방암, 유관 유방 관암, 위암, 난소암, 두경부암, 교모세포종, 자궁경부암, 신장암, 자궁암, 췌장암 또는 결장암이다.
본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물을 얻는 방법이 본 명세서에 또한 기재되어 있고, 상기 방법은 (a) 숙주 세포 배양물을 얻는 단계(여기서, 숙주 세포는 항원 결합 작제물을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함함); (b) 단리된 1가 항원 결합 작제물을 발현하기에 충분한 조건 하에 숙주 세포 배양물을 배양하는 단계; 및 (c) 숙주 세포 배양물로부터 항원 결합 작제물을 회수하는 단계를 포함한다.
대상체에서 EGFR 및/또는 HER 신호전달과 관련된 암 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 또는 작제물의 유효량을 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 또한 기재되어 있다.
몇몇 양상에서, 암은 EGFR 발현 암, 상피 세포 유래 암, 유방암, HER2 발현 암, 폐암, 삼중 음성 유방암, 유관 유방 관암, 위암, 난소암, 교모세포종, 자궁경부암, 신장암, 자궁암 또는 결장암이다.
몇몇 양상에서, 상기 방법은 추가 물질 이외에 단리된 1가 작제물을 제공하는 단계를 포함한다. 몇몇 양상에서, 단리된 1가 작제물은 추가 물질과 동시에 제공된다. 몇몇 양상에서, 단리된 1가 작제물은 추가 물질과 별도로 제공된다. 몇몇 양상에서, 추가 물질은 제2의 명확한 단리된 항원 결합 작제물이다. 몇몇 양상에서, 제2 작제물은 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 몇몇 양상에서, 제2 작제물은 HER2의 ECD2 및/또는 ECD4에 특이적으로 결합한다. 몇몇 양상에서, 제2 작제물은, 항원 결합 폴리펩타이드가 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다는 점을 제외하고는, 제1항의 단리된 1가 항원 결합 작제물과 동일하다.
몇몇 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 종양에서 EGFR에 대한 EGF의 결합을 차단한다. 몇몇 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 종양에서 구성적 EGFR 신호전달을 차단한다. 몇몇 양상에서, 종양과 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 ADCC를 발생시킨다. 몇몇 양상에서, 종양과 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 내재화를 발생시킨다.
종양의 성장을 저해하거나, 종양을 수축시키거나, 종양을 가지는 대상체의 생존을 증가시키는 방법으로서, 종양을 본 명세서에 기재된 조성물 또는 작제물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 또한 기재되어 있다.
몇몇 양상에서, 종양은 상피 세포 유래 종양 또는 HER2+ 종양이다. 몇몇 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 종양에서 EGFR에 대한 EGF의 결합을 차단한다. 몇몇 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 종양에서 구성적 EGFR 신호전달을 차단한다. 몇몇 양상에서, 종양과 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 ADCC를 발생시킨다. 몇몇 양상에서, 종양과 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 내재화를 발생시킨다.
세포에서 EGFR 및/또는 HER 신호전달을 저해하거나, 감소시키거나, 차단하는 방법으로서, 세포를 본 명세서에 기재된 작제물 또는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 또한 기재되어 있다.
몇몇 양상에서, 세포는 EGFR 발현 암 세포, 유방암 세포, 상피 세포 유래 종양 세포, HER2+ 종양 세포, 폐암 세포, 삼중 음성 유방암 세포, 유관 유방암 세포, 위암 세포 및 두경부암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 교모세포종 세포, 자궁경부암 세포, 신장암 세포, 자궁암 세포 또는 결장암 세포이다.
본 명세서에 기재된 단리된 항원 결합 작제물 및 사용 설명서를 포함하고, 임의로, 제2의 단리된 항원 결합 작제물을 추가로 포함하는 키트가 본 명세서에 또한 기재되어 있다.
질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 단리된 항원 결합 작제물이 본 명세서에 또한 기재되어 있고, 임의로 질환은 암, 예를 들어 EGFR 발현 암, 상피 세포 유래 암, 유방암, HER2 발현 암, 폐암, 삼중 음성 유방암, 유관 유방 관암, 위암, 난소암, 교모세포종, 자궁경부암, 신장암, 자궁암 또는 결장암이다.
본 발명의 이들 및 다른 특징, 양상 및 이점은 하기 설명 및 수반된 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 예시적인 일 암(one armed)의 항-EGFR 항체(OA-EGFR), v4353 및 1323의 순도의 평가를 도시한다. 도 1A는 79.95㎖의 보유 용적에서 주피크를 가지는 v4353의 SEC 프로필을 보여준다. 도 1B는 84.74㎖의 보유 용적에서 주피크를 가지는 v1323의 SEC 프로필을 보여준다. 도 1C는 각각 대략 110kDa 및 66kDa에서 종에 의한 v4353 및 v1323 둘 다의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 도 1D는 v4353의 포맷에서 예시적인 일 암의 항-EGFR 항체의 도시적 도면이다. 도 1E는 v1323의 포맷에서 예시적인 일 암의 항-EGFR 항체의 도시적 도면이다. 도 1E는 v7180의 포맷에서 2가 (전장) 항-EGFR 항체의 도시적 도면이다.
도 2는, 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance: SPR)에 의해 측정된, EGFR에 결합하는 예시적인 중화 및 비중화 OA-EGFR 항체의 능력을 도시한다. 도 2A 및 도 2B는 각각 v4353(중화 항체) 및 EGFR에 결합하는 이의 능력 및 HER2에 대한 결합의 결여에 대한 센서그램을 도시한다. 도 2C 및 도 2D는 각각 v1323(비중화) 및 EGFR에 결합하는 이의 능력 및 HER2에 대한 결합의 결여에 대한 센서그램을 도시한다.
도 3은 농도 의존적 및 포화 가능한 방식으로 HER2 3+ EGFR 발현 유방암 BT-474 세포에 결합하는 예시적인 OA-EGFR 항체의 능력을 도시한다. OA-EGFR 항체는 전장 2가 항-EGFR 항체인 얼비툭스(상표명)와 비교하여 더 큰 B최대를 보여준다.
도 4는 5일 노출에 걸쳐 EGFR을 발현하는 A431 폐암 세포의 성장을 저해하는 예시적인 중화 및 비중화 OA-EGFR 항체의 능력을 도시하고, 저해는 비중화 OA-EGFR v1323이 아닌 중화 OA-EGFR v4353에 의해 관찰된다.
도 5는 유방 BT-474 암 세포에서 25:1의 이팩터 대 표적 E:T 비율에서 농도 의존적 ADCC를 매개하는 예시적인 중화 및 비중화 OA-EGFR 항체의 능력을 도시한다.
도 6은 내재화되고 EGFR 발현을 하향조절하는 예시적인 OA-EGFR 항체의 능력의 측정을 도시한다. 도 6A는 JIMT-1 세포에서 내재화시키고 EGFR 발현을 하향조절하기 위한 20nM의 v4353의 효과를 보여준다. 도 6B는 단독으로 또는 다른 항체와 조합되어 JIMT-1 세포에서 내재화시키고 EGFR 발현을 하향조절하기 위한 100nM 및 200nM의 v4353의 효과를 보여준다. 도 6A 및 도 6B에서의 각각의 실험 군의 경우, 왼쪽 막대는 4℃에서의 표면이고; 중간 막대는 37℃에서의 표면이고; 오른쪽 막대는 37℃에서 내부이다.
도 7은 마우스 이종이식 모델에서 CTX 내성 확립된 난소 종양 SKOV3의 성장을 저해하는 예시적인 OA-EGFR과 OA-HER2 항체의 조합의 능력을 도시한다.
도 8은 도 7의 SKOV3 제노그래프(xenograph) 모델에서 예시적인 OA-EGFR과 OA-HER2 항체의 조합에 노출된 마우스에 대한 생존 데이터를 보여주는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 도면을 도시한다.
도 9는 단백질 A 및 SEC 정제 후 예시적인 탈푸코실화 OA-EGFR v4353(v7192) 항체의 UPLC-SEC 크로마토그램을 보여준다.
도 10은 예시적인 탈푸코실화 OA-EGFR v4353 최종 생성물(v7192)의 UPLC-SEC 크로마토그램(도 10a 및 도 10b) 및 비환원 SDS-PAGE(도 10C)를 보여준다.
도 11은 LC-MS에 의한 예시적인 탈푸코실화 항체 v7192의 트립신 분해의 글라이칸 분석을 보여준다.
도 12는 비접합 v7104 및 DM1 접합 v7192 예시적인 OA-EGFR 항체의 HIC-HPLC 크로마토그램의 오버레이를 보여준다.
도 13은 비접합 v7104 및 접합 v7192 예시적인 OA-EGFR 항체의 HPLC-SEC 크로마토그램의 오버레이를 보여준다.
도 14는 다양한 인간 종양 세포주에서 전체 세포 포화 결합을 보여준다. 상응하는 2가 항체와 비교하여 OA-EGFR의 B최대 배수 증가는 각각 결장 HCT116(도 14A), 삼중 음성 유방암(TNBC) MDA-MB-231(도 14B) 및 난소 SKOV3(도 14 C)에서 1.55, 1.68 및 1.38이었다.
도 15A 및 도 15B는 50:1의 PBMC 이팩터 대 표적 Caco2 E:T 비율에서 평가된 Caco2 세포주에서 예시적인 OAA의 농도 의존적 ADCC 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 16은 5:1의 NK92(CD16a: 158V/V) 이팩터 대 표적 TNBC MDA-MB-231 E:T 비율에서 평가된 TNBC MDA-MB-231 세포에서 탈푸코실화(v7192) 및 비탈푸코실화(v4353) 예시적인 OA-EGFR의 ADCC 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 17은 인간 삼중 음성 유방암 세포주 MDA-MB-231에서 예시적인 OAADC의 성장 저해 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 18A는 혈청의 존재 하에 불활화 HACAT 각질세포 세포주에서 얼비툭스(상표명) 및 허셉틴(Herceptin)(상표명)과 비교하여 예시적인 OA-EGFR 항체 v4353 및 v7192의 성장 저해 용량 반응 곡선을 보여준다. 도 18B는 혈청의 부재 하에 얼비툭스(상표명)와 비교하여 OA-EGFR 항체 v1323의 성장 저해 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 19는, 세포 표면에서 각각 높은, 중간 및 낮은 수준의 EGFR을 발현하는, A431 세포, A549 세포 및 HCT116 세포에서 탈푸코실화(v7192) 예시적인 OA-EGFR 및 얼비툭스(상표명)(v7180)의 ADCC 용량 반응 곡선을 보여준다.
항원에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 제공된다. 몇몇 양상에서, 작제물은 CH3 도메인을 각각 포함하는 2개의 단량체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 1개의 상기 단량체 Fc 폴리펩타이드는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물로부터의 적어도 하나의 폴리펩타이드에 융합되고; 상기 1가 항원 결합 작제물은 2개의 항원 결합 구역을 가지는 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 상기 항원을 디스플레이하는 표적 세포에 대한 결합 밀도 및 B최대의 증가를 나타내고, 상기 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 우수한 효율 및/또는 생물활성을 보여주고, 상기 더 우수한 효율 및/또는 생물활성은 결합 밀도의 증가 및 이에 따른 표적 세포의 장식의 증가의 결과이다. 본 명세서에 제공된 1가 항원 결합 작제물에 의한 B최대 또는 결합 밀도의 증가 및 이에 따른 표적 장식의 증가는 비특이적 결합으로 인한 것이 아니고 특이적 표적 결합의 효과이다. 소정의 실시형태에서, 최대 결합은 1:1의 표적 대 항체 비율에서 발생한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물(FSA)과 비교하여 B최대의 증가; 상응하는 FSA에 필적하는 Kd; 상응하는 FSA와 비교하여 동일한 또는 더 느린 분해 속도; 감소한 또는 부분 효현기능; 표적의 가교결합 및 이합체화가 없음; 관심 있는 표적 세포에 대한 특이성 및/또는 선택도; 표적 세포 성장의 전체 또는 부분 저해 또는 저해 없음; 이팩터 활성을 유도할 수 있는 완전한 Fc; 및 표적 세포에 의해 내재화되는 능력의 속성 중 적어도 하나 이상을 보유한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 FSA와 비교하여 B최대의 증가; 상응하는 FSA에 필적하는 Kd; 상응하는 FSA와 비교하여 동일한 또는 더 느린 분해 속도; 감소한 또는 부분 효현기능; 표적의 가교결합 및 이합체화가 없음; 관심 있는 표적 세포에 대한 특이성 및/또는 선택도; 표적 세포 성장의 전체 또는 부분 저해 또는 저해 없음; 이팩터 활성을 유도할 수 있는 완전한 Fc; 및 임의로 표적 세포에 의해 내재화되는 능력의 최소 속성을 보유한다.
1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 제공되고, 상기 작제물은 1가 용해 항체, 1가 내재화 항체 및 이들의 조합 중 적어도 하나이다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 작제물은 하기 효율 인자 사이의 이 항체 디스플레이의 균형에 기초하여 1가 용해 항체 및/또는 1가 내재화 항체이다: a) 내재화되는 1가 항원 결합 작제물의 능력, b) 1가 항원 결합 작제물의 B최대 및 Kd/분해 속도의 증가, 및 c) 1가 항원 결합 작제물의 효현기능/부분 효현기능의 정도.
항원에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 이합체 Fc 도메인을 포함하는, 1가 항원 결합 작제물을 표적 세포에 제공하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 표적 세포에서 항체 농도를 증가시키는 방법이 본 명세서에 제공되고, 상기 1가 항원 결합 작제물은 2개의 항원 결합 구역을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 상기 항원을 디스플레이하는 표적 세포에 대한 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 우수한 치료학적 효율을 나타내고, 상기 효율은 항원의 가교결합, 항원 이합체화, 항원 조정의 방지 또는 항원 활성화의 방지에 의해 발생하지 않는다. 반대로, 상기 효율이 순 사멸 효과를 극복하지 않는 한, 효율이 항원 조정 또는 항원 활성화에 의해 발생할 수 있다는 것이 달리 사실이다.
몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 항원 결합 작제물은 결합도(avidity)를 나타내지 않는다.
항원에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 CH3 도메인을 각각 포함하는 2개의 단량체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 제공되고, 1개의 상기 단량체 Fc 폴리펩타이드는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물로부터의 적어도 하나의 폴리펩타이드에 융합되고; 상기 1가 항원 결합 작제물은 2개의 항원 결합 구역을 가지는 상응하는 FSA 작제물과 비교하여 상기 항원을 디스플레이하는 표적 세포에 대한 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 우수한 효율 및/또는 생물활성을 나타내고, 상기 더 우수한 효율 및/또는 생물활성은 결합 밀도의 증가의 결과이다.
소정의 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 제공되고, 단일특이적 2가 항체에 대한 결합 밀도 및 B최대의 증가는 관찰된 평행 상수(Kd)보다 높은 농도에서 및 항체의 포화 농도에서 관찰된다. 몇몇 실시형태에서, 더 우수한 효율 및/또는 생물활성은 상기 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 FcγR 또는 보체(Clq) 결합의 증가 및 더 높은 ADCC, 더 높은 ADCP 및 더 높은 CDC 중 적어도 하나의 결과이다. 구체적인 실시형태에서, 단리된 1가 항원 결합 작제물은 항증식성이고 내재화된다. 소정의 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, FSA에 대한 결합 밀도 및 B최대의 상기 증가는 표적 세포에서 항원의 밀도에 독립적이다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 제공되고, 표적 세포는 암 세포, 또는 EGFR 및/또는 HER2 발현 이환 세포이다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물은 결합도를 나타내지 않는다.
정의
본 발명은 특정한 프로토콜에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 하고; 본 명세서에 기재된 세포주, 작제물 및 시약은 그러므로 변할 수 있다. 본 명세서에 사용된 전문용어는 오직 특정한 실시형태를 기술할 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 것으로 또한 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자에 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법, 장치 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 이제 기재된다.
본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허는 현재 기재된 발명과 관련하여 사용되는, 공보에 기재된, 예를 들어 작제물 및 방법론을 기술하고 개시할 목적으로 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다. 본 명세서에 기재된 공보는 본원의 출원일 전에 이의 개시내용을 위해서만 제공된다. 본 명세서에서 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용에 선행하도록 권한 부여되지 않았다는 것의 인정으로서 해석되지 않는다.
"이합체" 또는 "이종이합체"는 적어도 제1 단량체 폴리펩타이드 및 제2 단량체 폴리펩타이드를 포함하는 분자이다. 이종이합체의 경우에, 상기 단량체 중 1개는 적어도 하나의 아미노산 잔기만큼 다른 단량체와 다르다. 소정의 실시형태에서, 이합체의 어셈블리는 표면적 매립에 의해 추진된다. 몇몇 실시형태에서, 단량체 폴리펩타이드는 원하는 이합체 형성의 선호 및/또는 다른 원치 않는 견본의 형성의 비선호에 의해 이합체 형성을 추진하는 정전 상호작용 및/또는 염-브릿지 상호작용에 의해 서로 상호작용한다. 몇몇 실시형태에서, 단량체 폴리펩타이드는 원하는 이합체 형성의 선호 및/또는 다른 어셈블리 유형의 형성의 비선호에 의해 원하는 이합체 형성을 추진하는 소수성 상호작용에 의해 서로 상호작용한다. 소정의 실시형태에서, 단량체 폴리펩타이드는 공유 결합 형성에 의해 서로 상호작용한다. 소정의 실시형태에서, 공유 결합은 원하는 이합체 형성을 추진하는 자연에 존재하거나 도입된 시스테인 사이에 형성된다. 본 명세서에 기재된 소정의 실시형태에서, 단량체 사이에 공유 결합이 형성되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 폴리펩타이드는 원하는 이합체 형성의 선호 및/또는 다른 원치 않는 실시형태의 형성의 비선호에 의해 이합체 형성을 추진하는 패킹/크기-상보성/구멍에 손잡이(knob-into-hole)/돌기-동공 유형 상호작용에 의해 서로 상호작용한다. 몇몇 실시형태에서, 폴리펩타이드는 이합체 형성을 추진하는 양이온-pi 상호작용에 의해 서로 상호작용한다. 소정의 실시형태에서, 개별 단량체 폴리펩타이드는 용액 중에 단리된 단량체로서 존재할 수 없다.
용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc"는, 본 명세서에 사용되는 바대로, 일반적으로 면역글로불린 중쇄의 C 말단 폴리펩타이드 서열을 포함하는 이합체 착체를 의미하고, C 말단 폴리펩타이드 서열은 온전한 항체의 파파인 분해에 의해 얻어질 수 있는 것이다. Fc 도메인은 네이티브 또는 변이체 Fc 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 서열의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 서열은 약 Cys226 위치, 또는 약 Pro230 위치에서의 아미노산 잔기로부터 Fc 서열의 카복실 말단으로 신장하도록 보통 한정된다. 면역글로불린의 Fc 서열은 일반적으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인의 2개의 불변 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. "Fc 폴리펩타이드"란 본 명세서에서 Fc 도메인을 구성하는 폴리펩타이드 중 하나를 의미한다. Fc 폴리펩타이드는 임의의 적합한 면역글로불린, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 얻어질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 (일반적으로 이의 N 말단에서) 야생형 힌지 서열의 일부 또는 전부를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 기능적 또는 야생형 힌지 서열을 포함하지 않는다.
항체 "이팩터 기능"은 항체의 Fc 도메인(네이티브 서열 Fc 도메인 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 도메인)에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 의미한다. 항체 이팩터 기능의 예는 Clq 결합; 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절 등을 포함한다.
"항체 의존적 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)(예를 들어, 자연 살해(Natural Killer: NK) 세포, 호중구 및 대식세포)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에서 결합 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포를 용해시키는 세포 매개 반응을 의미한다.
"보체 의존적 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하의 표적의 용해를 의미한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 착체를 형성하는 분자(예를 들어, 항체)에 대한 보체 시스템(Clq)의 제1 성분의 결합에 의해 개시된다.
"항체 의존적 세포 식세포작용(antibody-dependent cellular phagocytosis)" 및 "ADCP"는 단핵구 또는 대식세포 매개 식세포작용을 통한 표적 세포의 파괴를 의미한다.
용어 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 도메인에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 예를 들어, FcR은 네이티브 서열 인간 FcR일 수 있다. 일반적으로, FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위유형의 수용체, 예컨대 이 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 주로 이의 세포질 도메인이 다른 유사한 아미노산 서열을 가지는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함한다. 다른 아이소타입의 면역글로불린은 소정의 FcR에 의해 또한 결합할 수 있다(예를 들어, 문헌[Janeway et al, Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999)] 참조). 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인에서 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)를 함유한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인에서 면역수용체 타이로신 기반 저해 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM)를 함유한다(문헌[
Figure pct00001
, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]에서 검토됨). FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 미래에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR은 본 명세서에서 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어는 태아에 대해 모계 IgG의 전달을 담당하는 FcRn인 신생아 수용체를 또한 포함한다(Guyer et al, J. Immunol. 117:587 (1976); 및 Kim et al, J. Immunol. 24:249 (1994)).
"장애"는 본 발명의 항체 또는 방법에 의한 치료로부터 이익을 얻는 임의의 병증이다. 이것은 포유동물이 해당 장애에 소인이 있는 병리학적 병증을 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본 명세서에 의해 치료되는 장애의 비제한적인 예는 악성 및 양성 종양; 비백혈병 및 림프성 악성종양, 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 다른 선상, 대식세포, 상피, 기질 및 배반포 장애; 및 염증성, 면역학적 및 다른 혈관형성 관련 장애를 포함한다.
용어 "암" 및 "암성"은 통상적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병증을 의미하거나 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 암의 더 특정한 예는 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 편평 암종, 복막의 암, 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 간세포암, 위장관암, 췌장암, 교모세포종/신경교종(예를 들어, 악성 성상세포종, 다형성 교모세포종, 악성 핍지교종, 악성 희돌기성상세포종), 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 대장암, 결장암, 자궁내막암 또는 자궁암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 질암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, "치료"는 치료되는 개인 또는 세포의 자연 과정을 변경하는 시도에서의 임상 중재를 의미하고, 임상 병리학의 예방을 위해 또는 이의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행의 속도의 감소, 질환 상태의 경감 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 진전을 지연시키기 위해 사용된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 방법은 종양 회귀를 가져온다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 방법은 종양/암 성장의 저해를 가져온다.
"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는, 삽입에 사용된 방법, 예를 들어 직접 흡수, 형질도입, f-메이팅, 또는 재조합 숙주 세포를 생성하기 위해 당해 분야에 공지된 다른 방법과 무관하게, 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 의미한다. 외인성 폴리뉴클레오타이드는 비통합 벡터, 예를 들어 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 대안적으로 숙주 게놈으로 통합될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "배지" 또는 "배지들"은, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵생물 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, CHO 세포, 원핵생물 숙주 세포, 이. 콜라이, 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포, 및 세포 내용물을 포함하는, 임의의 숙주 세포를 지지하거나 함유할 수 있는, 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체, 또는 경질 지지체를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 숙주 세포가 성장하는 배지, 예를 들어 단백질이 분비되는 배지, 예컨대 증식 단계 전의 또는 후의 배지를 포함할 수 있다. 상기 용어는, 예컨대 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물이 세포내 생성되고, 숙주 세포가 용해되거나 파괴되어 이형다합체를 방출하는 경우에, 숙주 세포 용해물을 함유하는 완충제 또는 시약을 또한 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "조정된 혈청 반감기"는 네이티브 형태에 비해 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물에 포함된 항원 결합 폴리펩타이드의 순환 반감기의 양성 또는 음성 변화를 의미한다. 혈청 반감기는 작제물의 투여 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 취하고, 각각의 샘플에서 그 분자의 농도를 결정함으로써 측정된다. 시간에 따른 혈청 농도의 보정은 혈청 반감기의 계산을 허용한다. 혈청 반감기의 증가는 바람직하게는 적어도 약 2배를 가지지만, 예를 들어 이것이 성공적인 투약 섭생이 가능하게 하거나 독성 효과를 피하는 경우, 더 적은 증가가 유용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 증가는 적어도 약 3배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배이다.
용어 "조정된 치료학적 반감기"는 본 명세서에 사용되는 바대로 비변형된 형태에 비해 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물에 포함된 항원 결합 폴리펩타이드의 치료학적 유효량의 반감기의 양성 또는 음성 변화를 의미한다. 치료학적 반감기는 투여 후 다양한 시점에 분자의 약동학적 및/또는 약동학적 특성을 측정함으로써 측정된다. 치료학적 반감기의 증가는 바람직하게는 특정한 유리한 투약 섭생, 특정한 유리한 전체 용량이 가능하게 하거나 원치 않는 효과를 피한다. 몇몇 실시형태에서, 치료학적 반감기의 증가는 효력의 증가, 표적에 대한 변형된 분자의 결합의 증가 또는 감소, 프로테아제와 같은 효소에 의한 분자의 분해의 증가 또는 감소, 또는 비변형된 분자의 또 다른 매개변수 또는 작용 기전의 증가 또는 감소, 또는 분자의 수용체 매개 청소율의 증가 또는 감소로부터 생긴다.
용어 "단리된"은, 핵산 또는 단백질에 적용될 때, 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 연관된 세포 성분 중 적어도 일부가 없다는 것, 또는 핵산 또는 단백질이 생체내 또는 실험실내 생성의 농도보다 높은 수준으로 농축된다는 것을 의미한다. 이것은 균질 상태에 있을 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태에, 또는 수성 용액(이것으로 제한되지는 않음)을 포함하는 용액 중에 있을 수 있다. 이것은 부가의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 성분일 수 있다. 순도 및 동질성은 통상적으로 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기법을 이용하여 결정된다. 제제 중에 존재하는 우세 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는 유전자를 플랭킹하고 관심 있는 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 분리된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 생성시킨다는 것을 의미한다. 특히, 이것은 핵산 또는 단백질이 적어도 85% 순수, 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 99% 또는 초과로 순수하다는 것을 의미할 수 있다.
용어 "핵산"은, 단일 또는 이중 가닥 형태의, 데옥시리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오사이드, 리보뉴클레오사이드, 또는 리보뉴클레오타이드 및 이의 중합체를 의미한다. 구체적으로 제한되지 않은 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지고, 천연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는, 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 구체적으로 달리 제한되지 않은 한, 상기 용어는 또한 PNA를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 유사체(펩티도핵산), 안티센스 기술에서 사용된 DNA의 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)를 의미한다. 달리 표시되지 않은 한, 특정한 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(축퇴성 코돈 치환을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않음) 및 상보성 서열, 및 명확히 표시된 서열을 함축하여 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기에 의해 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 아미노산 잔기의 중합체를 의미하도록 상호교환적으로 사용된다. 즉, 폴리펩타이드에 대한 설명은 펩타이드의 설명 및 단백질의 설명에 동등하게 적용되고, 그 반대도 그렇다. 상기 용어는 천연 발생 아미노산 중합체, 및 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연적으로 코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에 적용된다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 상기 용어는 전장 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함하고, 아미노산 잔기는 공유 펩타이드 결합에 의해 연결된다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 천연 비발생 아미노산, 및 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연으로 코딩된 아미노산은 20개의 공통 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글라이신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프랄린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린) 및 피롤리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 산소, 카복실기, 아미노기 및 R 기에 결합된 탄소를 가지는 화합물, 예컨대 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 의미한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 가지지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산에 대한 언급은 예를 들어 천연 발생 단백질생성 L-아미노산; D-아미노산, 화학 변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 변이체 및 유도체; 천연 발생 단백질비생성 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 오르니틴 등; 및 아미노산에 특징적인 당해 분야에 공지된 특성을 가지는 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다. 천연 비발생 아미노산의 예는 α-메틸 아미노산(예를 들어, α-메틸 알라닌), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(예를 들어, 2-아미노-히스티딘, β-하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘), 부사슬에서 추가의 메틸렌을 가지는 아미노산("호모" 아미노산), 및 부사슬에서의 카복실산 작용기가 설폰산기로 대체된 아미노산(예를 들어, 시스테산)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 단백질로의 합성 비네이티브 아미노산, 치환 아미노산, 또는 하나 이상의 D-아미노산을 포함하는 비천연 아미노산의 도입은 다수의 상이한 방식에서 유리할 수 있다. D-아미노산 함유 펩타이드 등은 L-아미노산 함유 대응물질과 비교하여 실험실내 또는 생체내 증가한 안정성을 나타낸다. 따라서, 펩타이드 등의 작제, 도입한 D-아미노산은 더 높은 세포내 안정성이 원해지거나 필요할 때 특히 유용할 수 있다. 더 구체적으로, D-펩타이드 등은 내인성 펩티다제 및 프로테아제에 내성이어서, 이러한 특성이 바람직할 때 분자의 개선된 생체이용률, 및 생체내 연장된 수명을 제공한다. 부가적으로, D-펩타이드 등은 T 보조 세포에 대한 주요 조직적합 복합체 클래스 II 제한된 제시를 위해 효과적으로 처리될 수 없고, 따라서 전체 유기체에서 체액 면역 반응을 덜 유도할 것이다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생물화학 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)가 추천한 이의 일반 공지된 3 철자 기호 또는 1 철자 기호에 의해 본 명세서에서 칭해질 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드는 이의 흔히 채택된 단일 철자 코드에 의해 칭해질 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정한 핵산 서열과 관련하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 언급되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩타이드를 변경하지 않으면서 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이"(보존적으로 변형된 변이의 일 종임)이다. 폴리펩타이드를 코딩하는 본 명세서에서 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 또한 기술한다. 당해 분야의 당업자는 핵산에서의 각각의 코돈(AUG(메티오닌에 대한 원래 유일한 코돈), 및 TGG(트립토판에 대한 원래 유일한 코돈) 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포된다.
아미노산 서열과 관련하여, 당해 분야의 당업자는 코딩된 서열에서의 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변경하거나, 부가시키거나, 결실시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것이고, 여기서 변경은 아미노산의 결실, 아미노산의 부가, 또는 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 발생시킨다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 또한 본 발명의 다형 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자를 배제하지 않는다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 하기 8개의 기는 각각 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글라이신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 [0139] 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)] 참조).
용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은, 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘(또는 당해 분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 시각 검사에 의해 측정할 때, 비교 창 또는 지정 구역에 걸쳐 비교되고 최대 상응도에 대해 정렬될 때, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 백분율(즉, 특정 구역에 걸쳐 약 60%의 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95%의 동일성)을 가지는 경우 "실질적으로 동일"하다. 이 정의는 또한 시험 서열의 보안에 관안 것이다. 동일성은 적어도 길이 약 50개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드인 구역, 또는 길이 75개 내지 100개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드인 구역에 걸쳐, 또는, 규정되지 않은 경우, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 인간 이외의 종으로부터의 동족체를 포함하는, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 가지는 표지된 프로브와의 엄격한 하이브리드화 조건 하에 라이브러리를 스크리닝하는 단계, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 전장 cDNA 및 게놈 클론을 단리하는 단계를 포함하는 과정에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 하이브리드화 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 서열 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수를 사용할 수 있거나, 대안적인 매개변수가 지정될 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 이후 프로그램 매개변수에 기초하여 기준 서열에 대해 시험 서열에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다.
"비교 창"은, 본 명세서에 사용되는 바대로, 20개 내지 600개, 보통 약 50개 내지 약 200개, 더욱 보통 약 100개 내지 약 150개(여기서, 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열과 비교될 수 있음)로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 수의 임의의 하나의 분절에 대한 기준을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬의 방법은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 문헌[Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 동종성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 동종성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 대한 조사에 의해, 이 알고리즘의 컴퓨터화 실행(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package), 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)(위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각 검사(예를 들어, 문헌[Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 검토)에 의해(이들로 제한되지는 않음) 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성의 백분율을 결정하기 위해 적합한 알고리즘의 일 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이것은 각각 문헌[Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 및 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 ncbi.nlm.nih.gov에서 월드 와이드 웹(World Wide Web)에서 이용 가능한 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공중에게 이용 가능하다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 속도 및 민감도를 결정한다. (뉴클레오타이드 서열에 대한) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 워드 길이(W), 10의 예측(E), M=5, N=-4 및 가닥 둘 다의 비교를 이용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 워드 길이 및 10의 예측(E)을 이용하고, BLOSUM62 점수 매김 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조)는 50의 (B), 10의 예측(E), M=5, N=-4 및 가닥 둘 다의 비교를 정렬한다. BLAST 알고리즘이 통상적으로 수행되고, "낮은 복잡도" 필터가 꺼진다.
BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성의 통계 분석을 또한 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 하나의 측정치는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률의 표시를 제공하는 가장 적은 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교 시 가장 적은 합계 확률이 약 0.2 미만, 또는 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만인 경우 핵산은 기준 서열과 유사하다고 생각된다.
구절 "선택적으로(또는 특이적으로) 하이브리드화한다"는 특정한 뉴클레오타이드 서열이 복합 혼합물(전체 세포, 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA(이들로 제한되지는 않음)를 포함)에 존재할 때 엄격한 하이브리드화 조건 하에 오직 그 서열에 대한 분자의 결합, 이중화 또는 하이브리드화를 의미한다.
구절 "엄격한 하이브리드화 조건"은, 당해 분야에 공지된 바대로, 낮은 이온 농도 및 높은 온도의 조건 하에 DNA, RNA, 또는 다른 핵산의 서열, 또는 이의 조합의 하이브리드화를 의미한다. 통상적으로, 엄격한 조건 하에 프로브는 핵산의 복합 혼합물(전체 세포, 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA(이들로 제한되지는 않음)를 포함)에서 이의 표적 하위서열에 하이브리드화하지만, 복합 혼합물에서 다른 서열에 하이브리드화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 더 긴 서열이 더 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 가이드는 문헌[Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 발견된다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "진핵생물"은 계통발생 도메인 진핵생물계(Eucarya)에 속하는 유기체, 예컨대 동물(포유동물, 곤충, 파충류, 조류(bird) 등(이들로 제한되지는 않음)을 포함), 섬모충류, 식물(외떡잎식물, 쌍떡잎식물, 조류(algae) 등(이들로 제한되지는 않음)을 포함), 진균, 효모, 편모충류, 미포자충류, 원생동물 등을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "원핵생물"은 원핵생물 유기체를 의미한다. 예를 들어, 비진핵생물 유기체는 유박테리아(Eubacteria)(에스체리치아 콜라이, 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 풀루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등(이들로 제한되지는 않음)을 포함) 계통발생 도메인, 또는 고세균(Archaea)(메타노코커스 야나쉬이(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모아우토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움(Halobacterium), 예컨대 할로페락스 볼카니(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아르카에오글로부스 풀지두스(Archaeoglobus fulgidus), 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii), 아에우로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 등(이들로 제한되지는 않음)을 포함) 계통발생 도메인에 속할 수 있다.
용어 "대상체"는, 본 명세서에 사용되는 바대로, 동물, 몇몇 실시형태에서 포유동물, 및 다른 실시형태에서 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 인간을 의미한다. 동물은 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 또는 실험실 동물(예를 들어, 래트, 마우스, 기니아 피그 등)일 수 있다.
용어 "유효량"은, 본 명세서에 사용되는 바대로, 치료되는 질환, 병증 또는 장애의 하나 이상의 증상을 약간의 정도로 경감시키는, 투여되는 1가 항원 결합 작제물의 양을 의미한다. 본 명세서에 기재된 작제물을 함유하는 조성물은 예방, 증대 및/또는 치료학적 치료를 위해 투여될 수 있다.
용어 "증대시킨다" 또는 "증대"는 효력 또는 기간에서 원하는 효과를 증가시키거나 연장한다는 것을 의미한다. 따라서, 약물 분자 또는 치료학적 물질의 효과의 증대와 관련하여, 용어 "증대"는 효력 또는 기간에서 시스템에 대한 치료학적 물질의 효과를 증가시키거나 연장한다는 것을 의미한다. "증대 유효량"은, 본 명세서에 사용되는 바대로, 원하는 시스템에서 또 다른 치료학적 물질 또는 약물의 효과를 증대시키기에 적절한 양을 의미한다. 환자에서 사용될 때, 이 용도에 효과적인 양은 질환, 장애 또는 병증의 중증도 및 과정, 이전 치료, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 주치의의 판단에 따라 달라질 것이다.
용어 "변형된"은, 본 명세서에 사용되는 바대로, 소정의 폴리펩타이드에 이루어진 임의의 변화, 예컨대 폴리펩타이드의 길이, 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 화학 구조, 공번역 변형, 또는 번역 후 변형의 변화를 의미한다. 형태 "(변형된)" 용어는 논의되는 폴리펩타이드가 임의로 변형된다는 것, 즉 논의 중인 폴리펩타이드가 변형 또는 비변형될 수 있다는 것을 의미한다.
용어 "번역 후 변형된"은 폴리펩타이드 사슬로 편입된 후 이러한 아미노산에 이루어진 천연 또는 비천연 아미노산의 임의의 변형을 의미한다. 상기 용어는 오직 예로서 공번역 생체내 변형, 공번역 실험실내 변형(예컨대, 무세포 번역 시스템에서), 번역 후 생체내 변형 및 번역 후 실험실내 변형을 포함한다.
용어 "단일특이적 2가 항원 결합 작제물"은, 본 명세서에 사용되는 바대로, 2개의 항원 결합 도메인(2가)(이들 둘 다 동일한 에피토프/항원(단일특이적)에 결합함)을 가지는 항원 결합 작제물을 의미한다. 항원 결합 도메인은 단백질 작제물, 예컨대 Fab(단편 항원 결합), scFv(단쇄 Fv) 및 sdab(단일 도메인 항체)일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 단일특이적 2가 항원 결합 작제물은 본 명세서에서 또한 "전장 항체" 또는 "FSA"라 불린다. 몇몇 실시형태에서, 단일특이적 2가 항원 결합 작제물은 1가 항원 결합 작제물의 특성이 측정되는 기준이다. 다른 실시형태에서, 2개의 단일특이적 2가 항원 결합 작제물의 조합은 2개의 1가 항원 결합 작제물의 조합의 특성이 측정되는 기준이다. 2개의 단일특이적 2가 항원 결합 작제물의 조합이 사용되는 경우, 단일특이적 2가 항원 결합 작제물은 EGFR에서 비중첩 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 단일특이적 2가 항원 결합 작제물의 조합이 사용되는 경우, 단일 단일특이적 2가 항원 결합 작제물은 기준으로서 사용되고, 여기서 단일 단일특이적 2가 항원 결합 작제물은 치료 표준(standard of care: SOC) 치료제, 예를 들어 얼비툭스를 대표한다.
작제물이 표적에 "특이적으로 결합한다"는 구절은 다른 생물물질의 불균일한 집단의 존재 하의 표적의 존재를 결정하는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지정된 면역검정 조건 하에, 언급된 작제물은 특정한 표적에 특이적으로 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 생물물질에 상당한 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건 하에 표적에 대한 항원 결합 작제물의 특이적 결합은 표적에 특이적인 항원 결합 작제물을 요한다. 다양한 면역검정 포맷은 특정한 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항원 결합 작제물을 선택하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 고상 ELISA 면역검정은 일상적으로 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항원 결합 작제물(예를 들어, 단일클론 항체)을 선택하도록 사용된다. 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 면역검정 포맷 및 조건의 설명을 위해, 예를 들어 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York]을 참조한다.
용어 "결합도"는 본 명세서에서 치료학적 단일특이적 2가 항체의 주요 구조 및 생물학적 속성 및 결합 친화도의 조합된 상승 강도를 의미하도록 사용된다. 결합도의 결여 및 결합의 상승 강도의 손실은 겉보기 표적 결합 친화도를 감소시킬 수 있다. 다른 한편, 고정된 수의 항원을 가지는 표적 세포에서, 다가(또는 2가) 결합으로부터 생긴 결합도는 1가 결합을 나타내는 항체에 대한 항체 분자의 더 낮은 수로 표적 항원의 점유를 증가시킨다. 표적 세포에 결합한 항체 분자의 더 낮은 수로, 2가 용해 항체의 분야에서, 항체 의존적 세포독성 사멸 기전은 효과적으로 발생하지 않아서 효율을 감소시킬 수 있다. 이 유형의 이팩터 기능이 Fc 농도 제한에 의존적인 것으로 일반적으로 생각되면서, 충분한 항체가 ADCC, CDC, ADCP를 매개하도록 결합하지 않는다. 효현 항체의 경우, 결합도 감소는 항원을 가교결합시키고 이합체화하고 경로를 활성화하는 이의 효율을 감소시킨다.
"단일 도메인 항체" 또는 "Sdab" - 단일 도메인 항체, 예컨대 카멜리드 VhH 도메인은 개별 면역글로불린 도메인이다. Sdab는 꽤 안정하고, 항체의 Fc 사슬과 융합 파트너로서 발현하기 쉽다(Harmsen MM, De Haard HJ (2007). "Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments". Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1):13-22).
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "EGFR"은 인간 형태(들)(Ulrich, A. et al., Nature 309:418-425 (1984); 스위스프로트 수탁 번호 P00533; 2차 수탁 번호: O00688, O00732, P06268, Q14225, Q92795, Q9BZS2, Q9GZX1, Q9H2C9, Q9H3C9, Q9UMD7, Q9UMD8, Q9UMG5), 및 이의 천연 발생 아이소폼 및 변이체를 포함하는 표피 성장 인자 수용체(또한 HER-1 또는 Erb-B1로 공지됨)를 의미한다. 이러한 아이소폼 및 변이체는 EGFRvIII 변이체, 대안적인 스플라이싱 생성물(예를 들어, 스위스프로트 수탁 번호 P00533-1, P00533-2, P00533-3, P00533-4로 확인되는 바와 같음), 변이체 GLN-98, ARG-266, Lys-521, ILE-674, GLY-962 및 PRO-988(Livingston, R. J. et al., NIEHS-SNPs, environmental genome project, NIEHS ES15478, Department of Genome Sciences, Seattle, Wash. (2004)), 및 NM005228.3, NM201282.1, NM201283.1, NM201284.1(REFSEQ mRNA); AF125253.1, AF277897.1, AF288738.1, AI217671.1, AK127817.1, AL598260.1, AU137334.1, AW163038.1, AW295229.1, BC057802.1, CB160831.1, K03193.1, U48722.1, U95089.1, X00588.1, X00663.1; H54484S1, H54484S3, H54484S2(MIPS 어셈블리); DT.453606, DT.86855651, DT.95165593, DT.97822681, DT.95165600, DT.100752430, DT.91654361, DT.92034460, DT.92446349, DT.97784849, DT.101978019, DT.418647, DT.86842167, DT.91803457, DT.92446350, DT.95153003, DT.95254161, DT.97816654, DT.87014330, DT.87079224(DOTS 어셈블리)의 수탁 번호로 확인된 기타를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서에 언급된 모든 수탁 번호는 2013년 11월 8일자에 NCBI 데이터베이스(또는 다른 관련 참조 데이터베이스)로부터 취해진다.
"HER 수용체"는 인간 표피 성장 인자 수용체(HER) 패밀리에 속하는 수용체 단백질 타이로신 키나제이고, EGFR, HER2, HER3 및 HER4 수용체를 포함한다. HER 수용체는 HER 리간드에 결합할 수 있는 세포외 도메인; 친유성 막관통 도메인; 보존된 세포내 타이로신 키나제 도메인; 및 인산화될 수 있는 몇몇 타이로신 잔기를 보유하는 카복실 말단 신호전달 도메인을 일반적으로 포함할 것이다.
HER2의 세포외 (외부) 도메인은 도메인 I(ECD1, 약 1개 내지 195개의 아미노산 잔기), 도메인 II(ECD2, 약 196-319개의 아미노산 잔기), 도메인 III(ECD3, 약 320개 내지 488개의 아미노산 잔기), 및 도메인 IV(ECD4, 약 489개 내지 630개의 아미노산 잔기)(신호 펩타이드가 없는 잔기 넘버링)의 4개의 도메인을 포함한다. 문헌[Garrett et al. Mol . Cell. 11:495-505 (2003), Cho et al. Nature 421:756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004), Tse et al. Cancer Treat Rev. 2012 Apr;38(2): 13-42 (2012), 또는 Plowman et al. Proc . Natl . Acad . Sci . 90:1746-1750 (1993)]을 참조한다.
표현 "ErbB2" 및 "HER2"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 예를 들어 문헌[Semba et al, PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) 및 Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986))(진뱅크 수탁 번호 X03363)]에 기재된 인간 HER2 단백질을 의미한다. 용어 "erbB2" 및 "neu"는 유전자 코딩 인간 ErbB2 단백질을 의미하고, p185 또는 p185neu는 neu 유전자의 단백질 생성물을 의미한다. 바람직한 HER2는 네이티브 서열 인간 HER2이다.
"HER 리간드"란 HER 수용체에 결합하고/하거나 이를 활성화는 폴리펩타이드를 의미한다. 본 명세서에 특정한 관심 있는 HER 리간드는 네이티브 서열 인간 HER 리간드, 예컨대 표피 성장 인자(EGF)(Savage et al., J. Biol . Chem . 247:7612-7621 (1972)); 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α)(Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)); 신경초종 또는 각질세포 자가분비 성장 인자로도 공지된 암피레굴린(Shoyab et al. Science 243:1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348:257-260 (1990); 및 Cook et al. Mol . Cell. Biol . 11:2547-2557 (1991)); 베타셀룰린(Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); 및 Sasada et al. Biochem . Biophys . Res. Commun. 190:1173 (1993)); 헤파린 결합 표피 성장 인자(heparin-binding epidermal growth factor: HB-EGF)(Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)); 에피레굴린(Toyoda et al., J. Biol . Chem . 270:7495-7500 (1995); 및 Komurasaki et al. Oncogene 15:2841-2848 (1997)); 헤레굴린(하기 참조); 뉴레굴린-2(NRG-2)(Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); 뉴레굴린-3(NRG-3)(Zhang et al., Proc . Natl . Acad. Sci . 94:9562-9567 (1997)); 뉴레굴린-4(NRG-4)(Harari et al. Oncogene 18:2681-89 (1999)) 또는 크립토(CR-1)(Kannan et al. J. Biol . Chem . 272(6):3330-3335 (1997))이다. EGFR에 결합하는 HER 리간드는 EGF, TGF-α, 암피레굴린, 베타셀룰린, HB-EGF 및 에피레굴린을 포함한다. HER3에 결합하는 HER 리간드는 헤레굴린을 포함한다. HER4에 결합할 수 있는 HER 리간드는 베타셀룰린, 에피레굴린, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 및 헤레굴린을 포함한다.
"헤레굴린"(HRG)은, 본 명세서에 사용되는 바대로, 미국 특허 제5,641,869호 또는 문헌[Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)]에 개시된 바대로 헤레굴린 유전자 생성물에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 의미한다. 헤레굴린의 예는 헤레굴린-α, 헤레굴린-β1, 헤레굴린-β2 및 헤레굴린-β3(Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); 및 미국 특허 제5,641,869호); neu 분화 인자(NDF)(Peles et al. Cell 69:205-216 (1992)); 아세틸콜린 수용체 유도 활성(acetylcholine receptor-inducing activity: ARIA)(Falls et al. Cell 72:801-815 (1993)); 신경교 성장 인자(glial growth factors: GGF)(Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); 감각 및 운동 뉴런 유래 인자(sensory and motor neuron derived factor: SMDF)(Ho et al. J. Biol . Chem . 270:14523-14532 (1995)); γ-헤레굴린(Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997))을 포함한다. 상기 용어는 네이티브 서열 HRG 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 단편 및/또는 아미노산 서열 변이체, 예컨대 이의 EGF양 도메인 단편(예를 들어, HRGβ1177-244)을 포함한다.
"HER 활성화" 또는 "HER2 활성화"는 임의의 하나 이상의 HER 수용체, 또는 HER2 수용체의 활성화 또는 인산화를 의미한다. 일반적으로, HER 활성화는 신호 형질도입(예를 들어, HER 수용체 또는 기질 폴리펩타이드에서 HER 수용체 인산화 타이로신 잔기의 세포내 키나제 도메인에 의해 야기된 것)을 발생시킨다. HER 활성화는 관심 있는 HER 수용체를 포함하는 HER 이합체에 결합하는 HER 리간드에 의해 매개될 수 있다. HER 이합체에 결합하는 HER 리간드는 이합체에서 하나 이상의 HER 수용체의 키나제 도메인을 활성화하고 이로써 하나 이상의 HER 수용체에서의 타이로신 잔기를 인산화하고/하거나, Akt 또는 MAPK 세포내 키나제와 같은 부가의 기질 폴리펩타이드(들)에서의 타이로신 잔기를 인산화할 수 있다.
항체의 "Fab 단편"(또한 단편 항원 결합이라 칭함)은 각각 경쇄 및 중쇄에서 가변 도메인 VL 및 VH를 따라 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. 가변 도메인은 항원 결합에 관여하는 상보성 결정 루프(complementarity determining loop: CDR, 또한 초가변 구역이라 칭함)를 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 구역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇몇 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 다르다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일 실시형태에서, Fv 폴리펩타이드는 항원 결합을 위해 scFv가 원하는 구조를 형성하게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. HER2 항체 scFv 단편은 WO93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호에 기재되어 있다.
비인간(예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분의 경우, 인간화 항체는 수혜자의 초가변 구역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 역량을 가지는 비인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 구역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 구역(framework region: FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 통상적으로 2개의, 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 구역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 상세내용을 위해, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
인간화 HER2 항체는 미국 특허 제5,821,337호(본 명세서에 참조문헌을 명확히 포함됨)의 표 3에 기재된 바와 같은 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 또는 트라스투주맙(허셉틴(등록상표)); 인간화 520C9(WO93/21319) 및 미국 특허 공보 제2006/0018899호에 기재된 바와 같은 20' 인간화 2C4 항체를 포함한다.
"에피토프 2C4"는 항체 2C4가 결합하는 HER2의 세포외 도메인에서의 구역이다. 2C4 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 일상적 가교결합 검정을 수행할 수 있다. 대안적으로, 항체가 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 HER2의 2C4 에피토프에 결합하는지를 평가하기 위해 에피토프 맵핑을 수행할 수 있고/있거나, HER2의 도메인(들)이 항체에 의해 결합되는지를 보기 위해 항체-HER2 구조를 연구할 수 있다(Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)). 에피토프 2C4는 HER2의 세포외 도메인에서 도메인 II로부터의 잔기를 포함한다. 2C4 및 페르투주맙은 도메인 I, II 및 III의 연결부에서 HER2의 세포외 도메인에 결합한다. Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004).
"에피토프 4D5"는 항체 4D5(ATCC CRL 10463) 및 트라스투주맙이 결합하는 HER2의 세포외 도메인에서의 구역이다. 이 에피토프는 HER2의 막관통 도메인에 가깝고, HER2의 도메인 IV 내에 있다. 4D5 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 일상적 가교결합 검정을 수행할 수 있다. 대안적으로, 항체가 HER2의 4D5 에피토프(예를 들어, 약 529번 잔기 내지 약 625번 잔기(포함)의 구역에서의 임의의 하나 이상의 잔기, 미국 특허 공보 제2006/0018899호의 도 1 참조)에 결합하는지를 평가하기 위해 에피토프 맵핑을 수행할 수 있다.
"에피토프 7C2/F3"은 7C2 및/또는 7F3 항체(각각 ATCC에 기탁됨, 하기 참조)가 결합하는 HER2의 세포외 도메인의, 도메인 I 내의, N 말단에서의 구역이다. 7C2/7F3 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 일상적 가교결합 검정을 수행할 수 있다. 대안적으로, 항체가 HER2 상의 7C2/7F3 에피토프(예를 들어, HER2의 약 22번 잔기 내지 약 53번 잔기의 구역에서의 임의의 하나 이상의 잔기, 미국 특허 공보 제2006/0018899호의 도 1 참조)에 결합하는지를 평가하기 위해 에피토프 맵핑을 수행할 수 있다.
용어 "항원 조정"은, 본 명세서에 사용되는 바대로, 예컨대 ADC에서 내재화 또는 하향조절을 통한 표면 수용체 밀도의 변화 또는 손실을 의미한다.
항원 결합 작제물
EGFR 및/또는 HER2에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 CH3 도메인을 각각 포함하는 2개의 단량체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, 낮은 EGFR 및/또는 HER2 발현을 가지는 표적 세포에서 EGFR 및/또는 HER2에 결합하는 단리된 1가 항원 결합 작제물이 소정의 실시형태에서 제공되고, 1개의 상기 단량체 Fc 폴리펩타이드는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물로부터의 적어도 하나의 폴리펩타이드에 융합되고; 상기 항원 결합 작제물은 항증식성이고, 표적 세포에 의해 내재화되고, 상기 작제물은 EGFR 및/또는 HER2에 결합하는 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 표적 세포에서 디스플레이된 EGFR 및/또는 HER2에 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 작제물은 상기 상응하는 2가 EGFR 및/또는 HER2 결합 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 ADCC, 더 높은 ADCP 및 더 높은 CDC 중 적어도 하나를 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 낮은 EGFR 및/또는 HER2 발현을 가지는 표적 세포는 암 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 낮은 EGFR 및/또는 HER2 발현을 가지는 표적 세포는 상피 세포 유래 암 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 삼중 음성 유방암 세포, 유관 유방 관암 세포, 위암 세포, 두경부암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포 또는 결장암 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 낮은 EGFR 및/또는 HER2 발현을 가지는 표적 세포는 유방암 세포이다.
소정의 실시형태에서, 항원에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 공지된 항체 또는 항원 결합 도메인으로부터 유래할 수 있거나, 새로운 항체 또는 항원 결합 도메인으로부터 유래할 수 있다. 1가 항원 결합 작제물에 대한 항원 결합 폴리펩타이드 작제물의 확인은 표적 세포의 선택 및 표적 세포의 표면에서 발현된 항원의 선택에 기초한다. 예를 들어, 표적 세포가 선택되면, a) 표적 세포의 세포 표면에서 발현되지만, 다른 세포의 표면에서 발현되지 않은 항원, 또는 b) 표적 세포의 세포 표면에서 더 높은 수준으로 발현되지만, 다른 세포의 표면에서 더 낮은 수준으로 발현된 항원이 선택된다. 이것은 표적 세포의 선택적 표적화를 허용한다.
EGFR 결합 작제물
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물은 EGFR을 발현하는 세포를 표적화하도록 설계되고, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 EGFR에 결합한다. EGFR은 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 패밀리에 속하는 원암유전자이고, 암의 하위세트에서 대개 과발현된다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 EGFR에 결합하고, 표적 세포는 낮은, 중간 또는 높은 EGFR 발현 세포이다. 일 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 EGFR에 결합하고, 표적 세포는 낮은 EGFR 발현 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 EGFR에 결합하고, 표적 세포는 2가 EGFR 결합 항체에 결합이 감소한 낮은 EGFR 발현 세포이다. 추가의 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 EGFR에 결합하고, 표적 세포는 낮은 EGFR 발현 세포이다. 일 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 EGFR에 결합하고, 표적 세포는 암 세포이다. 소정의 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 EGFR에 결합하고, 표적 세포는 상피 세포 유래 암 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 삼중 음성 유방암 세포, 유관 유방 관암 세포, 위암 세포, 두경부암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포 또는 결장암 세포이다.
본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물의 몇몇 실시형태에서, 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물은 이종이합체이다. 기재된 1가 항원 결합 작제물의 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 EGFR에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 적어도 하나의 EGFR 세포외 도메인에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 낮은, 중간 또는 높은 EGFR 발현 세포인 표적 세포에 의해 발현된 EGFR에 결합한다. 소정의 실시형태에서, EGFR 발현 세포는 2가 EGFR 결합 항체에 감소한 결합을 나타낸다. 일 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 EGFR에 결합하고, 표적 세포는, 2가 EGFR 결합 항체에 대한 결합이 감소한, 에스트로겐 수용체 음성 세포, 프로게스테론 수용체 음성 세포 및 항-EGFR 항체 내성 종양 세포 중 적어도 하나이다.
본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물의 몇몇 실시형태에서, 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물은 이종이합체이다. 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물의 소정의 실시형태에서, 1가 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 Fab 단편, scFv 및 sdAb, 항원 결합 펩타이드, 또는 항원에 결합할 수 있는 단백질 도메인이다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 제공되고, 1가 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 Fab 단편이다.
EGFR에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 CH3 도메인을 각각 포함하는 2개의 단량체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, EGFR에 결합하는 단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 제공되고, 1개의 상기 단량체 Fc 폴리펩타이드는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물로부터의 적어도 하나의 폴리펩타이드에 융합되고; 상기 항원 결합 작제물은 항증식성이고, 표적 세포에 의해 내재화되고, 상기 작제물은 EGFR에 결합하는 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 표적 세포에 디스플레이된 EGFR에 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 작제물은 상기 상응하는 2가 EGFR 결합 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 ADCC, 더 높은 ADCP 및 더 높은 CDC 중 적어도 하나를 나타낸다.
소정의 실시형태에서 EGFR에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 CH3 도메인을 각각 포함하는 2개의 단량체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, 낮은 EGFR 발현을 가지는 표적 세포에서 EGFR에 결합하는 단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 제공되고, 1개의 상기 단량체 Fc 폴리펩타이드는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물로부터의 적어도 하나의 폴리펩타이드에 융합되고; 상기 항원 결합 작제물은 항증식성이고, 표적 세포에 의해 내재화되고, 상기 작제물은 EGFR에 결합하는 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 표적 세포에 디스플레이된 EGFR에 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 작제물은 상기 상응하는 2가 EGFR 결합 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 ADCC, 더 높은 ADCP 및 더 높은 CDC 중 적어도 하나를 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 낮은 EGFR 발현을 가지는 표적 세포는 암 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 낮은 EGFR 발현을 가지는 표적 세포는 상피 세포 유래 암 세포이다.
일 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 항원 결합 작제물은 표적 세포 증식을 저해한다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 1가 EGFR 결합 폴리펩타이드 작제물은 Fab, scFv, sdAb 또는 폴리펩타이드 중 적어도 하나이다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 작제물은 2개의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물의 ADCC, ADCP 및 CDC 중 적어도 하나의 더 높은 정도를 보유한다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 작제물은 2개의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물의 ADCC, ADCP 및 CDC 중 적어도 하나의 적어도 약 105%를 보유한다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 작제물은 2개의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물의 ADCC, ADCP 및 CDC 중 적어도 하나의 약 110% 초과를 보유한다.
HER2 결합 작제물
몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물은 HER2를 발현하는 세포를 표적화하도록 설계되고, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 결합한다. HER2는 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 패밀리에 속하는 원암유전자이고, 대개 유방암의 하위세트에서 과발현된다. HER2 단백질은 neu 유전자, EGFR2, CD340, ErbB2 및 p185의 생성물이라 또한 칭한다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 결합하고, 표적 세포는 낮은, 중간 또는 높은 HER2 발현 세포이다. 일 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 결합하고, 표적 세포는 낮은 HER2 발현 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 결합하고, 표적 세포는 2가 HER2 결합 항체에 대한 결합이 감소한 낮은 HER2 발현 세포이다. 추가의 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 결합하고, 표적 세포는 트라스투주맙에 대한 결합이 감소한 낮은 HER2 발현 세포이다. 일 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 결합하고, 표적 세포는 암 세포이다. 소정의 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 결합하고, 표적 세포는 유방암 세포이다.
본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물의 몇몇 실시형태에서, 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물은 이종이합체이다. 기재된 1가 항원 결합 작제물의 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 적어도 하나의 HER2 세포외 도메인에 결합한다. 소정의 실시형태에서, 세포외 도메인은 ECD1, ECD2, ECD3 및 ECD4 중 적어도 하나이다. 소정의 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 낮은, 중간 또는 높은 HER2 발현 세포인 표적 세포에 의해 발현된 HER2에 결합한다. 소정의 실시형태에서, HER2 발현 세포는 2가 HER2 결합 항체에 대한 감소한 결합을 나타낸다. 일 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 HER2에 결합하고, 표적 세포는, 2가 HER2 결합 항체에 대한 결합이 감소한, 에스트로겐 수용체 음성 세포, 프로게스테론 수용체 음성 세포 및 항-HER2 항체 내성 종양 세포 중 적어도 하나이다.
본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물의 몇몇 실시형태에서, 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물은 이종이합체이다. 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물의 소정의 실시형태에서, 1가 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 Fab 단편, scFv 및 sdAb, 항원 결합 펩타이드, 또는 항원에 결합할 수 있는 단백질 도메인이다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 제공되고, 1가 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 Fab 단편이다.
HER2에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 CH3 도메인을 각각 포함하는 2개의 단량체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, HER2에 결합하는 단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 제공되고, 1개의 상기 단량체 Fc 폴리펩타이드는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물로부터의 적어도 하나의 폴리펩타이드에 융합되고; 상기 항원 결합 작제물은 항증식성이고, 표적 세포에 의해 내재화되고, 상기 작제물은 HER2에 결합하는 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 표적 세포에 디스플레이된 HER2에 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 작제물은 상기 상응하는 2가 HER2 결합 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 ADCC, 더 높은 ADCP 및 더 높은 CDC 중 적어도 하나를 나타낸다.
HER2에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 CH3 도메인을 각각 포함하는 2개의 단량체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, 낮은 HER2 발현을 가지는 표적 세포에서 HER2에 결합하는 단리된 1가 항원 결합 작제물이 소정의 실시형태에서 제공되고, 1개의 상기 단량체 Fc 폴리펩타이드는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물로부터의 적어도 하나의 폴리펩타이드에 융합되고; 상기 항원 결합 작제물은 항증식성이고, 표적 세포에 의해 내재화되고, 상기 작제물은 HER2에 결합하는 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 표적 세포에 디스플레이된 HER2에 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 작제물은 상기 상응하는 2가 HER2 결합 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 ADCC, 더 높은 ADCP 및 더 높은 CDC 중 적어도 하나를 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 낮은 HER2 발현을 가지는 표적 세포는 암 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 낮은 HER2 발현을 가지는 표적 세포는 유방암 세포이다.
ECD 1, ECD 2 및 ECD 3-4 중 적어도 하나인 세포외 도메인(ECD)에서 HER2에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 CH3 도메인을 각각 포함하는 2개의 단량체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, HER2에 결합하는 단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 제공되고, 1개의 상기 단량체 Fc 폴리펩타이드는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물로부터의 적어도 하나의 폴리펩타이드에 융합되고; 상기 항원 결합 작제물은 항증식성이고, 표적 세포에 의해 내재화되고, 상기 작제물은 HER2에 결합하는 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 표적 세포에 디스플레이된 HER2 ECD 1, 2, 및 3-4 중 적어도 하나에 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 작제물은 상기 상응하는 2가 HER3 결합 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 ADCC, 더 높은 ADCP 및 더 높은 CDC 중 적어도 하나를 나타낸다.
ECD 1, ECD 2, ECD 3 및 ECD4 중 적어도 하나인 세포외 도메인(ECD)에서 HER2에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 2개의 단량체 Fc 폴리펩타이드(각각 CH3 도메인을 포함하고, 1개의 상기 단량체 Fc 폴리펩타이드는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물로부터의 적어도 하나의 폴리펩타이드에 융합됨)를 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, HER2에 결합하는 단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 제공되고; 상기 항원 결합 작제물은 항증식성이고, 표적 세포에 의해 내재화되고, 상기 작제물은 HER2에 결합하는 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 표적 세포에 디스플레이된 HER2 ECD 1, 2, 3 및 4 중 적어도 하나에 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 작제물은 상기 상응하는 2가 HER2 결합 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 ADCC, 더 높은 ADCP 및 더 높은 CDC 중 적어도 하나를 나타낸다.
일 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 항원 결합 작제물은 표적 세포 증식을 저해한다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 1가 HER2 결합 폴리펩타이드 작제물은 Fab, scFv, sdAb 또는 폴리펩타이드 중 적어도 하나이다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 작제물은 2개의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물의 ADCC, ADCP 및 CDC 중 적어도 하나의 더 높은 정도를 보유한다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 작제물은 2개의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물의 ADCC, ADCP 및 CDC 중 적어도 하나의 적어도 약 105%를 보유한다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 작제물은 2개의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물의 ADCC, ADCP 및 CDC 중 적어도 하나의 약 110% 초과를 보유한다.
표적 세포의 선택
표적 세포는 1가 항원 결합 작제물의 의도된 사용에 기초하여 선택된다. 일 실시형태에서, 표적 세포는 암, 감염성 질환, 자가면역 질환 또는 염증성 질환에서 활성화되거나 증식된 세포이다.
1가 항원 결합 작제물이 암의 치료에 사용하도록 의도되는 일 실시형태에서, 표적 세포는 EGFR 및/또는 HER2 3+ 과발현을 나타내는 종양으로부터 유래한다. 일 실시형태에서, 표적 세포는 EGFR 및/또는 HER2 저발현을 나타내는 종양으로부터 유래한다. 일 실시형태에서, 표적 세포는 EGFR 및/또는 HER2 내성을 나타내는 종양으로부터 유래한다. 일 실시형태에서, 표적 세포는 삼중 음성(ER/PR/HER2) 종양인 종양으로부터 유래한다.
1가 항원 결합 작제물이 암의 치료에 사용하도록 의도되는 실시형태에서, 표적 세포는 EGFR 및/또는 HER2 3+ 과발현을 대표하는 암 세포주이다. 일 실시형태에서, 표적 세포는 EGFR 및/또는 HER2 저발현을 대표하는 암 세포주이다. 일 실시형태에서, 표적 세포는 EGFR 및/또는 HER2 내성을 대표하는 암 세포주이다. 일 실시형태에서, 표적 세포는 유방암 삼중 음성을 대표하는 암 세포주, 예를 들어 MDA-MD-231 세포이다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 1가 항원 결합 작제물은 유방암 세포 또는 상피 세포 유래 암 세포를 표적화하도록 설계된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물은 위 및 식도 선암을 표적화하도록 설계된다. 예시적인 조직학적 유형은 장 표현형을 가지는 HER2 양성 근위 위 암종 및 HER2 양성 원위 미만성 위 암종을 포함한다. 위암 세포의 예시적인 종류는 (N-87, OE-19, SNU-216 및 MK-7)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물은 뇌에서 전이성 HER2+ 유방암 종양을 표적화하도록 설계된다. 위암 세포의 예시적인 종류는 BT474를 포함하지만, 이것들로 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 1가 항원 결합 작제물이 암 세포를 표적화하도록 설계된 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 암 세포의 표면에서 발현된 항원에 1가로 결합한다. 적합한 항원은 EGFR 및/또는 HER2를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물이 표적 세포에서 표적 항원의 세포외 도메인에 결합하는 에피토프.
1가 항원 결합 작제물이 EGFR에 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 EGFR, 또는 EGFR의 특정한 도메인 또는 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 EGFR의 세포외 도메인에 결합한다.
항체의 선택
1가 항원 결합 작제물이 EGFR에 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은, Fab 단편, scFv 및 sdab를 포함하는, 다양한 포맷의 공지된 항-EGFR 항체 또는 항-EGFR 결합 도메인으로부터 유래할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 이 항체의 인간화, 또는 키메라 버전으로부터 유래할 수 있다. 일 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 트라스투주맙, 페르투주맙, 세툭시맙의 Fab 단편, 또는 이의 인간화 버전으로부터 유래한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 scFv로부터 유래한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물은 sdab로부터 유래한다.
FC
항원 결합 작제물은 Fc, 예를 들어 이합체 Fc를 포함할 수 있다.
용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 구역"은 본 명세서에서 불변 구역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 구역을 한정하도록 사용된다. 상기 용어는 네이티브 서열 Fc 구역 및 변이체 Fc 구역을 포함한다. 본 명세서에 달리 언급되지 않은 한, Fc 구역 또는 불변 구역에서의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바대로 EU 인덱스라 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다. 본 명세서에 사용되는 이합체 Fc의 "Fc 폴리펩타이드"는 이합체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩타이드, 즉 안정한 자기 회합할 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 불변 구역을 포함하는 폴리펩타이드 중 1개를 의미한다. 예를 들어, 이합체 IgG Fc의 Fc 폴리펩타이드는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인 서열을 포함한다.
Fc 도메인은 CH3 도메인 또는 CH3 및 CH2 도메인 중 어느 하나를 포함한다. CH3 도메인은 2개의 CH3 서열을 포함한다(1개는 이합체 Fc의 2개의 Fc 폴리펩타이드의 각각으로부터임). CH2 도메인은 2개의 CH2 서열을 포함한다(1개는 이합체 Fc의 2개의 Fc 폴리펩타이드의 각각으로부터임).
몇몇 양상에서, Fc는 적어도 1개 또는 2개의 CH3 서열을 포함한다. 몇몇 양상에서, Fc는, 하나 이상의 링커와 함께 또는 링커 없이, 제1 항원 결합 작제물 및/또는 제2 항원 결합 작제물에 커플링된다. 몇몇 양상에서, Fc는 인간 Fc이다. 몇몇 양상에서, Fc는 인간 IgG 또는 IgG1 Fc이다. 몇몇 양상에서, Fc는 이종이합체 Fc이다. 몇몇 양상에서, Fc는 적어도 1개 또는 2개의 CH2 서열을 포함한다.
몇몇 양상에서, Fc는 CH3 서열 중 적어도 하나에서 하나 이상의 변형을 포함한다. 몇몇 양상에서, Fc는 CH2 서열 중 적어도 하나에서 하나 이상의 변형을 포함한다. 몇몇 양상에서, Fc는 단일 폴리펩타이드, 예를 들어 이합체 Fc이고, 여기서 이합체의 2개의 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된다. 몇몇 양상에서, Fc는 다수의 펩타이드, 예를 들어 2개의 폴리펩타이드이다.
몇몇 양상에서, Fc는 특허 출원 PCT/CA2011/001238(2011년 11월 4일자에 출원) 또는 PCT/CA2012/050780(2012년 11월 2일자에 출원)(이들 각각의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 Fc이다.
변형된 CH3 도메인
몇몇 양상에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 비대칭적으로 변형된 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이합체 Fc를 포함한다. 이종이합체 Fc는 제1 Fc 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드(상호교환적으로 사용될 수 있되, 단 Fc는 1개의 제1 Fc 폴리펩타이드 및 1개의 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함함)인 2개의 중쇄 불변 도메인 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 제1 Fc 폴리펩타이드는 제1 CH3 서열을 포함하고, 제2 Fc 폴리펩타이드는 제2 CH3 서열을 포함한다.
비대칭 방식으로 도입된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 2개의 CH3 서열은 일반적으로, 2개의 CH3 서열이 이합체화될 때, 동종이합체보다는 이종이합체 Fc를 생성시킨다. 본 명세서에 사용되는 바대로, "비대칭 아미노산 변형"은 제1 CH3 서열에서 특정 위치에서의 아미노산이 제2 CH3 서열에서 동일한 위치에서의 아미산과 다른 임의의 변형을 의미하고, 제1 및 제2 CH3 서열은 우선적으로 쌍을 지어 동종이합체보다는 이종이합체를 형성한다. 이 이종이합체화는 각각의 서열에서 동일한 각각의 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산의 오직 하나의 변형; 또는 제1 및 제2 CH3 서열의 각각에서 동일한 각각의 위치에서의 각각의 서열에서 아미노산 둘 다의 변형의 결과일 수 있다. 이종이합체 Fc의 제1 및 제2 CH3 서열은 하나 또는 하나 초과의 비대칭 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
표 A는 전장 인간 IgG1 중쇄의 231번 내지 447번 아미노산에 상응하는 인간 IgG1 Fc 서열의 아미노산 서열을 제공한다. CH3 서열은 전장 인간 IgG1 중쇄의 341번 내지 447번 아미노산을 포함한다.
통상적으로 Fc는 이합체화할 수 있는 2개의 인접 중쇄 서열(A 및 B)을 포함할 수 있다. 몇몇 양상에서, Fc의 하나의 서열 또는 서열 둘 다는 EU 넘버링을 이용하여 L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400 및/또는 N390의 위치에서 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 포함한다. 몇몇 양상에서, Fc는 표 A에 기재된 돌연변이체 서열을 포함한다. 몇몇 양상에서, Fc는 변이체 1 A-B의 돌연변이를 포함한다. 몇몇 양상에서, Fc는 변이체 2 A-B의 돌연변이를 포함한다. 몇몇 양상에서, Fc는 변이체 3 A-B의 돌연변이를 포함한다. 몇몇 양상에서, Fc는 변이체 4 A-B의 돌연변이를 포함한다. 몇몇 양상에서, Fc는 변이체 5 A-B의 돌연변이를 포함한다.
Figure pct00002
제1 및 제2 CH3 서열은, 전장 인간 IgG1 중쇄의 231번 내지 447번 아미노산과 관련하여, 본 명세서에 기재된 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종이합체는 Fc는 F405번 및 Y407번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제1 CH3 서열, 및 T394번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제2 CH3 서열을 가지는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 L351Y, F405A 및 Y407V로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 가지는 제1 CH3 서열, 및 T366L, T366I, K392L, K392M 및 T394W로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 가지는 제2 CH3 서열을 가지는 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 L351번, F405번 및 Y407번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제1 CH3 서열, 및 T366, K392 및 T394번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제2 CH3 서열을 가지는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 제1 또는 제2 CH3 서열 중 하나는 Q347번 위치에서 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 다른 CH3 서열은 K360번 위치에서 아미노산 변형을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 L351번, F405번 및 Y407번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제1 CH3 서열, 및 T366번, K392번 및 T394번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제2 CH3 서열을 가지는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 제1 또는 제2 CH3 서열 중 하나는 Q347번 위치에서 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 다른 CH3 서열은 K360번 위치에서 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 상기 CH3 서열 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 변형 T350V를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 L351번, F405번 및 Y407번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제1 CH3 서열, 및 T366번, K392번 및 T394번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제2 CH3 서열을 가지는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제1 및 제2 CH3 서열 중 하나는 D399R 또는 D399K의 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 다른 CH3 서열은 T411E, T411D, K409E, K409D, K392E 및 K392D 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 L351번, F405번 및 Y407번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제1 CH3 서열, 및 T366번, K392번 및 T394번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제2 CH3 서열을 가지는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 제1 또는 제2 CH3 서열 중 하나는 D399R 또는 D399K의 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 다른 CH3 서열은 T411E, T411D, K409E, K409D, K392E 및 K392D 중 하나 이상을 포함하고, 상기 CH3 서열 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 변형 T350V를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 L351번, F405번 및 Y407번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제1 CH3 서열, 및 T366번, K392번 및 T394번 위치에서 아미노산 변형을 가지는 제2 CH3 서열을 가지는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 상기 CH3 서열 중 하나 또는 둘 다는 T350V의 아미노산 변형을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 하기 아미노산 변형을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 여기서 "A"는 제1 CH3 서열에 대한 아미노산 변형을 나타내고, "B"는 제2 CH3 서열에 대한 아미노산 변형을 나타낸다: A: L351Y_F405A_Y407V, B: T366L_K392M_T394W, A: L351Y_F405A_Y407V, B: T366L_K392L_T394W, A: T350V_L351Y_F405A_Y407V, B: T350V_T366L_K392L_T394W, A: T350V_L351Y_F405A_Y407V, B: T350V_T366L_K392M_T394W, A: T35GV_L351Y_S400E_F405A_Y407V 및/또는 B: T350V_T366L_N390R_K392M_T394W.
하나 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이종이합체 Fc의 형성을 촉진할 수 있고, 이종이합체 CH3 도메인은 야생형 동종이합체 CH3 도메인에 필적하는 안정성을 가진다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이종이합체 Fc 도메인의 형성을 촉진하고, 이종이합체 Fc 도메인은 야생형 동종이합체 Fc 도메인에 필적하는 안정성을 가진다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이종이합체 Fc 도메인의 형성을 촉진하고, 이종이합체 Fc 도메인은 시차 주사 열량계 연구에서 융점(Tm)을 통해 관찰된 안정성을 가지고, 융점은 상응하는 대칭 야생형 동종이합체 Fc 도메인에 관찰된 것의 4℃ 이내이다. 몇몇 양상에서, Fc는 야생형 동종이합체 Fc에 필적하는 안정성으로 이종이합체 Fc의 형성을 촉진하는 적어도 하나의 CH3 서열에서의 하나 이상의 변형을 포함한다.
일 실시형태에서, CH3 도메인의 안정성은 예를 들어 시차 주사 열량계(differential scanning calorimetry: DSC)에 의해 CH3 도메인의 융점을 측정함으로써 평가될 수 있다. 따라서, 추가의 실시형태에서, CH3 도메인은 약 68℃ 이상의 융점을 가진다. 또 다른 실시형태에서, CH3 도메인은 약 70℃ 이상의 융점을 가진다. 또 다른 실시형태에서, CH3 도메인은 약 72℃ 이상의 융점을 가진다. 또 다른 실시형태에서, CH3 도메인은 약 73℃ 이상의 융점을 가진다. 또 다른 실시형태에서, CH3 도메인은 약 75℃ 이상의 융점을 가진다. 또 다른 실시형태에서, CH3 도메인은 약 78℃ 이상의 융점을 가진다. 몇몇 양상에서, 이합체화된 CH3 서열은 약 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 77.5℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃ 또는 85℃ 이상의 융점(Tm)을 가진다.
몇몇 실시형태에서, 변형된 CH3 서열을 포함하는 이종이합체 Fc는 발현된 생성물에서 동종이합체 Fc와 비교하여 적어도 약 75%의 순도로 형성될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 약 80% 초과의 순도로 형성된다. 또 다른 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 약 85% 초과의 순도로 형성된다. 또 다른 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 약 90% 초과의 순도로 형성된다. 또 다른 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 약 95% 초과의 순도로 형성된다. 또 다른 실시형태에서, 이종이합체 Fc는 약 97% 초과의 순도로 형성된다. 몇몇 양상에서, Fc는 발현될 때 약 75% 초과, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 순도로 형성된 이종이합체이다. 몇몇 양상에서, Fc는, 단일 세포를 통해 발현될 때, 약 75% 초과, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 순도로 형성된 이종이합체이다.
이종이합체 Fc 형성을 촉진하기 위해 단량체 Fc 폴리펩타이드를 변형시키기 위한 부가의 방법은 국제 특허 공보 WO 제96/027011호(구멍에 손잡이), 문헌[Gunasekaran et al. (Gunasekaran K. et al. (2010) J Biol Chem. 285, 19637-46, 선택적 이종이합체화를 달성하기 위한 정전 설계)], 문헌[Davis et al. (Davis, JH. et al. (2010) Prot Eng Des Sel; 23(4):195-202, 가닥 교환 조작 도메인(strand exchange engineered domain: SEED) 기술)] 및 문헌[Labrijn et al [Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange. Labrijn AF, Meesters JI, de Goeij BE, van den Bremer ET, Neijssen J, van Kampen MD, Strumane K, Verploegen S, Kundu A, Gramer MJ, van Berkel PH, van de Winkel JG, Schuurman J, Parren PW. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Mar 26; 110(13):5145-50]에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단리된 항원 결합 작제물은 항원에 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 동일한 이합체 Fc를 포함하지 않는 항원 결합 작제물에 비해 안정성 및 제조 용이성과 같은 더 우수한 생물물리학적 특성을 가지는 이합체 Fc를 포함한다. 상이한 Fc-감마 수용체에 대한 Fc의 친화도를 선택적으로 변경하기 위한 Fc 구역에서의 다수의 아미노산 변형이 당해 분야에 공지되어 있다. 몇몇 양상에서, Fc는 Fc-감마 수용체의 선택적 결합을 촉진하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 이 유형의 아미노산 변형은 통상적으로 항원 결합 작제물의 CH2 도메인 또는 힌지 구역에 위치한다.
CH2 도메인
Fc의 CH2 도메인은 표 A에 기재된 서열의 231번 내지 340번 아미노산이다. 예시적인 돌연변이는 하기 기재되어 있다:
Figure pct00003
S298A/E333A/K334A, S298A/E333A/K334A/K326A(Lu Y, Vernes JM, Chiang N, et al. J Immunol Methods. 2011 Feb 28; 365(1-2):132-41);
Figure pct00004
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(Stavenhagen JB, Gorlatov S, Tuaillon N, et al. Cancer Res. 2007 Sep 15; 67(18):8882-90; Nordstrom JL, Gorlatov S, Zhang W, et al. Breast Cancer Res. 2011 Nov 30; 13(6):R123);
Figure pct00005
F243L(Stewart R, Thorn G, Levens M, et al. Protein Eng Des Sel. 2011 Sep; 24(9):671-8.), S298A/E333A/K334A(Shields RL, Namenuk AK, Hong K, et al. J Biol Chem. 2001 Mar 2; 276(9):6591-604);
Figure pct00006
S239D/I332E/A330L, S239D/I332E(Lazar GA, Dang W, Karki S, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Mar 14; 103(11):4005-10);
Figure pct00007
S239D/S267E, S267E/L328F(Chu SY, Vostiar I, Karki S, et al. Mol Immunol. 2008 Sep; 45(15):3926-33);
Figure pct00008
S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/S298A/K326A/A327H, G237F/S298A/A33 0L/I332E, S239D/I332E/S298A, S239D/K326E/A330L/I332E/S298A, G236A/S239 D/D270L/I332E, S239E/S267E/H268D, L234F/S267E/N325L, G237F/V266L/S267D 및 WO2011/120134 및 WO2011/120135(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 다른 돌연변이. 문헌[Therapeutic Antibody Engineering (by William R. Strohl and Lila M. Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1907568379, Oct 2012)]은 283페이지에 돌연변이를 수록하였다.
몇몇 실시형태에서, CH2 도메인은 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, CH2 도메인은 FcγR의 선택적 결합을 증대시키는 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, CH2 도메인은 본 명세서에 기재된 단리된 작제물의 분리 및 정제를 허용한다.
이팩터 기능을 개선하기 위한 부가의 변형.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 이의 이팩터 기능을 개선하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 당해 분야에 공지되어 있고, 탈푸코실화, 또는 활성화 수용체에 대한 Fc, 즉 ADCC에 대한 FCGR3a, 및 CDC에 대한 Clq의 친화도의 조작을 포함한다. 하기 표 B1은 이팩터 기능 조작에 대한 문헌에 보고된 다양한 설계를 요약한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 작제물은 개선된 이팩터 기능을 부여하는 표 B1에 기재된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이합체 Fc를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 작제물은 이팩터 기능을 개선하기 위해 탈푸코실화될 수 있다.
Figure pct00009
FcγR 및/또는 보체 결합 및/또는 이팩터 기능을 감소시키는 Fc 변형은 당해 분야에 공지되어 있다. 최근의 간행물은 이팩터 활성이 감소하거나 침묵화된 항체를 조작하기 위해 사용된 전략을 기재한다(문헌[Strohl, WR (2009), Curr Opin Biotech 20:685-691, 및 Strohl, WR and Strohl LM, "Antibody Fc engineering for optimal antibody performance" In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225-249] 참조). 이 전략은 글라이코실화의 변형을 통한 이팩터 기능의 감소, IgG2/IgG4 스캐폴드의 사용, 또는 Fc의 힌지 또는 CH2 구역에서의 돌연변이의 도입을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공보 제2011/0212087호(Strohl), 국제 특허 공보 WO 제2006/105338호(Xencor), 미국 특허 공보 제2012/0225058호(Xencor), 미국 특허 공보 제2012/0251531호(Genentech), 및 문헌[Strop et al ((2012) J. Mol. Biol. 420: 204-219)]은 FcγR 또는 Fc에 대한 보체 결합을 감소시키는 특정 변형을 기술한다.
공지된 아미노산 변형의 구체적인 비제한적인 예는 하기 표에 확인된 것을 포함한다:
Figure pct00010
일 실시형태에서, Fc는 상기 표에서 확인된 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 실시형태에서 Fc는 L234, L235 또는 D265 중 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, Fc는 L234, L235 및 D265에서의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, Fc는 아미노산 변형 L234A, L235A 및 D265S를 포함한다.
FcRn 결합 및 PK 매개변수
당해 분야에 공지된 바대로, FcRn에 대한 결합은 엔도솜으로부터 세포내이입된 항체(endocytosed antibody)를 혈류로 다시 재순환시킨다(Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766). 전장 분자의 큰 크기로 인한 신장 여과의 저지와 커플링된 이 과정은 1주 내지 3주의 범위의 양호한 항체 혈청 반감기를 발생시킨다. FcRn에 대한 Fc의 결합은 또한 항체 수송에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 FcRn에 결합할 수 있다.
링커
본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 본 명세서에 기재된 Fc에 작동 가능하게 커플링된 하나 이상의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함할 수 있다. 몇몇 양상에서, Fc는 하나 이상의 링커에 의해 하나 이상의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물에 커플링된다. 몇몇 양상에서, Fc는 하나 이상의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물에 직접적으로 커플링된다. 몇몇 양상에서, Fc는 링커에 의해 각각의 항원 결합 폴리펩타이드의 중쇄에 커플링된다.
몇몇 양상에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 폴리펩타이드 링커이다. 몇몇 양상에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 IgG1 힌지 구역을 포함한다.
기능을 개선하기 위한 항원 결합 작제물의 부가의 변형
몇몇 실시형태에서 항원에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 CH3 도메인을 포함하고 변이체 CH2 도메인을 추가로 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있다. 몇몇 실시형태에서, 변이체 CH2 도메인은 FcγR의 선택적 결합을 촉진하는 비대칭 아미노산 변형을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 변이체 CH2 도메인은 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항체의 분리 및 정제를 허용한다.
몇몇 실시형태에서 항원에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고; 항원 결합 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 통해 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 단량체 Fc 폴리펩타이드에 융합된다.
몇몇 실시형태에서 항원에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고; 항원 결합 폴리펩타이드는 Fab이고, Fab의 중쇄는 폴리펩타이드를 통해 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 단량체 Fc 폴리펩타이드에 융합되고, Fab의 경쇄는 폴리펩타이드를 통해 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 단량체 Fc 폴리펩타이드에 융합된다.
몇몇 실시형태에서 항원에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고; 항원 결합 폴리펩타이드는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 단량체 Fc 폴리펩타이드 및 임의의 항원에 결합할 수 없는 제2 폴리펩타이드에 융합되고; 제2 폴리펩타이드는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 단량체 Fc 폴리펩타이드에 융합되고; 2개의 단량체 Fc 폴리펩타이드는 쌍을 지어 이합체를 형성한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명에 따른 1가 항원 결합 작제물은 변형되어 이의 이팩터 기능을 개선할 수 있다. 이러한 변형은 당해 분야에 공지되어 있고, 탈푸코실화, 또는 활성화 수용체에 대한 항체의 Fc 부분, 즉 ADCC에 대한 FCGR3a, 및 CDC에 대한 Clq의 친화도의 조작을 포함한다. 하기 표 A3은 이팩터 기능 조작에 대한 문헌에 보고된 상이한 설계를 요약한 것이다.
Figure pct00011
따라서, 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은, 개선된 이팩터 기능을 부여하는, 상기 표에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 탈푸코실화되어 이팩터 기능을 개선한다.
아미노산 서열을 변경하지 않으면서 Fcγ 글라이코실화 부위(Asn 297 EU 넘버링)에 푸코스가 없거나 거의 없는 항원 결합 작제물을 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. GlymaX(등록상표) 기술(ProBioGen AG)은 항원 결합 작제물 제조에 사용된 세포로의 푸코스 생합성의 세포 경로를 피하는 효소에 대한 유전자의 도입에 기초한다. 이는 항원 결합 작제물 생성 세포에 의한 N 연결 항체 탄수화물 부분에 대한 당 "푸코스"의 첨가를 방지한다(von Horsten et al. (2010) Glycobiology. 2010 Dec; 20(12):1607-18). 더 낮은 수준의 푸코실화를 가지는 항원 결합 작제물을 얻는 또 다른 접근법은 미국 특허 제8,409,572호(항원 결합 작제물에서 더 낮은 수준의 푸코실화를 생성하는 이의 능력에 대해 항원 결합 작제물 제조를 위한 세포주를 선택하는 것을 교시함)에서 발견될 수 있다. 항원 결합 작제물은 완전 탈푸코실화될 수 있거나(이들이 검출 가능한 푸코스를 함유하지 않는다는 것을 의미), 또는 이들이 부분 탈푸코실화될 수 있어서, 단리된 항체가 포유동물 발현 시스템에 의해 생성된 유사한 항체에 대해 보통 검출된 푸코스의 양의 95% 미만, 85% 미만, 75% 미만, 65% 미만, 55% 미만, 45% 미만, 35% 미만, 25% 미만, 15% 미만 또는 5% 미만을 함유한다는 것을 의미한다.
동족 항원에 대해 항원 결합 폴리펩타이드 작제물의 친화도를 증가시키는 것이 바람직한 경우에, 당해 분야에 공지된 방법은 항원에 대한 항원 결합 폴리펩타이드 작제물의 친화도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예는 하기 문헌에 기재되어 있다[Birtalan et al. (2008) JMB 377, 1518-1528; Gerstner et al. (2002) JMB 321, 851-862; Kelley et al. (1993) Biochem 32(27), 6828-6835; Li et al. (2010) JBC 285(6), 3865-3871, 및 Vajdos et al. (2002) JMB 320, 415-428].
이러한 방법의 일 예는 친화도 성숙이다. HER2 항원 결합 도메인의 친화도 성숙을 위한 예시적인 일 방법은 하기한 바와 같이 기재되어 있다. 트라스투주맙/HER2(PDB 코드 1N8Z) 복합체 및 페르투주맙/HER2 복합체(PDB 코드 1S78)의 구조는 모델링을 위해 사용된다. 분자 동역학(MD)은 수성 환경에서 WT 복합체의 고유 동역 성질을 평가하기 위해 이용될 수 있다. 가요성 골격을 따른 평균 장 및 전량(dead-end) 제거 방법은 스크리닝되는 돌연변이체에 대한 모델 구조를 최적화하고 제조하기 위해 사용될 수 있다. 패킹 이후, 접촉 밀도, 충돌 점수, 소수화도 및 정전을 포함하는 다수의 특징이 점수 매겨질 것이다. 일반화 태생 방법은 용매 환경의 효과의 정확한 모델링을 허용하고, 교대하는 잔기 유형에 대한 단백질에서의 특정 위치의 돌연변이 이후 자유 에너지 차이를 산출할 것이다. 접촉 밀도 및 충돌 점수는 효과적인 단백질 패킹의 중요한 양상인 상보성의 측정치를 제공할 것이다. 스크리닝 절차는 지식 기반 가능성, 및 쌍 지음 잔기 상호작용 에너지 및 엔트로피 산출에 의존하는 커플링 분석 계획을 이용한다. HER2 결합을 증대시키도록 공지된 문헌 돌연변이, 및 이들의 조합은 하기 표에 요약되어 있다:
Figure pct00012
Figure pct00013
본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물은 표적 세포에 결합하면 내재화된다. 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 유사한 정도로 내재화된다. 몇몇 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 효과적으로 내재화된다.
해리 상수( K D ) 및 최대 결합(B최대)
몇몇 실시형태에서, 항원 결합 작제물은 해리 상수 및 최대 결합(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 기능적 특징으로 기술된다.
용어 "해리 상수(KD)"는, 본 명세서에 사용되는 바대로, 특정한 리간드-단백질 상호작용의 평형 해리 상수를 의미하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 리간드-단백질 상호작용은 단백질-단백질 상호작용 또는 항체-항원 상호작용을 의미하지만, 이들로 제한되지는 않는다. KD는 더 적은 성분(A+B)으로 가역적으로 해리하는 2개의 단백질(예를 들어, AB)의 성향을 측정하고, 결합 상수 또는 "온-레이트(on-rate)(kon)"에 대한 "오프-레이트(off-rate)(koff)"라고도 불리는 해리 상수의 비율로서 정의된다. 따라서, KD는 koff/kon이고, 몰 농도(M)로 표시된다. 그렇다면 KD가 더 적을수록, 결합의 친화도가 더 강하다. 따라서, 1mM의 KD는 1nM의 KD와 비교하여 약한 결합 친화도를 나타낸다. 항원 결합 작제물에 대한 KD 값은 당해 분야에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 항원 결합 작제물의 KD를 결정하는 일 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하는 것, 통상적으로 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(등록상표) 시스템을 사용하는 것에 의한다. 등온 적정 열량계(isothermal titration calorimetry: ITC)는 결정하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 방법이다.
항원 결합 작제물의 결합 특징은 다양한 기법에 의해 결정될 수 있다. 이 중 하나는 유세포 분석법(fluorescence-activated cell sorting: FACS, 형광 활성 세포 분류법)에 의해 항원을 발현하는 표적 세포에 대한 결합의 측정이다. 통상적으로, 이러한 실험에서, 관심 있는 항원을 발현하는 표적 세포는 상이한 농도의 항원 결합 작제물과 항온처리되고, 세척되고, 항원 결합 작제물을 검출하기 위해 2차 물질과 항온처리되고, 세척되고, 세포에서 검출 신호의 강도를 나타내는 중앙 형광 강도(median fluorescent intensity: MFI)(결국 세포에 결합된 항원 결합 작제물의 수와 관련됨)를 측정하기 위해 유세포 분석계에서 분석된다. MFI에 대한 항원 결합 작제물 농도 데이터는 이후 B최대 및 겉보기 KD인 2개의 중요한 결합 매개변수를 생성하기 위해 포화 결합 식으로 작도된다.
겉보기 KD, 또는 겉보기 평형 해리 상수는 최대 세포 결합의 절반이 관찰되는 항원 결합 작제물 농도를 나타낸다. 분명히, KD 값이 더 적을수록, 최대 세포 결합에 도달하는 데 필요한 항원 결합 작제물 농도가 더 적고, 따라서 항원 결합 작제물의 친화도가 더 높다. 겉보기 KD는 세포 결합 실험의 조건, 예컨대 세포에서 발현된 상이한 수용체 수준 및 항온처리 조건에 따라 달라지고, 따라서 겉보기 KD는 무세포 분자 실험, 예컨대 SPR 및 ITC로부터 결정된 KD 값과 일반적으로 다르다. 그러나, 상이한 방법 사이에 일반적으로 우수한 합의가 있다.
용어 "B최대" 또는 최대 결합은 항원 결합 작제물의 포화 농도에서 세포에 대한 최대 항원 결합 작제물 결합 수준을 의미한다. 이 매개변수는 상대 비교를 위해 임의 단위 MFI로 보고되거나, 표준 곡선의 사용에 의해 세포에 결합된 항원 결합 작제물의 수에 상응하는 절대 값으로 전환될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 작제물은 기준 항원 결합 작제물의 B최대의 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배 또는 2.0배인 B최대를 나타낸다.
본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물의 경우, FSA에 대한 B최대에서의 가장 깨끗한 분리는 포화 농도에서 발생하고, B최대는 FSA에 따라 더 이상 증가할 수 없다. 비포화 농도에서 유의성이 더 적다. 일 실시형태에서, 기준 항원 결합 작제물과 비교하여 항원 결합 작제물의 B최대 및 KD의 증가는 표적 세포에서 표적 항원 발현의 수준에 독립적이다.
몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 항원 결합 작제물이 있고, 상기 항원 결합 작제물은 상응하는 기준 항원 결합 작제물과 비교하여 상기 항원을 디스플레이하는 표적 세포에 대한 B최대(최대 결합)의 증가를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 상기 B최대의 증가는 상응하는 기준 항원 결합 작제물의 B최대의 적어도 약 125%이다. 소정의 실시형태에서, B최대의 증가는 상응하는 기준 항원 결합 작제물의 B최대의 적어도 약 150%이다. 몇몇 실시형태에서, B최대의 증가는 상응하는 기준 항원 결합 작제물의 B최대의 적어도 약 200%이다. 몇몇 실시형태에서, B최대의 증가는 상응하는 기준 항원 결합 작제물의 B최대의 약 110% 초과이다.
항원 결합 작제물 및 항체 약물 접합체(ADC)
소정의 실시형태에서, 항원 결합 작제물은 약물, 예를 들어 독소, 화학치료제, 면역 조절제 또는 방사선 동위원소에 접합된다. ADC(항체 약물 접합체 또는 항원 결합 작제물 약물 접합체)를 제조하는 몇몇 방법이 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제8,624,003호(포트 방법), 제8,163,888호(1단계) 및 제5,208,020호(2단계 방법)에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 약물은 메이탄신, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 또는 이들의 유도체로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 약물은 DM1 및 DM4로부터 선택된 메이탄신이다. 추가의 예는 하기 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 약물은 SMCC 링커(DM1) 또는 SPDB 링커(DM4)에 의해 단리된 항원 결합 작제물에 접합된다. 부가의 예는 하기 기재되어 있다. 약물-대-항원 결합 단백질 비율(DAR)은 예를 들어 1.0 내지 6.0, 또는 3.0 내지 5.0, 또는 3.5 내지 4.2일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항원 결합 작제물은 세포독성 물질에 접합된다. 용어 "세포독성 물질"은, 본 명세서에 사용되는 바대로, 세포의 기능을 저해하거나 방해하고/하거나, 세포의 파괴를 발생시키는 물질을 의미한다. 상기 용어는 방사선 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사선 동위원소), 화학치료제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소(이들의 단편 및/또는 변이체 포함)를 포함하도록 의도된다. 추가의 예는 하기 기재되어 있다.
약물
ADC의 다양한 실시형태에 사용된 약물 또는 페이로드(payload)의 예는 DM1(메이탄신, N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)- 또는 N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신), mc-MMAD(6-말레이미도카프로일-모노메틸아우리스타틴-D 또는 N-메틸-L-발릴-N-[(1S,2R)-2-메톡시-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-[[(1S)-2-페닐-1-(2-티아졸릴)에틸]아미노]프로필]-1-피롤리디닐]-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸]-N-메틸-(9Cl)-L-발린아마이드), mc-MMAF(말레이미도카프로일-모노메틸아우리스타틴 F 또는 N-[6-(2,5-다이하이드로-2,5-다이옥소-1H-피롤-1-일)-1-옥소헥실]-N-메틸-L-발릴-L-발릴-(3R,4S,5S)-3-메톡시-5-메틸-4-(메틸아미노)헵타노일-(αR,βR,2S)-β-메톡시-α-메틸-2-피롤리딘프로파노일-L-페닐알라닌) 및 mc-Val-Cit-PABA-MMAE(6-말레이미도카프로일-Val-Cit-(p-아미노벤질옥시카보닐)-모노메틸아우리스타틴 E 또는 N-[[[4-[[N-[6-(2,5-다이하이드로-2,5-다이옥소-1H-피롤-1-일)-1-옥소헥실]-L-발릴-N5-(아미노카보닐)-L-오르니틸]아미노]페닐]메톡시]카보닐]-N-메틸-L-발릴-N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-하이드록시-1-메틸-2-페닐에틸]아미노]-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]-1-피롤리디닐]-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸]-N-메틸-L-발린아마이드)를 포함한다. DM1은 튜불린 저해제 메이탄신의 유도체이지만, MMAD, MMAE 및 MMAF는 아우리스타틴 유도체이다.
메이탄시노이드 약물 모이어티
몇몇 실시형태에서, 약물은 메이탄시노이드이다. 메이탄신 화합물은 마이크로튜불린 단백질, 튜불린의 중합의 저해를 통해 유사분열 동안 미세소관의 형성을 저해함으로써 세포 증식을 저해한다(Remillard et al (1975) Science 189:1002-1005; 미국 특허 제5,208,020호). 메이탄신 및 메이탄시노이드는 매우 세포독성이지만, 암 치료에서의 이의 임상 사용은 주로 종양에 대한 이의 불량한 선택도에 기인하는 이의 심각한 전신 부작용에 의해 크게 제한된다. 메이탄신에 의한 임상 실험은 중추 신경계 및 위장관계에서의 심각한 부작용으로 인해 중단되었다(Issel et al (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199-207).
메이탄시노이드 약물 모이어티는 (ⅰ) 발효 또는 화학 변형, 발효 생성물의 유도체화에 의해 제조하기에 비교적 수정 가능하고, (ⅱ) 비다이설파이드 링커를 통한 항체에 대한 접합에 적합한 작용기에 의한 유도체화에 수정 가능하고, (ⅲ) 혈장에서 안정하고, (ⅳ) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이므로, 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드 약물 모이어티로서 사용하기에 적합한 메이탄신 화합물은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 공지된 방법에 따라 천연 공급원으로부터 단리되거나(문헌[Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973] 참조), 유전 조작 기법을 이용하여 제조되거나, 공지된 방법에 따라 합성으로 제조된 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체로부터 단리될 수 있다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 변형된 방향족 고리, 예컨대 C-19-데클로로(미국 특허 제4,256,746호)(안사미토신 P2의 리튬 알루미늄 하이드라이드 환원에 의해 제조); C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로(미국 특허 제4,361,650호 및 제4,307,016호)(스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 악티노마이세스(Actinomyces)를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈클로르화에 의해 제조); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(-OCOR), +/-데클로로(미국 특허 제4,294,757호)(아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조)를 가지는 것, 및 다른 위치에서 변형을 가지는 것을 포함한다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 또한 변형을 가지는 것, 예컨대 메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조된, C-9-SH(미국 특허 제4,424,219호); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 제4,331,598호); 노카르디아(Nocardia)로부터 제조된 C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 제4,450,254호); 스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조된, C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 제4,364,866호); 트레위아 누들플로라(Trewia nudlflora)로부터 단리된, C-15-메톡시(미국 특허 제4,313,946호 및 미국 특허 제4,315,929호); 스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조된, C-18-N-탈메틸(미국 특허 제4,362,663호 및 미국 특허 제4,322,348호); 및 메이탄시놀의 삼염화티탄/LAH 환원에 의해 제조된, 4,5-데옥시(미국 특허 제4,371,533호)를 포함한다.
메이탄신 화합물에서 많은 위치는 링크의 유형에 따라 연결 위치로서 유용한 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 에스터 연결을 형성하기 위해, 하이드록실기를 가지는 C-3 위치, 하이드록시메틸에 의해 변형된 C-14 위치, 하이드록실기에 의해 변형된 C-15 위치 및 하이드록실기를 가지는 C-20 위치가 모두 적합하다.
메이탄시노이드 약물 모이어티의 모든 입체이성질체는 본 발명의 화합물, 즉 D의 키랄 탄소에서 R 및 S 입체구성의 임의의 조합에 고려된다. ADC의 실시형태는 DM1, DM3, DM4를 포함한다(US20090202536 참조).
DM3 및 DM4의 황 원자에 인접한 탄소에서의 메틸기와 같은 알킬기에 의해 부여된 입체 장애는 ADC의 세포내 절단의 속도에 영향을 미칠 수 있다(US 2004/0235840 A1). 다양한 알킬 단위 (CR2)m은 따라서 실험실내 및 생체내 효력, 효율 및 안전성/독성에 영향을 미칠 수 있다.
아우리스타틴
몇몇 실시형태에서, 약물은 아우리스타틴, 예컨대 아우리스타틴 E(또한 돌라스타틴-10의 유도체로서 당해 분야에 공지됨) 또는 이의 유도체이다. 아우리스타틴은 예를 들어 아우리스타틴 E와 케토산 사이에 형성된 에스터일 수 있다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 각각 AEB 및 AEVB를 생성하기 위해 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응할 수 있다. 다른 통상적인 아우리스타틴은 AFP, MMAF 및 MMAE를 포함한다. 예시적인 아우리스타틴의 합성 및 구조는 미국 특허 제6,884,869호, 제7,098,308호, 제7,256,257호, 제7,423,116호, 제7,498,298호 및 제7,745,394호(이들 각각은 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
아우리스타틴은 미세소관 동역학 및 핵 및 세포 분할을 방해하고, 항암 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 아우리스타틴은 튜불린에 결합하고, 5T4 발현 세포 또는 세포주에서 세포독성 또는 세포정지 효과를 발휘할 수 있다. 아우리스타틴 또는 생성된 항체-약물 접합체가 원하는 세포 또는 세포주에서 세포정지 또는 세포독성 효과를 발휘하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있는, 당해 분야에 공지된, 다수의 상이한 검정이 존재한다. 화합물이 튜불린에 결합하는지를 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Muller et al., Anal. Chem 2006, 78, 4390-4397; Hamel et al., Molecular Pharmacology, 1995 47:965-976; 및 Hamel et al., The Journal of Biological Chemistry, 1990 265:28, 17141-17149]을 참조한다.
화학치료제
몇몇 실시형태에서, 항원 결합 작제물은 화학치료제에 접합된다. 예는 시스플라틴 및 라파티닙을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. "화학치료제"는 암의 치료에서 유용한 화학 화합물이다.
화학치료제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로스포스파마이드(사이톡산(CYTOXAN)(상표명)); 알킬 설포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보퀀, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아마이드, 트리에틸렌티오포스포르아마이드 및 트리메틸올로멜라민; 질소 머스타드, 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 나이트로우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀄라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항아드레날린, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글라이코시드; 아미노레뷸린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트라세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀀; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카르바진; PSK7; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀀; 2,2',2'=-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노신("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁산, 예를 들어 파클리탁셀(탁솔(TAXOL)(등록상표), Bristol-Myers Squibb Oncology(뉴저지주 프린스톤)) 및 도세탁셀(탁소테레(TAXOTERE)(등록상표),
Figure pct00014
-Poulenc Rorer(프랑스 안토니)); 클로르암부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기의 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐제, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston); 및 항안드로겐제, 예컨대 플루타마이드, 닐루타마이드, 비칼루타마이드, 류프롤라이드 및 고세렐린; 및 상기의 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 또한 이 정의 내에 포함된다.
접합체 링커
몇몇 실시형태에서, 약물은 링커에 의해 항체와 같은 항원 결합 작제물에 연결된다. 항체에 대한 링커의 부착은 다양한 방식으로, 예컨대 표면 라이신, 산화 탄수화물에 대한 환원 커플링을 통해, 및 사슬간 다이설파이드 연결을 감소시킴으로써 방출된 시스테인 잔기를 통해 달성될 수 있다. 하이드라존, 이황화 및 펩타이드 기반 연결을 포함하는 다양한 ADC 연결 시스템이 당해 분야에 공지되어 있다.
적합한 링커는 예를 들어 절단 가능 및 절단 불가 링커를 포함한다. 절단 가능한 링커는 통상적으로 세포내 조건 하에 절단에 놓이기 쉽다. 적합한 절단 가능한 링커는 예를 들어 세포내 프로테아제, 예컨대 리소좀 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커를 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 링커는 다이펩타이드 링커, 예컨대 발린-시트룰린(val-cit), 페닐알라닌-라이신(phe-lys) 링커, 또는 말레이미도카프로닉-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카보닐(mc-Val-Cit-PABA) 링커일 수 있다. 또 다른 링커는 설포숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트(smcc)이다. 설포-smcc 접합은 설프하이드릴(티올, -SH)과 반응하는 말레이미드기를 통해 발생하지만, 이의 설포-NHS 에스터는 (라이신 및 단백질 또는 펩타이드 N 말단에서 발견되는 것처럼) 1차 아민에 대해 반응성이다. 훨씬 또 다른 링커는 말레이미도카프로일(mc)이다. 다른 적합한 링커는 특정 pH 또는 pH 범위에서 가수분해 가능한 링커, 예컨대 하이드라존 링커를 포함한다. 부가의 적합한 절단 가능한 링커는 다이설파이드 링커를 포함한다. 링커, 예를 들어 mc 링커 등은 약물이 방출되게 하기 위해 항체가 세포내 분해되어야 하는 정도로 항체에 공유로 결합할 수 있다.
링커는 항체에 대한 연결을 위한 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 아미노, 하이드록실, 카복실 또는 설프하이드릴 반응성 기(예를 들어, 말레이미드, 할로아세트아마이드(예를 들어, 요오도, 브로모 또는 클로로), 할로에스터(예를 들어, 요오도, 브로모 또는 클로로), 할로메틸 케톤(예를 들어, 요오도, 브로모 또는 클로로), 벤질 할라이드(예를 들어, 요오드, 브롬 또는 염소), 비닐 술폰 및 프리딜티오)를 포함할 수 있다. 일반적으로 문헌[Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking; CRC Press, Inc., Boca Raton, 1991]을 참조한다.
일 실시형태에서, 항체 및 약물 모이어티의 공유 부착은 링커가 2개의 반응성 작용기, 즉 반응성 의미에서 2원자가를 가질 것을 요한다. 2개 이상의 작용기의 또는 생물학적으로 활성인 모이어티에 부착하기에 유용한 2가 링커 시약, 예컨대 펩타이드, 핵산, 약물, 독소, 항체, 합텐 및 리포터 기가 공지되어 있고, 방법은 이의 생성된 접합체에 대해 기재되어 있다(Bioconjugate Techniques, Third Edition by Greg T. Hermanson, Academic Press 2013 ISBN-13:978-0123822390).
또 다른 실시형태에서, 링커는 용해도 또는 반응성을 조절하는 기에 의해 치환될 수 있다. 예를 들어, 설포네이트 치환기는 시약의 수용해도를 증가시키고, 링커 시약과 항체 또는 약물 모이어티의 커플링 반응을 촉진하거나, ADC를 제조하기 위해 사용된 합성 경로에 따라 Ab-L과 D, 또는 D-L과 Ab의 커플링 반응을 촉진할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 링커는 항체에 존재하는 친전자기에 반응성인 친핵기를 가지는 반응성 작용기를 가진다. 항체에서 유용한 친전자기는 알데하이드 및 케톤 카보닐기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 링커의 친핵기의 이종원자는 항체에서 친전자기와 반응하고, 항체 단위에 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커에서 유용한 친핵기는 하이드라자이드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진, 카복실레이트 및 아릴하이드라자이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 항체에서 친전자기는 링커에 대한 부착을 위한 편리한 부위를 제공한다.
링커는 하나 이상의 아미노산 단위를 포함하는 펩타이드성일 수 있다. 펩타이드 링커 시약은 자동화 합성장치, 예컨대 라이닌 심포니 펩타이드 신써사이저(Rainin Symphony Peptide Synthesizer)(프로테인 테크놀로지스, 인코포레이션(Protein Technologies, Inc.)(아리조나주 투싼)), 또는 모델 433(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(캘리포니아주 포스터 시티))에서 t-BOC 화학물질(Geiser et al "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R. Liss, Inc., 1988, pp. 199-218) 및 Fmoc/HBTU 화학물질(Fields, G. and Noble, R. (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214)을 포함하는 펩타이드 화학의 분야에서 널리 공지된 고상 또는 액상 합성 방법에 의해 제조될 수 있다(E.
Figure pct00015
and K.
Figure pct00016
, The Peptides, volume 1, pp 76-136 (1965) Academic Press).
화합물은 가교결합제 시약에 의해 제조된 ADC: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SPDB, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트), 및 비스-말레이미드 시약: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)2 및 BM(PEO)3(피어스 바이오테크놀로지, 인코포레이션(Pierce Biotechnology, Inc.), (고객 서비스 부서, 미국 61105 록포드 III 피.오. 박스 117, U.S.A 1-800-874-3723, 국제전화 +815-968-0747)으로부터 상업적으로 구입 가능)을 명확히 고려하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 문헌[2003-2004 Applications Handbook and Catalog, 467-498 페이지]을 참조한다.
비스-말레이미드 시약은 순차 또는 동시 방식으로 티올 함유 약물 모이어티, 라벨, 또는 링커 중간체에 대한 항체의 시스테인 잔기의 자유 티올 기의 부착을 허용한다. 항체, 메이탄시노이드 약물 모이어티, 또는 링커 중간체의 티올기와 반응성인 말레이미드 이외의 다른 작용기는 요오도아세트아마이드, 브로모아세트아마이드, 비닐 피리딘, 다이설파이드, 피리딜 다이설파이드, 아이소사이아네이트 및 아이소티오사이아네이트를 포함한다.
유용한 링커 시약은 다른 상업 공급원, 예컨대 모레큘러 바이오사이언시스 인코포레이션(Molecular Biosciences Inc.)(콜로라도주 볼더)을 통해 얻어지거나, 문헌[Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872]; 미국 특허 제6,214,345호(Firestone 등); WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; 및 WO 04/032828에 기재된 절차에 따라 또한 합성될 수 있다.
링커는 항체에 대한 분지의 다작용성 링커 모이어티를 통해 하나 초과의 약물 모이어티의 공유 부착을 위한 수지상 유형 링커일 수 있다(Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King et al (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). 수지상 링커는 약물 대 항체의 몰 비, 즉 ADC의 효력과 관련한 로딩을 증가시킬 수 있다. 따라서, 항체가 오직 하나의 반응성 시스테인 티올기를 보유하는 경우, 다수의 약물 모이어티는 수지상 링커를 통해 부착될 수 있다.
ADC의 제조
ADC는, (1) 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성하기 위한, 공유 결합을 통한 항체의 친핵기 또는 친전자기와 2가 링커 시약의 반응, 이어서 활성화 약물 모이어티 D와의 반응; 및 (2) 약물-링커 중간체 D-L을 형성하기 위한, 공유 결합을 통한 약물 모이어티의 친핵기 또는 친전자기와 링커 시약의 반응, 이어서 항체의 친핵기 또는 친전자기와의 반응을 포함하는, 당해 분야의 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 몇몇 방식에 의해 제조될 수 있다. 접합 방법 (1) 및 (2)는 본원에 기재된 항체-약물 접합체를 제조하기 위해 다양한 항체, 약물 모이어티 및 링커에 의해 이용될 수 있다.
ADC를 제조하는 방법의 몇몇 구체적인 예는 당해 분야에 공지되어 있고, 미국 특허 8,624,003호(포트 방법), 제8,163,888호(1단계) 및 5,208,020호(2단계 방법)에 기재되어 있다.
항체에서의 친핵기는 (ⅰ) N 말단 아민기, (ⅱ) 측쇄 아민기, 예를 들어 라이신, (ⅲ) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인, 및 (ⅳ) 당 하이드록실 또는 아미노기(여기서, 항체는 글라이코실화됨)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 아민, 티올 및 하이드록실기는 친핵이고, (ⅰ) 활성 에스터, 예컨대 NHS 에스터, HOBt 에스터, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ⅱ) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아마이드; (ⅲ) 알데하이드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기를 포함하는, 링커 모이어티 및 링커 시약에서 친전자기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다. 소정의 항체는 환원성 사슬간 다이설파이드, 즉 시스테인 브릿지를 가진다. 항체는 환원제, 예컨대 DTT(클레란드(Cleland) 시약, 다이티오트레이톨) 또는 TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures(매사추세츠주 비벌리))에 의한 처리에 의해 링커 시약과 접합을 위해 반응성이 될 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 다이설파이드 브릿지는 이론적으로 2개의 반응성 티올 친핵원자를 형성할 것이다. 부가의 친핵기는 라이신과 2-이미노티올란(트라우트(Traut) 시약)의 반응을 통해 항체로 도입되어 티올로의 아민의 전환을 생성시킨다.
항체-약물 접합체는 링커 시약 또는 약물에서, 친핵 치환기와 반응할 수 있는, 친전자 모이어티를 도입하기 위해 항체의 변형에 의해 또한 제조될 수 있다. 글라이코실화 항체의 당은 예를 들어 페리오데이트 산화 시약에 의해 산화되어, 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데하이드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기 기는 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 안정한 아민 연결을 형성하기 위해 예를 들어 보로하이드라이드 시약에 의해 환원될 수 있디. 일 실시형태에서, 글라이코실화 항체의 탄수화물 부분과 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-페리오데이트의 반응은 약물에서 적절한 기와 반응할 수 있는 단백질에서 카보닐 (알데하이드 및 케톤) 기를 생성할 수 있다(Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p234-242). 또 다른 실시형태에서, N 말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질은 나트륨 메타-페리오데이트와 반응하여, 제1 아미노산 대신에 알데하이드를 생성시킬 수 있다(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; 미국 특허 제5,362,852호). 이러한 알데하이드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵원자와 반응할 수 있다.
마찬가지로, 약물 모이어티에서 친핵기는 (ⅰ) 활성 에스터, 예컨대 NHS 에스터, HOBt 에스터, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ⅱ) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아마이드; (ⅲ) 알데하이드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기를 포함하는, 링커 모이어티 및 링커 시약에서 친전자기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는, 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라자이드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴하이드라자이드 기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
메이탄신은 예를 들어 May-SSCH3으로 전환될 수 있고, 이것은 다이설파이드 링커와 메이탄시노이드-항체 면역접합체를 생성하기 위해 자유 티올, May-SH로 환원되고, 변형된 항체와 반응할 수 있다(Chari et al (1992) Cancer Research 52:127-131). 다이설파이드 링커를 가지는 항체-메이탄시노이드 접합체가 보고되어 있다(WO 04/016801; 미국 특허 제6,884,874호; US 제2004/039176호 A1; WO 03/068144; US 제2004/001838호 A1; 미국 특허 제6,441,163호; 미국 특허 제5,208,020호; 미국 특허 제5,416,064호; WO 01/024763). 다이설파이드 링커 SPP는 링커 시약 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트에 의해 작제된다. 본 발명의 ADC는 SMCC 링커 및 DM1 메이탄시노이드 약물 모이어티를 포함한다.
Ab-(SMCC-DM1)p의 일 실시형태에서, 평균 p는 1, 2, 3 또는 4이다(WO 2005/037992). ADC의 또 다른 실시형태는 Ab-(SIAB-DM1)p이다.
약물은 항체에서 접합 지점과 반응성인 기를 가지거나 이것을 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 약물은 (예를 들어, 항체의 엡실론-아미노기 라이신 또는 N 말단에서) 알킬화, 산화된 탄수화물의 환원 아미노화, 하이드록실기와 카복실기 사이의 에스터교환반응, 아미노기 또는 카복실기에서의 아미노화, 및 티올에 대한 접합에 의해 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체 분자마다 접합된 약물 모이어티의 수(p)는 평균 1 내지 8; 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, p는 평균 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4 또는 2 내지 3의 범위이다. 다른 실시형태에서, p는 평균 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, p는 평균 약 1 내지 약 8; 약 1 내지 약 7, 약 1 내지 약 6, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 또는 약 1 내지 약 2의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, p는 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4 또는 약 2 내지 약 3의 범위이다. 접합에 사용될 수 있는 화학물질의 예를 위해, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.), Chapter 15 (Chemical Modifications of Proteins)](이의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다)을 참조한다.
예를 들어, 단백질의 화학 활성화가 자유 티올기를 형성시키는 경우, 단백질은 설프하이드릴 반응성 기와 접합될 수 있다. 일 양상에서, 물질은 자유 티올기에 실질적으로 특정한 것이다. 이러한 물질은 예를 들어 말레이미드, 할로아세트아마이드(예를 들어, 요오도, 브로모 또는 클로로), 할로에스터(예를 들어, 요오도, 브로모 또는 클로로), 할로메틸 케톤(예를 들어, 요오도, 브로모 또는 클로로), 벤질 할라이드(예를 들어, 요오드, 브롬 또는 염소), 비닐 술폰 및 피리딜티오를 포함한다.
1가 항원 결합 작제물의 시험
본 발명에 따른 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 증대된 이팩터 기능을 나타낼 수 있다. 1가 항원 결합 작제물의 이팩터 기능을 하기와 같이 시험할 수 있다. ADCP, CDC 및/또는 ADCC 활성을 평가하기 위해 실험실내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, FcγR 결합을 측정하도록 Fc 수용체(FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. NK 세포인 ADCC를 매개하기 위한 1차 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포에서 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 페이지 464에서 표 3에 요약되어 있다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 실험실내 검정의 예는 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재되어 있다. 이러한 검정에 유용한 이팩터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌[Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 생체내 평가될 수 있다. Clq 결합 검정은, 1가 항원 결합 작제물이 Clq에 결합하고 따라서 CDC를 활성화할 수 있는지를 결정하기 위해, 또한 수행될 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 CDC 검정을 수행할 수 있다. 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 예컨대 SPR에 의한 FcRn 결합 및 항체의 생체내 PK 결정을 또한 수행될 수 있다.
본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물의 존재 및 분량을 당해 분야에 널리 공지된 면역검정인 ELISA를 이용하여 결정할 수 있다. 하나의 ELISA에서 본 명세서에 기재된 이형다합체를 검출하고/정량화하기에 유용한 프로토콜은 ELISA 플레이트를 항인간 혈청 알부민 항체에 의해 코팅하는 단계, 플레이트를 차단하여 비특이적 결합을 방지하는 단계, ELISA 플레이트를 세척하는 단계, (하나 이상의 상이한 농도의) 본 명세서에 기재된 단백질을 함유하는 용액을 첨가하는 단계, (본 명세서에 기재되거나 달리 당해 분야에 공지된) 검출 가능한 라벨에 커플링된 2차 항항원 결합 작제물 폴리펩타이드 특이적 항체를 첨가하는 단계, 및 2차 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 표시된 바대로, 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 우수한 효율 및/또는 생물활성을 나타낸다. 본 발명에 따른 1가 항원 결합 작제물의 효율 및/또는 생물활성의 비제한적인 일 예는 표적 세포의 성장을 저해하는 1가 항원 결합 작제물의 능력으로 표시된다. 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물의 더 우수한 효율 및/또는 생물활성은 주로 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 1가 항원 결합 작제물의 증가한 이팩터 기능의 결과이다. 이 유형의 1가 항원 결합 작제물의 예는 1가 용해 항체(MV-L)로 표시된다.
시험될 수 있는 증가한 이팩터 기능은 ADCC, ADCP 또는 CDC 중 적어도 하나를 포함한다.
ADCC
일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물이 하는 것보다 ADCC에 의해 더 높은 정도의 세포 사멸을 나타낸다. 이 실시형태에 따라, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 비해 약 1.2배 내지 1.6배의 ADCC 활성의 증가를 나타낸다. 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물이 하는 것보다 ADCC에 의해 세포 사멸의 약 1.3배 증가를 나타낸다. 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물이 하는 것보다 ADCC에 의해 세포 사멸의 약 1.4배 증가를 나타낸다. 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물이 하는 것보다 ADCC에 의해 세포 사멸의 약 1.5배 증가를 나타낸다.
일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 EGFR 및/또는 HER2에 결합하고, 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 비해 약 1.2배 내지 1.6배의 ADCC 활성의 증가를 나타내는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 EGFR 및/또는 HER2에 결합하고, 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물이 하는 것보다 ADCC에 의해 세포 사멸의 약 1.3배 증가를 나타내는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 EGFR 및/또는 HER2에 결합하고, 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물이 하는 것보다 ADCC에 의해 세포 사멸의 약 1.5배 증가를 나타내는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다.
일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 EGFR 및/또는 HER2에 결합하고, 상응하는 비탈푸코실화 항원 결합 작제물의 것에 비해 ADCC 활성의 증가를 나타내는 탈푸코실화 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 몇몇 양상에서, ADCC의 증가는 약 1배 내지 3배 또는 초과, 예를 들어 1배, 2배 또는 3배이다.
ADCP
일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물이 하는 것보다 ADCP에 의해 더 높은 정도의 세포 사멸을 나타낸다.
CDC
일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물이 하는 것보다 CDC에 의해 더 높은 정도의 세포 사멸을 나타낸다. 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 EGFR 및/또는 HER2에 결합하고, 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물이 하는 것보다 CDC에 의해 세포 사멸의 약 1.5배 증가를 나타내는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다.
몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 작제물은 2개의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물의 ADCC, ADCP 및 CDC 중 적어도 하나의 적어도 약 125%를 보유한다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 작제물은 2개의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물의 ADCC, ADCP 및 CDC 중 적어도 하나의 적어도 약 150%를 보유한다. 몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물이 있고, 상기 작제물은 2개의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물의 ADCC, ADCP 및 CDC 중 적어도 하나의 적어도 약 300%를 보유한다.
FcγR에 대한 결합 용량의 증가
몇몇 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 하나 이상의 FcγR에 대한 더 높은 결합 용량(R최대)을 나타낸다. 1가 항원 결합 작제물이 HER2에 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 비해 약 1.3배 내지 2배의 하나 이상의 FcγR에 대한 R최대의 증가를 나타낸다. 1가 항원 결합 작제물이 EGFR 및/또는 HER2에 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 비해 약 1.3배 내지 1.8배의 CD16 FcγR에 대한 R최대의 증가를 나타낸다. 1가 항원 결합 작제물이 EGFR 및/또는 HER2에 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 비해 약 1.3배 내지 1.8배의 CD32 FcγR에 대한 R최대의 증가를 나타낸다. 1가 항원 결합 작제물이 EGFR 및/또는 HER2에 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 비해 약 1.3배 내지 1.8배의 CD64 FcγR에 대한 R최대의 증가를 나타낸다.
Fc γR에 대한 친화도의 증가
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 FcγR에 대한 예상치 못하게 증가한 친화도를 가진다. 장식으로부터 생긴 Fc 농도의 증가는 ADCC, ADCP, CDC 활성의 증가와 일치한다.
몇몇 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 하나 이상의 FcγR에 대한 증가한 친화도를 나타낸다. 1가 항원 결합 작제물이 HER2에 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 적어도 하나의 FcγR에 대한 증가한 친화도를 나타낸다. 이 실시형태에 따라, 1가 항원 결합 작제물은 CD32에 대한 증가한 친화도를 나타낸다.
또 다른 실시형태에서, 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 증가한 내재화를 나타내어서, 더 우수한 효율 및/또는 생물활성을 발생시키는 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물이 있다.
약동학적 매개변수
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 1가 항원 결합 작제물은 상업적으로 구입 가능한 치료학적 항체에 필적하는 약동학적(PK) 특성을 나타낸다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물은 혈청 농도, t1/2, 베타 반감기 및/또는 CL과 관련하여 공지된 치료학적 항체와 유사한 PK 특성을 나타낸다. 일 실시형태에서, 1가 항원 결합 작제물은 상기 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 필적하거나 이보다 큰 생체내 안정성을 나타낸다. 이러한 생체내 안정성 매개변수는 혈청 농도, t1/2, 베타 반감기 및/또는 CL을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 분포의 용적(Vss)을 나타낸다. 항체의 분포의 용적은 혈장 또는 혈액의 용적(Vp), 조직의 용적(VT), 및 조직 대 혈장 분배(kP)에 관한 것이다. 선형 조건 하에, IgG 항체는 동물 또는 인간에서 혈관내 투여 후 주로 혈장 구획 및 혈관외 유체로 분포된다. 몇몇 실시형태에서, 능동 수송 과정, 예컨대 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 의한 흡수는 또한 다른 결합 단백질 중에서 항체 생체 분포에 영향을 미친다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 1가 항원 결합 작제물은 더 높은 분포의 용적(Vss)을 나타내고, 상응하는 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 유사한 친화도로 FcRn에 결합한다.
경쟁 검정
항원 결합 작제물 사이의 경쟁은, 시험 중인 항원 결합 작제물이 공통 항원에 대한 기준 항원 결합 작제물의 특이적 결합을 저해하는, 검정에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990] 참조). 과량의 시험 항원 결합 작제물(예를 들어, 적어도 2배, 5배, 10배, 20배 또는 100배)이, 경쟁적 결합 검정에서 측정될 때, 예를 들어 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%만큼 기준 항원 결합 작제물의 결합을 저해하는 경우, 시험 항원 결합 작제물은 기준 항원 결합 작제물과 경쟁한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항원 결합 작제물(경쟁하는 항원 결합 작제물)은 기준 항원 결합 작제물과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 작제물 및 입체 장애가 발생하도록 기준 항원 결합 작제물에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접한 에피토프에 결합하는 항원 결합 작제물을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 제1의 단리된 1가 항원 결합 작제물과 EGFR에 대한 결합에 대해 경정하는 제2의 경쟁하는 단리된 1가 항원 결합 작제물이 확인될 수 있다. 소정의 경우에, 제2 작제물은 경쟁적 결합 검정에서 측정될 때 예를 들어 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%만큼 제1 작제물의 결합을 저해할 수 있다. 소정의 경우에, 제2 작제물은 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%만큼 제1 작제물을 대체할 수 있다.
키트
개체에서 관심 있는 바이오마커의 존재를 검출하기 위한 키트가 본 명세서에 제공되고, 상기 키트는 (a) 본 명세서에 기재된 단리된 1가 항원 결합 작제물; 및 (b) 사용 설명서를 포함한다. 소정의 실시형태에서 EGFR 및/또는 HER2 중 적어도 하나 및 이의 가용성 ECD의 검출을 위한 키트가 있고, 상기 키트는 (a) 본 명세서에 기재된 단리된 1가 EGFR 및/또는 HER2 결합 항원 결합 작제물; 및 (b) 사용 설명서를 포함한다. 몇몇 실시형태에서 EGFR 및/또는 HER2 중 적어도 하나 및 이의 가용성 ECD의 농도를 결정하기 위한 키트가 있고, 상기 키트는 (a) 본 명세서에 기재된 단리된 1가 EGFR 및/또는 HER2 결합 항원 결합 작제물; 및 (b) 사용 설명서를 포함한다.
항원 결합 작제물의 제조
항원 결합 작제물은 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바대로 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물을 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항원 결합 작제물의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항원 결합 작제물의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 일 실시형태에서, 핵산은 다시스트론성 벡터에서 제공된다. 추가의 실시형태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 일 실시형태에서, 숙주 세포는 (1) 항원 결합 작제물의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항원 결합 폴리펩타이드 작제물의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항원 결합 폴리펩타이드 작제물의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항원 결합 폴리펩타이드 작제물의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어, 이들에 의해 형질전환된다). 일 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 인간 배아 신장(human embryonic kidney: HEK) 세포, 또는 림프성 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 실시형태에서, 항원 결합 작제물을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 항원 결합 작제물의 발현에 적합한 조건 하에 상기 제공된 바와 같은 항원 결합 작제물을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양물 배지)로부터 항원 결합 작제물을 회수하는 단계를 포함한다.
항원 결합 작제물의 재조합 제조를 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항원 결합 작제물을 코딩하는 핵산은 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 단리되고 하나 이상의 벡터로 삽입된다. 이러한 핵산은 전통적인 절차를 이용하여(예를 들어, 항원 결합 작제물의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항원 결합 작제물 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항원 결합 작제물은 특히 글라이코실화 및 Fc 이팩터 기능이 필요하지 않을 때 박테리아에서 제조될 수 있다. 박테리아에서 항원 결합 작제물 단편 및 폴리펩타이드의 발현을 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호 및 제5,840,523호를 참조한다. (이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기술하는 문헌[Charlton, Methods in Molecular Biology , Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254]을 또한 참조한다.) 발현 후, 항원 결합 작제물은 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리되고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에, 진핵생물 미생물, 예컨대 섬질 진균 또는 효모는, 진균 및 효모 균주를 포함하는, 항원 결합 작제물 코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이고, 이 균주의 글라이코실화 경로는 "인간화"되어, 부분 또는 완전 인간 글라이코실화 패턴을 가지는 항원 결합 작제물을 생성시킨다. 문헌[Gerngross, Nat . Biotech . 22:1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat . Biotech . 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글라이코실화 항원 결합 작제물의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 또한 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포돕테라 프루지페르다 세포의 형질감염에 대해 곤충 세포와 조합되어 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주(baculoviral strain)가 동정되었다.
식물 세포 배양물은 숙주로서 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, (형질전환 식물에서 항원 결합 작제물을 제조하기 위해 플란티바디즈(PLANTIBODIES)(상표명)를 기재하는) 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호 및 제6,417,429호를 참조한다.
척추동물 세포는 숙주로서 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에 성장하기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, 문헌[Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암종 세포(HELA); 개과 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad . Sci . 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 DHFR- CHO 세포(Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항원 결합 작제물 제조에 적합한 소정의 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology , Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 적어도 하나의 안정한 포유동물 세포를 미리 결정된 비율의 항원 결합 작제물을 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 단계; 및 적어도 하나의 포유동물 세포에서 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 안정한 포유동물 세포에서 제조된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산의 미리 결정된 비율은, 발현된 생성물에서 가장 높은 백분율의 항원 결합 작제물을 생성시키는, 유입 핵산의 상대 비율을 결정하기 위한, 일시적 형질감염 실험에서 결정된다.
몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 안정한 포유동물 세포에서 1가 항원 결합 작제물을 제조하는 방법이 있고, 적어도 하나의 안정한 포유동물 세포의 발현 생성물은 단량체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드, 또는 다른 항체와 비교하여 더 큰 백분율의 원하는 글라이코실화 1가 항체를 포함한다.
몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 안정한 포유동물 세포에서 글라이코실화 1가 항원 결합 작제물을 제조하는 방법이 있고, 상기 방법은 원하는 글라이코실화 1가 항체를 확인하고 정제하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 확인은 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법 중 하나 또는 둘 다에 의한다.
필요한 경우, 항원 결합 작제물은 발현 후 정제되거나 단리될 수 있다. 단백질은 당해 분야의 당업자에게 공지된 다양한 방식으로 단리되거나 정제될 수 있다. 표준 정제 방법은, FPLC 및 HPLC와 같은 시스템을 이용하여, 대기압 또는 고압에서 수행되는, 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화도, 사이징 또는 겔 여과, 및 역상을 포함하는 크로마토그래피 기법을 포함한다. 정제 방법은 또한 전기영동, 면역학적, 침전, 투석 및 크로마토포커싱(chromatofocusing) 기법을 포함한다. 단백질 농도와 조합된, 한외여과 및 정용여과 기법이 또한 유용하다. 당해 분야에 널리 공지된 것처럼, 다양한 천연 단백질은 Fc 및 항체에 결합하고, 이 단백질은 항원 결합 작제물의 정제를 위해 본 발명에서 용도가 발견될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 단백질 A 및 G는 Fc 구역에 결합한다. 마찬가지로, 박테리아 단백질 L은 몇몇 항체의 Fab 구역에 결합한다. 정제는 특정한 융합 파트너에 의해 대개 가능해질 수 있다. 예를 들어, 항체는 GST 융합이 이용되는 경우 글루타티온을 사용하거나, His-태그가 이용되는 경우 Ni+2 친화도 크로마토그래피를 사용하거나, 플래그-태그가 이용되는 경우 부동화 항-플래그 항체를 사용하여 정제될 수 있다. 적합한 정제 기법에서 일반 가이드를 위해, 예를 들어 전문이 참조문헌으로 포함된 문헌[Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994(전문이 참조문헌으로 포함됨)]을 참조한다. 필요한 정제의 정도는 항원 결합 작제물의 사용에 따라 달라질 것이다. 몇몇 경우에, 정제가 필요하지 않다.
소정의 실시형태에서, 항원 결합 작제물은 Q-세파로스(SEPHAROSE), DEAE 세파로스, 포로스(poros) HQ, 포로스 DEAF, 토요펄(Toyopearl) Q, 토요펄 QAE, 토요펄 DEAE, 리소스(Resource)/소스(Source) Q 및 DEAE, 프락토겔(Fractogel) Q 및 DEAE 칼럼(이들로 제한되지는 않음)에서의 크로마토그래피를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제된다.
구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단백질은 SP-세파로스, CM 세파로스, 포로스 HS, 포로스 CM, 토요펄 SP, 토요펄 CM, 리소스/소스 S 및 CM, 프락토겔 S 및 CM 칼럼, 및 이들의 등가물 및 등가물(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제된다.
또한, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 당해 분야에 공지된 기법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y, 및 Hunkapiller et al., Nature, 310:105-111 (1984)] 참조). 예를 들어, 폴리펩타이드의 단편에 상응하는 폴리펩타이드는 펩타이드 합성장치의 사용에 의해 합성될 수 있다. 더욱이, 원하는 경우, 비전통적인 아미노산 또는 화학 아미노산 유사체는 폴리펩타이드 서열에 대한 치환 또는 부가로서 도입될 수 있다. 비전통적인 아미노산은 일반적으로 공통 아미노산의 D-이성질체, 2,4-다이아미노뷰티르산, 알파-아미노 아이소뷰티르산, 4-아미노뷰티르산, Abu, 2-아미노 뷰티르산, g-Abu, e-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 아이소뷰티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테산, t-부틸글라이신, t-부틸알라닌, 페닐글라이신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 예컨대 β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산 및 아미노산 유사체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 더욱이, 아미노산은 D(우선성) 또는 L(좌선성)일 수 있다.
예를 들어, 글라이코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드에 대한 연결 등에 의해 번역 동안 또는 후에 다르게 변형된 항원 결합 작제물이 또한 제공된다. 임의의 수많은 화학 변형은 시아노겐 브로마이드, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH4에 의한 특정 화학 절단; 아세틸화, 포밀화, 산화, 환원; 투니카마이신의 존재 하의 대사 합성; 등(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에 포함된 부가의 번역 후 변형은 원핵생물 숙주 세포 발현의 결과로서 예를 들어 N 연결 또는 O 연결 탄수화물 사슬, N 말단 또는 C 말단 끝의 프로세싱, 아미노산 골격에 대한 화학 모이어티의 부착, N 연결 또는 O 연결 탄수화물 사슬의 화학 변형, 및 N 말단 메티오닌 잔기의 부가 또는 결실 등을 포함한다. 항원 결합 작제물은 검출 가능한 라벨, 예컨대 효소, 형광, 동위원소 또는 친화도 라벨에 의해 변형될 수 있어서, 단백질의 검출 및 단리를 허용한다.
적합한 효소의 예는 겨자무과산화효소, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘 바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적합한 형광 재료의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 다이클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 재료의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 재료의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사성 재료의 예는 요오드, 탄소, 황, 트리튬, 인듐, 테크네튬, 탈륨, 갈륨, 팔라듐, 몰리브덴, 제논, 불소를 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 항원 결합 작제물 또는 이의 단편 또는 변이체는 방사선 금속 이온과 회합하는 대환식 킬레이터에 부착된다.
언급한 바대로, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 천연 과정, 예컨대 번역 후 과정, 또는 당해 분야에 널리 공지된 화학 변형 기법에 의해 변형될 수 있다. 동일한 유형의 변형이 소정의 폴리펩타이드에서 몇몇 자리에서 동일한 또는 다양한 정도로 존재할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들어 유비퀴틴화의 결과로서 분지될 수 있고, 이들은 분지와 함께 또는 분지 없이 환형일 수 있다. 환형, 분비 및 분지의 환형 폴리펩타이드는 번역 후 천연 과정으로부터 생길 수 있거나, 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교결합, 고리화, 다이설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 크로스링크의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포밀화, 감마-카복실화, 글라이코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 페길화, 단백질분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 대한 아미노산의 전이-RNA 매개 첨가, 예컨대 아르기닐화 및 유비퀴틴화를 포함한다. (예를 들어, 문헌[PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)] 참조).
소정의 실시형태에서, 항원 결합 작제물은, 본 발명의 알부민 융합 단백질에 의해 결합되거나, 이에 결합하거나, 이것과 회합되는, 폴리펩타이드의 면역검정 또는 정제에 특히 유용한, 고체 지지체에 또한 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아마이드, 나일론, 폴리스타이렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
부가의 이점, 예컨대 폴리펩타이드의 용해도, 안정성 및 순환 시간의 증가, 또는 면역원성의 감소를 제공할 수 있는 항원 결합 작제물의 화학 변형된 유도체가 본 명세서에 또한 제공된다(미국 특허 제4,179,337호 참조). 유도체화를 위한 화학 모이어티는 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜, 에틸렌 글라이콜/프로필렌 글라이콜 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜 등으로부터 선택될 수 있다. 단백질은 분자 내의 무작위 위치에서, 또는 분자 내의 미리 결정된 위치에서 변형될 수 있고, 1개, 2개, 3개 이상의 부착된 화학 모이어티를 포함할 수 있다.
중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지 또는 비분지일 수 있다. 폴리에틸렌 글라이콜의 경우, 바람직한 분자량은 취급 및 제조의 용이성을 위해 약 1kDa 및 약 100kDa이다(용어 "약"은 폴리에틸렌 글라이콜의 제제에서, 몇몇 분자가 언급된 분자량보다 크거나 약간 작은 중량이라는 것을 나타낸다). 다른 크기는 원하는 치료학적 프로필(예를 들어, 원하는 지속 방출의 기간, 있다면 생물학적 활성에 대한 효과, 취급 용이성, 항원성의 정도 또는 결여, 및 치료학적 단백질 또는 유사체에 대한 폴리에틸렌 글라이콜의 다른 공지된 효과)에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜은 약 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 105,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000 또는 100,000kDa의 평균 분자량을 가질 수 있다. 소정의 실시형태에서, 적어도 하나의 안정한 포유동물 세포를, 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩타이드 및 제1 Fc 도메인 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 DNA 서열; 제2 Fc 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 제2 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 DNA 서열(여기서, 상기 제2 중쇄 폴리펩타이드는 가변 도메인이 없음); 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 DNA 서열과 형질감염시키는 단계(이로써 상기 제1 DNA 서열, 상기 제2 DNA 서열 및 상기 제3 DNA 서열은 미리 결정된 비율로 상기 포유동물 세포에서 형질감염됨); 적어도 하나의 포유동물 세포에서 상기 제1 DNA 서열, 상기 제2 DNA 서열 및 상기 제3 DNA 서열을 번역하는 단계(이로써 상기 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 상기 적어도 하나의 안정한 포유동물 세포에서 글라이코실화 1가 항체로서 발현됨)를 포함하는, 안정한 포유동물 세포에서 글라이코실화 1가 항원 결합 작제물을 제조하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 2개의 상이한 세포를 상기 제1 DNA 서열, 상기 제2 DNA 서열 및 상기 제3 DNA 서열의 상이한 미리 결정된 비율로 형질감염시키는 단계(이로써 2개의 세포의 각각은 상이한 비율로 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 발현함)를 포함하는, 본 명세서에 기재된 안정한 포유동물 세포에서 글라이코실화 1가 항원 결합 작제물을 제조하는 방법이 있다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 포유동물 세포를 상기 제1, 제2 및 제3 DNA 서열을 포함하는 다중 시스트론 벡터로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 안정한 포유동물 세포에서 글라이코실화 1가 항원 결합 작제물을 제조하는 방법이 있다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 포유동물 세포는 VERO, HeLa, HEK, HEK293, NSO, 중국 햄스터 난소(CHO), W138, BHK, COS-7, Caco-2 및 MDCK 세포, 및 이의 하위종류 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 안정한 포유동물 세포에서 글라이코실화 1가 항원 결합 작제물을 제조하는 방법이 있고, 제1 DNA 서열:제2 DNA 서열:제3 DNA 서열의 미리 결정된 비율은 약 1:1:1이다. 몇몇 실시형태에서, 제1 DNA 서열:제2 DNA 서열:제3 DNA 서열의 상기 미리 결정된 비율은, 번역된 제1 중쇄 폴리펩타이드의 양이 제2 중쇄 폴리펩타이드의 양 및 경쇄 폴리펩타이드의 양과 거의 동일한 것이다.
몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 안정한 포유동물 세포에서 글라이코실화 1가 항원 결합 작제물을 제조하는 방법이 있고, 적어도 하나의 안정한 포유동물 세포의 발현 생성물은 단량체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드와 비교하여 더 큰 백분율의 원하는 글라이코실화 1가 항체, 또는 다른 항체를 포함한다.
몇몇 실시형태에서 본 명세서에 기재된 안정한 포유동물 세포에서 글라이코실화 1가 항원 결합 작제물을 제조하는 방법이 있고, 상기 방법은 원하는 글라이코실화 1가 항체를 확인하고 정제하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 확인은 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법 중 하나 또는 둘 다에 의한다.
적어도 하나의 안정한 포유동물 세포를, 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩타이드 및 제1 Fc 도메인 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 DNA 서열; 제2 Fc 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 제2 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 DNA 서열(여기서, 상기 제2 중쇄 폴리펩타이드는 가변 도메인이 없음); 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 DNA 서열과 형질감염시키는 단계(이로써 상기 제1 DNA 서열, 상기 제2 DNA 서열 및 상기 제3 DNA 서열은 미리 결정된 비율로 상기 포유동물 세포에서 형질감염됨); 적어도 하나의 포유동물 세포에서 상기 제1 DNA 서열, 상기 제2 DNA 서열 및 상기 제3 DNA 서열을 번역하는 단계(이로써 상기 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 상기 적어도 하나의 안정한 포유동물 세포에서 글라이코실화 1가 항체로서 발현됨)를 포함하는, 개선된 ADCC를 가지는 항원 결합 작제물을 제조하는 방법이 본 명세서에 제공되고, 상기 글라이코실화 1가 비대칭 항체는 상응하는 야생형 항체와 비교하여 더 큰 ADCC를 가진다.
적어도 하나의 안정한 포유동물 세포를, 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩타이드 및 제1 Fc 도메인 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 DNA 서열; 제2 Fc 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 제2 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 DNA 서열(여기서, 상기 제2 중쇄 폴리펩타이드는 가변 도메인이 없음); 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 DNA 서열과 형질감염시키는 단계(이로써 상기 제1 DNA 서열, 상기 제2 DNA 서열 및 상기 제3 DNA 서열은 미리 결정된 비율로 상기 포유동물 세포에 형질감염됨); 적어도 하나의 포유동물 세포에서 상기 제1 DNA 서열, 상기 제2 DNA 서열, 및 상기 제3 DNA 서열을 번역하는 단계(이로써 상기 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 상기 적어도 하나의 안정한 포유동물 세포에서 원하는 글라이코실화 1가 비대칭 항체로서 발현됨)를 포함하는, 안정한 포유동물 세포에서 글라이코실화 1가 항원 결합 작제물을 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물을 코딩하고 발현하도록 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 함유하도록 변형된 형질전환 유기체가 또한 제공된다.
약제학적 조성물
본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 임의의 방법에 의해 적용 따라 제제화되고 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 작제물은 항원 결합 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체의 약제학적 조성물에서 제제화된다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방정부 또는 주 정부의 규제 기간이 승인하거나, 동물, 더욱 특히 인간에서의 사용에 대해 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에 수록된다는 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제가 투여되는 희석제, 아쥬번트, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약제학적 담체는 무균 액체, 예컨대 물 및 오일, 예컨대 석유, 동물, 식물성 또는 합성 기원의 것, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등일 수 있다. 몇몇 양상에서, 담체는 자연에서 발견되지 않는 인공 담체이다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내 투여될 때 담체로서 사용될 수 있다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글라이세롤 용액을 특히 주사용 용액을 위해 액체 담체로서 또한 사용할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 옥수수, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글라이세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글라이세롤, 프로필렌, 글라이콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 상기 조성물은, 바람직한 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 이 조성물은 액제, 현탁제, 유화제, 정제, 환제, 캡슐, 산제, 지효성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예컨대 트리글라이세라이드와 좌제로서 제제화될 수 있다. 경구 제제는 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등의 약제학적 등급의 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 이. 더블유. 마틴(E. W. Martin)의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 환자에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태의, 치료학적 유효량의 화합물을 함유할 것이다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.
소정의 실시형태에서, 항원 결합 작제물을 포함하는 조성물은 인간에 대한 정맥내 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 일상적 절차에 따라 제제화된다. 통상적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 무균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 주사 부위에서의 통증을 없애기 위해 국소 마취제, 예컨대 리그노카인 및 가용화제를 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 단위 제형 중에, 예를 들어 활성 물질의 분량을 나타내는 밀봉 밀폐 용기, 예컨대 앰플 또는 사세트(sachette)에서 건조 동결건조 분말 또는 물 비함유 농축물로서 별개로 또는 함께 혼합되어 제공된다. 상기 조성물이 점적주사에 의해 투여되는 경우, 이것은 무균 약제학적 등급 물 또는 식염수를 함유하는 점적주사 병이 없을 수 있다. 상기 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 무균 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있어서, 성분은 투여 전에 혼합될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 천연 또는 염 형태로서 제제화된다. 약제학적으로 허용되는 염은 음이온에 의해 형성된 것, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것, 및 양이온에 의해 형성된 것, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제이철, 아이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래한 것을 포함한다.
단백질의 비정상 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 치료, 저해 및 예방에서 효과적인 본 명세서에 기재된 조성물의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 실험실내 검정은 최적 투약량 범위를 확인하는 것을 돕도록 임의로 사용될 수 있다. 제제에서 사용되는 정확한 용량은 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 중증도에 따라 또한 달라질 것이고, 의사의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 실험실내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽된다.
소정의 실시형태에서 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물 및 아쥬번트를 포함하는 약제학적 조성물이 있다. 소정의 실시형태에서 1가 항원 결합 작제물에 접합된 약물 분자를 추가로 포함하는 본 명세서에 약제학적 기재된 조성물이다. 소정의 실시형태에서, 약물 분자는 자가면역 장애의 치료를 위한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 약물 분자는 암의 치료를 위한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 약물 분자는 화학치료제이다.
생물학적 및 치료학적 용도
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 작제물은 하나 이상의 생물학적 활성을 대해 시험하기 위해 검정에서 사용된다. 작제물이 특정한 검정에서 활성을 나타내는 경우, 항원 결합 작제물에 의해 포함된 항원 결합 작제물이 생물학적 활성과 연관된 질환에 연루될 것이다. 따라서, 상기 작제물은 연관 질환의 치료에 사용된다.
소정의 실시형태에서 항원 분자의 다합체화를 저해하기 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물의 용도가 있다. 소정의 실시형태에서 동족 결합 파트너에 대한 항원의 결합을 저해하기 위한 1가 항원 결합 작제물의 용도가 있다.
소정의 실시형태에서, 이러한 치료, 예방 또는 경감이 바람직한 환자에게 질환 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나, 경감시키기에 효과적인 양으로 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 내분비계의 질환 및/또는 장애의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료에 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 신경계의 질환 및/또는 장애의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료에 사용된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 면역계의 질환 및/또는 장애의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료에 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 호흡계의 질환 및/또는 장애의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료에 사용된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 심혈관계의 질환 및/또는 장애의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료에 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 생식계의 질환 및/또는 장애의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료에 사용된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 소화계의 질환 및/또는 장애의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료에 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 혈액과 관련된 질환 또는 장애의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료에 사용된다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물 및/또는 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로호르몬 활성화, 신경전달물질 활성, 세포 신호전달, 세포 증식, 세포 분화 및 세포 이동(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 활성과 연관된 질환 및/또는 장애의 진단, 검출 및/또는 치료에 사용된다.
일 양상에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 개시된 질환, 장애 또는 병증 중 하나 이상을 치료하기 위해 환자에게 항원 결합 작제물을 투여하는 단계를 포함하는 항체 기반 치료제에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 치료학적 화합물은 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물을 코딩하는 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
구체적인 실시형태에서, 신경 장애, 면역계 장애, 근육 장애, 생식 장애, 위장관 장애, 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 증식성 장애 및/또는 암성 질환 및 병증(이들로 제한되지는 않음) 및/또는 본 명세서에 어딘가에 기재된 것과 같은 것을 포함하는, 하나 이상의 질환, 장애 또는 병증을 치료하기 위해 환자에게 적어도 항체의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물을 투여하는 단계를 포함하는 항체 기반 치료제가 있다.
적어도 항체의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 단독으로 또는 다른 유형의 치료제(예를 들어, 방사선 치료제, 화학치료제, 호르몬 치료제, 면역치료 및 항종양제)와 조합되어 투여될 수 있다. 일반적으로, 환자의 것과 동일한 종인, (항체의 경우) 종 기원 또는 종 반응성의 생성물의 투여가 바람직하다. 따라서, 일 실시형태에서, 인간 항체, 단편 유도체, 유사체 또는 핵산은 치료 또는 예방을 위해 인간 환자에게 투여된다.
유효량의 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물 또는 약제학적 조성물의 대상체에 대한 투여에 의한 치료, 저해 및 예방의 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 항원 결합 작제물은 실질적으로 정제된다(예를 들어, 이의 효과를 제한하거나 원치 않는 부작용을 생성하는 물질이 실질적으로 없음). 소정의 실시형태에서, 대상체는 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등(이들로 제한되지는 않음)과 같은 동물이고, 소정의 실시형태에서, 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다.
다양한 전달 시스템, 예를 들어 리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐에서의 캡슐화, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 내포작용(예를 들어, 문헌[Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)] 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 작제 등은 공지되어 있고, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물 제제를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 상기 화합물 또는 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 점적주사 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적으로 활성인 물질과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 또한, 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물 조성물을 심실내 및 척추강내 주사를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 중추 신경계로 도입하는 것이 바람직할 수 있고; 심실내 주사는 예를 들어 옴야(Ommaya) 저장소와 같은 저장소에 부착된 심실내 카테터에 의해 수월해질 수 있다. 폐 투여는 예를 들어 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸제를 가지는 제제의 사용에 의해 또한 이용될 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 치료의 필요 부위에 국소로 항원 결합 작제물, 또는 본 명세서에 기재된 조성물을 투여하는 것이 바람직하고; 이는 예를 들어 예의 방식으로 수술 동안 국소 점적주사, 국소 적용에 의해, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 병행되어, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있고, 상기 임플란트는 시알라스틱(sialastic) 막 또는 섬유와 같은 막을 포함하는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 재료이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 포함하는 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수하지 않는 재료를 사용하도록 주의를 기울어야 한다.
또 다른 실시형태에서, 항원 결합 작제물 또는 조성물은 소포, 특히 리포솜에서 전달될 수 있다(문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, 상기 참조, pp. 317-327; 일반적으로 상기 참조).
훨씬 또 다른 실시형태에서, 항원 결합 작제물 또는 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 일 실시형태에서, 펌프를 사용할 수 있다(문헌[상기 Langer 문헌; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). 또 다른 실시형태에서, 중합체 재료를 사용할 수 있다(문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)]참조; 또한 문헌[Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)] 참조). 훨씬 또 다른 실시형태에서, 제어 방출 시스템은 치료학적 표적, 예를 들어 뇌에 근접하게 위치할 수 있어서, 전신 용량의 분획만을 요한다(예를 들어, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조).
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 일 암 1가 항원 결합 작제물은 비중첩 결합 표적 에피토프를 가지는 다른 일 암 1가 또는 다가 항체와 조합으로 투여된다.
몇몇 실시형태에서 유효량의 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 단계를 포함하는 면역계 장애를 치료하는 방법이 있다. 소정의 실시형태에서 종양을 유효량의 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 종양의 성장을 저해하는 방법이 있다. 종양을 유효량의 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 종양의 수축 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태에서 항원을 유효량의 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 항원 분자의 다합체화를 저해하는 방법이 있다. 항원에 결합하기에 충분한 1가 항원 결합 작제물의 양을 포함하는 조성물과 항원을 접촉시키는 단계를 포함하는 동족 결합 파트너에 대한 항원의 결합을 저해하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
표적 세포에 항원에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 이합체 Fc 도메인을 포함하는 1가 항원 결합 작제물을 제공하는 단계를 포함하는 적어도 하나의 표적 세포에서 항체 농도를 증가시키는 방법이 본 명세서에 제공되고; 상기 1가 항원 결합 작제물은 2개의 항원 결합 구역을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 상기 항원을 디스플레이하는 표적 세포에 대한 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 우수한 치료학적 효율을 나타내고, 상기 효율은 항원의 가교결합, 항원 이합체화, 항원 조정의 방지 또는 항원 활성화의 방지에 의해 발생하지 않는다.
항원에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 CH3 도메인을 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 제공되고; 상기 1가 항원 결합 작제물은 2개의 항원 결합 구역을 가지는 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 상기 항원을 디스플레이하는 표적 세포에 대한 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 1가 항원 결합 작제물은 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 우수한 치료학적 효율을 나타내고, 상기 효율은 항원의 가교결합, 항원 이합체화, 항원 조정의 방지 또는 항원 활성화의 방지에 의해 발생하지 않는다.
EGFR 및/또는 HER2에 1가로 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물; 및 CH3 도메인을 포함하는 이합체 Fc 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, EGFR 및/또는 HER2에 결합하는 단리된 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 제공되고; 상기 항원 결합 작제물은 표적 세포에 의해 내재화되고, 상기 작제물은 EGFR 및/또는 HER2에 2가로 결합하는 상응하는 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 표적 세포에서 디스플레이된 EGFR 및/또는 HER2에 결합 밀도 및 B최대(최대 결합)의 증가를 나타내고, 상기 작제물은 상기 상응하는 2가 EGFR 및/또는 HER2 결합 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 ADCC, 더 높은 ADCP 및 더 높은 CDC 중 적어도 하나를 나타낸다.
본 명세서에 제공된 1가 항원 결합 작제물에 대한 항원의 결합에 의해 항원 세포외 도메인 단백질분해 절단을 방지하는 방법이 또한 제공된다.
암의 치료
암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물의 용도가 본 명세서에 제공된다. 면역계 장애의 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물의 용도가 또한 제공된다. 소정의 실시형태에서 종양의 성장을 저해하기 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물의 용도가 있다. 소정의 실시형태에서 종양을 수축시키기 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물의 용도가 있다.
암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 1가 EGFR 및/또는 HER2 결합 항원 결합 작제물의 용도가 본 명세서에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 암은 낮은 EGFR 및/또는 HER2 발현 암이다. 소정의 실시형태에서, 암은 2가 EGFR 및/또는 HER2 항체에 의한 치료에 내성이다. 트라스투주맙에 의한 치료에 내성인 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 1가 EGFR 및/또는 HER2 결합 항원 결합 작제물의 용도가 본 명세서에 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물은 암의 치료에 사용된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 EGFR 및/또는 HER2 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 1가 항원 결합 작제물은, HER1 기능이상, HER2 기능이상, HER3 기능이상 및/또는 HER4 기능이상을 포함하는, EGFR 및/또는 HER 기능이상과 연관된 암 또는 임의의 증식성 질환의 치료에서 유용하다. 소정의 실시형태에서, 암은 유방암, 삼중 음성 유방암, KRAS 돌연변이 양성 암, 위암, 뇌암, 폐암, 난소암, 유표피 유래 암, 방광암, 두경부암, 췌장암 중 적어도 하나이거나, 암종의 적어도 하나의 유형이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항원 결합 작제물은 유방암 세포의 치료에 사용된다. 소정의 실시형태에서, EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항원 결합 작제물은 암을 겪는 개체에게 투여하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용된다. 몇몇 실시형태에서 유효량의 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항원 결합 작제물을 상기 개체에게 제공함으로써 개체에서의 암의 치료가 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항원 결합 작제물은 현재의 치료제에 부분적으로 반응성인 환자를 치료하기 위해 사용된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항원 결합 작제물은 현재의 치료제에 내성인 환자를 치료하기 위해 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항원 결합 작제물은 현재의 치료제에 내성을 발전시키는 환자를 치료하기 위해 사용된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항원 결합 작제물은 현재의 치료제에 반응성이 아닌 환자를 치료하는 데 유용하다. 소정의 실시형태에서, 이 환자는 삼중 음성 암을 겪는다. 몇몇 실시형태에서, 삼중 음성 암은 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR) 및 Her2에 대한 유전자의 발현이 낮거나 느린 유방암이다. 소정의 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항원 결합 작제물은 임의로 하나 이상의 현재의 항-HER2 치료제와 조합되어 현재의 치료제에 반응성이 아닌 환자에게 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 현재의 항-HER2 치료제는 항-HER2 또는 항-HER3 단일특이적 2가 항체, 트라스투주맙, 페르투주맙, T-DM1, 이중특이적 HER2/HER3 scFv, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물은 단독으로 또는 조합되어 트라스투주맙, 페르투주맙, T-DM1, 항-HER2, 또는 항-HER3에 반응성이 아닌 환자를 치료하기 위해 사용된다.
일 실시형태에서, EGFR 및/또는 HER2에 결합하는 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항원 결합 작제물은 전이성 유방암을 가지는 환자의 치료에서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항체는 국소 진행성 또는 진행성 전이성 암을 가지는 환자의 치료에서 유용하다. 일 실시형태에서, EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항체는 불응성 암을 가지는 환자의 치료에서 유용하다. 일 실시형태에서, EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항체는 상기 환자가 이전의 항-HER2 치료에서 진행되었을 때 전이성 암의 치료를 위해 환자에게 제공된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항체는 삼중 음성 유방암을 가지는 환자의 치료에서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항체는 진행성, 불응성 HER2 증폭된, 헤레굴린 양성 암을 가지는 환자의 치료에 사용된다.
몇몇 유형의 EGFR 발현 암에서, 예를 들어 2가 항-EGFR 항체 세툭시맙을 사용한 비소세포 폐암 치료는 EGFR 발현의 수준이 높은 암에 대해 더 효과적이다(Pirker et al., Lancet 13:33-42 (2102). 세포의 EGFR 발현의 수준을 결정하고, 종양에서 EGFR 발현의 수준을 결정하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있고, 상업용 키트, 예를 들어 DAKO pharmDX 키트(Glostrup, 덴마크)는 이 목적에 구입 가능하다. 종양은 (1+ 내지 3+의 점수로) 샘플에서 개별 종양 세포의 막 염색 강도 및 또한 각각의 강도에서의 샘플 염색에서 종양 세포의 분획에 대해 점수 매겨질 수 있다. 막 염색은 하기와 같이 등급 매겨진다: 0 = 염색 무; 1+ = 고배율에서만 보이는 약한 염색; 2+ = 1+ 내지 3+; 3+ = 저배율에서 보이는 어두운 선의 막. 피커(Pirker) 등은 염색의 강도가 종양 샘플에서 염색의 빈도로 통합된다는 연구를 보고하였다. 각각의 종양 샘플에 대해 1-300의 규모의 면역 화학(IHC) 점수를, 최대 300의 점수(세포 염색 3+의 100%에 대해)가 생성시키는, 식을 이용하여 계산하였다: 1X(세포 염색 1+의 백분율) + 2X(세포 염색 2+의 백분율) + 3 X(세포 염색 3+의 백분율). 200 이상의 IHC 점수를 가지는 종양은 높은-EGFR 발현 종양인 것으로 생각된다. 이 점수 방법은 후속 연구에서 매우 재현 가능한 것으로 나타났다(Ruschoff el al. Arch Pathol Lab Med 137:1255-1261 (2013)).
링커와 함께 또는 링커 없이 이종이합체 Fc에 커플링된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 유효량의 단리된 1가 EGFR 결합 작제물과 종양을 접촉시키는 단계를 포함하는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 항원 결합 폴리펩타이드는 EGFR에 특이적으로 결합한다. 몇몇 양상에서, 작제물은 EGFR에 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 B최대로 EGFR에 결합한다.
소정의 양상에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 치료되는 종양은 낮은 수준의 EGFR을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양은 대조군 종양에 비해 낮은 수준의 EGFR을 발현한다. 몇몇 양상에서, 종양은 A431, A549, BT474, CACO2, HACAT, HCT116, JIMT1, MDA-MB-231, SKOV3, MCF7 또는 SKBR3의 세포주 중 하나 또는 하나 초과의 세포 표면 EGFR의 제2 수준과 동일하거나 이보다 낮은 세포 표면 EGFR의 제1 수준을 발현한다. 추가의 상세내용을 위해 하기 표 AA를 참조한다. 소정의 양상에서, 종양은 세포마다 약 3.5x106 이하의 EGFR의 평균을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양은 세포마다 약 2.8x106 이하의 EGFR의 평균을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양은 세포마다 약 1.2x106 이하의 EGFR의 평균을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양은 세포마다 약 2.4x105 이하의 EGFR의 평균을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양은 세포마다 약 2.6x105 이하의 EGFR의 평균을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양은 세포마다 약 4.2x104 이하의 EGFR의 평균을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양의 샘플은 면역조직화학 염색을 이용하여 평가할 때 3+ 미만의 EGFR의 평균 수준을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양의 샘플은 면역조직화학 염색을 이용하여 평가할 때 2+ 미만의 EGFR의 평균 수준을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양의 샘플은 면역조직화학 염색을 이용하여 평가할 때 1+ 미만의 EGFR의 평균 수준을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양은 피커 등에 기재된 방법에 의해 평가될 때 300 이하의 수준으로 EGFR을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양은 피커 등에 기재된 방법에 의해 평가될 때 200 이하의 수준으로 EGFR을 발현한다. 소정의 양상에서, 종양은 피커 등에 기재된 방법에 의해 평가될 때 100 이하의 수준으로 EGFR을 발현한다.
소정의 양상에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 치료되고, 본 명세서에 개시된 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 고정된 용량이 투여된 대상체는 EGFR에 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물의 고정된 용량으로 치료된 대상체와 비교하여 치료로부터 피부 독성을 덜 경험한다.
소정의 양상에서, 대상체는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 치료되고, 본 명세서에 개시된 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 고정된 용량이 투여되고, 치료 후, 대상체의 각질세포의 성장은 EGFR에 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물의 고정된 용량으로 치료된 대상체와 비교하여 덜 감소한다.
소정의 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물에 의해 치료되는 EGFR 발현 종양은 표피 세포 유래 암, 폐암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 유관 유방 관암, 췌장암, 두경부암, 위암, 난소암, HER2+ 암 또는 결장암이다. 소정의 양상에서, 암은 KRAS 돌연변이 양성이다. 소정의 양상에서, 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 탈푸코실화된다. 몇몇 양상에서, 치료의 결과는 종양의 수축, 종양의 성장의 저해, 종양의 진행에 대한 시간의 증가, 대상체의 무질환 생존기간의 연장 또는 대상체의 생존의 증가이다.
암의 치료를 위해 다른 공지된 치료제와 조합되어 투여되는 EGFR 및/또는 HER2 결합 1가 항원 결합 작제물이 본 명세서에 또한 제공된다. 이 실시형태에 따라, 1가 항원 결합 작제물은 FSA 초과로 B최대 및 항체 독립적 세포독성 활성을 유의적으로 증가시키기 위해 다른 1가 항원 결합 작제물 또는 비중첩 결합 표적 에피토프를 가지는 다가 항체와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 1가 EGFR 결합 작제물은 1) 하나 이상의 1가 HER2 결합 작제물, 예컨대 OA-Tras 또는 OA-Pert와의 조합되어 또는 2) 하나 이상의 2가 HER2 결합 작제물, 예컨대 페르투주맙 또는 트라스투주맙과 조합되어, 또는 3) 동일한 표적 세포에서 동일한 및 상이한 표면 항원에 지향된 비경쟁 항체와 다수로 조합되어 투여될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 1가 항원 결합 작제물은 허셉틴(상표명), TDM1, 탈푸코실화 항체, 독소에 접합된 항체, 예컨대 DM1, 또는 퍼제타(Perjeta)(상표명)로부터 선택된 치료제와 조합되어 투여된다.
유효량의 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 치료되는 질환은 암이다. 또 다른 실시형태에서, 치료되는 암은 유방암이고, 예를 들어 유방암의 세포가 높은, 중간 또는 낮은 밀도로 HER2 단백질을 발현한다. 하기 표 A6은 여러 대표적인 유방암 세포주에서 HER2의 발현 수준을 기재한다(Subik et al. (2010) Breast Cancer: Basic Clinical Research:4; 35-41; Prang et al. (2005) British Journal of Cancer Research:92; 342-349). 표에 기재된 바대로, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포는 낮은 HER2 발현 세포인 것으로 생각되고; SKOV3 세포는 중간 HER2 발현 세포인 것으로 생각되고, SKBR3 세포는 높은 HER2 발현 세포인 것으로 생각된다.
Figure pct00017
유전자 치료:
구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산은 유전자 치료의 방식으로 단백질의 비정상 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나, 저해하거나, 예방하기 위해 투여된다. 유전자 치료는 발현된 또는 발현 가능한 핵산의 대상체에 대한 투여에 의해 수행된 치료를 의미한다. 본 발명의 이 실시형태에서, 핵산은 치료학적 효과를 중재하는 이의 코딩된 단백질을 생성한다. 당해 분야에서 이용 가능한 유전자 치료를 위한 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물을 코딩하는 핵산을 포함하는 구체적인 실시형태에서, 핵산은, 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 이것을 작제하고 이것을 투여함으로써, 예를 들어 레트로바이러스 벡터(미국 특허 제4,980,286호 참조)의 사용에 의해, 또는 직접 주사에 의해, 또는 마이크로입자 충격(예를 들어, 유전자 총; 유전자충격(Biolistic), 듀퐁(Dupont))의 사용에 의해, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염 물질에 의한 코팅에 의해, 또는 핵에 진입하는 것으로 알려진 호메오박스(homeobox) 유사 펩타이드에 대한 연결에서 이것의 투여에 의해(예를 들어, 문헌[Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 (1991)] 참조) 및 기타 등등에 의해 이것이 세포내가 됨으로써, 이의 코딩된 단백질의 발현을 촉진하도록 생체내 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 상동성 재조합에 의해 발현을 위해 세포내 도입되고 숙주 세포 DNA 내에 혼입될 수 있다.
다양한 공보가 본 명세서에 인용되고, 이들의 개시내용은 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
참조문헌:
Figure pct00018
Figure pct00019
실시예
본 발명을 수행하기 위한 특정 실시형태의 예가 하기 있다. 예는 오직 예시 목적을 위해 제공되고, 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력이 이루어지지만, 몇몇 실험 오차 및 편차가 물론 허용되어야 한다.
본 발명의 실행은, 달리 표시되지 않은 한, 당해 분야의 지식 내에 단백질 화학, 생물화학, 재조합 DNA 기법 및 약리학의 전통적인 방법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3 rd Ed . (Plenum Press) Vols A and B(1992)]을 참조한다.
표 AA는 본 명세서에 기재된 특정 실시형태의 예에서 사용된 세포주의 목록을 제공한다.
Figure pct00020
* 발현 수준은 허셉테스트(HercepTest)에 기재된 기준에 따라 (이용 가능할 때) 보고된 면역조직학적 균주로부터의 결과에 기초한다. 세포마다 수용체 수에 대한 참조문헌은 문헌[McDonagh et al Mol Cancer Ther. 2012 Mar;11(3):582-93, Subik et al Breast Cancer (Auckl). 2010 May 20;4:35-41, Kurai et al Clin Cancer Res 2007;13(5):1552-61, Gaborit et al J Biol Chem. 2011 Apr 1;286(13):11337-45, Spangler et al, PNAS 2010; 107(30):13252-13257, Anido et al, Clin Cancer Res 2003;9:1274-1283, Nakamura et al, Cancer Letters 230 (2005) 33-46, Bunn et al, Clin Cancer Res 2001;7:3239-3250, Xu et al, Mol Cancer Ther 2005;4:435-442, Rao et al, Oncogene (2012) 31, 2888-2898, Dragowska et al. BMC Cancer 2011, 11:420, Tanner et al, Mol Cancer Ther 2004;3:1585-1592 및 Neve et al, Cancer Cell 2006 Dec;10(6):515-27]에 보고되어 있다. 수용체 수에 대한 약간의 작은 변동은 결정을 위해 이용된 방법에 따라 관찰된다.
실시예 1 - 예시적인 OA-EGFR 항체 및 대조군의 제조
표 1은 준비된 OA-EGFR 항체 및 대조군의 확인을 제공한다.
Figure pct00021
hIgG1(카탈로그 009-000-003호)을 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)(필라델피아주 웨스트 그로브)로부터 구입하였다.
허셉틴(상표명)(트라스투주맙)을 로슈(Roche)로부터 구입하였다. 트라스투주맙은 HER2의 세포외 도메인4(ECD4)에 결합한다.
얼비툭스(상표명)(세툭시맙)를 브리톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Meyers Squibb)로부터 구입하였다. 세툭시맙은 EGFR의 ECD3에 결합한다.
FSA-Tras(v506)는 대조군으로서 CHO 세포에서 사내 제조된 야생형 트라스투주맙이다. Fab HER2 결합 도메인 둘 다는 트라스투주맙과 동일하고, Fc는 야생형 동종이합체이고; 항원 결합 도메인의 에피토프는 HER2의 도메인 4이다.
OA-Tras(v1040)는 1가 항-HER2 항체이고, 여기서 HER2 결합 도메인은 사슬 A에서 Fab이고, Fc 구역은 사슬 A에서 돌연변이 T350V_L351Y_F405A_Y407V(EU 넘버링), 및 사슬 B에서 T350V_T366L_K392L_T394W(EU 넘버링)를 가지는 이종이합체이고; 항원 결합 도메인의 에피토프는 HER2의 도메인 4이다.
OA-Pert(v4182)는 1가 항-HER2 항체이고, 여기서 HER2 결합 도메인은 사슬 A에서 Fab이고, Fc 구역은 사슬 A에서 돌연변이 T350V_L351Y_F405A_Y407Y, 및 사슬 B에서 T350V_T366L_K392L_T394W를 가지는 이종이합체이다. 항원 결합 도메인의 에피토프는 HER2의 도메인 2이다.
OA-CTX(v4353)는 이종이합체 IgG1 Fc를 가지는 1가 항-EGFR 항체이다. Fab(이의 단백질 서열은 진뱅크 수탁 번호 1YY8_B 및 1YY8_A로부터 유래함(각각 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/66361248 및 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/66361247; 2014년 11월 10일에 기탁)를 T350V_L351Y_F405A_Y407V를 함유하는 중쇄 A에 탑재하고, 중쇄 B는 T350V_T366L_K392L_T394W를 가지는 Fc 단편에 상응한다. 항원 결합 도메인에 의해 인식된 에피토프는 EGFR의 도메인 3이다. 분자는, EGFR의 리간드 의존적 및 리간드 독립적 활성화 둘 다를 방지할 수 있다는 점에서, 또한 세툭시맙과 같이 중화인 것으로 예상된다(Li et al Cancer Cell. 2005 Apr;7(4):301-11).
OA-EG2(v1323)는 이종이합체 IgG1 Fc에서 단일 도메인 항체 EG2의 일 암 항체이다(Bell et al Cancer Lett. 2010 Mar 1;289(1):81-90). Fab는 T350V_L351Y_F405A_Y407V를 함유하는 중쇄 A에 탑재되고, 중쇄 B는 T350V_T366L_K392L_T394W를 가지는 Fc 단편에 상응한다. OA-EG2는 EGFR의 세포외 도메인에 결합하고, EGFR 결합에 대해 세툭시맙 또는 EGF와 경쟁하지 않는다.
OA-CTX-탈푸코는 OA-CTX의 탈푸코실화 형태이다(실시예 9 참조).
OA-CTX-탈푸코-ADC는 DM1에 접합된 OA-CTX의 탈푸코실화 형태이다(실시예 10 참조).
서열은 표 B에 제공되어 있다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
실시예 2: OA-EGFR 항체 및 대조군의 발현 및 정제
실시예 1에 기재된 OA-EGFR 항체 및 대조군을 하기와 같이 50㎖의 배양물 중에 발현시키고 정제하였다.
항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 인간/포유동물 발현에 최적화된 코돈을 사용하여 유전자 합성을 통해 작제하였다. 최종 유전자 생성물을 포유동물 발현 벡터 pTT5(NRC-BRI, 캐나다)로 하위클로닝하고, CHO 세포에서 발현시켰다(Durocher, Y., Perret, S. & Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing CHO cells. Nucleic acids research 30, E9 (2002)). 표준 분자 생물학 DNA 재조합 기법을 이용하여 클로닝된 v1323을 제외하고, 항체 작제물의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자의 DNA를 유전자 합성에 의해 모두 생성하였다.
CHO 세포를 수성 1㎎/㎖의 25kDa 폴리에틸렌이민(PEI, 폴리사이언시스)에 의해 2.5:1의 PEI:DNA 비율로 지수 성장 단계(1.5 내지 2백만 개의 세포/㎖)에서 형질감염시켰다. (Raymond C. et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55(1):44-51 (2011)). Fc 이종이합체를 형성하기 위한 최적 농도 범위를 결정하기 위해, 중쇄 A(HC-A), 경쇄(LC) 및 중쇄 B(HC-B)의 DNA를 초기에 상이한 비율로 형질감염시켰다. v4353의 최적 HC:Fc:LC DNA 비율은 36:24:40이었다. v1323의 최적 HC:Fc DNA 비율은 60:40이었다. 형질감염된 세포를 4000rpm에서 원심분리 후 수집된 배양 배지에 의해 5-6일 후 수확하고, 0.45㎛ 필터를 사용하여 깨끗하게 하였다.
깨끗한 배양 배지를 MabSelect SuRe(GE Healthcare) 단백질-A 칼럼에 로딩하고, 10 칼럼 용적의 PBS 완충제(pH 7.2)에 의해 세척하였다. 항체를, pH 11에서 트리스(TRIS)에 의해 중화된 항체를 함유하는 혼주된 분획을 가지는, 10 칼럼 용적의 시트르산 완충제(pH 3.6)에 의해 용리시켰다. 단백질을 이후 에코노-팩(Econo-Pac) 10DG 칼럼(Bio-Rad)을 사용하여 탈염시켰다.
단백질을 겔 여과에 의해 추가로 정제하고, 3.5㎎의 항체 혼합물을 1.5㎖로 농축시키고, 1㎖/분의 유속에서 AKTA Express FPLC(GE Healthcare)를 통해 슈퍼덱스(Superdex) 200 HiLoad 16/600 200pg 칼럼으로 로딩하였다. PBS 완충제(pH 7.4)를 1㎖/분의 유속에서 사용하였다. 정제된 항체에 상응하는 분획을 수집하고, 약 1㎎/㎖로 농축시키고, -80℃에서 저장하였다.
도 1A는 79.95의 보유에서 주피크를 가지는 단백질 A 정제 후 v4353의 SEC 프로필을 보여준다. 도 1B는 84.74의 보유에서 주피크를 가지는 단백질 A 정제 후 v1323의 SEC 프로필을 보여준다. 도 1C는 각각 대략 110kDa 및 66kDa의 종을 가지는, 비환원 SDS-PAGE 분석에 의해 측정될 때, 단백질 A 및 SEC 정제 후 v4353 및 v1323 둘 다의 순도를 보여준다. 하기 표 2는 정제 과정을 통한 항체의 수율의 요약을 제공한다.
Figure pct00029
최적화된 DNA 비율을 이용하여 표시할 때, 예시적인 일 암 항체 v4353 및 v1323은 단백질 A 정제 단계 후, SEC 크로마토그램에서 보이는 바와 같이, 상당한 양의 동종이합체 오염물질 또는 고분자량 응집체를 보여주지 않았다(도 1A 및 도 1B). 혼주된 SEC 분획의 SDS-PAGE는 이종이합체 Fc의 순도의 높은 수준을 나타냈다(도 1C). 순도는 UPLC SEC 및 질량 분광법에 의해 95% 초과인 것으로 추가로 확인되었다.
V4353은 문제 없이 10ℓ 제조로 규모 확대되어서, 단백질 A 및 SEC 정제 후 97.5㎎/ℓ 이하의 역가를 생성시켰다.
실시예 3: EGFR에 특이적으로 결합하는 OA-EGFR 항체
EGFR에 특이적으로 결합하는, v4353 및 v1323의, 2개의 예시적인 OA-EGFR 항체의 능력을 평가하기 위해 이 실험을 수행하였다. EGFR에 대한 특이적 결합을 비아코어(BIAcore) T200 기기(GE Healthcare)를 사용하여 하기 기재된 방법에 따라 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하여 측정하였다.
항-인간 IgG Fc 항체(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 109-005-098호)를 1차 아민기를 통해 시리즈 S 센서 칩 CM5(카탈로그 BR-1005-30호, GE Healthcare)에 공유로 커플링하였다. 칩을 처음에 10㎕/분의 유속으로 5분 동안 HBS-EP(10mM HEPES(pH 7.4), 150mM NaCl, 3.4mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)와 평형화시켰다. 칩을 이후 7분 동안 10㎕/분으로 흐르는 NHS(N-하이드록시숙신이미드) 및 EDC(1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드)의 1 대 1 혼합물에 의해 활성화하였다. 포획 항체를 이후 10㎕/분의 유속으로 7분 동안 주입하고, 마지막으로 10㎕/분의 유속으로 7분 동안 에탄올아민을 주입합으로써 과량의 반응성 기를 탈활성화시켰다.
항원에 대한 항체 결합을 하기한 바대로 시험하였다. 칩 표면을 처음에 HBS-EP 실행 완충제의 3회 동일한 분석 사이클에 의해 안정화시켰다. 샘플 항체를 20초 내지 2분 동안 10㎕/분에서 100nM에서 포획을 위해 주입하여 대략 100 RU(반응 단위)의 포획 수준을 달성하였다. 칩을 이후 실행 완충제를 사용하여 평형화시켰다. HER2 세포외 도메인(ECD) 또는 EGFR ECD인 항원을 이후 3분 내지 4분 동안 30㎕/분의 유속으로 항체 결합을 측정하기 위해 증가하는 농도(예를 들어, 1, 3, 9, 27nM으로부터 81nM으로)에서 주사하였다. 이것 후에 해리 단계가 후행하고, 여기서 실행 완충제는 약 20분 동안 또는 완전히 해리될 때까지 30㎕/분으로 흘렀다. 매회 0.5분 동안 유속 10㎕/분으로 흐르는 2회의 실행 완충제, 이후 0.25분 동안 10㎕/분으로 흐르는 6회 재생 완충제(글라이신-HCL(pH 1.7)) 주사 사이클에 의해 표면을 재생하였다. 일련의 결합 센소그램이 완료될 때까지 다음 더 높은 항원 농도를 사용하여 이를 반복하였다.
결과가 도 2A 내지 도 2D에 도시되어 있다. 도 2B 및 도 2D에서, HER2 결합의 부재는 확인되었고, 여기서 하위섹션 'a'가 항체 포획의 센서그램에 상응하고, 하위섹션 'b'가 HER2 주사 후 센서그램에 상응한다.
OA-EGFR 항체에 대한 EGFR 결합 특징의 요약이 표 3에 기재되어 있다.
Figure pct00030
EGFR에 대한 OA-CTX의 결합을 대략 0.85nM의 KD로 SPR에 의해 정량화하였다(도 2A). 이것은 1가 결합 상호작용을 특징으로 하는 항체 포획 프로토콜을 사용하는 유사한 SPR 실험에 의해 결정된 세툭시맙(1nM)에 대해 보고된 KD에 필적하였다. HER2에 대한 결합이 관찰되지 않았다. EGFR에 대한 OA-EG2의 결합을 대략 12nM의 KD로 또한 결정하였다. OA-EG2의 결합은 EGFR에 또한 특이적이었다. 종합하면, 이 결과는 일 암 항체가 설계에 의해 EGFR의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 이것이 유래한 상응하는 2가 항체와 비교하여 동일한 1가 결합 친화도를 보유할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 4: 낮은 수준의 EGFR(저 EGFR)을 발현하는 세포에 결합하는 예시적인 OA-EGFR 항체의 능력
이 실험을 낮은 수준의 EGFR을 발현하는 세포주인 유방 BT-474 암 세포주에 대한 OA-EGFR 항체의 결합을 평가하기 위해 수행하였다(McDonagh et al Mol Cancer Ther. 2012 Mar;11(3):582-93). 하기 기재된 바대로 실험을 수행하였다.
BT-474 세포를 다양한 농도의 항체에 의해 항온처리하고, 8개의 농도 지점은 1시간 동안 4℃에서 0.3pM 내지 300nM로 기하학적으로 분포하였다. 이후, 세포를 PBS에 의해 3회 세척하고, 이후 항-인간 IgG-FITC를 과량으로 첨가하였다. 세포를 암소에서 4℃에서 1시간 동안 추가로 항온처리하고, PBS에 의해 다시 3회 세척하였다. 마지막으로, 세포를 PBS 중에 재현탁시키고, MFI를 FACSCalibur(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 사용하여 측정하였다.
결과는 도 3에 도시되어 있다. 표 4A는 BT-474에서 세포 결합 데이터의 요약을 제공한다.
Figure pct00031
FACS 결합 결과는 일 암 항체가 포화 농도에 대해 상응하는 2가 항체보다 더 높은 B최대를 나타낸다는 것을 보여준다. OA-CTX는 OA-EG2보다 더 높은 B최대를 나타내고, 이것은 EGFR에 대한 상이한 결합 및 해리 동역학에 의해 설명될 수 있다.
실시예 5: 세포 EGFR 발현 A431 세포의 성장을 저해하는 예시적인 OA - EGFR 항체의 능력의 평가
이 실험을 높은 수준의 EGFR을 발현하는 유표피 암종 세포주(ATCC(등록상표) CRL-1555)의 성장을 저해하는 예시적인 OA-EGFR 항체의 능력을 결정하기 위해 수행하였다. 하기 기재된 바대로 성장 저해 검정을 수행하였다.
5천 개의 A431 세포를 96웰 플레이트의 각각의 웰에 시딩하였다. 항체 OA-CTX v4353, OA-EG2 v1323 또는 얼비툭스(상표명)를 300nM, 30nM, 3nM 및 0.3nM의 최종 농도로 3회 첨가하였다. 성장 배지의 최종 검정 용적은 200㎕이고, 96웰 플레이트를 5일 동안 37℃에서 항온처리하였다. 배지를 플레이트로부터 제거하고, 50㎕의 PBS를 각각의 웰에 첨가하였다. 이후, 50㎕의 셀티터-글루(CellTiter-Glo)(등록상표)(프로메가(Promega)) 반응 혼합물을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 항온처리하였다. 마지막으로, RLU(상대 광 단위) 값을 페라스타(Pherastar) 플레이트 판독기에 의해 판독하였다. 비처리 대조군에 대한 세포 성장의 백분율을 하기와 같이 계산하였다:
세포 성장(%) = 100% x (RLU샘플)/(RLU비처리)
결과가 도 4에 도시되어 있다. OA-CTX는 포화 조건에서 얼비툭스(상표명)만큼 많이 A431의 성장을 저해하지만, OA-EG2는 A431의 성장을 저해하지 않았다. 높은 EGFR 발현 A431 세포에서 EGFR 의존적 성장의 저해는 EGF를 중화시키는 OA-CTX의 능력 및 EGF를 중화시키는 OA-EG2의 불능과 일치하였다. 활성 차이는 세포 성장을 추진하는 EGFR 구성적 수용체 신호전달을 차단하는 (결합 에피토프에 따라) OAA의 상이한 능력을 또한 반영한다.
실시예 6: ADCC를 매개하는 예시적인 OA-EGFR 항체의 능력
유방 관암종 유래 세포주인 BT-474에서 ADCC를 매개하는 OA-EGFR 항체의 능력을 측정하였다. 하기 기재된 바대로 ADCC 검정을 수행하였다.
표적 BT-474 세포(10,000개의 세포, 50㎕)를 96웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 여기에 상이한 농도의 항체를 첨가하고, 3pM 내지 300nM(최종 농도)으로 기하학적으로 분포시켰다. 플레이트를 30분 동안 항온처리한 후 PBMC 이팩터 세포를 25:1의 이팩터 세포 대 표적 세포(E:T)로 첨가하였다. 세포를 교차 진탕시켜 온화하게 혼합하고, 플레이트를 6시간 동안 37℃/5% CO2에서 추가로 항온처리하였다.
LDH 키트 및 플렉스스테이션(Flexstation) 3을 사용하여 상청액으로 방출된 LDH의 양을 측정함으로써 용해된 세포의 백분율을 결정하였다. 492㎚에서의 흡광도 값을 650㎚에서의 것에 의해 모두 배경 공제하였다. 결과의 계산이 하기 기재되어 있고, 용량 반응 곡선 매개변수를 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)에서 작도하였다:
세포 용해(%) = 100% x (OD샘플 - OD비특이적) / (OD최대 - OD최소)
여기서, 표적 세포가 다른 치료 없이 이팩터 세포에 의해 항온처리될 때 OD샘플은 샘플의 배경 공제 값에 상응하고; OD비특이적은 LDH 검정에서의 판독에 상응하고; OD최대는 용해된 표적 세포의 최대 양에 상응한다. 1% 트리톤(Triton) X-100을 표적 세포에 첨가하고, 이팩터 세포 없이 항체에 의해 항온처리함으로써 이 판독을 생성하였고; OD최소는 용해된 표적 세포의 최소 양에 상응한다. 표적 세포를 이팩터 세포 및 항체 없이 검정 완충제 중에 항온처리하였다.
결과가 도 5에 도시되어 있다. OA-CTX(v4353) 및 OA-EG2(v1323)는 얼비툭스(상표명)와 비교하여 더 큰 ADCC 매개 세포 용해를 나타냈다.
표 5는 BT-474 세포의 ADCC 용해의 용량 반응 매개변수의 요약을 제공한다.
Figure pct00032
예시적인 OA-EGFR 둘 다는 시험된 최고 항체 농도에서 대략 2배의 차이로 얼비툭스(상표명)와 비교하여 더 큰 백분율의 표적 세포 용해를 나타냈다. 이 결과는 실시예 4에 기재된 상응하는 전장 항체와 비교하여 일 암 항체에 대해 관찰된 세포 표면 장식의 수준의 증가에 기초하여 예상되었다. 허셉틴(상표명)은 또한 양성 대조군으로서 포함되었고, BT-474가 EGFR보다 13배 더 높은 HER2 수용체 수준을 발현하지만, OA-CTX v4353 및 OA-EG2 v1323 둘 다는 허셉틴(상표명)과 유사한 수준의 최대 백분율 ADCC 용해를 달성할 수 있었다. 이 결과는 일 암 항체가 상응하는 전장 항체에 의해 달성되지 않는 더 높은 ADCC 용해를 달성할 수 있다는 것을 입증한다. 수용체 수준이 효과적인 이팩터 매개 세포 사멸을 유도하기에 통상적으로 충분하지 않을 때 이것은 마찬가지로 특히 중요할 것이다. 부가적으로, 일 암 항체에 의해 매개된 ADCC의 수준은 세포 표면에서 유의적으로 더 높은 수준에서 발현된 상이한 수용체를 표적화하는 전장 항체에 의해 매개된 것과 일치할 수 있다.
실시예 7: 내재화되고, 표면 EGFR 발현을 하향조절하는 예시적인 OA - EGFR의 능력
내재화되고 표면 EGFR 발현을 하향조절하는 v4353의 능력을 트라스투주맙 내성 유방암 JIMT1 세포(높은 수준의 EGFR을 발현)에서 측정하였다.
예시적인 일 암 항-EGFR 항체가 EGFR 발현 세포에서 내재화되는지를 결정하고, 항-HER2 항체와의 이의 조합의 특성을 규명하기 위해 이 실험을 수행하였다. 직접 내재화 방법은 문헌[Schmidt, M. et al., Kinetics of anti-carcinoembryonic antigen antibody internalization: effects of affinity, bivalency, and stability. Cancer Immunol Immunother (2008) 57:1879-1890]에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다. 구체적으로, 항체를 제조업자의 지시에 따라 알렉사플루오르(AlexaFluor)(등록상표) 488 프로테인 라벨링 키트(Protein Labeling Kit)(인비트로겐(Invitrogen), 카탈로그 A10235호)를 사용하여 직접 라벨링하였다.
내재화 검정을 위해, 12웰 플레이트를 1x105개의 세포/웰로 시딩하고, 37℃/5% CO2에서 밤새 항온처리하였다. 다음날, 라벨링된 항체를 DMEM + 10% FBS 중에 200nM로 첨가하고, 37℃/5% CO2에서 24시간 항온처리하였다. 암소 조건 하에, 배지를 흡인시키고, 웰을 2 x 500㎕의 PBS로 세척하였다. 세포를 수확하기 위해, 세포 해리 완충제(250㎕)를 37℃에서 첨가하였다. 세포를 펠렛화하고, 50㎍/㎖에서 항-알렉사 플루오르 488, 토끼 IgG 분획(모레큘러 프로브즈(Molecular Probes), A11094, 롯트 1214711) 없이 또는 함께 100㎕의 DMEM + 10% FBS 중에 재현탁시키고, 30분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 300㎕의 DMEM + 10% FBS를 분석하기 전에, 샘플 여과된 4㎕의 프로피듐 아이오다이드를 첨가하였다. 샘플을 LSRII 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다.
하향조절 검정을 위해, 4℃에서 항온처리된 세포에 대해 항체의 형광의 수준을 또한 측정하였다.
20nM에서의 내재화 및 하향조절 실험의 결과가 도 6A에 도시되어 있다. 조합의 100nM 및 200nM에서 측정된 결과가 도 6B에 도시되어 있다. 조합의 경우, 형광단을 보유하는 분자는 *로 표시된다. 1040+4353*의 '표면 4°'의 측정이 이용 가능하지 않다.
20nM에서, 얼비툭스 및 OA-CTX(v4353)와 비교하여 유사한 정도로 내재화된 OA-CTX(v4353)는 얼비툭스보다 더 적은 정도지만 표면 EGFR을 하향조절하였다.
100nM에서, 얼비툭스(상표명)는 FSA-Tras(v506)의 내재화도 HER2 하향조절도 강화시키지 않았다.
200nM에서, 조합 중의 OA-CTX v4353 + OA-Tras, OA-CTX는 OA-Tras의 내재화에도 OA-Tras에 의해 유도된 HER2 수용체 수준에도 영향을 미치지 않았고, OA-Tras(v1040)는 EGFR 수용체 수준이 아니라 OA-CTX의 내재화를 약간 감소시키는 것으로 나타났다. OA-CTX v4353은, 20nM에서 보이는 것처럼, 더 적은 정도로 표면 EGFR을 하향조절하였다.
수용체 하향조절 및 내재화의 정도를 상이한 항체 농도에서 시험하였다. 20nM에서, 53%의 EGFR은 OA-CTX v4353에 의해 시험될 때 표면에 남아 있지만, 얼비툭스(상표명)는 36%에서 약간 더 높은 수준의 수용체 하향조절을 매개하였다. 그러나, 분자 둘 다는 거의 동일한 정도로 내재화되었다. 수용체 하향조절 및 내재화에 대한 농도 의존도가 200nM에서 시험된 OA-CTX와 비교할 때 관찰된다는 것을 또한 주목한다.
100nM에서, FSA-Tras 내재화에 대한 얼비툭스(상표명)의 영향을 시험하고, 결과는 얼비툭스(상표명)가 FSA-Tras의 HER2 내재화 및 하향조절 특성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
200nM에서, 일 암 항체 조합의 거동을 조사하였다. 여기서, OA-CTX v4353은, 전장 대응물에 대한 관찰과 일치하게, OA-Tras v1040에 의해 매개된 HER2 내재화 및 상향조절을 변경하지 않았다. 그러나, OA-Tras는 1300 MFI로부터 1050 MFI로 OA-CTX v4353에 의해 매개된 내재화의 양을 상당히 감소시키는 것으로 나타났다. EGFR 하향조절의 정도가 조합에서 감소하는 것으로 또한 보였다.
예시적인 일 암 항체의 내재화 프로필은 이것이 항체-약물 접합체(ADC)에 대한 적합한 후보물질이라는 것을 나타낸다.
실시예 8: SKOV3 이종이식 모델에서의 OA - EGFR 및 OA - HER2 항체의 조합의 항종양 활성
OA-EGFR 및 OA-HER2의 조합이 세포주 유래 이종이식 모델에서 종양 용적을 감소시키거나 생존을 증가시킬 수 있는지를 결정하기 위해 이 실험을 수행하였다.
단일 물질로서의 항-EGFR 일 암 단일클론 항체와의 조합으로 또는 종양 성장을 억제하기 위한 조합으로 항-HER2 일 암 항체의 항종양 효율을 평가하기 위해 인간 난소 세포주 유래 이종이식 모델인 SKOV-3을 사용하였다. 암컷 Fox In nude 마우스에 피하 조직에서 1㎣ 종양 단편의 삽입을 통해 종양을 접종하였다. 200㎣의 용적이 도달한 후 종양 측정을 2주 1회 취하고; 동물을 이후 3 치료 그룹으로 무작위화하였다. 치료 그룹은 하기와 같다:
Figure pct00033
그룹 (a) 1주 2회 투약된 비특이적 hIgG 대조군.
Figure pct00034
그룹 (b) 일 암 트라스투주맙 (OA-Tras; v1040), 21일 동안 1주 2회 투약되고, 이후 치료는 22일에 일 암 트라스투주맙 + 일 암 페르투주맙(OA-Pert; v4182)으로 전환됨.
Figure pct00035
그룹 (c) 1주 2회 투약된 일 암 트라스투주맙 + 일 암 세툭시맙(OA-CTX; v4353).
치료 그룹을 전체 4주 시간까지 이의 투약 스케줄에 따라 T0에 15㎎/㎏의 로딩 용량 및 10㎎/㎏의 유지 용량으로 정맥내 투약하였다. 치료 기간 동안 2주 1회 및 추적관찰 기간 동안 1주 1회 종양 직경을 측정함으로써 종양 용적을 평가하였다.
11일에 혈청 농도를 시험 코호트에 대해 결정하였다. 그룹 b(OA-Tras)의 경우, 평균 혈청 농도는 70.9㎍/㎖(35-95㎍/㎖의 범위)이고, 그룹 c(OA-Tras + OA-CTX)의 경우, 전체 시험 항체의 평균 혈청 농도는 165.6㎍/㎖(100-280㎍/㎖의 범위)이었다.
그룹 (c)에 의한 SKOV-3 종양 보유 마우스의 치료는 그룹 a와 비교하여 종양의 성장을 가장 효율적으로 저해하였다.
종양 용적에 대한 OA 항체의 조합의 효과가 도 7에 도시되어 있다.
표 6은 22일에 생체내 종양 성장 저해 결과의 요약을 제공하고, 여기서 선택된 코호트에 대한 약물 전환이 발생하였다.
Figure pct00036
생존율에 대한 OA 항체의 조합의 효과를 보여주는 결과가 도 8에 도시되어 있다.
SKOV3 마우스 이종이식 모델에서, OA-CTX + OA-Tras 조합은 확립된 종양의 성장을 저해하는 데 있어서 최고 효율을 입증하였다. 통계 유의성은 대조군 및 다른 치료 그룹과 관련하여 치료 2주 내에 확립되었다(도 7). OA-Tras와 비교하여, OA-CTX의 부가는 추가의 종양 성장 저해를 부여하였다. 간접 비교는, OA-Tras 코호트가 일 암 페르투주맙의 부가에 의해 조합 그룹으로 전환될 때, 2개의 항-HER2 일 암 항체의 조합에 의해 만들어지고, 이후 종양 성장률은 유의적으로 감소하지 않았다. 데이터는 상이한 수용체를 표적화하는 일 암 항체의 조합에 의해 치료될 때 종양 성장 저해가 더 효율적이라는 것을 제시한다. 동일한 암 세포주에서 실험실내 관찰된 예시적인 일 암 항체의 생물학적 활성에 기초하여, 부가 효율이 부가의 세포 표면 장식으로부터 항체 매개 이팩터 기능으로부터 생기는 것으로 보인다.
OA-CTX + OA-Tras의 효율은 또한 카플란-마이어 곡선(도 8)으로부터 명확하고, 여기서 2000㎣의 종양 용적은 생존을 위한 대리 판독으로서 작용하는 말단 종점으로서 사용된다. 도 8에 도시된 것처럼, hIgG 대조군에서의 마우스는 치료 후 33일이 지나 생존하지 않았다. 비교하면, OA-Tras/+OA-Pert 그룹에서의 마우스의 생존은 60일에 33% 미만으로 감소하였다. 그러나, OA-CTX + OA-Tras 그룹에서, 모든 동물은 살아 남아, 일 암 항체 조합의 효율을 추가로 입증하였다.
대체로, OAA의 예시적인 조합은 대조군과 비교하여 생체내 더 우수한 종양 성장 저해 특성을 입증하였다. OAA 조합 코호트에서의 모든 종양은 내부 기준에 따라 치료에 반응하였다. 부가적으로, OAA 조합은 진행성 질환의 수를 감소시키고, 고형 종양 성장의 RECIST 평가에 따라 대조군과 비교하여 진행에 대한 평균 시간을 적어도 2.3배 지연시켰다.
표 7은 카플란-마이어 곡선(도 8)에 도시된 결과의 요약을 제공한다.
Figure pct00037
표 8은 종양 성장 동역학에 대한 결과의 요약을 제공한다.
Figure pct00038
실시예 9: 예시적인 탈푸코실화 항체의 일시적 CHO 발현, 정제 및 수율
탈푸코실화 항체는 ADCC 및 다른 항체 이팩터 기능을 증대시키는 것으로 공지되어 있다. 슈도모나스 아에루지노사 PAO1로부터의 GDP-6-데옥시-D-일속소-4-헥술로스 환원효소(RMD)를 코딩하는 추가의 클론을 형질감염된 전체 DNA의 15%에 첨가하여(즉, HC:Fc:LC:RMD의 최종 DNA 비율은 30.6:20.4:34:15임), 예시적인 탈푸코실화 항체(OA-CTX-탈푸코, v7192)를 실시예 2에 기재된 바와 동일한 일시적 CHO 발현 시스템 및 단백질 A 및 크기 배제 크로마토그래피 정제 절차를 사용하여 제조하였다(von Horsten et al Glycobiology (2010) 20 (12):1607-1618).
예시적인 탈푸코실화 항체를 10ℓ 배양물 중에 발현시켰다. 단백질 A 정제 후(도 9a), 1g의 단백질을 회수하였다. 슈퍼덱스 200 칼럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의한 추가의 정제 시(도 9b), 975㎎의 단백질을 회수하였다.
내독소 수준은 0.001 EU/㎎ 미만이었다. UPLC-SEC에 의해 평가된 순도는 99.81%이었다. 도 10a 및 도 10b는 정제된 v7192의 UPLC-SEC 크로마토그램을 보여준다. 도 10C는 최종 v7192 생성물의 비환원 SDS-PAGE를 보여준다.
간단히 말하면, 처음에 56℃에서 1시간 동안 10mM 다이티오트레이톨(DTT)을 사용하여 샘플을 환원시키고, 1시간 동안 실온에서 55mM 요오도아세트아마이드에 의해 알킬화하고, 이후 37℃에서 밤새 50mM 중탄산암모늄 중의 트립신에 의해 분해함으로써 항체의 글라이칸 분석을 수행하였다. 분해된 샘플을 Q-Tof Ultimate MS에서 나노LC-MS/MS에서 분석하였다. 단백질 서열을 확인하기 위해 NCBI 데이터베이스를 마스코트(Mascot)에 의해 조사하였다. 글라이코펩타이드 이온을 디콘볼루션하고, 상이한 글라이코 형태의 상대 풍부도를 정량화하기 위해 MaxEnt3(MassLynx)을 사용하였다.
LC-MS에 의해 예시적인 항체에서 유의적인 푸코실화가 검출되지 않았다(98% 초과의 탈푸코실화). 도 11은 LC-MS에 의한 예시적인 탈푸코실화 항체 v7192-탈푸코의 트립신 분해의 글라이칸 분석을 보여준다.
이 결과는 예시적인 OAA 항체가 탈푸코실화 항체로서 큰 규모로 제조될 수 있고, 표준 절차를 이용하여 매우 높은 순도로 정제될 수 있다는 것을 보여준다.
표 9는 예시적인 탈푸코실화 항체의 순도 및 수율을 요약한다.
Figure pct00039
실시예 10: ADC를 생성하기 위한 독성 약물 페이로드에 대한 예시적인 항체의 접합
예시적인 OA-CTX-탈푸코 v7192를 메르탄신(DM1)에 접합하여, 1단계 절차를 이용하여 항체-약물 접합체(ADC, v7104)를 형성하였다.
접합을 하기와 같이 수행하였다. 출발 단백질 샘플을 처음에 PD-10 칼럼을 사용하여 50mM 인산칼륨(pH 6.5), 50mM NaCl 및 2mM EDTA로 이루어진 완충제로 교환하고, 10㎎/㎖의 단백질 농도로 조정하였다. 다이메틸아세트아마이드(DMA) 중에 용해된 SMCC-DM1(사내 제조)의 10mM 용액을 이후 단백질 샘플의 7.5 몰 당량으로 첨가하였다. DMA를 10% v/v의 최종 농도로 추가로 첨가하고, 샘플을 간단히 혼합하였다. 반응 혼합물을 혼합하면서 밤새 25℃에서 항온처리하였다. 비접합 단백질 샘플의 함량에 의해 결정된 반응의 과정을 소수성 상호작용 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC)에 의해 모니터링하였다. 이를 토쇼(Tosoh) TSK 겔 부틸-NPR 칼럼(4.6㎜x3.5㎜x2.5㎜)을 사용하여 수행하였다. 25분 동안 10-90% 완충제 B의 구배, 이어서 4분 동안 100% 완충제 B를 사용하여 1㎖/분에서 용리를 수행하였다. 완충제 A는 20mM 인산나트륨, 1.5M 황산암모늄(pH 7.0)을 포함한다. 완충제 B는 20mM 인산나트륨, 25% v/v 아이소프로판올(pH 7.0)을 포함한다. SMCC-DM1을 비접합 단백질의 양이 5% 미만일 때 적은 증분으로 첨가하였다. 이후 생성물을 PD-10 칼럼을 사용하여 20mM 숙신산나트륨(pH 5.0)으로 이루어진 완충제로 교환하고, 단백질 농도 및 약물 대 항체 비율(DAR)을 252 및 280㎚의 흡광도에 기초하여 계산하였다. 완충제를 20mM 숙신산나트륨, 6% w/v 트레할로스 및 0.02% w/v 폴리소르베이트 20(pH 5.0)의 최종 조성물로 조정하였다. 고성능 액체 크로마토그래피-크기 배제 크로마토그래피(HPLC-SEC)를 수행하여 1㎖/분의 유속에서 100mM 인산나트륨, 300mM 염화나트륨(pH 7.0) 중에 토쇼 G3000-SWXL 칼럼(7.8㎜x30㎝)을 사용하여 ADC의 순도를 결정하였다.
234㎎의 예시적인 탈푸코실화 항체에서 접합을 수행하여, 98% 순도의 ADC 및 3.09의 DAR을 생성하였다. 3.63%의 비접합 항체 및 4.81%의 고분자량(HMW) 오염물질이 존재하였다. 회수율은 73%이고, 내독소 수준은 0.25 EU/㎎ 미만이였다. 도 12는 비접합 OA-CTX-탈푸코 v7192 및 접합 OA-CTX-탈푸코 v7104의 HIC-HPLC 크로마토그램의 오버레이를 보여준다. v7192의 지연된 용리 프로필은 SMCC-DM1에 대한 화학 접합의 결과로서 ADC의 소수화도의 증가에 기초하여 예상되었다. v7192 크로마토그램의 폭은 항체에서 접근 가능한 라이신 잔기의 난수(통상적으로 0-10)로 SMCC-DM1의 접합과 또한 일치하였다. 도 13은 예시적인 비접합 탈푸코실화 OA-CTX v7192 및 접합 탈푸코실화 OA-CTX v7104의 SEC-HPLC 크로마토그램을 보여준다. 크로마토그램의 밀접한 중첩은 항체의 전체 구조 통합성이 보유되고, 예시적인 OA-CTX-탈푸코가 임의의 원치 않는 HMW 오염물질을 형성하지 않으면서 표준 접합 절차에 수정 가능하다는 것을 보여준다.
이 결과는 예시적인 항체가 표준 대규모 접합 절차에 수정 가능한 것을 보여준다.
실시예 11: 상응하는 2가 항체보다 더 높은 B 최대 로 세포에 결합하는 예시적인 OA-EGFR
상이한 수준의 표적 항원 EGFR을 발현하는 인간 종양 세포에서 예시적인 OA-EGFR과 상응하는 2가 항체 사이의 결합의 수준을 비교하기 위해 전체 세포 결합 검정을 수행하였다(세포주에 대해 표 1 참조).
1차 항체의 항온처리가 2시간 동안이라는 변형으로, 실시예 4에 기재된 바대로 유세포 분석법을 수행하였다. 또한, AF488 항-인간 IgG(Fc 특이적) 항체(잭슨 이뮤노리서치스)를 검출을 위한 2차 항체로서 대신에 사용하였다.
시험된 모든 인간 종양 세포주에서, 예시적인 OA-CTX v4353은 시험된 세포주에 따라 상응하는 2가 항체보다 대략 1.38-1.68배 더 높은 B최대를 나타냈다. 부가적으로, OA-CTX + OA-Tras v1040의 조합에 대한 B최대는 홀로 개별 OAA의 각각보다 더 높고, 이의 개별 B최대의 합과 대략 일치한다.
도 14A, 도 14B 및 도 14C는 결장 HCT116, 유방 MDA-MB-231 및 난소 SKOV3 세포주에서 전체 세포 결합 실험의 결과를 보여준다.
FACS 결합 결과는 더 많은 항체 분자가 세포에 결합한다는 점에서 예시적인 OA-EGFR이 상응하는 2가 항체보다 더 높은 수준으로 인간 종양 세포에 결합할 수 있다는 것을 보여준다. 세포 결합의 수준은 동일한 결합 부위에 대해 경쟁하지 않는 항체의 조합을 사용함으로써 추가로 증가할 수 있다.
실시예 12: 인간 결장암 세포 Caco2에서 ADCC를 매개하는 예시적인 OAA의 능력
인간 결장암 세포주 Caco2인, 상이한 EGFR 발현 세포에서 ADCC를 매개하는 예시적인 항-EGFR OAA의 능력을 전장 2가 항-EGFR 항체와 비교하였다.
PBMC E:T 비율이 50:1이라는 점을 제외하고는, 실시예 6에 기재된 바대로 ADCC 검정을 수행하였다.
예시적인 항-EGFR OAA v4353 및 v1323 둘 다는 300nM 항체 농도에서 2가 얼비툭스(상표명)보다 약간 더 높은 표적 세포 용해(%)(즉, 더 높은 효율)를 나타냈다. 그러나, EC50에서 큰 차이가 있었고; 예시적인 v1323의 상당히 더 낮은 효력은 세포 표면 EGFR로부터 이의 비교적 높은 해리 상수와 일치한다. 그럼에도 불구하고, v1040(일 암 항-HER2 항체)과 v1323의 조합은 근포화 농도에서 상당히 더 높은 표적 세포 용해(%)를 발생시켰다. 도 15A 및 도 15B는 Caco2 세포에서 예시적인 OAA의 ADCC 용량 반응 곡선을 보여준다.
이 결과는 항-EGFR OAA가 2가 항-EGFR 항체와 비교하여 더 큰 ADCC 효율을 매개한다는 것을 입증한다. 상이한 에피토프에 결합하는 항체의 조합은 또한 더 높은 ADCC 효율을 발생시킨다. 이것은 표적 세포에 결합하는 항체의 수준의 증가와 일치한다. 그러나, 세포 결합과 ADCC 효율 사이의 상대 증가는 표적 세포의 관련 수용체 발현 수준에 따라 변하는 것으로 보인다.
실시예 13: 예시적인 OAA는 상응하는 2가 항체보다 더 높은 ADCC 효율을 나타낸다
항체의 탈푸코실화는 이팩터 기능을 증대시키는 것으로 공지되어 있다. 탈푸코실화의 결과로서 효율 및 효력의 변화를 평가하기 위해 MDA-MB-231(중/고 EGFR)에서 ADCC 검정에서 비탈푸코실화 대응물 v4353에 대해 예시적인 탈푸코실화 OA-CTX-탈푸코 v7192를 시험하였다.
NK92/CD16a(158V/V) 세포(진스크립트(Genscript)에 의해 생성)가 5:1의 E:T 비율로 이팩터 세포로서 사용된다는 점을 제외하고는, ADCC 검정을 실시예 6에 기재된 바대로 수행하였다. 결과가 도 16에 도시되어 있다.
예시적인 탈푸코실화 OAA v7192는 비탈푸코실화 대응물 v4353(62% 대 45% 표적 세포 용해)보다 더 높은 효율을 나타냈다. 탈푸코실화 항체는 상응하는 비탈푸코실화 OAA의 EC50보다 대략 16배 더 낮은 9pM의 EC50으로 또한 훨씬 더 강력하였다.
탈푸코실화 OAA v7192는 유사한 효력을 나타내지만 얼비툭스(상표명), (v7180)와 비교하여 약간 더 높은 표적 세포 용해(%)를 또한 나타냈다.
이 결과는 예시적인 OAA의 탈푸코실화가 이팩터 매개 기능, 예컨대 ADCC에서 효율 및 효력을 증대시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 14: 예시적인 OA - ADC는 인간 삼중 음성 유방암 세포주 MDA -MB-231의 성장을 저해한다
실험실내 성장 저해 검정을 이용하여 인간 삼중 음성 유방암 세포주 MDA-MB-231(중/고 EGFR, 저 HER2, KRAS G13D 돌연변이체)에서 예시적인 OA-CTX-탈푸코-ADC v7104의 효력 및 효율을 결정하였다.
간단히 말하면, 2,000개의 MDA-MB-231 세포를 96웰 플레이트로 시딩하고, 10% FBS가 보충된 RPMI에서 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 항온처리하였다. 이후, 30nM의 최종 농도(0.00457nM로 연속하여 3배 희석됨)로부터 시작하여 항체를 3회 첨가하였디. 세포를 5일 동안 추가로 항온처리하였다. 제조업자의 추천 프로토콜에 따라 설포로다민 B(시그마(Sigma)) 검정을 이용하여 세포 성장을 측정하였다. 비처리 대조군 세포는 실험의 과정에 걸쳐 대략 6배 성장하였다.
도 17의 결과는 예시적인 OA-CTX-탈푸코-ADC v7104가 음성 대조군 v6249(IgG-ADC)(10nM 이하에서 유의적인 성장 저해를 나타내지 않음)와 비교하여 유의적인 성장 저해(50% 이하)를 나타낸다는 것을 보여준다. 30nM에서, 비특이적 활성이 대조군에 대해 관찰되었지만, 예시적인 OA-CTX-탈푸코-ADC는 대략 67%의 더 높은 성장 저해 수준을 나타냈다. 더 높은 항체 농도를 시험하지 않았다. v7104의 EC50은 3-10nM인 것으로 예상되지만, v6249는 대략 30nM였다.
T-DM1(v6246, 사내 제조된 트라스투주맙 엠탄신)을 또 다른 대조군으로서 또한 시험하였지만, 이것은 음성 대조군 v6249와 동일한 용량 반응 프로필을 나타냈다. 이것은 MDA-MB-231에서의 매우 낮은 HER2 발현 상태를 고려하여 놀랍지 않았다.
이 결과는 예시적인 OA-CTX-탈푸코-ADC가 EGFR을 발현하는 인간 삼중 음성 유방암 세포주 MDA-MB-231에 대해 강력하고 효율적이라는 것을 입증한다. 결과는 표적 암 세포에 의해 내재화되는 항-EGFR OAA의 능력과 일치한다. 부가적으로, OA-CTX-탈푸코-ADC는 전통적인 항-EGFR 치료제, 예컨대 세툭시맙에 내성을 부여하는 것으로 공지된 KRAS G13D 돌연변이를 가지는 세포주에서 효율을 입증하였다.
실시예 15: 예시적인 OAA 성장은 감소한 효력으로 각질세포를 저해한다
피부 발진은 항-EGFR 항체를 포함하는 EGFR 저해제, 예컨대 세툭시맙에 의해 치료된 환자 중에서 흔히 관찰되는 부작용이다. 각질세포에 대한 EGFR 저해제의 직접 독성은 피부 발진을 발생시키는 기전 중 하나인 것으로 생각된다. HACAT 각질세포(EGFR 중간 발현물질)에서 성장 저해 검정을 이용하여 예시적인 항-EGFR OAA의 잠재적 피부 독성을 평가하였다.
실시예 5에 기재된 바대로 성장 저해 검정을 수행하였다. 간단히 말하면, 5,000 또는 10,000개의 HACAT 세포를 각각의 웰에 시딩하였다. 밤샘 항온처리 후, 세포를 항체에 의해 처리하고, 3일 또는 5일 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 셀티터 96(등록상표) 수성 비방사선 세포 증식 검정(AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay)(MTS) 키트(프로메가)를 사용하여 성장의 수준을 결정하였다. OA-CTX v4353 및 OA-CTX-탈푸코 v7192를 10% FBS의 존재 하에 시험하고, OA-EG2 v1323을 FBS의 부재 하에 시험하였다. 결과가 도 18A 및 도 18B에 도시되어 있다.
예시적인 항체 OA-CTX v4353은 시험된 항체의 가장 높은 농도(300nM)에서 얼비툭스(상표명)와 유사한 성장 저해 특성을 나타냈다. 그러나, OA-CTX는 더 낮은 항체 농도에서 훨씬 더 적은 세포 성장 저해로 입증되는 것처럼 얼비툭스(상표명)와 비교하여 훨씬 감소한 효력을 나타냈다. OA-CTX-탈푸코는 OA-CTX와 유사한 용량 반응을 나타냈다.
비교하면, OA-EG2는 시험된 농도에서 유의적인 성장 저해를 나타내지 않았다. 이것은 EGFR을 중화시키지 않는 항체인 EG2와 일치한다.
결과는 예시적인 OA-CTX 항체가 상응하는 2가 항체보다 피부 세포에 대해 더 낮은 독성을 가진다는 것을 나타낸다.
실시예 14: 상이한 EGFR 수준을 발현하는 인간 암 세포에서의 예시적인 OAA의 ADCC 활성
2가 대응물에 비해 1가 항-EGFR OAA의 더 우수한 ADCC 활성을 입증하기 위해 상이한 수준의 EGFR을 발현하는 부가의 인간 암 세포주를 추가로 시험하였다.
2차 항체로서 알렉사 플루오르 488-접합 어피니퓨어(AffiniPure) Fab 단편 염소 항-인간 IgG(H+L)를 사용하여 실시예 11에 기재된 바대로 암 세포주에서 (300nM에서) EGFR 발현 및 항체 결합의 상대 수준을 수행하였다.
실시예 6에 기재된 바대로 ADCC 검정을 수행하였다. A431 및 A549 세포 ADCC는 NK92/FcγR3a(158V/V) 세포를 사용하지만, HCT116 세포는 IL2에 의해 밤새 미리 자극된 PMBC를 사용하였다.
Figure pct00040
3개의 부가의 인간 암 세포주의 상대 EGFR 발현을 결정하였다. 상기 표에 기재된 바대로, 높은, 중간 및 낮은 EGFR 발현 세포주를 시험하였다. 이 정량적 용어는 A431의 문헌 보고된 EGFR 수준에 기초하여 배정되고, 세포마다 수백만 개의 수용체 분자의 순서이고, 높은 수준의 수용체 발현으로 고려된다.
높은 EGFR을 발현하는 A431 유표피 암 세포에서, 예시적인 v7192와 대조군 v7180 사이의 ADCC 효력(0.09nM 대 0.07nM의 EC50) 및 효율(53% 대 51%)은 매우 유사하였다.
중간 EGFR을 발현하는 A549 폐암 세포에서, v7192는 v7180과 유사한 효력(0.13nM 대 0.052nM의 EC50), 그러나 ADCC 효율의 1.9배 증대(68% 대 35%)를 나타냈다.
유사하게, 낮은 EGFR을 발현하는 HCT116 결장암 세포에서, 1가 v7192와 2가 v7180 사이의 효력은 유사하지만(EC50 8pM 대 4pM), OAA는 효율의 1.4배 증대를 부여한다.
이 결과는 OAA가 상이한 EGFR을 발현하는 암 세포에서 상응하는 2가 항체와 동일하거나 더 우수한 효율을 매개한다는 것을 보여준다. 구체적으로, 1가 항체는 높은 EGFR 발현 세포에서 2가 대응물과 유사한 것으로 예상되지만, 어떠한 유의적인 효력 소실 없이 더 낮은 EGFR 발현 세포에서 효율을 유의적으로 증대시키는 것으로 예상된다.
실시예에서 사용된 시약은 일반적으로 상업적으로 구입 가능하거나, 당해 분야에 공지된 상업적으로 구입 가능한 기기, 방법 또는 시약을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 실시예는 본 발명의 다양한 양상 및 본 발명의 방법의 실행을 예시한다. 실시예는 본 발명의 많은 상이한 실시형태의 배타적인 설명을 제공하도록 의도되지 않는다. 따라서, 상기 발명이 이해의 명확성의 목적을 위해 약간 자세히 예시 및 예로 기재되어 있지만, 당해 분야의 당업자는 첨부된 청구범위의 정신 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 많은 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 참조문헌으로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로, 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> ZYMEWORKS INC. <120> MONOVALENT ANTIGEN BINDING CONSTRUCTS TARGETING EGFR AND/OR HER2 AND USES THEREOF <130> 30712-27951/PCT <140> PCT/US2014/065546 <141> 2014-11-13 <150> 61/903,825 <151> 2013-11-13 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His 1 5 10 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> 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gccgctcctt ctgtcttcat ctttccccct 360 agtgacgaac agctgaaaag cggcacagcc tccgtggtct gtctgctgaa taacttttac 420 ccaagagagg caaaggtgca gtggaaagtc gataatgccc tgcagtcagg gaacagccag 480 gagtccgtga ctgaacagga ctctaaggat agtacctatt cactgagctc cactctgacc 540 ctgtccaaag ctgattacga gaagcacaaa gtgtatgcat gcgaagtcac ccatcagggg 600 ctgtctagtc ccgtgacaaa gagctttaac cggggagagt gt 642 <210> 59 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gaacctaaaa gcagcgacaa gacccacaca tgcccccctt gtccagctcc agaactgctg 60 ggaggacca 69 <210> 60 <211> 306 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 agcgtgttcc tgtttccacc caagcccaaa gatacactga tgatcagccg aactcccgag 60 gtcacctgcg tggtcgtgga cgtgtcccac gaggaccccg aagtcaagtt caactggtac 120 gtggacggcg tcgaagtgca taatgcaaag actaaaccac gggaggaaca gtacaactct 180 acatatagag tcgtgagtgt cctgactgtg ctgcatcagg attggctgaa cggcaaagag 240 tataagtgca aagtgtctaa taaggccctg cctgctccaa tcgagaaaac tattagtaag 300 gcaaaa 306 <210> 61 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 gggcagccca gggaacctca ggtctacgtg ctgcctccaa gtcgcgacga gctgaccaag 60 aaccaggtct cactgctgtg tctggtgaaa ggattctatc cttccgatat tgccgtggag 120 tgggaatcta atggccagcc agagaacaat tacctgacct ggccccctgt gctggacagc 180 gatgggtcct tctttctgta ttcaaagctg acagtggaca aaagcagatg gcagcaggga 240 aacgtcttta gctgttccgt gatgcacgaa gccctgcaca atcattacac ccagaagtct 300 ctgagtctgt cacctggcaa a 321 <210> 62 <211> 696 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 gaacctaaaa gcagcgacaa gacccacaca tgcccccctt gtccagctcc agaactgctg 60 ggaggaccaa gcgtgttcct gtttccaccc aagcccaaag atacactgat gatcagccga 120 actcccgagg tcacctgcgt ggtcgtggac gtgtcccacg aggaccccga agtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt cgaagtgcat aatgcaaaga ctaaaccacg ggaggaacag 240 tacaactcta catatagagt cgtgagtgtc ctgactgtgc tgcatcagga ttggctgaac 300 ggcaaagagt ataagtgcaa agtgtctaat aaggccctgc ctgctccaat cgagaaaact 360 attagtaagg caaaagggca gcccagggaa cctcaggtct acgtgctgcc tccaagtcgc 420 gacgagctga ccaagaacca ggtctcactg ctgtgtctgg tgaaaggatt ctatccttcc 480 gatattgccg 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agaactgctg 60 ggaggaccaa gcgtgttcct gtttccaccc aagcccaaag atacactgat gatcagccga 120 actcccgagg tcacctgcgt ggtcgtggac gtgtcccacg aggaccccga agtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt cgaagtgcat aatgcaaaga ctaaaccacg ggaggaacag 240 tacaactcta catatagagt cgtgagtgtc ctgactgtgc tgcatcagga ttggctgaac 300 ggcaaagagt ataagtgcaa agtgtctaat aaggccctgc ctgctccaat cgagaaaact 360 attagtaagg caaaagggca gcccagggaa cctcaggtct acgtgctgcc tccaagtcgc 420 gacgagctga ccaagaacca ggtctcactg ctgtgtctgg tgaaaggatt ctatccttcc 480 gatattgccg tggagtggga atctaatggc cagccagaga acaattacct gacctggccc 540 cctgtgctgg acagcgatgg gtccttcttt ctgtattcaa agctgacagt ggacaaaagc 600 agatggcagc agggaaacgt ctttagctgt tccgtgatgc acgaagccct gcacaatcat 660 tacacccaga agtctctgag tctgtcacct ggcaaa 696 <210> 65 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 gatattcaga tgacccagtc ccctagctcc ctgtccgctt ctgtgggcga cagggtcact 60 atcacctgcc gcgcatctca ggatgtgaac accgcagtcg cctggtacca gcagaagcct 120 gggaaagctc caaagctgct gatctacagt gcatcattcc 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tccgtgatgc acgaagccct gcacaatcat 660 tacacccaga agtctctgag tctgtcacct ggcaaa 696 <210> 68 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 gatattcaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagtgcct cagtgggcga ccgagtcacc 60 atcacatgca aggcttccca ggatgtgtct attggagtcg catggtacca gcagaagcca 120 ggcaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctacc ggtataccgg cgtgccctct 180 agattctctg gcagtgggtc aggaacagac tttactctga ccatctctag tctgcagcct 240 gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag tactatatct acccatatac ctttggccag 300 gggacaaaag tggagatcaa gaggactgtg gccgctccct ccgtcttcat ttttccccct 360 tctgacgaac agctgaaaag tggcacagcc agcgtggtct gtctgctgaa caatttctac 420 cctcgcgaag ccaaagtgca gtggaaggtc gataacgctc tgcagagcgg caacagccag 480 gagtctgtga ctgaacagga cagtaaagat tcaacctata gcctgtcaag cacactgact 540 ctgagcaagg cagactacga gaagcacaaa gtgtatgcct gcgaagtcac acatcagggg 600 ctgtcctctc ctgtgactaa gagctttaac agaggagagt gt 642 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 1 5 10 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 1 5

Claims (112)

  1. 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 종양을, 링커와 함께 또는 링커 없이, 이종이합체 Fc에 커플링된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 항원 결합 폴리펩타이드는 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하고, 상기 작제물은 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 B최대로 EGFR에 결합하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Fc는 EU 넘버링에 따라 사슬 A에서 돌연변이 T350V_L351Y_F405A_Y407V, 및 EU 넘버링에 따라 사슬 B에서 돌연변이 T350V_T366L_K392L_T394W를 가지는 이종이합체 인간 IgG1 Fc이고, 상기 항원 결합 폴리펩타이드는 EGFR의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합하고, 상기 대상체는, EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 의해 치료된 대상체와 비교하여 상기 치료로부터 피부 독성을 덜 경험하고, 상기 종양은 A431, A549, BT474, CACO2, HCT116, JIMT1, MDA-MB-231, SKOV3, MCF7 또는 SKBR3의 세포주 중 하나 또는 하나 초과의 세포 표면 EGFR의 제2 수준과 동일하거나 이보다 낮은 세포 표면 EGFR의 제1 수준을 발현하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 OA-CTX(v4353) 또는 OA-EG2(v1323)인, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc는 이종이합체 IgG1 Fc이고, 상기 Fc는 적어도 2개의 CH3 서열을 포함하고, 상기 Fc는, 링커와 함께 또는 링커 없이, 상기 항원 결합 폴리펩타이드에 커플링된, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc는 EU 넘버링에 따라 사슬 A에서 돌연변이 T350V_L351Y_F405A_Y407V, 및 EU 넘버링에 따라 사슬 B에서 돌연변이 T350V_T366L_K392L_T394W를 가지는 인간 이종이합체 IgG1인, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3은 표 B에 기재된 상응하는 서열인, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 EGFR의 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은 제35항 내지 제73항 중 어느 한 항의 작제물인, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1가 EGFR 결합 작제물은 탈푸코실화(afucosylated)된, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1가 EGFR 결합 작제물은 약물에 접합되고, 임의로 상기 약물은 메이탄시노이드(maytansinoid) 또는 DM1인, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 효율이 증가하고 부작용이 감소한 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물에 의한 상기 대상체의 치료를 위한 시간 기간은 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 의한 치료를 위한 시간 기간보다 긴, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 표피 세포 유래 암, 폐암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 유관 유방 관암, 위암, 난소암, HER2+ 암, 교모세포종, 자궁경부암, 신장암, 자궁암 또는 결장암인, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 상기 종양에서 EGFR에 대한 EGF의 결합을 차단하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 상기 종양에서 구성적 EGFR 신호전달을 차단하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양과 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 ADCC를 발생시키는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양과 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 내재화(internalization)를 발생시키는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 A431, A549, BT474, CACO2, HCT116, JIMT1, MDA-MB-231, SKOV3, MCF7 또는 SKBR3의 세포주 중 하나 또는 하나 초과의 세포 표면 EGFR의 제2 수준과 동일하거나 이보다 낮은 세포 표면 EGFR의 제1 수준을 발현하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양의 샘플은 면역조직화학(immunohistochemistry: IHC) 염색을 이용하여 평가할 때, 3+ 이하, 2+ 이하 또는 1+ 이하의 EGFR의 평균 수준을 발현하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 세포마다 3.5x106 이하, 2.8x106 이하, 1.2x106 이하, 2.4x105 이하, 2.6x105 이하, 또는 4.2x104 이하의 EGFR의 평균을 발현하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 상기 종양의 수축, 상기 종양의 성장의 저해, 상기 종양의 진행에 대한 시간의 증가, 상기 대상체의 무질환 생존기간의 연장, 전이의 감소, 상기 대상체의 무진행 생존기간의 증가 또는 대상체의 집단의 전체 생존기간의 증가를 발생시키는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 작제물의 고정된 용량이 투여되고, EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물의 고정된 용량으로 치료된 대상체와 비교하여 상기 치료로부터 피부 독성을 덜 경험하고, 상기 고정된 용량은 몰 기준으로 결정되는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 각질세포의 성장은, EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물의 고정된 용량으로 치료된 대상체와 비교하여 상기 작제물의 고정된 용량에 의한 치료 후 덜 감소하고, 상기 고정된 용량은 몰 기준으로 결정되는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 트라스투주맙 및/또는 페르투주맙 및/또는 세툭시맙에 내성 또는 불응성인, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 추가 물질을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 추가 물질은 HER2에 결합하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 추가 물질은 페르투자맙 또는 트라스투자맙인, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 1가 EGFR 결합 작제물 및 상기 추가 물질은 동시에 제공되는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 1가 EGFR 결합 작제물 및 상기 추가 물질은 별개로 제공되는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 물질은 제2의 단리된 항원 결합 작제물인, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제2의 단리된 항원 결합 작제물은 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 결합하거나 특이적으로 결합하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 제2의 단리된 항원 결합 작제물은 HER2의 ECD2 및/또는 ECD4에 결합하거나 특이적으로 결합하는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 상기 종양의 수축, 상기 종양의 성장의 저해, 상기 종양의 진행에 대한 시간의 증가, 상기 대상체의 무질환 생존기간의 연장 또는 상기 대상체의 생존의 증가를 발생시키는, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 제2의 단리된 항원 결합 작제물은, 상기 제2의 단리된 항원 결합 작제물의 항원 결합 폴리펩타이드가 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 결합하거나 특이적으로 결합한다는 것을 제외하고는, 제35항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단리된 1가 EGFR 결합 작제물과 동일한, EGFR 발현 종양을 가지는 대상체를 치료하는 방법.
  35. 단리된 1가 항원 결합 작제물로서,
    중쇄 가변 도메인을 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 폴리펩타이드로서, 상기 항원 결합 폴리펩타이드는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하거나 특이적으로 결합하는, 항원 결합 폴리펩타이드; 및
    이종이합체 Fc로서, 상기 Fc는 적어도 2개의 CH3 서열을 포함하고, 상기 Fc는, 링커와 함께 또는 링커 없이, 상기 항원 결합 폴리펩타이드에 커플링된, 이종이합체 Fc를 포함하되;
    상기 1가 항원 결합 작제물은, EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 더 큰 B최대로 EGFR에 선택적으로 결합하고/하거나, 특이적으로 결합하고;
    상기 이합체화된 CH3 서열은 약 68℃ 이상의 융점(Tm)을 가지는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 OA-CTX(v4353) 또는 OA-EG2(v1323)인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 1:1의 작제물 대 표적 비율에서 상기 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 대한 B최대의 증가는 포화 농도까지 상기 작제물의 관찰된 평행 상수(Kd)보다 큰 농도에서 관찰된, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 1가 항원 결합 작제물은 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 비해 EGFR에 대해 더 낮은 친화도를 가지는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 1가 항원 결합 작제물은 EGFR의 세포외 도메인 1, 2, 3 또는 4에 위치한 에피토프 또는 EGFR의 세포외 도메인에 결합하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 폴리펩타이드는 경쇄 가변 도메인, 경쇄 CL1 도메인 및/또는 중쇄 CH1 도메인을 추가로 포함하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 상기 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  42. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 CL1 도메인의 아미노산 서열은 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 경쇄 CL1 도메인의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 상기 중쇄 CH1 도메인의 아미노산 서열은 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄 CH1 도메인의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 폴리펩타이드는 Fab 단편, scFv, sdAb, 항원 결합 펩타이드, 또는 상기 항원에 결합할 수 있는 단백질 도메인인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  44. 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 폴리펩타이드는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 중쇄 폴리펩타이드는 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 중쇄의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 폴리펩타이드는 표 B에 기재된 EGFR 특이적 항원 결합 폴리펩타이드 경쇄의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  46. 제35항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR에 대해 1.16E-8M 내지 8.51E-10M 이하의 결합 친화도(KD)를 가지는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  47. 제35항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR에 결합될 때, 대조군에 비해 A431 세포 성장을 저해하고/하거나, 대조군에 비해 BT-474 세포의 ADCC 매개 표적 세포 용해(%)를 증가시키고/시키거나, EGFR의 내재화를 발생시키고/시키거나, EGFR의 하향조절을 발생시키는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  48. 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은 상기 세포에서 EGFR에 결합 시 세포로 내재화된, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  49. 제35항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc는 링커에 의해 상기 항원 결합 폴리펩타이드에 융합된, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 링커는 폴리펩타이드 링커인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  51. 제49항에 있어서, 상기 링커는 IgG1 힌지 구역을 포함하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  52. 제35항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR은 EGFR 아이소폼 A 또는 EGFRvIII인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  53. 제35항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은 적어도 하나의 약물에 접합된, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 약물은 메이탄시노이드인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 메이탄시노이드는 DM1인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 메이탄시노이드는 SMCC 링커를 통해 상기 작제물에 접합된, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  57. 제35항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물 또는 상기 항원 결합 폴리펩타이드는 중화된 것인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  58. 제35항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물 또는 상기 항원 결합 폴리펩타이드는 비중화된 것인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  59. 제35항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc는 인간 Fc인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 인간 Fc는 인간 IgG1 Fc인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  61. 제35항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이합체화된 CH3 서열은 약 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77.5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 또는 85℃ 이상의 융점(Tm)을 가지는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  62. 제35항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc는 발현될 때 약 75% 초과, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 순도로 형성된 이종이합체인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 Fc는 단일 세포를 통해 발현될 때 약 75% 초과, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 순도로 형성된 이종이합체인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  64. 제35항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이합체 Fc는 상기 CH3 서열 중 적어도 하나에서 하나 이상의 변형을 포함하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  65. 제35항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이합체 Fc 도메인은 야생형 동종이합체 Fc에 필적하는 안정성으로 이종이합체의 형성을 촉진하는 상기 CH3 서열 중 적어도 하나에서 하나 이상의 변형을 포함하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  66. 제35항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이합체 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따라 사슬 A에서 돌연변이 T350V_L351Y_F405A_Y407V, 및 EU 넘버링에 따라 사슬 B에서 돌연변이 T350V_T366L_K392L_T394W를 가지는 이종이합체 IgG1 Fc인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  67. 제35항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이합체 Fc는 적어도 하나의 CH2 도메인을 추가로 포함하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 이종이합체 Fc의 CH2 도메인(들)은 하나 이상의 변형을 포함하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  69. 제35항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이합체 Fc는 Fc-감마 수용체의 선택적 결합을 촉진하는 하나 이상의 변형을 포함하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  70. EGFR에 대한 결합에 대해 제35항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 단리된 1가 항원 결합 작제물과 경쟁하는 제2의 단리된 1가 항원 결합 작제물로서, 임의로 상기 제2의 단리된 1가 항원 결합 작제물은 50% 초과, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%로 제35항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 단리된 1가 항원 결합 작제물을 대체하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  71. 제35항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은, 상기 세포가 상기 작제물에 의해 접촉될 때,
    d. EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물과 비교하여 BT474 세포, HCT116 세포, MDA-MB-234 세포 또는 SKOV3 세포 중 하나 이상에서, FACS에 의해 결정된, 더 높은 세포 표면(B최대),
    e. EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 의해 매개된 것과 비교하여 BT-474 세포의 항체 의존적 세포내 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity: ADCC)의 증가의 매개, 또는
    f. JIMT1 세포의 내재화
    중 하나 이상을 특징으로 하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  72. 제35항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은 탈푸코실화되고, 상기 작제물은 EGFR에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상응하는 단리된 단일특이적 2가 항원 결합 작제물에 의해 매개된 것에 비해 A549 세포의 ADCC의 1.9배 증가 및/또는 HCT116 세포의 ADCC의 1.4배 증가를 매개하는, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  73. 제35항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 작제물은 적어도 하나의 변형을 포함하고, 상기 변형은 탈푸코실화인, 단리된 1가 항원 결합 작제물.
  74. 제35항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단리된 1가 항원 결합 작제물을 코딩하는, 적어도 하나의 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  75. 제74항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드는 cDNA인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  76. 상기 폴리뉴클레오타이드 청구항 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 벡터 또는 일련의 벡터.
  77. 제76항에 있어서, 플라스미드, 바이러스 벡터, 비에피솜 포유동물 벡터, 발현 벡터 및 재조합 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된, 벡터 또는 일련의 벡터.
  78. 상기 폴리뉴클레오타이드 청구항 중 어느 하나 또는 상기 벡터 청구항 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 일련의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단리된 세포.
  79. 제78항에 있어서, 하이브리도마, 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포 또는 HEK293 세포인, 단리된 세포.
  80. 제35항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단리된 1가 항원 결합 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 완충제, 항산화제, 저분자량 분자, 약물, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 지질, 킬레이트화제, 안정화제 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 제2의 단리된 항원 결합 작제물을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  83. 제82항에 있어서, 상기 제2 작제물은 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
  84. 제8282항에 있어서, 상기 제2 작제물은 HER2의 세포외 도메인 (ECD)2 및/또는 ECD4에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
  85. 제82항에 있어서, 상기 제2 작제물은, 상기 항원 결합 폴리펩타이드가 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다는 점을 제외하고는, 제35항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단리된 1가 항원 결합 작제물과 동일한, 약제학적 조성물.
  86. 약제에서 사용하기 위한 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물.
  87. 암성 병증을 치료하는 데 사용하기 위한, 제80항 내지 제86항 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물.
  88. 제87항에 있어서, 상기 암성 병증은 EGFR 발현 암, 상피 세포 유래 암, 유방암, HER2 발현 암, 폐암, 삼중 음성 유방암, 유관 유방 관암, 위암, 난소암, 두경부암, 교모세포종, 자궁경부암, 신장암, 자궁암, 췌장암 또는 결장암인, 약제학적 조성물.
  89. 제35항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 단리된 1가 항원 결합 작제물을 얻는 방법으로서, (a) 숙주 세포 배양물을 얻는 단계로서, 상기 숙주 세포는 상기 항원 결합 작제물을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 상기 숙주 세포 배양물을 얻는 단계; (b) 상기 단리된 1가 항원 결합 작제물을 발현하기에 충분한 조건 하에 상기 숙주 세포 배양물을 배양하는 단계; 및 (c) 상기 숙주 세포 배양물로부터 상기 항원 결합 작제물을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  90. 대상체에서 EGFR 및/또는 HER 신호전달과 연관된 암 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 제80항 내지 제88항 중 어느 한 항 또는 제35항 내지 제73항 어느 한 항의 약제학적 조성물의 유효량을 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 암은 EGFR 발현 암, 상피 세포 유래 암, 유방암, HER2 발현 암, 폐암, 삼중 음성 유방암, 유관 유방 관암, 위암, 난소암, 교모세포종, 자궁경부암, 신장암, 자궁암 또는 결장암인 방법.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 방법은 추가 물질 이외에 상기 단리된 1가 작제물을 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 단리된 1가 작제물은 상기 추가 물질과 동시에 제공되는, 방법.
  94. 제92항에 있어서, 상기 단리된 1가 작제물은 상기 추가 물질과 별도로 제공되는, 방법.
  95. 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 물질은 제2의 명확한 단리된 항원 결합 작제물인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 제2 작제물은 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는, 방법.
  97. 제95항에 있어서, 상기 제2 작제물은 HER2의 ECD2 및/또는 ECD4에 특이적으로 결합하는, 방법.
  98. 제95항에 있어서, 상기 제2 작제물은, 상기 항원 결합 폴리펩타이드가 HER2 또는 HER2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다는 점을 제외하고는, 제1항의 단리된 1가 항원 결합 작제물과 동일한, 방법.
  99. 제90항에 있어서, 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 상기 종양에서 EGFR에 대한 EGF의 결합을 차단하는, 방법.
  100. 제90항에 있어서, 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 상기 종양에서 구성적 EGFR 신호전달을 차단하는, 방법.
  101. 제90항에 있어서, 상기 종양과 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 ADCC를 발생시키는, 방법.
  102. 제90항에 있어서, 상기 종양과 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 내재화를 발생시키는, 방법.
  103. 종양의 성장을 저해하거나, 종양을 수축시키거나, 종양을 가지는 대상체의 생존을 증가시키는 방법으로서, 상기 종양을 제80항 내지 제88항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제35항 내지 제73항 중 어느 한 항의 작제물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 종양은 상피 세포 유래 종양 또는 HER2+ 종양인 방법.
  105. 제103항에 있어서, 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 상기 종양에서 EGFR에 대한 EGF의 결합을 차단하는, 방법.
  106. 제103항에 있어서, 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물은 상기 종양에서 구성적 EGFR 신호전달을 차단하는, 방법.
  107. 제103항에 있어서, 상기 종양과 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 ADCC를 발생시키는, 방법.
  108. 제103항에 있어서, 상기 종양과 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 접촉은 상기 단리된 1가 EGFR 결합 작제물의 내재화를 발생시키는, 방법.
  109. 세포에서 EGFR 및/또는 HER 신호전달을 저해하거나, 감소시키거나, 차단하는 방법으로서, 상기 세포를 제80항 내지 제88항 중 어느 한 항의 조성물에 따른 작제물 또는 제35항 내지 제73항 중 어느 한 항의 작제물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 세포는 EGFR 발현 암 세포, 유방암 세포, 상피 세포 유래 종양 세포, HER2+ 종양 세포, 폐암 세포, 삼중 음성 유방암 세포, 유관 유방암 세포, 위암 세포, 및 두경부암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 교모세포종 세포, 자궁경부암 세포, 신장암 세포, 자궁암 세포 또는 결장암 세포인 방법.
  111. 제35항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단리된 항원 결합 작제물 및 사용 설명서를 포함하는 키트로서, 임의로 제2의 단리된 항원 결합 작제물을 추가로 포함하는, 키트.
  112. 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 제35항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항원 결합 작제물로서, 임의로 상기 질환은 암인, 단리된 항원 결합 작제물.
KR1020167015484A 2013-11-13 2014-11-13 Egfr 및/또는 her2를 표적화하는 1가 항원 결합 작제물 및 이의 용도 KR20160083949A (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190099333A (ko) * 2017-01-06 2019-08-26 모멘타 파머슈티컬스 인코포레이티드 유전자 조작 Fc 작제물에 관한 조성물 및 방법

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9499634B2 (en) 2012-06-25 2016-11-22 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
CN106699890B (zh) * 2016-10-31 2021-05-07 上海大学 基于金纳米粒子的靶向表皮生长因子受体egfr的人工抗体及其制备方法
EP3601368A4 (en) * 2017-03-31 2021-03-31 Zymeworks Inc. TUMOR ANTIGEN PRESENTATION-INDUCING CONSTRUCTS AND USES THEREFORE
CN107325184A (zh) * 2017-08-08 2017-11-07 安徽大学 一种靶向egfr和her2的双特异性抗体及其应用
CN111936516B (zh) 2018-03-19 2023-03-03 上海药明生物技术有限公司 新型抗egfr抗体多肽
CA3134363A1 (en) * 2019-03-22 2020-10-01 Olivia Newton-John Cancer Research Institute Anti-her2 binding molecules
CN112111012B (zh) * 2019-06-20 2023-07-04 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
BR112022022036A2 (pt) * 2020-04-30 2022-12-13 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd Construtos de ligação ao antígeno que têm como alvo her2 e usos dos mesmos
WO2023242372A1 (en) * 2022-06-15 2023-12-21 argenx BV Fcrn/hsa binding molecules and methods of use

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
SK281142B6 (sk) 1991-03-06 2000-12-11 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschr�Nkter Haftung Humanizovaná monoklonálna protilátka, expresné vektory a farmaceutický prostriedok
IL101943A0 (en) 1991-05-24 1992-12-30 Genentech Inc Structure,production and use of heregulin
EP0861893A3 (en) 1991-09-19 1999-11-10 Genentech, Inc. High level expression of immunoglobulin polypeptides
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2289549A3 (en) 1999-10-01 2011-06-15 Immunogen, Inc. Immunoconjugates for treating cancer
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
AR030612A1 (es) 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
CA2467242A1 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
US20050180972A1 (en) 2002-07-31 2005-08-18 Wahl Alan F. Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
US6913748B2 (en) 2002-08-16 2005-07-05 Immunogen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
WO2004032961A1 (en) 2002-10-10 2004-04-22 Merck Patent Gmbh Bispecific anti-erb-b antibodies and their use in tumor therapy
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
KR101200133B1 (ko) 2004-06-01 2012-11-13 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
KR20070038557A (ko) 2004-07-22 2007-04-10 제넨테크, 인크. Ｈｅｒ２ 항체 조성물
US20060074225A1 (en) 2004-09-14 2006-04-06 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin Fc domains
RU2488597C2 (ru) 2005-02-07 2013-07-27 Гликарт Биотехнологи Аг Антигенсвязывающие молекулы, которые связывают egfr, кодирующие их векторы и их применение
CA2602663A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
NZ565511A (en) 2005-07-22 2011-03-31 Five Prime Therapeutics Inc Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins
AR056142A1 (es) * 2005-10-21 2007-09-19 Amgen Inc Metodos para generar el anticuerpo igg monovalente
US20090214541A1 (en) 2006-01-04 2009-08-27 L'instut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Combination Therapy Using Anti-EGFR and Anti-HER2 Antibodies
CA2588106A1 (en) * 2007-05-18 2008-11-18 Nrc - Institute For Biological Sciences Single-domain antibodies and heavy chain antibody against egfr and uses thereof
CL2008003561A1 (es) * 2007-11-30 2010-02-05 Glaxo Group Ltd Construccion de union a il - 13 que comprende a lo menos un dominio simple (dab) de anticuerpo injertado en un anticuerpo monoclonal ( mabdab); polinucleotido y celula huesped; procedimiento para preparar la construccion; composicion farmaceutica que la comprende y uso para tratar cancer o enfermedades inflamatorias.
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
DK2437790T3 (da) 2009-06-03 2019-05-20 Immunogen Inc Konjugeringsfremgangsmåder
WO2011028952A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
JP2013511281A (ja) 2009-11-23 2013-04-04 アムジェン インコーポレイテッド 単量体抗体Ｆｃ
EA201890907A1 (ru) 2009-11-30 2020-04-30 Янссен Байотек, Инк. МУТИРОВАННЫЕ Fc АНТИТЕЛА С УСТРАНЕННЫМИ ЭФФЕКТОРНЫМИ ФУНКЦИЯМИ
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
EP2552957A4 (en) 2010-03-29 2013-11-20 Zymeworks Inc ANTIBODIES HAVING ENHANCED OR DELETED EFFECTIVE FUNCTION
CN103429620B (zh) * 2010-11-05 2018-03-06 酵活有限公司 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计
BR112013021526B1 (pt) 2011-02-25 2021-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polipeptídio variante, métodos para manter ou diminuir as atividades de ligação a fcgriia (tipo r) e fcgriia (tipo h) e aumentar a atividade de ligação a fcgriib de um polipeptídio e para a supressão da produção de um anticorpo contra um polipeptídio compreendendo a região fc do anticorpo, métodos para a produção do referido polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas e aumentada e para a produção suprimida de um anticorpo, composição farmacêutica e uso de um polipeptídio
MX354359B (es) 2011-03-29 2018-02-28 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
US9890218B2 (en) 2011-06-30 2018-02-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
WO2013026837A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP2748197A2 (en) 2011-08-26 2014-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
PT2773671T (pt) * 2011-11-04 2021-12-14 Zymeworks Inc Geração de anticorpo heterodimérico estável com mutações no domínio fc
EP2794010A4 (en) 2011-11-21 2015-10-21 Immunogen Inc METHOD OF TREATING TUMORS RESISTANT TO EGFR THERAPIES BY A CYTOTOXIC EGFR-AGENT ANTIBODY CONJUGATE
EP2847224A4 (en) * 2012-05-10 2016-04-27 Zymeworks Inc SINGLE ARM MONOVALENT ANTIBODY CONSTRUCTS AND USES THEREOF
AU2013258834B2 (en) 2012-05-10 2017-09-07 Zymeworks Bc Inc. Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the Fc domain
KR20150036606A (ko) * 2012-07-13 2015-04-07 자임워크스 인코포레이티드 항-cd3 구조체를 포함하는 이중특이적 비대칭 이형이합체
WO2014084607A1 (ko) * 2012-11-27 2014-06-05 아주대학교산학협력단 항체 중쇄불변부위의 이종이중체 고효율 형성을 유도하는 ch3 도메인 변이체 쌍, 이의 제조방법, 및 용도

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190099333A (ko) * 2017-01-06 2019-08-26 모멘타 파머슈티컬스 인코포레이티드 유전자 조작 Fc 작제물에 관한 조성물 및 방법

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