JP7245793B2 - 安定化したキメラＦａｂ - Google Patents

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Description

コンパクトディスクで提出される「配列表」、表、またはコンピュータープログラミングリスト付録への参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されており、参照によりその全体として本明細書によって組み入れられる配列表を含有する。２０１８年６月２７日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、２０１８－０６－２７（０９７９９３－１０９２２８０（００１６１０ＷＯ））Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名前を付されており、サイズが４５バイトである。
背景
抗体は、研究ツールとして、診断法として、及び当然治療法としてを含めた、多くの適用において用途を見い出し、そのすべては大量の抗体の製造を要する。熱安定性などの抗体の物理的特性は、抗体の製造可能性に影響を及ぼし得る。例えば、低い熱安定性を有する抗体、または凝集するものは、製造する及び保管するのが困難である。
天然に存在する抗体、及び人工的に作出されているもの（例えば、ファージディスプレイまたは組み換え操作によって）は、ある域の熱安定性を呈し、人工的に作出された抗体は、それらを製造するのを困難にする熱安定性のレベルを有することが多い（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ｍＡｂｓ：６：１２７４－１２８２）。さらに、合成Ｆａｂライブラリーから同定された抗体において、ラムダ軽鎖由来の可変ドメインを含有する抗体の平均融解温度は、カッパ軽鎖由来の可変ドメインを含有する抗体のものよりも低かったことが示唆されている（Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍａｂｓ ５：３，４４５－４７０）。
いくつかの目的のために、キメラ軽鎖を含むキメラＦａｂが構築され得る。例えば、ファージディスプレイにより作出されたｓｃＦｖのＦａｂ形式への変換があるとキメラＦａｂが作出されて、天然に存在する形式の抗体を獲得し得る。加えて、ヒトにおいてマウス抗体の免疫原性を低下させるために、マウス－ヒトキメラ抗体が構築され得る。キメラＦａｂは、可変ラムダドメイン及び定常カッパドメイン（Ｖラムダ－Ｃカッパ）または可変カッパドメイン及び定常ラムダドメイン（Ｖカッパ－Ｃラムダ）を含み得る。キメラ軽鎖を有するキメラＦａｂは、親ラムダ軽鎖を含むＦａｂと比べて、熱安定性の減少を呈することが多い。
ゆえに、キメラＦａｂの熱安定性ならびにラムダ軽鎖を有する抗体のそれを増加させて、それらの製造可能性を向上させる必要がある。
簡単な概要
本開示は、安定化したキメラＦａｂを提供する。１つの態様において、重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）配列及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む第一の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド構築物（Ｈ１）と、カッパ軽鎖定常ドメイン（Ｃカッパ）配列及びラムダ軽鎖可変ドメイン（Ｖラムダ）配列を含む第一のキメラ免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド構築物（Ｌ１）とを含む、安定化したキメラＦａｂまたはキメラヘテロ二量体が提供され、当該Ｖラムダ配列は、安定化アミノ酸置換を有しない対応する野生型キメラヘテロ二量体と比較して、キメラヘテロ二量体の熱安定性を増加させる１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含み、Ｈ１及びＬ１は、第一のエピトープに結合する第一のＦａｂ領域を形成する。
別の態様において、第一のヘテロ二量体であって、当該第一のヘテロ二量体は、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂまたはキメラヘテロ二量体である第一のヘテロ二量体、及び足場を含む抗体構築物が提供され、当該第一のヘテロ二量体のＨ１及びＬ１の少なくとも一方は、リンカーの有りまたは無しで足場に連結されている。
別の態様において、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂもしくはキメラヘテロ二量体、または抗体構築物、及び薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物が提供される。
別の態様において、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂもしくはキメラヘテロ二量体、または抗体構築物をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットが提供される。
別の態様において、本明細書において記載されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットのうちの１つまたは複数を含むベクターまたはベクターのセットが提供される。
別の態様において、本明細書において記載されるポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドのセット、ベクター、またはベクターのセットを含む単離された細胞が提供される。
別の態様において、キメラヘテロ二量体または抗体構築物をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含む宿主細胞を獲得するステップ；当該宿主細胞を、当該キメラヘテロ二量体または抗体構築物の発現を可能にする条件下での宿主細胞培養において培養するステップ；及び当該宿主細胞培養から当該キメラヘテロ二量体または抗体構築物を回収するステップを含む、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂもしくはキメラヘテロ二量体または抗体構築物を調製する方法が提供される。
別の態様において、カッパ軽鎖定常ドメイン（Ｃカッパ）配列及びラムダ軽鎖可変ドメイン（Ｖラムダ）配列を含むキメラ軽鎖ポリペプチド構築物が提供され、当該Ｖラムダ配列は、キメラ軽鎖を含むキメラヘテロ二量体の熱安定性を増加させる１つまたは複数の安定化アミノ酸置換を含む。
別の態様において、本明細書において記載されるキメラ軽鎖ポリペプチド構築物、及び薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物が提供される。
別の態様において、本明細書において記載されるキメラ軽鎖ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドが提供される。
別の態様において、ラムダ免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖を含む抗体の熱安定性を増加させる方法が提供され、当該方法は、抗体のＶラムダ配列、及びカッパ軽鎖を有する抗体由来のＣカッパ配列を含むＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖を調製することであって、当該Ｖラムダ配列は１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む調製すること、ならびに免疫グロブリン重鎖とともに当該Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖を発現させて、増加した熱安定性を有する抗体を獲得することを含む。
別の態様において、本明細書において記載されるキメラヘテロ二量体または抗体構築物の有効量を対象または患者に投与することを含む、対象におけるがん、自己免疫疾患、炎症性障害、または感染性疾患を治療する方法が提供される。
別の態様において、対象におけるがん、自己免疫疾患、炎症性障害、または感染性疾患の治療における、本明細書において記載されるキメラヘテロ二量体または抗体構築物の有効量の使用が提供される。１ つの実施形態において、がん、自己免疫疾患、炎症性障害、または感染性疾患の治療のための医薬の調製における、本明細書において記載されるキメラヘテロ二量体または抗体構築物の使用が提供される。別の実施形態において、対象におけるがん、自己免疫疾患、炎症性障害、または感染性疾患の治療における使用のための、本明細書において記載されるキメラヘテロ二量体または抗体構築物が提供される。
［態様１］ ａ）重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）配列及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、第一の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド構築物（Ｈ１）と、
ｂ）カッパ軽鎖定常ドメイン（Ｃカッパ）配列及びラムダ軽鎖可変ドメイン（Ｖラムダ）配列を含む、第一のキメラ免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド構築物（Ｌ１）
とを含むキメラヘテロ二量体であって、
前記Ｖラムダ配列は、安定化アミノ酸改変を有しない対応する野生型キメラヘテロ二量体と比較して、前記キメラヘテロ二量体の熱安定性を増加させる１つまたは複数の前記安定化アミノ酸改変を含み、
Ｈ１及びＬ１は、第一のエピトープに結合する第一のＦａｂ領域を形成する、前記キメラヘテロ二量体。
［態様２］ 前記Ｖラムダ配列は、前記Ｃカッパ配列及び前記Ｖラムダ配列間の接合部分における１つまたは複数のアミノ酸に１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む、態様１に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様３］ 前記Ｖラムダ配列は、残基８０、８３、１０５、及び１０６のうちの１つまたは複数から選択される箇所に１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含み、アミノ酸残基の番号付けはＫａｂａｔに従う、態様２に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様４］ 残基８３は疎水性アミノ酸で置換されている、態様３に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様５］ 前記疎水性アミノ酸はＦ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、またはＡである、態様４に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様６］ 残基８３は極性非荷電アミノ酸で置換されている、態様３に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様７］ 前記極性非荷電アミノ酸はＳ、Ｔ、Ｈ、Ｎ、またはＱである、態様６に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様８］ 残基８３はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｈ、またはＱで置換されている、態様３に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様９］ 残基８３はＡで置換されている、態様８に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様１０］ 残基１０５は負荷電アミノ酸で置換されている、態様３に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様１１］ 前記負荷電アミノ酸はＤまたはＥである、態様１０に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様１２］ 残基１０５は極性非荷電アミノ酸で置換されている、態様３に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様１３］ 前記極性非荷電アミノ酸はＮまたはＱである、態様１２に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様１４］ 残基１０５はＥ、Ｄ、Ｎ、またはＱで置換されており、かつ残基１０６はＩ、Ｌ、またはＭで置換されている、態様３に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様１５］ 前記Ｖラムダ配列は、残基８５に１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含み、残基の番号付けはＫａｂａｔに従う、態様１に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様１６］ 残基８５は極性非荷電アミノ酸で置換されている、態様１５に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様１７］ 前記極性非荷電アミノ酸はＳ、Ｈ、またはＱである、態様１６に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様１８］ 残基８５は疎水性アミノ酸で置換されている、態様１５に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様１９］ 前記疎水性アミノ酸はＶまたはＡである、態様１８に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様２０］ 残基８５はＴ、Ｖ、Ｎ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｈ、またはＱで置換されている、態様１５に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様２１］ 前記Ｖラムダ配列は、残基８３、８５、１０５、及び１０６から選択される箇所に安定化アミノ酸改変の組み合わせを含む、態様１～２０のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様２２］ 残基８０は極性非荷電アミノ酸で置換されている、態様３に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様２３］ 前記極性非荷電アミノ酸はＳ、Ｎ、またはＱである、態様２２に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様２４］ 残基８０は疎水性アミノ酸で置換されている、態様３に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様２５］ 前記疎水性アミノ酸はＡ、Ｐ、またはＶである、態様２４に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様２６］ 残基８０はＡ、Ｐ、Ｖ、Ｓ、Ｎ、またはＱで置換されている、態様３に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様２７］ 前記Ｖラムダ配列は、残基８３及び８５に；残基８３及び１０６に；残基１０５及び１０６に；残基１０５及び１０６Ａに；残基８３及び１０５に；残基８５及び１０５に；残基８５及び１０６に；残基８３、８５、及び１０５に；残基８３、１０５、及び１０６Ａに；残基８３、８５、及び１０６に；残基８３、１０５、及び１０６に；残基８５、１０５、及び１０６に；残基８０、８３、８５、及び１０５に；残基８０、８３、８５、及び１０５に；残基８０、８５、１０５、及び１０６に；残基８０、８３、１０５、及び１０６に；残基８０、８３、８５、１０５、１０６に；残基８３、８５、１０５、及び１０６に；残基８０、８３、１０５、及び１０６Ａに；残基８３、１０５、１０６、及び１０６Ａに；残基８０、８３、８５、１０５、及び１０６Ａに；残基８０、８３、１０５、１０６、及び１０６Ａに；残基８３、８５、１０５、１０６、及び１０６Ａに；または残基８０、８３、８５、１０５、１０６、及び１０６Ａに安定化アミノ酸改変を含む、態様２１～２６のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様２８］ 前記安定化アミノ酸置換は、８３Ｆ及び８５Ｔ；８３Ｖ及び８５Ｔ；８３Ｉ及び８５Ｔ；８３Ａ及び８５Ｔ；８３Ｆ及び１０５Ｅ；８３Ｖ及び１０５Ｅ；８３Ｉ及び１０５Ｅ；８３Ａ及び１０５Ｅ；８３Ｆ及び１０６Ｉ；８３Ｖ及び１０６Ｉ；８３Ｉ及び１０６Ｉ；８３Ａ及び１０６Ｉ；８３Ｆ、８５Ｔもしくは８５Ｖ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉ；８３Ｖ、８５Ｔもしくは８５Ｖ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉ；８３Ｉ、８５Ｔもしくは８５Ｖ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉ；８３Ａ、８５Ｔもしくは８５Ｖ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉ；８３Ｆ、１０５Ｅ、及び１０６ＡＫ；８３Ｆ、１０５Ｅ、１０６Ｉ、及び１０６ＡＫ；８０Ａ、８３Ｆ、１０５Ｅ、及び１０６ＡＫ；８０Ａ、８３Ｆ、１０５Ｅ、１０６Ｉ、及び１０６ＡＫ；８０Ａ、８３Ｆ、８５Ｔ、１０５Ｅ、及び１０６ＡＫ；８０Ａ、８３Ｆ、８５Ｔ、１０５Ｅ、１０６Ｉ、及び１０６ＡＫ；または８０Ｐ、８３Ｆ、８５Ｔ、１０５Ｅ、１０６Ｉ、及び１０６ＡＫである、態様２７に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様２９］ Ｈ１及びＬ１はヒトまたはヒト化配列である、態様１～２８のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様３０］ 前記キメラヘテロ二量体は薬物に抱合されている、態様１～２９のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体。
［態様３１］ ａ）第一のヘテロ二量体であって、前記第一のヘテロ二量体は、態様１～２９のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体である、前記第一のヘテロ二量体、及び
ｂ）足場
を含む抗体構築物であって、前記第一のヘテロ二量体のＨ１及びＬ１の少なくとも一方は、リンカーの有りまたは無しで前記足場に連結されている、前記抗体構築物。
［態様３２］ 第二のヘテロ二量体をさらに含み、前記第二のヘテロ二量体は、
ｉ）重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）配列及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、第二の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド構築物（Ｈ２）と、
ｉｉ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）配列及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む、第二の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド構築物（Ｌ２）
とを含み、Ｈ２及びＬ２は、第二のエピトープに結合する第二のＦａｂ領域を形成し、かつＨ２及びＬ２の少なくとも一方は、リンカーの有りまたは無しで前記足場に連結されている、態様３１に記載の抗体構築物。
［態様３３］ 前記第二のヘテロ二量体は、態様１～２９のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体である、態様３２に記載の抗体構築物。
［態様３４］ 前記第一のエピトープ及び前記第二のエピトープは同じである、態様３１～３３のいずれか１項に記載の抗体構築物。
［態様３５］ 前記第一のエピトープ及び前記第二のエピトープは互いに異なる、態様３１～３３のいずれか１項に記載の抗体構築物。
［態様３６］ 前記第一及び／または第二のヘテロ二量体は、軽鎖対合を促進する１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、態様３１～３５のいずれか１項に記載の抗体構築物。
［態様３７］ 前記足場は、第一の重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）配列及び第二のＣＨ３配列を含むＦｃ領域である、態様３１～３６のいずれか１項に記載の抗体構築物。
［態様３８］ 前記第一のＣＨ３配列及び前記第二のＣＨ３配列はそれぞれ、ホモ二量体ＣＨ３ドメインと比較して、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインの形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、態様３７に記載の抗体構築物。
［態様３９］ 前記Ｆｃ領域は、第一の定常ドメイン２（ＣＨ２）配列及び第二のＣＨ２配列をさらに含む、態様３７または３８に記載の抗体構築物。
［態様４０］ 前記Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＡ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ Ｆｃ、ヒトＩｇＤ Ｆｃ、ヒトＩｇＥ Ｆｃ、ヒトＩｇＭ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃである、態様３７～３９のいずれか１項に記載の抗体構築物。
［態様４１］ 前記リンカーは１つまたは複数のポリペプチドリンカーである、態様３１～４０のいずれか１項に記載の構築物。
［態様４２］ 前記リンカーは１つまたは複数の抗体ヒンジ領域を含む、態様４１に記載の構築物。
［態様４３］ 前記リンカーは１つまたは複数のＩｇＧ１ヒンジ領域を含む、態様４２に記載の構築物。
［態様４４］ 前記抗体構築物は薬物に抱合されている、態様３１～４３のいずれか１項に記載の抗体構築物。
［態様４５］ 態様１～３０のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体、または態様３１～４４のいずれか１項に記載の抗体構築物、及び薬学的に許容されるキャリアを含む、薬学的組成物。
［態様４６］ 態様１～２９のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体、または態様３１～４４のいずれか１項に記載の抗体構築物をコードする、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
［態様４７］ 態様４６に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットのうちの１つまたは複数を含む、ベクターまたはベクターのセット。
［態様４８］ 前記ベクターまたは前記ベクターのセットの少なくとも１つのベクターは多シストロン性である、態様４７に記載のベクターまたはベクターのセット。
［態様４９］ 態様４６に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、または態様４７もしくは４８に記載のベクターもしくはベクターのセットを含む、単離された細胞。
［態様５０］ 前記細胞は、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である、態様４９に記載の単離された細胞。
［態様５１］ 前記細胞には、態様４６に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、または態様４７もしくは４８に記載のベクターもしくはベクターのセットが、安定にトランスフェクトされているまたは一過性にトランスフェクトされている、態様５０に記載の単離された細胞。
［態様５２］ （ａ）前記キメラヘテロ二量体または抗体構築物をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含む宿主細胞を獲得するステップ；
（ｂ）前記宿主細胞を、前記キメラヘテロ二量体または抗体構築物の発現を可能にする条件下での宿主細胞培養において培養するステップ；及び
（ｃ）前記宿主細胞培養から前記キメラヘテロ二量体または抗体構築物を回収するステップ
を含む、態様１～３０のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体、または態様３１～４４のいずれか１項に記載の抗体構築物を調製する方法。
［態様５３］ 前記宿主細胞には、前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットが一過性にトランスフェクトされているまたは安定にトランスフェクトされている、態様５２に記載の方法。
［態様５４］ カッパ軽鎖定常ドメイン（Ｃカッパ）配列及びラムダ軽鎖可変ドメイン（Ｖラムダ）配列を含むキメラ軽鎖ポリペプチド構築物であって、前記Ｖラムダ配列は、前記キメラ軽鎖を含むキメラヘテロ二量体の熱安定性を増加させる１つまたは複数の安定化アミノ酸置換を含む、前記キメラ軽鎖ポリペプチド構築物。
［態様５５］ 態様５４に記載のキメラ軽鎖ポリペプチド構築物、及び薬学的に許容されるキャリアを含む、薬学的組成物。
［態様５６］ 態様５４に記載のキメラ軽鎖ポリペプチド構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
［態様５７］ ラムダ免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖を含む抗体の熱安定性を増加させる方法であって、前記方法は、
ａ）前記抗体のＶラムダ配列、及びカッパ軽鎖を有する抗体由来のＣカッパ配列を含むＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖を調製することであって、前記Ｖラムダ配列は１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む、前記調製すること、ならびに
ｂ）前記免疫グロブリン重鎖とともに前記Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖を発現させて、増加した熱安定性を有する抗体を獲得すること
を含む、前記方法。
［態様５８］ 態様１～３０のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体、または態様３１～４４のいずれか１項に記載の抗体構築物の有効量を投与することを含む、対象におけるがん、自己免疫疾患、炎症性障害、または感染性疾患を治療する方法。
［態様５９］ 対象におけるがん、自己免疫疾患、炎症性障害、または感染性疾患の治療における、態様１～３０のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体、または態様３１～４４のいずれか１項に記載の抗体構築物の有効量の使用。
［態様６０］ がん、自己免疫疾患、炎症性障害、または感染性疾患の治療のための医薬の調製における、態様１～３０のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体、または態様３１～４４のいずれか１項に記載の抗体構築物の使用。
［態様６１］ 対象におけるがん、自己免疫疾患、炎症性障害、または感染性疾患の治療における使用のための、態様１～３０のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体、または態様３１～４４のいずれか１項に記載の抗体構築物。
Ｖラムダ－ＣカッパキメラＦａｂの概略的表示、及びＶラムダ－ＣカッパキメラＦａｂの熱安定性を向上させるために取られた操作手法を描写している。野生型重鎖Ｆａｂ配列（ＶＨ及びＣＨ１ドメイン、灰色の塗りつぶし）及び野生型ラムダ軽鎖（白の塗りつぶし）を有する、ＷＴ（野生型）ラムダＦａｂ（親ラムダＦａｂとも呼ばれる）が示されている。この親ラムダＦａｂは、親ラムダ軽鎖のＣラムダ配列をＣカッパ配列と入れ替えてＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物を形成することによって、親キメラＦａｂ（Ｖラムダ－ＣカッパキメラＦａｂ）に操作され得る。ゆえに、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物は、Ｃカッパ配列（細かく刻まされた塗りつぶし）に融合した親ラムダＦａｂ由来のＶラムダ配列（白の塗りつぶし）を含む。親キメラＦａｂの熱安定性は、Ｖラムダ配列に変異を導入して、可変カッパ及び定常カッパドメイン（Ｖカッパ－Ｃカッパ）間で観察される接合部分を模倣し、Ｖラムダ－Ｃカッパ接合部分の適合性の向上をもたらすことによって増加し得る。この安定化したキメラＦａｂは、図１に「設計されたＶラムダ－ＣカッパキメラＦａｂ」として描写されており、星の記号は安定化アミノ酸改変（安定性最適化設計とも呼ばれる）を表す。親キメラＦａｂは、本明細書において「野生型キメラヘテロ二量体」とも呼ばれる。 抗体ＣＡＴ－２２００に対する、例示的なＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物の配列を示している。ＣＡＴ－２２００（ＰＤＢエントリー２ＶＸＳ、Ｌ鎖）に相当するＷＴラムダ軽鎖配列を、ＣＡＴ－２２００抗体に基づくＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物とアラインして、２つの構築物間の差異を強調している。Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物は、残基Ｌ１０６Ａで終結するＣＡＴ－２２００のラムダ可変ドメイン配列と、箇所Ｒ１０８から開始する、ＩＧＫＣ＊０１に相当するカッパ定常ドメイン配列とから構成される。ＥＭＢＬ－ＥＢＩウェブサイトで参照されるように、星印（＊）は、単一の保存された残基を有する箇所を示し；コロン（：）は、強く類似した特性の基の間での保存を示し；ピリオド（．）は、弱く類似した特性の基の間での保存を示し；及び、コンセンサス記号がないことは、非常に異なる残基を示す。 図３Ａ～３Ｄは、軽鎖における可変ドメイン－定常ドメイン接合部分のリボン図を描写している。図３Ａは、Ｆａｂの概略的表示を描写している。枠で囲まれたエリアに相当する領域が、図３Ｂ～３Ｄにおいて拡大されている。図３Ｂは、Ｖカッパ－Ｃカッパ接合部分（Ｄ３Ｈ４４抗体、ＰＤＢ：１ｊｐｔ）におけるホットスポット残基８３、８５、及び１０５を強調している。図３Ｃは、Ｖラムダ－Ｃラムダ接合部分（ＣＡＴ－２２００抗体、ＰＤＢ：２ｖｘｓ）を描写しており、また残基８３、８５、及び１０５を強調している。図３Ｄは、最適化されていないＶラムダ－Ｃカッパ接合部分（抗体Ｓ４、ＰＤＢ：３ｎｐｓ）を描写しており、再度残基８３、８５、及び１０５を強調している。 Ｍａｂ形式に当てはめた、図１におけるものに類似の略図を描いており、ＷＴラムダＭａｂ、Ｖラムダ－ＣカッパキメラＭａｂ、及び設計されたＶラムダ－ＣカッパキメラＭａｂ（安定化したＭａｂとも呼ばれる）を描写しており、星の記号は安定性最適化設計の存在を示す。 ＣＡＴ－２２００システムにおける、選択された設計されたキメラＦａｂ（ＣＡＴ－２２００抗体重鎖の可変領域は、ＶＨ３生殖系列サブグループに属し、プロテインＡに結合し得る能力を有する）、Ｍａｂ、及びそれぞれの野生型形式に対するプロテインＡ力価の比較を提供している。３つの独立した５０ｍｌトランスフェクションからの平均プロテインＡ力価（ｍｇ／Ｌ）がプロットされている。 図６Ａ～６Ｂは、種々の親キメラＦａｂに基づく、８３Ｘ設計テーマ内の及びテーマにわたる安定化アミノ酸改変の効果を描写しており、Ｘ＝Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ａである。図６Ａは、ＣＡＴ－２２００ラムダ抗体に基づく安定化したキメラＦａｂの熱安定性を示しており；及び図６Ｂは、Ｈ３ラムダ抗体に基づく安定化したキメラＦａｂの熱安定性を示している。それぞれの親キメラＦａｂのものと比較した、安定化したキメラＦａｂのＴｍ（ＤＳＦによって測定される）の変化が、テーマ設計の番号に対してプロットされている。 種々のＦａｂシステムにわたる熱安定性の増加の程度を描写している。３つの試験システムＨ３、ＣＡＴ－２２００、及びＥＰ６ｂ＿Ｂ０１における、それぞれの親キメラＦａｂのものと比較した、設計されたキメラＦａｂのＴｍ（ＤＳＣによって測定される）の変化が、７つの選択された設計（すべてのテーマを網羅する）に対してプロットされている。 ＦａｂからＭａｂ形式への、安定性の増加の移転可能性を実証している。それぞれのキメラＦａｂまたはＭａｂのものと比較した、７つの選択された設計されたキメラＦａｂ及びＭａｂのＴｍ（ＤＳＣによって測定される）の変化が、２つの試験システムＨ３及びＣＡＴ－２２００に関してプロットされている。 図９Ａ～９Ｂは、Ｈ３抗体システムにおける２つの設計（設計１８及び３９）のサブセットに関する、設計されたキメラＦａｂ（図９Ａ）及びＭａｂ（図９Ｂ）の典型的なＤＳＣプロファイルを描写している。それぞれの野生型ならびにキメラＦａｂ及びＭａｂに関するＤＳＣプロファイルが参照のために含まれている。 図１０Ａ～１０Ｆは、卓上安定性調査の種々の時点における、Ｈ３システムに基づく設計されたキメラＭａｂの典型的な単分散ＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルを描写している。この調査は、ＰＢＳバッファーｐＨ７．４中３７℃及び５ｍｇ／ｍｌの濃度で行われた。図１０Ａ、１０Ｃ、及び１０Ｅは、それぞれ０、２０、及び３０日目における、野生型ラムダＭａｂに関するＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルを示している。図１０Ｂ、１０Ｄ、及び１０Ｆは、それぞれ０、２０、及び３０日目における、設計３７に相当する安定化アミノ酸改変を有する安定化したＭａｂに関するＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルを示している。 ２つの異なる軽鎖を２つの異なる重鎖とともに細胞において共発現させる場合に予想され得る、潜在的な重鎖関連産物を描写している。優先的対合は、ＳＭＣＡ（モノクローナル抗体競合アッセイ）を用いて査定される。 親Ｆａｂ１（カッパＦａｂ）及び親Ｆａｂ２（設計されたＶラムダ－ＣカッパキメラＦａｂ）から構成される例示的な設計された二特異性キメラ抗体の概略的表示を描写しており、星の記号は安定性最適化設計を示し、長方形の記号は軽鎖対合設計または重鎖対合設計を示す。
詳細な説明
キメラＦａｂとは、キメラ軽鎖を含むＦａｂである。本開示の文脈において、キメラＦａｂは、ラムダ軽鎖由来の軽鎖可変ドメイン配列（Ｖラムダ配列）及びカッパ軽鎖由来の軽鎖定常ドメイン配列（Ｃカッパ配列）を有するキメラ軽鎖構築物を含み得る。そのようなキメラ軽鎖は、本明細書においてＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖（Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖）と呼ばれる。多くの場合、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖を有するキメラＦａｂは、野生型ラムダ軽鎖を含む親Ｆａｂと比較して、熱安定性の減少を呈し得る。さらに、ラムダ軽鎖を有する多くの抗体は、カッパ軽鎖を有する抗体と比較して減少する熱安定性を呈する。熱安定性の減少は、治療用抗体開発に要される必要な分量のかつ必要な品質を有する、そのようなキメラＦａｂを含有する抗体を製造することの困難につながり得る。
改変されたＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含む安定化したキメラＦａｂが本明細書において提供される。改変されたＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物は、キメラＦａｂの熱安定性を増加させる１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含むＶラムダ配列を含む。一部の実施形態において、安定化アミノ酸改変は、Ｖラムダ及びＣカッパドメイン間の接合部分における１つまたは複数のアミノ酸残基にある。一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、野生型ラムダ軽鎖を有する対応する野生型Ｆａｂ（野生型ラムダＦａｂ）のものよりもさらに大きい熱安定性を呈し得る。安定化アミノ酸改変は、種々の抗体系にわたって移転可能であり、安定化したキメラＦａｂが抗原に結合し得る能力にほとんどまたは全く影響を有しない。安定化アミノ酸改変を有するＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物が、Ｍａｂ形式の抗体の背景において存在する場合、当該安定化アミノ酸改変は、当該抗体がＦｃガンマ受容体またはＦｃＲｎに結合し得る能力に影響を及ぼさない。
安定化したキメラＦａｂは、治療用ポリペプチドとして有用である、またはそれを用いて、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖が存在する、Ｍａｂ形式もしくは他の抗体形式を含めた他の形式の抗体構築物を調製し得る。安定化したキメラＦａｂは、一般的に、ラムダ軽鎖を有する抗体の安定性を増加させるのにも有用であり得る。この背景において、親ラムダ抗体は、熱安定性を増加させる安定化アミノ酸改変を含むＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物を用いて調製され得る。
定義
別様に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての技術的及び科学的な用語は、請求される主題が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において用語に対する複数の定義が存在する事象において、本節におけるものが優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスへの参照がなされる場合、そのような識別子は変化し得、インターネット上の特定の情報が行き来し得るが、インターネットを検索することによって同等の情報が見い出され得ることが理解される。それへの参照は、そのような情報の入手可能性及び公的な普及の証明となる。
前述の全般的な説明及び以下の詳細な説明は、単なる例示的及び説明的なものであり、請求されるいかなる主題をも制限するものではないことが理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は、別様に具体的に記述されていない限り、複数形を含む。
本説明において、任意の濃度域、パーセンテージ域、比率域、または整数域は、別様に示されていない限り、列挙された値域内の任意の整数の値、及び適当な場合には、その一部（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むと理解されるべきである。本明細書において使用するとき、「約」とは、別様に示されていない限り、示された値域、値、配列、または構造の±１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％を意味する。本明細書において用いられる「ａ」及び「ａｎ」という用語は、その文脈によって別様に示されていないまたは述べられていない限り、挙げられた構成要素の「１つまたは複数」を指すことが理解されるべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢の１つ、両方、またはその任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書において使用するとき、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同義的に用いられる。加えて、本明細書において記載される構造及び置換基の様々な組み合わせに由来する個々の一本鎖ポリペプチドまたは免疫グロブリン構築物は、あたかも各一本鎖ポリペプチドまたは安定化したキメラＦａｂが個々に明記されているのと同程度に、本出願によって開示される。ゆえに、個々の一本鎖ポリペプチドまたは安定化したキメラＦａｂを形成する特定の構成要素の選択は、本開示の範囲内にある。
本明細書において用いられる節の見出しは、単なる体系化目的のためのものであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、マニュアル、及び論文を含むがそれらに限定されない、本出願において引用されるすべての文書または文書の一部は、任意の目的のために参照によりそれらの全体として本明細書によって明示的に組み入れられる。
本明細書において記載される方法及び組成物は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコール、細胞株、構築物、及び試薬に限定されるわけではなく、そのため変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において用いられる術語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される、本明細書において記載される方法及び組成物の範囲を限定することを意図されるわけではないことも理解されるべきである。
本明細書において言及されるすべての刊行物及び特許は、例えば、本明細書において記載される方法、組成物、及び化合物と関連して用いられ得る、刊行物に記載される構築物及び方法論を記載する及び開示する目的のために、参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられる。本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。先行発明が理由でまたは他の任意の理由のために、本明細書において記載される本発明者らがそのような開示に先行する権利を与えられないという承認として解釈されるべきものは本明細書において何もない。
本出願において、アミノ酸名及び原子名（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｃ等）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）によって定義されるとおりに用いられ、それは、ＩＵＰＡＣ命名法（ＩＵＰＡＣ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ ｆｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ｒｅｓｉｄｕｅ ｎａｍｅｓ，ａｔｏｍ ｎａｍｅｓ ｅｔｃ．），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８，９－３７（１９８４）、それとともにＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５２，１（１９８５）におけるそれらの訂正に基づく。「アミノ酸残基」という用語は、２０種の天然に存在するアミノ酸、すなわちアラニン（ＡｌａまたはＡ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、及びチロシン（ＴｙｒまたはＹ）残基からなる群に含有されるアミノ酸残基を示すことを主として意図される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換可能に用いられる。つまり、ポリペプチドに向けられる説明は、ペプチドの説明及びタンパク質の説明に同等に適用され、逆もまた同様である。当該用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基が非天然コードアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書において使用するとき、当該用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、全長タンパク質を含めた任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、連続した一続きの２つまたはそれを上回る数のヌクレオチド分子を示すことを意図される。ヌクレオチド配列は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ＲＮＡ起源、半合成もしくは合成起源、またはその任意の組み合わせのものであり得る。
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は本明細書において互換可能に用いられ、すべてのそのような用語は、細胞の成長または培養により生じる子孫を含むと理解されるべきである。「形質転換」及び「トランスフェクション」は、細胞内に核酸配列を導入する工程を指すために互換可能に用いられる。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在する及び天然に存在しないアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然コードアミノ酸とは、２０種の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）、ならびにピロリシン及びセレノシステインである。アミノ酸類似体とは、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなど、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合している炭素を有する化合物を指す。そのような類似体は、改変されたＲ基（ノルロイシンなど）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸への言及には、例えば、天然に存在するタンパク質生成Ｌ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変種及び誘導体など、化学的に改変されたアミノ酸；アラニン、オルニチンなど、天然に存在する非タンパク質生成アミノ酸；ならびに、アミノ酸に特徴的である当技術分野において公知の特性を有する化学的に合成された化合物が含まれる。天然に存在しないアミノ酸の例には、Ｎ－メチルアミノ酸（例えば、メチルアラニン）、Ｄ－アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２－アミノ－ヒスチジン、ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖に追加のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び側鎖におけるカルボン酸官能基がスルホン酸基で置き換えられているアミノ酸（例えば、システイン酸）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂのタンパク質内への合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸、または１つもしくは複数のＤ－アミノ酸を含めた非天然アミノ酸の組み入れは、いくつかの異なるやり方で有利であり得る。Ｄ－アミノ酸含有ペプチド等は、Ｌ－アミノ酸含有対応物と比較して、インビトロまたはインビボにおいて増加した安定性を呈する。ゆえに、Ｄ－アミノ酸を組み入れるペプチド等の構築は、より大きな細胞内安定性が望まれるまたは要される場合、特に有用であり得る。より具体的には、Ｄ－ペプチド等は内因性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに抵抗性であり、それにより、分子の生体利用性の向上及びインビボにおける寿命の延長を、そうした特性が望ましい場合に提供する。加えて、Ｄ－ペプチド等は、Ｔヘルパー細胞への主要組織適合性複合体クラスＩＩ制限提示のために効率的にプロセシングされ得ず、それゆえ、生物全体における液性免疫応答を誘導する可能性が低い。
アミノ酸は、本明細書において、それらの一般によく知られる３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字記号のいずれかによって言及される。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に認められた１文字表記によって言及され得る。
「保存的に改変された変種」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に改変された変種」とは、同一のもしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重が理由で、多数の機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。ゆえに、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる箇所において、当該コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載される対応するコドンのいずれかに変更され得る。そのような核酸変動は、保存的に改変された変動の１種である「サイレント変動」である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる考え得るサイレント変動も記載する。当業者であれば、核酸における各コドン（通常ではメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常ではトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を産出し得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変動は、記載される各配列において黙示的である。
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コード配列における単一のアミノ酸またはわずかなパーセンテージのアミノ酸を変更する、付加する、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、変更がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす「保存的に改変された変種」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当業者に公知である。そのような保存的に改変された変種は、本発明の多型変種、種間ホモログ、及びアレルに付加的なものであり、それらを除外するわけではない。
機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当業者に公知である。以下の８つの群それぞれは、互いに対する保存的置換として見なされ得るアミノ酸を含有する。
１．アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２．アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３．アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４．アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５．イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６．フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；及び
７．セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）；
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９３年１２月）を参照されたい）。
２つまたはそれを上回る数の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、同じである２つまたはそれを上回る数の配列または部分配列を指す。配列は、比較ウィンドウにわたる最大の合致に対して、または以下の配列比較アルゴリズム（または、当業者にとって使用可能な他のアルゴリズム）の１つを用いてもしくは手作業でのアライメント及び目視点検によって測定される指定の領域に対して比較される及びアラインされる場合に、それらが、あるパーセンテージの同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、指定される領域にわたって少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有する場合、「実質的に同一」または「実質的に同様」である。この定義は、試験配列の相補体も指す。同一性は、長さが少なくとも約５０個のアミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、または長さが７５～１００個のアミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、または指定されない場合には、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの配列全体にわたって存在し得る。ヒト以外の種由来のホモログを含めた、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂのポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを有する標識プローブとのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングするステップ、ならびに当該ポリヌクレオチド配列を含有する全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するステップを含む工程によって獲得され得る。そのようなハイブリダイゼーション技法は、当業者に周知である。
配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するのに適切であるアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ（商標）及びＢＬＡＳＴ（商標）２．０アルゴリズムであり、それらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２，１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ（商標）分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公的に使用可能である（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにてインターネットを参照されたい）。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターＭ（一致している残基のペアに対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列に関しては、スコア行列を用いて累積スコアを算出する。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大の到達値から分量Ｘ分下落する場合；１つもしくは複数のマイナスに採点される残基アライメントの累積に起因して、累積スコアがゼロになるもしくはそれを下回る場合；または、いずれかの配列の末端に達した場合、中断される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）に対するアルゴリズムパラメーターの例は、１１というワード長（Ｗ）、１０という期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較である。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムに対するアルゴリズムパラメーターの例は、３というワード長、１０という期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５，１９８９を参照されたい）。
ポリペプチドの誘導体または変種は、当該誘導体または変種のアミノ酸配列が、元のペプチド由来の長さが１００アミノ酸である配列にわたって少なくとも５０％の同一性を有する場合、当該ペプチドと「相同性」を共有するまたは「相同」であると言われる。ある特定の実施形態において、誘導体または変種は、当該誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドのフラグメントのいずれかのものと少なくとも７５％同じである。ある特定の実施形態において、誘導体または変種は、当該誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドのフラグメントのいずれかのものと少なくとも８５％同じである。ある特定の実施形態において、誘導体のアミノ酸配列は、当該誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドのフラグメントと少なくとも９０％同じである。一部の実施形態において、誘導体のアミノ酸配列は、当該誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドのフラグメントと少なくとも９５％同じである。ある特定の実施形態において、誘導体または変種は、当該誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドのフラグメントのいずれかのものと少なくとも９９％同じである。
本明細書において使用するとき、「単離された」ポリペプチドまたは構築物とは、その天然の細胞培養環境の構成要素から同定され及び分離され及び／または回収されている構築物またはポリペプチドを意味する。その天然環境の混入構成要素は、典型的に、安定化したキメラＦａｂまたは安定化したキメラＦａｂを含む抗体構築物に関する診断的または治療的使用を妨げるであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。
ある特定の実施形態において、本明細書において使用するとき、「単離された」抗体構築物とは、その天然の細胞培養環境の構成要素から同定され及び分離され及び／または回収されている、安定化したキメラＦａｂを含めた抗体構築物を記載する。例えば、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂは、重鎖Ｆａｂ配列、ならびにＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物（ヘテロ二量体）あるいはその天然の細胞培養環境の構成要素から同定され及び分離され及び／または回収されている「単離された」ヘテロ二量体を含む。その天然環境の混入構成要素は、ヘテロ二量体または抗体構築物に関する診断的または治療的使用を妨げるであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。
安定化したキメラＦａｂ及びそれを含む抗体構築物は、実質的な均一性まで精製され得る。「実質的に均一な」、「実質的に均一な形態」、及び「実質的な均一性」という語句は、正しく対合した産物が、非所望のポリペプチド組み合わせ（例えば、ホモ二量体または誤対合したヘテロ二量体）により生じる副産物を実質的に欠いていることを示すために用いられる。１つの実施形態において、精製された安定化したキメラＦａｂは、軽鎖二量体を実質的に欠いている。１つの実施形態において、二特異性抗体構築物の背景において、Ｈ１（重鎖１）、Ｌ１（軽鎖１）、Ｈ２（重鎖２）、及びＬ２（軽鎖２）が発現される場合、正しく対合した産物は、正しく対合したＨ１Ｌ１及びＨ２Ｌ２を含むヘテロ二量体ペア（Ｈ１Ｌ１Ｈ２Ｌ２）である。一部の実施形態において、二特異性抗体構築物の背景において、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２が発現される場合、正しく対合した産物は、例えばＨ１Ｌ１Ｈ２Ｌ１もしくはＨ１Ｌ２Ｈ２Ｌ２など、少なくとも１つのＦａｂ領域において正しい対合を呈する付加的な産物を含み得る、または「半抗体」が産生される場合、Ｈ１Ｌ１もしくはＨ２Ｌ２を含み得る（図１１を参照されたい）。純度の観点から表現すると、１つの実施形態において、実質的な均一性とは、完全に誤対合した副産物の量が、混合物中に存在するすべての種からの総ＬＣ－ＭＳ強度の２０％を超えない、例えば１０％を下回る、５％を下回る、１％を下回る、または０．５％を下回ることを意味し、当該パーセンテージは質量分光分析からの結果を反映する。
抗体技術の当業者によって理解される用語はそれぞれ、本明細書において明示的に異なって定義されていない限り、当技術分野において獲得された意味を与えられえる。抗体は、可変領域、ヒンジ領域、及び定常ドメインを有することが公知である。免疫グロブリンの構造及び機能は、例えばＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）に総説されている。
本明細書において使用するとき、「抗体」及び「免疫グロブリン」または「抗体構築物」という用語は、互換可能に用いられる。「抗体構築物」とは、分析物（エピトープまたは抗原）に特異的に結合する、１つもしくは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチド、または１つもしくは複数のそのフラグメントを指す。認められている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロンとして分類され、それが今度は、それぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを規定する。さらに、抗体は、いくつかのサブタイプのうちの１つに属し得、例えばＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスに属し得る。カッパ軽鎖を含む抗体は、本明細書において「カッパ抗体」と呼ばれ、一方でラムダ軽鎖を含む抗体は、本明細書において「ラムダ抗体」と呼ばれる。
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、各ペアが１本の免疫グロブリン「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１本の免疫グロブリン「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する、２対のポリペプチド鎖から構成される。このタイプの免疫グロブリンまたは抗体構造単位は、「天然に存在する」と見なされ、本明細書において「Ｍａｂ」形式とも呼ばれる。「軽鎖」という用語には、全長軽鎖、及び結合特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有するそのフラグメントが含まれる。全長軽鎖は、可変ドメインＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、カッパ鎖及びラムダ鎖が含まれる。「重鎖」という用語には、全長重鎖、及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントが含まれる。全長重鎖は、可変ドメインＶＨ、ならびに３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３はポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４サブクラスを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを含めた、任意のクラスのものであり得る。「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、典型的に重鎖（ＶＨ）においておよそ１２０～１３０個のアミノ末端アミノ酸、及び軽鎖（ＶＬ）において約１００～１１０個のアミノ末端アミノ酸を含む、一般的に抗原認識に関与する、抗体の軽鎖及び／または重鎖の一部を指す。
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、抗原結合特異性及びアフィニティーに寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの適正な立体構造を維持して、抗原結合領域と抗原との間の結合を促進するのを支援し得る。構造的に、フレームワーク領域は、抗体においてＣＤＲの間に位置し得る。可変領域は、典型的に、３つの超可変領域ＣＤＲによってつながった比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を呈する。各ペアの２本の鎖由来のＣＤＲは、典型的にフレームワーク領域によって並び、それにより特異的エピトープへの結合が可能となり得る。Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖及び重鎖可変領域の両方は、典型的にドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、別様に記述されていない限り、典型的にＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７及び１９９１））のＫａｂａｔの定義に従っている。
「多特異性抗体構築物」または「多特異性抗体」とは、１種を上回る種類の個別の抗原またはエピトープを標的にするまたは結合するものである。「二特異性」、「二重特異性」、または「二機能性」抗体構築物または抗体とは、２種の異なる抗原またはエピトープを標的にするまたは結合する多特異性抗体構築物の１種である。一般的に、二特異性抗体構築物は、２つの異なる抗原結合ドメインを有し得る。二特異性抗体構築物または抗体の２つの抗原結合ドメインは、同じまたは異なる分子標的上に存在し得る２種の異なるエピトープに結合する。１つの実施形態において、二特異性抗体構築物は、天然に存在する形式にある。言い換えれば、二特異性抗体構築物は、天然に存在するＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体と同じ形式を有する。
抗体重鎖は抗体軽鎖と対合し、１つまたは複数の「接合部分」において互いと出会いまたは接触する。「接合部分」は、第一のポリペプチドにおける１つまたは複数の「接触」アミノ酸残基を含み、それは、第二のポリペプチドの１つもしくは複数の「接触」アミノ酸残基と、または付加的なポリペプチド由来の１つもしくは複数の接触残基と相互作用し、そこで当該第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または付加的なポリペプチドは互いに出会いまたは接触する。例えば、接合部分は、重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメイン間、軽鎖のＶＬ及びＣＬドメイン間、二量体化したＦｃ領域の２つのＣＨ３ドメイン間、重鎖のＣＨ１ドメイン及び軽鎖のＣＬドメイン間、ならびに重鎖のＶＨドメイン及び軽鎖のＶＬドメイン間に存在する。「接合部分」は、ＩｇＧ抗体、例えばヒトＩｇＧ１抗体に由来し得る。あるいは、接合部分は、ポリペプチドの一部分由来の１つまたは複数の接触アミノ酸残基を含み、それは、同じポリペプチドの異なる部分由来の１つまたは複数の接触残基と相互作用する。例えば、接合部分は、軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメイン間に存在する。
「接触アミノ酸残基」によって、互いへの非共有結合性結合の少なくとも１つのタイプ（例えば、ファンデルワールス、水素結合等）を呈する２つの残基を最小限に含むアミノ酸残基を意味する。
Ｆａｂ（抗原結合性フラグメントとも呼ばれる）は、それぞれ軽鎖及び重鎖上の可変ドメインＶＬ及びＶＨとともに、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。重鎖Ｆａｂ配列は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む短縮重鎖である。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、超可変領域とも呼ばれる）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端におけるいくつかの残基の付加の分、Ｆａｂフラグメントとは異なる。「Ｆａｂ形式」という用語は、Ｆａｂ及びＦａｂ’フラグメントなどの抗体構築物を含むことを企図される。Ｆａｂ形式の構築物の軽鎖部分には、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、もしくはキメラ軽鎖、またはその組み合わせが含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。Ｆａｂ形式の構築物の重鎖部分には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤクラスに由来する重鎖が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。１つの実施形態において、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの総説に関しては、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）におけるＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖフラグメントは、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号に記載されている。
「Ｍａｂ形式」の抗体とは、天然に存在する抗体と同様の構造を有する抗体を指す。言い換えれば、Ｍａｂ形式の抗体は、２本の全長重鎖及び２本の全長軽鎖を有し得る。軽鎖には、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、もしくはキメラ軽鎖、またはその組み合わせが含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。Ｍａｂ形式の構築物の重鎖部分には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤクラスに由来する重鎖が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。Ｍａｂ形式の抗体は二価であり、単一特異性または二特異性であり得る。
本明細書において用いられる「アミノ酸改変」という用語には、アミノ酸の挿入、欠失、置換、化学的改変、物理的改変、及び転位が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に対するアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ａｎｄ Ｗｕ，１９９１；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２，ｐ６４７（１９９１）に記載される）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．，ｅｔ ａｌ．ＩＭＧＴ（登録商標），ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３７，Ｄ１００６－Ｄ１０１２（２００９）、及びＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．，ＩＭＧＴ，ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１１ Ｊｕｎ １；２０１１（６）に明記される）、１ＪＰＴ（Ｋａｔｊａ Ｆａｅｌｂｅｒ，Ｄａｎｉｅｌ Ｋｉｒｃｈｈｏｆｅｒ，Ｌｅｏｎａｒｄ Ｐｒｅｓｔａ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｆ Ｋｅｌｌｅｙ，Ｙｖｅｓ Ａ Ｍｕｌｌｅｒ，Ｔｈｅ １．８５Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｆａｂ ｄ３ｈ４４ ａｎｄ ｏｆ ｆｒｅｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｆａｂ ｄ３ｈ４４：ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３１３，Ｉｓｓｕｅ １，Ｐａｇｅｓ ８３－９７に記載される）、及びＥＵ（ＥＵ抗体の番号付けを参照したＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従う（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５））を含めた、いくつかの慣例に従って番号付けされ得る。別様に示されていない限り、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＬ、及びＶＬドメインに対して、Ｋａｂａｔ番号付けが本明細書において用いられる。別様に示されていない限り、ＣＨ３及びＣＨ２ドメイン、ならびにヒンジ領域に対して、ＥＵ番号付けが本明細書において用いられる。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変ドメインにおけるアミノ酸残基を識別するために、ＡＨｏ番号付けシステム（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：Ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，３０９（２００１）６５７－６７０に記載される）、及びＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステム（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ，Ｌｅｓｋ ＡＭ，Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ，Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２７３（１９９７）９２７－９４８）も用いられ得る。
当技術分野において公知であるように、特異的なアミノ酸残基または箇所におけるアミノ酸置換の識別は、多くの形式で表示され得及び略記され得る。例えば、下線「＿」またはスラッシュ「／」の使用は、アミノ酸置換の組み合わせのうちの個々のアミノ酸置換を分離するために用いられ得る。例示的な例として、アミノ酸置換の組み合わせ８３Ｖ、８５Ｔ、及び１０５Ｅは、８３Ｖ＿８５Ｔ＿１０５Ｅとしてまたは８３Ｖ／８５Ｔ／１０５Ｅとしても表され得る。これら３つのタイプの形式は、本開示において互換可能に用いられる。
キメラＦａｂ及び安定化したキメラＦａｂ
改変されたＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含む安定化したキメラＦａｂが本明細書において提供される。改変されたＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物は、キメラＦａｂの熱安定性を増加させる１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含むＶラムダ配列を含む。本明細書において用いられる「キメラＦａｂ」または「キメラヘテロ二量体」という用語は、ＣＨ１ドメイン配列及びＶＨドメイン配列を含む重鎖と、キメラ免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド（Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖）構築物とを有するＦａｂを指し、当該重鎖配列及び当該Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物は、エピトープに結合するＦａｂ領域を形成する。「重鎖Ｆａｂ配列」とは、ＣＨ１ドメイン配列及びＶＨドメイン配列を含む、免疫グロブリン重鎖のフラグメントを指す。キメラＦａｂは、典型的に、安定化したキメラＦａｂを操作するための開始点である。ゆえに、安定化したキメラＦａｂは、キメラＦａｂの熱安定性を増加させる１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含むように操作されている親キメラＦａｂに基づく。
１つの実施形態において、親キメラＦａｂは、ラムダ軽鎖を有する親抗体（親ラムダ抗体）に由来する配列を含み得る。これらの実施形態において、親キメラＦａｂは、親ラムダ抗体由来の重鎖Ｆａｂ配列と、ならびに親ラムダ抗体由来のＶラムダ配列及びカッパ軽鎖由来のＣカッパ配列を有するＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物とを含む。親キメラＦａｂは、１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を有しない野生型キメラヘテロ二量体とも呼ばれる。
親ラムダ抗体
いくつかのラムダ抗体が当技術分野において公知であり、それらが天然に存在するラムダ軽鎖構造を含む限りにおいて、親ラムダ抗体として適切である。本明細書において用いられる「天然に存在する軽鎖構造」とは、ラムダＶＬ及びＣＬドメインを有する軽鎖構造を意味する。１つの実施形態において、親ラムダ抗体は、天然に存在する抗体である。別の実施形態において、親ラムダ抗体は、操作されたラムダ抗体である。操作された抗体とは、当該抗体のポリペプチド配列または機能的特性を変更する１つまたは複数の改変を含むものである。変更され得る機能的特性には、抗原結合、エフェクター機能、熱安定性、二特異性抗体の背景における重鎖対合及び／または軽鎖対合が含まれるが、それらに限定されるわけではない。親ラムダ抗体は、その薬物動態学的／薬力学的特性を向上させ及び免疫原性を減少させるようにも操作され得る。これらの機能的特性は、親抗体のポリペプチド配列における１つまたは複数のアミノ酸改変によって変更され得る。これらの機能的特性を変更する適切な方法は当技術分野において公知であり、その一部は本明細書における他の箇所で記載される。
１つの実施形態において、親ラムダ抗体は、マウス、ヒト、またはヒト化抗体である。非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する抗体である。ほとんどに関して、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、アフィニティー、及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見い出されない残基を含み得る。これらの改変を加えて、抗体性能をさらに洗練する。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み得、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含み得る。さらなる詳細に関しては、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。ゆえに、一部の実施形態において、親キメラ抗体は、マウス、ヒト、もしくはヒト化重鎖Ｆａｂ配列、またはＶラムダ配列を含む。
一部の実施形態において、親キメラＦａｂは、ヒトまたはヒト化ラムダ抗体由来のＶラムダ配列とＣカッパ配列とを有するＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物を含む。例示的なＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物の配列は図２に提供されており、親抗体のラムダ軽鎖の配列に対してアラインされている。
マウスラムダ軽鎖のマウスＶＬドメイン及びＣＬドメイン間の接合部分は、ヒトラムダ軽鎖のヒトＶＬドメイン及びＣＬドメイン間の接合部分と非常に類似しており、マウスカッパ軽鎖のマウスＶＬドメイン及びＣＬドメイン間の接合部分は、ヒトカッパ軽鎖のヒトＶＬドメイン及びＣＬドメイン間の接合部分と非常に類似している。ゆえに、本明細書において記載される安定化アミノ酸改変は、マウス親ラムダ抗体由来のＶラムダ配列とヒトカッパ抗体由来のＣカッパ配列とを有するＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物を含む親キメラＦａｂにも適用され得る。ゆえに、１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、マウスラムダ抗体由来のＶラムダ配列とヒトカッパ抗体由来のＣカッパ配列とを有するＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物を含むキメラＦａｂを含む。
ラムダ抗体のＣＬ及びＶＬドメインは、異なる生殖系列に属する軽鎖を含む。１つの実施形態において、親ラムダ抗体のＶＬドメインは、ヒト生殖系列サブグループＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ４、ＩＧＬＶ５、ＩＧＬＶ６、ＩＧＬＶ７、ＩＧＬＶ８、ＩＧＬＶ９、ＩＧＬＶ１０、またはＩＧＬＶ１１から選択される。１つの実施形態において、親ラムダ抗体のＶＬドメインは、ヒト生殖系列サブグループＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、またはＩＧＬＶ６から選択される。
ラムダ抗体は、異なる生殖系列に属する重鎖ドメインも含み得る。１つの実施形態において、親ラムダ抗体は、ヒトＶＨドメイン生殖系列サブグループＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６、またはＩＧＨＶ７から選択されるＶＨドメインを有する重鎖を含む。１つの実施形態において、親ラムダ抗体は、ヒトＶＨドメイン生殖系列サブグループＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ３、またはＩＧＨＶ４由来のＶＨドメインを有する重鎖を含む。１つの実施形態において、親ラムダ抗体は、ヒトＶＨドメイン生殖系列サブグループＩＧＨＶ３またはＩＧＨＶ４由来のＶＨドメインを有する重鎖を含む。別の実施形態において、親ラムダ抗体は、ヒトＪセグメント生殖系列遺伝子ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５、またはＩＧＨＪ６から選択されるＪセグメントを有する重鎖を有する。１つの実施形態において、親ラムダ抗体は、ヒトＣＨ１ドメイン生殖系列サブグループＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、またはＩＧＨＧ４から選択されるＣＨ１ドメインを有する重鎖を有する。１つの実施形態において、親ラムダ抗体は、生殖系列サブグループＩＧＨＧ１由来のヒトＣＨ１ドメインを有する重鎖を有する。
１つの実施形態において、親ラムダ抗体は治療用抗体である。ラムダ軽鎖を含む適切な治療用抗体、及びそれらが結合する抗原の非限定的な例は、下記の表Ａにおいて識別されている。
Figure 0007245793000001
１つの実施形態において、親キメラＦａｂは、重鎖Ｆａｂ配列、及び表Ａに列挙される抗体の１つ由来のＶラムダ配列を含む。
表Ａに列挙される抗体、及び治療用または別様の他の適切な親抗体のアミノ酸配列は、これらの抗体を記載した刊行物、及び／またはＴＡＢＳ、ＰＤＢ、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）などのデータベースから容易に獲得され得、そのすべてはインターネット上でアクセス可能である。
他の適切な親ラムダ抗体の例は、ＣＡＴ－２２００抗体、Ｈ３抗体、及びＥＰ６ｂ＿Ｂ０１抗体である。これらの抗体の配列は当技術分野において公知であり、表２に提供されている。例えば、ＣＡＴ－２２００抗体（ＩＬ－１７に結合する）のアミノ酸配列は、ＰＤＢエントリー２ＶＸＳ ９において見い出され得、Ｈ３（ＨＥＲ３に結合する）のアミノ酸配列は、米国特許第８，３２９，８７３号において見い出され得、及びＥＰ６ｂ＿Ｂ０１（Ｆａｓに結合する）のアミノ酸配列は、ＰＤＢエントリー３ＴＨＭにおいて見い出され得る。
ｓｃＦｖ
上で示されるように、一部の実施形態において、親キメラＦａｂは、ｓｃＦｖに由来し得る。ｓｃＦｖに由来する親キメラＦａｂは、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーをスクリーニングして関心対象の結合物質を同定する結果としばしば作出され得る。ｓｃＦｖをＦａｂに変換する方法は当技術分野において公知であり、例えばＳｔｅｉｎｗａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｍａｂｓ ６：２０４、及びＺｕｂｅｒｂｕｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２２：１６９－１７４に記載されている。１つの実施形態において、親キメラＦａｂは、ｓｃＦｖの配列から直接構築され得る。別の実施形態において、親キメラＦａｂは、ｓｃＦｖから変換されているＦａｂに由来し得る。
Ｓｍｉｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８：１５９５４（リアクチボディ（ｒｅａｃｔｉｂｏｄｉｅｓ）を記載している）、またはＮｉｅｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２４：２０９－２１９；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１５：６９９－７１５；及びｓｃＦｖとしてもともと同定された抗体を記載しているＦｅｎｎ（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８：ｅ６１９５３－ｅ６１９５３に記載されるように、多くの適切なｓｃＦｖが当技術分野において公知である。１つの実施形態において、親キメラＦａｂは、治療用ｓｃＦｖから、例えばブリナツモマブ、エファングマブ、ペキセリズマブ、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）などから調製され得る。親キメラＦａｂは、ｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨ配列に基づいて構築され得、カッパ抗体のＣＨ１及びＣカッパドメインに融合され得る。これらの実施形態において、親キメラＦａｂは、ｓｃＦｖ由来のＶラムダ配列とカッパ軽鎖由来のＣカッパ配列とを有するＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物を含み、一方で重鎖Ｆａｂ配列は、ｓｃＦｖ由来のＶＨドメインとＣＨ１ドメインとを含む。適切なＣＨ１ドメイン配列は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＡクラス由来のヒトＣＨ１ドメインから選択され得る。１つの実施形態において、ＣＨ１ドメイン配列は、ＣＨ１ドメイン生殖系列サブグループＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、またはＩＧＨＧ４から選択される。適切なＣカッパ配列は下で記載される。
Ｃカッパ配列
Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物のポリペプチド配列は、親抗体のラムダ軽鎖のＶＬドメイン（Ｖラムダ）配列と、適切なＣカッパ定常ドメインの配列とを融合することによって作出され得る。適切なＣカッパ定常ドメイン配列は、ＣＬ生殖系列アレルＩＧＫＣ＊０１、ＩＧＫＣ＊０２、ＩＧＫＣ＊０３、ＩＧＫＣ＊０４、またはＩＧＫＣ＊０５から選択されるものである。１つの実施形態において、Ｃカッパ定常ドメイン配列は、生殖系列サブグループＩＧＫＣ＊０１由来のものである。これらのＣカッパ定常ドメインのアミノ酸配列は、上で記されたＩＭＧＴデータベースから容易に入手可能である。
一部の実施形態において、親キメラＦａｂは、当技術分野において公知のまたは記載されるキメラＦａｂであり得る。例えば、親キメラＦａｂは、Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ａｃｔ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ７０：７０８－７１９に記載されるキメラＦａｂであり得る。
一部の実施形態において、親キメラＦａｂは、親ラムダ抗体由来のＦａｂのものと同じである熱安定性を有する。一部の実施形態において、親キメラＦａｂは、親ラムダ抗体由来のＦａｂのものよりも少なくとも１０℃低い熱安定性を有する。一部の実施形態において、親キメラＦａｂは、親ラムダ抗体由来のＦａｂのものよりも少なくとも５℃低い熱安定性を有する。
安定化アミノ酸改変
本明細書において用いられる「安定化したキメラＦａｂ」という用語は、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物のＶラムダ配列が、親キメラＦａｂの熱安定性を増加させる１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む、キメラＦａｂまたはキメラヘテロ二量体を指す。ゆえに、１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）配列及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む免疫グロブリン重鎖ポリペプチド構築物（重鎖Ｆａｂ配列）と、親キメラＦａｂの熱安定性を増加させる１つまたは複数の安定化アミノ酸改変をＶラムダ配列に含むＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物とを含み、当該重鎖Ｆａｂ配列及び当該Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物は、エピトープに結合するＦａｂ領域を形成する。安定化したキメラＦａｂは、親キメラＦａｂから操作され、本明細書において記載される１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む本質的には親キメラＦａｂである。
「熱安定性」という用語は、単離されたまたは抗体構築物におけるＦａｂ領域のＴｍ、すなわち融解温度を測定することによって、抗体に対してしばしば査定される特性である。Ｆａｂの熱安定性は、本明細書における他の箇所で記載されるいくつかの公知の方法を用いて測定され得る。
本明細書で記載される安定化アミノ酸改変は、Ｆａｂ形式の（すなわち、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有する重鎖フラグメントと対合した）天然に存在する軽鎖の構造を調べ、これらの構造とＶラムダ－ＣカッパキメラＦａｂのものとを比較することによって同定された。これらの構造の比較は、安定化したキメラＦａｂにおけるＶラムダ－Ｃカッパ接合部分の適合性の向上をもたらす、Ｖカッパ－Ｃカッパドメイン間で観察される接合部分を模倣するように改変され得る可変ラムダドメインにおけるアミノ酸残基の同定につながった。
１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物のＶラムダ及びＣカッパドメイン間の接合部分におけるアミノ酸残基に、Ｖラムダ配列における安定化アミノ酸改変を含む。安定化アミノ酸改変が生じる箇所は、別様に示されていない限り、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って識別される。
１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物のＶラムダ配列における１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物のＶラムダ配列における２つまたはそれを上回る数の安定化アミノ酸改変を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物のＶラムダ配列における３つまたはそれを上回る数の安定化アミノ酸改変を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物のＶラムダ配列における４つまたはそれを上回る数の安定化アミノ酸改変を含む。
安定化アミノ酸改変は、Ｖラムダ－ＣカッパキメラＦａｂ軽鎖のＶラムダ及びＣカッパドメイン間の接合部分にあり得る。１つの実施形態において、安定化アミノ酸改変は、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物のＶラムダ及びＣカッパドメインの接合部分にないと見なされるアミノ酸残基にあり得る。
一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物のＶラムダ及びＣカッパドメイン間の接合部分に１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む。そのようなアミノ酸残基の非限定的な例は、Ｖラムダ配列の箇所８０、８３、１０５、及び１０６において見い出される。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、残基８３にＶラムダ配列における安定化アミノ酸改変を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、残基１０５にＶラムダ配列における安定化アミノ酸改変を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、残基１０６にＶラムダ配列における安定化アミノ酸改変を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、残基８０にＶラムダ配列における安定化アミノ酸改変を含む。
安定化したキメラＦａｂは、接合部分にないアミノ酸残基にＶラムダ配列における安定化アミノ酸改変を含み得る。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、Ｖラムダ配列における残基８５に安定化アミノ酸改変を含む。
一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、２つのアミノ酸残基にＶラムダ配列における安定化アミノ酸改変の組み合わせを含み得る。一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、残基８３及び８５；８３及び１０６；１０５及び１０６；１０５及び１０６Ａ；８３及び１０５；８５及び１０５；または８５及び１０６に、安定化アミノ酸改変の組み合わせを含み得る。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、残基８３及び８５に；残基８３及び１０６に；残基１０５及び１０６Ａに；または残基８３及び１０５に、安定化アミノ酸改変の組み合わせを含み得る。
他の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、３つのアミノ酸残基にＶラムダ配列における安定化アミノ酸改変の組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、残基８３、８５、及び１０５に；残基８３、１０５、及び１０６Ａに；残基８３、８５、及び１０６に；残基８３、１０５、及び１０６に；または残基８５、１０５、及び１０６に、安定化アミノ酸改変の組み合わせを含み得る。一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、残基８３、８５、及び１０５に、または残基８３、１０５、及び１０６Ａに、安定化アミノ酸改変の組み合わせを含み得る。
他の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、４つまたはそれを上回る数のアミノ酸残基にＶラムダ配列における安定化アミノ酸改変の組み合わせを含み得る。ゆえに、一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、残基８３、８５、１０５、及び１０６に；残基８０、８３、１０５、及び１０６Ａに；残基８０、８３、８５、及び１０５に；残基８０、８３、８５、及び１０５に；残基８０、８５、１０５、及び１０６に；残基８０、８３、１０５、及び１０６に；または残基８３、１０５、１０６、及び１０６Ａに、安定化アミノ酸改変の組み合わせを含み得る。
さらに他の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、残基８０、８３、８５、１０５、及び１０６Ａに；残基８０、８３、１０５、１０６、及び１０６Ａに；残基８３、８５、１０５、１０６、及び１０６Ａに；残基８０、８３、８５、１０５、１０６に；または残基８０、８３、８５、１０５、１０６、及び１０６Ａに、Ｖラムダ配列における安定化アミノ酸改変の組み合わせを含み得る。
上で示されるように、安定化アミノ酸改変が生じるアミノ酸箇所は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って本明細書において記載される。しかしながら、これらのアミノ酸箇所は、代替的な番号付けシステムに従っても識別され得る。例えば、以下の表は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、ＡＨｏ、及びＥＵ番号付けシステムに従って、Ｖラムダドメインにおける選択された特異的アミノ酸箇所を識別している。
Figure 0007245793000002
アミノ酸置換
アミノ酸残基は、疎水性、極性、側鎖体積、及び／またはサイズなど、それらの側鎖の特性に従ってグループ分けされ得る。疎水性アミノ酸残基の例には、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、システイン、及びトリプトファンが含まれる。極性非荷電アミノ酸残基の例には、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、及びチロシンが含まれる。負荷電アミノ酸残基の例には、グルタミン酸及びアスパラギン酸が含まれる。正荷電アミノ酸残基の例には、リジン及びアルギニンが含まれる。アミノ酸残基の側鎖体積は測定されており、米国特許第５，８２１，３３３号の表１に示されるように当技術分野において公知であり、下記の表Ｂにおいて再現されている。
Figure 0007245793000003
安定化したキメラＦａｂは、下で記載される各残基に安定化アミノ酸改変を含み得る。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所８３におけるアミノ酸は、疎水性アミノ酸での置換を含む。一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所８３におけるアミノ酸は、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、またはＡから選択される疎水性アミノ酸での置換を含む。一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所８３におけるアミノ酸は、Ｆ、Ｉ、Ｖ、またはＡから選択される疎水性アミノ酸での置換を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所８３におけるアミノ酸は、極性非荷電アミノ酸での置換を含む。箇所８３に対する直近周辺環境についての構造査定に基づき、この箇所に適合し得、キメラ軽鎖における比較的硬くない可変及び定常ドメイン接合部分にわたる接触を提供し、ゆえに熱安定性を向上させるであろう、この箇所における付加的なアミノ酸置換が企図される。これらの付加的なアミノ酸には、Ｓ、Ｎ、Ｈ、Ｑ、またはＴなど、適切なサイズ及び形状の極性非荷電アミノ酸が含まれる。ゆえに、一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所８３におけるアミノ酸は、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｎ、またはＱから選択される極性非荷電アミノ酸での置換を含む。他の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、極性非荷電アミノ酸置換８３Ｓ、８３Ｎ、８３Ｈ、または８３Ｑを含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、アミノ酸置換８３Ａ、８３Ｆ、８３Ｉ、８３Ｖ、８３Ｌ、または８３Ｔを含む。
１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所８５におけるアミノ酸は、疎水性アミノ酸での置換を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所８５におけるアミノ酸は、８５Ｖまたは８５Ａから選択される疎水性アミノ酸での置換を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所８５におけるアミノ酸は、８５Ｖから選択される疎水性アミノ酸での置換を含む。箇所８５の直近周辺環境の背景における、付加的なアミノ酸置換の適切性についての構造査定は、Ｔ、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、及びＹなど、適切なサイズ及び形状の極性非荷電アミノ酸が、キメラ軽鎖における可変及び定常ドメイン間の接合部分の全体的適合性に間接的に寄与し得、ゆえに、熱安定性の向上に寄与すると予想され得ることを示した。ゆえに、１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所８５におけるアミノ酸は、極性非荷電アミノ酸で置換され得る。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、アミノ酸置換８５Ｔ、８５Ｓ、８５Ｈ、８５Ｎ、８５Ｑ、または８５Ｙを含む。他の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、８５Ｓ、８５Ｈ、または８５Ｑから選択される極性非荷電アミノ酸での置換を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、アミノ酸置換８５Ｔ、８５Ｖ、８５Ｎ、８５Ａ、または８５Ｙを含む。
１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所１０５におけるアミノ酸は、負に荷電しているアミノ酸での置換を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所１０５におけるアミノ酸は、負荷電アミノ酸置換１０５Ｅまたは１０５Ｄを含む。直近周辺環境の背景における、この箇所におけるＥ以外の付加的なアミノ酸置換の適切性についての構造査定は、ＮまたはＱなどの極性非荷電アミノ酸が、１０５Ｅのものと、キメラ軽鎖における可変及び定常ドメイン接合部分にわたる同様の相互作用を提供し得、ゆえに、熱安定性の向上にも寄与し得ることを示した。ゆえに、１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所１０５におけるアミノ酸は、極性非荷電アミノ酸での置換を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所１０５におけるアミノ酸は、極性非荷電アミノ酸置換１０５Ｎまたは１０５Ｑを含む。
一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所１０６におけるアミノ酸は、疎水性アミノ酸での置換を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所１０６における疎水性アミノ酸置換は、１０６Ｉ、１０６Ｌ、または１０６Ｍから選択される。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの箇所１０６における疎水性アミノ酸置換は１０６Ｉである。
一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂの残基８０は、疎水性であるアミノ酸での置換を含む。ある特定の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、８０Ａ、８０Ｐ、または８０Ｖから選択される疎水性アミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、８０Ａまたは８０Ｐから選択される疎水性アミノ酸置換を含む。直近周辺環境の背景における、この箇所における他のアミノ酸置換の適切性についての構造査定に基づき、Ｓ、Ｎ、またはＱなどの極性非荷電アミノ酸は、８０Ａ及び８０Ｐのものと、キメラ軽鎖における可変及び定常ドメイン接合部分における同様の相互作用につながり得、ゆえに、熱安定性の向上への同様のわずかな寄与を有すると予想され得る。ゆえに、一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂの残基８０は、極性がありかつ非荷電であるアミノ酸での置換を含む。ある特定の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、８０Ｓ、８０Ｎ、または８０Ｑから選択される極性非荷電アミノ酸置換を含む。
当業者であれば、本明細書において記載されるアミノ酸箇所及び置換の複数の組み合わせを用いて、親キメラＦａｂと比較して、キメラＦａｂの安定性を増加させ得ることを理解するであろう。そのような組み合わせの代表的な番号は、実施例において記載され及び試験されているが、本開示はこれらのみに限定されるわけではない。例えば、本開示に記載されるアミノ酸箇所の組み合わせに関して、各箇所に対して記載されるアミノ酸置換が採用され得、箇所（複数可）及び置換の各組み合わせは本明細書において記載される。
ゆえに、付加的な実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、表３に記載されるものから選択されるアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせを含む。他の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、アミノ酸置換８３Ｌ及び８５Ｔ；８３Ｌ及び８５Ｖ；８３Ｌ及び１０５Ｅ；８３Ｌ及び１０６Ｉ；８３Ｌ、８５Ｖ、及び１０５Ｅ；８３Ｌ、８５Ｔ、及び１０５Ｅ；８３Ｌ、８５Ｔ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉ；または８３Ｌ、８５Ｖ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉを含む。さらに他の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、アミノ酸置換８３Ｓ及び８５Ｔ；８３Ｓ及び８５Ｖ；８３Ｓ及び１０５Ｅ；８３Ｓ及び１０６Ｉ；８３Ｓ、８５Ｖ、及び１０５Ｅ；８３Ｓ、８５Ｔ、及び１０５Ｅ；８３Ｓ、８５Ｔ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉ；または８３Ｓ、８５Ｖ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉを含む。一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、アミノ酸置換８３Ｔ及び８５Ｔ；８３Ｔ及び８５Ｖ；８３Ｔ及び１０５Ｅ；８３Ｔ及び１０６Ｉ；８３Ｔ、８５Ｖ、及び１０５Ｅ；８３Ｔ、８５Ｔ、及び１０５Ｅ；８３Ｔ、８５Ｔ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉ；または８３Ｔ、８５Ｖ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉを含む。付加的な実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、アミノ酸置換８３Ａ及び８５Ｓ；８３Ａ、８５Ｓ、及び１０５Ｅ；８３Ａ、８５Ｓ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉ；８３Ｉ及び８５Ｓ；８３Ｉ、８５Ｓ、及び１０５Ｅ；８３Ｉ、８５Ｓ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉ；８３Ｖ及び８５Ｓ；８３Ｖ、８５Ｓ、及び１０５Ｅ；８３Ｖ、８５Ｓ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉ；８３Ｆ及び８５Ｓ；８３Ｆ、８５Ｓ、及び１０５Ｅ；または８３Ｆ、８５Ｓ、１０５Ｅ、及び１０６Ｉを含む。さらなる実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、アミノ酸置換８３Ａ及び１０５Ｄ；８３Ａ、８５Ｔ、及び１０５Ｄ；８３Ａ、８５Ｖ、及び１０５Ｄ；８３Ｉ及び１０５Ｄ；８３Ｉ、８５Ｔ、及び１０５Ｄ；８３Ｉ、８５Ｖ、及び１０５Ｄ；８３Ｖ及び１０５Ｄ；８３Ｖ、８５Ｔ、及び１０５Ｄ；８３Ｖ、８５Ｖ、及び１０５Ｄ；８３Ｆ及び１０５Ｄ；８３Ｆ、８５Ｔ、及び１０５Ｄ；または８３Ｆ、８５Ｖ、及び１０５を含む。
一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、アミノ酸置換８３Ｆ及び８５Ｖ；８３Ｖ及び８５Ｖ；８３Ｉ及び８５Ｖ；８３Ａ及び８５Ｖ；８５Ｔ及び１０５Ｅ；８５Ｖ及び１０５Ｅ；８３Ｆ及び８５Ｔ；８５Ｖ及び１０５Ｅ；８３Ｖ及び８５Ｔ；８５Ｖ及び１０５Ｅ；８３Ｉ及び８５Ｔ；８５Ｖ及び１０５Ｅ；８３Ａ及び８５Ｔ；または８５Ｖ及び１０５Ｅを含む。
安定性の増加
安定化したキメラＦａｂの熱安定性を親キメラＦａｂのものと比較して、親キメラＦａｂと比べた、安定化したキメラＦａｂによって呈される安定性の増加を判定する。１つの実施形態において、熱安定性は、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定される。別の実施形態において、熱安定性は、示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）によって測定される。一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、親キメラＦａｂと比べて１５℃を上回る熱安定性の増加を呈し得る。一部の実施形態において、１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む安定化したキメラＦａｂは、親キメラＦａｂと比べて約１５℃の熱安定性の増加を呈し得る。一部の実施形態において、１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む安定化したキメラＦａｂは、親キメラＦａｂと比べて約１０℃の熱安定性の増加を呈し得る。一部の実施形態において、１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む安定化したキメラＦａｂは、親キメラＦａｂと比べて約９、８、７、６、５、４、３、２、または１℃の熱安定性の増加を呈し得る。
一部の実施形態において、１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む安定化したキメラＦａｂは、親ラムダ抗体のＦａｂと比べて約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１℃の熱安定性の増加を呈し得る。一部の実施形態において、１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む安定化したキメラＦａｂは、示差走査熱量測定法によって測定される、親ラムダ抗体のＦａｂと比べて約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１℃の熱安定性の増加を呈し得る。一部の実施形態において、１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む安定化したキメラＦａｂは、示差走査蛍光測定法によって測定される、親ラムダ抗体のＦａｂと比べて約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１℃の熱安定性の増加を呈し得る。
抗原結合に対する効果
１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む安定化したキメラＦａｂは、親キメラ抗体のものとまたは親ラムダ抗体のものと同程度であるアフィニティーで、標的抗原上のエピトープに結合し得る。ゆえに、１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、親ラムダ抗体のものの約１０倍以内にあるアフィニティーで、標的抗原上のエピトープに結合し得る。他の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、親ラムダ抗体のものの約５倍以内にあるアフィニティーで、標的抗原上のエピトープに結合し得る。さらに他の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、親ラムダ抗体のものの約２．５倍以内にあるアフィニティーで、標的抗原上のエピトープに結合し得る。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂのアフィニティーは、本明細書における他の箇所で記載される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定される。
移転可能性
安定化アミノ酸改変は、実施例において具体的に記載されるもの以外の親キメラＦａｂ内に操作され得る。ラムダ軽鎖における可変及び定常ドメイン間の接合部分におけるアミノ酸残基の大多数は高度に保存されているため、本明細書で記載される安定化アミノ酸改変の効果は、一般的に、ほとんどの親キメラＦａｂ及びＭａｂシステムに移転可能であると予想される。ゆえに、安定化アミノ酸改変は、一般的に、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖を含むキメラＦａｂの安定性を増加させ得る。
付加的な任意の改変
一部の実施形態において、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂは、共有結合性付着が、安定化したキメラＦａｂが標的抗原のエピトープに結合し得る能力を妨げないようにさらに改変され得る（すなわち、様々なタイプの分子の共有結合性付着によって）。そのような改変には、例としてであり限定としてではなく、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結等が含まれる。特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含むがそれらに限定されない数々の化学的改変のいずれかが、公知の技法によって行われ得る。
１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、当該Ｆａｂの免疫原性を潜在的に減少させ得る１つまたは複数の改変を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、Ｋａｂａｔに従い、残基１０６Ａにアミノ酸改変を含む。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂはアミノ酸置換１０６ＡＫを含む。
他の実施形態において、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂは、所定の生物学的応答を改変する治療剤または薬物部分に（直接的または間接的に）抱合され得る。ある特定の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、薬物、例えば毒素、化学療法剤、免疫変調剤、または放射性同位体に抱合される。ＡＤＣ（抗体－薬物抱合体または抗体構築物薬物抱合体）を調製するいくつかの方法が当技術分野において公知であり、例えば米国特許第８，６２４，００３号（ポット法）、第８，１６３，８８８号（１ステップ）、及び第５，２０８，０２０号（２ステップ法）に記載されている。一部の実施形態において、薬物は、マイタンシン、オーリスタチン、カリケアマイシン、またはその誘導体から選択される。他の実施形態において、薬物は、ＤＭ１及びＤＭ４から選択されるマイタンシンである。
一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは細胞毒性剤に抱合される。本明細書において用いられる「細胞毒性剤」という用語は、細胞の機能を阻害しもしくは阻止し、及び／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。当該用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、及びＬｕ１７７）、化学療法剤、ならびにそのフラグメント及び／または変種を含めた、細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素を含むことが意図される。
治療剤または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を所有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）（または、別の細胞毒性ＲＮａｓｅ）、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、アルファ－インターフェロン、ベータ－インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えばＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ、ＡＩＭ Ｉ（国際公報第ＷＯ９７／３３８９９号を参照されたい）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公報第ＷＯ９７／３４９１１号を参照されたい）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１５６７）、及びＶＥＧＩ（国際公報第ＷＯ９９／２３１０５号を参照されたい）、血栓剤もしくは抗血管新生剤、例えばアンギオスタチンもしくはエンドスタチンなどのタンパク質；または、例えばリンホカイン（例えば、インターロイキン－１（「ＩＬ－１」）、インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）、インターロイキン－６（「ＩＬ－６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ－ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ－ＣＳＦ」）、もしくは成長因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」）などの生物学的応答改変剤が含まれ得る。
さらに、代替的な実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、放射性金属イオンを抱合するのに有用な放射性材料または大環状キレート剤などの治療用部分に抱合され得る（放射性材料の例に関しては上記を参照されたい）。ある特定の実施形態において、大環状キレート剤は１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－四酢酸（ＤＯＴＡ）であり、それはリンカー分子を介して抗体に付着され得る。そのようなリンカー分子は、当技術分野において一般に公知であり、Ｄｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４：２４８３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：５５３；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６：９４３に記載されている。
一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、タグを含む融合タンパク質として発現されて、精製及び／または試験等を容易にする。本明細書において言及するとき、「タグ」とは、Ｃ末端、Ｎ末端、または内部のいずれかにおいてタンパク質に提供される任意の付加される一連のアミノ酸であり、それは当該タンパク質の同定または精製に寄与する。適切なタグには、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、及びマルトース結合タンパク質など、精製及び／または試験において有用であることが当業者に公知のタグが含まれるが、それらに限定されるわけではない。そのようなタグ付けされたタンパク質は、精製の前、間、または後のタグの除去をしやすくするために、トロンビン、エンテロキナーゼ、または第Ｘ因子切断部位などの切断部位を含むようにも操作され得る。
分子形式
安定化したキメラＦａｂはＦａｂとして有用であり、他の分子形式または抗体構築物にも組み入れられ得る。適切な分子形式には、以下の非限定的な例：アルブミンまたはそのフラグメント、エフェクターペプチド、毒素、細胞外タンパク質、サイトカインのリガンド結合ドメインなどのポリペプチドに、リンカーの有りまたは無しで連結された安定化したキメラＦａｂが含まれる。例示的な非限定的な抗体構築物は、安定化したキメラＦａｂを、キメラのもしくは別様のＦａｂ、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体、または天然に存在する抗体などの他のポリペプチドに融合することによって設計され得る。安定化したキメラＦａｂの重鎖Ｆａｂ配列及び／またはＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物は、リンカーの有りまたは無しで他のポリペプチドに連結され得る。安定化したキメラＦａｂは、これら他のポリペプチドにそれらのＮまたはＣ末端において融合され得る。安定化したキメラＦａｂは、一本鎖Ｆａｂとしても操作され得る。そのような一本鎖Ｆａｂは、国際特許公報第ＷＯ２０１４／０１８５７２号、米国特許公報第２０１１／０２９３６１３号及び第２０１０／０３２２９３５Ａ１号に記載されている。
一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、足場に直接的または間接的に連結され得る。ゆえに、１つの実施形態において、抗体構築物は、足場に連結された少なくとも１つの安定化したキメラＦａｂを含む。適切な足場及びそれの改変は当技術分野において公知であり、例示的な足場及びそれの改変は下で記載される。
足場
安定化したキメラＦａｂは、足場、例えばペプチド、ポリペプチド、ポリマー、ナノ粒子、または他の化学的実体に連結され得る。安定化したキメラＦａｂの重鎖Ｆａｂ配列またはＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物は、それらのＮまたはＣ末端のいずれかによって足場に連結され得る。１つの実施形態において、足場は、アルブミンポリペプチドまたは分割アルブミンポリペプチドである。適切な分割アルブミンポリペプチドの例は、国際特許公報第ＷＯ２０１２／１１６４５３号及び第ＷＯ２０１４／０１２０８２号に記載されている。
別の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、免疫グロブリンＦｃ（Ｆｃ）またはその一部である足場に連結され得る。一部の実施形態において、Ｆｃは、少なくとも１つまたは２つのＣＨ３ドメイン配列を含む。一部の実施形態において、Ｆｃは、少なくとも１つまたは２つのＣＨ２ドメイン配列をさらに含む。一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、１つまたは複数のリンカーの有りまたは無しでＦｃに共役される。一部の実施形態において、ＦｃはヒトＦｃである。一部の実施形態において、Ｆｃは、ヒトＩｇＧまたはＩｇＧ１ Ｆｃである。一部の実施形態において、Ｆｃはヘテロ二量体Ｆｃである。一部の実施形態において、Ｆｃは単一ポリペプチドである。一部の実施形態において、Ｆｃは複数のペプチド、例えば２つのポリペプチドである。
一部の実施形態において、Ｆｃは、ＣＨ３ドメイン配列の少なくとも１つにおける１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。アミノ酸改変を免疫グロブリンＦｃに加えて、ホモ二量体ＣＨ３ドメイン配列と比べて、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメイン配列間の優先的対合を推進し得る。これらのアミノ酸改変は、本明細書において重鎖対合設計とも呼ばれる。そのようなアミノ酸改変は当技術分野において公知であり、例えば米国特許公報第２０１２／０１４９８７６号に記載されるものを含む。例えば「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）」、イオン相互作用を有する荷電残基、及び鎖交換操作ドメイン（ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ）（ＳＥＥＤ）を含めた、ホモ二量体ＣＨ３配列と比べて、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメイン配列間の優先的対合を推進するための代替的なストラテジーも採用され得る。後者のストラテジーは当技術分野において記載されており、上記Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌに総説されている。Ｆｃドメインのさらなる考察は下記に続く。
一部の態様において、Ｆｃは、２０１１年１１月４日に出願された特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８、または２０１２年１１月２日に出願されたＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０に記載されるＦｃであり、そのそれぞれの全開示は、すべての目的のために参照によりその全体として本明細書によって組み入れられる。
一部の態様において、抗体構築物は、リンカーの有りまたは無しで、非対称的に改変されている改変ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃに連結された安定化したキメラＦａｂを含む。ヘテロ二量体Ｆｃは、２つの重鎖定常ドメインポリペプチド：第一の重鎖ポリペプチド及び第二の重鎖ポリペプチドを含み得、それは、Ｆｃが１つの第一の重鎖ポリペプチド及び１つの第二の重鎖ポリペプチドを含むという条件で、互換可能に用いられ得る。一般的に、第一の重鎖ポリペプチドは第一のＣＨ３配列を含み、第二の重鎖ポリペプチドは第二のＣＨ３配列を含む。
非対称形式で導入された１つまたは複数のアミノ酸改変を含む２つのＣＨ３配列は、当該２つのＣＨ３配列が二量体化した場合、一般的にホモ二量体よりもむしろヘテロ二量体Ｆｃをもたらす。本明細書において使用するとき、「非対称アミノ酸改変」とは、第一のＣＨ３配列上の特異的箇所におけるアミノ酸が、同じ箇所における第二のＣＨ３配列上のアミノ酸とは異なり、かつ当該第一及び第二のＣＨ３配列が優先的に対合してホモ二量体よりもむしろヘテロ二量体を形成する、任意の改変を指す。このヘテロ二量体化は、各配列上のそれぞれの同じアミノ酸箇所における２つのアミノ酸のうちの一方のみの改変；または第一及び第二のＣＨ３配列のそれぞれの上のそれぞれの同じ箇所における各配列上の両アミノ酸の改変の結果であり得る。ヘテロ二量体Ｆｃの第一及び第二のＣＨ３配列は、１つまたは１つを上回る数の非対称アミノ酸改変を含み得る。
表Ｘは、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１～４４７に相当する、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列のアミノ酸配列を提供している。ＣＨ３配列は、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１～４４７を含む。
典型的に、Ｆｃは、二量体化し得る２つの近接重鎖配列（Ａ及びＢ）を含み得る。一部の態様において、Ｆｃの一方または両方の配列は、以下の位置：ＥＵ番号付けを用いた、Ｌ３５１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｔ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｔ３５０、Ｓ４００、及び／またはＮ３９０に、１つまたは複数の変異または改変を含む。一部の態様において、Ｆｃは、表Ｘに示される変異体配列を含む。一部の態様において、Ｆｃは、変種１Ａ～Ｂの変異を含む。一部の態様において、Ｆｃは、変種２Ａ～Ｂの変異を含む。一部の態様において、Ｆｃは、変種３Ａ～Ｂの変異を含む。一部の態様において、Ｆｃは、変種４Ａ～Ｂの変異を含む。一部の態様において、Ｆｃは、変種５Ａ～Ｂの変異を含む。
Figure 0007245793000004
一部の実施形態において、Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン配列の少なくとも１つにおける１つまたは複数のアミノ酸改変を含み得る。種々のＦｃガンマ受容体に対する抗体Ｆｃのアフィニティーを選択的に変更するための、Ｆｃの重鎖配列におけるいくつかの変異は当技術分野において公知である。一部の実施形態において、Ｆｃは、抗体構築物へのＦｃ－ガンマ受容体の結合を変更する１つまたは複数の改変を含む。
ＣＨ２ドメインは、表Ｘに示される配列のアミノ酸２３１～３４０に相当する。抗体構築物のＦｃが、Ｆｃ－ガンマ受容体に結合し得る能力を変更する例示的な非限定的なアミノ酸改変が下で列挙される。
Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２６Ａ（Ｌｕ Ｙ，Ｖｅｒｎｅｓ ＪＭ，Ｃｈｉａｎｇ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１ Ｆｅｂ ２８；３６５（１－２）：１３２－４１）；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｌ２３５Ｖ／Ｐ３９６Ｌ（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ＪＢ，Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ，Ｔｕａｉｌｌｏｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｓｅｐ １５；６７（１８）：８８８２－９０；Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ ＪＬ，Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ｎｏｖ ３０；１３（６）：Ｒ１２３）；Ｆ２４３Ｌ（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｒ，Ｔｈｏｍ Ｇ，Ｌｅｖｅｎｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１１ Ｓｅｐ；２４（９）：６７１－８）、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ，Ｎａｍｅｎｕｋ ＡＫ，Ｈｏｎｇ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９）：６５９１－６０４）；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｌａｚａｒ ＧＡ，Ｄａｎｇ Ｗ，Ｋａｒｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００６ Ｍａｒ １４；１０３（１１）：４００５－１０）；Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（Ｃｈｕ ＳＹ，Ｖｏｓｔｉａｒ Ｉ，Ｋａｒｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｓｅｐ；４５（１５）：３９２６－３３）；Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈ、Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２７０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｌ２３４Ｆ／Ｓ２６７Ｅ／Ｎ３２５Ｌ、Ｇ２３７Ｆ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｄ、ならびに参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１１／１２０１３４及びＷＯ２０１１／１２０１３５において列挙される他の変異。Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ ａｎｄ Ｌｉｌａ Ｍ．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｎｏ１１，ＩＳＢＮ １ ９０７５６８ ３７ ９，Ｏｃｔ ２０１２）は、Ｆｃ－ガンマ受容体へのＦｃの結合に影響を及ぼす、Ｆｃへの付加的な改変を２８３頁に記載している。
１つの実施形態において、抗体構築物は、安定化したキメラＦａｂ及び二量体Ｆｃを含み、当該二量体Ｆｃは、アミノ酸改変Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓを含む。
エフェクター機能を向上させる付加的な改変
一部の実施形態において、本明細書において記載される安定化したＦａｂを含む抗体構築物のＦｃは、そのエフェクター機能を向上させるように改変され得る。そのような改変は当技術分野において公知であり、アフコシル化、または活性化受容体への、主にＡＤＣＣに対するＦＣＧＲ３ａ及びＣＤＣに対するＣ１ｑへの抗体のＦｃ部分のアフィニティーの操作を含む。以下の表Ｙは、エフェクター機能操作のための、文献において報告された様々な設計を要約している。
Figure 0007245793000005
ゆえに、１つの実施形態において、抗体構築物は、安定化したキメラＦａｂ、及びエフェクター機能の向上を付与する上の表に記される１つまたは複数の改変を含む二量体Ｆｃを含む。別の実施形態において、抗体構築物をアフコシル化して、エフェクター機能を向上させ得る。
ＦｃＲｎ結合及びＰＫパラメーター
当技術分野において公知であるように、ＦｃＲｎへの結合は、血流に戻るように、エンドソームからのエンドサイトーシスされた抗体をリサイクルする（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１－２２０；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９－７６６）。全長分子の大きなサイズに起因した腎臓濾過からの除外と相まって、この工程は、１～３週間に及ぶ好ましい抗体血清半減期をもたらす。ＦｃＲｎへのＦｃの結合は、抗体輸送における重要な役割も果たす。ゆえに、１つの実施形態において、Ｆｃは、当該ＦｃがＦｃＲｎに結合し得る能力を変更するまたは促進する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。安定化したキメラＦａｂ及びＦｃを含む抗体構築物は、ＦｃＲｎに結合し得る。
リンカー
安定化したキメラＦａｂは、本明細書において記載される足場に作動的に共役され得る。例えば、安定化したキメラＦａｂを含む抗体構築物は、本明細書において記載されるＦｃに作動的に共役され得る。当業者であれば、安定化したキメラＦａｂを含む抗体構築物を共役するための複数の構成及び方法が可能であり、そのすべては本開示の範囲内に入ることを理解するであろう。一部の態様において、Ｆｃは、１つまたは複数のリンカーの有りまたは無しで、安定化したキメラＦａｂに共役される。一部の態様において、Ｆｃは、安定化したキメラＦａｂに直接共役される。一部の態様において、Ｆｃは、１つまたは複数のリンカーによって、安定化したキメラＦａｂに共役される。一部の態様において、Ｆｃは、リンカーによって、安定化したキメラＦａｂの重鎖に共役される。一部の態様において、Ｆｃは、リンカーによって、安定化したキメラＦａｂのキメラ軽鎖に共役される。
一部の態様において、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のポリペプチドリンカーである。一部の態様において、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数の抗体ヒンジ領域を含む。一部の態様において、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のＩｇＧ１ヒンジ領域を含む。
一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、一価の抗体構築物である、すなわち１つのみの抗原結合ドメインを有する抗体構築物内に組み入れられ得る。これら一価の抗体構築物は、安定化したキメラＦａｂ及び足場を含み得る。１つの実施形態において、足場はＦｃ領域である。
他の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、多特異性抗体構築物である抗体構築物内に組み入れられ得る。ある特定の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、二特異性抗体構築物である抗体構築物内に組み入れられ得る。１つの実施形態において、二特異性抗体構築物は、安定化したキメラＦａｂ及び第二のＦａｂを含み得、当該第二のＦａｂは、免疫グロブリン軽鎖構築物及び免疫グロブリン重鎖構築物を含む。ある特定の実施形態において、第二のＦａｂも、安定化したキメラＦａｂである。
安定化したキメラＦａｂ、第二のＦａｂ、及びＦｃ足場を含む二特異性抗体構築物の背景において、付加的なアミノ酸改変を二特異性抗体構築物内に操作して、当該二特異性抗体構築物の調製を容易にし得る。例えば、重鎖対合設計及び／または軽鎖対合設計を二特異性抗体構築物内に操作して、重鎖及び軽鎖の対合を促進して、所望の二特異性抗体を形成し得る。重鎖対合設計の例は、本明細書における他の箇所で記載される。軽鎖対合設計の例は当技術分野において公知であり、例えば国際特許公報第ＷＯ２０１４／０８２１７９号、第ＷＯ２０１５／１８１８０５号、及び第ＷＯ２０１７／０５９５５１号に記載されている。
安定化したキメラＦａｂを調製する方法
上で記載されるように、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂは、ＣＨ１ドメイン配列及びＶＨドメイン配列を含む重鎖（重鎖Ｆａｂ配列）と、キメラ免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド（Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖）構築物とを含み、当該重鎖Ｆａｂ配列及び当該Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物は、標的抗原上のエピトープに結合するＦａｂ領域を形成する。Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物のＶラムダ配列は、親キメラＦａｂと比べて、安定化したキメラＦａｂの熱安定性を増加させる１つまたは複数の安定化アミノ酸改変を含む。
したがって、典型的には、安定化したキメラＦａｂを作り上げる２つのポリペプチド配列：重鎖Ｆａｂ配列及びＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物、が存在する。一部の実施形態において、安定化したキメラＦａｂを含む抗体構築物は、単一特異性の二価抗体としてまたは二特異性抗体として調製され得る。これらの実施形態において、典型的には、２つの免疫グロブリン重鎖ポリペプチド配列（Ｆｃ領域を作り上げる配列を含む）またはそのフラグメント、及びその少なくとも一方がＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物である２つの免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド配列、という４つの個別のポリペプチド配列が存在する。これらポリペプチド配列のすべては、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ポリペプチドと呼ばれ、当技術分野において公知の組み換えＤＮＡ技術を用いて容易に調製され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄ ｅｄ．，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ ｅｄ．，１９８９）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，４ｔｈ ｅｄ．，１９９９）；及びＧｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２ｎｄ ｅｄ．，１９９８）に記載されるものなどの標準的な技法が、組み換え核酸法、核酸合成、細胞培養、導入遺伝子の組み入れ、及び組み換えタンパク質発現に用いられ得る。
安定化したキメラＦａｂを作り上げる、親ラムダ抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖、またはカッパ軽鎖配列のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列は当技術分野において公知である、あるいは核酸及び／またはタンパク質シーケンシング法を用いて容易に決定され得る。
したがって、安定化したキメラＦａｂの重鎖Ｆａｂ配列及びＶラムダ－ＣカッパキメラＦａｂ軽鎖構築物をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットも提供される。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂのＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物をコードするポリヌクレオチドが提供される。そのようなポリヌクレオチドには、一本鎖及び二本鎖形態の両方でのＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに対応する相補的配列が含まれる。ＤＮＡには、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びその組み合わせが含まれる。ポリヌクレオチドには、全長遺伝子またはｃＤＮＡ分子、ならびにそのフラグメントの組み合わせが含まれる。
本明細書において記載される操作された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、カセットもしくはＰＣＲ変異導入または当技術分野において周知の他の技法を用いた、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異導入によって調製して、操作された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡを産生し得、その後、本明細書において概説される細胞培養において組み換えＤＮＡを発現させる。しかしながら、操作された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、確立された技法を用いたインビトロ遺伝子合成によっても調製され得る。
当業者によって解されるであろうように、遺伝子コードの縮重に起因して、極めて多数のポリヌクレオチドが作製され得、そのすべては、本明細書において記載される操作された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする。ゆえに、特定のアミノ酸配列が同定されている場合、当業者であれば、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させないやり方で１つまたは複数のコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の異なるポリヌクレオチドを作製し得るであろう。
上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形態の発現システム及び構築物も提供される。そのような発現システムまたは構築物を含む宿主細胞も提供される。
典型的に、宿主細胞において用いられる発現ベクターは、プラスミド維持のための、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含有する。集合的に「隣接配列」と呼ばれるそのような配列は、ある特定の実施形態において、典型的に、以下のヌクレオチド配列：プロモーター、１種または複数種のエンハンサー配列、複製の起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現される対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカーエレメントのうちの１つまたは複数を含む。ベクターは多シストロン性であり得る、すなわち安定化したキメラＦａｂの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドのうちの２種もしくはそれを上回る種類を発現する、または安定化したキメラＦａｂはベクターのセットによって発現され得、各ベクターは当該ポリヌクレオチドのうちの１種もしくは複数種を発現する。抗体構築物は、多シストロン性ベクターと、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の一方をコードする単一ポリヌクレオチドを含むベクターとの組み合わせを含むベクターのセットを用いても発現され得る。
一部の実施形態において、ベクターは、「タグ」をコードする配列、すなわちポリペプチドコード配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有し得；当該オリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（６Ｈｉｓなど）、またはＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、もしくはｍｙｃなどの別の「タグ」をコードし、それに対する市販の抗体が存在する。このタグは、典型的に、ポリペプチドの発現があると当該ポリペプチドに融合され、宿主細胞からの当該ポリペプチドのアフィニティー精製または検出のための手段として働き得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリックスとしてタグに対する抗体を用いたカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。任意で、タグは、ペプチダーゼ切断などの様々な手段によって、精製されたポリペプチドからその後除去され得る。
ベクターは、典型的に、宿主生物によって認識されかつポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動的に連結されているプロモーターを含有する。プロモーターとは、構造遺伝子の転写を制御する、当該構造遺伝子の開始コドンに対して上流（すなわち、５’）（一般的に、約１００～１０００ｂｐ以内）に位置する非転写配列である。プロモーターは、慣習的に２つのクラス：誘導性プロモーター及び構成的プロモーターのうちの一方にグループ分けされる。誘導性プロモーターは、栄養素の存在もしくは非存在または温度の変化などの培養条件におけるある変化に応答して、それらの制御下でＤＮＡからの増加したレベルの転写を始動する。その一方で、構成的プロモーターは、それらが作動的に連結している遺伝子を、一様に、つまり遺伝子発現に対してほとんどまたは全くの制御なしで転写する。多様な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。
酵母宿主、細菌宿主、及び昆虫宿主との使用のための適切なプロモーターは、当技術分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに有利に用いられる。哺乳類宿主細胞との使用のための適切なプロモーターは周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）を含むが、それらに限定されるわけではない。他の適切な哺乳類プロモーターには、異種哺乳類プロモーター、例えば熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが含まれる。
ベクターは、当該ベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれた場合に発現を促す１種または複数種のエレメントを含有し得る。例には、ＥＡＳＥエレメント（Ａｌｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．１９：１４３３－３８）及びマトリックス付着領域（ＭＡＲ）が含まれる。ＭＡＲは、クロマチンの構造組織化を媒介し、組み込まれたベクターを「位置」効果から防護し得る。ゆえに、ベクターを用いて安定なトランスフェクタントを創出する場合、ＭＡＲは特に有用である。いくつかの天然及び合成ＭＡＲ含有核酸が当技術分野において公知である、例えば米国特許第６，２３９，３２８号；第７，３２６，５６７号；第６，１７７，６１２号；第６，３８８，０６６号；第６，２４５，９７４号；第７，２５９，０１０号；第６，０３７，５２５号；第７，４２２，８７４号；第７，１２９，０６２号。
ベクターを構築し、ポリヌクレオチドを当該ベクターの適正な部位に挿入した後、完成したベクターを、増幅及び／またはポリペプチド発現のための適切な宿主細胞内に挿入し得る。選択された宿主細胞内への発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、インフェクション、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、または他の公知の技法を含めた周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、一部には、用いられる対象となる宿主細胞のタイプの機能である。宿主細胞は一過性にトランスフェクトされ得る、または宿主細胞は安定にトランスフェクトされ得る。これらの方法及び他の適切な方法は当業者に周知であり、例えば上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１に明記されている。
組み換えタンパク質の長期にわたる高収量の産生のために、安定な発現がしばしば好まれる。例えば、安定化したキメラＦａｂの操作された重鎖及び軽鎖を安定に発現する細胞株が調製され得る。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞を、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位等）によって制御されるＤＮＡ、及び選択可能マーカーで形質転換し得る。外来性ＤＮＡまたはポリヌクレオチドの導入後、操作された細胞を富化培地中で１～２日間成長させ、次いで選択培地に切り替える。組み換えプラスミド内の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がそれらの染色体にプラスミドを安定に組み込みかつ成長して焦点を形成するのを可能にし、それを今度はクローン化し得及び細胞株に拡張し得る。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２６）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子を含むがそれらに限定されない、いくつかの選択システムが用いられ得、それぞれｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－、またはａｐｒｔ－細胞において採用され得る。また、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ ３０：１４７）遺伝子に対する選択の基礎として、抗代謝産物耐性が用いられ得る。
宿主細胞は、適当な条件下で培養された場合、安定化したキメラＦａｂを産生し、それはその後培養培地から回収され得る（宿主細胞が培地中にそれを分泌する場合）、またはそれを産生する宿主細胞から直接回収され得る（それが分泌されない場合）。適当な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要であるポリペプチド改変（グリコシル化またはリン酸化など）、及び生物学的に活性な分子へのフォールディングのしやすさなど、様々な因子に依存する。宿主細胞は、真核性または原核性であり得る。例えば、細菌系における発現はグリコシル化されていない産物を産生し、酵母における発現はグリコシル化された産物を産生する。遺伝子産物の一次転写産物の適正なプロセシングのための細胞機構（例えば、グリコシル化及びリン酸化）を所有する真核生物宿主細胞が用いられ得る。
発現のための宿主として使用可能な哺乳類細胞株は当技術分野において周知であり、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を含むがそれらに限定されるわけではなく、当技術分野において公知の、発現系において用いられる任意の細胞株を用いて、本明細書において記載される組み換えポリペプチドを作製し得る。一般的に、宿主細胞を、安定化したキメラＦａｂをコードするＤＮＡを含む組み換え発現ベクターで形質転換する。採用され得る宿主細胞には、原核生物、酵母、またはより高等な真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えばＥ．ｃｏｌｉまたはｂａｃｉｌｌｕｓが含まれる。より高等な真核細胞には、昆虫細胞、及び哺乳類起源の確立された細胞株が含まれる。適切な哺乳類宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ－７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくは血清不含培地中で成長するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯ及び関連細胞株などのそれらの誘導体（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、及びＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１によって記載される、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株、２９３、２９３ＥＢＮＡ、もしくはＭＳＲ２９３などのヒト胎児腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常２倍体細胞、初代組織のインビトロ培養に由来する細胞系統、初代移植片、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。あるいは、酵母などのより下等な真核生物において、または細菌などの原核生物において、ポリペプチドを産生することが可能である。適切な酵母には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ系統、Ｃａｎｄｉｄａ、または異種ポリペプチドを発現し得る任意の酵母系統が含まれる。適切な細菌系統には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種ポリペプチドを発現し得る任意の細菌系統が含まれる。
安定化したキメラＦａｂを酵母または細菌において産生する場合、機能的産物を獲得するために、そこで産生された産物を、例えば適当な部位のリン酸化またはグリコシル化によって改変することが望ましくあり得る。そのような共有結合性付着は、公知の化学的または酵素的方法を用いて達成され得る。抗体構築物は、ポリヌクレオチドのセットを１つまたは複数の昆虫発現ベクターにおける適切な制御配列に作動的に連結し、かつ昆虫発現系を採用することによっても産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料及び方法は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．からキット形態で市販されており（ＭａｘＢａｃ（商標）キット）、そのような方法は、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）、及びＬｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）に記載されるように当技術分野において周知である。細菌、真菌、酵母、及び哺乳類細胞宿主との使用のための適当なクローニング及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５）によって記載されている。
ある特定の実施形態において、無細胞タンパク質発現系を利用して、生きた細胞を使用せずに、ポリヌクレオチドのセットからポリペプチド（例えば、重鎖及び軽鎖ポリペプチド）を共発現させ得る。その代わりに、ＤＮＡをＲＮＡに転写する及びＲＮＡをタンパク質に翻訳するのに必要とされるすべての構成要素（例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、酵素、補因子、アミノ酸）は、インビトロでの使用のための溶液中に提供される。ある特定の実施形態において、インビトロ発現は、（１）重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする遺伝子鋳型（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）、ならびに（２）必要な転写及び翻訳分子機構を含有する反応液、を要する。ある特定の実施形態において、細胞抽出物は、反応液の構成要素、例えばｍＲＮＡ転写のためのＲＮＡポリメラーゼ、ポリペプチド翻訳のためのリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノ酸、酵素補因子、エネルギー源、及び適正なタンパク質フォールディングに必須の細胞構成要素を実質的に供給する。無細胞タンパク質発現系は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、またはその組み合わせに由来する溶解物を用いて調製され得る。そのような細胞溶解物は、翻訳に要される酵素及びビルディングブロックの正しい組成及び割合を提供し得る。一部の実施形態において、細胞膜を除去して、細胞の細胞質構成要素及び細胞小器官構成要素のみを残す。
Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３０：１１８５－１１９４に総説されるように、いくつかの無細胞タンパク質発現系が当技術分野において公知である。例えば、原核または真核細胞に基づく、無細胞タンパク質発現系が使用可能である。原核生物無細胞発現系の例には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のものが含まれる。例えばウサギ網状赤血球、小麦胚芽、及び昆虫細胞からの抽出物に基づく、真核生物無細胞タンパク質発現系が使用可能である。そのような原核生物及び真核生物無細胞タンパク質発現系は、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑｉａｇｅｎ、及びＮｏｖａｇｅｎなどの会社から市販されている。当業者であれば、互いと対合し得るポリペプチド（例えば、重鎖及び軽鎖ポリペプチド）を産生する適切な無細胞タンパク質発現系を容易に選択し得るであろう。さらに、無細胞タンパク質発現系に、シャペロン（例えば、ＢｉＰ）及びイソメラーゼ（例えば、ジスルフィドイソメラーゼ）を補給して、ＩｇＧフォールディングの効率も向上させ得る。
重鎖及び軽鎖の共発現
上で記されるように、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂの操作された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を哺乳類細胞において共発現させ得る。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂの免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を宿主細胞において共発現させる。ゆえに、少なくとも１つの安定化したキメラＦａｂ、第二のＦａｂ、及びＦｃ足場を含む二特異性抗体構築物の場合、２本の免疫グロブリン重鎖（Ｈ１及びＨ２）及び２本の免疫グロブリン軽鎖（Ｌ１及びＬ２）を宿主細胞において共発現させて、第一のエピトープに結合するＨ１Ｌ１ペア及び第二のエピトープに結合するＨ２Ｌ２ペアを形成する。しかしながら、４本すべての鎖を発現する単一クローン細胞株または一過性細胞株の使用に依存しない、二特異性抗体構築物を産生する代替的な方法も当技術分野において公知である（Ｇｒａｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ｍＡｂｓ ５，９６２；Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２０，２０４）。これらの方法は、二特異性抗体の形成に関与する２対の軽鎖及び重鎖の、酸化還元条件下での産生後アーム交換に依存する（酸化還元産生）。この手法では、Ｈ１Ｌ１及びＨ２Ｌ２ヘテロ二量体を２種の異なる細胞株において発現させて、当該２種のヘテロ二量体を独立して産生し得る。その後、２本の固有の重鎖Ｈ１及びＨ２の再会合を達成する選択酸化還元条件下で当該２種のヘテロ二量体を混合して、Ｈ１Ｌ１Ｈ２Ｌ２を含む二特異性抗体構築物を形成する。
一部の実施形態において、２本の固有の重鎖及び２本の固有の軽鎖の共発現により生じる所望の二特異性抗体の量は、本明細書における他の箇所で記載されるＨ１及びＨ２間の優先的対合を促進する、２本の重鎖のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸改変によって増加する。一部の実施形態において、２本の固有の重鎖及び２本の固有の軽鎖の共発現により生じる所望の二特異性抗体の量は、重鎖及び軽鎖間の優先的対合を促進する、これらの鎖のＣＨ１とＣＬドメインにおける及び／またはＶＨとＶＬドメインにおけるアミノ酸改変によって増加する。後者のアミノ酸改変の例は、国際公報第ＷＯ２０１４／０８２１７９号及び第ＷＯ２０１５／１８１８０５号に記載されている。
優先的対合は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ポリペプチド内への、ＣＨ１／ＣＬ及び／またはＶＨ／ＶＬドメインにおけるアミノ酸改変の組み入れによって主に推進されるものの、正しく対合したヘテロ二量体の量は、実施例において示されるように、互いに対する、各ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの比率を変動させることによってさらに最適化され得る。
安定化したキメラＦａｂの試験
各安定化したキメラＦａｂのそのそれぞれの抗原に対するアフィニティーは、下で記載されるように試験され得る。各安定化したキメラＦａｂの熱安定性も、下で記載されるように試験され得る。
熱安定性
安定化したキメラＦａｂの熱安定性は、当技術分野において公知の方法に従って判定され得る。各安定化したキメラＦａｂの融解温度は、その熱安定性を指し示す。安定化したキメラＦａｂの融解温度は、示差走査熱量測定法（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２０：１９５２－６０；Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６８：４７－５２）及び示差走査蛍光測定法（Ｎｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２（９）：２２１２－２１）などの技法を用いて測定され得る。後者の方法は、「融解温度」、すなわちＴｍの観点における熱安定性の測定を提供する。あるいは、安定化したキメラＦａｂの熱安定性は、円偏光二色性（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｓｃｉ ４０：３４３－９）を用いて測定され得る。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂまたは安定化したキメラＦａｂを含む抗体の熱安定性は、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定される。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂまたは安定化したキメラＦａｂを含む抗体の熱安定性は、示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）によって測定される。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂまたは安定化したキメラＦａｂを含む抗体の熱安定性は、ＤＳＣまたはＤＳＦによって測定される。
抗原に対するアフィニティー
安定化したキメラＦａｂのそれらのそれぞれの抗原に対する結合アフィニティー、及び相互作用のオフレートは、当技術分野において周知の方法に従った競合結合アッセイによって判定され得る。競合結合アッセイの１つの例は、漸増量の非標識抗原の存在下における標識抗原のインキュベーション（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉと関心対象の分子（例えば、本明細書で記載される安定化したキメラＦａｂ））、及び標識リガンドに結合している分子の検出を含むラジオイムノアッセイである。抗原に対する安定化したキメラＦａｂのアフィニティー、及び結合オフレートは、スキャッチャード分析による飽和データから判定され得る。
抗原への本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂの結合に関する速度論的パラメーターは、当技術分野において公知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ速度論的分析）を用いても判定され得る。ＳＰＲに基づく技術の総説に関しては、Ｍｕｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２：７７－９１；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８２：３０３－２３；Ｆｉｖａｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９７－１０１；Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：５４－６１を参照されたい。加えて、安定化したキメラＦａｂが抗原に結合し得る能力を査定する方法において、米国特許第６，３７３，５７７号；第６，２８９，２８６号；第５，３２２，７９８号；第５，３４１，２１５号；第６，２６８，１２５号に記載される、タンパク質－タンパク質相互作用を測定するためのＳＰＲ機器及びＳＰＲに基づく方法のいずれかが企図される。ＦＡＣＳ及びバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ、Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，ｔｈｅ Ｏｃｔｅｔ．Ａｂｄｉｃｈｅ，Ｙ．Ｎ．；Ｍａｌａｓｈｏｃｋ，Ｄ．Ｓ．；Ｐｉｎｋｅｒｔｏｎ，Ａ；Ｐｏｎｓ，Ｊ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，３７７（２），２０９－２１７に記載される）を含めた、当技術分野において公知の他の方法を用いても、アフィニティーを測定し得る。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂまたは安定化したキメラＦａｂを含む抗体が標的抗原に結合し得る能力は、ＳＰＲによって測定される。１つの実施形態において、安定化したキメラＦａｂまたは安定化したキメラＦａｂを含む抗体のその標的抗原に対するアフィニティーは、ＳＰＲによって測定される。
薬学的組成物
本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂまたは抗体構築物を含む薬学的組成物も本明細書において提供される。そのような組成物は、治療上有効量の安定化したキメラＦａｂ、及び薬学的に許容されるキャリアを含む。具体的な実施形態において、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって認可された、または米国薬局方もしくは動物における及びより特にヒトにおける使用のための他の一般的に認められた薬局方においてリストに挙げられたことを意味する。「キャリア」という用語は、それとともに治療法が施される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的キャリアは、落花生油、大豆油、鉱油、ごま油など、石油、動物、植物、または合成起源のものを含めた、水及び油などの無菌の液体であり得る。薬学的組成物が静脈内投与される場合、水が好ましいキャリアである。特に注射液に関して、生理食塩溶液ならびに水性デキストロース及びグリセロール溶液も液体キャリアとして採用され得る。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。組成物は、所望の場合、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態を取り得る。組成物は、トリグリセリドなどの伝統的な結合剤及びキャリアとともに、坐薬として製剤化され得る。経口製剤は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、患者への適正な投与のための形態を提供する適切な量のキャリアとともに、好ましくは精製された形態での治療上有効量の化合物を含有する。製剤は、投与の様態に合うべきである。
ある特定の実施形態において、安定化したキメラＦａｂまたは安定化したキメラＦａｂを含む抗体構築物を含む組成物は、人間への静脈内投与に適応した薬学的組成物として、ルーチン手順に従って製剤化される。典型的に、静脈内投与のための組成物は、無菌の等張水性緩衝液の状態の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤、及び注射の部位における痛みを和らげるリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。一般的に、成分は、活性剤の分量を表示したアンプルまたはサシェなどの密閉容器中に、例えば乾燥した凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、別個にまたは単位剤形中に一緒に混合して供給される。組成物が点滴によって投与されるべきである場合、それは、無菌の薬学的等級の水または生理食塩水を含有する点滴ボトルで分注され得る。組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、投与前に成分が混合され得るように提供され得る。
ある特定の実施形態において、本明細書において記載される組成物は、中性のまたは塩の形態として製剤化される。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどのアニオンで形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどのカチオンで形成されるものが含まれる。
治療用タンパク質の異常な発現及び／または活性に伴う疾患または障害の治療、阻害、及び予防において有効であろう本明細書において記載される組成物の量は、標準的臨床技法によって決定され得る。加えて、インビトロアッセイを任意で採用して、最適な投薬量域を同定するのを助け得る。製剤において採用されるべき精確な用量は、投与の経路及び疾患または障害の重篤度にも依存し、実践者の判断及び各患者の環境に従って決められるべきである。有効な用量は、インビトロまたは動物モデル試験システムから導き出された用量応答曲線から推定される。
使用
上で記載されるように、安定化したキメラＦａｂ及び安定化したキメラＦａｂを含む抗体構築物は、１種または複数種の親抗体から獲得される。したがって、それらは、親抗体または親抗体の組み合わせが用いられる対象における同じ疾患、障害、または感染症の治療または予防において用いられ得る。１つの実施形態において、対象は哺乳類である。１つの実施形態において、対象はヒトである。
別の実施形態において、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂ及び安定化したキメラＦａｂを含む抗体構築物は、対象におけるがん、自己免疫疾患、炎症性障害、または感染性疾患の治療または予防のために、当技術分野において公知の他の治療剤と組み合わせても利用され得る。具体的な実施形態において、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂ及び安定化したキメラＦａｂを含む抗体構築物は、例えば、当該分子と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させるのに役立つ及び免疫応答を増加させるのに役立つ、モノクローナル抗体もしくはキメラ抗体、リンホカイン、または造血成長因子（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－３、及びＩＬ－７など）と組み合わせて用いられ得る。本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂ及び安定化したキメラＦａｂを含む抗体構築物は、例えば抗がん剤、抗炎症剤、または抗ウイルス剤など、疾患、障害、または感染症を治療するために用いられる１種または複数種の薬物と組み合わせても利用され得る。
別の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、本明細書において記載されるように、様々な形式の抗体構築物の調製において用いられ得る。ある特定の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、二特異性抗体構築物の調製において用いられ得る。そのような使用の例は、実施例１４に記載される。
さらに別の実施形態において、安定化したキメラＦａｂは、ラムダ抗体（すなわち、免疫グロブリン重鎖及びラムダ軽鎖を含む親ラムダ抗体）、またはこれが望ましい場合にはラムダＦａｂの安定性を増加させる方法において用いられ得る。例えば、親ラムダ抗体の安定性を増加させるために、当該親ラムダ抗体のＶラムダ配列と、Ｃカッパ配列とを含むＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖を調製し得、当該Ｖラムダ配列は、本明細書において記載される安定化アミノ酸改変のうちの１つまたは複数を含む。次いで、当該Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖を用いて、当該Ｖラムダ配列を含む抗体を調製し得る。例えば、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖を免疫グロブリン重鎖とともに共発現させて、親ラムダ抗体と比較して増加した熱安定性を有するキメラ抗体を獲得し得る。あるいは、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖を、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む免疫グロブリン重鎖フラグメントとともに共発現させて、親ラムダＦａｂと比較して増加した安定性を有するキメラＦａｂを獲得し得る。
下記に、本明細書において記載される安定化したキメラＦａｂを作製する及び使用するための具体的な実施形態の例がある。実施例は、単に例示目的のために与えられるものであり、決して本開示の範囲を限定することを意図されるわけではない。用いられる数字（例えば、量、温度等）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、いくらかの実験的な誤差及び偏差は当然認められるべきである。
本明細書において記載される構築物及び方法は、別様に示されていない限り、当技術分野の技能の範囲内にあるタンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技法の従来的方法を採用して調製され得及び行われ得る。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ．Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。
実施例１：Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖におけるＶラムダ及びＣカッパ接合部分でのアミノ酸保存及び構造ガイドによる設計
多くの場合、キメラ軽鎖を含有するＦａｂ（キメラＦａｂ）は、野生型軽鎖を含有するＦａｂと比較して、熱安定性の下降を呈することが観察されている。それゆえ、構造ガイドによる及びアミノ酸保存ガイドによる手法を主として用いて、キメラ軽鎖を含有するＦａｂの熱安定性を向上させるための解決策を立案し、当該キメラ軽鎖は可変ラムダドメイン及び定常カッパドメインから構成された。このタイプのキメラ軽鎖は、本明細書においてＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖（ＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖）と呼ばれ、このタイプのキメラ軽鎖を含有するキメラＦａｂは、本明細書においてＶＬ－ＣＫキメラＦａｂと呼ばれる。ＶＬ－ＣＫキメラＦａｂの描写は図１に示されている。野生型ラムダＦａｂ（ＣＡＴ－２２００）のものと比較した、代表的なＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖の配列が図２に示されている。
構造ガイドによる分析を、主として、カッパ軽鎖を含有するヒトまたはヒト化Ｆａｂの代表的なＸ線結晶構造に対して、及びラムダ軽鎖を含有するヒトまたはヒト化Ｆａｂに対して、ならびにＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖を含有するいくつかの使用可能なＦａｂに対して実施した。代表的なカッパ及びラムダＦａｂ構造を、以下のやり方で同定した。関心対象の接合部分で接触している残基の数についての分析、ならびに接触残基の数についての残基あたりの分析を提供するインシリコツールを用いた、ＩＭＧＴ（登録商標）によって主催されるＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅにおいて見い出される非冗長のラムダ及びカッパヒト／ヒト化Ｆａｂ構造のセットに対して、軽鎖における可変：定常ドメイン接合部分のドメイン間接触についての分析を実施した。この分析により、カッパＦａｂにおける分布と比較して、ラムダＦａｂ軽鎖における可変：定常接合部分に接触の数の異なる分布が存在することが判定された。抗体Ｄ３Ｈ４４及びＣＡＴ－２２００のＦａｂを、分析のために、それぞれカッパＦａｂ代表及びラムダＦａｂ代表として選定した。これらのＦａｂは、それぞれカッパ及びラムダＦａｂ構造に関する、可変：定常ドメイン接合部分での接合部分接触の平均数を呈示した。次いで、これら代表的なカッパ及びラムダＦａｂ構造の軽鎖における可変：定常接合部分の目視分析を行って、そのような接合部分における重要な残基を同定した。いくつかの使用可能なＶラムダ－ＣカッパＦａｂ構造についての目視分析と合わせて、それをさらに用いて、キメラ軽鎖における可変：定常接合部分における任意の不適合性を同定した。上記の分析は、インシリコツールを用いて獲得される残基保存分析及び残基あたりの接触分析によって支援された。非冗長のヒト及びヒト化カッパ及びラムダ配列の配列アライメントを実施することによって、可変：定常ドメイン軽鎖接合部分に対して残基保存分析を実施して（ＩＭＧＴデータベース）、接合部分での関心対象の箇所における最もよく見られる残基タイプ（重要な残基）を同定した。
上記の分析は、ラムダ軽鎖と比較した、カッパ軽鎖の可変：定常ドメイン接合部分における差異を強調し、キメラ軽鎖のＶラムダ及びＣカッパドメイン間のキメラ接合部分における準最適な適合性が、キメラ軽鎖を含有するＦａｂの熱安定性の観察された減少と関係している可能性が高いという仮説につながった。箇所８３、８５、及び１０５（Ｋａｂａｔに従って番号付けされており、表１及び図３に示される）を含めた、Ｖラムダ：Ｃカッパ接合部分におけるいくつかのホットスポット残基を同定した。実施例を通じて、Ｆａｂ領域におけるアミノ酸箇所は、別様に示されていない限り、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って識別される。Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖の可変ドメインにおけるアミノ酸置換のいくつかのセット（「設計」と呼ばれる）は、図１に示されるように、可変カッパ及び定常カッパドメイン（Ｖカッパ－Ｃカッパ）間で観察される接合部分を模倣することによってＶラムダ－Ｃカッパ接合部分の適合性を向上させ、ゆえにそれぞれのキメラＦａｂの熱安定性を向上させると提案された。それゆえ、キメラＦａｂ変種は、熱安定性を向上させるように改変されていない重鎖と、ＶＬ－ＣＫキメラＦａｂの熱安定性を向上させると提案されたアミノ酸置換を含むＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖とを含んだ。
設計の評価のために、３つの代表的なＶＬ－ＣＫキメラＦａｂ試験システムを選定した。これらの試験システムは、以下の基準：ａ）実践的試験を可能にするのに十分な収量で産生され得る能力、ｂ）親野生型抗体のＦａｂと比較して、ＶＬ－ＣＫキメラＦａｂ形式において減少した熱安定性を呈すること、ｃ）親野生型抗体のものに匹敵するアフィニティーで抗原に結合し得る能力、及びｄ）個別のヒトフレームワーク（具体的には、ヒトＶＨ及びラムダＶＬサブグループ）の網羅、を満たした。代表的なＶＬ－ＣＫキメラＦａｂは、以下の抗体：ＣＡＴ－２２００ Ｆａｂ（抗ＩＬ１７；ｈＩＧＨＶ３、ｈＩＧＬＶ６）、Ｈ３（抗ＨＥＲ３；ｈＩＧＨＶ３、ｈＩＧＬＶ２）、及びＥＰ６ｂ＿Ｂ０１（抗Ｆａｓ；ｈＩＧＨＶ４、ｈＩＧＬＶ１）由来のＶラムダドメインを有するキメラ軽鎖を含有した。Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖構築物は、箇所Ｌ１０６Ａで終結するラムダ可変ドメイン配列と、箇所Ｒ１０８から開始する、ＩＧＫＣ＊０１（最もよく見られるヒトカッパアレル配列の１つ）に相当するカッパ定常ドメイン配列とから構成された。図２は、この場合にはＣＡＴ－２２００ Ｆａｂに関して、キメラ軽鎖配列の例を提供している。参照のために、表１は、Ｋａｂａｔに従い、ＣＡＴ－２２００、Ｈ３、及びＥＰ６ｂ＿Ｂ０１に関する軽鎖可変ドメインに対するアミノ酸の番号付けを提供している。
実施例２：安定性最適化設計
実施例１に記載される分析に基づき、いくつかの設計は、ＶＬ－ＣＫキメラＦａｂの熱安定性を向上させると提案された。Ｖラムダドメインにおけるホットスポット箇所８３、８５、及び１０５での、ならびに他の二次的箇所でのアミノ酸置換を選択して、カッパ可変ドメインにおけるそれらの箇所で最も保存されたアミノ酸タイプ（例えば、８３Ｆ）、ならびにあまり保存されていないアミノ酸タイプ（例えば、８３Ｖ／８３Ｉ／８３Ａ）を導入した。主たるホットスポットとして、箇所８３におけるアミノ酸置換は、実施例において「設計テーマ」、例えば「８３Ｆテーマ」、「８３Ｖテーマ」、「８３Ｉテーマ」、または「８３Ａテーマ」と呼ばれるものを規定する。表３に示されるように、合計３９個の設計を試験のために提案した。熱安定性を向上させるためにＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖に導入されるアミノ酸置換は、本明細書において「安定性最適化設計」または単に「設計」と呼ばれる。他の箇所で記されるように、設計において置換されるアミノ酸箇所は、本出願を通じて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムを用いて識別される。表１は、ＣＡＴ－２２００、Ｈ３、及びＥＰ６ｂ＿Ｂ０１ラムダ軽鎖に関する可変ドメインのＫａｂａｔ番号付けの参照を提供している。
表３に列挙された３９個の安定性最適化設計を、以下の実施例において記載されるように、ＶＬ－ＣＫキメラＦａｂの安定性を向上させ得るそれらの能力について試験した。
実施例３：対照構築物及び安定性最適化設計を有する構築物の調製
安定性最適化設計を、親抗体ＣＡＴ－２２００、Ｈ３、及びＥＰ６ｂ＿Ｂ０１に基づき、その両方とも本実施例において単一特異性形式であるＦａｂ形式及びＭａｂ形式で試験した（留意すべきは、ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１システムはＭａｂ形式で試験されなかったことである）。Ｆａｂ形式を、設計の初回ラウンドを試験するための簡易システムとして用いた。選択された設計を、その後にＭａｂ形式で、完全なサイズの抗体の背景において試験した。
Ｆａｂ形式の構築物は、ＣＨ１及びＶＨドメインを含む短縮重鎖と、親ラムダ軽鎖（野生型Ｆａｂ対照）またはＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖（ＶＬ－ＣＫキメラＦａｂ）とを含み、当該短縮重鎖及び当該ＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖のＶラムダドメインは親抗体由来のものであり、当該ＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖のＣカッパドメインは、ＩＧＫＣ＊０１に相当するカッパ定常ドメイン配列である。ＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖における安定性最適化設計を有するＦａｂ形式の構築物は、「設計されたキメラＦａｂ」と呼ばれる（このタイプの構築物の描写に関しては、図１を参照されたい）。
Ｍａｂ形式の構築物は、親抗体に相当する２本の同一の全長重鎖と、２本の同一の親ラムダ軽鎖（野生型Ｍａｂ対照）または２本の同一のＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖とを有し、各ＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖のＶラムダドメインは親抗体由来のものであり、Ｃカッパドメインは、ＩＧＫＣ＊０１に相当するカッパ定常ドメイン配列である（キメラＭａｂ）。ＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖における安定性最適化設計を有するＭａｂ形式の構築物は、「設計キメラＭａｂ」と呼ばれる。図４は、これらＭａｂ構築物の例示的な構造を提供している。
Ｆａｂ形式の構築物の調製
２つのタイプのＦａｂ形式対照を設計の評価に用いた。親抗体ＣＡＴ－２２００、Ｈ３、及びＥＰ６ｂ＿Ｂ０１に基づく「野生型」ラムダＦａｂ構築物は、短縮非改変重鎖（ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有する）、及び親抗体由来の野生型ラムダ軽鎖を含有した。キメラＦａｂ構築物は、非改変短縮重鎖、及び親ＶラムダドメインとＩＧＫＣ＊０１に相当する配列を有するＣカッパドメインとを有するＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖を含有した。図１は、野生型ラムダＦａｂ構築物（ＷＴラムダＦａｂ）及びキメラＦａｂ構築物（Ｖλ－ＣκキメラＦａｂ）の描写を表している。
ＣＡＴ－２２００親抗体の短縮重鎖、野生型軽鎖、及びＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖を以下のように調製した。ＣＡＴ－２２００ Ｆａｂ軽鎖（２ＶＸＳ Ｌ鎖、配列番号：８）、及び上部ＩｇＧ１ヒンジ「ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ」（配列番号：３０）を含む短縮重鎖（２ＶＸＳ Ｈ鎖、配列番号：７）のタンパク質配列を、ＰＤＢエントリー２ＶＸＳ ９から取り出し、ＤＮＡに逆翻訳（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｌａｔｅ）し、哺乳類発現のためにコドン最適化し、及び遺伝子合成した（それぞれ配列番号：２３及び２２）。図２に示されるように、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖は、箇所Ｌ１０６Ａで終結するＣＡＴ－２２００ Ｖラムダドメイン配列と、Ｃカッパ配列の箇所Ｒ１０８からの、ＩＧＫＣ＊０１に相当するＣカッパドメイン配列とから構成された。ＣＡＴ－２２００ Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖に対するタンパク質配列は配列番号：９に明記されており、ＤＮＡ配列は配列番号：２４に明記されている。
Ｈ３親抗体の短縮重鎖、野生型軽鎖、及びＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖を以下のように調製した。Ｈ３抗体ＶＬドメインのタンパク質配列を、米国特許第８３２９８７３号の配列番号：４、残基１５６～２６７から獲得し、この抗体のＶＨドメインのタンパク質配列を、同じ特許の配列番号：４、残基２３～１４０から獲得した。ＶＨドメイン配列をＩＧＨＧ１＊０１のＣＨ１ドメイン配列（配列番号：３１）に付け加えて、上部ＩｇＧ１ヒンジ「ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ」（配列番号：３０）を含む、Ｆａｂに対する短縮重鎖に対するタンパク質配列（配列番号：１）を獲得した。ＶＬドメイン配列をＩＧＬＣ２のラムダＣＬ配列に付け加えて、Ｈ３抗体に関する「野生型」軽鎖に対するタンパク質配列（配列番号：２）を獲得した。これらの配列をＤＮＡに逆翻訳し、哺乳類発現のためにコドン最適化し、及び遺伝子合成した（軽鎖に関しては配列番号：１７、及び短縮重鎖に関しては配列番号：１６）。Ｈ３ Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖に対するタンパク質配列を、ＣＡＴ－２２００抗体に関して記載されるように獲得し、結果として生じたアミノ酸配列は配列番号：３に明記されている。Ｈ３ ＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号：１８に明記されている。
ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１親抗体の短縮重鎖、野生型軽鎖、及びＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖を以下のように調製した。ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１ Ｆａｂ軽鎖（３ＴＨＭ Ｌ鎖、配列番号：５）、及び上部ＩｇＧ１ヒンジ「ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ」（配列番号：３０）を含む重鎖（３ＴＨＭ Ｈ鎖、Ｃ末端１０×Ｈｉｓタグ配列を除く、配列番号：４）のタンパク質配列を、ＰＤＢエントリー３ＴＨＭから取り出し、ＤＮＡに逆翻訳し、哺乳類発現のためにコドン最適化し、及び遺伝子合成した（それぞれ配列番号：２０及び１９）。ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１ Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖に対するタンパク質配列は、ＣＡＴ－２２００抗体に関して記載されるように獲得され、配列番号：６に明記されている。ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１ ＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、配列番号：２１に明記されている。
上で記される抗体重鎖、軽鎖、及びＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖のポリペプチド及びＤＮＡ配列は、表２に提供されている。
設計されたキメラＦａｂの安定性最適化設計に相当する軽鎖アミノ酸置換を、主として部位指向性変異導入（Ｂｒａｍａｎ Ｊ，Ｐａｐｗｏｒｔｈ Ｃ＆Ｇｒｅｅｎｅｒ Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）５７：３１－４４）によって、ＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖ＤＮＡ配列において作出した。
５’－ＥｃｏＲＩ切り取り部位－ＨＬＡ－Ａシグナルペプチド－野生型軽鎖またはＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖配列－「ＴＧＡまたはＴＡＡ終止」－ＢａｍＨ１切り取り部位－３’からなる軽鎖ベクターインサートを、ｐＴＴ５ベクター（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２；３０，Ｎｏ．２ ｅ９）にライゲーションして、軽鎖発現ベクターを産生した。結果として生じた軽鎖発現ベクターをシーケンスして、コードＤＮＡの正しいリーディングフレーム及び配列を確認した。同様に、５’－ＥｃｏＲ１制限部位－ＨＬＡ－Ａシグナルペプチド－重鎖配列（Ｔ２３８（Ｋａｂａｔ番号付け）で終結する）－「ＴＧＡまたはＴＡＡ終止」－ＢａｍＨ１切り取り部位－３’からなる重鎖ベクターインサートを、ｐＴＴ５ベクターにライゲーションして、重鎖発現ベクターを産生した。結果として生じた重鎖発現ベクターもシーケンスして、コードＤＮＡの正しいリーディングフレーム及び配列を確認した。
Ｍａｂ形式の構築物の調製
Ｆａｂ形式に関するように、２つの類似したタイプのＭａｂ形式対照が、設計：親抗体ＣＡＴ－２２００、Ｈ３、及びＥＰ６ｂ＿Ｂ０１に基づく「野生型」ラムダＭａｂ構築物の評価に用いられ、全長非改変重鎖及び親抗体由来の軽鎖を含有した。キメラＭａｂ構築物は、非改変重鎖及びキメラ軽鎖を含有した。
各Ｍａｂ対照構築物に関する野生型軽鎖及びＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖に対するタンパク質配列を、Ｆａｂ形式の構築物に関して記載されるように獲得した。「Ｆａｂ形式の構築物の調製」の節において記載される短い重鎖に相当する、ＣＡＴ－２２００抗体の全長重鎖に対する配列をＰＤＢエントリー２ＶＸＳから獲得し、それに続いて、下部ＩｇＧ１ヒンジ（「ＣＰＰＣＰ」、配列番号：３２）、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（表２における配列番号：１５）を付け加えた。この配列をＤＮＡに逆翻訳し、哺乳類発現のためにコドン最適化し、及び遺伝子合成した。Ｈ３抗体の全長重鎖に対するタンパク質配列は、同様の様式で、Ｈ３重鎖配列に基づいた。
Ｍａｂ構築物を創出するための軽鎖及びキメラ軽鎖ベクターを、上で記載されるように作出されている安定性最適化設計に相当する軽鎖アミノ酸置換を有して、Ｆａｂ構築物に対してと同じ様式で調製した。５’－ＥｃｏＲ１制限部位－ＨＬＡ－Ａシグナルペプチド－ＣＨ３のＧ４４６（ＥＵ番号付け）で終結する重鎖クローン－「ＴＧＡまたはＴＡＡ終止」－ＢａｍＨ１切り取り部位－３’からなる重鎖ベクターインサートを、ｐＴＴ５ベクターにライゲーションして、重鎖発現ベクターを産生した。上で記載されるように、結果として生じた重鎖発現ベクターもシーケンスして、コードＤＮＡの正しいリーディングフレーム及び配列を確認した。
実施例４：設計されたキメラＦａｂ及び設計されたキメラＭａｂの発現及び精製
対照Ｆａｂ及びＭａｂ構築物ならびに設計されたキメラＦａｂ及び設計されたキメラＭａｂ構築物の重鎖及び軽鎖を、ＣＨＯ－３Ｅ７細胞の５０または２００ｍｌ培養において発現させた。１．７～２×１０６個細胞／ｍｌの密度のＣＨＯ－３Ｅ７細胞を、４ｍＭグルタミン（Ｈｉｃｌｏｎｅ ｃａｔ＃ＳＨ３００３４．０１）及び０．１％ＫｏｌｉｐｈｏｒＰ１８８（Ｓｉｇｍａ ＃Ｋ４８９４）を補給したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７培地（Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ＃Ａ－１３８３５０１）中にて３７℃で培養した。５０または２００ｍｌの総容量に、それぞれ１：２．５のＤＮＡ：ＰＥＩ比でのＰＥＩ－ｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｃａｔ＃１１５－３７５）、または１：４のＤＮＡ：ＰＥＩ比でのＰＥＩ－ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ：２４７６５）を用いて、合計５０または２００μｇのＤＮＡ（例えば、２００μｇの場合に関しては、１００μｇのＦａｂ／Ｍａｂ ＤＮＡ及び１００μｇのＧＦＰ／ＡＫＴ／スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）ＤＮＡ）をトランスフェクトした。ＤＮＡ－ＰＥＩ混合物の添加の２４時間後、０．５ｍＭバルプロ酸（最終濃度）及び１％ｗ／ｖトリプトン（最終濃度）を細胞に添加し（＋Ｈｉ－ｃｌｏｎｅ ｃａｔ＃ＳＶ３００７９からの抗生物質１×）、それを次いで３２℃に移し、収穫前に７日間インキュベートした。
Ｆａｂ構築物精製
対照及び設計されたキメラＦａｂ構築物を、バッチまたは混合式バッチ：カラムクロマトグラフィーによる、ＩｇＧ－ＣＨ１ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、カタログ番号：１９４－３２０－００５）を用いたアフィニティー捕捉によって、澄んだ上清（細胞収穫後）から精製した。上清を、平衡バッファー（カルシウム、マグネシウム、及びフェノールレッドを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）＃ＳＨ３００２８．０２））中にて２０～２５％の澄んだ上清に希釈した、またはある場合にはＩｇＧ－ＣＨ１ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）（平衡バッファーであらかじめ平衡化された）とともに４℃で１６時間混合しながら直接インキュベートした。結合したタンパク質を含有する樹脂をＥｃｏｎｏカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に注いだ、またはそれを遠心分離によって回収し、９６ウェルフリットプレートに移した。両方法とも、平衡バッファーでの洗浄ステップ、それに続く１００ｍＭグリシンＨＣｌ ｐＨ２．６～２．７を用いて実施される溶出ステップ、及び１０％（ｖ／ｖ）１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０を用いたｐＨ６．０～７．０への溶出サンプルの即時中和を含んだ。タンパク質定量をＡ２８０ｎｍ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）によって実施した。
設計されたキメラＦａｂ及び／または対照が、ＩｇＧ－ＣＨ１ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）への準最適な結合プロファイルを呈した場合、これらのＦａｂを、以下のようにカッパ選択樹脂を用いて、澄んだ上清から精製した。タンパク質を、バッチ様態でまたはＰｒｏｔｅｉｎ Ｍａｋｅｒ機器（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いた充填１ｍＬ ＨｉＴｒａｐカラムを用いて、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。樹脂をＤＰＢＳ中で平衡化し、あらかじめ充填された１ｍＬ ＨｉＴｒａｐカラムに澄んだ上清を３分間／ｍＬの滞留時間で適用した、またはバッチ精製に関しては、澄んだ上清に樹脂を４℃で一晩撹拌しながら添加した。樹脂へのタンパク質結合の後、洗浄ステップを平衡バッファーを用いて実施し、その後に１００ｍＭグリシンＨＣｌ ｐＨ２．６～２．７を用いた溶出ステップが続いた。１０％（ｖ／ｖ）１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基ｐＨ９を用いて、溶出サンプルをｐＨ６～７へ直ちにｐＨ調整した。タンパク質定量をＡ２８０ｎｍ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）によって実施した。
Ｍａｂ構築物精製
澄んだ上清サンプルを、ＤＰＢＳ中で平衡化された１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ｍＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した、またはｍＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂スラリー（ＤＰＢＳ中であらかじめ平衡化された）とともに２～８℃で一晩インキュベートした（バッチ様態）。次いで、バッチ混合物をクロマトグラフィーカラムに移し、素通りを回収した。カラムをＤＰＢＳで洗浄し、タンパク質を１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファーｐＨ３．０で溶出した。溶出を、１０％（ｖ／ｖ）１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８中に実施して、６～７の最終ｐＨをもたらした。タンパク質を、Ａ２８０ｎｍ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）に基づいて定量した。
精製後、Ｆａｂ及びＭａｂ構築物の両方についての発現を、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃７６０４９９）を用いた非還元型ハイスループットタンパク質発現アッセイによって査定した。以下の改変を有して、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＬａｂＣｈｉｐ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ｖｅｒｓｉｏｎ２ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌに従って手順を行った。２μｌまたは５μｌ（濃度域５～２０００ｎｇ／μｌ）のいずれかのＦａｂ／Ｍａｂサンプルを、７μｌのＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃７６０３２８）とともに、９６ウェルプレート（ＢｉｏＲａｄ ＃ＨＳＰ９６０１）における別個のウェルに添加した。次いで、Ｆａｂ／Ｍａｂ／ｂｓＡｂサンプルを７０℃で１５分間変性させた。ＬａｂＣｈｉｐ機器を、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃７６０４９９）及びＡｂ－２００アッセイ設定を用いて作動した。
タンパク質発現に対する安定性最適化設計の効果
図５は、親ＣＡＴ－２２００抗体に基づく対照及び選択された設計されたキメラＦａｂまたは設計されたキメラＭａｂに関する、Ｆａｂ及びＭａｂ構築物の力価を比較している。キメラＦａｂ及び設計されたキメラＦａｂの発現は、野生型ラムダＦａｂの発現と比較してやや低かった。設計されたキメラＭａｂの発現は、野生型ラムダＭａｂ及びキメラＭａｂと比較してやや低かった。キメラ形式への安定性最適化変異の内包は、タンパク質発現に対して有意な影響を有しなかった（設計されたキメラＦａｂの発現と野生型ラムダＦａｂのものとを、及び設計されたキメラＭａｂの発現と野生型ラムダＭａｂのものとを比較する）。
実施例３に記されるように、一部の設計されたキメラＦａｂは、ＩｇＧ－ＣＨ１ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ手法で準最適な精製効率を呈したが、しかしながら、これらの同じ設計されたキメラＦａｂをＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔによって精製した場合または類似の設計されたキメラＭａｂをプロテインＡによって精製した場合、それらは、他の設計されたキメラＦａｂ／設計されたキメラＭａｂと同様に挙動した。これらの設計されたキメラＦａｂ／設計されたキメラＭａｂの一部は、８３Ａまたは８３Ｖテーマに属した。以下のものによって決して限定されることなく、ＩｇＧ－ＣＨ１ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ樹脂への結合における観察された可変性は、例えばこれらの設計されたキメラＦａｂ構築物の損なわれた構造的完全性の結果としてよりもむしろ、（例えば、精製効率が野生型のものに匹敵する、例えば８３Ａテーマ対８３Ｆテーマの場合における、より小さなアミノ酸置換の結果としての）軽鎖：重鎖接合部分または可変：定常接合部分における可変的立体構造動力学に起因し得る。この仮説は、それぞれ他の２つの代替的な精製法（上で記載される）によって精製された残りの設計されたキメラＦａｂ／設計されたキメラＭａｂに対する、そのような設計されたキメラＦａｂ／設計されたキメラＭａｂの匹敵する精製効率によって裏付けられる。
実施例５：生物物理学的特徴付けのための、設計されたキメラＦａｂ及び設計されたキメラＭａｂの分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
実施例４に記載されるように調製された、設計されたキメラＦａｂ、設計されたキメラＭａｂ、及び対照を、それらの生物物理学的特徴を査定する前に、分取ＳＥＣに供していかなる不純物も除去した。分取ＳＥＣを以下のように行った。サンプル中の抗体種を、カラム上にサンプルを注入するために用いられるＡＬＩＡＳ Ｂｉｏ Ｃｏｏｌオートサンプラー（Ｓｐａｒｋ－Ｈｏｌｌａｎｄ）を備えたＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ２５システムに取り付けられたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００またはＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを用いて分離した。ＰＢＳ ｐＨ７．４（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＤＰＢＳ／ｍｏｄｉｆｉｅｄ，Ｎｏ Ｃａｌｃｉｕｍ，Ｎｏ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＨ－３０００２８．０２）中のＦａｂまたはＭａｂ形式のサンプル（０．９ｍｌ）を、ＰＢＳで満たされた２ｍｌループに自動的にロードした。次いで、サンプルをカラム上に自動的に注入し、１ＣＶ溶出容量で０．５ｍｌ／分にて分解した（早期の精製バッチの一部に関しては、１ｍｌサンプルループを用いてサンプルローディングを手動で実施した）。タンパク質溶出をＯＤ２８０でモニターし、０．５ｍｌ画分で回収した。各サンプルに対して、主要なピークを含む画分（画分をＣａｌｉｐｅｒによって査定した）をプールし、実施例７～１１に記載されるように、さらに生物物理学的に特徴付けした。
実施例６：設計されたキメラＦａｂ及び設計されたキメラＭａｂの品質査定のための、超高速液体クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＳＥＣ）
実施例４に記載される初回アフィニティークロマトグラフィーステップ（ＩｇＧ－ＣＨ１ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔまたはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ）によって精製された設計されたキメラＦａｂサンプル、ならびに実施例５に記載される分取ＳＥＣによって精製された設計されたキメラＭａｂサンプルをＵＰＬＣ－ＳＥＣに供して、設計されたキメラＦａｂの場合には初回精製後に、または設計されたキメラＭａｂの場合には卓上安定性調査の経過中に、サンプルの単分散性を査定した（実施例１３を参照されたい）。
３０℃に設定され及びＰＤＡ検出器を有するＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏシステムに取り付けられたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラム（２．５ｍＬ、４．６×１５０ｍｍ、ステンレス製、１．７μｍ粒子）を用いて、ＵＰＬＣ－ＳＥＣを実施した。ラン時間は、７分間、及びＤＰＢＳまたは０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０ ｐＨ７．４を有するＤＰＢＳのランニングバッファーを用いた０．４ｍｌ／分での２．８ｍＬの注入あたりの総容量からなった。溶出を２１０～５００ｎｍの値域におけるＵＶ吸光度によってモニターし、クロマトグラムを２８０ｎｍで抽出した。ピーク積分をＥｍｐｏｗｅｒ３ソフトウェアを用いて実施した。
ＩｇＧ－ＣＨ１ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔによって精製された設計されたキメラＦａｂサンプルのＵＰＬＣ－ＳＥＣ分析は、種均一性を反映した。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔによって精製された設計されたキメラＦａｂのＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルは、様々な軽鎖含有種に関連している可能性が高い不純物を反映し、そのほとんどは分取ＳＥＣによってその後除去された。
実施例７：設計されたキメラＦａｂの熱安定性に対する設計の効果
安定性最適化設計の有効性を判定するために、設計されたキメラＦａｂ及び対照の熱安定性を示差走査蛍光（ＤＳＦ）及び／または示差走査熱量測定（ＤＳＣ）法によって査定し、それぞれのキメラＦａｂの熱安定性と比較した。設計されたキメラＦａｂ及び対照を、実施例５に記載されるように精製した。
ＤＳＣによる熱安定性の測定
設計されたキメラＦａｂ及び対照の熱安定性を、以下のようにＤＳＣを用いて測定した。ＰＢＳ中に主として０．４ｍｇ／ｍＬの濃度の４００μＬの精製サンプル（設計されたキメラＦａｂのごく一部は、０．１７５ｍｇ／ｍＬの濃度にあった）を、ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＤＳＣ分析に用いた。各ＤＳＣランの開始時に、５つのバッファーブランク注入を実施してベースラインを安定させ、参照のためにバッファー注入を各サンプル注入の前に置いた。各サンプルを、低フィードバック、８ｓｅｃフィルター、３または５分間のプレスキャンサーモスタット、及び７０ｐｓｉ窒素圧にて、６０℃／時間の速度で２０から１００℃までスキャンした。結果として生じたサーモグラムを参照し及びＯｒｉｇｉｎ７ソフトウェアを用いて分析して、熱安定性の指標としての融解温度（Ｔｍ）を決定した。
ＤＳＦによる熱安定性の測定
設計されたキメラＦａｂ及び対照の熱安定性を、以下のようにＤＳＦを用いて測定した。各精製された設計されたキメラＦａｂを、ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ＨｙＣｌｏｎｅ Ｃａｔ＃ＳＨ３００２８．０２）中０．６７ｍｇ／ｍＬに希釈した。Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ＃Ｓ－６６５０）のワーキングストックを、ＤＰＢＳ中１：１０００希釈によって調製した。１５μＬの０．６７ｍｇ／ｍＬタンパク質（１０μｇ）を１５μＬのＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ ｇｅｌ ｓｔａｉｎワーキングストックに添加することによって、ＤＳＦサンプルを調製した。しかしながら、０．６７ｍｇ／ｍＬ未満の濃度を有するタンパク質に関しては、１５μＬの０．２７ｍｇ／ｍＬ（４μｇ）タンパク質または希釈していないタンパク質を１５μＬのＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ色素のワーキングストックに添加することによって、各ＤＳＦサンプルを調製した。次いで、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ６０００ ｑＰＣＲ機器（ＱｉａＧｅｎ Ｉｎｃ）を用いて、ＤＳＦ分析を３０μｌアリコートに対して行った。各サンプルを、各ステップ間に１０秒間の平衡を有する１℃間隔及び開始時の３０秒間の待ち時間を用いて、３０℃から９４℃までスキャンした。４７０ｎｍの励起フィルター及び６１０ｎｍの発光フィルターを、７～１０の間に手動で調整されるゲインとともに用いて、サンプルが飽和していないこと及び検出器のダイナミックレンジ内にあることを確保した。変性曲線の一次導関数からの最大値をＴｍ（融解温度）として用いて、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ６０００ソフトウェアでデータを分析した。
結果
対照の熱安定性
実施例１に記されるように、安定性最適化設計を試験するための代表的なＦａｂを選択する基準の１つは、ＶＬ－ＣＫキメラＦａｂが、親抗体の野生型ラムダＦａｂと比較して、熱安定性の減少を呈することであった。表４は、野生型ラムダＦａｂ及びＶＬ－ＣＫキメラＦａｂ（表４において「ＷＴ」及び「キメラ」として識別される）に関して獲得されたＴｍ値を示している。列８～１３は、ＤＳＣによって測定されるこれらの対照に関するＴｍを示しており、一方で列２～７は、ＤＳＦによって測定されるこれらの対照に関するＴｍを示している。すべての場合において、ＶＬ－ＣＫキメラＦａｂはＴｍの減少を呈し、減少の量は親抗体に依存して変動した。野生型ＣＡＴ－２２００ラムダＦａｂ構築物に関する平均Ｔｍは７８．８℃であることが決定され、ＣＡＴ－２２００キメラＦａｂに関しては７３．１℃であることが決定された。野生型Ｈ３ラムダＦａｂ構築物に関する平均Ｔｍは８０．９℃であることが決定され、キメラＦａｂに関しては７６．０℃であることが決定された。野生型ラムダＥＰ６ｂ＿Ｂ０１ Ｆａｂ構築物に関する平均Ｔｍは８５．４℃であることが決定され、キメラＦａｂに関しては８０．５℃であることが決定された。これらのデータは、野生型ラムダＦａｂのＶラムダ－ＣカッパキメラＦａｂへの変換が、ＤＳＦによって測定される４．９～５．７℃の値域内の熱安定性の喪失を伴い、一方でＤＳＣによって測定されるＴｍの減少は３．７～４．６℃であったことを実証し、これは他のシステムにおいても起こり得る傾向であることが示唆された。
設計されたキメラＦａｂの熱安定性
実施例１に記載される設計ストラテジーに基づき、８つの設計の初回セット（表３に列挙される設計１～８）を、ＤＳＣによって単一システムＣＡＴ－２２００において試験した。結果に基づき、設計の第二のセット（表３における設計９～３９）を、ＤＳＦによってＣＡＴ－２２００及びＨ３システムにおいて試験して、ＶＬ－ＣＫキメラＦａｂの熱安定性を増加させることにおいて最も重要であるアミノ酸置換を同定した。ＤＳＦは、融解温度を測定するための精度の低い方法であることが知られているものの、それは熱安定性を測定するハイスループットな方法であり、かつ対照と比較した安定性に対する相対的効果を査定するのに適切であるため、ここではそれを用いた。
設計１～８を有する設計されたキメラＦａｂに関するＤＳＣ結果は、表４（列８～１３）に報告されている。３つのシステムに関する熱安定性データは、列８（ＣＡＴ－２２００）、１０（Ｈ３）、及び１２（ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１）に報告されている。それぞれのＶラムダ－ＣカッパキメラシステムのＴｍ値に対する、設計されたキメラＦａｂ Ｔｍ値の比較は、列９（ＣＡＴ－２２００）、１１（Ｈ３）、及び１３（ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１）に報告されている。繰り返しが行われた設計されたキメラＦａｂに関して、報告されるＴｍ値は平均値である。
設計されたキメラＦａｂに関するＤＳＦ結果は、表４（列２～７）に報告されている。３つの異なる試験システムに関する熱安定性データは、列２（ＣＡＴ－２２００）、４（Ｈ３）、及び６（ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１）に報告されている。繰り返しが行われた設計されたキメラＦａｂに関して、報告されるＴｍ値は平均値である。それぞれのＶラムダ－ＣカッパキメラシステムのＴｍ値に対する、設計されたキメラＦａｂ Ｔｍ値の比較は、列３（ＣＡＴ－２２００）、５（Ｈ３）、及び７（ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１）に報告されている。
表４におけるデータは、選定された設計ストラテジーを用いると、ＤＳＦによって測定されるように、野生型の安定性が取り戻されただけでなく、最高で７．６℃上回った（Ｈ３システムにおける設計３９）ことを実証している。２つのシステムＣＡＴ－２２００及びＨ３に基づくデータは、残基８３Ｘ（式中、Ｘ＝Ｆ／Ｖ／Ｉ／Ａ、これらのアミノ酸残基はカッパ軽鎖において最も保存されたアミノ酸タイプであり、Ｆはすべての中で最も保存されている）におけるたった１つのアミノ酸置換の導入が、対応するキメラＦａｂのものと比較して熱安定性のかなりの向上につながり得、１．８～７．４℃の安定性の増加が呈示されることを示している（図６Ａ、図６Ｂ、ならびに表４：設計１４、２３、３０、及び３５を参照されたい）。箇所８３におけるアミノ酸がＶ、Ｉ、またはＡで置換された設計は、野生型ラムダＦａｂのものさえを上回るＴｍを有する。それゆえ、Ｅ８３Ｘは、置換のためのコアな箇所であることが判定された。この箇所におけるアミノ酸Ｌでの置換を、キメラＦａｂ形式でＣＡＴ－２２００システムにおいて実験的に試験し（データは提供されない）、そのような置換を含有する変種（例えば、８３Ｌ＿１０５Ｅ＿１０６ＡＫ、ならびに８５Ｔ及び１０６Ｉを含む他の組み合わせ）は、本明細書においてデータが提供される疎水性アミノ酸置換と、熱安定性の向上の観点において同様の挙動を示した。
８３Ｘ＿８５Ｔ設計を獲得するための箇所８５における付加的なアミノ酸置換の導入は、熱安定性のさらなる増加をもたらし、その程度はシステム依存的であるように見えた（図６Ａ、図６Ｂ、ならびに表４：設計１７、２６、３２、及び３７）。８３Ｘ＿８５Ｔ／Ｖ＿１０５Ｅまたは８３Ｘ＿８５Ｔ＿１０５Ｅ＿１０６Ｉへの設計のさらなる拡大は、Ｔｍのなおさらなる向上につながり、その程度は試験されたシステムに依存した（図６Ａ、図６Ｂ、及び表４）。試験された設計の背景における、カッパ軽鎖において最も保存されたアミノ酸タイプ、つまりＴ及びＶでの箇所８５におけるアミノ酸置換は、Ｔｍの同一の向上に寄与した。
実施例８：Ｆａｂ形式における安定性最適化設計の効果の移転可能性
安定性最適化設計の移転可能性をさらに査定するために、タイプ８３Ｘ＿８５Ｔ、８３Ｘ＿８５Ｔ＿１０５Ｅ＿１０６Ｉ、式中、Ｘ＝Ｖ／Ｉ／Ａ、及び８３Ｆ＿８５Ｔ＿１０５Ｅの設計のサブセットを、ＤＳＦによって第三のＦａｂシステムＥＰ６ｂ＿Ｂ０１において試験するために選択した。７つの設計についてのこのセットに対する熱安定性測定を、３つすべてのシステムＣＡＴ－２２００、Ｈ３、及びＥＰ６ｂ＿Ｂ０１においてＤＳＣ（２つのうちでより精確な方法として）によっても実施した。
これらの設計を、以下のことに基づいて試験のために選択した：ａ）設計は最小数のアミノ酸置換を有するが、とはいえ依然として最適な性能を呈した：８３Ｘ＿８５Ｔ；またはｂ）設計は、変異の数に関係なく最高の性能を発揮した（すなわち、最大のＴｍ増大を示した）：８３Ｘ＿８５Ｔ＿１０５Ｅ＿１０６Ｉ。８３Ｆテーマは他の８３Ｘテーマよりも効果が低かったため、２つのＣＡＴ－２２００及びＨ３システムデータに基づき、最大のＴｍ増大に対して変異の最小限のセットを表す８３Ｆ＿８５Ｔ＿１０５Ｅ設計のみを選択した。ゆえに、選択された設計は、表３に列挙される設計１８、２６、２９、３２、３４、３７、及び３９を含んだ。
ＤＳＦ及びＤＳＣ測定を、実施例７に記載されるように行った。
表４及び図７におけるデータは、試験された設計が、第三のシステムＥＰ６ｂ＿Ｂ０１のＶＬ－ＣＫキメラＦａｂに移転されることを実証した。他の２つのシステムにおいて観察されたものと、設計のＴｍにおける同様の傾向が観察された。先に記されたように、開始キメラと比較したＴｍ変化の程度のシステム依存的変動が、ここでも観察された。留意すべきは、ＤＳＣによって決定されるＴｍ値は、概して、ＤＳＦによって観察されるものよりも低く（実施例７に記載される）、それゆえＤＳＣまたはＤＳＦによって測定される場合、同じ設計に対するＴｍ値に相違があることである（表４に示されるように）。しかしながら、設計間の及びシステムにわたる相対的な傾向は保たれる。
実施例９：Ｍａｂ形式における安定性最適化設計の効果の移転可能性
実施例７及び８において、選択された安定性最適化設計の移転可能性はＦａｂ形式において実証された。Ｍａｂ形式への移転可能性を試験するために、実施例８に記載される７つの設計のセットに対する熱安定性測定を、２つのシステムＣＡＴ－２２００及びＨ３においてＤＳＣによって実施した。
試験されたＭａｂを、実施例５に記載されるように分取ＳＥＣによって精製した。ＤＳＣを実施例７に記載されるように実施した。実施例７及び８におけるように、設計されたキメラＭａｂに関するＴｍ値を、それぞれのキメラＭａｂ対照（キメラ）及び野生型ラムダＭａｂ（ＷＴ）のものと比較した。設計されたキメラＭａｂに関するＤＳＣ結果は、表５に報告されており、２つの試験されたシステムに関するＴｍ値は、列２（ＣＡＴ－２２００）及び４（Ｈ３）に報告されている。それぞれのキメラＭａｂのＴｍに対するＴｍの変化は、列３（ＣＡＴ－２２００）及び５（Ｈ３）に報告されている。
表５に示されるように、７つの選択された設計のすべてが、それぞれのキメラＭａｂと比較して、設計されたキメラＭａｂのＴｍを増加させ得た。図８は、試験された２つのシステムにおける、設計されたキメラＦａｂ及びＭａｂに関して獲得されたＴｍ値の比較を提供している。非常に類似したＴｍ値に関する限り、Ｆａｂ及びＭａｂ形式における試験された設計に関して、設計間で同一の傾向が観察された。設計されたキメラＦａｂ（単一の移行）及び設計されたキメラＭａｂ（単一の顕著なＦａｂ移行、ならびにＦａｂ移行によってマスクされない場合にはＣＨ２及び／またはＣＨ３移行が観察される）に関して獲得された典型的なＤＳＣサーモグラムが、図９に提供されている。これらのサーモグラムは、予想される移行を示した。
実施例７、８、及び９に示される結果は、システム及び抗体形式にわたる安定性最適化設計の移転可能性を実証している。
実施例１０：設計されたキメラＦａｂ及び設計されたキメラＭａｂの抗原結合アフィニティー測定
設計されたキメラＦａｂ（設計１４～３９を持つ、Ｅ８３Ｘテーマの設計されたキメラＦａｂ）及び設計されたキメラＭａｂ（設計１８、２６、２９、３２、３４、３７、及び３９を持つ、実施例８及び９において試験された同じ７種の設計されたキメラＭａｂ）が適当な抗原に結合し得る能力を査定して、安定性最適化設計のアミノ酸置換が、抗原結合アフィニティーに対して何らかの効果を有するかどうかを判定した。設計されたキメラＦａｂ及びＭａｂを、実施例５に記載されるように精製した。抗原結合アフィニティーを、設計されたキメラＦａｂに関してはＣＡＴ－２２００、Ｈ３、及びＥＰ６ｂ＿Ｂ０１システムにおいて、及び設計されたキメラＭａｂに関してはＣＡＴ－２２００及びＨ３システムにおいて、以下のようにＳＰＲによって判定した。
ＳＰＲバイオセンサーアッセイ
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００：ＣＭ５ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓセンサーチップでの調査に関しては、Ｂｉａｃｏｒｅアミンカップリングキット（ＮＨＳ、ＥＤＣ、及び１Ｍエタノールアミン）及び１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。Ｂｉｏｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ：ＧＬＣセンサーチップでの調査に関しては、Ｂｉｏｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎアミンカップリングキット（ＥＤＣ、ｓＮＨＳ、及びエタノールアミン）及び１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）から購入した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳランニングバッファー（ＰＢＳＴ）を、Ｔｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入した。ヤギポリクローナル抗ヒトＦｃ抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。抗原：組み換えヒトＨＥＲ３を、ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）から購入し、組み換えヒトｓＦａｓ受容体を、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）から購入し、及び組み換えヒトＩＬ－１７Ａを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。
抗原ＨＥＲ３（Ｆａｂ）及びＦａｓに関する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）ランニングバッファー（３．４ｍＭの最終濃度まで添加された０．５Ｍ ＥＤＴＡストック溶液を有する）とともにＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５℃の温度で行った。ＩＬ－１７及びＨＥＲ３（Ｍａｂ）抗原に関する表面プラズモン共鳴アッセイを、ＰＢＳＴランニングバッファーとともにＢｉｏＲａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ））を用いて２５℃の温度で行った。
Ｈ３：ＦａｂにおけるＨＥＲ３アフィニティー判定
ＦａｂにおけるＨＥＲ３アフィニティー判定を以下のように行った。ＨＥＲ３抗原への結合についてのＦａｂ（分取ＳＥＣにより精製された）のスクリーニングは、抗Ｈｉｓ抗体へのＨＥＲ３の間接的捕捉、それに続くシングルサイクルカイネティクスを用いた速度論的分析のための５つの濃度のＦａｂの注入、という２つのステップで生じた。メーカーの指示に従い、活性及び参照フローセルにおよそ１００００ＲＵの抗Ｈｉｓ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をアミンカップリングすることによって、抗Ｈｉｓ抗体捕捉表面をＣＭ５ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓセンサーチップ上に調製した。ＨＥＲ３を、１０μＬ／分の流速で６０秒間、活性フローセルの上に４～８μｇ／ｍＬで注入した。概して、これは、抗Ｈｉｓ抗体表面へのおよそ１００～２００ＲＵのＨＥＲ３の捕捉をもたらした。ＨＥＲ３は参照（ブランク）フローセル上には捕捉されなかった。捕捉ステップの後に、５つの濃度のＦａｂ（２００ｎＭ及び２倍希釈）が続き、それを、５０μＬ／分で９０秒間、活性及び参照フローセルの両方の上に逐次的に注入し、３００秒間の解離相を有した。捕捉されたＨＥＲ３表面を、３０μＬ／分で１２０秒間の１０ｍＭグリシンｐＨ１．５によって再生させて、次の注入サイクルのための表面を調製した。少なくとも２回のモックバッファー注入を各分析物注入に対して実施し、参照に用いた。結果として生じたシングルサイクルカイネティクスセンサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．０を用いて分析し、１：１結合モデルにフィットさせた。
Ｈ３：ＭａｂにおけるＨＥＲ３アフィニティー判定
ＭａｂにおけるＨＥＲ３アフィニティー判定を以下のように行った。ＨＥＲ３抗原への結合についてのＭａｂのスクリーニングは、抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体表面へのＭａｂの間接的捕捉、それに続く５つの濃度のＨＥＲ３の注入、という２つのステップで生じた。アミンカップリングによって、抗ヒトＦｃ表面をＧＬＣセンサーチップ上に調製した。ＧＬＣセンサーチップ表面を、分析物（水平）方向に１００μＬ／分で１４０秒間注入される標準ＢｉｏＲａｄ ｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の１：１０希釈物によって活性化した。活性化の直後に、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ４．５中抗ヒトＦｃの２５マイクロｇ／ｍＬ溶液を、およそ３０００共鳴単位（ＲＵ）が固定化されるまで、２５マイクロＬ／分の流速で２４０秒間リガンド（垂直）方向に注入した。残存する活性基を、再度分析物方向における１Ｍエタノールアミンの１００μＬ／分で１４０秒間の注入によってクエンチングした。２０マイクロｇ／ｍＬ溶液をリガンド（垂直）方向に２５マイクロＬ／分の流速で２４０秒間注入することによって、分析のためのＭａｂを抗Ｆｃ表面に間接的に捕捉した。その後、ＨＥＲ３を分析物（水平）方向に注入した。まず、分析物（水平）方向における１００マイクロＬ／分で３０秒間の２回のバッファー注入を用いて、ベースラインを安定させた。次いで、ブランクバッファー対照を有して、１８０ｎＭで始まる各Ｈ３ Ｍａｂの５つの濃度の３倍希釈系列を、２５マイクロＬ／分で１２０秒間同時に注入し、１０分間の解離相を有し、バッファー参照を有する一連の結合センサーグラムをもたらした。抗ヒトＦｃ表面を再生させて、１００マイクロＬ／分で１８秒間の０．８５％リン酸の２回のパルスによって次の注入サイクルに備えた。センサーグラムをアラインし、バッファーブランク注入及びインタースポット（ｉｎｔｅｒｓｐｏｔ）を用いて二重参照し、結果として生じたセンサーグラムをＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖ３．１を用いて分析した。二重参照したセンサーグラムをラングミュア結合モデルにフィットさせた。
ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１：Ｆａｓアフィニティー判定
Ｆａｓアフィニティー判定を以下のように行った。Ｆａｓを１０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．５中に希釈し、アミンカップリングを介してＣＭ５ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓセンサーチップ上に直接固定化した。これは、およそ１００ＲＵの固定化Ｆａｓをもたらした。参照フローセルを空のままにして（エタノールアミンでブロッキングされた）、ブランク対照として用いた。シングルサイクルカイネティクスを用いた速度論的分析のために、Ｆａｓを、エタノールアミンでブロッキングされた参照表面及びＦａｓ表面の両方の上に注入した。具体的には、精製されたＦａｂ（分取ＳＥＣ精製された）の５つの濃度（５ｎＭ及び２倍希釈物）を、３０μＬ／分で６００秒間、活性及び参照フローセルの両方の上に逐次的に注入し、３６００秒間の解離相を有した。Ｆａｓ表面を、２サイクルの３０μＬ／分で１２０秒間の１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を用いて再生させて、次の注入サイクルのための表面を調製した。少なくとも２回のモックバッファー注入を各分析物注入に対して実施して、参照に用いた。結果として生じたシングルサイクルカイネティクスセンサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．０を用いて分析し、１：１結合モデルにフィットさせた。
ＣＡＴ－２２００：ＩＬ－１７アフィニティー判定
ＩＬ－１７アフィニティー判定を以下のように行った。リガンド（垂直）方向に１００μＬ／分で１４０秒間注入される標準ＢｉｏＲａｄ ｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の１：１０希釈物によって活性化されたＧＬＣセンサーチップを用いて、ＩＬ－１７Ａ表面を作出した。活性化の直後に、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ４．５中ＩＬ－１７Ａの１～４マイクロｇ／ｍＬ溶液を、およそ７５～２００共鳴単位（ＲＵ）が固定化されるまで、２５または１００マイクロＬ／分の流速でリガンド（垂直）方向に注入した。残存する活性基を、再度リガンド方向における１Ｍエタノールアミンの１００μＬ／分で１４０秒間の注入によってクエンチングした。ＩＬ－１７Ａへの結合についてのＦａｂ／Ｍａｂのスクリーニングを、分析物（水平）方向における精製されたＣＡＴ－２２００ Ｆａｂ／Ｍａｂの注入によって実施した。まず、分析物（水平）方向における１００マイクロＬ／分で３０秒間の２回のバッファー注入を用いて、ベースラインを安定させた。ブランクバッファー対照を有して、各ＣＡＴ－２２００ Ｆａｂ／Ｍａｂの５つの濃度の３倍希釈系列（６０ｎＭ、２０ｎＭ、６．７ｎＭ、２．２ｎＭ、０．７４ｎＭ）を、５０マイクロＬ／分で１２０秒間同時に注入し、１０または１５分間の解離相を有し、バッファー参照を有する一連の結合センサーグラムをもたらした。ＳＰＲ表面のＣＡＴ－２２００：ＩＬ－１７Ａ複合体を解離させ、ＩＬ－１７Ａ表面を再生させて、１００マイクロＬ／分で１８秒間の０．８５％リン酸の２回のパルスによって次の注入サイクルに備えた。センサーグラムをアラインし、バッファーブランク注入及びインタースポットを用いて二重参照し、結果として生じたセンサーグラムをＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖ３．１を用いて分析した。二重参照したセンサーグラムをラングミュア結合モデルにフィットさせた。
結果
繰り返しが行われた設計されたキメラＦａｂ／Ｍａｂに関して、報告されるＫＤ値は平均値である。
それぞれの野生型ラムダＦａｂ及びキメラＦａｂを参照して、設計されたキメラＦａｂの抗原結合アフィニティーを査定した。設計されたキメラＦａｂに関するＳＰＲ結果は表６に報告されており、３つの試験されたシステムに関する決定されたＫＤ値は、列２（ＣＡＴ－２２００）、３（Ｈ３）、及び４（ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１）に報告されている。試験されたすべてのシステムにおいて、キメラＦａｂ対照（キメラ）の抗原結合アフィニティーは、野生型ラムダＦａｂ対照（ＷＴ）と非常に類似していた。表６におけるデータは、ＣＡＴ－２２００親抗体に基づく設計されたキメラＦａｂの抗原結合アフィニティーが、野生型ラムダＦａｂ及びキメラＦａｂのものの約２倍以内にあったことを示している。Ｈ３親抗体に基づく設計されたキメラＦａｂの抗原結合アフィニティーも、野生型ラムダＦａｂ及びキメラＦａｂのものの約２倍以内にあった。ＥＰ６ｂ＿Ｂ０１システムではより少ない数の設計されたキメラＦａｂが試験されたものの、同じ傾向が観察された。
それぞれの野生型ラムダＭａｂ及びキメラＭａｂを参照して、設計されたキメラＭａｂの抗原結合アフィニティーを査定した。設計されたキメラＭａｂに関するＳＰＲ結果は表７に報告されており、２つの試験されたシステムに関する決定ＫＤ値は、列２（ＣＡＴ－２２００）及び３（Ｈ３）に報告されている。試験された両システムにおいて、野生型ラムダＭａｂ対照（ＷＴ）及び対応するキメラＭａｂ対照の抗原結合アフィニティーは、互いの１．５倍以内にあった。設計されたキメラＭａｂは、上記対照と非常に類似したＫＤで抗原に結合し得た。
表６及び７からわかるように、安定性最適化設計に相当するアミノ酸置換を持つ設計されたキメラＭａｂまたはＦａｂは、それぞれ野生型ラムダＦａｂ及びＭａｂのものに匹敵するＫＤ値で抗原に結合し得た。
実施例１１：ＦｃγＲ結合に対する安定性最適化設計の効果
野生型ＩｇＧ１抗体は、ＦｃガンマＲ受容体（ＦｃγＲ）に結合して、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰなどのエフェクター機能を媒介し得る。安定性最適化設計のアミノ酸置換が、設計されたキメラＭａｂがＦｃγＲに結合し得る能力に対して何らかの効果を有するかどうかを判定するために、ＦｃγＲに対する設計されたキメラＭａｂの選択されたセット（設計２９、３７、及び３９を持つ）のアフィニティーを測定した。４つの異なるタイプのＦｃγＲ受容体ＣＤ１６ａＶ、ＣＤ３２ｂＦ、ＣＤ３２ａＲ、及びＣＤ３２ａＨへの設計されたキメラＭａｂの結合アフィニティーを査定した。設計されたキメラＭａｂを、実施例５に記載されるように精製した。結合アフィニティーを、以下のようにＳＰＲによって判定した。
表面プラズモン共鳴アッセイを、ＰＢＳＴランニングバッファーとともにＢｉｏＲａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ））を用いて２５Ｃの温度で行った。ＧＬＣセンサーチップ、Ｂｉｏｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎアミンカップリングキット（ＥＤＣ、ｓＮＨＳ、及びエタノールアミン）、及び１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）から購入した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳランニングバッファー（ＰＢＳＴ）を、Ｔｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入した。ヤギポリクローナル抗ヒトＦｃ抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。抗原：ヒト組み換えＦｃＲｎを社内で産生した。ヒト組み換えＦｃγＲ受容体：ＣＤ１６ａＶ、ＣＤ３２ｂＦ、ＣＤ３２ａＲ、及びＣＤ３２ａＨを、Ｃ末端にＨｉｓ１０タグを含有する構築物として発現させ、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その後にＨｉｓタグ除去及びＳＥＣ精製が続いた。
Ｍａｂ：ＦｃγＲアフィニティー判定
ＦｃγＲアフィニティー判定を以下のように行った。様々なＦｃγＲ受容体への結合についてのＭａｂのスクリーニングは、抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体表面へのＭａｂサンプルの間接的捕捉、それに続く５つの濃度のＦｃγＲ受容体のそれぞれの注入、という２つのステップで生じた。アミンカップリングによって、抗ヒトＦｃ表面をＧＬＣセンサーチップ上に調製した。ＧＬＣセンサーチップ表面を、分析物（水平）方向に１００μＬ／分で１４０秒間注入される標準ＢｉｏＲａｄ ｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の１：１０希釈物によって活性化した。活性化の直後に、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ４．５中抗ヒトＦｃの２５マイクロｇ／ｍＬ溶液を、およそ４５００または２５００共鳴単位（ＲＵ）が固定化されるまで、２５マイクロＬ／分の流速で２４０秒間分析物方向に注入した。残存する活性基を、再度分析物方向における１Ｍエタノールアミンの３０μＬ／分で３００秒間の注入によってクエンチングした。１０マイクロｇ／ｍｌ溶液をリガンド（垂直）方向に２５マイクロＬ／分の流速で２４０秒間注入することによって、分析のためのＭａｂを抗ヒトＦｃ表面に間接的に捕捉した。その後、ＦｃγＲ受容体のそれぞれを分析物（水平）方向に注入した。まず、分析物（水平）方向における１００マイクロＬ／分で３０秒間の２回のバッファー注入を用いて、ベースラインを安定させた。次いで、ブランクバッファー対照を有して、１０μＭで始まる４種のＦｃγＲ受容体のそれぞれの５つの濃度の３倍希釈系列を、５０マイクロＬ／分で１２０秒間同時に注入し、３分間の解離相を有し、バッファー参照を有する一連の結合センサーグラムをもたらした。抗ヒトＦｃ表面を再生させて、１００マイクロＬ／分で１８秒間の０．８５％リン酸の２回のパルスによって次の注入サイクルに備えた。センサーグラムをアラインし、バッファーブランク注入及びインタースポットを用いて二重参照し、結果として生じたセンサーグラムをＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖ３．１を用いて分析した。二重参照したセンサーグラムをラングミュア結合モデルにフィットさせた、または定常状態のＫＤ決定のために平衡結合モデルにフィットさせた。
結果
表８は、２つのシステム（ＣＡＴ－２２００及びＨ３）における設計されたキメラＭａｂに関するＳＰＲ結果を示している。ＣＤ１６ａＶ受容体への結合に関する決定されたＫＤ値は列２に、ＣＤ３２ｂＦに関しては列３に、ＣＤ３２ａＲに関しては列４に、ＣＤ３２ａＨに関しては列５に報告されている。繰り返しが行われた試験された設計されたキメラＭａｂに関して、報告されるＫＤ値は平均値である。表８からわかるように、設計されたキメラＭａｂに関して測定されたＫＤ値は、試験されたＦｃγＲ受容体に対するそれぞれの野生型ラムダＭａｂ対照（ＷＴ）に関するものに匹敵した。
実施例１２：ＦｃＲｎ結合に対する安定性最適化設計の効果
野生型ＩｇＧ１抗体は、ＦｃＲｎ受容体（胎児性受容体）に結合し得、それらの長い半減期をもたらす。安定性最適化設計のアミノ酸置換が、設計されたキメラＭａｂがＦｃＲｎに結合し得る能力に対して何らかの効果を有するかどうかを判定するために、ＦｃＲｎに対する設計されたキメラＭａｂの選択されたセット（設計２９、３７、及び３９を持つ）のアフィニティーを測定した。設計されたキメラＭａｂを、実施例５に記載されるように精製し、結合アフィニティーを、以下のようにＳＰＲによって判定した。
Ｍａｂ：ＦｃＲｎアフィニティー判定
ＦｃＲｎアフィニティー判定を以下のように行った。リガンド（垂直）方向に１００μＬ／分で１４０秒間注入される標準ＢｉｏＲａｄ ｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の１：１０希釈物によって活性化されたＧＬＣセンサーチップを用いて、ＦｃＲｎ表面を作出した。活性化の直後に、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ４．５中ＦｃＲｎの１０マイクロｇ／ｍＬ溶液を、およそ２０００共鳴単位（ＲＵ）が固定化されるまで、２５マイクロＬ／分の流速で１２０秒間リガンド（垂直）方向に注入した。残存する活性基を、再度リガンド方向における１Ｍエタノールアミンの３０μＬ／分で１４０秒間の注入によってクエンチングした。ＦｃＲｎ表面で用いられたランニングバッファーは、ＰＢＳＴ ｐＨ５．８であった。ＦｃＲｎへの結合についてのＭａｂのスクリーニングを、分析物（水平）方向における精製されたＭａｂの注入によって実施した。まず、分析物（水平）方向における１００マイクロＬ／分で３０秒間の２回のバッファー注入を用いて、ベースラインを安定させた。ブランクバッファー対照を有して、１００ｎＭで始まる各Ｍａｂの５つの濃度の３倍希釈系列を、５０マイクロＬ／分で１２０秒間同時に注入し、１０分間の解離相を有し、バッファー参照を有する一連の結合センサーグラムをもたらした。ＳＰＲ表面のＭａｂ：ＦｃＲｎ複合体を解離させ、ＦｃＲｎ表面を再生させて、１００マイクロＬ／分で１８秒間のＰＢＳＴ ｐＨ７．４の２回のパルスによって次の注入サイクルに備えた。センサーグラムをアラインし、バッファーブランク注入及びインタースポットを用いて二重参照し、結果として生じたセンサーグラムをＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖ３．１を用いて分析した。二重参照したセンサーグラムをラングミュア結合モデルにフィットさせた。
表８は、２つのシステム（ＣＡＴ－２２００及びＨ３）における設計されたキメラＭａｂに関するＳＰＲ結果を示している。ＦｃＲｎへの結合に関する決定されたＫＤ値は、列６に報告されている。繰り返しが行われた試験された設計されたキメラＭａｂに関して、報告されるＫＤ値は平均値である。表８からわかるように、ＦｃＲｎに対する、ＣＡＴ－２２００及びＨ３の両方の、試験された設計されたキメラＭａｂの結合アフィニティーは、それぞれの野生型ラムダＭａｂ対照（ＷＴ）のものの１．５～２倍以内にある。
実施例１３：選択された設計されたキメラＭａｂの卓上安定性に対する安定性最適化設計の効果
経時的な設計されたキメラＭａｂの安定性を、下で記載されるように、安定性最適化設計２９、３７、及び３９を持つ設計されたキメラＭａｂに関して測定した。設計されたキメラＭａｂを、ＣＡＴ－２２００及びＨ３親抗体に基づいて試験した。
設計されたキメラＭａｂを、ＰＢＳ ｐＨ７．４中５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、３７℃で３０日間インキュベートした。０、６、１０、２０、及び３０日の時点でサンプルを採取した。各サンプルを遠心分離し、上清をＵＰＬＣ－ＳＥＣ及びＣａｌｉｐｅｒ分析によって査定した。０、６、１０、２０、及び３０日目におけるサンプルのＵＰＬＣ－ＳＥＣ及びＣａｌｉｐｅｒ分析、ならびにＡ２８０ｎｍ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）によるタンパク質定量を実施して、サンプルの単分散性への任意の変化を査定した。ＵＰＬＣ－ＳＥＣを、実施例６に記載されるように行った。
図１０は、Ｈ３野生型ラムダＭａｂ、及び設計３７に相当するアミノ酸置換を有するＨ３設計されたキメラＭａｂの例に関する、これらの設計されたキメラＭａｂに対する３７℃におけるインキュベーションの０、２０、及び３０日目に観察された典型的なＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルを描写している。パネルＡ及びＢは０日目における、パネルＣ及びＤは２０日目における、ならびにＥ及びＦは３０日目における、それぞれＨ３システムにおける野生型ラムダＭａｂ対照及び設計３７に関するＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルを対比している。観察されたＵＰＬＣ－ＳＥＣプロファイルは、インキュベーション期間中にＭａｂ分子の単分散性にいかなる変化もないことを実証した。タンパク質濃度の測定は、いかなる潜在的凝集へのタンパク質の喪失もないことを反映した（データは提供されない）。
実施例１４：設計されたキメラ二特異性抗体における重鎖及び軽鎖間の優先的対合についての査定
キメラ軽鎖は、二特異性抗体の調製において、特に一方または両方の親抗体がラムダ軽鎖を有する場合に有用であり得る。本実施例は、二特異性抗体の一方の親抗体がラムダ軽鎖を有する二特異性抗体を調製するための、安定性最適化設計の使用を記載する。
用いられる安定性最適化設計は、表３に記載される設計２９及び３９に相当するものであった。２つの二特異性抗体システムを試験した。第一のものは、ＣＡＴ－２２００親抗体がラムダ軽鎖を有しかつＤ３Ｈ４４抗体がカッパ軽鎖を有する、ＣＡＴ－２２００／Ｄ３Ｈ４４二特異性抗体であった。第二のシステムは、Ｈ３抗体がラムダ軽鎖を有しかつペルツズマブがカッパ軽鎖を有する、Ｈ３／ペルツズマブ二特異性抗体であった。ＣＡＴ－２２００及びＨ３はヒト抗体であり、一方でペルツズマブ及びＤ３Ｈ４４はヒト化抗体である。これらのシステムにおいて、ＣＡＴ－２２００及びＨ３抗体の軽鎖を、実施例３に記載されるようにＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖として構築した。
対合を推進するための、親抗体のＦａｂ領域におけるアミノ酸置換（軽鎖対合設計）を用いて、二特異性抗体を調製した。そのようなアミノ酸置換は当技術分野において公知であり、国際特許公報第ＷＯ２０１４／０８２１７９号及び第ＷＯ２０１５／１８１８０５号を含めたいくつかの刊行物に記載されている。下記の表Ａに示されるように、２つのそのような設計を本実施例において試験した。
Figure 0007245793000006
アミノ酸置換を、重鎖のＣＨ３ドメインにも導入して、重鎖のヘテロ二量体化を促進した（重鎖対合設計）。これらのアミノ酸置換は、国際特許公報第ＷＯ２０１２／０５８７６８号及び第ＷＯ２０１３／０６３７０２号を含めて、当技術分野においても記載されている。下記の表Ｂに示されるように、１つの例示的な設計を本実施例において試験した。
Figure 0007245793000007
各二特異性抗体の４本のポリペプチド鎖を共発現させ、所望の二特異性抗体の量の増加を、下記で記載されるＳＭＣＡアッセイにおいて判定した。
アッセイ形式（ＳＭＣＡ）
アッセイは、２つの親抗体の４本の鎖（親抗体１の重鎖及び軽鎖、それぞれＨ１及びＬ１、それとともに、親抗体２の重鎖及び軽鎖、それぞれＨ２及びＬ２）を共発現させること、及び正しく形成された二特異性抗体の存在を質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を用いて検出することに基づく。図１１は、４本の開始ポリペプチド鎖、ならびにヘテロ二量体ペアの重鎖及び軽鎖間の（Ｆａｂ及びＦｃ領域の両方における）優先的対合の非存在下でこれらの開始ポリペプチド鎖の共発現により生じる潜在的産物を描写した略図を提供している。２つの固有の全長重鎖構築物を２つの固有の軽鎖構築物とともに共発現させ、１０種の考え得る抗体種（Ａｂ種とも呼ばれる）：Ｈ１Ｌ１＿Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２＿Ｈ１Ｌ２、Ｈ１Ｌ１＿Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１＿Ｈ２Ｌ１、Ｈ２Ｌ２＿Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ１＿Ｈ２Ｌ２、Ｈ１Ｌ１＿Ｈ２Ｌ１、Ｈ１Ｌ２＿Ｈ２Ｌ２、Ｈ１Ｌ２＿Ｈ２Ｌ１、及びＨ１Ｌ１＿Ｈ２Ｌ２を産出した。Ｈ１Ｌ１＿Ｈ２Ｌ２種は、正しく対合した二特異性抗体である（図１１、種Ａ）。図１１に示されるように、４つのタイプの半抗体（半Ａｂ）も考えられ得る。Ｆｃ領域内に改変を導入して、固有の重鎖のヘテロ二量体化を促進する場合、潜在的抗体種の数は減少する（すなわち、種Ｅ～Ｊはあまり観察されない）。正しく対合した二特異性抗体種Ｈ１Ｌ１＿Ｈ２Ｌ２対他の種についての、量の観点における相対的な対合特異性を、プロテインＡ（ｐＡ）精製及び脱グリコシル化の後に、ＬＣ－ＭＳを用いて判定した。可能であれば、すべての抗体種及び半Ａｂ種が互いに少なくとも５０Ｄａ異なるという条件で、鎖をタグ付けされないままにした。質量差がこの可能性を排除する場合、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを軽鎖に付加して、種間の十分な質量差を提供した。
ポリペプチド配列
ＣＡＴ－２２００及びＨ３の重鎖及びＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖のタンパク質配列を、実施例３に記載されるように獲得した。
ＰＤＢエントリー１ＪＰＴにおけるものに相当するＤ３Ｈ４４軽鎖（配列番号：１３）及び重鎖（配列番号：１２）のタンパク質配列をＤＮＡに逆翻訳し、哺乳類発現のためにコドン最適化し、及び遺伝子合成した（それぞれ配列番号：２８及び２７）。ペルツズマブ軽鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＨＣ３５９０２５．１、配列番号：１１）及び重鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＨＣ３５９０２４．１、配列番号：１０）のタンパク質配列をＤＮＡに逆翻訳し、哺乳類発現のためにコドン最適化し、及び遺伝子合成した（それぞれ配列番号：２６及び２５）。これらの抗体重鎖及び軽鎖のポリペプチド及びＤＮＡ配列は、表２に示されている。
二特異性キメラ抗体対照構築物の以下のセットを調製して、各二特異性システムに特有の軽鎖対合の量を査定した。
Ａ．対照Ｈ３／ペルツズマブキメラ二特異性抗体をコードする構築物のセットを調製した（表９における二特異性抗体（１）に相当する）：
・鎖ＡまたはＢに対する重鎖対合設計を含む、全長Ｈ３重鎖をコードする構築物（Ｈ１）、及びＨ３ ＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖をコードする構築物（Ｌ１）。
・Ｈ１に対する相補鎖に対する重鎖対合設計を有する、全長ペルツズマブ重鎖をコードする構築物（Ｈ２）、及びペルツズマブカッパ軽鎖をコードする構築物（Ｌ２）。
Ｂ．対照ＣＡＴ－２２００／Ｄ３Ｈ４４キメラ二特異性抗体をコードする構築物のセットを調製した（表９における二特異性抗体（２）及び（３）に相当する）：
・鎖ＡまたはＢに対する重鎖対合設計を含む、全長ＣＡＴ－２２００重鎖をコードする構築物（Ｈ１）、及びＣＡＴ－２２００ ＶＬ－ＣＫキメラ軽鎖をコードする構築物（Ｌ１）。
・Ｈ１に対する相補鎖に対する重鎖対合設計を有する、全長Ｄ３Ｈ４４重鎖をコードする構築物（Ｈ２）、及びＤ３Ｈ４４カッパ軽鎖をコードする構築物（Ｌ２）。
以下の付加的な構築物を、上で記載される二特異性キメラ抗体対照に基づいて調製した。
ａ．安定性最適化設計対照－これらの構築物は二特異性キメラ抗体対照と類似しているが、安定性最適化設計を含む。これらの対照は、表９における二特異性抗体（４）～（７）に相当する。
ｂ．設計された二特異性キメラ抗体－これらの構築物は二特異性キメラ抗体対照と類似しているが、安定性最適化設計及び軽鎖対合設計を含む。これらの対照は、表９における二特異性抗体（８）～（１５）に相当する。
図１２は、設計された二特異性キメラ抗体に含まれる種々のタイプの改変を示した、代表的な二特異性キメラ抗体構造を提供している。
設計に従ったアミノ酸改変を含む、ＣＡＴ－２２００及びＨ３ Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖、Ｄ３Ｈ４４及びペルツズマブカッパ軽鎖、ならびにそれぞれのＩｇＧ重鎖をコードする構築物を以下のように調製した。ＣＡＴ－２２００、Ｈ３、Ｄ３Ｈ４４、及びペルツズマブ軽鎖配列を、安定性最適化設計及び／または軽鎖のヘテロ二量体化を促進するためのカッパ－カッパ軽鎖対合設計に従ったアミノ酸改変を有して、実施例３に記載されるように調製した。これらの抗体に対する全長重鎖配列を、重鎖のヘテロ二量体化を促進するアミノ酸改変を有して、実施例３に記載されるように創出した。留意すべきは、標準的Ｃ末端重鎖リジン残基を除去して、Ｃ末端リジンクリッピングに起因したＬＣ－ＭＳシグナル不均一性を阻止したことである（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｗ．Ｄｉｃｋ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００８）１００：１１３２－４３）。ある場合には、ＦＬＡＧタグを軽鎖に付加して、すべての抗体及び半Ａｂ種間の５０Ｄａ差を実現し、その場合、軽鎖ベクターインサートは、５’－ＥｃｏＲＩ切り取り部位－ＨＬＡ－Ａシグナルペプチド－ＦＬＡＧタグ－軽鎖Ｉｇクローン－「ＴＧＡまたはＴＡＡ終止」－ＢａｍＨ１切り取り部位－３’からなった。
安定性最適化設計のみを有するキメラ二特異性抗体も調製して、そのような設計が、導入された軽鎖対合設計によってもたらされる優先的対合に対して何らかの効果を有するかどうかを査定し得た。
二特異性キメラ抗体構築物のトランスフェクション、発現、及び精製
軽鎖セットがＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖及びカッパ軽鎖、または安定性最適化設計を有するＶラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖及び導入されたカッパ－カッパ設計の有無でのカッパ軽鎖のいずれかである、各二特異性抗体システムの２本の重鎖及び２本の軽鎖をコードする構築物を、実施例４において先に記載されるようにＣＨＯ－３Ｅ７細胞にトランスフェクトし、５０ｍｌの総容量に、Ｈ１：Ｈ２：Ｌ１：Ｌ２の１５：１５：３５：３５比で合計５０μｇのＤＮＡをトランスフェクトした。
培養培地を遠心分離によって収穫し、Ｓｔｅｒｉｃｕｐ ０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ＃ＳＣＧＰＵ０５ＲＥ）を用いて真空濾過した。濾過された培養培地を、次いで、ＰＢＳ ｐＨ７．４であらかじめ平衡化されたプロテインＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃１７－５４３８－０２）を用いて精製した。樹脂に結合した抗体種を、次いでＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄し、１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファーｐＨ３．６で溶出した。溶出された抗体種を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ １５ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｆｉｌｔｅｒ Ｕｌｔｒａｃｅｌ １０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＃ＵＦＣ９０１０２４）を用いて遠心分離によってＰＢＳ ｐＨ７．４にバッファー交換した。発現した二特異性抗体サンプルの一部を、Ｍａｂ構築物精製に関して実施例３に記載される手順（バッチ様態）に従って代替的に精製した。抗体種を含有する、結果として生じたプロテインＡ精製されたＳＭＣＡサンプルを、脱グリコシル化及びＬＣ－ＭＳの前にＣａｌｉｐｅｒによって査定した。
質量分析法
二特異性抗体の背景においてカッパ－カッパ設計によって推進されるヘテロ二量体の優先的対合の程度を、プロテインＡ精製及び非変性脱グリコシル化の後に、質量分析を用いて査定した。二特異性抗体はＦｃ Ｎ－結合型グリカンのみを含有したため、ＳＭＣＡサンプルを１種のみの酵素Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ－Ｆ）で処理した。精製されたサンプルを、ＰＮＧａｓｅＦで以下のように脱グリコシル化した：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．０中０．２Ｕ ＰＮＧａｓｅＦ／抗体μｇ、３７℃で一晩のインキュベーション、０．５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度。脱グリコシル化の後、サンプルをＬＣ－ＭＳ分析の前に４℃で保管した。
脱グリコシル化されたタンパク質サンプルを、Ｉｏｎ Ｍａｘエレクトロスプレーソース（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を介してＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と連動したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムを用いて、インタクトＬＣ－ＭＳによって分析した。サンプル（５μｇ）を２．１×３０ｍｍ Ｐｏｒｏｓ Ｒ２逆相カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に注入し、以下の勾配条件：０～３分：２０％溶媒Ｂ；３～６分：２０～９０％溶媒Ｂ；６～７分：９０～２０％溶媒Ｂ；７～９分：２０％溶媒Ｂ、を用いて分解した。溶媒Ａは脱気した０．１％ギ酸水溶液であり、溶媒Ｂは脱気したアセトニトリルであった。流速は３ｍＬ／分であった。流れをポストカラムで分割して、１００μＬ／ｍＬをエレクトロスプレーインターフェースに向かわせた。カラムを８２．５℃に加熱し、溶媒をプレカラムで８０℃に加熱して、タンパク質ピーク形状を改善した。分析前に、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ’ｓ ＬＴＱ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｏｎ ＥＳＩキャリブレーション溶液（カフェイン、ＭＲＦＡ、及びＵｌｔｒａｍａｒｋ１６２１）を用いて較正し、１０ｍｇ／ｍＬのＣｓＩ溶液を用いて調整した。コーン電圧（ソースフラグメンテーション設定）はおよそ４８Ｖであり、ＦＴ分解能は７，５００であり、走査域はｍ／ｚ ４００～４，０００であった。ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬを、より大きなタンパク質（＞５０ｋＤａ）の最適な検出のために調整した。脱グリコシル化ＩｇＧ標準物質（Ｗａｔｅｒｓ ＩｇＧ標準物質）ならびに脱グリコシル化ｍＡｂ標準物質ミックス（２５：７５の半分：フルサイズｍＡｂ）を用いて、ＬＣ－ＭＳシステムをＩｇＧサンプル分析について評価した。
フルサイズの抗体及び半抗体からの多価イオンを含有する域（典型的に、それぞれｍ／ｚ ２０００～３８００及びｍ／ｚ １４００～２０００）を、機器制御及びデータ分析ソフトウェアであるＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）のＭａｘＥｎｔ１モジュールを用いて、分子量プロファイルに別個にデコンボリューションした。簡潔には、生のタンパク質ＬＣ－ＭＳデータを、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のスペクトル閲覧モジュールであるＱｕａｌＢｒｏｗｓｅｒでまず開き、Ｗａｔｅｒｓによって提供されるファイル変換プログラムであるＤａｔａｂｒｉｄｇｅを用いてＭａｓｓＬｙｎｘと適合するように変換した。変換されたタンパク質スペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘのスペクトルモジュールで閲覧し、ＭａｘＥｎｔ１を用いてデコンボリューションした。結果として生じた分子量プロファイルにおけるそれらのピーク高から、各サンプルにおける各抗体種の見かけの量を判定した。
結果
全体として、ほとんどの場合、脱グリコシル化処理は、ＬＣ－ＭＳによって同定される考え得る種々の抗体種のすべてを同定し得る能力をもたらした。多くの場合、各抗体種は、単一のＬＣ－ＭＳピークによって表された。例外には、所望の二特異性種に相当する可能性もある副次的ピーク（おそらく、リーダーペプチドの切断の際の付加物または異成分）が含まれたが、しかしながら、副次的ピークをもたらす種の同定は明白ではないため、これらの副次的ピークは、二特異性種への寄与において考慮されなかった。所望の二特異性種Ｈ１Ｌ１＿Ｈ２Ｌ２は、一般的に、ＬＣ－ＭＳに基づいて、誤対合タイプＨ１Ｌ２＿Ｈ２Ｌ１と実験上区別され得ない。そのため、二特異性抗体含有量が表において報告される場合、それがこのタイプの誤対合種を含有しないことを完全には排除し得ない。しかしながら、Ｈ１Ｌ２＿Ｈ１Ｌ２及びＨ２Ｌ１＿Ｈ２Ｌ１、ならびにＨ１Ｌ２及びＨ２Ｌ１半抗体などの種に関して観察される非常に低い含有量は、たとえあったとしてもごくわずかな誤対合種による二特異性種の混入しか生じないことを指し示す。
ＬＣ－ＭＳ分析結果は表９に報告されている。列８において、存在するすべての抗体種についてのパーセンテージとして、正しく対合した二特異性抗体（Ｈ１Ｌ１＿Ｈ２Ｌ２及びＨ１Ｌ２＿Ｈ２Ｌ１）の量に関する算出（図１１は、４本の鎖：Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、Ｌ２の共発現があると考え得るすべての種、種Ａ～Ｊを描写している）。列６において、半抗体種を除外した対合を測定するために、すべてのフルサイズの抗体種のみについてのパーセンテージとして、正しく対合した二特異性抗体（Ｈ１Ｌ１＿Ｈ２Ｌ２及びＨ１Ｌ２＿Ｈ２Ｌ１＊＊）の量に関する算出が提供されている。安定性最適化設計のみを有するまたはカッパ－カッパ軽鎖対合設計と組み合わせた安定性最適化設計を有する、正しく対合したキメラ二特異性抗体（設計されたキメラ二特異性抗体）の量と、キメラ二特異性抗体対照のものとの比較が、それぞれ列７及び９に報告されている。Ｈ３／ペルツズマブシステムの場合、すべての抗体及び半Ａｂ種間の５０Ｄａ差を実現するためにペルツズマブの軽鎖にＦＬＡＧタグを要したため、同等の比較は不可能であった。このシステムに関しては、報告される値の隣の「＊」によって示される、同様の構築物（すなわち、ペルツズマブ軽鎖にＦＬＡＧタグを含有するキメラ二特異性抗体対照）に対して比較を実施した。分析された二特異性サンプルに存在する支配的な誤対合種はＨ１Ｈ２Ｌ１Ｌ１であり、サンプルに存在するすべての抗体種についてのパーセンテージとしてのその量が列１０に報告されている。
Ｈ３／ペルツズマブ及びＣＡＴ－２２００／Ｄ３Ｈ４４の両システムにおいて、二特異性抗体含有量は、二特異性キメラＡｂ対照と比較して、二特異性キメラ抗体への安定性最適化設計の導入があるとわずかな程度減少した（列９）。Ｈ３／ペルツズマブ及びＣＡＴ－２２００／Ｄ３Ｈ４４システムにおいて、列８において規定される、設計された二特異性キメラ抗体の、すなわち安定性最適化設計とともにカッパ－カッパ軽鎖対合設計を有する、二特異性抗体含有量は、試験された２セットの安定性最適化設計及び２セットのカッパ－カッパ軽鎖対合設計にわたって大いに匹敵し、６４．６～８６．４％の値域内にあった。これは、Ｈ３／ペルツズマブシステムにおける２５．３～３６％、及びＣＡＴ－２２００／Ｄ３Ｈ４４システムにおける４６．３～８０．４％という、二特異性キメラ対照のものと比較した、所望の二特異性種含有量の増加に翻訳された（列９）。特異的タイプのカッパ－カッパ設計（すなわち、設計９０６０～９７５６または９８２０～９８２３のいずれか）は、ＣＡＴ－２２００／Ｄ３Ｈ４４システムにおける値の観察された変動（値域）に優位に関与した。列７において示される、これらの設計の二特異性含有量の向上の同程度の値域は、試験されたサンプルにおける半抗体種の低い含有量を反映する。
表９におけるデータは、試験されたカッパ－カッパ軽鎖対合設計が、二特異性キメラ抗体対照のものと比較して、設計された二特異性キメラ抗体の二特異性抗体含有量の実質的な増加を促進し得たことを実証している。このことは、Ｖラムダ－Ｃカッパキメラ軽鎖における安定性最適化設計が、ここで試験されたカッパ－カッパ軽鎖対合設計と適合することを示す。
本明細書の本文内で引用されたすべての参考文献、発行済み特許、特許出願、及び配列アクセッション番号（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）は、すべての目的のために参照によりそれらの全体として本明細書によって組み入れられる。
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Claims (22)

  1. ａ）重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）配列及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、第一の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド構築物（Ｈ１）と、
    ｂ）カッパ軽鎖定常ドメイン（Ｃカッパ）配列及びラムダ軽鎖可変ドメイン（Ｖラムダ）配列を含む、第一のキメラ免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド構築物（Ｌ１）
    とを含むキメラヘテロ二量体であって、
    前記Ｖラムダ配列は、安定化アミノ酸改変を有しない対応する野生型キメラヘテロ二量体と比較して、前記キメラヘテロ二量体の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）又は示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）によって測定される融解温度を増加させる１つまたは複数の前記安定化アミノ酸改変を含み、
    Ｈ１及びＬ１は、第一のエピトープに結合する第一のＦａｂ領域を形成し、
    前記１つまたは複数の前記安定化アミノ酸改変は、残基８３若しくは残基８５の置換、又は両残基の置換を含み、残基８３はＦ、Ｖ、Ｉ若しくはＡで置換されており、残基８５はＴ若しくはＶで置換されており、そして
    アミノ酸残基の番号付けはＫａｂａｔに従う、前記キメラヘテロ二量体。
  2. 前記Ｖラムダ配列は、前記Ｃカッパ配列及び前記Ｖラムダ配列間の接合部分における１つまたは複数のアミノ酸残基に安定化アミノ酸改変をさらに含み、前記１つまたは複数のアミノ酸残基は、残基８０、１０５、および１０６からなる群から選択され、残基８０はＡまたはＰで置換され、残基１０５はＥで置換され、そして残基１０６はＩで置換されている、請求項１に記載のキメラヘテロ二量体。
  3. Ｖラムダ配列が、残基８３、８５、１０５および１０６からなる群より選択される２以上の残基の安定化アミノ酸改変を含み、残基８３がＦ、Ｖ、ＩまたはＡで置換され、残基８５がＴまたはＶで置換され、残基１０５がＥで置換され、そして残基１０６がＩで置換されている、請求項１または２に記載のキメラヘテロ二量体。
  4. 前記キメラヘテロ二量体のＶラムダ配列が、
    （ａ）８３Ｆ、１０５Ｅおよび１０６ＡＫ；
    （ｂ）８３Ｆ、１０５Ｅ、Ｖ１０６Ｉおよび１０６ＡＫ；
    （ｃ）８０Ａ、８３Ｆ、１０５Ｅおよび１０６ＡＫ；
    （ｄ）８０Ａ、８３Ｆ、１０５Ｅ、１０６Ｉおよび１０６ＡＫ；
    （ｅ）８０Ａ、８３Ｆ、８５Ｔ、１０５Ｅおよび１０６ＡＫ；
    （ｆ）８０Ａ、８３Ｆ、８５Ｔ、１０５Ｅ、１０６Ｉおよび１０６ＡＫ；
    （ｇ）８０Ｐ、８３Ｆ、８５Ｔ、１０５Ｅ、１０６Ｉおよび１０６ＡＫ；
    （ｈ）８５Ｔ；
    （ｉ）８５Ｖ；
    （ｊ）８３Ｆ；
    （ｋ）８３Ｆおよび１０５Ｅ；
    （ｌ）８３Ｆおよび１０６Ｉ；
    （ｍ）８３Ｆおよび８５Ｔ；
    （ｎ）８３Ｆ、８５Ｔおよび１０５Ｅ；
    （ｏ）８３Ｆ、８５Ｖおよび１０５Ｅ；
    （ｐ）８３Ｆ、８５Ｔ、１０５Ｅおよび１０６Ｉ；
    （ｑ）８３Ｆ、８５Ｖ、１０５Ｅおよび１０６Ｉ；
    （ｒ）８３Ｆ、８５Ｔ、１０５Ｅ、１０６Ｉおよび１０６ＡＫ；
    （ｓ）８３Ｖ；
    （ｔ）８３Ｖおよび１０５Ｅ；
    （ｕ）８３Ｖおよび１０６Ｉ；
    （ｖ）８３Ｖおよび８５Ｔ；
    （ｗ）８３Ｖ、８５Ｔおよび１０５Ｅ；
    （ｘ）８３Ｖ、８５Ｖおよび１０５Ｅ；
    （ｙ）８３Ｖ、８５Ｔ、１０５Ｅおよび１０６Ｉ；
    （ｚ）８３Ｉ；
    （ａａ）８３Ｉおよび１０５Ｅ；
    （ｂｂ）８３Ｉおよび８５Ｔ；
    （ｃｃ）８３Ｉ、８５Ｔおよび１０５Ｅ；
    （ｄｄ）８３Ｉ、８５Ｔ、１０５Ｅおよび１０６Ｉ；
    （ｅｅ）８３Ａ；
    （ｆｆ）８３Ａおよび１０５Ｅ；
    （ｇｇ）８３Ａおよび８５Ｔ；
    （ｈｈ）８３Ａ、８５Ｔおよび１０５Ｅ、又は
    （ｉｉ）８３Ａ、８５Ｔ、１０５Ｅおよび１０６Ｉ
    を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体。
  5. ａ）第一のヘテロ二量体であって、前記第一のヘテロ二量体は、請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体である、前記第一のヘテロ二量体、及び
    ｂ）足場
    を含む抗体構築物であって、前記第一のヘテロ二量体のＨ１及びＬ１の少なくとも一方は、リンカーの有りまたは無しで前記足場に連結されている、前記抗体構築物。
  6. 第二のヘテロ二量体をさらに含み、前記第二のヘテロ二量体は、
    ｉ）重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）配列及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、第二の免疫グロブリン重鎖ポリペプチド構築物（Ｈ２）と、
    ｉｉ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）配列及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む、第二の免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド構築物（Ｌ２）
    とを含み、Ｈ２及びＬ２は、第二のエピトープに結合する第二のＦａｂ領域を形成し、かつＨ２及びＬ２の少なくとも一方は、リンカーの有りまたは無しで前記足場に連結されている、請求項５に記載の抗体構築物。
  7. 前記第一のエピトープ及び前記第二のエピトープは同じである、請求項６に記載の抗体構築物。
  8. 前記第一のエピトープ及び前記第二のエピトープは互いに異なる、請求項６に記載の抗体構築物。
  9. 前記第一のヘテロ二量体、第二のヘテロ二量体、または両ヘテロ二量体は、軽鎖対合を促進する１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項６～８のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  10. 前記足場は、第一の重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）配列及び第二のＣＨ３配列を含むＦｃ領域である、請求項６～９のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  11. 前記第一のＣＨ３配列及び前記第二のＣＨ３配列はそれぞれ、ホモ二量体ＣＨ３ドメインと比較して、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインの形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項１０に記載の抗体構築物。
  12. 前記Ｆｃ領域は、第一の定常ドメイン２（ＣＨ２）配列及び第二のＣＨ２配列をさらに含む、請求項１０～１１のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  13. 前記Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＡ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ Ｆｃ、ヒトＩｇＤ Ｆｃ、ヒトＩｇＥ Ｆｃ、ヒトＩｇＭ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃである、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  14. 前記リンカーは１つまたは複数のポリペプチドリンカーである、請求項５～１３のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  15. 前記リンカーは１つまたは複数の抗体ヒンジ領域を含む、請求項５～１４のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  16. 前記リンカーは１つまたは複数のＩｇＧ１ヒンジ領域を含む、請求項５～１５のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  17. 前記抗体構築物は薬物に抱合されている、請求項５～１６のいずれか１項に記載の抗体構築物。
  18. 請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体、または請求項５～１７のいずれか１項に記載の抗体構築物、及び薬学的に許容されるキャリアを含む、薬学的組成物。
  19. 請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体、または請求項５～１６のいずれか１項に記載の抗体構築物をコードする、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
  20. 請求項１９に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットのうちの１つまたは複数を含む、ベクターまたはベクターのセット。
  21. 請求項１９に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、または請求項２０に記載のベクターもしくはベクターのセットを含む、単離された細胞。
  22. （ａ）請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体、または請求項５～１６のいずれか１項に記載の抗体構築物をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含む宿主細胞を獲得するステップ；
    （ｂ）前記宿主細胞を、前記キメラヘテロ二量体または抗体構築物の発現を可能にする条件下での宿主細胞培養において培養するステップ；及び
    （ｃ）前記宿主細胞培養から前記キメラヘテロ二量体または抗体構築物を回収するステップ
    を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラヘテロ二量体、または請求項５～１６のいずれか１項に記載の抗体構築物を調製する方法。
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