KR102611853B1 - 안정화된 키메라 fabs - Google Patents
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Abstract
본 명세서의 요약서
람다 경쇄를 갖는 부모 키메라 Fab로부터 유래된 안정화된 키메라 Fabs가 본원에서 제공된다. 상기 안정화된 키메라 Fabs는 상기 부모 키메라 Fab의 면역글로블린 중쇄 폴리펩티드 구조체를 포함하고, CH1 서열 및 VH 서열, 뿐만 아니라 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체를 보유한다. 키메라 경쇄 구조체의 V람다 서열은 상기 부모 키메라 Fab의 것에 대응하며, 그리고 상기 부모 키메라 Fab와 비교하여 상기 안정화된 키메라 Fab의 열 안정성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 상기 안정화된 Fabs는 치료 폴리펩티드로 유용하며, 또는 다른 포멧의 항체 구조체를 만들 때 이용될 수 있다. 상기 안정화된 키메라 Fabs는 람다 경쇄를 갖는 항체의 안정성을 증가시키는데 일반적으로 또한 유용할 수 있다.
람다 경쇄를 갖는 부모 키메라 Fab로부터 유래된 안정화된 키메라 Fabs가 본원에서 제공된다. 상기 안정화된 키메라 Fabs는 상기 부모 키메라 Fab의 면역글로블린 중쇄 폴리펩티드 구조체를 포함하고, CH1 서열 및 VH 서열, 뿐만 아니라 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체를 보유한다. 키메라 경쇄 구조체의 V람다 서열은 상기 부모 키메라 Fab의 것에 대응하며, 그리고 상기 부모 키메라 Fab와 비교하여 상기 안정화된 키메라 Fab의 열 안정성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 상기 안정화된 Fabs는 치료 폴리펩티드로 유용하며, 또는 다른 포멧의 항체 구조체를 만들 때 이용될 수 있다. 상기 안정화된 키메라 Fabs는 람다 경쇄를 갖는 항체의 안정성을 증가시키는데 일반적으로 또한 유용할 수 있다.
Description
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본 출원은 EFS-Web을 통하여 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 2018년 6월 27일에 만들어진 ASCII 복사본은 2018-06-27 (097993-1092280 (001610WO)) 서열 Listing.txt로 명명되며, 크기는 45 바이트이다.
배경
항체는 항체는 연구 도구, 진단 및 물론 치료제를 포함한 많은 응용 분야에서 용도를 가지며, 이들은 모두 대량의 항체를 필요로 한다. 열 안정성과 같은 항체의 물리적 특성은 항체의 제조 가능성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 열 안정성이 낮은 항체, 또는 응집하는 항체는 제작 및 보관이 힘들다.
자연 발생 항체 및 인위적으로 생성된 항체 (예를 들면, 파아지 디스플레이, 또는 재조합 공학에 의해)는 다양한 열 안정성을 나타내는데, 인위적으로 생성된 항체는 대개 제작이 곤란한 열 안정성 수준을 갖는다 (McConnell 외. (2014) mAbs: 6:1274-1282). 더욱이, 합성 Fab 라이브러리로부터 확인된 항체에서, 람다 경쇄의 가변 도메인을 함유하는 항체의 평균 용융 온도는 카파 경쇄의 가변 도메인들을 함유하는 항체의 것보다 더 낮다고 제시되었다 (Tiller 외. (2013) Mabs 5:3, 445-470).
몇 가지 목적으로 키메라 경쇄를 포함하는 키메라 Fabs가 작제될 수 있다. 예를 들면, 자연 발생적 포멧의 항체를 획득하기 위하여, 키메라 Fabs는 파아지 디스플레이-생성된 scFvs를 Fab 포멧으로 전환시에 만들어질 수 있다. 추가적으로, 마우스-인간 키메라 항체는 인간에게서 마우스 항체의 면역원성을 감소시키기 위하여 작제될 수 있다. 키메라 Fabs는 가변 람다 도메인 및 불변 카파 도메인 (V람다-C카파) 또는 가변 카파 도메인 및 불변 람다 도메인 (V카파-C람다)을 포함할 수 있다. 키메라 경쇄를 갖는 키메라 Fabs는 부모 람다 경쇄를 포함하는Fab와 비교하였을 때, 열 안정성의 감소를 대개 나타낸다.
따라서, 항체의 제작가능성을 개선시키기 위하여, 키메라 Fabs의 열 안정성, 뿐만 아니라 람다 경쇄를 갖는 항체의 열 안정성을 증가시킬 필요가 있다.
간단한 요약
본 명세서는 안정화된 키메라 Fabs를 제공한다. 한 측면에서, 다음을 포함하는 안정화된 키메라 Fab 또는 키메라 이형이량체가 제공된다: 중쇄 불변 도메인 1 (CH1) 서열 및 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 제 1 면역글로블린 중쇄 폴리펩티드 구조체 (H1), 그리고 카파 경쇄 불변 도메인 (C카파) 서열 및 람다 경쇄 가변 도메인 (V람다) 서열을 포함하는 제 1 키메라 면역글로블린 경쇄 폴리펩티드 구조체 (L1), 상기 V람다 서열은 대응하는 야생형 키메라 이형이량체 안정화 아미노산 치환 없는 대응하는 야생형 키메라와 비교하였을 때, 키메라 이형이량체의 열 안정성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하고, 이때 H1 및 L1은 제 1 에피토프에 결합하는 제 1 Fab 영역을 형성한다.
또다른 측면에서, 다음을 포함하는 항체 구조체가 제공된다: 제 1 이형이량체, 이때 상기 제 1 이형이량체는 본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fab 또는 키메라 이형이량체, 그리고 스캐폴드(scaffold), 이때 전술한 제 1 이형이량체의 H1 및 L1중 최소한 하나는 링커와 함께, 또는 링커없이 상기 스캐폴드에 연계된다(linked).
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fab 또는 키메라 이형이량체, 또는 항체 구조체, 그리고 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fab 또는 키메라 이형이량체, 또는 항체 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트가 제공된다.
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는 벡터 또는 벡터 세트가 제공된다.
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 세트, 벡터, 또는 벡터 세트를 포함하는 단리된 세포가 제공된다.
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fab 또는 키메라 이형이량체, 또는 항체 구조체를 준비하는 방법이 제공되는데, 이 방법은, 다음의 단계들을 포함한다: 키메라 이형이량체 또는 항체 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는 숙주 세포를 획득하고; 상기 키메라 이형이량체 또는 항체 구조체의 발현이 허용되는 조건하에 숙주 세포 배양물내 숙주 세포를 배양하고, 그리고 상기 숙주 세포 배양물로부터 키메라 이형이량체 또는 항체 구조체를 수집한다.
또다른 측면에서, 카파 경쇄 불변 도메인 (C카파) 서열 및 람다 경쇄 가변 도메인 (V람다) 서열를 포함하는 키메라 경쇄 폴리펩티드 구조체를 제공하고, 상기 V람다 서열은 키메라 경쇄를 포함하는 키메라 이형이량체의 열 안정성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 치환을 포함한다.
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 키메라 경쇄 폴리펩티드 구조체, 그리고 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 키메라 경쇄 폴리펩티드 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또다른 측면에서, 람다 면역글로블린 경쇄 및 면역글로블린 중쇄를 포함하는 항체의 열 안정성을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다: 항체의 V람다 서열, 그리고 카파 경쇄를 갖는 항체의 C카파 서열을 포함하는 V람다-C카파 키메라 경쇄를 준비하고, 이때 V람다 서열은 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하고, 그리고 면역글로블린 중쇄와 함께 V람다-C카파 키메라 경쇄를 발현시켜, 열 안정성이 증가된 항체를 획득한다.
또다른 측면에서, 대상의 암, 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 감염성 질환을 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 효과량의 본원에서 기술된 키메라 이형이량체 또는 항체 구조체를 대상 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
또다른 측면에서, 대상에게서 암, 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 감염성 질환의 치료에 있어서 효과량의 본원에서 기술된 키메라 이형이량체 또는 항체 구조체의 용도를 제공한다. 한 구체예에서, 암, 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 감염성 질환 치료용 약물 제조에 있어서 본원에서 기술된 키메라 이형이량체 또는 항체 구조체의 용도를 제공한다. 또다른 구체예에서, 대상에게서 암, 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에서 기술된 키메라 이형이량체 또는 항체 구조체가 제공된다.
도 1은 V람다-C카파 키메라 Fab의 도식 표현 및 V람다-C카파 키메라 Fab의 열 안정성을 개선시키기 위하여 취한 공학적 접근법을 나타낸다. WT (야생형) 람다 Fab (부모 람다 Fab라고도 칭함)를 나타내는데, 야생형 중쇄 Fab 서열 (VH 및 CH1 도메인들, 회색으로 채워짐) 및 야생형 람다 경쇄 (흰색으로 채워짐)를 갖는다. V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체를 만들기 위하여, 이 부모 람다 Fab는 부모 람다 경쇄의 C람다 서열을 C카파 서열과 교환함으로써, 부모 키메라 Fab (V람다-C카파 키메라 Fab)로 공작될 수 있다. 따라서, V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 C카파 서열 (빗금으로 채워짐)에 융합된 부모 람다 Fab (흰색으로 채워짐)의 V람다 서열을 포함한다. 부모 키메라 Fab의 열 안정성은 V람다 서열 안에 가변 카파와 불변 카파 도메인들 (V카파-C카파) 사이에서 관찰되는 계면을 모방하는 돌연변이를 도입시키고, 이로써 V람다-C카파 계면(interface)의 양립성이 개선되는 결과에 의해 증가될 수 있다. 이 안정화된 키메라 Fab는 도 1에서 "기획된 V람다-C카파 키메라 Fab"로 나타내며, 여기에서 별표는 안정화 아미노산 변형 (안정성 최적화 디자인으로 또한 지칭됨)을 나타낸다. 부모 키메라 Fabs는 본원에서 또한 "야생형 키메라 이형이량체"로 지칭된다.
도 2는 항체 CAT-2200의 예시적인 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 서열을 나타낸다. CAT-2200에 대응하는 WT 람다 경쇄 서열 (PDB 엔트리 2VXS, 쇄 L)은 상기 CAT-2200 항체에 기초한 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체와 나란히 배열되어, 이들 두 구조체 간의 차이를 강조한다. V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 잔기 L106A에서 끝나는 CAT-2200의 람다 가변 도메인 서열과 위치 R108에서 출발하는 IGKC*01에 대응하는 카파 불변 도메인 서열을 포함한다. EMBL-EBI 웹사이트를 참고하였을 때, 별표 (*)는 단일 보존된 잔기를 갖는 위치를 나타내고; 콜론(:)은 상당히 유사한 성질들의 집단 간에 보존을 나타내고; 마침표 (.)는 유사성이 매우 약한 집단 간에 보존을 나타내고; 그리고 합의(consensus) 기호가 없다는 것은 매우 상이한 잔기를 나타낸다.
도 3a-3d는 경쇄에서 가변 도메인-불변 도메인 계면의 리본 다이아그램을 도시한다. 도 3a는 Fab의 도식적 표시를 나타낸다. 상자 영역에 대응하는 영역은 대응하는 도 3b 내지 3d에 확대되어 있다. 도 3b 는 V카파-C카파 계면에서 핫 스팟 잔기 83, 85 및 105를 강조한다 (D3H44 항체, PDB:1jpt). 도 3c는 V람다-C람다 계면 (CAT-2200 항체, PDB:2vxs)을 나타내며, 또한 잔기 83, 85 및 105를 강조한다. 도 3d 는 최적화되지 않은(unoptimized) V람다-C카파 계면 (항체 S4, PDB: 3nps)을 나타내며, 다시 잔기 83, 85 및 105를 강조한다.
도 4는 Mab 형식에 적용된 도 1과 유사한 도해로 나타내는데, WT 람다 Mab, V람다-C카파 키메라 Mab 및 기획된 V람다-C카파 키메라 Mab (안정화된 Mab로도 또한 지칭됨)을 도시하고, 여기에서 별표는 안정성 최적화 디자인의 존재를 보여준다.
도 5는 CAT-2200 시스템에서 선별된 기획된 키메라 Fabs (CAT-2200 항체 중쇄의 가변 영역은 VH3 생식계열 하위집단에 속하고, 단백질-A에 결합하는 능력을 갖는다), Mabs 그리고 각각의 야생형 포멧에 대한 단백질-A 역가(titers)를 비교한 것을 제공한다. 3개의 독립적인 50 ml 형질감염으로부터의 평균 단백질-A 역가 (mg/L)가 플롯된다.
도 6a-6b는 83X 디자인 테마 안에 그리고 이를 가로질러 안정화 아미노산 변형의 효과를 나타내며, 여기에서 상이한 부모 키메라 Fabs에 근거하였을 때, X= F, V, I, A이다. 도 6a는 CAT-2200 람다 항체에 기초하여 안정화된 키메라 Fabs의 열 안정성을 나타내고; 그리고 도 6b는 H3 람다 항체에 기초하여 안정화된 키메라 Fabs의 열 안정성을 나타낸다. 각각의 부모 키메라 Fab의 것과 비교하였을 때, 안정화된 키메라 Fab의 Tm에서의 변화(DSF에 의해 측정됨)가 테마 디자인 수에 대하여 플롯된다.
도 7은 상이한 Fab 시스템에 걸쳐 열 안정성의 증가 정도를 도시한다. 3가지 테스트 시스템 H3, CAT-2200 및 EP6b_B01에서 7개의 선별된 디자인(모든 테마를 커버함)에 대하여 각각의 부모 키메라 Fab의 것과 비교하였을 때, 기획된 키메라 Fab의 Tm에서의 변화(DSC에 의해 측정됨)가 플롯된다.
도 8은 Fab에서 Mab 포멧으로의 안정성 증가의 이동성을 드러낸다. 2개의 테스트 시스템 H3 및 CAT-2200에 대하여 각각의 키메라 Fab 또는 Mab의 것과 비교하였을 때, 7가지 선별된 기획된 키메라 Fabs 및 Mabs의 Tm에서의 변화(DSC에 의해 측정됨)가 플롯된다.
도 9a-9b는 H3 항체 시스템에서 2개의 디자인 (디자인 18 및 39)의 하위집단 상에 기획된 키메라 Fabs (도 9a) 및 Mabs (도 9b)의 전형적인 DSC 프로파일을 도시한다. 각각의 야생형 그리고 키메라 Fabs 및 Mabs에 대한 DSC 프로파일은 참조용으로 포함된다.
도 10a-10f는 벤치탑 안정성 연구의 상이한 시점에서 H3 시스템에 기초한 기획된 키메라 Mabs의 전형적인 단분산 UPLC-SEC 프로파일을 도시한다. 이 연구는 37℃에서 PBS 완충액 pH 7.4에서 5 mg/ml 농도에서 실행되었다. 도 10a, 10c, 그리고 10e는 차례로 0일, 20일, 그리고 30일에 야생형 람다 Mab의 UPLC-SEC 프로파일을 나타낸다. 도 10b, 10d, 그리고 10f는 차례로 0일, 20일 30일에 디자인 37에 대응하는 안정화 아미노산 변형을 갖는 안정화된 Mab의 UPLC-SEC 프로파일을 나타낸다.
도 11은 세포에서 2개의 상이한 경쇄가 2개의 상이한 중쇄와 함께 공동-발현될 때, 예상될 수 있는 잠재적 중쇄-연합된 산물을 도시한다. 선호적 페어링(pairing)은 SMCA (단일클론성 항체 경쟁 분석)을 이용하여 평가된다.
도 12는 부모의 Fab 1 (카파 Fab) 및 부모의 Fab 2 (기획된 V람다-C카파 키메라 Fab)로 구성된 예시적인 기획된 이중특이적 키메라 항체의 도식적 표시를 나타내고, 여기에서 별표는 안정성 최적화 디자인을 나타내고, 직사각형 기호는 경쇄 페어링 디자인 또는 중쇄 페어링 디자인을 나타낸다.
도 2는 항체 CAT-2200의 예시적인 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 서열을 나타낸다. CAT-2200에 대응하는 WT 람다 경쇄 서열 (PDB 엔트리 2VXS, 쇄 L)은 상기 CAT-2200 항체에 기초한 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체와 나란히 배열되어, 이들 두 구조체 간의 차이를 강조한다. V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 잔기 L106A에서 끝나는 CAT-2200의 람다 가변 도메인 서열과 위치 R108에서 출발하는 IGKC*01에 대응하는 카파 불변 도메인 서열을 포함한다. EMBL-EBI 웹사이트를 참고하였을 때, 별표 (*)는 단일 보존된 잔기를 갖는 위치를 나타내고; 콜론(:)은 상당히 유사한 성질들의 집단 간에 보존을 나타내고; 마침표 (.)는 유사성이 매우 약한 집단 간에 보존을 나타내고; 그리고 합의(consensus) 기호가 없다는 것은 매우 상이한 잔기를 나타낸다.
도 3a-3d는 경쇄에서 가변 도메인-불변 도메인 계면의 리본 다이아그램을 도시한다. 도 3a는 Fab의 도식적 표시를 나타낸다. 상자 영역에 대응하는 영역은 대응하는 도 3b 내지 3d에 확대되어 있다. 도 3b 는 V카파-C카파 계면에서 핫 스팟 잔기 83, 85 및 105를 강조한다 (D3H44 항체, PDB:1jpt). 도 3c는 V람다-C람다 계면 (CAT-2200 항체, PDB:2vxs)을 나타내며, 또한 잔기 83, 85 및 105를 강조한다. 도 3d 는 최적화되지 않은(unoptimized) V람다-C카파 계면 (항체 S4, PDB: 3nps)을 나타내며, 다시 잔기 83, 85 및 105를 강조한다.
도 4는 Mab 형식에 적용된 도 1과 유사한 도해로 나타내는데, WT 람다 Mab, V람다-C카파 키메라 Mab 및 기획된 V람다-C카파 키메라 Mab (안정화된 Mab로도 또한 지칭됨)을 도시하고, 여기에서 별표는 안정성 최적화 디자인의 존재를 보여준다.
도 5는 CAT-2200 시스템에서 선별된 기획된 키메라 Fabs (CAT-2200 항체 중쇄의 가변 영역은 VH3 생식계열 하위집단에 속하고, 단백질-A에 결합하는 능력을 갖는다), Mabs 그리고 각각의 야생형 포멧에 대한 단백질-A 역가(titers)를 비교한 것을 제공한다. 3개의 독립적인 50 ml 형질감염으로부터의 평균 단백질-A 역가 (mg/L)가 플롯된다.
도 6a-6b는 83X 디자인 테마 안에 그리고 이를 가로질러 안정화 아미노산 변형의 효과를 나타내며, 여기에서 상이한 부모 키메라 Fabs에 근거하였을 때, X= F, V, I, A이다. 도 6a는 CAT-2200 람다 항체에 기초하여 안정화된 키메라 Fabs의 열 안정성을 나타내고; 그리고 도 6b는 H3 람다 항체에 기초하여 안정화된 키메라 Fabs의 열 안정성을 나타낸다. 각각의 부모 키메라 Fab의 것과 비교하였을 때, 안정화된 키메라 Fab의 Tm에서의 변화(DSF에 의해 측정됨)가 테마 디자인 수에 대하여 플롯된다.
도 7은 상이한 Fab 시스템에 걸쳐 열 안정성의 증가 정도를 도시한다. 3가지 테스트 시스템 H3, CAT-2200 및 EP6b_B01에서 7개의 선별된 디자인(모든 테마를 커버함)에 대하여 각각의 부모 키메라 Fab의 것과 비교하였을 때, 기획된 키메라 Fab의 Tm에서의 변화(DSC에 의해 측정됨)가 플롯된다.
도 8은 Fab에서 Mab 포멧으로의 안정성 증가의 이동성을 드러낸다. 2개의 테스트 시스템 H3 및 CAT-2200에 대하여 각각의 키메라 Fab 또는 Mab의 것과 비교하였을 때, 7가지 선별된 기획된 키메라 Fabs 및 Mabs의 Tm에서의 변화(DSC에 의해 측정됨)가 플롯된다.
도 9a-9b는 H3 항체 시스템에서 2개의 디자인 (디자인 18 및 39)의 하위집단 상에 기획된 키메라 Fabs (도 9a) 및 Mabs (도 9b)의 전형적인 DSC 프로파일을 도시한다. 각각의 야생형 그리고 키메라 Fabs 및 Mabs에 대한 DSC 프로파일은 참조용으로 포함된다.
도 10a-10f는 벤치탑 안정성 연구의 상이한 시점에서 H3 시스템에 기초한 기획된 키메라 Mabs의 전형적인 단분산 UPLC-SEC 프로파일을 도시한다. 이 연구는 37℃에서 PBS 완충액 pH 7.4에서 5 mg/ml 농도에서 실행되었다. 도 10a, 10c, 그리고 10e는 차례로 0일, 20일, 그리고 30일에 야생형 람다 Mab의 UPLC-SEC 프로파일을 나타낸다. 도 10b, 10d, 그리고 10f는 차례로 0일, 20일 30일에 디자인 37에 대응하는 안정화 아미노산 변형을 갖는 안정화된 Mab의 UPLC-SEC 프로파일을 나타낸다.
도 11은 세포에서 2개의 상이한 경쇄가 2개의 상이한 중쇄와 함께 공동-발현될 때, 예상될 수 있는 잠재적 중쇄-연합된 산물을 도시한다. 선호적 페어링(pairing)은 SMCA (단일클론성 항체 경쟁 분석)을 이용하여 평가된다.
도 12는 부모의 Fab 1 (카파 Fab) 및 부모의 Fab 2 (기획된 V람다-C카파 키메라 Fab)로 구성된 예시적인 기획된 이중특이적 키메라 항체의 도식적 표시를 나타내고, 여기에서 별표는 안정성 최적화 디자인을 나타내고, 직사각형 기호는 경쇄 페어링 디자인 또는 중쇄 페어링 디자인을 나타낸다.
상세한 설명
키메라 Fabs는 키메라 경쇄를 포함하는 Fabs이다. 본 명세서의 내용에서, 키메라 Fabs는 람다 경쇄의 경쇄 가변 도메인 서열 (V람다 서열)과 카파 경쇄의 경쇄 불변 도메인 서열 (C카파 서열)을 갖는 키메라 경쇄 구조체를 포함할 수 있다. 이러한 키메라 경쇄는 본원에서 V람다-C카파 키메라 경쇄 (V람다-C카파 키메라 경쇄)라고 불린다. 많은 경우들에서, V람다-C카파 키메라 경쇄를 갖는 키메라 Fabs는 야생형 람다 경쇄를 포함하는 부모 Fab와 비교하였을 때, 열 안정성의 감소를 나타낼 수 있다. 더욱이, 람다 경쇄를 갖는 많은 항체는 카파 경쇄를 갖는 항체와 비교하였을 때, 감소된 열 안정성을 나타낸다. 열 안정성의 감소는 이러한 키메라 Fabs를 함유하는 항체를 치료 항체 개발에 요구되는 필요한 품질과 필요한 양으로의 제작을 어렵게 만들 수 있다.
변형된 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체와 VH 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 안정화된 키메라 Fabs를 본원에서 제공한다. 상기 변형된 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 키메라 Fab의 열 안정성을 증가시키는 하나 또는 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하는 V람다 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 안정화 아미노산 변형은 V람다와 C카파 도메인 사이의 계면에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 야생형 람다 경쇄를 갖는 대응하는 야생형 Fab (야생형 람다 Fab)의 것보다 훨씬 더 큰 열 안정성을 나타낼 수 있다. 상기 안정화 아미노산 변형은 상이한 항체 시스템에 걸쳐 이동가능하고, 상기 안정화된 키메라 Fab의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주지 않거나, 또는 거의 영향을 주지 않는다. 상기 안정화 아미노산 변형을 갖는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 Mab 포멧의 항체로 제시될 때, 상기 안정화 아미노산 변형은 이 항체의 Fc 감마 수용체들 또는 FcRn에 결합하는 능력에 영향을 주지 않는다.
상기 안정화된 키메라 Fabs는 치료 폴리펩티드로 유용하거나, 또는 Mab 포멧 또는 다른 항체 포멧을 포함하는 다른 포멧의 항체 구조체를 만드는데 이용될 수 있고, 여기에서 V람다-C카파 키메라 경쇄가 존재한다. 상기 안정화된 키메라 Fabs는 람다 경쇄를 갖는 항체의 안정성을 증가시키는데 일반적으로 또한 유용할 수 있다. 이 내용에서, 상기 부모 람다 항체는 열 안정성을 증가시키기 위하여, 상기 안정화 아미노산 변형을 포함하는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체를 갖도록 준비될 수 있다.
정의
다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 청구된 주제가 속하는 분야의 통상적 숙련자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 용어에 대한 다수의 정의들이 있는 경우, 이 단락에 있는 정의가 우선한다. 참고문헌은 URL 또는 기타 이러한 식별자 또는 주소에 대하여 만들어지며, 이러한 식별자는 변화될 수 있고, 인터넷 상에서 특정 정보가 오고 갈 수 있지만, 인터넷 검색에 의해 등가의 정보가 발견될 수 있다. 본 명세서에 대한 참고자료는 이러한 정보의 이용성 및 일반 대중에 전파를 입증한다.
전술한 전반적인 설명 및 다음의 상세선 설명은 예시적이며 설명을 위함이고, 청구되는 임의의 주제를 제한하는 것이 아님을 인지할 것이다. 본 출원에서, 단수의 용도는 다른 명시적 언급이 없는 한, 복수를 포함한다.
본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 언급된 범위 안에 임의의 정수 값, 그리고 다른 언급이 없는 한, 적절한 경우, 이들의 분수 값(이를 테면, 한 정수의 1/10 및 1/100)이 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "약(about)"이란 다른 언급이 없는 한, 표시된 범위, 값, 서열, 또는 구조의 ± 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%를 의미한다. 본 명세서에서 이용된 용어 단수 부정관사("a" 및 "an")은 다른 명시가 없거나 또는 내용에서 지적되지 않는 한, 열거된 성분들 "하나 또는 그 이상"을 지칭한다. 대체어 (예를 들면, "또는")의 이용은 이들 대체물중 하나, 둘 또는 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "함유하다(include)"와 "포함하다(comprise)"는 동의어로 이용된다. 추가로, 본 명세서에서 설명된 구조 및 치환체들의 다양한 조합으로부터 유도된 개별 단일 쇄 폴리펩티드 또는 면역글로블린 구조체는 각 단일 쇄 폴리펩티드 또는 안정화된 키메라 Fab가 개별적으로 제시되는 것과 동일한 수준으로 설명된다. 따라서, 개별 단일 쇄 폴리펩티드 또는 안정화된 키메라 Fabs를 형성하기 위한 특정 성분들의 선별은 본 공개 범위 안에 있다.
본 명세서에서 사용된 섹션 제목은 오로지 구획을 분리하려는 목적을 위함이며 서술된 주제를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 문헌, 책, 메뉴얼 및 협정이 포함되나, 이에 국한되지 않은 본 명세서에서 언급된 모든 서류, 또는 서류의 일부는 본 명세서에서 논의된 일부 뿐만 아니라 이의 전문은 본 명세서의 참고자료에 명시적으로 편입된다.
본 발명은 설명된 특정 방법, 프로토콜, 세포 계통, 동물 종 또는 속, 및 시약은 매우 다변할 수 있기 때문에, 이들에 본 발명이 한정되지 않는다는 것을 인지해야 한다. 또한, 본 명세서에서 설명된 용어는 특정 구체예들을 설명하기 위함이며, 본 명세서에서 설명된 방법 및 조성물의 범위를 제한하려는 의도는 아니며, 오직 본원 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다는 것 또한 인지해야 한다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개 및 특허는 공개에서 설명된 예를 들면, 구조체들과 방법을 설명하고 공개하는 것을 목적으로 이들의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입되며, 이는 본 명세서에서 설명된 방법, 조성물 및 화합물과 연계하여 이용될 수 있다. 본 명세서에서 논의된 공개는 본 출원 출원일 이전에 이들의 공개만을 위하여 제공된다. 본 명세서에서 설명된 발명자들은 선행 발명에의해 또는 임의의 다른 이유로 인하여 이러한 공개를 선행자격이 없는 것을 인정하는 것으로 간주되는 것은 없다.
본 출원에서, 아미노산 이름 및 원자 이름(예를 들면 N, O, C, 등등)은 IUPAC 명명 (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids와 펩티드 (잔기 이름, 원자 이름 등등), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984) 및 Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)에서 수정에 근거하여 Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org)에 의해 정의된 것을 이용한다. 용어 "아미노산 잔기"는 20개의 자연 발생적 아미노산, 즉, 알라닌 (Ala 또는 A), 시스테인 (Cys 또는 C), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H) , 이소류신 (Ile 또는 I), 리신 (Lys 또는 K), 류신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 프롤린 (Pro 또는 P), 글루타민 (Gln 또는 Q), 아르기닌 (Arg 또는 R), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 발린 (Val 또는 V), 트립토판 (Trp 또는 W) 및 티로신 (Tyr 또는 Y) 잔기로 구성된 군에 함유된 아미노산 잔기를 주로 나타낸다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들의 중합체를 포함하는 것으로 본 명세서에서 호환된다. 즉, 폴리펩티드에 관한 설명은 펩티드의 설명과 단백질의 설명에 대등하게 적용되며, 이 역도 성립된다. 상기 용어들은 자연 발생적 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 비-자연적으로 인코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에도 적용된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 상기 용어는 전장 단백질이 포함된, 임의의 길이의 아미노산 쇄가 포괄되며, 여기에서 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연계된다.
용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 두 가지 또는 그 이상의 뉴클레오티드 분자들의 연속 스트레취를 나타낸다. 상기 뉴클레오티드 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반합성 또는 합성 기원, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
"세포", "숙주 세포", "세포 계통" 및 "세포 배양물"은 본 명세서에서 호환되며, 이러한 모든 용어는 이 세포의 성장 또는 배양으로부터 야기된 후대를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "형질변환" 및 "형질감염"은 호환 이용되며, 이는 핵산 서열을 세포 안으로 도입시키는 공정을 지칭한다.
용어 "아미노산"이란 자연적으로 생성되는 아미노산과 비-자연적으로 생성되는 아미노산, 뿐만 아니라 자연적으로 생성되는 아미노산과 유사한 방식으로 기능을 하는 아미노산 유사체들과 아미노산 모방체을 지칭한다. 자연적으로 인코딩된 아미노산은 20개의 통상 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린) 그리고 피롤리신과 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체들이란 자연적으로 생성되는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 가령, 수소에 결합된 탄소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기를 갖는 화합물, 이를 테면, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포니움이다. 이러한 유사체들은 변형된 R 기들(이를 테면, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 보유하지만, 자연적으로 생성되는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산에 대한 언급은 예를 들면, 자연적으로 생성되는 단백질생성에 이용되는(proteogenic) L-아미노산들; D-아미노산들, 화학적으로 변형된 아미노산들, 이를 테면 아미노산 변이체 및 유도체들; 자연적으로 생성되는 비-단백질생성에 이용되는 아미노산들 이를 테면, 알라닌, 오르니틴, 등등; 그리고 아미노산들의 특징인 당업계에 공지된 성질들을 가진 화학적으로 합성된 화합물들을 포함한다. 비-자연적으로 생성되는 아미노산들의 예로는 N-메틸 아미노산들 (예를 들면, 메틸 알라닌), D-아미노산들, 히스티딘-유사 아미노산들 (예를 들면, 2-아미노-히스티딘, 히드록시-히스티딘, 호모히스티딘), 측쇄에 여분의 메틸렌을 보유한 아미노산들 ("호모" 아미노산들), 그리고 측쇄에 있는 카르복실 기능기가 술포닌산 기로 대체된 아미노산들(예를 들면, 시스테인산)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 본원에서 기술된 상기 안정화된 키메라 Fabs의 단백질 안에 합성 비-고유한 아미노산들, 치환된 아미노산들, 또는 하나 또는 그 이상의 D-아미노산들이 포함된 비-천연 아미노산들의 혼입은 다양한 방식으로 유익할 수 있다. D-아미노산-함유 펩티드, 등등은 L-아미노산-함유 대응부(counterparts)와 비교하였을 때, 시험관 또는 생체내에서 증가된 안정성을 나타낸다. 따라서, D-아미노산들의 혼입이 포함된 펩티드 등등의 구축은 세포내 더 큰 안정성이 바람직하거나 또는 요구될 때 구체적으로 유용할 것이다. 더욱 구체적으로, D-펩티드 등등은 내생성 펩티다제와 프로테아제에 대한 저항적이며, 이로 인하여 이러한 성질들이 바람직한 경우, 이들 분자의 개선된 생물이용성과 연장된 생체내 생존을 제공한다. 추가적으로, D-펩티드, 등등은 T 헬퍼 세포들에게 주요 조직적합성 복합체 클래스 II-제한된 제공을 위하여 효과적으로 가공되지 않을 수 있고, 따라서 전체 유기체에서 체액 면역 반응을 덜 유도할 것이다.
아미노산은 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에서 권장하는 통상적으로 알려진 3문자 기호 또는 1-문자 기호에 의해 본 명세서에서 지칭된다. 유사하게, 뉴클레오티드는 통상적으로 인정되는 단일-문자 코드로 언급될 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산과 핵산 서열들에 모두 적용된다. 특정 핵산 서열들에 있어서, "보존적으로 변형된 변이체"란 동일한 또는 기본적으로 동일한 아미노산 서열들을 인코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 상기 핵산은 아미노산 서열, 기본적으로 동일한 서열들을 인코딩하지 않는다. 유전자 코드의 축중성(degeneracy)으로 인하여, 기능적으로 동일한 핵산의 다수는 임의의 주어진 단백질을 인코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈으로 특정화된 모든 위치에서 상기 코돈은 인코딩된 폴리펩티드의 변형없이 표시된 대응하는 임의의 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이(silent variations)"이며, 이는 보존적으로 변형된 변이중 한 종류이다. 폴리펩티드를 인코딩하는 본 명세서에서의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 나타낸다. 당업자는 핵산에서 각 코돈 (오직 메티오닌에 대한 코돈인 AUG, 그리고 오직 트립토판에 대한 코돈인 TGG를 제외)은 기능적으로 동일한 분자를 만들기 위하여 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각 표시된 서열에 내포된다.
아미노산 서열들에 있어서, 인코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산의 변경, 추가 또는 결손되는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 개별 치환, 결손 또는 추가는 "보존적으로 변형된 변이체"이며, 이때 상기 변형으로 아미노산의 결손, 아미노산의 추가, 또는 한 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환되게 된다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산들을 제공하는 보존적 치환표는 당업자들에게 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 추가되며, 이들이 배제되지 않는다.
기능적으로 유사한 아미노산들을 제공하는 보존적 치환표는 당업자들에게 공지되어 있다. 다음의 8개 각 군은 서로에 대하여 보존적 치환으로 고려될 수 있는 아미노산들을 포함한다:
1. 알라닌 (A), 글리신 (G);
2. 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3. 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4. 아르기닌 (R), 리신 (K);
5. 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);
6. 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 그리고
7. 세린 (S), 트레오닌 (T), 시스테인 (C);
(가령, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993) 참고.
두 가지 또는 그 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열들 내용에서 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 동일한 두 가지 또는 그 이상의 서열들 또는 하위서열들을 지칭한다. 서열들이 다음의 서열 비교 창 또는 다음의 서열 비교 알고리즘(또는 당업자들이 이용가능한 다른 알고리즘)중 하나를 이용하여 측정될 때 지정된 영역에 걸쳐 최대 대응을 위하여 비교되고, 정렬될 때, 또는 수작업 배열 및 눈으로 관찰에 의해, 이 서열들이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 백분율을 갖는다면(즉, 명시된 영역에 걸쳐 최소한 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성), 이 서열들은 "실질적으로 동일하거나" 또는 "실질적으로 유사하다". 이 정의는 테스트 서열의 보체에 또한 적용된다. 상기 동일성은 길이가 최소한 약 50개 아미노산들 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐, 또는 길이가 75-100개 아미노산들 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐, 또는 특정화되지 않은 경우, 전체 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 걸쳐 존재할 수 있다. 인간 이외의 종으로부터 상동체가 포함된, 본원에서 기술된 상기 안정화된 키메라 Fabs의 폴리펩티드가 인코딩된 폴리뉴클레오티드는 엄격성 혼성화 조건하에 본원에서 기술된 상기 안정화된 키메라 Fabs의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 보유한 라벨된 프로브로 스크리닝하는 단계, 그리고 전술한 폴리뉴클레오티드 서열이 함유된 전장 cDNA 및 게놈 클론을 단리시키는 단계가 포함된 공정에 의해 획득될 수 있다. 이러한 혼성화 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
서열 동일성 백분율 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 예는 BLAST™ 및 BLAST™ 2.0 알고리즘이며, 이들은 차례로 Altschul 외. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977), 그리고 Altschul 외. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)에서 기술된다. BLAST™ 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 제공된다 (인터넷 www.ncbi.nlm.nih.gov 참고). 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M (한 쌍의 일치 잔기에 대한 보상 스코어; 항상> 0) 및 N (부정합 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 <0)을 사용하여 누적 스코어가 산출된다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 다음과 같은 경우 각 방향으로의 단어 히트(hits) 확장이 중지된다: 누적 정렬 점수는 최대 달성 값에서 수량 X만큼 떨어질 때; 하나 또는 그 이상의 음수-스코어링 잔기 정렬로 인해 누적 스코어가 0 이하로 갈 때; 또는 두 서열의 끝에 도달할 때. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대한)에 대한 알고리즘 파라미터의 예는 단어길이 (W) 11, 기대치 (E) 10, M = 5, N = -4 및 두 가닥의 비교이다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램에 대한 알고리즘 파라미터의 예는 단어 길이 3, 기대치 (E) 10 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스이다(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989 참고).
폴리펩티드의 유도체, 또는 변이체는 이 유도체 또는 변이체의 아미노산 서열이 원래 펩티드로부터 100개 아미노산 서열에 걸쳐과 최소한 50% 동일한 경우, 상기 펩티드와 "상동(homology)" 또는 "상동성(homologous)"을 공유한다고 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가진 펩티드 또는 상기 펩티드 또는 단편과 최소한 75% 동일하다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가진 펩티드 또는 상기 펩티드 또는 단편과 최소한 85% 동일하다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가진 펩티드 또는 상기 펩티드 또는 단편과 최소한 90% 동일하다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가진 펩티드 또는 상기 펩티드 또는 단편과 최소한 95% 동일하다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가진 펩티드 또는 상기 펩티드 또는 단편과 최소한 99% 동일하다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "단리된" 폴리펩티드 또는 구조체는 자연적인 세포 배양 환경의 성분에서 확인되고, 분리되고, 및/또는 회수된 구조체 또는 폴리펩티드를 말한다. 자연 환경의 오염 성분들은 상기 안정화된 키메라 Fab 또는 상기 안정화된 키메라 Fab를 포함하는 항체 구조체의 진단 또는 치료 용도를 전형적으로 간섭하는 물질이며, 그리고 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성(proteinaceous) 또는 비-단백질성 용질을 함유할 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "단리된" 항체 구조체는 자연적인 세포 배양 환경의 성분에서 확인되고, 분리되고, 및/또는 회수된 안정화된 키메라 Fabs를 포함하는 항체 구조체를 말한다. 예를 들면, 본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fab는 자연적인 세포 배양 환경의 성분에서 확인되고, 분리되고, 및/또는 회수된 중쇄 Fab 서열 및 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체 (이형이량체) 또는 "단리된" 이형이량체를 포함한다. 자연 환경의 오염 성분들은 상기 이형이량체 또는 항체 구조체의 진단 또는 치료요법적 용도를 간섭하는 물질이며, 그리고 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 함유할 수 있다.
상기 안정화된 키메라 Fabs 및 이를 포함하는 항체 구조체는 실질적으로 동질성(homogeneity)이 되도록 정제될 수 있다. "실질적으로 동질한", "실질적으로 동질 형태" 및 "실질적인 동질성"이라는 문구는 올바르게 쌍을 이룬 산물이 바람직하지 않은 폴리펩티드 조합 (예를 들어, 동종이량체 또는 잘못된 쌍을 이룬 이형이량체)으로부터 유래된 부-산물이 실질적으로 없음을 나타내는 데 사용된다. 한 구체예에서, 정제된 안정화된 키메라 Fab는 실질적으로 경쇄 이량체가 없다. 한 구체예에서, H1 (중쇄 1), L1 (경쇄 1), H2 (중쇄 2), 그리고 L2 (경쇄 2)로 표현되는, 이중특이적 항체 구조체 내용에서, 상기 정확하게 쌍을 이룬 산물은 정확하게 쌍을 이룬 H1L1 및 H2L2 (H1L1H2L2)을 포함하는 이형이량체 쌍이다. 일부 구체예들에서, H1, L1, H2, 그리고 L2로 표현되는, 이중특이적 항체 구조체 내용에서, 상기 정확하게 쌍을 이룬 산물은 최소한 하나의 Fab 영역 이를 테면, 예를 들면, H1L1H2L1 또는 H1L2H2L2에서 정확한 페어링을 나타내는 추가 산물을 포함할 수 있고, 또는 여기에서 "하프(half) 항체", H1L1 또는 H2L2가 만들어진다 (도 11 참고). 순도 측면에서, 한 구체예에서, 실질적인 동질성은 완전히 잘못 짝 지어진 부산물의 양이 20%를 초과하지 않음을 의미하는데, 예를 들면, 혼합물에 존재하는 모든 종으로부터의 총 LC-MS 강도의 10 % 미만, 5 % 미만, 1 % 미만 또는 0.5 % 미만이고, 여기서 백분율은 질량 분석 결과를 반영한다.
항체 기술 분야의 당업자들이 이해하는 용어들은 명시적으로 다른 정의가 없는 한, 당업계에서 인지되는 의미로 제공된다. 항체는 가변 영역, 힌지 영역 및 불변 도메인을 갖는 것으로 공지되어 있다. 면역글로블린 구조 및 기능에 대해서는 예를 들면, Harlow 외, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)를 참고한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체" 및 "면역글로블린" 또는 "항체 구조체"는 호환 사용된다. "항체 구조체"는 피분석물 (에피토프 또는 항원)에 특이적으로 결합하는 면역글로블린 유전자 또는 면역글로블린 유전자들, 또는 이의 하나 또는 그 이상의 단편들에 의해 실질적으로 인코딩된 폴리펩티드를 지칭한다. 인지된 면역글로블린 유전자들은 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤 불변 영역 유전자들, 뿐만 아니라 무수한 면역글로블린 가변 영역 유전자들을 함유한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로 분류되며, 이는 다시 차례로 면역글로블린 클래스, IgG, IgM, IgA, IgD, 그리고 IgE로 정의된다. 더욱이, 이 항체는 다수의 서브 타입 중 하나에 속할 수 있으며, 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스에 속할 수 있다. 카파 경쇄를 포함하는 항체는 본원에서 "카파 항체"로 지칭되는 반면, 람다 경쇄를 포함하는 항체는 본원에서 "람다 항체"로 지칭된다.
예시적인 면역글로블린 (항체) 구조적 단위는 폴리펩티드 쇄의 두 개 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 면역글로블린 "경쇄(light chain)"(약 25 kD)와 하나의 면역글로블린 "중쇄(heavy)" (약 50-70 kD)를 보유한다. 이러한 유형의 면역 글로불린 또는 항체 구조 단위는 "자연적으로 발생하는" 것으로 간주되며, 본 명세서에서 "Mab"포멧으로도 지칭된다. 용어 "경쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 도메인 서열을 갖는 전장 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장의(full-length) 경쇄는 가변 도메인, VL, 그리고 불변 도메인, CL을 함유한다. 경쇄의 가변 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다. 경쇄는 카파 쇄 및 람다 쇄를 함유한다. 용어 "중쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장의 중쇄는 가변 도메인, VH, 그리고 3개의 불변 도메인들, CH1, CH2, 그리고 CH3을 함유한다. 상기 VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, 그리고 상기 CH 도메인들은 카르복시-말단에 있고, 상기 CH3은 이 폴리펩티드의 카르복시-말단에 가장 근접해 있다. 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브클래스를 비롯), IgA (IgA1 및 IgA2 서브클래스를 비롯), IgM, IgD 및 IgE가 함유된, 임의의 클래스일 수 있다. 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원 인지를 주로 담당하는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부분을 말하며, 전형적으로 중쇄(VH)에서 대략 아미노-말단의 120 내지 130개의 아미노산, 그리고 경쇄(VL)에서 약 100 내지 110개의 아미노산을 일반적으로 포함한다.
"상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원-결합 특이성 및 친화력에 기여하는 아미노산 서열이다. "프레임워크(Framework)" 영역 (FR)은 항원- 결합 영역과 항원 사이의 결합을 촉진하기 위해, CDRs의 적절한 형태를 유지하는 것을 도울 수 있다. 구조적으로, 프레임워크 영역은 항체에서 CDRs 사이에 위치할 수 있다. 상기 가변 영역들은 3개의 초가변 영역, CDRs에 연결된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. 2개 쇄로부터 CDRs은 전형적으로 기본골격 영역과 나란하게 정렬되어, 특이적 에피토프에 결합할 수 있다. N-말단에서 부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 모두 전형적으로 도메인들 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 그리고 FR4를 포함한다. 다른 언급이 없는 한, 각 도메인에 대한 아미노산의 할당은 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest의 정의에 따른다 (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)).
"다중 특이적 항체 구조체" 또는 "다중 특이적 항체"는 하나 이상의 별개의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하거나 이에 결합하는 것이다. "이중특이적", "이중-특이적" 또는 "이중기능적" 항체 구조체 또는 항체는 2개의 상이한 항원 또는 에피토프를 표적으로 하거나 이에 결합하는 다중특이적 항체 구조체의 종이다. 일반적으로, 이중특이적 항체 구조체는 2개의 상이한 항원-결합 도메인들을 가질 수 있다. 이중특이적 항체 구조체 또는 항체의 2개의 항원-결합 도메인은 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 이는 동일하거나 다른 분자 표적에 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 이중특이적 항체 구조체는 자연 발생적 포멧이다. 환언하면, 상기 이중특이적 항체 구조체는 자연 발생적 IgG, IgA, IgM, IgD, 또는 IgE 항체와 동일한 포멧을 갖는다.
항체 중쇄는 항체 경쇄와 쌍을 이루고, 하나 또는 그 이상의 "계면(interface)"에서 서로 만나거나 또는 접촉된다. "계면"에는 제 2 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 "접촉" 아미노산 잔기와 상호작용하거나, 또는 추가 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 접촉 잔기와 상호작용하는 제 1 폴리펩티드 안의 하나 또는 그 이상의 "접촉" 아미노산 잔기가 포함되며, 여기에서 상기 제 1 폴리펩티드, 제 2 폴리펩티드, 또는 추가 폴리펩티드는 서로 만나거나 또는 접촉한다. 예를 들면, 중쇄의 VH 및 CH1 도메인 사이, 경쇄의 VL 및 CL 도메인 사이, 이량체화된 Fc 영역의 2개의 CH3 도메인 사이, 중쇄의 CH1 도메인과 경쇄의 CL 도메인 사이, 그리고 중쇄의 VH 도메인과 경쇄의 VL 도메인 사이에 계면이 존재한다. 상기 "계면"은 IgG 항체로부터, 예를 들면, 인간 IgG1 항체로부터 유도될 수 있다. 대안적으로, 계면은 하나의 폴리펩티드의 한 부분에 있는 하나 또는 그 이상의 접촉 아미노산 잔기와 상호작용하는 동일한 폴리펩티드의 상이한 부분으로부터 하나 또는 그 이상의 접촉 잔기를 함유한다. 예를 들면, 계면은 경쇄의 가변 도메인과 불변 도메인 사이에 존재한다.
"접촉 아미노산 잔기"란 서로 최소한 한 가지 유형의 비-공유 결합 (가령, 반 데르 발스, 수소 결합 등등)을 나타내는 2개의 잔기를 최소한으로 포함하는 아미노산 잔기를 말한다.
Fab (단편 항원-결합으로도 불림)는 경쇄와 중쇄 상에 차례로 가변 도메인들 VL 및 VH과 함께, 경쇄의 불변 도메인 (CL)과 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. 중쇄 Fab 서열은 VH 및 CH1 도메인들을 포함하는 절두된 중쇄다. 상기 가변 도메인들은 항원-결합에 관여하는 상보성 결정 루프 (CDR, 초가변 영역이라고도 칭함)를 포함한다. Fab′단편들은 이 항체 힌지 영역의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 함유하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇개의 잔기를 추가함으로써 Fab 단편들과는 상이하다. 용어 "Fab 포멧"은 항체 구조체, 이를 테면 Fabs 및 Fab' 단편들을 함유한다는 의미다. Fab 포멧에서 구조체의 경쇄 부분은 카파 경쇄, 람다 경쇄, 또는 키메라 경쇄, 또는 이의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. Fab 포멧에서 구조체의 중쇄 부분은 IgG, IgM, IgA, IgE, 또는 IgD 클래스로부터 유래된 중쇄를 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
"단일-쇄 Fv"또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인들을 포함하며, 이때 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄로 제시된다. 한 구체예에서, 상기 scFv 폴리펩티드는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하고, 이는 상기 scFv가 항원-결합을 위한 바람직한 구조를 만들게 한다. scFvs에 관한 리뷰는 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참고한다. HER2 항체 scFv 단편들은 WO93/16185; U.S. 특허 번호 5,571,894; 그리고 U.S. 특허 번호 5,587,458에서 기술된다.
"Mab 포멧"의 항체는 자연 발생적 항체와 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭한다. 환언하면, Mab 포멧의 항체는 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 가질 수 있다. 상기 경쇄는 카파 경쇄, 람다 경쇄, 또는 키메라 경쇄 또는 이의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. Mab 포멧에서 구조체의 중쇄 부분은 IgG, IgM, IgA, IgE, 또는 IgD 클래스로부터 유래된 중쇄를 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. Mab 포멧의 항체는 이가(bivalent)이며, 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
용어 "아미노산 변형"은 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 아미노산 삽입, 결손, 치환, 화학적 변형, 물리적 변형, 그리고 재배열을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
면역글로블린 중쇄 및 경쇄를 위한 아미노산 잔기는 Kabat(Kabat와 Wu, 1991에서 기술된 바와 같이; Kabat 외, Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication no. 91-3242, p 647 (1991)), IMGT (Lefranc, M.-P., 외. IMGT® internationalImMunoGeneTics information system®Nucl. Acids Res, 37, D1006-D1012 (2009), 그리고 Lefranc, M.-P., IMGT, international ImMunoGeneTics Information System, Cold Spring Harb Protoc. 2011 Jun 1; 2011(6)), 1JPT (Katja Faelber, Daniel Kirchhofer, Leonard Presta, Robert F Kelley, Yves A Muller, The 1.85 Å resolution crystal structures of tissue factor in complex with humanized Fab d3h44 and of free humanized Fab d3h44: revisiting the solvation of antigen combining sites1, Journal of Molecular Biology, Volume 313, Issue 1, Pages 83-97에서 기술된 바와 같이) EU (EU 항체의 번호매김을 참고할 때 Kabat에서와 같이, EU 색인 (Edelman 외., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85))을 비롯한 몇몇 조약에 따라 번호매김될 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, Kabat 번호매김은 VH, CH1, CL 및 VL 도메인에 사용된다. 달리 지시되지 않는 한, EU 번호매김은 상기 CH3 및 CH2 도메인들, 그리고 힌지 영역에 사용된다. AHo 번호매김 시스템 (Honegger, A. and , A., Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: An automatic modeling and analysis tool, J. Mol. Biol, 309(2001) 657-670) 및 Chothia 번호매김 시스템 (Al-Lazikani B, Lesk AM, Chothia C, Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins J. Mol. Biol, 273(1997) 927-948) 은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들에서 아미노산 잔기를 식별해내는데 또한 이용될 수 있다.
특정 아미노산 잔기 또는 위치에서 아미노산 치환의 식별은 아미노산 치환의 확인은 당 업계에 공지된 바와 같이, 많은 형식으로 표시되고 약어화될 수 있다. 예를 들면, 밑줄 "_"또는 슬래시 "/"를 사용하여 아미노산 치환 조합의 개별 아미노산 치환을 구별할 수 있다. 예시적인 실시예로써, 아미노산 치환 83V, 85T, 그리고 105E의 조합은 83V_85T_105E, 또는 83V/85T/105E로 또한 나타낼 수 있다. 이들 3 가지 유형의 포맷은 본 개시에서 상호 교환적으로 사용된다.
키메라 Fabs 및 안정화된 키메라 Fabs
변형된 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체 및 VH 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 안정화된 키메라 Fabs가 본원에서 제공된다. 상기 변형된 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 키메라 Fab의 열 안정성을 증가시키는 하나 또는 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하는 V람다 서열을 포함한다. 용어 "키메라 Fab"또는 "키메라 이형이량체"란 본 명세서에서 이용된 바와 같이, CH1 도메인 서열 및 VH 도메인 서열을 포함하는 중쇄, 그리고 키메라 면역글로블린 경쇄 폴리펩티드 (V람다-C카파 키메라 경쇄) 구조체를 갖는 Fab를 지칭하고, 이때 상기 중쇄 서열과 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 에피토프에 결합하는 Fab 영역을 형성한다. "중쇄 Fab 서열"은 CH1 도메인 서열과 VH 도메인 서열을 포함하는 면역글로블린 중쇄의 단편을 지칭한다. 키메라 Fab는 전형적으로 안정화된 키메라 Fabs를 작제하기 위한 출발점이다. 따라서, 안정화된 키메라 Fabs는 키메라 Fab의 열 안정성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하도록 공작된 부모 키메라 Fabs에 기초한다.
한 구체예에서, 상기 부모 키메라 Fab는 람다 경쇄를 갖는 부모 항체 (부모 람다 항체)로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 이들 구체예에서, 상기 부모 키메라 Fab는 부모 람다 항체의 중쇄 Fab 서열, 뿐만 아니라 상기 부모 람다 항체의 V람다 서열과 카파 경쇄의 C카파 서열을 갖는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체를 포함한다. 부모 키메라 Fab는 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형 없는, 야생형 키메라 이형이량체를 또한 지칭한다.
부모 람다 항체
다수의 람다 항체가 당분야에 공지되어 있고, 이들이 자연 발생적 람다 경쇄 구조를 포함하는 한, 부모 람다 항체로 적합하다. "자연 발생적 경쇄 구조"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 람다 VL 및 CL 도메인들을 갖는 경쇄 구조를 의미한다. 한 구체예에서, 상기 부모 람다 항체는 자연 발생적 항체다. 또다른 구체예에서, 상기 부모 람다 항체는 공작된(engineered) 람다 항체이다. 공작된 항체는 해당 항체의 폴리펩티드 서열 또는 기능적 성질을 변경시키는 하나 또는 그 이상의 변형을 포함하는 항체다. 이중특이적 항체 내용에서 변경될 수 있는 기능적 성질에는 항원-결합, 작동체 기능, 열 안정성, 중쇄 페어링 및/또는 경쇄 페어링을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 상기 부모 람다 항체는 이의 약력학/약동학 프로파일을 개선시키고, 면역원성이 감소되도록 공작될 수 있다. 이들 기능적 성질은 상기 부모 항체의 폴리펩티드 서열내 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형에 의해 변경될 수 있다. 이들 기능적 성질을 변경시키는 적합한 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 이들중 일부는 하기에서 설명된다
한 구체예에서, 상기 부모 람다 항체는 마우스, 인간 또는 인간화된 항체다. 비-인간 (가령, 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로블린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 항체다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수령자의 초가변 영역이 비-인간 종 공여항체) 이를 테면 원하는 특이성, 친화력, 그리고 수용력(capacity)을 갖는 마우스, 렛, 토끼, 또는 비인간 영장류의 초가변 영역의 잔기로 대체된, 인간 면역글로블린 (수령 항체)이다. 일부 경우에서, 인간 면역글로블린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수령자 항체 또는 기증자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 수행능을 더 개선하기 위하여 만들어진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 수 있는데, 이때 초가변 루프의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 면역글로블린에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 면역글로블린의 서열에 대응한다. 상기 인간화된 항체는 임의선택적으로 면역글로블린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 면역글로블린의 것을 포함할 것이다. 더욱 상세한 내용은 Jones 외., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 외., Nature 332:323-329 (1988); 그리고 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)을 참고한다. 따라서, 일부 구체예들에서, 상기 부모 키메라 항체는 마우스, 인간, 또는 인간화된 중쇄 Fab 서열, 또는 V람다 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 부모 키메라 Fab는 인간 또는 인간화된 람다 항체의 V람다 서열, 그리고 C카파 서열을 갖는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체를 포함한다. 예시적인 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 서열은 도 2에 제공되며, 상기 부모 항체의 람다 경쇄 서열에 대하여 정렬되어 있다.
마우스 람다 경쇄의 마우스 VL 도메인과 CL 도메인 사이의 계면은 인간 람다 경쇄의 인간 VL 도메인과 CL 도메인 사이의 계면과 매우 유사하며, 그리고 마우스 카파 경쇄의 마우스 VL 도메인과 CL 도메인의 계면은 인간 카파 경쇄의 인간 VL 도메인과 CL 도메인 사이의 계면과 매우 유사하다. 따라서, 본원에서 기술된 안정화 아미노산 변형은 마우스 부모 람다 항체의 V람다 서열, 그리고 인간 카파 항체의 C카파 서열을 갖는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체를 포함하는 부모 키메라 Fab에 또한 적용될 수 있는 것이 고려된다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 마우스 람다 항체의 V람다 서열, 그리고 인간 카파 항체의 C카파 서열을 갖는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체를 포함하는 키메라 Fab를 포함한다.
람다 항체의 CL 및 VL 도메인들은 상이한 생식계열에 속하는 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 부모 람다 항체의 VL 도메인은 상기 인간 생식계열 하위집단 IGLV1, IGLV2, IGLV3, IGLV4, IGLV5, IGLV6, IGLV7, IGLV8, IGLV9, IGLV10 또는 IgLV11로부터 선택된다. 한 구체예에서, 상기 부모 람다 항체의 VL 도메인은 상기 인간 생식계열 하위집단 IGLV1, IGLV2 또는 IgLV6으로부터 선택된다.
람다 항체는 상이한 생식계열에 속하는 중쇄 도메인을 또한 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 부모 람다 항체는 상기 인간 VH 도메인 생식계열 하위집단 IGHV1, IGHV2, IGHV3, IGHV4, IGHV5, IGHV6 또는 IgHV7로부터 선별된 VH 도메인을 갖는 중쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 부모 람다 항체는 인간 VH 도메인 생식계열 하위집단 IGHV1, IGHV3 또는 IgHV4의 VH 도메인을 갖는 중쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 부모 람다 항체는 인간 VH 도메인 생식계열 하위집단 IGHV3 또는 IgHV4의 VH 도메인을 갖는 중쇄를 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 부모 람다 항체는 상기 인간 J 세그먼트 생식계열 유전자 IGHJ1, IGHJ2, IGHJ3, IGHJ4, IGHJ5, 또는 IgHJ6으로부터 선별된 J 세그먼트를 갖는 중쇄를 보유한다. 한 구체예에서, 상기 부모 람다 항체는 상기 인간 CH1 도메인 생식계열 하위집단 IGHG1, IGHG2, IGHG3, 또는 IgHG4로부터 선별된 CH1 도메인을 갖는 중쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 부모 람다 항체는 생식계열 하위집단 IGHG1로부터 인간 CH1 도메인을 갖는 중쇄를 갖는다.
한 구체예에서, 상기 부모 람다 항체는 치료 항체다. 람다 경쇄 및 이들이 결합하는 항원을 포함하는 적합한 치료용 항체의 비 제한적 예는 하기 표 A에서 확인된다:
한 구체예에서, 상기 부모 키메라 Fab는 표 A에 열거된 항체들중 하나로부터 중쇄 Fab 서열 및 V람다 서열을 포함한다.
치료용이건 또는 아니건, 표 A에 열거된 항체, 그리고 다른 적합한 부모 항체의 아미노산 서열은 이들 항체들이 기술된 공보로부터 용이하게 구할 수 있거나, 및/또는 데이터베이스 이를 테면, TABS, PDB, GenBankTM,에서 구할 수 있으며, 이들 모두는 인터넷으로 접근가능하다.
다른 적합한 부모 람다 항체의 예로는 CAT-2200 항체, H3 항체, 그리고 EP6b_B01 항체들이 있다. 이들 항체의 서열은 당분야에 공지되어 있고, 표 2에서 제공된다. 예를 들면, CAT-2200 항체 (IL-17에 결합)의 아미노산 서열은 PDB 엔트리 2VXS 9에서 찾아볼 수 있고, H3의 아미노산 서열 (HER3에 결합)은 U.S. 특허 번호. 8,329,873에서 찾아볼 수 있고; 그리고 EP6b_B01 (Fas에 결합)의 아미노산 서열은 PDB 엔트리 3THM에서 찾아볼 수 있다.
scFvs
상기에서 명시된 바와 같이, 일부 구체예들에서, 부모 키메라 Fabs는 scFvs로부터 유래될 수 있다. scFvs로부터 유래된 부모 키메라 Fabs는 관심대상의 결합제를 식별해내기 위하여 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝 결과로 대개 생성될 수 있다. scFvs에서 Fabs로의 전환 방법은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면 Steinwand 외. (2014) in Mabs 6:204, 그리고 Zuberbuhler 외. (2009) in Protein Engineering, Design & Selection 22: 169-174에서 기술된다. 한 구체예에서, 상기 부모 키메라 Fab는 scFv의 서열로부터 직접적으로 구축될 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 부모 키메라 Fab는 scFv로부터 전환된 Fab로부터 유래될 수 있다.
Smirnov 외. (2011) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108: 15954 (리엑터바디(reactibodies))를 기술)에서 기술된 바와 같이 당분야에는 적합한 많은 scFvs이 공지되어 있고, 또는 Niemi 외. (2010) J.Mol.Recognit. 24: 209-219; Schneider 외. (2012) J.Mol.Biol. 415: 699-715; 그리고 Fenn (2013) Plos One 8: e61953-e61953에서는 scFvs와 같이 원래 확인된 항체를 기술한다. 한 구체예에서, 치료 scFv, 예를 들면 블리나누모마브, 에푸구마브, 페셀리주마브, 솔리토마브, 그리고 다른 것들로부터 부모의 키메라 Fab가 준비될 수 있다. 부모의 키메라 Fabs는 scFv의 VL 및 VH 서열에 기초한 구조체일 수 있고, 카파 항체의 CH1 및 C카파 도메인들에 융합될 수 있다. 이들 구체예에서, 상기 부모 키메라 Fab는 scFv의 V람다와 카파 경쇄의 C카파 서열을 갖는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체를 포함하는 반면, 중쇄 Fab 서열은 scFv의 VH 도메인과 CH1 도메인을 포함한다. 적합한 CH1 도메인 서열은 IgG, IgD, IgE, IgM, 또는 IgA 클래스의 인간 CH1 도메인들로부터 선별될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 CH1 도메인 서열은 상기 CH1 도메인 생식계열 하위집단 IGHG1, IGHG2, IGHG3, 또는 IgHG4로부터 선별된다. 적합한 C카파 서열은 하기에서 기술된다.
C카파 서열
V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 폴리펩티드 서열은 상기 부모 항체의 람다 경쇄의 VL 도메인 (V람다) 서열을 적합한 C카파 불변 도메인 서열에 융합시킴으로써 생성될 수 있다. 적합한 C카파 불변 도메인 서열은 CL 생식계열 대립유전자 IGKC*01, IGKC*02, IGKC*03, IGKC*04, 또는 IgKC*05로부터 선택된 것이다. 한 구체예에서, 상기 C카파 불변 도메인 서열은 생식계열 하위집단 IGKC*01로부터 유래된 것이다. 이들 C카파 불변 도메인의 아미노산 서열은 상기에서 명시된 IMGT 데이터베이스로부터 바로 이용가능하다.
일부 구체예들에서, 상기 부모 키메라 Fab는 공지의 또는 당분야에 기술된 키메라 Fab일 수 있다. 예를 들면, 상기 부모 키메라 Fab는 Ponomarenko 외. (2014) in Act Crystallographica D70: 708-719에서 기술된 키메라 Fab일 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 부모 키메라 Fab는 상기 부모 람다 항체의 Fab의 것과 동일한 열 안정성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 부모 키메라 Fab는 상기 부모 람다 항체의 Fab보다 최소한 10℃ 더 낮은 열 안정성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 부모 키메라 Fab는 상기 부모 람다 항체의 Fab보다 최소한 5℃ 더 낮은 열 안정성을 갖는다.
안정화 아미노산 변형
용어 "안정화된 키메라 Fab"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 키메라 Fab 또는 키메라 이형이량체를 지칭하는데, 이때 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 V람다 서열은 상기 부모 키메라 Fab의 열 안정성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 안정화된 키메라 Fab는 중쇄 불변 도메인 1 (CH1) 서열 및 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열 (중쇄 Fab 서열)을 포함하는 면역글로블린 중쇄 폴리펩티드 구조체, 그리고 상기 부모 키메라 Fab의 열 안정성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 V람다 서열에 포함하는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체를 포함하며, 이때 상기 중쇄 Fab 서열 및 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 에피토프에 결합하는 Fab 영역을 형성한다. 안정화된 키메라 Fabs는 부모 키메라 Fabs로부터 만들어지고, 기본적으로 본원에서 기술된 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하는 부모 키메라 Fabs이다.
용어 "열 안정성"이란 단리되거나 또는 항체 구조체 안의 Fab 영역의 Tm 또는 용융 온도를 측정함으로써, 항체에 대해 흔히 평가되는 성질이다. Fabs의 열 안정성은 본원 도처에 기술된 바와 같이, 다수의 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
상기 본원에서 기술된 안정화 아미노산 변형은 Fab 포멧의 자연 발생적 경쇄의 구조 (즉, VH 및 CH1 도메인들을 갖는 중쇄 단편과 쌍을 이룬)를 검사하고, 이들 구조를 V람다-C카파 키메라 Fabs의 구조에 비교함으로써 식별되었다. 이들 구조의 비교는 V람다-C카파 도메인 사이에서 관찰된 계면을 모방하여, 안정화된 키메라 Fabs에서 V람다-C카파 계면의 양립성을 개선하도록 변형될 수 있는 가변 람다 도메인에서 아미노산 잔기의 식별을 유도하였다.
한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 V람다와 C카파 도메인 사이의 계면에 아미노산 잔기에서 V람다 서열내 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 안정화 아미노산 변형이 발생되는 위치는 다른 언급이 없는 한, Kabat 번호매김 시스템에 따라 식별된다.
한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 V람다 서열 안에 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 V람다 서열 안에 2개 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 V람다 서열 안에 3개 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 V람다 서열 안에 4개 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함한다.
안정화 아미노산 변형은 V람다-C카파 키메라 Fab 경쇄의 V람다와 C카파 도메인 사이의 계면에 있을 수 있다. 한 구체예에서, 상기 안정화 아미노산 변형은 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 V람다 도메인과 C카파 도메인의 계면에 있는 것으로 간주되지 않는 아미노산 잔기에 있을 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 V람다 도메인과 C카파 도메인 사이의 계면에서 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 이러한 아미노산 잔기의 비-제한적인 예들은 V람다 서열의 위치80, 83, 105, 그리고 106에서 찾는다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다 서열내 잔기 83에서 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다 서열내 잔기 105에서 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다 서열내 잔기 106에서 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다 서열내 잔기 80에서 안정화 아미노산 변형을 포함한다.
상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다 서열 안의 계면에 있지 않는 아미노산 잔기에서 안정화 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다 서열내 잔기 85에서 안정화 아미노산 변형을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 V람다 서열 안에 2개의 아미노산 잔기에서 안정화 아미노산 변형 조합을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 잔기 83과 85; 83과 106; 105와 106; 105와 106A; 83과 105; 85와 105; 또는 85와 106에서 안정화 아미노산 변형 조합을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 잔기 83과 85에서; 잔기 83과 106에서; 잔기 105와 106A에서; 또는 잔기 83과 105에서 안정화 아미노산 변형 조합을 포함할 수 있다.
다른 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fabs는 V람다 서열 안에 3개의 아미노산 잔기에서 안정화 아미노산 변형 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 잔기 83, 85, 그리고 105에서; 잔기 83, 105, 그리고 106A에서; 잔기 83, 85, 그리고 106에서; 잔기 83, 105, 그리고 106에서; 또는 잔기 85, 105, 그리고 106에서 안정화 아미노산 변형 조합을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 잔기 83, 85, 그리고 105에서, 또는 잔기 83, 105, 그리고 106A에서 안정화 아미노산 변형 조합을 포함할 수 있다.
다른 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fabs는 V람다 서열 안에 4개 또는 그 이상의 아미노산 잔기에서 안정화 아미노산 변형 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 잔기 83, 85, 105, 그리고 106에서; 잔기 80, 83, 105, 및 106A에서; 잔기 80, 83, 85 및 105에서; 잔기 80, 83, 85 및 105에서; 잔기 80, 85, 105 및 106에서; 잔기 80, 83, 105 및 106에서; 또는 잔기 83, 105, 106, 및 106A에서 안정화 아미노산 변형 조합을 포함할 수 있다.
여전히 다른 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fabs는 V람다 서열 안에 잔기 80, 83, 85, 105, 및 106A에서; 잔기 80, 83, 105, 106 및 106A에서; 잔기 83, 85, 105, 106 및 106A에서; 잔기 80, 83, 85, 105, 106에서; 또는 잔기 80, 83, 85, 105, 106 및 106A에서 안정화 아미노산 변형 조합을 포함할 수 있다.
상기에서 명시된 바와 같이, 안정화 아미노산 변형이 일어나는 아미노산 위치는 Kabat 번호매김 시스템에 따라 본원에서 기술된다. 그러나, 이들 아미노산 위치는 번호매김 대안 시스템에 따라 또한 식별될 수 있다. 예를 들면, 다음 표에서 Kabat, IMGT, AHo, 그리고 EU 번호매김 시스템에 따라, V람다 도메인 안에 선별된 특정 아미노산 위치가 확인된다.
아미노산 치환
아미노산 잔기는 이들 측쇄의 성질, 이를 테면 소수성, 극성, 측쇄 부피 및/또는 크기에 따라, 집단화될 수 있다. 소수성 아미노산 잔기의 예는 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 프롤린, 알라닌, 페닐알라닌, 시스테인 및 트립토판을 포함한다. 극성 비-하전 아미노산 잔기의 예는 글루타민, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 히스티딘 및 티로신을 포함한다. 음으로 하전된 아미노산 잔기의 예는 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 양으로 하전된 아미노산 잔기의 예는 리신 및 아르기닌을 포함한다. 아미노산 잔기의 측쇄 부피가 측정되었으며, 하기 표 B에 재현된 미국 특허 제 5,821,333 호의 표 1에 나타낸 바와 같이, 당업계에 공지되어있다:
상기 안정화된 키메라 Fabs는 하기에서 기술된 바와 같이, 각 잔기에서 안정화 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 83의 아미노산은 소수성 아미노산으로 치환을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 83의 아미노산은 F, L, I, V, 또는 A에서 선택된 소수성 아미노산으로의 치환을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 83의 아미노산은 F, I, V, 또는 A에서 선택된 소수성 아미노산으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 83의 아미노산은 극성 비-하전된 아미노산으로의 치환을 포함한다. 위치 83에 대한 바로 주변 환경의 구조적 평가에 근거하여, 이 위치에서 호환될 수 있고, 키메라 경쇄에서 상대적으로 비-강성 가변 및 불변 도메인 계면에 걸쳐 접촉을 제공하고, 따라서 열안정성이 개선할 수 있는 이 위치의 추가 아미노산 치환이 고려된다. 이들 추가 아미노산은 적합한 크기 및 기하학의 극성 비-하전된 아미노산, 이를 테면 S, N, H, Q 또는 T을 포함한다. 따라서, 일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 83의 아미노산은 S, T, H, N 또는 Q로부터 선택된 극성 비-하전된 아미노산으로의 치환을 포함한다. 다른 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 극성 비-하전된 아미노산 치환 83S, 83N, 83H 또는 83Q를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 아미노산 치환 83A, 83F, 83I, 83V, 83L 또는 83T를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 85의 아미노산은 소수성 아미노산으로 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 85의 아미노산은 85V 또는 85A로부터 선택된 소수성 아미노산으로 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 85의 아미노산은 85V로부터 선택된 소수성 아미노산으로 치환을 포함한다. 위치 85의 바로 주변 환경 내용에서, 추가 아미노산 치환의 적합성의 구조적 평가에서 적합한 크기 및 기하학의 극성 비-하전된 아미노산, 이를 테면 T, S, H, N, Q 및 Y는 키메라 경쇄의 가변 및 불변 도메인 사이 계면의 전반적 양립성에 간접적으로 기여하고, 따라서 열안정성의 개선에도 기여할 것으로 예상된다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 85의 아미노산은 극성 비-하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 아미노산 치환 85T, 85S, 85H, 85N, 85Q, 또는 85Y를 포함한다. 다른 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 85S, 85H, 또는 85Q로부터 선택된 극성 비-하전된 아미노산으로 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 아미노산 치환 85T, 85V, 85N, 85A, 또는 85Y를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 105의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산으로 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 105의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산 치환 105E 또는 105D를 포함한다. 바로 주변 환경 내용에서 이 위치에서 E 이외의 추가 아미노산 치환의 적합성의 구조적 평가에서, 극성 비-하전된 아미노산 이를 테면 N 또는 Q는 키메라 경쇄에서 상기 가변과 불변 도메인 계면에 걸쳐 105E와 유사한 계면을 제공할 수 있고, 따라서 개선된 열안정성에 기여할 것이다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 105의 아미노산은 극성 비-하전된 아미노산으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 105의 아미노산은 극성 비-하전된 아미노산 치환 105N 또는 105Q를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 106의 아미노산은 소수성 아미노산으로 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 106에서 소수성 아미노산은 106I, 106L, 또는 106M으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 위치 106에서 소수성 아미노산은 106I이다.
일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 잔기 80은 소수성인 아미노산으로의 치환을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 80A, 80P, 또는 80V로부터 선택된 소수성 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 80A 또는 80P로부터 선택된 소수성 아미노산 치환을 포함한다. 바로 주변 환경 내용에서 이 위치에서 다른 아미노산 치환의 적합성의 구조적 평가에서, 극성 비-하전된 아미노산 이를 테면 S, N 또는 Q는 키메라 경쇄에서 상기 가변과 불변 도메인 계면에 걸쳐 80A 및 80P와 같이 유사한 계면을 제공할 수 있고, 열안정성의 개선에 있어서 유사한 작은 기여를 할 것으로 예상된다. 따라서, 일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 잔기 80은 극성이며, 비-하전된 아미노산으로의 치환을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 80S, 80N, 또는 80Q로부터 선택된 극성 비-하전된 아미노산 치환을 포함한다.
당업자는 본원에 기술된 아미노산 위치 및 치환의 다중 조합이 부모 키메라 Fab에 비교하였을 때, 키메라 Fabs의 안정성을 증가시키기 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 대표적인 다수의 이러한 조합이 실시예에서 기술되고 시험되었지만, 본 명세서는 이들로만 제한되지는 않는다. 예를 들면, 본 개시 내용에 기재된 아미노산 위치의 조합에 대해, 각각의 위치에 대해 설명된 아미노산 치환이 사용될 수 있고, 각각의 위치(들) 및 치환의 조합이 본원에 기재되어 있는 것으로 고려된다.
따라서, 추가 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 도 3에서 기술된 것에서부터 선택된 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 다른 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 아미노산 치환 83L과 85T; 83L과 85V; 83L과 105E; 83L과 106I; 83L, 85V와 105E; 83L, 85T와 105E; 83L, 85T, 105E와 106I; 또는 83L, 85V, 105E와 106I를 포함한다. 여전히 다른 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 아미노산 치환 83S와 85T; 83S와 85V; 83S 및 105E; 83S와 106I; 83S, 85V와 105E; 83S, 85T 및 105E; 83S, 85T, 105E와 106I; 또는 83S, 85V, 105E와 106I를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 아미노산 치환 83T와 85T; 83T와 85V; 83T 및 105E; 83T와 106I; 83T, 85V와 105E; 83T, 85T 및 105E; 83T, 85T, 105E와 106I; 또는 83T, 85V, 105E와 106I를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 아미노산 치환 83A와 85S; 83A, 85S 및 105E; 83A, 85S, 105E와 106I; 83I와 85S; 83I, 85S 및 105E; 83I, 85S, 105E와 106I; 83V와 85S; 83V, 85S 및 105E; 83V, 85S, 105E와 106I; 83F와 85S; 83F, 85S 및 105E; 또는 83F, 85S, 105E와 106I를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 아미노산 치환 83A와 105D; 83A, 85T와 105D; 83A, 85V와 105D; 83I와 105D; 83I, 85T와 105D; 83I, 85V와 105D; 83V와 105D; 83V, 85T와 105D; 83V, 85V와 105D; 83F와 105D; 83F, 85T와 105D; 또는 83F, 85V와 105를 포함하다.
일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 아미노산 치환 83F와 85V; 83V와 85V; 83I와 85V; 83A와 85V; 85T와 105E; 85V와 105E; 83F와 85T; 85V와 105E; 83V와 85T; 85V와 105E; 83I와 85T; 85V와 105E; 83A와 85T; 또는 85V와 105E를 포함한다.
증가된 안정성
상기 안정화된 키메라 Fab의 열 안정성을 상기 부모 키메라 Fab의 것과 비교함으로써, 상기 부모 키메라 Fab와 비교하여 상기 안정화된 키메라 Fab에 의해 나타나는 안정성의 증가를 결정한다. 한 구체예에서, 열 안정성은 시차주사열량분석 (DSC)에 의해 측정된다. 또다른 구체예에서, 열 안정성은 차등적 스캐닝 형광측정법 (DSF)에 의해 측정된다. 일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 상기 부모 키메라 Fab와 비교하여 열 안정성이 15℃이상 더 증가됨을 나타낼 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하는 안정화된 키메라 Fabs는 상기 부모 키메라 Fab와 비교하여 열 안정성이 15℃이상 더 증가됨을 나타낼 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하는 안정화된 키메라 Fabs는 상기 부모 키메라 Fab와 비교하여 열 안정성이 10℃이상 더 증가됨을 나타낼 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하는 안정화된 키메라 Fabs는 상기 부모 키메라 Fab와 비교하여 열 안정성이 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1℃의 증가를 나타낼 수 있다.
일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하는 안정화된 키메라 Fabs는 상기 부모 람다 항체의 Fab와 비교하여 열 안정성이 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1℃의 증가를 나타낼 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하는 안정화된 키메라 Fabs는 시차주사열량분석에 의해 측정되었을 때, 상기 부모 람다 항체의 Fab와 비교하여 열 안정성이 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1℃의 증가를 나타낼 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하는 안정화된 키메라 Fabs는 차등적 스캐닝 형광측정법에 의해 측정되었을 때, 상기 부모 람다 항체의 Fab와 비교하여 열 안정성이 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1℃의 증가를 나타낼 수 있다.
항원-결합에의 효과
하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하는 안정화된 키메라 Fab는 상기 부모 키메라 항체, 또는 상기 부모 람다 항체의 것과 유사한 친화력으로 표적 항원 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 상기 부모 람다 항체의 친화력의 약 10-배 안에 있는 친화력으로 표적 항원 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 구체예들에서, 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 상기 부모 람다 항체의 친화력의 약 5-배 안에 있는 친화력으로 표적 항원 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 여전히 다른 구체예들에서, 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 상기 부모 람다 항체의 친화력의 약 2.5-배 안에 있는 친화력으로 표적 항원 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 친화력은 본원 도처에서 기술된 바와 같이 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 이용하여 측정된다.
이동성
상기 안정화 아미노산 변형은 실시예에서 구체적으로 기술된 것 이외의 부모 키메라 Fabs로 공작될 수 있다. 람다 경쇄에서 가변 도메인과 불변 도메인 사이 계면에서 아미노산 잔기의 대부분이 상당히 보존되어 있기 때문에, 본원에서 기술된 안정화 아미노산 변형의 효과는 일반적으로 대부분의 부모 키메라 Fab 및 Mab 시스템으로 이동가능할 것으로 예상된다. 따라서, 상기 안정화 아미노산 변형은 일반적으로, V람다-C카파 키메라 경쇄를 포함하는 키메라 Fabs의 안정성을 증가시킬 수 있다.
추가 임의선택적 변형
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fabs는 (즉, 다양한 분자 유형의 공유적 부착에 의해) 더 변형될 수 있는데, 공유 부착은 상기 안정화된 키메라 Fab가 표적 항원의 에피토프에 결합하는 능력을 간섭하지 않는다. 이러한 변형에는 예를 들면, 당화, 아세틸화, 페길화, 포스포릴화, 아미드화, 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질 등과의 결합 등이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 다양한 화학적 변형 중 임의의 것을 임의의 특정 화학적 절단, 아세틸화, 포일화, 튜니카마이신의 대사 합성 등을 포함하는 공지된 기술에 의해 수행할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fabs는 Fab의 면역원성을 잠재적으로 감소시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 Kabat에 따라, 잔기 106A에서 아미노산 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 아미노산 치환 106AK를 포함한다.
다른 구체예들에서, 본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fabs는 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료제 또는 약물 모이어티에 (직접적으로 또는 간접적으로) 접합될 수 있다. 특정 구체예들에서, 안정화된 키메라 Fab는 약물, 예를 들어 독소, 화학요법제, 면역 조절제 또는 방사성동위원소에 접합된다. ADCs (항체-약물 접합체 또는 항체 구조체 약물 접합체)를 준비하는 몇 가지 방법들이 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면, US 특허 8,624,003 (포트 방법), 8,163,888 (원-스텝), 그리고 5,208,020 (투-스텝 방법)에 기술된다. 일부 구체예들에서, 상기 약물은 메이탄신, 아우리스테틴, 칼리케아미친, 또는 이의 유도체로부터 선택된다. 다른 구체예들에서, 상기 약물은 DM1 및 DM4로부터 선택된 메이탄신이다.
일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 세포독성제에 접합된다. 용어 "세포독성제(cytotoxic agent)"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 세포의 기능을 저해 또는 막는 및/또는 세포의 파괴시키는 물질을 지칭한다. 용어는 방사능활성 동위원소 (가령 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 그리고 Lu177), 화학치료요법적 물질, 그리고 독소, 이를 테면 세균, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 작은 분자 독소 또는 효소적으로 활성 독소, 및 이의 단편들 및/또는 변이체를 포함한다.
치료제 또는 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료제로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들면, 상기 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 소유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질에는 다음이 포함될 수 있다: 예를 들면, 독소 이를 테면, 아브린, 리친 A, 온코나제 (또는 또다른 세포독성 RNase), 슈도모나스 엑소톡신, 콜레라 톡신, 또는 디프테리아 톡신; 단백질 이를 테면 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성물질, 자가사멸제, 가령, TNF-알파, TNF-베타, AIM I (국제 공개 번호. WO 97/33899 참고), AIM II (국제 공개 번호. WO 97/34911 참고), Fas 리간드 (Takahashi 외., 1994, J. Immunol., 6:1567), 그리고 VEGI (국제 공개 번호. WO 99/23105 참고), 혈전제 또는 항-혈관형성제, 가령, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는, 생물학적 반응 조절제, 이를 테면, 예를 들면, 림포킨 (가령, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 마크로파아지 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 그리고 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF")), 또는 성장 인자 (가령, 성장 호르몬 ("GH")).
더욱이, 대안 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 방사성 금속 이온의 접합에 유용한 방사성활성 물질 또는 마크로시클릭 킬레이터와 같은 치료 모이어티에 접합될 수 있다(방사성활성 물질의 예는 위를 참조). 특정 구체예들에서, 마크로시클릭 킬레이터는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10- 테트라아자사이클로도데칸-N,N',N'',N''-테트라아세트산 (DOTA)이다. 이러나 링커 분자는 당분야에 공통적으로 공지되어 있고, Denardo 외., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Peterson 외., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; 그리고 Zimmerman 외., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943에서 기술된다.
일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 면역글로블린 중쇄 및 경쇄는 정제 및/또는 테스트 등을 용이하게 하는 태그(tag)를 포함하는 융합 단백질로 발현된다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, "태그"는 단백질의 확인 또는 정제에 기여하기 위하여 단백질의 C-말단, N-말단 또는 내부에 제공되는 첨가된 일련의 아미노산이다. 적합한 태그는 알부민 결합 도메인 (ABD), His 태그, FLAG 태그, 글루타티온-s-트랜스퍼라제, 헤마글 루티 닌 (HA) 및 말토오스 결합 단백질과 같은 정제 및/또는 시험에 유용한 것으로 당업자에게 공지된 태그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 태그된 단백질은 또한 정제 전, 정제 도중 또는 정제 후에 태그의 제거를 용이하게 하기위해 트롬빈, 엔테로 키나제 또는 인자 X 절단 부위와 같은 절단 부위를 포함하도록 조작될 수 있다.
분자 포멧
상기 안정화된 키메라 Fabs는 Fabs로 유용하며, 그리고 다른 분자 포멧, 또는 항체 구조체로 또한 혼입될 수 있다. 적합한 분자 포멧은 다음의 비-제한적 예를 포함한다: 링커와 함께, 또는 링커 없이, 폴리펩티드, 이를 테면 알부민 또는 이의 단편들, 작동체 펩티드, 톡신, 세포외 단백질, 사이토킨의 리간드-결합 도메인들, 그리고 이와 유사한 것들에 연계된 안정화된 키메라 Fabs. 예시적인, 비-제한적 항체 구조체는 다른 폴리펩티드, 이를 테면 Fabs, 키메라 또는 그렇지 않으면, scFvs, 도메인 항체, 또는 자연 발생 항체에 안정화된 키메라 Fabs를 융합시킴으로써, 기획될 수 있다. 상기 안정화된 키메라 Fabs의 중쇄 Fab 서열 및/또는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 링커와 함께, 또는 링커 없이, 다른 폴리펩티드에 연계될 수 있다. 상기 안정화된 키메라 Fabs는 해당 다른 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에서 이들에 융합될 수 있다. 상기 안정화된 키메라 Fab는 단일 쇄 Fab로써 또한 공작될 수 있다. 이러한 단일 쇄 Fabs는 국제 특허 공개 번호 WO 2014/018572, U.S. 특허 공개 번호. 2011/0293613 및 2010/0322935A1에 기술된다.
일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 스캐폴드에 직접 또는 간접적으로 연계될 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 항체 구조체는 스캐폴드에 연계된 최소한 하나의 안정화된 키메라 Fab를 포함한다. 적합한 스캐폴드 및 그의 변형은 당업계에 공지되어 있으며, 예시적인 스캐폴드 및 그의 변형은 하기에 기재되어 있다.
스캐폴드
상기 안정화된 키메라 Fab는 스캐폴드, 예를 들면 펩티드, 폴리펩티드, 중합체, 나노입자 또는 다른 화학적 엔터티에 연계될 수 있다. 상기 안정화된 키메라 Fab의 중쇄 Fab 서열 또는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 스캐폴드의 N- 또는 C-말단에 연계될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 스캐폴드는 알부민 폴리펩티드, 또는 쪼개진(split) 알부민 폴리펩티드이다. 적합한 쪼개진 알부민 폴리펩티드의 예들은 국제 특허 공개 번호. WO 2012/116453 및 WO 2014/012082에서 기술된다.
또다른 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 면역글로블린 Fc (Fc), 또는 이의 일부분인 스캐폴드에 연계될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc는 최소한 하나 또는 두 개의 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc는 최소한 하나 또는 두 개의 CH2 도메인 서열을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 하나 또는 그 이상의 링커와 함께 또는 링커 없이, 상기 Fc에 결합된다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc는 인간 Fc이다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc는 인간 IgG 또는 IgG1 Fc이다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc는 이형이량체 Fc이다. 일부 구체예들에서, Fc는 단일 폴리펩티드이다. 일부 구체예들에서, Fc는 다중 펩티드, 가령, 두 개의 폴리펩티드이다.
일부 구체예들에서, 상기 Fc는 최소한 하나의 상기 CH3 도메인 서열 안에 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 동종이량체 CH3 도메인 서열에 대하여 이형이량체 CH3 도메인 서열 간의 선호적 페어링을 유도하기 위하여 면역글로블린 Fc에 아미노산 변형이 만들어질 수 있다. 이들 아미노산 변형은 또한 본원에서 중쇄 페어링 디자인으로도 지칭된다. 이러한 아미노산 변형은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면, US 특허 공개 번호. 2012/0149876에 기술된 것들이 포함된다. 동종이량체 CH3 서열에 대하여 이형이량체 CH3 도메인 서열 사이에 선호적 페어링을 유도하기 위한 대안 전략에는 예를 들면, "노브 인투 홀(knobs into holes)"이온 상호작용을 가진 하전된 잔기, 그리고 가닥-교환 공작된 도메인 (SEED) 기술이 또한 이용될 수 있다. 후자의 전략은 관련 기술 분야에 기술되어 있으며, Klein 외, supra에서 검토된다. Fc 도메인들에 대한 추가 논의는 하기에 따른다.
일부 측면에 있어서, Fc는 2011년 11월 4일자로 제출된 특허 출원 PCT/CA2011/001238 또는 2012년 11월 2일자로 제출된 PCT/CA2012/050780에서 설명된 Fc이며, 이들 각각의 전제 공개문은 모든 목적을 위하여 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
일부 측면들에서, 이 항체 구조체는 비대칭적으로 변형된 변형 CH3 도메인을 포함하는 이형이량체 Fc에 링커와 함께, 또는 링커없이, 연계된 안정화된 키메라 Fab를 포함한다. 상기 이종이량성 Fc는 두 개의 중쇄 불변 도메인 폴리펩티드: 제 1 중쇄 폴리펩티드 및 제 2 중쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, Fc가 하나의 제 1 중쇄 폴리펩티드와 하나의 제 2 중쇄 폴리펩티드를 포함한다면, 호환이용될 수 있다. 일반적으로, 제 1 중쇄 폴리펩티드는 제 1 CH3 서열을 포함하고, 제 2 중쇄 폴리펩티드는 제 2 CH3 서열을 포함한다.
비대칭 방식으로 도입된 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 포함된 2개의 CH3 서열은 두 게의 CH3 서열이 이량체화될 때, 일반적으로 동종이량체보다는 이종이량체 Fc를 초래한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "비대칭 아미노산 변형"은 임의의 변형을 지칭하는데, 제 1 CH3 서열의 특정 위치의 아미노산은 제 2 CH3 서열의 동일한 위치의 아미노산과 상이하며, 제 1 및 제 2 CH3 서열은 선호적으로 동종이량체보다는 이종이량체가 형성되도록 쌍을 이룬다. 이러한 이종이량체화는 각 서열에서 동일한 해당 아미노산 위치에서 두 개 아미노산중 오직 하나의 변형 결과일 수 있거나; 또는 제 1 및 제 2 CH3 서열 각각에 동일한 각 위치에서 각 서열의 두 아미노산 모두의 변형 결과일 수 있다. 이종이량성 Fc의 제 1 및 제 2 CH3 서열은 하나 또는 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
표 X는 전장의 인간 IgG1 중쇄 아미노산 231-447에 상응하는, 인간 IgG1 Fc 서열의 아미노산 서열을 제공한다. CH3 서열은 전장 인간 IgG1 중쇄의 아미노산 341-447을 포함한다.
전형적으로 Fc는 이량체화할 수 있는 두 개의 인접 중쇄 서열 (A 및 B)을 포함한다. 일부 측면에 있어서, Fc의 하나 또는 두 서열 모두는 다음 위치에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이 또는 변형을 함유한다: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400, 및/또는 N390 - EU 번호매김에 따름. 일부 측면들에서, Fc는 표 X에 나타낸 돌연변이 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, Fc는 변이체 1 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면들에서, Fc는 변이체 2 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면들에서, Fc는 변이체 3 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면들에서, Fc는 변이체 4 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 측면들에서, Fc는 변이체 5 A-B의 돌연변이를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 Fc는 최소한 하나의 상기 CH2 도메인 서열 안에 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 상기 Fc의 중쇄 서열에서 다수의 돌연변이는 상이한 Fc감마 수용체들에 대한 항체 Fc의 친화력을 선택적으로 변경시키는 것으로 당분야에 알려져 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc는 Fc-감마 수용체들의 이 항체 구조체로의 결합을 변경시키는 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다.
상기 CH2 도메인은 표 X의 서열에 나타낸 아미노산 231-340에 대응한다. 예시적인, 이 항체 구조체의 Fc가 Fc-감마 수용체들에 대한 능력을 변경시키는 비-제한적 아미노산 변형은 하기에 열거된다:
S298A/E333A/K334A, S298A/E333A/K334A/K326A (Lu Y, Vernes JM, Chiang N, 외. J Immunol Methods. 2011 Feb 28;365(1-2):132-41); F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen JB, Gorlatov S, Tuaillon N, 외. Cancer Res. 2007 Sep 15;67(18):8882-90; Nordstrom JL, Gorlatov S, Zhang W, 외. Breast Cancer Res. 2011 Nov 30;13(6):R123); F243L (Stewart R, Thom G, Levens M, 외. Protein Eng Des Sel. 2011 Sep;24(9):671-8.), S298A/E333A/K334A (Shields RL, Namenuk AK, Hong K, 외. J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604); S239D/I332E/A330L, S239D/I332E (Lazar GA, Dang W, Karki S, 외. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10); S239D/S267E, S267E/L328F (Chu SY, Vostiar I, Karki S, 외. Mol Immunol. 2008 Sep;45(15):3926-33); S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/S298A/K326A/A327H, G237F/S298A/A330L/ I332E, S239D/I332E/S298A, S239D/K326E/A330L/I332E/S298A, G236A/S239D/D270L/I332E, S239E/S267E/H268D, L234F/S267E/N325L, G237F/V266L/S267D 그리고 WO2011/120134 및 WO2011/120135에 열거된 다른 돌연변이, 이들은 본원의 참고자료에 편입됨. Therapeutic Antibody Engineering (William R. Strohl and Lila M. Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, Oct 2012)에서는 페이지 283에 Fc가 Fc-감마 수용체들로의 결합에 영향을 주는 Fc의 변형을 기술한다.
한 구체예에서, 항체 구조체는 안정화된 키메라 Fab 및 이량체 Fc를 포함하며, 이때 상기 이량체 Fc는 아미노산 변형 L234A, L235A, 그리고 D265S를 포함한다.
작동체 기능을 개선시키기 위한 추가 변형.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 안정화된 Fab를 포함하는 항체 구조체의 Fc는 이의 작동체 기능을 개선시키기 위하여 변형될 수 있다. 이러한 변형은 당분야에 공지되어 있으며, 탈푸코실화(afucosylation), 또는 활성화 수용체, ADCC의 경우 주로 FCGR3a를 지향하고, CDC의 경우 C1q를 지향하는 항체의 Fc 부분의 친화력의 공작을 포함한다. 다음 표 Y에는 작동체 기능 공학에 대하여 문헌에서 보고된 다양한 디자인이 요약되어 있다.
따라서, 한 구체예에서, 항체 구조체는 상기 표에 명시된 개선된 작동체 기능을 부여하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함하는 안정화된 키메라 Fab 및 이량체 Fc를 포함한다. 또다른 구체예에서, 이 항체 구조체는 작동체 기능을 개선시키기 위하여 탈푸코실화될 수 있다.
FcRn 결합 및 PK 매개변수들
당분야에 공지된 바와 같이, FcRn에 결합은 엔도좀으로부터 세포내이입된(endocytosed) 항체를 다시 혈류로 돌려보낸다(Raghavan 외, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie 외, 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766). 전장 분자의 큰 크기로 인하여 신장 여과가 배제된 이 과정은 1 내지 3주 범위의 우호적인 항체 혈장 반감기를 결과한다. Fc가 FcRn에 결합되는 것은 또한 항체 운반에 역할을 한다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 Fc는 상기 Fc가 FcRn에 결합하는 능력을 변경 또는 촉진시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 안정화된 키메라 Fab 및 Fc를 포함하는 항체 구조체는 FcRn에 결합할 수 있다.
링커
안정화된 키메라 Fabs는 본원에 기재된 바와 같이 스캐폴드에 작동 가능하게 커플링될 수 있다. 예를 들면, 안정화된 키메라 Fab를 포함하는 항체 구조체는 본원에 기술된 바와 같이 Fc에 작동 가능하게 커플링될 수 있다. 당업자는 안정화된 키메라 Fab를 포함하는 항체 구조체를 커플 링하기 위한 다수의 구성 및 방법이 가능하며, 이들 모두는 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 이해할 것이다. 일부 측면들에서, 상기 Fc는 하나 또는 그 이상의 링커와 함께, 또는 링커 없이 상기 안정화된 키메라 Fab에 결합된다. 일부 측면들에서, 상기 Fc는 상기 안정화된 키메라 Fab에 직접적으로 결합된다. 일부 측면들에서, 상기 Fc는 하나 또는 그 이상의 링커에 의해 상기 안정화된 키메라 Fab에 결합된다.. 일부 측면들에서, Fc는 링커에 의해 상기 안정화된 키메라 Fab의 중쇄에 결합된다. 일부 측면들에서, 상기 Fc는 링커에 의해 상기 안정화된 키메라 Fab의 키메라 경쇄에 결합된다.
일부 측면들에서, 하나 또는 그 이상의 링커는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 링커이다. 일부 측면들에서, 하나 또는 그 이상의 링커는 하나 또는 그 이상의 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 링커는 하나 또는 그 이상의 IgG1 힌지 영역을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 단가(monovalent) 항체 구조체, 즉, 오직 하나의 항원-결합 도메인만을 갖는 항체 구조체 안으로 혼입될 수 있다. 이들 단가 항체 구조체는 안정화된 키메라 Fab, 그리고 스캐폴드를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 스캐폴드는 Fc 영역이다.
다른 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 다중-특정 항체 구조체인 항체 구조체 안으로 혼입될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fab는 이중특이적 항체 구조체인 항체 구조체 안으로 혼입될 수 있다. 한 구체예에서, 이중특이적 항체 구조체는 안정화된 키메라 Fab, 그리고 제 2 Fab를 포함할 수 있으며, 상기 제 2 Fab는 면역글로블린 경쇄 구조체와 면역글로블린 중쇄 구조체를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 제 2 Fab는 또한 안정화된 키메라 Fab이다.
안정화된 키메라 Fab, 제 2 Fab, 그리고 Fc 스캐폴드를 포함하는 이중특이적 항체 구조체 내용에서, 상기 이중특이적 항체 구조체 준비를 가능하게 하기 위하여 추가 아미노산 변형은 상기 이중특이적 항체 구조체 안으로 공작될 수 있다. 예를 들면, 중쇄 페어링 디자인 및/또는 경쇄 페어링 디자인은 바람직한 이중특이적 항체가 형성되도록 중쇄 및 경쇄의 페어링을 촉진시키기 위하여 이중특이적 항체 구조체 안으로 공작될 수 있다. 중쇄 페어링 디자인의 예들은 본 명세서의 도처에서 설명된다. 경쇄 페어링 디자인의 예는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 국제 특허 공개 번호. WO 2014/082179, WO 2015/181805, 그리고 WO 2017/059551에서 기술된다.
안정화된 키메라 Fabs를 준비하는 방법
상기에서 기술된 바와 같이, 본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fabs는 CH1 도메인 서열 및 VH 도메인 서열을 포함하는 중쇄 (중쇄 Fab 서열), 그리고 키메라 면역글로블린 경쇄 폴리펩티드 (V람다-C카파 키메라 경쇄) 구조체를 포함하고, 이때 상기 중쇄 Fab 서열 및 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 표적 항원 상에서 에피토프에 결합하는 Fab 영역을 형성한다. V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체의 V람다 서열은 상기 부모 키메라 Fab와 비교하여 상기 안정화된 키메라 Fab의 열 안정성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함한다.
따라서, 상기 안정화된 키메라 Fab를 구성하는 두 개의 폴리펩티드 서열이 일반적으로 존재한다: 중쇄 Fab 서열 및 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체. 일부 구체예들에서, 안정화된 키메라 Fabs를 포함하는 항체 구조체는 단일특이적 이가 항체, 또는 이중특이적 항체로 준비될 수 있다. 이들 구체예에서, 전형적으로 4개의 별개 폴리펩티드 서열, 두 개의 면역글로블린 중쇄 폴리펩티드 서열 (상기 Fc 영역을 구성하는 서열 포함) 또는 이의 단편들와 두 개의 면역글로블린 경쇄 폴리펩티드 서열이 있는데, 최소한 하나는 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체이다. 이들 모든 폴리펩티드 서열은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드로 지칭되며, 당분야에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 바로 준비될 수 있다. 표준 기술 이를 테면, 예를 들면, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd ed., 2001); Sambrook 외., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2nd ed., 1989); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel 외., John Wiley and Sons, New York, 4th ed., 1999); 그리고 Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 2nd ed., 1998)에 기술된 것들이 재조합 핵산 방법, 핵산 합성, 세포 배양물, 이식유전자 혼입, 그리고 재조합 단백질 발현에 이용될 수 있다.
상기 부모 람다 항체의 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열 또는 상기 안정화된 키메라 Fab를 구성하는 카파 경쇄 서열은 당분야에 공지되어 있거나 또는 핵산 및/또는 단백질 서열화 방법을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.
따라서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 상기 중쇄 Fab 서열 및 V람다-C카파 키메라 Fab 경쇄 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트가 또한 제공된다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 및 이중-가닥 형태 모두의 DNA와 RNA, 뿐만 아니라 대응하는 보체 서열을 포함한다. DNA는 예를 들면, cDNA, 게놈 DNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA, 그리고 이의 조합을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 전장의 유전자 또는 cDNA 분자 뿐만 아니라 이의 단편들의 조합을 포함한다.
본원에서 기술된 공작된 면역글로블린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공작된 면역글로블린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 만들고, 그리고 그 다음 본원에서 기술된 바와 같이 세포 배양물에서 상기 재조합 DNA를 발현시키기 위하여, 카세트 또는 PCR 돌연변이생성 또는 당분야에 공지된 다른 기술을 이용하여 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA에 뉴클레오티드의 부위 특정 돌연변이 생성에 의해 준비될 수 있다. 그러나, 공작된 면역글로블린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 확립된 기술을 이용하여 시험관내 유전자 합성에 의해 또한 준비될 수 있다.
당업자들이 인지할 수 있는 바와 같이, 유전자 코드의 축중성으로 인하여, 상당히 많은 수의 폴리뉴클레오티드가 만들어질 수 있고, 이들 모두는 본원에서 기술된 공작된 면역글로블린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 인코딩한다. 따라서, 특정 아미노산 서열을 확인한 경우, 당업자는 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 방식으로 하나 또는 이상의 코돈의 서열을 간단히 변형시킴으로써, 임의의 수의 상이한 폴리뉴클레오티드를 만들 수 있다.
상기와 같이 최소한 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 라스미드, 발현 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 발현 시스템 및 구조체가 또한 제공된다. 이러한 발현 시스템 또는 구조체를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.
전형적으로, 상기 숙주 세포에 이용되는 발현 벡터는 플라스미드 유지용 서열과 외인성 뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현용 서열을 포함하고 있을 것이다. "측면(flanking) 서열"로 집합적으로 불리는 이러한 서열은 특정 구체예들에서 다음의 뉴클레오티드 서열:중 하나 또는 그 이상을 전형적으로 포함할 것이다: 프로모터, 하나 또는 그 이상의 인헨서 서열, 복제 원점, 전사 종료 서열, 공여 및 수용 스플라이스 부위를 함유하는 완전 인트론 서열, 폴리펩티드 분비용 리더 서열, 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현되는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 삽입용 폴리링커 영역, 그리고 선택적 표지 원소를 인코딩하는 서열. 벡터는 다중시스트론성(multicistronic)일 수 있는데 즉, 상기 안정화된 키메라 Fab의 면역글로블린 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 2개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현시키거나, 또는 상기 안정화된 키메라 Fab는 벡터 세트에 의해 발현될 수 있는데, 각 벡터는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현시킨다. 이 항체 구조체는 다중시스트론성 벡터와 면역글로블린 중쇄 및 경쇄중 하나를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 조합을 포함하는 벡터 세트를 이용하여 또한 발현될 수 있다.
일부 구체예들에서, 벡터는 "태그"-인코딩 서열, 즉, 폴리펩티드 코딩 서열의 5' 또는 3' 단부에 위치한 올리고뉴클레오티드 분자를 함유할 수 있는데; 상기 올리고뉴클레오티드 서열은 폴리His (이를 테면 헥사His), 또는 또다른 "태그", 이를 테면 FLAG, HA (헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스), 또는 시판되는 이용가능한 항체가 존재하는 myc를 인코딩한다. 이 태그는 폴리펩티드의 발현시 폴리펩티드에 전형적으로 융합되며, 그리고 상기 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 친화력 정제 또는 탐지하기 위한 수단으로 작용할 수 있다. 친화력 정제는 예를 들면, 친화력 매트릭스로써 이 태그에 대한 항체를 이용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 실행될 수 있다. 임의선택적으로, 이 태그는 다양한 수단, 이를 테면 펩티다제 절단에 의해 상기 절제된 폴리펩티드로부터 후속적으로 제거될 수 있다.
벡터는 전형적으로 숙주 유기체에 의해 인지되고, 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터는 구조 유전자의 전사를 조절하는 이 구조 유전자의 시작 코돈의 상류(즉, 5')(일반적으로 약 100 내지 1000bp 안에) 위치한 미전사 서열이다. 프로모터는 통상적으로 2 가지 클래스: 유도성 프로모터 및 구성적 프로모터의중 하나로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서 일부 변화, 가령, 영양분의 존부 또는 온도의 변화에 반응하여 이들 프로모터 조절 하에 DNA로부터 증가된 전사 수준을 개시한다. 한편, 구성적 프로모터는 유전자 발현을 거의 또는 전혀 제어하지 않고, 이에 작동가능하게 연결된 유전자를 균일하게 전사한다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인지되는 다수의 프로모터가 잘 알려져 있다.
효모 숙주, 박테리아 숙주, 그리고 곤충 숙주로 이용가능한 적합한 프로모터는 당분야에 잘 알려져 있다. 효모 인헨서는 효모 프로모터와 함께 유익하게 이용된다. 포유류 숙주 세포와 사용하기에 적합한 프로모터는 공지되어 있고, 바이러스의 게놈, 이를 테면 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(이를 테면, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 그리고 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 획득될 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 다른 적합한 포유류 프로모터는 이종(heterologous) 포유류 프로모터, 예를 들면, 열-쇼크 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
벡터는 벡터가 숙주 세포 게놈으로 통합될 때 발현을 촉진시키는 하나 또는 그 이상의 요소를 함유할 수 있다. 예로는 EASE 요소 (Aldrich 외. 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38) 및 매트릭스 부착 영역 (MAR)이 포함된다. MARs는 염색질의 구조적 조직을 매개하고, 통합된 벡터를 "위치" 효과로부터 격리시킬 수 있다. 따라서, MARs은 벡터가 안정적인 형질감염체를 생성하는데 사용될 때 특히 유용하다. 다수의 천연 및 합성 MAR-함유 핵산은 당업계에 공지되어있고, 가령, U.S. 특허 번호. 6,239,328; 7,326,567; 6,177,612; 6,388,066; 6,245,974; 7,259,010; 6,037,525; 7,422,874; 7,129,062에 기술된다.
벡터가 구축되고, 폴리뉴클레오티드가 벡터의 적절한 부위에 삽입된 후, 완성된 벡터는 증폭 및/또는 폴리펩티드 발현을 위해 적합한 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 발현 벡터의 선택된 숙주 세포로의 형질전환은 형질 감염, 감염, 인산 칼슘 공-침전, 전기천공, 미세주입, 지방감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질 감염 또는 다른 공지된 기술을 비롯한 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로 사용될 숙주 세포 유형의 함수일 것이다. 숙주 세포는 일시적으로 형질감염되거나, 또는 숙주 세포는 안정적으로 형질감염될 수 있다. 이들 방법 및 다른 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Sambrook 외., 2001, supra.에 기재되어 있다.
재조합 단백질의 장기적인, 고-수율 생산을 위하여, 안정적 발현이 대개 바람직하다. 예를 들면, 안정화된 키메라 Fab의 공작된 중쇄 및 경쇄를 안정적으로 발현하는 세포주를 제조할 수 있다. 바이러스의 복제 원점이 포함된 발현 벡터 이용보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소들 (가령, 프로모터, 인헨서, 서열, 전사 종료인자들, 폴리아데닐화 부위, 등.)에 의해 조절된 DNA, 그리고 선택가능한 표지로 형질전환될 수 있다. 외부 DNA 또는 폴리뉴클레오티드의 도입 후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1-2일간 성장하도록 허용하고, 그 다음 선택 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드에서 선택가능한 표지는 선택에 대하여 저항성을 부여하고, 세포가 이들의 염색체 안으로 플라스미드를 안정적으로 통합시키도록 하고, 증식소(foci)가 형성되도록 성장되고, 그 결과 클론되고, 세포 계통으로 확장될 수 있도록 한다.
다수의 선별 시스템이 이용될 수 있는데, 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제(Wigler 외., 1977, Cell 11 :223), 하이포산틴-구아닌 포스포리보실전달효소 (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), 그리고 아데닌 포스포리보실전달효소 (Lowy 외., 1980, Cell 22:817) 유전자들이 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포들에서 이용될 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 또한, 항대사물질 내성은 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler 외., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare 외., 1981 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); 미코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, 1981 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 저형성을 부여하는 neo (Colberre-Garapin 외., 1981 , J. Mol. Biol. 150:1); 그리고 하이그로마이신에 저항성을 부여하는 hygro(Santerre 외., 1984, 유전자 30:147) 유전자에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다.
적절한 조건에서 배양될 때 숙주 세포는 안정화된 키메라 Fab를 생성하며, 이는 후속적으로 배양 배지로부터 수집될 수 있거나(상기 숙주 세포가 이를 배지로 분비한다면) 또는 이를 생산하는 상기 숙주 세포로부터 직접적으로 수집할 수 있다 (분비하지 않는다면). 적절한 숙주 세포의 선택은 원하는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 필요한 폴리펩티드 변형 (예, 글리코실화 또는 인산화) 및 생물학적 활성 분자로의 폴딩 용이성과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들면, 박테리아 시스템에서의 발현은 당화되지 않은 생성물을 생성하고, 효모에서의 발현은 글리코실화된 생성물을 생성할 것이다. 유전자 산물의 일차 전사체의 적절한 가공(가령, 당화 및 인산화)를 위한 세포 기전을 보유하는 진핵 숙주 세포가 이용될 수 있다.
발현용 숙주로 이용가능한 포유류 세포 계통은 당분야에 공지되어 있고, American Type Culture Collection (ATCC)로부터 이용가능한 불사화된 세포 계통을 포함하나, 이에 국한되지 않으며, 당분야에 공지된 발현 시스템에 이용되는 임의의 세포 계통을 이용하여 본원에서 기술된 재조합 폴리펩티드를 만들 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 상기 안정화된 키메라 Fab를 인코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된다. 사용될 수 있는 숙주 세포 중에는 원핵 생물, 효모 또는 고등 진핵 세포가 있다. 원핵 생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 대장균(E. coli) 또는 바실리를 포함한다. 고등 진핵 세포는 곤충 세포 및 포유류 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 적합한 포유류 숙주 세포 계통의 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7 계통 (ATCC CRL 1651) (Gluzman 외., 1981, Cell 23:175), L 세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포, 또는 이들의 유도체, 이를 테면 Veggie CHO 및 무-혈청 배지에서 성장하는 관련된 세포 계통 (Rasmussen 외., 1998, Cytotechnology 28: 31), HeLa 세포, BHK (ATCC CRL 10) 세포 계통, 그리고 McMahan 외., 1991, EMBO J. 10: 2821에서 기술된 바와 같은 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 계통 CV1 (ATCC CCL 70)로부터 유래된 CV1/EBNA 세포 계통, 인간 배아 신장 세포, 이를 테면 293, 293 EBNA 또는 MSR 293, 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 다른 형질전환된 영장류 세포 계통, 정상적인 이배체 세포, 일차 세포, 일차 체외 배양 조직의 시험관 배양물로부터 유래된 세포 균주, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포를 포함한다. 대안으로, 효모와 같은 하등 진핵 생물, 또는 박테리아와 같은 원핵 생물에서 폴리펩티드를 생산하는 것이 가능하다. 적합한 효모는 사카로미세스 세르비시에( Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루베로미세스(Kluyveromyces ) 계통, 칸디다(Candida), 또는 이종 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 임의의 효모 균주를 포함한다. 적합한 박테리아 균주는 대장균( Escherichiacoli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티리무리움(Salmonella typhimurium), 또는 이종 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 임의의 박테리아 균주를 포함한다.
상기 안정화된 키메라 Fab는 효모 또는 박테리아에서 생산된다면, 기능성 산물을 수득하기 위해, 예를 들어, 적절한 부위의 인산화 또는 글리코실화에 의해 생산된 산물을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 공유 부착은 공지된 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 이 항체 구조체는 또한 폴리뉴클레오티드의 세트를 하나 또는 그 이상의 곤충 발현 벡터에서 적합한 제어 서열에 작동 가능하게 연결하고, 곤충 발현 시스템을 사용함으로써 생성될 수 있다. 베큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 재료 및 방법은 가령, Invitrogen, San Diego, Calif., U.S.A.의 시판 키트 형태가 있고(MaxBac™ 키트), 그리고 이러한 방법은 Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), 그리고 Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)에 기술된 바와 같이, 당분야에 공지되어 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유 동물 세포 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 Pouwels 외. (Cloning Vector: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)에서 기술된다.
특정 구체예들에서, 무-세포 단백질 발현 시스템을 이용하여, 살아있는 세포의 사용 없이, 폴리뉴클레오티드의 세트로부터 폴리펩티드 (가령, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드)를 공동-발현시킬 수 있다. 대신, DNA를 RNA로 전사하고, RNA를 단백질로 해독하는데 필요한 모든 성분 (예를 들어 리보솜, tRNA, 효소, 보조인자, 아미노산)이 시험 관내 사용을 위해 용액으로 제공된다. 특정 구체예들에서, 시험관내 발현을 위해서 (1) 상기 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 주형(mRNA 또는 DNA) 그리고 (2) 필요한 전사 및 번역 분자 기전을 함유하는 반응 용액이 필요하다. 특정 구체예들에서, 세포 추출물은 실질적으로 반응 용액의 성분을 공급하는데, 예를 들면: mRNA 전사를 위한 RNA 중합효소, 폴리펩티드 해독을 위한 리보솜, tRNA, 아미노산, 효소 보조인자, 에너지 원, 그리고 단백질 폴딩에 필수적인 세포 성분. 무-세포 단백질 발현 시스템은 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유류 세포, 인간 세포 또는 이의 조합으로부터 유래된 용해물을 이용하여 준비할 수 있다. 이러한 세포 용해물은 해독에 필요한 정확한 조성 및 비율의 효소 및 빌딩 블록을 제공할 수 있다. 일부 구체예들에서, 세포 막은 세포의 세포질 및 소기관(organelle) 성분만을 남기도록 제거된다.
몇 가지 무 세포 단백질 발현 시스템은 Carlson 외. (2012) Biotechnol. Adv. 30:1185-1194에서 검토된 바와 같이, 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 무-세포 단백질 발현 시스템은 원핵 또는 진핵 세포에 기반하여 이용가능하다. 원핵 무-세포 발현 시스템의 예로는 대장균의 것들을 포함한다. 진핵 무-세포 단백질 발현 시스템은 예를 들어, 토끼 망상 적혈구, 밀 배아 및 곤충 세포로부터의 추출물을 기초로 이용할 수 있다. 이러한 원핵 및 진핵 무-세포 단백질 발현 시스템은 이를 테면 Roche, Invitrogen, Qiagen, 그리고 Novagen와 같은 회사로부터 상업적으로 구입가능하다. 당업자는 서로 페어링을 이룰수 있는 폴리펩티드 (예를 들어, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드)를 생성하는 적합한 무-세포 단백질 발현 시스템을 용이하게 선택할 수 있을 것이다. 더욱이, 상기 무-세포 단백질 발현 시스템은 또한 샤프론 (가령, BiP) 및 이성질화 효소 (가령, 이황화 이성질화 효소)를 보충하여 IgG 폴딩의 효율을 향상시킬 수 있다.
중쇄 및 경쇄의 공동-발현
상기 본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fab의 공작된 면역글로블린 중쇄 및 경쇄는 상기에서 기술된 바와 같이, 포유류 세포에서 공동-발현될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab의 면역글로블린 중쇄 및 면역글로블린 경쇄는 숙주 세포에서 공동-발현될 수 있다. 따라서, 최소한 하나의 안정화된 키메라 Fab를 포함하는 이중특이적 항체 구조체의 경우에서, 제 2 Fab 및 Fc 스캐폴드, 두 개의 면역글로블린 중쇄 (H1 및 H2) 및 두 개의 면역글로블린 경쇄 (L1 및 L2)는 숙주 세포에서 공동-발현되어 제 1 에피토프에 결합하는 H1L1 쌍과 제 2 에피토프에 결합하는 H2L2 쌍을 형성한다. 그러나, 4 개의 쇄를 모두 발현하는 단일 클론 또는 일시적 세포주의 사용에 의존하지 않는 이중 특이적 항체 구조체를 생성하는 대안 방법은 또한 당 업계에 공지되어있다(Gramer, 외. (2013) mAbs 5, 962; Strop 외. (2012) J Mol Biol 420, 204.). 이들 방법은 이중 특이적 항체의 형성에 수반된 두 개 쌍의 경쇄 및 중쇄의 산화 환원 조건 하에서 생산 후 암(arm) 교환에 의존한다(산화환원 생산). 이 방법에서, H1L1 및 H2L2 이형이량체는 2 개의 이형이량체를 독립적으로 생성하기 위해 2 개의 상이한 세포 계통에서 발현될 수 있다. 후속적으로, 두 개의 이형이량체는 선택된 산화환원 조건 하에서 혼합되어, 2 개의 고유한 중쇄 H1 및 H2의 재-연합을 달성하여 H1L1H2L2를 포함하는 이중 특이적 항체 구조체를 형성한다.
일부 구체예들에서, 2 개의 고유한(unique) 중쇄 및 2 개의 고유 한 경쇄의 공동-발현에 의해 생성된 목적하는 이중 특이적 항체의 양은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, H1과 H2 사이의 선호적 페어링을 촉진하는 2 개의 중쇄의 CH3 도메인에서 아미노산 변형에 의해 증가된다. 일부 구체예들에서, 2 개의 고유한 중쇄 및 2 개의 고유 한 경쇄의 공동-발현에 의해 생성된 목적하는 이중 특이적 항체의 양은 상기 CH1 및 CL 도메인들에서 및/또는 VH와 VL 도메인들에서 중쇄와 경쇄 간의 선호적 페어링을 촉진하는 아미노산 변형에 의해 증가된다. 후자의 아미노산 변형의 예는 국제 공개 번호. WO2014/082179 및 WO2015/181805에서 기술된다.
상기 CH1/CL 및/또는 VH/VL 도메인들에 아미노산 변형이 면역글로블린 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드로 혼입됨으로써 주로 구동되기는 하지만, 정확하게-쌍을 이룬 이형이량체의 양은 실시예에서 나타낸 것과 같이, 서로 각각 폴리펩티드를 인코딩하는 비율을 변화시킴으로써 더욱 최적화될 수 있다.
안정화된 키메라 Fabs의 테스트
각각의 안정화된 키메라 Fab의 각각의 항원에 대한 친화력은 하기 기재된 바와 같이 테스트될 수 있다. 각 안정화된 키메라 Fab의 열 안정성은 하기 기재된 바와 같이 또한 테스트될 수 있다.
열 안정성
상기 안정화된 키메라 Fabs의 열 안정성은 당분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 각 안정화된 키메라 Fab의 용융 온도는 이의 열 안정성의 지표다. 상기 안정화된 키메라 Fab의 용융 온도는 이를 테면, 시차주사열량분석 (Chen 외 (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando 외 (1999) Immunol Lett 68:47-52), 그리고 차등적 스캐닝 형광측정법 (Niesen 외. (2007) Nature Protocols 2(9): 2212-21) 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 후자의 방법은 "용융 온도" 또는 Tm과 관련하여 열 안정성의 척도를 제공한다. 대안으로, 안정화된 키메라 Fab의 열 안정성은 원형 이색성(circular dichroism)을 사용하여 측정될 수 있다 (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9). 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab, 또는 상기 안정화된 키메라 Fab를 포함하는 항체의 열 안정성은 시차주사열량분석 (DSC)에 의해 측정된다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab, 또는 상기 안정화된 키메라 Fab를 포함하는 항체의 열 안정성은 차등적 스캐닝 형광측정법 (DSF)에 의해 측정된다. 한 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fab, 또는 상기 안정화된 키메라 Fab를 포함하는 항체의 열 안정성은 DSC 또는 DSF에 의해 측정된다.
항원의 친화력
이들 각각의 항원에 대한 안정화된 키메라 Fabs의 결합 친화력 및 상호 작용의 해리 속도(off-rate)는 당업계에 공지된 방법에 따른 경쟁적 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 분석의 한 예는 라벨안된 항원의 양을 증가시키면서, 라벨된 항원 (예를 들어, 관심 분자(가령,본원에 기재된 안정화된 키메라 Fabs)와 함께 3H 또는 125I)의 배양 및 라베로딘 항원에 결합된 분자의 탐지를 포함하는 방사성 면역 분석법이다. 항원에 대한 안정화된 키메라 Fabs의 친화력 및 결합 해리 속도는 Scatchard 분석에 의해 포화(saturation) 데이터로부터 결정될 수 있다.
본원에 기재된 안정화된 키메라 Fab가 항원에로의 결합에 대한 동역학 파라미터는 당업계에 공지된 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기반 분석법 (예를 들어, BIAcore 동역학적 분석)을 사용하여 결정될 수 있다. SPR-기반 기술에 대한 검토는 Mullet 외., 2000, Methods 22: 77-91; Dong 외., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash 외., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich 외., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61을 참고한다. 추가적으로, U.S. 특허 번호. 6,373,577; 6,289,286; 5,322,798; 5,341,215; 6,268,125에서 기술된 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 임의의 SPR 기구 및 SPR 기반 방법은 안정화된 키메라 Fab가 항원에 결합하는 능력을 평가하는 방법에 고려된다. FACS와 바이오-층 간섭측정을 비롯한 당분야에 공지된 다른 방법 (평행 실시간 라벨-없는 바이오센스를 이용하여 단백질 상호작용의 역학 및 친화력을 결정하기 위하여 설명된 BLI, Octet. Abdiche, Y.N.; Malashock, D. S.; Pinkerton, A; Pons, J. Analytical Biochemistry, 2008, 377(2), 209-217)은 또한 친화력을 측정하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 안정화된 키메라 Fab 또는 안정화된 키메라 Fab를 포함하는 항체가 표적 항원에 결합하는 능력은 SPR에 의해 측정된다. 한 구체예에서, 안정화된 키메라 Fab 또는 안정화된 키메라 Fab를 포함하는 항체가 표적 항원을 지향하는 친화력은 SPR에 의해 측정된다.
약학 조성물
본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fabs 또는 항체 구조체를 포함하는 약학 조성물이 또한 본원에서 제공된다. 이러한 조성물은 치료요법적으로 유효량의 안정화된 키메라 Fab, 그리고 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함한다. 특이적 구체예에서, 용어 "약학적으로 수용가능한"이란 U.S. 약전에 열거된 연방 또는 주정부의 관리가 승인한 또는 동물, 더욱 구체적으로 인간에 사용할 수 있는 것으로 일반적으로 인지된 다른 약전에서 승인되었다는 것을 의미한다. 용어 "운반체"는 치료요법제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 운반체를 말한다. 이러한 약학 운반체들은 멸균 유체, 이를 테면 물 그리고 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일, 이를 테면 땅콩유, 대두유, 미네랄유, 참깨유 및 이와 유사한 것들이 포함된 오일이 될 수 있다. 물은 상기 약학 조성물이 정맥으로 투여될 때, 바람직한 운반체다. 염 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액은 특히 주사용 용액을 위한 액체 운반체로 또한 이용될 수 있다. 적합한 약학 부형제는 가령, 전분, 셀룰로오즈, 활석, 포도당, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 석회분말, 실리카 겔, 스테아레이트 나트륨, 모노스테아레이트 글리세롤, 활석, 염화 나트륨, 건조 탈지우유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다. 바람직한 경우, 상기 조성물은 미량의 가습 또는 유화 물질, 또는 pH 완충 물질을 또한 포함할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 유액, 테블릿, 알약, 캡슐, 분말, 지연-방출 제형 및 이와 유사한 것들의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물은 통상적인 결합체 및 운반체, 이를 테면 트리글리세리드와 함께, 좌약으로 제형화될 수 있다. 경구 제형은 표준 운반체, 이를 테면 약학 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아레이트 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오즈, 탄산 마그네슘, 등등을 함유할 수 있다. 적합한 약학 운반체의 예들은 E. W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에서 설명된다. 이러한 조성물은 환자에게 적절하게 투여하기 위한 형태를 제공할 수 있도록 적합한 양의 운반체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태의 치료요법적으로 유효량의 상기 화합물을 포함할 것이다. 상기 제형은 투여 방식에 맞아야 한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 안정화된 키메라 Fab 또는 안정화된 Fab를 포함하는 항체 구조체가 포함된 상기 조성물은 인간에게 정맥 투여용으로 개작된 약학 조성물로써 통상적인 절차에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 안의 용액이다. 필요에 따라, 상기 조성물은 가용화 물질과 주사 부위에 통증을 완화시키기 위하여 국소 마취제, 이를 테면 리그노카인을 포함한다. 일반적으로, 이들 성분은 별도로 공급되거나 또는 단위 투약형, 예를 들면, 건조 동결건조된 분말 또는 밀봉된 용기, 이를 테면 활성 물질의 양이 표시된 앰플 또는 사세(sachette)에 함께 혼합될 수 있다. 상기 조성물이 주입에 의해 투여될 때, 약학 등급의 멸균 물 또는 염수가 포함된 주입 병 안에 분배될 수 있다. 상기 조성물이 주사에 의해 투여될 때, 주사용 멸균 수 또는 염수 앰플이 제공되고, 상기 성분들은 투여 전 혼합될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 조성물은 중성 또는 염의 형태로 제형화된다. 약학적으로 수용가능한 염은 음이온으로 형성된 것들, 이를 테면 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등등, 그리고 양이온으로 형성된 것들, 이를 테면 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등등으로부터 유도된 것들을 포함한다.
치료 단백질의 비정상 발현 및/또는 활성과 연합된 질환 또는 장애의 치료, 억제 및 방지에 효과적일 수 있는 본 명세서에서 설명된 조성물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 최적의 투여량 범위를 확인하기 위하여 시험관내 분석이 임의선택적으로 이용될 수 있다. 제형 안에 이용되는 정확한 투여분량은 투여 경로, 및 상기 질환 또는 장애의 심각성에 따라 또한 달라질 수 있으며, 의사의 판단과 각 환자의 환경에 따라 결정되어야 한다. 효과적인 투여분량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유도된 투여분량-반응 곡선으로부터 외삽된다.
용도
상기에서 기술된 바와 같이, 상기 안정화된 키메라 Fabs와 안정화된 키메라 Fabs를 포함하는 항체 구조체는 하나 또는 그 이상의 부모 항체로부터 획득된다. 따라서, 이들은 부모 항체 또는 부모 항체의 조합이 사용되는 대상에서 동일한 질환, 장애 또는 감염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 대상은 포유류다. 한 구체예에서, 상기 대상은 인간이다.
또다른 구체예에서, 본원에서 기술된 상기 안정화된 키메라 Fabs와 안정화된 키메라 Fabs를 포함하는 항체 구조체는 대상에서 암, 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위하여 당분야에 공지된 다른 치료제와 조합되어 또한 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fabs와 안정화된 키메라 Fabs를 포함하는 항체 구조체는 단일클론성 또는 키메라 항체, 림포킨, 또는 조혈 성장 인자 (이를 테면, 가령, IL-2, IL-3 및 IL-7)와 조합되어 이용될 수 있는데, 예를 들어, 분자와 상호작용하고, 면역 반응을 증가시키는 작동체 세포의 수 또는 활성을 증가시키는 역할을 한다. 본원에 기술된 안정화된 키메라 Fabs와 안정화된 키메라 Fabs를 포함하는 항체 구조체는 질환, 장애, 또는 감염을 치료하는데 이용된 하나 또는 그 이상의 약물, 이를 테면, 예를 들면 항-암제, 항-염증제 또는 항-바이러스제와 조합하여 또한 이용될 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fabs는 본원에서 기술된 바와 같이 포멧을 변화시키면서 항체 준비에 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 안정화된 키메라 Fabs는 이중특이적 항체 구조체의 준비에 이용될 수 있다. 이러한 사용의 예는 실시예 14에 기재되어 있다.
여전히 또다른 구체예에서, 상기 안정화된 키메라 Fabs는 람다 항체 (즉, 면역글로블린 중쇄 및 람다 경쇄를 포함하는 부모 람다 항체), 또는 바람직한 경우 람다 Fab의 안정성을 증가시키는 방법에 이용될 수 있다. 예를 들면, 부모 람다 항체의 안정성을 증가시키기 위하여, 상기 부모 람다 항체의 V람다 서열과 C카파 서열을 포함하는 V람다-C카파 키메라 경쇄가 준비될 수 있는데, 이때 V람다 서열은 본원에 기술된 하나 또는 그 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함한다. 그 다음 V람다-C카파 키메라 경쇄는 V람다 서열을 포함하는 항체를 준비하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, V람다-C카파 키메라 경쇄는 상기 부모 람다 항체와 비교하였을 때, 열 안정성이 증가된 키메라 항체를 획득하기 위하여, 면역글로블린 중쇄와 함께 공동-발현될 수 있다. 대안적으로, V람다-C카파 키메라 경쇄는 상기 부모 람다 Fab와 비교하였을 때, 안정성이 증가된 키메라 Fab를 획득하기 위하여, VH 및 CH1 도메인들을 포함하는 면역글로블린 중쇄와 함께 공동-발현될 수 있다.
실시예
본원에서 기술된 안정화된 키메라 Fabs를 만들고, 이용하는 특정 구체예의 실시예들이 하기에 있다. 실시 예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 개시의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 사용된 수 (예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 물론 일부 실험 오차 및 편차가 허용되어야 한다.
본원에 기재된 구조체 및 방법은 달리 지시되지 않는 한, 당업자에게 통상적인 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 제조 및 수행될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 가령, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, 외., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols. A and B(1992) 참고.
실시예
실시예 1:
V람다-C카파 키메라 경쇄에서 V람다 및 C카파 계면에서 아미노산 보존 및 구조-유도된 디자인
많은 경우에, 키메라 경쇄를 함유하는 Fabs (키메라 Fabs)는 야생형 경쇄를 함유하는 Fabs와 비교하여 열 안정성의 저하를 나타내는 것으로 관찰되었다. 따라서, 구조-유도된 그리고 아미노산 보존-유도된 방법은 키메라 경쇄를 함유하는 Fabs의 열 안정성을 개선시키기 위한 용액을 작제하는데 주로 이용되며, 상기 키메라 경쇄는 가변 람다 도메인 및 불변 카파 도메인으로 구성된다. 키메라 경쇄의 유형은 본원에서 V람다-C카파 키메라 경쇄 (VL-CK 키메라 경쇄)으로 지칭되며, 그리고 이러한 유형의 키메라 경쇄를 함유하는 키메라 Fab는 본원에서 VL-CK 키메라 Fab로 지칭된다. VL-CK 키메라 Fab의 대표는 도 1에 나타낸다. 야생형 람다 Fab (CAT-2200)의 것과 비교하였을 때, 대표적인 VL-CK 키메라 경쇄의 서열은 도 2에 나타낸다.
구조-유도 분석은 주로 카파 경쇄를 함유하는 인간 또는 인간화된 Fabs 및 람다 경쇄를 함유하는 인간 또는 인간화된 Fabs의 대표적인 X-선 결정 구조, 뿐만 아니라 V람다-C카파 키메라 경쇄를 함유하는 몇몇 이용 가능한 Fabs에 대해 수행되었다. 대표적인 카파 및 람다 Fab 구조는 다음과 같이 식별되었다. 경쇄에서 가변:불변 도메인 계면의 도메인-간 접촉의 분석은 가상환경 도구를 이용한 IMGT®에 의해 진행된 단일클론 항체 데이터베이스에서 발견된 비-중복 람다 및 카파 인간/인간화된 Fab 구조 세트에서 수행되었고, 이것은 접촉 잔기 수에 대한 잔기 분석 뿐만 아니라, 관심대상 계면에서 접촉하는 잔기 수의 분석을 제공하였다. 이 분석은 카파 Fabs에서의 분포와 비교하여, 람다 Fab 경쇄에서 가변:불변 계면에서 상이한 개수의 접촉 분포가 있음을 결정하였다. 분석을 위해 항체 D3H44 및 CAT-2200의 Fabs를 각각 카파 Fab 대표와 람다 Fab 대표로 선택되었다. 이들 Fabs는 각각 카파 및 람다 Fab 구조에 대한 가변:불변 도메인 계면에서 평균 계면 접촉 수를 나타냈다. 이러한 대표적인 카파 및 람다 Fab 구조의 경쇄에서 가변:불변 계면의 시각적 분석을 수행하여 그러한 계면에서 중요한 잔기를 확인하였다. 사용 가능한 V람다-C카파 Fab 구조의 시각적 분석과 함께 키메라 경쇄의 가변 계면에서 비호환성을 식별하는데 더 사용되었다. 상기 분석은 잔기 보존 분석 및 가상 도구로 획득된 잔기 접촉 분석에 의해 도움을 받았다. 계면에서 관심 위치에서 가장 흔한 잔기(중요한 잔기)를 확인하기 위하여, 비-중복성(redundant) 인간 및 인간화된 카파 및 람다 서열의 서열 정렬(IMGT 데이터베이스)을 실행함으로써, 상기 가변:불변 도메인 경쇄 계면에 대한 잔기 보존 분석을 실행하였다.
상기 분석은 람다 경쇄와 비교하여 카파 경쇄의 가변:불변 도메인 계면에서 차이를 강조하였고, 그리고 키메라 경쇄의 V람다와 C카파 도메인들 사이의 키메라 계면에서의 차선적 호환성은 키메라 경쇄를 함유하는 Fabs의 열적 안정성의 관찰된 감소와 관련이 있다는 가설로 이어졌다. 위치 83, 85 및 105 (Kabat에 따라 번호매김되며, 표 1 및 도 3에 나타낸다)를 비롯한, V람다:C카파 계면의 몇 개 핫 스팟 잔기가 확인되었다. 실시예를 통하여, 다른 언급이 없는 한, Fab 영역에서 아미노산 위치는 Kabat 번호매김 시스템에 따라 확인된다. V람다-C카파 키메라 경쇄의 가변 도메인에서 아미노산 치환의 몇 개 세트("디자인"이라고 지칭됨)는 도 1에 나타낸 것과 같이, 가변 카파와 불변 카파 도메인들 (V카파-C카파) 사이에 관찰되는 계면을 모방함으로써 V람다-C카파 계면의 양립성을 개선시키고, 따라서 각각의 키메라 Fabs의 열 안정성을 개선시키도록 제안되었다. 이런 이유로, 키메라 Fab 변이체는 열 안정성을 개선시키기 위하여 변형되지 않은 중쇄와 VL-CK 키메라 Fab의 열 안정성을 개선시키도록 제안된 아미노산 치환을 함유하는 V람다-C카파 키메라 경쇄를 포함한다.
디자인을 평가하기 위하여 3개의 대표적인 VL-CK 키메라 Fab 테스트 시스템이 선택되었다. 이들 테스트 시스템은 다음 기준에 부합된다: a) 실질적인 테스트를 가능하게 하는 충분한 수율로 만들어질 능력, b) 상기 부모의 야생형 항체의 Fab와 비교하여 VL-CK 키메라 Fab 포멧에서 감소된 열 안정성의 발휘, c) 부모의 야생형 항체의 능력과 필적되는 친화력으로 항원에 결합하는 능력, 그리고 d) 분명한 인간 프레임워크의 범위 (구체적으로, 인간 VH 및 람다 VL 하위집단). 상기 대표 VL-CK 키메라 Fabs는 다음 항체로부터 V람다 도메인을 갖는 키메라 경쇄를 포함하였다: CAT-2200 Fab (항-IL17; hIGHV3, hIGLV6), H3 (항-HER3; hIGHV3, hIGLV2) 및 EP6b_B01 (항-Fas; hIGHV4, hIGLV1). V람다-C카파 키메라 경쇄 구조체는 위치 L106A에서 끝나는 람다 가변 도메인 서열과 위치 R108에서 시작하여 IGKC*01 (가장 흔한 인간 카파 대립유전자 서열중 하나)에 대응하는 카파 불변 도메인 서열을 포함하였다. 도 2는 이 경우 CAT-2200 Fab에 대한 키메라 경쇄 서열의 예를 제공한다. 참고로, 표 1은 Kabat에 따라 CAT-2200, H3 및 EP6b_B01의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 번호매김을 제공한다.
실시예 2: 안정성 최적화 디자인
실시예 1에 기술된 분석에 기초하여, VL-CK 키메라 Fabs의 열 안정성을 개선하기 위한 다수의 디자인이 제안되었다. 카파 가변 도메인들에서 이들 위치에 가장 보존된 아미노산 유형 (가령, 83F) 뿐만 아니라 덜 보존된 아미노산 유형 (예를 들면, 83V/83I/83A)을 도입하기 위하여, V람다 도메인에서 핫 스팟 위치83, 85 및 105와 다른 제 2 위치에서 아미노산 치환이 선택되었다. 일차 핫스팟인 위치 83의 아미노산 치환은 실시예에서 예로써 '83F 테마', '83V 테마', '83I 테마'또는 '83A 테마'와 같이 '디자인 테마'라고 정의된다. 표 3에 표시된 바와 같이, 테스트를 위해 총 39 개의 디자인이 제안되었다. 열 안정성을 개선시키기 위하여, VL-CK 키메라 경쇄에 도입된 아미노산 치환은 본원에서 "안정성 최적화 디자인", 또는 단순하게 "디자인"으로 지칭된다. 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 디자인에서 치환된 아미노산 위치는 Kabat 번호매김 시스템을 사용하여 적용 전반에 걸쳐 확인된다. 표 1은 CAT-2200, H3, 그리고 EP6b_B01 람다 경쇄의 가변 도메인의 Kabat 번호매김에 대한 참조를 제공한다.
표 3에 열거된 39개의 안정성 최적화 디자인은 다음의 실시예에서 기술된 바와 같이, VL-CK 키메라 Fabs의 안정성을 개선시키는 이들의 능력에 대하여 테스트되었다.
실시예 3:
대조군 구조체 및 안정성 최적화 디자인을 갖는 구조체 준비
상기 안정성 최적화 디자인은 Fab 포멧과 Mab 포멧에서 테스트되었는데, 이둘 모두다 본 실시예에서 부모 항체 CAT-2200, H3 및 EP6b_B01에 기초하여 단일특이적 포멧이다 (EP6b_B01 시스템은 Mab 포멧에서 테스트되지 않았다). Fab 포멧은 초기 디자인 라운드를 테스트하는 단순화된 시스템으로 사용되었다. 선별된 디자인은 온전한-크기 항체에서, Mab 포멧으로 후속적으로 테스트되었다.
Fab 포멧의 구조체는 CH1 및 VH 도메인들을 포함하는 절두된 중쇄와 부모의 람다 경쇄 (야생형 Fab 대조군), 또는 VL-CK 키메라 경쇄 (VL-CK 키메라 Fabs)를 포함하고, 이때 절두된 중쇄와 VL-CK 키메라 경쇄의 V람다 도메인은 상기 부모 항체로부터 온 것이며, 그리고 VL-CK 키메라 경쇄의 C카파 도메인은 IGKC*01에 대응하는 카파 불변 도메인 서열이다. VL-CK 키메라 경쇄에서 안정성 최적화 디자인을 갖는, Fab 포멧의 구조체는 "기획된 키메라 Fabs"(이런 유형의 구조체를 나타내는 도 1 참고)라고 지칭된다.
Mab 포멧의 구조체는 상기 부모 항체에 대응하는 두 개의 동일한 전장의 중쇄, 그리고 두 개의 동일한 부모의 람다 경쇄 (야생형 Mab 대조군) 또는 두 개의 동일한 VL-CK 키메라 경쇄를 갖고, 여기에서 각 VL-CK 키메라 경쇄의 V람다 도메인은 상기 부모 항체로부터 온 것이며, 그리고 상기 C카파 도메인은 IGKC*01에 대응하는 카파 불변 도메인 서열이다 (키메라 Mabs). VL-CK 키메라 경쇄에서 안정성 최적화 디자인을 갖는, Mab 포멧의 구조체는 "기획된 키메라 Mabs"라고 지칭된다. 도 4에서 이들 Mab 구조체의 예시적인 구조가 제시된다.
Fab 포멧의 구조체 준비
두 가지 유형의 Fab 포멧 대조군은 디자인 평가에 사용되었다. 부모 항체 CAT-2200, H3 및 EP6b_B01에 기반을 둔 "야생형" 람다 Fab 구조체는 절두된 변형안된 중쇄 (VH 및 CH1 도메인들을 갖는)와 상기 부모 항체의 야생형 람다 경쇄를 보유하였다. 키메라 Fab 구조체는 IGKC*01에 대응하는 서열을 갖는 부모의 V람다 도메인 및 C카파 도메인과 함께, 변형안된 절두된 중쇄와 VL-CK 키메라 경쇄를 포함하였다. 도 1은 야생형 람다 Fab 구조체 (WT 람다 Fab)와 키메라 Fab 구조체 (Vλ-Cκ 키메라 Fab)를 나타낸다.
절두된 중쇄, 야생형 경쇄, 그리고 CAT-2200 부모 항체의 VL-CK 키메라 경쇄는 다음과 같이 준비되었다. CAT-2200 Fab 경쇄 (2VXS 쇄 L, 서열 번호:8)와 상부(upper) IgG1 힌지 'EPKSCDKTHT' (서열 번호:30)를 포함하는 절두된 중쇄 (2VXS 쇄 H, 서열 번호:7)의 단백질 서열은 PDB 엔트리 2VXS 9로부터 얻었고, DNA로 역해독되었고, 포유류 발현을 위하여 코돈 최적화되었고, 그리고 유전자 합성되었다 (차례로 서열 번호: 23 및 22). 도 2에 나타낸 바와 같이, V람다-C카파 키메라 경쇄는 위치 L106A에서 종료되는 CAT-2200 V람다 도메인 서열, 그리고 C카파 서열의위치 R108에서 IGKC*01에 대응하는 C카파 도메인 서열을 포함하였다. CAT-2200 V람다-C카파 키메라 경쇄의 단백질 서열은 서열 번호: 9에 제시되며, DNA 서열은 서열 번호: 24에 제시된다.
절두된 중쇄, 야생형 경쇄, 그리고 H3 부모 항체의 VL-CK 키메라 경쇄는 다음과 같이 준비되었다. H3 항체 VL 도메인의 단백질 서열은 U.S. 특허 번호. 8329873의 서열 번호: 4, 잔기 156-267로부터 획득되었으며, 이 항체의 VH 도메인의 단백질 서열은 동일한 부모의 서열 번호:4, 잔기 23-140로부터 획득되었다. VH 도메인 서열은 IGHG1*01 (서열 번호:31)의 CH1 도메인 서열에 덧붙여져, Fab (서열 번호:1)에 대한 상부 IgG1 힌지 'EPKSCDKTHT'(서열 번호:30)을 포함하는, 절두된 중쇄에 대한 단백질 서열을 획득하였다. VL 도메인 서열은IGLC2의 람다 CL 서열에 덧붙여져 H3 항체의 "야생형" 경쇄에 대한 단백질 서열을 획득하였다 (서열 번호:2). 이들 서열은 DNA로 역해독되고, 포유류 발현을 위하여 코돈 최적화되었고, 그리고 유전자 합성되었다 (경쇄의 경우 서열 번호:17, 그리고 절두된 중쇄의 경우 서열 번호:16). H3 V람다-C카파 키메라 경쇄의 단백질 서열은 상기 CAT-2200 항체의 경우에 설명된 것과 같이 획득되었으며, 그리고 생성된 아미노산 서열은 서열 번호:3에 제시된다. H3 VL-CK 키메라 경쇄를 인코딩하는 DNA 서열은 서열 번호: 18에 제시된다.
절두된 중쇄, 야생형 경쇄, 그리고 EP6b_B01 부모 항체의 VL-CK 키메라 경쇄는 다음과 같이 준비되었다. EP6b_B01 Fab 경쇄 (3THM 쇄 L, 서열 번호:5) 그리고 상부 IgG1 힌지 'EPKSCDKTHT' (서열 번호:30)을 포함하는중쇄 (3THM 쇄 H, 상기 C-말단 10xHis-태그 서열, 서열 번호:4을 배제)의 단백질 서열은 PDB 엔트리 3THM로부터 얻었고, DNA로 역해독되었고, 포유류 발현을 위하여 코돈 최적화되었고, 그리고 유전자 합성되었다 (차례로 서열 번호: 20 및 19). EP6b_B01 V람다-C카파 키메라 경쇄의 단백질 서열은 상기 CAT-2200 항체의 경우에 설명된 것과 같이 획득되었으며, 서열 번호:6에 제시된다. EP6b_B01 VL-CK 키메라 경쇄를 인코딩하는 DNA 서열은 서열 번호: 21에 제시된다.
상기에서 명시된 항체 중쇄, 경쇄, 그리고 VL-CK 키메라 경쇄의 폴리펩티드 및 DNA 서열은 표 2에서 제공된다.
기획된 키메라 Fabs의 안정성 최적화 디자인에 대응하는 경쇄 아미노산 치환은 VL-CK 키메라 경쇄 DNA 서열에서, 주로 부위-지향된 돌연변이생성에 의해 만들어졌다 (Braman J, Papworth C & Greener A., Methods Mol. Biol. (1996) 57:31-44).
5'-EcoRI 절단 부위 - HLA-A 신호 펩티드 - 야생형 경쇄 또는 VL-CK 키메라 경쇄 서열 - 'TGA 또는 TAA 중지' - BamH1 절단부위-3'로 구성된 경쇄 벡터 삽입물을 pTT5 벡터 (Durocher Y 외., Nucl. Acids Res. 2002; 30, No.2 e9)에 결찰시켜, 경쇄 발현 벡터를 만들었다. 생성된 경쇄 발현 벡터를 시퀀싱하여, 코딩 DNA의 정확한 판독 프레임 및 서열을 확인하였다. 유사하게, 5'-EcoR1 제한 부위 - HLA-A 신호 펩티드 - 중쇄 서열 (T238에서 종료됨 (Kabat 번호매김) - TGA 또는 TAA 중지' - BamH1 절단부위-3'로 구성된 중쇄 벡터 삽입물을 pTT5 벡터에 결찰시켜, 중쇄 발현 벡터를 만들었다. 생성된 중쇄 발현 벡터를 시퀀싱하여, 코딩 DNA의 정확한 판독 프레임 및 서열을 확인하였다.
Mab 포멧의 구조체 준비
Fab 포멧의 경우, 두 개의 유사한 유형의 Mab 포멧 대조군이 디자인 평가에 사용되었다. 부모 항체 CAT-2200, H3 및 EP6b_B01에 기초한 "야생형" 람다 Mab 구조체는 전장의 변형안된 중쇄와 이 부모 항체의 경쇄를 포함하였다. 키메라 Mab 구조체는 변형안된 중쇄 및 키메라 경쇄를 포함하였다.
야생형 경쇄와 각 Mab 대조군 구조체의 VL-CK 키메라 경쇄에 대한 단백질 서열은 Fab 포멧의 구조체에서 기술된 바와 같이 획득되었다. PDB 엔트리 2VXS로부터 'Fab 포멧의 구조체 준비' 단락에서 기술된 바와 같은 짧은 중쇄에 대응하는 CAT-2200 항체의 전장 중쇄 서열을 획득하고, 이어서, 하부(lower) IgG1 힌지 ('CPPCP', 서열 번호:32), CH2 및 CH3 도메인들 (표 2에서 서열 번호. 15)에 덧붙였다. 이 서열은 DNA로 역해독되고, 포유류 발현을 위하여 코돈 최적화되었고, 그리고 유전자 합성되었다 유사한 방식으로, H3 항체의 전장 중쇄의 단백질 서열은 H3 중쇄 서열에 기초한다.
상기에서 기술된 바와 같이 생성된 안정성 최적화 디자인에 대응하는 경쇄 아미노산 치환을 갖는, Mab 구조체를 만들기 위하여 경쇄 및 키메라 경쇄 벡터는 Fab 구조체와 유사한 방법으로 준비되었다. 5'-EcoR1 제한 부위 - HLA-A 신호 펩티드 - CH3의 G446 (EU 번호매김)에서 종료되는 중쇄 클론 - TGA 또는 TAA 중지' - BamH1 절단부위-3'로 구성된 중쇄 벡터 삽입물을 pTT5 벡터에 결찰시켜, 중쇄 발현 벡터를 만들었다. 상기에서 기술된 바와 같이, 생성된 중쇄 발현 벡터를 시퀀싱하여, 코딩 DNA의 정확한 판독 프레임 및 서열을 확인하였다.
실시예 4: 기획된 키메라 Fabs와 기획된 키메라 Mabs의 발현 및 정제
대조군 Fab 및 Mab 구조체, 뿐만 아니라 기획된 키메라 Fab 및 기획된 키메라 Mab 구조체의 중쇄 및 경쇄는 CHO-3E7 세포의 50 또는 200 ml 배양물에서 발현되었다. 1.7 - 2 x 106 세포/ml의 밀도에서 CHO-3E7 세포는 37℃에서 4 mM 글루타민 (Hiclone cat# SH30034.01) 및 0.1% KoliphorP188 (Sigma #K4894)이 보충된 FreeStyleTM F17 배지 (Gibco cat# A-1383501)에서 배양되었다. 총 50 또는 200 ㎍ DNA (가령, 200㎍의 경우, 100㎍의 Fab/Mab DNA와 100㎍의 GFP/AKT/스투퍼(stuffer) DNA)는 1:2.5 비율의 DNA:PEI에서 PEI-pro(Polyplus cat# 115-375), 또는 1:4 비율의 DNA:PEI에서 PEI-max (Polyscience cat: 24765)를 이용하여 50 또는 200 ml의 총 용적으로 형질감염되었다. DNA-PEI 혼합물을 추가한 후 24시간 시점에, 0.5mM 발프로산 (최종 농도) 및 1% w/v 트립토판 (최종 농도)이 이 세포 (+ Hi-clone cat# SV30079의 항생제 1X)에 추가되고, 그 다음 32℃로 옮겨진 후, 수거될 때까지 7일 동안 배양되었다.
Fab 구조체 정제
대조군 및 기획된 키메라 Fab 구조체는 배취(batch) 또는 혼합형 배취:컬럼 크로마토그래피에 의해 IgG-CH1 CaptureSelect™(Life Technologies™, Catalog No.: 194-320-005)를 이용한 친화력 포획에 의해 맑은(Clarified) 상청액(세포 수거 후)으로부터 정제되었다. 상청액을 평형 완충액 (칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드 없는, Dulbecco의 인산염 완충된 염수 (DPBS)(HyClone™# SH30028.02))에서 20-25 % 투명 상청액으로 희석되거나, 또는 일부 경우에서 4℃에서 IgG-CH1 CaptureSelect™(평형 완충액으로 이미 평형을 이룬)으로 16 시간 동안 혼합시키면서 직접적으로 배양되었다. 결합 단백질을 함유하는 수지를 Econo 컬럼 (Bio-Rad)에 부어 넣거나, 또는 원심 분리로 수집하여 96 개의 웰-프릿(fritted) 플레이트로 옮겼다. 이 두 방법에는 모두 평형 완충액으로 세척하는 단계, 이어서 100 mM 글리신 HCl pH 2.6-2.7로 실행되는 용리단계, 그리고 10% (v/v) 1M Tris pH 9.0를 이용하여 용리된 샘플을 pH 6.0-7.0로 중화시키는 단계가 포함되어 있다. 단백질 정량화는 A280 nm (NanoDrop)에 의해 실행되었다.
기획된 키메라 Fabs 및/또는 대조군이 IgG-CH1 CaptureSelect™에 대하여 준최적 결합 프로파일을 나타내는 경우, 이들 Fabs는 다음과 같이 카파-선별 수지를 이용하여 맑은 상청액으로부터 정제되었다. 단백질은 배취 모드에서 KappaSelect 수지(GE Healthcare)를 이용하여, 또는 단백질 메이커 기구 (Protein BioSolutions)를 이용하여 패킹된(packed) 1 mL HiTrap 컬럼을 이용하여 정제되었다. DPBS에서 수지를 평형화하고, 맑은 상청액을 3 분/mL의 체류 시간으로 사전-패킹된 1mL HiTrap 컬럼에 적용하거나, 또는 배취 정제를 위해 4℃에서 밤새 교반하면서 맑은 상청액에 수지를 첨가하였다. 수지에 단백질 결합시킨 후, 평형 완충액으로 세척 단계를 수행 한 후, 100 mM 글리신 HCl pH 2.6-2.7을 사용하여 용리 단계를 수행하였다. 용리된 샘플을 10 % (v/v) 1M Tris 염기 pH 9를 사용하여 pH 6-7로 즉시 pH 조정하였다. 단백질 정량화는 A280 nm (NanoDrop)에 의해 실행되었다.
Mab 구조체 정제
맑은 상청액 샘플은 DPBS에서 평형화된 1 mL HiTrap mAb Select SuRe 컬럼 (GE Healthcare)에 적용시키거나, 또는 2-8℃에서 하룻밤 동안 mAb Select SuRe 수지 슬러리 (DPBS 완충액으로 미리 평형화됨) (배취 모드)와 함께 배양되었다. 이어서 배취 혼합물을 크로마토그래피 컬럼으로 옮기고, 관통액(flow-through)을 수집하였다. 컬럼을 DPBS로 세척하고, 단백질을 100 mM 시트르산 나트륨 완충액 pH 3.0으로 용리시켰다. 최종 pH 6-7을 수득하기 위해, 10 % (v/v)의 1M Tris pH 8로 용리하였다. 단백질은 A280 nm (Nanodrop)에 기초하여 정량화되었다.
정제 후, Fab 및 Mab 구조체 모두의 발현은 Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer #760499)를 이용하여 비-환원 고출력(High Throughput) Protein Express 분석에 의해 평가되었다. 절차는 다음과 같은 변형과 함께, HT Protein Express LabChip 사용 설명서 버전 2 LabChip GXII 사용 설명서에 따라 수행되었다. 2 μl 또는 5 μl (농도 범위 5-2000 ng/μl)의 Fab/Mab 샘플은 7 μl의 HT Protein Express 샘플 완충액 (Perkin Elmer # 760328)과 함께, 96 웰 플레이트(BioRad # HSP9601)의 별개 웰에 추가하였다. 그 다음 Fab/Mab/bsAb 샘플은 70℃에서 15 분 동안 변성되었다. LabChip 기구는 HT Protein Express Chip (Perkin Elmer #760499)과 Ab-200 분석 세팅을 이용하여 작동되었다.
단백질 발현에서 안정성 최적화 디자인의 효과
도 5는 대조군용 Fab 및 Mab 구조체의 역가와 부모 CAT-2200 항체에 기초하여 선별된 기획된 키메라 Fabs 또는 기획된 키메라 Mabs의 역가를 비교하였다. 키메라 Fab 및 기획된 키메라 Fabs의 발현은 야생형 람다 Fab의 발현과 비교하였을 때 다소 낮았다. 기획된 키메라 Mabs의 발현은 야생형 람다 Mab 및 키메라 Mab와 비교하였을 때 다소 낮았다. 키메라 포멧에서 안정성 최적화된 돌연변이 포함은 단백질 발현에서 유의적인 영향을 가지지 못하였다 (야생형 람다 Fab의 것과 비교하여 기획된 키메라 Fabs의 발현, 그리고 야생형 람다 Mab의 것과 비교하여 기획된 키메라 Mab의 발현 비교).
실시예 3에서 기술된 바와 같이, 일부 기획된 키메라 Fabs는 IgG-CH1 CaptureSelect 방식으로 준최적 정제 효과를 나타내었지만, 그러나, 이들 동일한 기획된 키메라 Fabs가 KappaSelect에 정제되었거나 또는 유사한 기획된 키메라 Mabs가 단백질-A에 의해 정제될 때, 이들은 다른 기획된 키메라 Fabs/기획된 키메라 Mabs와 유사하게 거동하였다. 이들 기획된 키메라 Fabs/기획된 키메라 Mabs의 일부는 83A 또는 83V 테마에 속하였다. 다음에 의해 어떤 식으로든 제한되지 않고, IgG-CH1CaptureSelect 수지에 결합에 있어서 관찰된 가변성은 예를 들면 이들 기획된 키메라 Fab 구조체의 구조 온전성의 손상으로 인간 결과라기 보다는 경쇄:중쇄 계면 또는 가변:불변 계면에서 가변적 형태학적 역학(가령, 예를 들면, 83A 테마 대(vs.) 83F 테마의 경우 더 작은 아미노산 치환 결과이며, 이들의 정제 효과는 야생형의 것에 필적한다)으로 인한 것일 수 있다. 이러한 가설은 이러한 기획된 키메라 Fabs/기획된 키메라 Mabs와 2 개의 다른 대안적인 정제 방법에 의해 각각 정제된 (상기 기술된) 나머지 기획된 키메라 Fabs/기획된 키메라 Mabs에 대한 필적가능한 정제 효율에 의해 뒷받침된다.
실시예 5: 생물물리적 특징에 대하여 기획된 키메라 Fabs와 기획된 키메라 Mabs의 예비 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)
실시예 4에서 기술된 바와 같이, 기획된 키메라 Fabs, 기획된 키메라 Mabs와 대조군은 이들의 생물물리적 특징을 평가하기에 앞서, 임의의 불순물을 제거하기 위하여 예비 SEC를 거쳤다. 예비 SEC는 다음과 같이 수행되었다. 샘플내 항체 종(species)은 컬럼으로 샘플을 주입하는데 이용되는 ALIAS Bio Cool 오토샘플러 (Spark-Holland)가 구비된 GE Healthcare Avant 25 시스템 상에 탐재된 Superdex 200 10/300 또는 Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare) 컬럼을 이용하여 분리되었다. PBS pH 7.4 (Hyclone DPBS/변형된, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, Cat. No. SH-300028.02)에서 Fab 또는 Mab 포멧 (0.9 ml) 샘플은 PBS가 충전된 2ml 루프에 자동적으로 로딩되었다. 이어서, 샘플을 컬럼에 자동 주입하고, 1 CV 용리 부피로 0.5ml/분으로 분석하였다(초기 정제 배취의 일부에서, 샘플 로딩은 1 ml 샘플 루프를 이용하여 수동으로 수행되었다). 단백질 용리는 OD280에서 모니터되고, 0.5 ml 분액으로 수집되었다. 각 샘플에 대해, 주요 피크를 포함하는 분액 (분액은 캘리퍼스로 측정하였다)을 모으고, 실시예 7-11에 기재된 바와 같이 상기 생물물리적으로 더 특징화되었다.
실시예 6:
기획된 키메라 Fabs와 기획된 키메라 Mabs의 질 평가를 위한 고성능 액체 크로마토그래피 크기 배제 크로마토그래피 (UPLC-SEC)
실시예 4에서 기술된 초기 친화력 크로마토그래피 단계(IgG-CH1CaptureSelect 또는 KappaSelect)에 의해 정제된 기획된 키메라 Fab 샘플, 뿐만 아니라 실시예 5에서 기술된 바와 같이 예비 SEC에 의해 정제된 기획된 키메라 Mab 샘플은 기획된 키메라 Fabs의 경우 초기 정제 후, 또는 기획된 키메라 Mabs의 경우 벤치탑 안정성 연구 과정 동안 (실시예 13 참고) 샘플의 단분산을 평가하기 위하여 UPLC-SEC를 거쳤다.
UPLC-SEC는 PDA 검출기가 있는 Waters Acquity UPLC H-Class Bio 시스템 상에 탑재되고, 30℃로 설정된 Waters Acquity BEH200 SEC 컬럼 (2.5 mL, 4.6 x 150 mm, 스테인레스 강, 1.7 μm 입자)를 이용하여 실행되었다. 실행 시간은 0.4 ml/분에서 0.02 % Tween 20 pH 7.4의 DPBS 또는 DPBS의 러닝 완충액으로 7 분간, 2.8 mL의 주사당 총 부피로 구성되었다. 210 내지 500 nm 범위의 UV 흡광도에 의해 용리를 모니터링하고, 280 nm에서 크로마토그램을 추출 하였다. Empower 3 소프트웨어를 사용하여 피크 통합을 수행했다.
IgG-CH1CaptureSelect에 의해 정제된 기획된 키메라 Fab 샘플의 UPLC-SEC 분석에는 종 동질성이 반영되었다. KappaSelect에 의해 정제된 기획된 키메라 Fabs의 UPLC-SEC 프로파일은 경쇄 함유하는 다양한 종과 관련이 있을 가능성이 있는 불순물을 반영하였으며, 그 대부분의 불순물은 이후 예비 SEC에 의해 제거되었다.
실시예 7: 기획된 키메라 Fabs의 열 안정성에서 디자인의 효과
상기 안정성 최적화 디자인의 효과를 결정하기 위하여, 기획된 키메라 Fabs와 대조군의 열 안정성은 차등적 스캐닝 형광 (DSF) 및/또는 시차주사열량분석 (DSC) 방법에 의해 평가되었고, 각각의 키메라 Fab의 열 안정성과 비교되었다. 기획된 키메라 Fabs와 대조군은 실시예 5에 기술된 바와 같이 정제되었다.
DSC에 의한 열 안정성 측정
기획된 키메라 Fabs와 대조군의 열 안정성은 다음과 같이 DSC를 이용하여 측정되었다. VP-Capillary DSC (GE Healthcare)와 함께, DSC 분석을 위하여, PBS에서 농도 0.4 mg/mL에서 주로 정제된 400 μL의 샘플 (기획된 키메라 Fabs의 더 작은 하위집단의 농도는 0.175 mg/mL이다)이 이용되었다. 각 DSC 시행 시작 시, 5회 완충액 블랭크 주입을 실행하여 기선을 안정화시키고, 참고용으로 각 샘플 주입 전, 완충액 주입이 배치되었다. 각 샘플은 낮은 피드백, 8 초 필터, 3 분 또는 5 분 사전-스캔 온도 조절기 및 70psi 질소 압력으로, 20에서 100℃까지 60℃/hr 속도에서 스캔되었다. 열 안정성을 나타내는 지표로서 용융 온도 (Tm)를 결정하기 위해, Origin 7 소프트웨어를 사용하여 생성된 온도기록을 참조하고, 분석하였다.
DSF에 의한 열 안정성 측정
기획된 키메라 Fabs와 대조군의 열 안정성은 다음과 같이 DSF를 이용하여 측정되었다. 각 정제된 기획된 키메라 Fab는 DPBS (Dulbecco 인산염 완충된 염수, HyClone Cat # SH30028.02)에서 0.67 mg/mL로 희석되었다. DPBS에서 1:1000 희석에 의해 Sypro Orange 겔 스테인 (Life Technologies Cat # S-6650)의 작업 원액(stock)을 제조하였다. 15 μL의 0.67 mg/mL 단백질 (10 μg)을 15 μL의 Sypro Orange 겔 스테인 작업 원액에 첨가하여 DSF 샘플을 제조 하였다. 그러나, 0.67 mg/mL 미만의 농도를 갖는 단백질의 경우, 각 DSF 샘플은 15 μL의 0.27 mg/ml (4 μg) 단백질 또는 희석안된 단백질을 15 μL의 Sypro Orange 염료의 작업 원액에 추가하여 만들었다. 그 다음 DSF 분석은 Rotor-Gene 6000 qPCR 기구 (QiaGen Inc)를 이용하여 30 μl 방울에서 시행되었다. 각 단계 사이의 10 초 평형과 시작 시 30 초의 대기 시간으로 1 ℃ 간격을 사용하여 30 ℃ ~ 94 ℃에서 각 샘플을 스캔했다. 7-10 사이에서 수동으로 조정한 게인(gain)과 함께, 470 nm의 여기 필터와 610 nm의 방출 필터를 사용하여 샘플이 포화되지 않고 검출기의 동적 범위 내에 있도록 하였다. 변성 곡선의 1 차 함수로부터의 최대 값을 Tm (용융 온도)으로 사용하여 Rotor-Gene 6000 소프트웨어로 데이터를 분석하였다.
결과
대조군의 열 안정성
실시예 1에서 명시된 바와 같이, 안정성 최적화 디자인을 시험하기 위한 대표적인 Fabs를 선택하기 위한 기준 중 하나는 VL-CK 키메라 Fab가 부모 항체의 야생형 람다 Fab에 비해 열 안정성의 감소를 나타내는 것이었다. 표 4는 야생형 람다 Fab 및 VL-CK 키메라 Fabs (표 4에서 "WT" 및 "키메라"로 식별됨)에 대해 수득된 Tm 값을 나타낸다. 컬럼 8-13은 DSC로 측정한 이러한 대조군의 Tm을 보여주고, 한편 컬럼 2-7은 DSF로 측정한 이러한 대조군의 Tm을 보여준다. 모든 경우에, VL-CK 키메라 Fabs는 Tm의 감소를 나타내었고, 감소량은 부모 항체에 따라 가변적이었다. 야생형 CAT-2200 람다 Fab 구조체의 평균 Tm은 78.8℃ 인 것으로 결정되었고, CAT-2200 키메라 Fab의 경우 73.1℃ 인 것으로 결정되었다. 야생형 H3 람다 Fab 구조체의 평균 Tm은 80.9℃이며, 키메라 Fab의 것은 76.0℃로 결정되었다. 야생형 람다 EP6b_B01 Fab 구조체의 평균 Tm은 85.4℃이며, 키메라 Fab는 80.5℃로 결정되었다. 이들 데이터에서 DSF에 의해 측정될 때, 야생형 람다 Fab의 V람다-C카파 키메라 Fab로의 전환으로 4.9 내지 5.7 ℃ 범위의 열 안정성 손실을 동반함을 입증한 반면, DSC에 의해 측정된 Tm에서의 감소는 3.7내지 4.6℃였고, 이것은 다른 시스템에서도 유사한 경향임을 시사한다.
기획된 키메라 Fabs의 열 안정성
실시예 1에서 기술된 디자인 전략에 기초하여, 초기 8개 디자인 세트(표 3에 열거된 바와 같이 디자인 1-8)는 단일 시스템 CAT-2200에서 DSC에 의해 테스트되었다. 이 결과에 기초하여, 제 2 세트 디자인 (표 3에서 디자인 9-39)은 VL-CK 키메라 Fabs의 열 안정성을 증가시키는 데 가장 중요한 아미노산 치환을 확인하기 위해, DSF에 의해 상기 CAT-2200 및 H3 시스템에서 테스트되었다. 비록 DSF는 용융 온도를 측정하는 다소 덜 정확한 방법으로 알려져 있으나, 열 안정성을 측정하는 고 처리량 방법이기 때문에 여기에서 사용되었으며, 대조군과 비교하여 안정성에 대한 상대 효과를 평가하는 데 적합하다.
디자인 1-8을 갖는 기획된 키메라 Fabs에 대한 DSC 결과는 표 4(컬럼 8-13)에 보고되어 있다. 3 개 시스템의 열 안정성 데이터는 컬럼 8 (CAT-2200), 컬럼 10 (H3) 및 컬럼 12 (EP6b_B01)에 보고 되어 있다. 각각의 V람다-C카파 키메라 시스템의 Tm 값에 대한 기획된 키메라 Fab Tm 값의 비교는 컬럼 9 (CAT-2200), 컬럼 11 (H3) 및 컬럼 13 (EP6b_B01)에 보고되어 있다. 반복이 수행된 기획된 키메라 Fabs의 경우, 보고된 Tm 값은 평균 값이다.
기획된 키메라 Fabs에 대한 DSF 결과는 표 4 (컬럼 2-7)에 보고되어 있다. 3 가지 상이한 시험 시스템에 대한 열 안정성 데이터는 컬럼 2 (CAT-2200), 컬럼 4 (H3) 및 컬럼 6 (EP6b_B01)에 보고되어 있다. 반복이 수행된 기획된 키메라 Fabs의 경우, 보고된 Tm 값은 평균 값이다. 각각의 V람다-C카파 키메라 시스템의 Tm 값에 대한 기획된 키메라 Fab Tm 값의 비교는 컬럼 3 (CAT-2200), 컬럼 5 (H3) 및 컬럼 7 (EP6b_B01)에 보고되어 있다.
표 4의 데이터는 선택된 디자인 전략으로 야생형 안정성이 회복되었을 뿐만 아니라, DSF에 의해 측정될 때 최대 7.6 ℃ (H3 시스템의 디자인 39)를 능가함을 보여준다. 두 개의 시스템, CAT-2200 및 H3에 기초한 데이터는 잔기 83X (여기에서 X=F/V/I/A, 여기에서 이들 아미노산 잔기는 카파 경쇄에서 가장 보존된 아미노산 유형이며, F는 가장 보존된 것이다)에 단일 아미노산 치환과 같은 소수의 도입으로 대응하는 키메라 Fab의 것과 비교하였을 때 열 안정성의 상당한 개선을 유도할 수 있고, 1.8-7.4℃ 사이의 안정성 증가를 나타낸다 (도 6a, 도 6b 및 표 4: 디자인 14, 23, 30 및 35 참고). 위치 83의 아미노산이 V, I 또는 A로 치환된 디자인은 야생형 람다 Fab의 것을 능가하는 Tm을 갖는다. 따라서, E83X는 치환을 위한 핵심 위치로 결정되었다. 이 위치에서 아미노산 L로의 치환은 키메라 Fab 포멧의 CAT-2200 시스템에서 실험적으로 테스트되었고 (데이터는 제공되지 않음) 그리고 치환체(예를 들면: 83L_105E_106AK와 같은 치환을 함유하는 변이체, 그리고 85T와 106I을 포함하는 기타 조합)은 본 명세서에서 데이터가 제공되는 소수성 아미노산 치환과 같은 열 안정성 개선 측면에서 유사한 거동을 보여 주었다.
83X_85T 디자인을 획득하기 위하여 위치 85에서 추가 아미노산 치환을 도입하면, 열 안정성이 더욱 증가되며, 그 정도는 시스템-의존적인 것으로 보인다 (도 6a, 도 6b, 그리고 표 4: 디자인 17, 26, 32 및 37). 더욱이, 상기 디자인을 83X_85T/V_105E 또는 83X_85T_105E_106I로 확장시키면, Tm이 더욱 개선되었으며, 그 정도는 테스트된 시스템에 따라 달랐다 (도 6a, 도 6b, 그리고 표 4). 테스트된 디자인과 관련하여, 카파 경쇄에서 가장 보존된 아미노산 유형, 즉 T 및 V로 위치 85에서 아미노산 치환은 Tm의 동일한 개선에 기여하였다.
실시예 8: Fab 포멧에서 안정성 최적화 디자인의 효과 이동성
안정성 최적화 디자인의 이동성을 추가 평가하기 위하여, 디자인 유형 83X_85T, 83X_85T_105E_106I 하위집단, (여기에서 X=V/I/A) 그리고 83F_85T_105E는 세 번째 Fab 시스템, EP6b_B01에서 DSF에 의한 테스트를 위하여 선택되었다. 이 7개 디자인 세트의 열 안정성 측정은 3개 시스템, CAT-2200, H3 및 EP6b_B01 모두에서 DSC(두 개 방법중 좀더 정확한 방법으로써) 에 의해 또한 실행되었다.
이들 디자인은 다음을 기초한 테스트를 위하여 선택되었다: a) 이 디자인은 최적의 성능을 여전히 나타내면서도 최소 수의 아미노산 치환을 가졌다: 83X_85T; 또는 b) 돌연변이의 수에 관계없이 이 디자인이 가장 잘 수행되었다 (즉, 최대 Tm 이득이 입증됨): 83X_85T_105E_106I. 83F 테마가 다른 83X 테마보다 덜 효과적이기 때문에, 2 개의 CAT-2200 및 H3 시스템 데이터에 기초하여, 최대 Tm 이득에 대한 최소 세트의 돌연변이를 나타내는 83F_85T_105E 디자인 만이 선택되었다. 따라서, 선택된 디자인은 표 3에 열거된 바와 같이 디자인 18, 26, 29, 32, 34, 37 및 39을 포함하였다.
DSF와 DSC 측정은 실시예 7에서 기술된 바와 같이 실행되었다.
표 4 및 도 7에서의 데이터에서는 테스트된 디자인이 세 번째 시스템, EP6b_B01의 VL-CK 키메라 Fab로의 이동을 입증하였다. 다른 2개 시스템에서 관찰된 것과 유사한 디자인의 Tm 경향이 관찰되었다. 앞서 언급 한 바와 같이, 출발 키메라와 비교하여 Tm 변화 정도의 시스템-의존적 변화가 또한 여기에서 관찰되었다. DSC에 의해 결정된 Tm 값은 일반적으로 DSF에 의해 관찰된 것보다 낮고 (실시예 7에 기술됨), 따라서 DSC 또는 DSF로 측정할 때 동일한 설계에 대해 Tm 값에 차이가 있다 (표 4에 나타냄). 그러나, 디자인 간 및 시스템 간 상대적 경향이 유지된다.
실시예 9: Mab 포멧에서 안정성 최적화 디자인의 효과 이동성
실시 예 7 및 8에서, 선택된 안정성 최적화 디자인의 이동성은 Fab 포멧에서 입증되었다. Mab 포맷으로의 이동성을 테스트하기 위해, 실시예 8에 기술된 7 개의 디자인 세트에 대한 열 안정성 측정은 CAT-2200 및 H3의 두 시스템에서 DSC로 수행하였다.
테스트된 Mabs를 실시예 5에 기재된 바와 같이 예비-SEC에 의해 정제되었다. DSC는 실시예 7에서 기술된 바와 같이 실행되었다. 실시예 7과 8에서와 같이, 기획된 키메라 Mabs의 Tm 값은 키메라 Mab 대조군 (키메라)과 야생형 람다 Mab (WT) 각각의 의 것과 비교되었다. 기획된 키메라 Mabs에 대한 DSC 결과는 표 5에 보고 되며, 2 개의 테스트된 시스템에 대한 Tm 값은 컬럼 2 (CAT-2200) 및 컬럼 4 (H3)에 보고 된다. 각각의 키메라 Mab의 Tm에 대한 Tm의 변화는 컬럼 3 (CAT-2200) 및 컬럼 5 (H3)에 보고 된다.
7 개의 선택된 디자인 모두 표 5에 나타낸 바와 같이, 각각의 키메라 Mab와 비교하여 기획된 키메라 Mabs의 Tm을 증가시킬 수 있었다. 도 8은 테스트된 두 시스템에서 기획된 키메라 Fabs 및 Mabs에 대해 얻은 Tm 값을 비교한 것이다. Fab 및 Mab 포멧의 테스트된 디자인의 경우 매우 유사한 Tm 값까지의 디자인 간 동일한 경향이 관찰되었다. 기획된 키메라 Fabs (단일 전이) 및 기획된 키메라 Mabs (단일 눈에 띄는 Fab 전이 및 CH2 또는/및 CH3 전이는 Fab 전이에 의해 마스킹되지 않은 경우에 관찰됨)에 대해 얻어진 전형적인 DSC 온도기록은 도 9에 제공된다. 이들 온도기록은 예상되는 전이를 보여주었다.
실시예 7, 8 및 9에서 보여준 결과는 시스템 및 항체 포멧에 걸쳐 안정성 최적화 디자인의 이동성을 입증하였다.
실시예 10: 기획된 키메라 Fabs와 기획된 키메라 Mabs의 항원-결합 친화력 측정
안정성 최적화 디자인의 아미노산 치환이 항원-결합 친화력에 임의의 영향을 끼지는 지를 결정하기 위하여, 기획된 키메라 Fabs (디자인 14 내지 39을 가진 E83X 테마의 기획된 키메라 Fabs)와 기획된 키메라 Mabs (실시예 8과 9에서 테스트된 동일한 7개의 기획된 키메라 Mabs인 디자인 18, 26, 29, 32, 34, 37, 그리고 39을 가지고 있음)가 적절한 항원에 결합하는 능력이 테스트되었다. 상기 기획된 키메라 Fabs 및 Mabs는 실시예 5에 기술된 바와 같이 정제되었다. 항원-결합 친화력은 기획된 키메라 Fabs의 경우 CAT-2200, H3, 그리고 EP6b_B01 시스템에서 그리고 기획된 키메라 Mabs의 경우 CAT-2200 및 H3 시스템에서 다음과 같이 SPR에 의해 결정되었다.
SPR 바이오센서 분석
Biacore T200에서의 연구: CM5 시리즈 S 센서 칩, Biacore 아민 커플링 키트 (NHS, EDC 및 1 M 에탄올아민), 그리고 10 mM 아세테이트 나트륨 완충액은 GE Healthcare Life Science (Mississauga, ON, Canada)로부터 구입하였다. Biorad ProteOn상에의 연구: GLC 센서칩, Biorad ProteOn 아민 커플링 키트 (EDC, sNHS와 에탄올아민), 그리고 10mM 아세테이트 나트륨 완충액은 Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)로부터 구입하였다. 0.05% Tween20 (PBST)과 함께 PBS 러닝 완충액은 Teknova Inc. (Hollister, CA)로부터 구입하였다. 염소 다중클론 항-인간 Fc 항체는 Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (West Grove, PA)로부터 구입하였다. 항원: 재조합 인간 HER3은 ACRObiosystems (Newark,DE)에서 구입하였고, 재조합 인간 sFas 수용체 는 Pepro Tech Inc. (Rocky Hill, NJ)에서 구입하였고, 재조합 인간 IL-17A는 R&D Systems (Mineapolis, MN)로부터 구입하였다.
항원 HER3 (Fabs) 및 Fas와 함께 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석은 25℃의 온도에서 PBS-T (PBS + 0.05% (v/v) Tween 20) 러닝 완충액 (3.4 mM 최종 농도로 추가된 0.5 M EDTA 원액) 과 함께 Biacore T200 기구 (GE Healthcare)을 이용하여 실행되었다. IL-17 및 HER3 (Mabs) 항원과 함께, 표면 플라스몬 공명 분석은 25℃의 온도에서 PBST 러닝 완충액과 함께 BioRad ProteOn XPR36 기구 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON))을 이용하여 실행되었다.
H3: Fabs에서 HER3 친화력 측정
Fabs에서 HER3 친화력 측정은 다음과 같이 실행되었다. HER3 항원에의 결합에 대한 Fabs의 스크리닝 (정제된 예비 SEC)는 2 단계로 실행된다: 항-His 항체 상에서 HER3의 간접 포획, 이어서 단일 사이클 역학을 이용한 역학 분석용으로 5개의 Fabs를 주입. 상기 항-His 항체 포획 표면은 제작자의 지침에 따라 활성 및 기준 유동 세포 상에 대략 10000 RUs의 항-His 항체 (GE Healthcare)를 아민 커플링시킴으로써 CM5 시리즈 S 센서 칩 상에 준비되었다. HER3은 10 μL/분의 유속으로 60s 동안 활성 유동 세포에 걸쳐 4-8 μg/mL로 주입되었다. 일반적으로, 이로써 상기 항-His 항체 표면 상에 대략 100-200 RUs의 HER3이 포획되었다. HER3은 기준(블랭크) 유동 세포 상에서는 포획되지 않았다. 상기 포획 단계는 5개 농도의 Fabs (200 nM 및 2-배 희석)가 90s 동안 50 μL/분에서 활성 및 기준 유동 세포 모두에 걸쳐 후속적으로 주입되며, 300s의 해리 단계를 가진다. 상기 포획된 HER3 표면은 다음 주입 주기를 위한 표면을 준비하기 위하여 120s 동안 30 μL/분으로 10 mM 글리신 pH 1.5에 의해 재생되었다. 각 피분석물 주입을 위하여 최소한 두 개의 모의(mock)-완충액 주입이 실행되었고, 기준으로 이용되었다. 생성된 단일 주시 역학 센서그램은 Biacore T200 BiaEvaluation 소프트웨어 버젼 3.0을 이용하여 분석되었고, 1:1 결합 모델에 티핑되었다.
H3: Mabs에서 HER3 친화력 측정
Mabs에서 HER3 친화력 측정은 다음과 같이 실행되었다. HER3 항원에의 결합에 대한 Mabs의 스크리닝은 2 단계로 실행된다: 항-인간 Fc-특정 다중클론 항체 표면 상에 Mabs의 간접 포획, 이어서 5개 농도의 HER3 주입. 상기 항-인간 Fc 표면은 GLC 센서칩 상에 아민 커플링에 의해 준비되었다. GLC 센서칩 표면은 피분석물 방향(수평)에서 140s 동안 100 μL/분으로 주입된 표준 BioRad sNHS/EDC 용액의 1:10 희석물에 의해 활성화되었다. 활성화 직후, 25 μg/mL 용액의 항-인간 Fc/10 mM NaOAc pH 4.5는 대략 3000 공명 단위(RUs)가 고정될 때까지,240s 동안 25 μL/분의 유속으로 리간드 방향(수직)으로 주입되었다. 나머지 활성 그룹은 또한 피분석물 방향으로 140s 동안 100 μL/분으로 1M 에탄올 아민의 주입에 의해 켄칭되었다. 분석용 Mabs는 항-Fc 표면 상에 240s 동안 25 μL/분의 유속으로 리간드 방향(수직)에서 20 μg/mL 용액을 주입함으로써 간접적으로 포획되었다. HER3은 피분석물 방향(수평)으로 후속적으로 주입되었다. 우선, 기선을 안정화시키기 위하여, 30s 동안 피분석물 방향(수평)으로 100 μL/분으로 두 개의 완충액 주입이 이용되었다. 그 다음 180 nM에서 시작하여 5개 농도의 H3 Mab의 3-배 희석물과 블랭크 완충액 대조군은 120s 동안 25 μL/분으로 후속적으로 주입되고, 10분의 해리 단계를 가지면, 완충액 기준과 함께 결합 센서그램 세트를 얻었다. 다음 주입 주기를 준비하기 위하여 항-인간 Fc 표면은 100 μL/분으로 18s 동안 0.85 % 인산의 두 펄스에 의해 재생되었다. 다음 주입 주기를 준비하였다. 완충액 블랭크 주입 및 인터 스팟을 사용하여 센서그램을 정렬하고 이중-참조하였고(double-referenced), 생성된 센서그램을 ProteOn Manager 소프트웨어 v3.1을 사용하여 분석하였다. 이중-참조된 센서그램은 Langmuir 결합 모델로 피팅하였다.
EP6b_B01:Fas 친화력 측정
Fas 친화력 측정은 다음과 같이 실행되었다. Fas를 10 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5에 희석시키고, 아민 커플링을 통해 CM5 시리즈 S 센서 칩에 직접 고정시켰다. 그 결과 대략 100 RUs 의 고정 Fas가 생성되었다. 기준 유동 세포는 비워두고 (에탄올 아민 차단됨) 블랭크 대조군으로서 사용하였다. 단일 주기 역학을 사용한 동역학적 분석을 위해 에탄올아민-차단된 기준 표면 및 Fas 표면 둘 모두에 Fab를 주입하였다. 구체적으로, 5개 농도 (5 nM 및 2-배 희석물)의 정제된 Fabs (정제된 예비 SEC)는 600s 동안 30 μL/분에서 활성 및 기준 유동 세포 모두에 걸쳐 후속적으로 주입되며, 3600s의 해리 단계를 가진다. Fas 표면은 다음 주입 주기를 위한 표면을 준비하기 위하여 120s 동안 30 μL/분으로 10 mM 글리신 pH 1.5의 2 주기를 이용하여 재생되었다. 각 피분석물 주입을 위하여 기준으로 이용하기 위한 최소한 두 개의 모의(mock)-완충액 주입이 실행되었다. 생성된 단일 주시 역학 센서그램은 Biacore T200 BiaEvaluation 소프트웨어 버젼 3.0을 이용하여 분석되었고, 1:1 결합 모델에 티핑되었다.
CAT-2200:IL-17 친화력 측정
IL-17 친화력 측정은 다음과 같이 실행되었다. IL-17A 표면은 리간드 방향(수직)에서 140s 동안 100 μL/분으로 주입된 표준 BioRad sNHS/EDC 용액의 1:10 희석물에 의해 활성화된 GLC 센서칩을 이용하여 생성되었다. 활성화 직후, 1 내지 4 μg/mL 용액의 IL-17A/10 mM NaOAc pH 4.5는 대략 75-200공명 단위(RUs)가 고정될 때까지, 25 또는 100 μL/분의 유속으로 리간드 방향(수직)으로 주입되었다. 나머지 활성 그룹은 또한 리간드 방향으로 140s 동안 100 μL/분으로 1M 에탄올 아민의 주입에 의해 켄칭되었다. IL-17A에 결합하기 위한 Fabs/Mabs의 스크리닝은 피분석물 방향 (수평)으로 정제된 CAT-2200 Fabs/Mab의 주입에 의해 수행되었다. 우선, 기선을 안정화시키기 위하여, 30s 동안 피분석물 방향(수평)으로 100 μL/분으로 두 개의 완충액 주입이 이용되었다. 그 다음 5개 농도(60nM, 20nM, 6.7nM, 2.2nM, 0.74nM)의 CAT-2200 Fab/Mab의 3-배 희석물과 블랭크 완충액 대조군은 120s 동안 50 μL/분으로 후속적으로 주입되고, 10 또는 15분의 해리 단계를 가지면, 완충액 기준과 함께 결합 센서그램 세트를 얻었다. SPR 표면 상에 CAT-2200:IL-17A 복합체는 해리되었고, IL-17A 표면은 다음 주입 주기를 준비하기 위하여, 100 μL/분으로 18s 동안 0.85 % 인산의 두 펄스에 의해 재생되었다. 완충액 블랭크 주입 및 인터 스팟을 사용하여 센서그램을 정렬하고 이중-참조하였고, 생성된 센서 그램을 ProteOn Manager 소프트웨어 v3.1을 사용하여 분석하였다. 이중-참조된 센서그램은 Langmuir 결합 모델로 피팅하였다.
결과
반복 실행된 기획된 키메라 Fabs/Mabs의 경우, 보고된 KD 값은 평균 값이다.
기획된 키메라 Fabs의 항원-결합 친화력은 각각의 야생형 람다 Fab 및 키메라 Fab를 참고하여 평가되었다. 기획된 키메라 Fabs에 대한 SPR 결과는 표 6에 보고되며, 여기에서 3개의 테스트된 시스템에 대한 측정된 KD 값은 컬럼 2, (CAT-2200), 컬럼 3 (H3) 그리고 컬럼 4 (EP6b_B01)에 보고된다. 테스트된 모든 시스템에서, 키메라 Fab 대조군 (키메라)의 항원-결합 친화력은 야생형 람다 Fab 대조군 (WT)과 매우 유사하였다. 표 6의 데이터에서 상기 CAT-2200 부모 항체에 기반을 둔 기획된 키메라 Fabs의 항원-결합 친화력은 야생형 람다 Fab 및 키메라 Fab의 약 2-배 안에 있다. H3 부모 항체에 기반을 둔 기획된 키메라 Fabs의 항원-결합 친화력 또한 야생형 람다 Fab 및 키메라 Fab의 약 2-배 안에 있다. EP6b_B01 시스템에서 테스트된 키메라 Fabs의 수는 더 적었지만, 동일한 경향이 관찰되었다.
기획된 키메라 Mabs의 항원-결합 친화력은 각각의 야생형 람다 Mab 및 키메라 Mab를 참고하여 평가되었다. 기획된 키메라 Mabs에 대한 SPR 결과는 표 7에 보고되며, 여기에서 2개의 테스트된 시스템에 대한 KD 값은 컬럼 2, (CAT-2200), 그리고 컬럼 3 (H3)에 보고된다. 테스트된 두 시스템 모두에서, 야생형 람다 Mab 대조군 (WT) 및 상응하는 키메라 Mab 대조군의 항원-결합 친화력은 서로 1.5 배 내에 있었다. 기획된 키메라 Mabs는 상기 대조군과 매우 유사한 KD로 항원에 결합할 수 있었다.
표 6 및 7에서 볼 수 있는 것과 같이, 안정성 최적화 디자인에 대응하는 아미노산 치환을 보유한 기획된 키메라 Mabs 또는 Fabs는 각각 야생형 람다 Fabs 및 Mabs의 것에 필적되는 KD 값으로 항원에 결합할 수 있었다.
실시예 11: FcγR 결합에서 안정성 최적화 디자인의 효과
작동체 기능, 이를 테면 ADCC 및 ADCP를 중재하기 위하여, 형 IgG1 항체는 Fc 감마 R 수용체들 (FcγR)에 결합할 수 있다. 상기 안정성 최적화 디자인의 아미노산 치환이 기획된 키메라 Mabs의 FcγR에 결합하는 능력에 있어서 임의의 영향을 갖는 지를 결정하기 위하여, FcγR에 대하여 선택된 기획된 키메라 Mabs (디자인 29, 37 및 39을 보유한)의 친화력을 측정하였다. 기획된 키메라 Mabs의 4개의 상이한 유형의 FcγR 수용체들, CD16aV, CD32bF, CD32aR, 그리고 CD32aH에 대한 결합 친화력이 평가되었다. 상기 기획된 키메라 Mabs는 실시예 5에 기술된 바와 같이 정제되었다. 결합 친화력은 다음과 같이 SPR에 의해 결정되었다.
표면 플라스몬 공명 분석은 25C의 온도에서 PBST 러닝 완충액과 함께, BioRad ProteOn XPR36 기구 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON))을 이용하여 실행되었다. GLC 센서칩, Biorad ProteOn 아민 커플링 키트 (EDC, sNHS와 에탄올아민), 그리고 10mM 아세테이트 나트륨 완충액은 Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)로부터 구입하였다. 0.05% Tween20 (PBST)과 함께 PBS 러닝 완충액은 Teknova Inc. (Hollister, CA)로부터 구입하였다. 염소 다중클론 항-인간 Fc 항체는 Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (West Grove, PA)로부터 구입하였다. 항원: 인간 재조합 FcRn은 자체 생산하였다. 인간 재조합 FcγR 수용체들: CD16aV, CD32bF, CD32aR, 그리고 CD32aH는 상기 C-말단에 His10-태그를 보유한 구조체로 발현되었고, Ni-친화력 크로마토그래피에 이어서 His-태그 제거 및 SEC 정제에 의해 정제되었다.
Mab: FcγR 친화력 측정
FcγR 친화력 측정은 다음과 같이 실행되었다. 다양한 FcγR 수용체들에 결합에 대한 Mabs의 스크리닝은 2 단계로 실행된다: 항-인간 Fc-특정 다중클론 항체 표면 상에 Mab 샘플의 간접 포획, 5개 농도의 각 FcγR 수용체들의 주입. 상기 항-인간 Fc 표면은 GLC 센서칩 상에 아민 커플링에 의해 준비되었다. GLC 센서칩 표면은 피분석물 방향(수평)에서 140s 동안 100 μL/분으로 주입된 표준 BioRad sNHS/EDC 용액의 1:10 희석물에 의해 활성화되었다. 활성화 직후, 25 μg/mL 용액의 항-인간 Fc/10 mM NaOAc pH 4.5는 대략 4500 또는 2500 공명 단위(RUs)가 고정될 때까지, 240s 동안 25 μL/분의 유속으로 피분석물 방향으로 주입되었다. 나머지 활성 그룹은 또한 피분석물 방향으로 300s동안 30 μL/분으로 1M 에탄올 아민의 주입에 의해 켄칭되었다. 분석용 Mabs는 항-인간 Fc 표면 상에 240s 동안 25 μL/분의 유속으로 리간드 방향(수직)에서 10 μg/ml 용액을 주입함으로써 간접적으로 포획되었다. 각 상기 FcγR 수용체들은 피분석물 방향(수평)으로 후속적으로 주입되었다. 우선, 기선을 안정화시키기 위하여, 30s 동안 피분석물 방향(수평)으로 100 μL/분으로 두 개의 완충액 주입이 이용되었다. 그 다음 10 μM에서 시작하여 5개 농도의 4개 FcγR 수용체들의 3-배 희석물과 블랭크 완충액 대조군은 120s 동안 50 μL/분으로 후속적으로 주입되고, 3분의 해리 단계를 가지면, 완충액 기준과 함께 결합 센서그램 세트를 얻었다. 다음 주입 주기를 준비하기 위하여 항-인간 Fc 표면은 100 μL/분으로 18s 동안 0.85 % 인산의 두 펄스에 의해 재생되었다. 완충액 블랭크 주입 및 인터 스팟을 사용하여 센서그램을 정렬하고 이중-참조하였고, 생성된 센서 그램을 ProteOn Manager 소프트웨어 v3.1을 사용하여 분석하였다. 이중-참조된 센서 그램은 Langmuir 결합 모델에 피팅되거나 또는 정상 상태 KD 측정을 위해 평형 결합 모델에 피팅되었다.
결과
표 8에서는 두 개의 시스템 (CAT-2200 및 H3)에서 기획된 키메라 Mabs에 대한 SPR 결과를 보여준다. 상기 CD16aV 수용체에 결합에 대한 측정된 KD 값은 컬럼 2에, CD32bF의 경우 컬럼 3에, CD32aR의 경우 컬럼 4에, CD32aH의 경우 컬럼 5에 보고된다. 반복 실행된 테스트된 기획된 키메라 Mabs의 경우, 보고된 KD 값은 평균 값이다.. 표 8에서 볼 수 있는 것과 같이, 기획된 키메라 Mabs에 대하여 측정된 KD 값은 테스트된 FcγR 수용체들에 대한 각각의 야생형 람다 Mab 대조군 (WT)의 것들에 필적하였다.
실시예 12: FcRn 결합에서 안정성 최적화 디자인의 효과
야생형 IgG1 항체는 FcRn 수용체들 (신생 수용체들)에 결합할 수 있고, 이로 인하여 이들의 긴 반감기가 생성된다. 상기 안정성 최적화 디자인의 아미노산 치환이 기획된 키메라 Mabs의 FcRn에 결합하는 능력에 있어서 임의의 영향을 갖는 지를 결정하기 위하여, FcRn에 대하여 선택된 기획된 키메라 Mabs (디자인 29, 37 및 39를 보유) 세트의 친화력을 측정하였다. 기획된 키메라 Mabs는 실시예 5에 기술된 바와 같이 정제되었고, 결합 친화력은 다음과 같이 SPR에 의해 결정되었다.
Mab:FcRn 친화력 측정
FcRn 친화력 측정은 다음과 같이 실행되었다. FcRn 표면은 리간드 방향(수직)에서 140s 동안 100 μL/분으로 주입된 표준 BioRad sNHS/EDC 용액의 1:10 희석물에 의해 활성화된 GLC 센서칩을 이용하여 생성되었다. 활성화 직후, 10 μg/mL 용액의 FcRn/10 mM NaOAc pH 4.5는 대략 2000 공명 단위(RUs)가 고정될 때까지, 120s 동안 25 μL/분의 유속으로 리간드 방향(수직)으로 주입되었다. 나머지 활성 그룹은 또한 리간드 방향으로 140s동안 30 μL/분으로 1M 에탄올아민의 주입에 의해 켄칭되었다. 상기 FcRn 표면에서 이용된 러닝 완충액은 PBST pH 5.8이었다. FcRn에 결합하기 위한 Mabs의 스크리닝은 피분석물 방향 (수평)으로 정제된 Mabs의 주입에 의해 수행되었다. 우선, 기선을 안정화시키기 위하여, 30s 동안 피분석물 방향(수평)으로 100 μL/분으로 두 개의 완충액 주입이 이용되었다. 100 nM에서 시작하여 5개 농도의 Mab의 3-배 희석물과 블랭크 완충액 대조군은 120s 동안 50 μL/분으로 후속적으로 주입되고, 10분의 해리 단계를 가지면, 완충액 기준과 함께 결합 센서그램 세트를 얻었다. SPR 표면 상에 Mab:FcRn 복합체는 해리되었고, FcRn 표면은 다음 주입 주기를 준비하기 위하여, 100 μL/분으로 18s 동안 PBST pH 7.4의 두 펄스에 의해 재생되었다. 완충액 블랭크 주입 및 인터 스팟을 사용하여 센서그램을 정렬하고 이중-참조하였고, 생성된 센서 그램을 ProteOn Manager 소프트웨어 v3.1을 사용하여 분석하였다. 이중-참조된 센서그램은 Langmuir 결합 모델로 피팅하였다.
표 8에서는 두 개의 시스템 (CAT-2200 및 H3)에서 기획된 키메라 Mabs에 대한 SPR 결과를 보여준다. FcRn에 대한 결합을 위한 측정된 KD 값은 컬럼 6에 보고된다. 반복 실행된 테스트된 기획된 키메라 Mabs의 경우, 보고된 KD 값은 평균 값이다. 표 8에서 볼 수 있는 것과 같이, FcRn에 대한 테스트된 기획된 키메라 Mabs, CAT-2200 및 H3의 결합 친화력은 모두 각각의 야생형 람다 Mab 대조군 (WT)의 1.5 내지 2-배 안에 있다.
실시예 13: 선별된 기획된 키메라 Mabs의 벤치탑 안정성에서 안정성 최적화 디자인의 효과
안정성 최적화 디자인 29, 37 및 39를 보유한 기획된 키메라 Mabs에 대하여 시간에 걸쳐 기획된 키메라 Mabs의 안정성을 하기에서 기술된 바와 같이 측정하였다. 기획된 키메라 Mabs는 상기 CAT-2200 및 H3 부모 항체에 기초하여 테스트되었다.
기획된 키메라 Mabs는 PBS pH7.4에서 5 mg/ml로 농축시키고, 30일 동안 37℃에서 배양되었다. 0, 6, 10, 20 및 30 일 시점에 샘플을 취하였다. 각 샘플은 원심분리하고, 상청액은 UPLC-SEC 및 Caliper 분석에 의해 평가되었다. 샘플을 0, 6, 10, 20 및 30일 시점에서 UPLC-SEC 및 Caliper 분석을 실행하였고, 뿐만 아니라 A280 nm (NanoDrop)에서 단백질 정량화하여 이 샘플의 단분산에서 임의의 변화를 평가하였다. UPLC-SEC는 실시예 6에서 기술된 바와 같이 실행되었다.
도 10은 37℃에서 배양에서 이들 기획된 키메라 Mabs, 예로써 H3 야생형 람다 Mab 및 디자인 37에 대응하는 아미노산 치환을 갖는 H3 기획된 키메라 Mab에 대하여 0, 20 및 30일차에 관찰된 전형적인 UPLC-SEC 프로파일을 나타낸다. H3 시스템에서 야생형 람다 Mab 대조군 및 디자인 37에 대해 차례로, 0일차에 패널 A와 B 대비 UPLC-SEC 프로파일, 20일차에 패널 C와 D, 그리고 30일차에 패널 E와 F. 관찰된 UPLC-SEC 프로파일은 배양 기간 동안 Mab 분자의 단분산의 임의의 변화가 없음을 입증하였다. 단백질 농도의 측정은 임의의 잠재적 응집에 대한 단백질 손실이 반영되지 않았다 (데이터 제공되지 않음).
실시예 14: 기획된 키메라 이중특이적 항체에서 중쇄와 경쇄 사이의 선호적 페어링의 평가
키메라 경쇄는 이중특이적 항체의 준비, 구체적으로 하나 또는 두 부모 항체가 모두 람다 경쇄를 갖는 경우에 유용할 수 있다. 본 실시예는 이중특이적 항체를 준비하기 위하여 안정성 최적화 디자인의 이용을 설명하는데, 여기에서 상기 이중특이적 항체중 하나의 부모 항체가 람다 경쇄를 갖는다.
이용된 안정성 최적화 디자인은 표 3에서 기술된, 디자인 29 및 39에 대응하는 것들이다. 두 개의 이중특이적 항체 시스템이 테스트되었다. 첫번째 것은 CAT-2200/D3H44 이중특이적 항체이며, 여기에서 상기 CAT-2200 부모 항체는 람다 경쇄를 갖고, D3H44 항체는 카파 경쇄를 갖는다. 두번째 시스템은 H3/페르투주마브 이중특이적 항체이며, 여기에서 상기 H3 항체는 람다 경쇄를 갖고, 페르투주마브 항체는 카파 경쇄를 갖는다. CAT-2200 및 H3은 인간 항체이며, 페르투주마브 및 D3H44는 인간화된 항체이다. 이들 시스템에서, CAT-2200 및 H3 항체의 경쇄는 실시예 3에서 기술된 바와 같이 VL-CK 키메라 경쇄로 작제되었다.
상기 이중특이적 항체는 상기 부모 항체의 Fab 영역 (경쇄 페어링 디자인)에서 페어링을 구동시키기 위하여 아미노산 치환을 이용하여 준비되었다. 이러한 아미노산 치환은 당분야에 공지되어 있고, 국제 특허 공개 번호. WO 2014/082179 및 WO 2015/181805를 비롯한 다수의 공개에 기술되어 있다. 하기 표 A에서 나타낸 바와 같이, 두 개의 이러한 디자인이 본 실시예에서 테스트되었다:
아미노산 치환은 상기 중쇄 (중쇄 페어링 디자인)의 이형이량체화를 촉진시키기 위하여 중쇄의 CH3 도메인 안으로 또한 도입되었다. 이들 아미노산 치환은 국제 특허 공개 번호. WO 2012/058768 및 WO2013/063702를 비롯한 당업계에 또한 기술되어 있다. 하기 표 B에서 나타낸 바와 같이, 하나의 예시적인 디자인이 본 실시예에서 테스트되었다:
각 이중특이적 항체의 4개 폴리펩티드 쇄는 공동-발현되었고, 바람직한 이중특이적 항체의 양은 하기에서 기술된 SMCA 분석에서 측정되었다
분석 포멧 (SMCA)
이 분석은 두 개의 부모 항체의 4개 쇄 (부모 항체 1, H1 및 L1의 각 중쇄와 경쇄, 부모 항체 2, H2 및 L2의 각 중쇄와 경쇄)를 공동-발현시키고, 질량분석(LC-MS)을 이용하여 정확하게 형성된 이중특이적 항체가 존재하는 지를 탐지하는 것에 기반을 둔다. 도 11은 4개의 출발 폴리펩티드 쇄의 도식 및 상기 이형이량체 쌍의 (Fab 및 Fc 영역 모두에서) 중쇄와 경쇄 사이에 선호적 페어링 없이, 이들 출발 폴리펩티드 쇄의 공동-발현으로 인하여 생성된 산물을 제공한다. 두 개의 독특한 전장의 중쇄 구조체는 두 개의 독특한 경쇄 구조체와 함께 공동-발현되어, 10개의 가능한 항체 종이 생성된다(또한 Ab 종으로 지칭됨): H1L1_H1L1, H1L2_H1L2, H1L1_H1L2, H2L1_H2L1, H2L2_H2L2, H2L1_H2L2, H1L1_H2L1, H1L2_H2L2, H1L2_H2L1 및 H1L1_H2L2. H1L1_H2L2 종은 상기 정확하게 쌍을 이룬 이중특이적 항체다 (도 11, 종 A). 4가지 유형의 하프-항체 (하프-Ab) 종이 또한 도 11에 나타낸 것과 같이 가능하다. 독특한 중쇄의 이형이량체화를 촉진시키기 위하여 Fc 영역 안으로 변형이 도입될 때, 잠재적 항체 종의 수는 감소된다 (즉, 종 E 내지 J이 덜 관찰된다). 다른 종에 비하여 정확하게 쌍을 이룬 이중특이적 항체 종 H1L1_H2L2의 양에 있어서 상대적 페어링 특이성이 단백질 A (pA) 정제 및 탈당화 후, LC-MS를 이용하여 측정되었다. 가능한 경우, 모든 항체 종 및 하프-Ab 종이 서로 최소한 50 Da 이상 상이하다면, 쇄는 태그가 없는 상태로 남았다. 질량 차이가 이러한 가능성을 배제할 때, 종간에 충분한 질량 차등을 제공하기 위해 N-말단 FLAG 태그를 경쇄에 첨가하였다.
폴리펩티드 서열
CAT-2200, H3 중쇄 그리고 VL-CK 키메라 경쇄의 단백질 서열은 실시예 3에서 기술된 바와 같이 획득하였다.
D3H44 경쇄 (서열 번호:13) 및 중쇄 (서열 번호:12)의 단백질 서열은 PDB 엔트리 1JPT에 있는 것들에 대응하였고, DNA로 역해독되었으며, 포유류 발현을 위하여 코돈 최적화되었고, 그리고 유전자 합성되었다 (차례로 서열 번호:28 및 27). 페르투주마브 경쇄 (GenBank 기탁 번호. HC359025.1, 서열 번호:11) 및 중쇄 (GenBank 기탁 번호. HC359024.1, 서열 번호:10)의 단백질 서열은 DNA로 역해독되었으며, 포유류 발현을 위하여 코돈 최적화되었고, 그리고 유전자 합성되었다(차례로 서열 번호: 26 및 25). 이들 항체 중쇄 및 경쇄의 폴리펩티드 및 DNA 서열은 표 2에 나타낸다.
다음 세트의 이중특이적 키메라 항체 대조군 구조체를 준비하여 각 이중특이적 시스템에 내재된 경쇄 페어링의 양을 평가하였다.
A. 대조군 H3/페르투주마브 키메라 이중특이적 항체를 인코딩하는 구조체 세트가 준비되었다(표 9에서 이중특이적 항체 (1)에 대응):
· 쇄 A 또는 B에 대한 중쇄 페어링 디자인을 포함하는 전장의 H3 중쇄 (H1)를 인코딩하는 구조체, 그리고 H3 VL-CK 키메라 경쇄 (L1)를 인코딩하는 구조체.
· H1에 대한 보체 쇄의 중쇄 페어링 디자인과 전장의 페르투주마브 중쇄 (H2)를 갖는 구조체, 그리고 페르투주마브 카파 경쇄 (L2)를 인코딩하는 구조체.
B. 대조군 CAT-2200/D3H44 키메라 이중특이적 항체를 인코딩하는 구조체 세트가 준비되었다 (표 9에서 이중특이적 항체 (2) 및 (3)에 대응):
· 쇄 A 또는 B에 대한 중쇄 페어링 디자인을 포함하는 전장의 CAT-2200 중쇄 (H1)를 인코딩하는 구조체, 그리고 CAT-2200 VL-CK 키메라 경쇄 (L1)를 인코딩하는 구조체.
· H1에 대한 보체 쇄의 중쇄 페어링 디자인과 전장의 D3H44 중쇄 (H2)를 갖는 구조체, 그리고 D3H44 카파 경쇄 (L2)를 인코딩하는 구조체.
다음 추가 구조체는 상기에서 기술된 이중특이적 키메라 항체 대조군에 기초하여 준비되었다:
a. 안정성 최적화 디자인 대조군 - 이들 구조체는 상기 이중특이적 키메라 항체 대조군에 유사하지만, 그러나 안정성 최적화 디자인을 포함한다. 이들 대조군은 표 9의 이중특이적 항체 (4) 내지 (7)에 대응한다.
b. 기획된 이중특이적 키메라 항체 - 이들 구조체은 상기 이중특이적 키메라 항체 대조군에 유사하나, 그러나 안정성 최적화 디자인 및 경쇄 페어링 디자인을 포함한다. 이들 구조체는 표 9의 이중특이적 항체 (8) 내지 (15)에 대응한다.
도 12는 대표적인 이중특이적 키메라 항체 구조를 제공하는데, 기획된 이중특이적 키메라 항체에 포함된 상이한 유형의 변형을 보여준다.
디자인에 따른 아미노산 변형을 포함하는, CAT-2200 및 H3 V람다-C카파 키메라 경쇄, D3H44 그리고 페르투주마브 카파 경쇄와 각각의 IgG 중쇄는 다음과 같이 준비되었다. 경쇄의 이형이량체화를 촉진시키기 위한 안정성 최적화 디자인 및/또는 카파-카파 경쇄 페어링 디자인에 따른 아미노산 변형을 갖는, CAT-2200, H3, D3H44 및 페르투주마브 경쇄 서열은 실시예 3에서 기술된 바와 같이 준비되었다. 상기 중쇄의 이형이량체화를 촉진시키기 위한 아미노산 변형을 갖는 이들 항체의 전장의 중쇄 서열은 실시예 3에서 기술된 바와 같이 준비되었다. 중요한 것은, C-말단 리신 클리핑으로 인한, LC-MS 신호 이질성을 방지하기 위하여 표준이 되는 C-말단 중쇄 리신 잔기가 제거되었다 (Lawrence W. Dick Jr. 외., Biotechnol. Bioeng. (2008) 100:1132-43). 일부 경우에서, 모든 항체와 하프-Ab 종 간의 50Da 차이를 얻기 위하여 상기 경쇄에 FLAG 태그가 추가되었고, 이 경우 상기 경쇄 벡터 삽입물은 5'-EcoRI 절단부위 - HLA-A 신호 펩티드 - FLAG 태그 - 경쇄 Ig 클론 - 'TGA 또는 TAA 중지' - BamH1 절단 부위-3'로 구성된다.
이러한 디자인은 도입된 경쇄 페어링 디자인에 의해 발휘되는 선호적 페어링에 임의의 효과를 갖는지를 평가하기 위하여, 오직 안정성 최적화 디자인을 갖는 키메라 이중특이적 항체만 준비하였다.
이중특이적 키메라 항체 구조체의 형질감염, 발현 및 정제
각 이중특이적 항체 시스템의 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 인코딩하는 구조체, 이때 경쇄 세트는 V람다-C카파 키메라 경쇄 및 카파 경쇄, 또는 안정성 최적화 디자인을 갖는 V람다-C카파 키메라 경쇄와 도입된 카파-카파 디자인을 갖는, 또는 없는 카파 경쇄는 실시예 4에서 이미 기술된 바와 같이 CHO-3E7 세포 안으로 형질감염되었고, 여기에서 50 ml의 총 용적이 15:15:35:35 비율의 H1:H2:L1:L2에서 총 50 μg DNA로 형질감염되었다.
배양물 배지는 원심분리로 수확되고, Stericup 0.22 μm 필터 (Millipore Cat # SCGPU05RE)를 이용하여 진공 여과되었다. 여과된 배양물 배지는 그 다음 PBS pH 7.4로 사전 평형된 단백질 A MabSelect SuRe 수지 (GE Healthcare #17-5438-02)를 이용하여 정제되었다. 이 수지에 결합된 항체 종들은 그 다음 PBS pH 7.4로 세척되고, 100 mM 시트르산 나트륨 완충액 pH 3.6으로 용리되었다. 용리된 항체 종은 농축되었고, Amicon 울트라 15 원심분리 필터 Ultracel 10K (Millipore # UFC901024)를 이용한 원심분리에 의해 PBS pH 7.4에서 완충액 교환되었다. 발현된 일부 이중특이적 항체 샘플은 Mab 구조체 정제 (배취 방식)에 대하여 실시예 3에서 기술된 과정에 따라 대안적으로 정제되었다. 이 항체 종을 함유하는 생성된 단백질 A-정제된 SMCA 샘플은 탈당화 및 LC-MS 전, Caliper에 의해 평가되었다.
질량 분광분석법 방법
이중특이적 항체 내용에서 카파-카파 디자인에 의해 구동된 이형이량체의 선호적 페어링 정도는 단백질 A 정제 및 비-변성 탈당화 후, 질량 분광분석법에 의해 평가되었다. 상기 이중특이적 항체는 Fc N-연계된 글리칸만을 포함하기 때문에, SMCA 샘플은 오직 하나의 효소, N-글리코시다제 F (PNGase-F)로만 처리되었다. 상기 정제된 샘플은 다음과 같이 PNGaseF로 탈-당화되었다: 0.2U PNGaseF/μg의 항체는 50mM Tris-HCl pH 7.0에서, 37℃에서 단백질의 최종 농도가 0.5 mg/mL 되도록 하룻밤 동안 배양. 탈당화후, 이 샘플은 LC-MS 분석 전, 4℃에 보관되었다.
탈당화된 단백질 샘플은 Ion Max 전기분무 소스 (ThermoFisher)를 통하여 LTQ-Orbitrap XL 질량 분석계 (ThermoFisher Scientific)에 결합된 Agilent 1100 HPLC 시스템을 이용하여 고유 LC-MS에 의해 분석되었다. 샘플 (5 μg)을 2.1 x 30 mm Poros R2 역상 컬럼 (Applied Biosystems)에 주입시키고, 다음의 구배 조건을 이용하여 해리시켰다: 0-3 분: 20% 용매 B; 3-6 분: 20-90% 용매 B; 6-7 분: 90-20% 용매 B; 7-9 분: 20% 용매 B. 용매 A는 0.1% 포름산 aq.으로 탈기되었고, 용매 B는 아세토나이트릴로 탈기되었다. 유속은 3 mL/분이었다. 유동은 컬럼-후 분할하여, 전기분무 계면으로 100μL/mL를 유도하였다. 이 컬럼은 82.5℃로 가열하였고, 용매는 단백질 피크 모양을 개선시키기 위하여 용매를 예비-컬럼을 80℃로 가열하였다. 분석에 앞서, LTQ-Orbitrap XL는 ThermoFisher Scientific's LTQ Positive Ion ESI 교정 용액(카페인, MRFA와 Ultramark 1621)을 이용하여 교정하였고, 10 mg/mL 용액 CsI을 이용하여 조정하였다. 콘(cone) 전압 (소스 단편화 설정)은 대략 48 V이었고, FT 해상도는 7,500이며, 스캔 범위는 m/z 400-4,000이었다. LTQ-Orbitrap XL은 더 큰(>50 kDa) 단백질의 최적 탐지를 위해 조정되었다. LC-MS 시스템은 탈당화된 IgG 표준 (Waters IgG 표준) 및 탈당화된 mAb 표준 혼합물 (25:75 하프:전장 사이즈 mAb)을 사용하여 IgG 샘플 분석에 대해 평가되었다.
전장-크기 항체 및 하프-항체로부터 다중 하전된 이온을 함유하는 범위(전형적으로 각각 m/z 2000-3800 및 m/z 1400-2000)는 MaxEnt 1 모듈의 MassLynx, 기구 대조군 및 데이터 분석 소프트웨어 (Waters)를 이용하여 별도의 분자량 프로파일로 풀어되었다(deconvoluted). 간략하게 설명하자면, 비가공 단백질 LC-MS 데이터는 우선QualBrowser, Xcalibur의 스펙트럼 뷰잉 모듈 (Thermo Scientific)에서 개방되었고, Waters에서 제공되는 파일 전환 프로그램인 Databridge를 이용한 MassLynx에 필적되도록 전환되었다. 전환된 단백질 스펙트럼을 MassLynx의 Spectrum 모듈에서 확인하고, MaxEnt 1을 사용하여 풀어내었다. 각 샘플에서 각각의 항체 종의 겉보기 양은 생성된 분자량 프로파일에서의 피크 높이로부터 결정되었다.
결과
전반적으로, 대부분의 경우, 탈당화 처리로 LC-MS에 의해 확인된 가능한 상이한 항체 종을 모두 식별하는 능력이 초래되었다. 많은 경우에, 각 항체 종은 단일 LC-MS 피크로 표시되었다. 예외적으로 원하는 이중 특이성 종에 해당하는 측면 피크 (리더 펩티드의 절단에서 부가물 또는 이질성일 수 있음)를 포함하지만; 그러나, 측면 피크를 초래하는 종의 동일성이 명확하지 않았기 때문에, 이 측면 피크는 이중특이적 종에 대한 기여에서 고려되지 않았다. 바람직한 이중특이적 종 H1L1_H2L2는 LC-MS에 기초하여 일반적으로 잘못 짝 지어진 유형 H1L2_H2L1과 실험적으로 구별될 수 없을 것이다. 따라서, 이중특이적 항체 함량이 표에 보고 될 때, 이러한 유형의 잘못 짝 지어진 종을 포함하지 않는 것을 완전히 배제 할 수는 없다. 그러나, 종, 이를 테면 H1L2_H1L2 및 H2L1_H2L1, 뿐만 아니라 H1L2와 H2L1 하프 항체에서 관찰된 매우 낮은 함령은 만약 존재한다면, 잘못 짝 지어진 종으로 이중특이적 종의 오염이 단지 미미하게 발생되었음을 나타낸다.
LC-MS 분석 결과는 표 9에서 보고된다. 컬럼 8에서, 존재하는 모든 항체 종의 백분율로서 정확하게 쌍을 이룬 이중특이적 항체의 양 (H1L1_H2L2 및 H1L2_H2L1)의 계산 (도 11은 4개 쇄: H1, L1 H2, L2의 공동-발현시 모든 가능한 종, 종 A-J을 나타낸다). 컬럼 6에서, 모든 전장 항체 종만의 백분율로써 정확하게 쌍을 이룬 이중특이적 항체 (H1L1_H2L2 및 H1L2_H2L1**)의 양의 계산이 제공되어, 하프-항체 종을 배제한 페어링이 측정된다. 안정성 최적화 디자인 단독을 갖는, 정확하게 쌍을 이룬 키메라 이중특이적 항체의 양, 또는 카파-카파 경쇄 페어링 디자인 (기획된 키메라 이중특이적 항체)와 복합되어 안정성 최적화 디자인의 양을 키메라 이중특이적 항체 대조군의 양과 비교한 것을 차례로 컬럼 7과 9에 각각 보고된다. H3/페르투주마브 시스템의 경우, 등가의 비교가 불가능하였는데, 그 이유는 모든 항체와 하프: Ab 종 간의 50Da 차이를 얻기 위하여 페르투주마브의 경쇄에 FLAG 태그가 필요하였기 때문이다. 이 시스템의 경우, 보고된 값 다음에 '*'로 표시된 유사한 구조체 (즉, 페르투주마브 경쇄 상에 FLAG 태그를 함유하는 키메라 이중특이적 항체 대조군)에 비교가 실행되었다. 분석된 이중특이적 샘플에 존재하는 우세한 잘못 짝지어진 종은 H1H2L1L1이었고, 이 양은 이 샘플에 존재하는 모든 항체 종에 대한 백분율로써 컬럼 10에 보고된다.
H3/페르투주마브 및 CAT-2200/D3H44 두 시스템 모두에서, 이중특이적 항체 함량은 상기 이중특이적 키메라 Ab 대조군과 비교하여, 이중특이적 키메라 항체에 안정성 최적화 디자인을 도입할 때 작은 정도로 감소되었다(컬럼 9). H3/페르투주마브 및 CAT-2200/D3H44 시스템에서, 기획된 이중특이적 키메라 항체의 이중특이적 항체 함량, 즉, 컬럼 8에서 정의된 바와 같이, 안정성 최적화 디자인과 카파-카파 경쇄 페어링 디자인을 갖는 항체는 테스트된 안정성 최적화 디자인 2개 세트와 카파-카파 경쇄 페어링 디자인 2개 세트에 걸쳐 거의 필적하였고, 그 범위는 64.6-86.4 %이었다. 이것은 이중특이적 키메라 대조군과 비교하여 H3/페르투주마브 시스템에서 바람직한 이중특이적 종 함량은 25.3-36%로 증가되었고, CAT-2200/D3H44 시스템에서 46.3-80.4%로 증가된 것으로 해석되었다(컬럼 9). 특정 유형의 카파-카파 디자인 (즉, 디자인 9060-9756 또는 9820-9823)은 CAT-2200/D3H44 시스템에서 관찰된 값 변이(범위)를 주요 원인이었다. 컬럼 7에서 나타낸 것과 같이, 이들 디자인의 이중특이적 함량의 유사한 범위의 개선은 테스트된 샘플에서 하프 항체 종의 낮은 함량을 반영한다.
표 9의 데이터는 테스트된 카파-카파 경쇄 페어링 디자인이 상기 이중특이적 키메라 항체 대조군의 것과 비교하여, 기획된 이중특이적 키메라 항체 의 이중특이적 항체의 실질적 증가를 촉진시킬 수 있음을 입증한다. 이것은 V람다-C카파 키메라 경쇄에서 안정성 최적화 디자인은 여기에서 테스트된 카파-카파 경쇄 페어링 디자인과 필적한다는 것을 나타낸다.
본 명세서의 본문 내에 인용된 모든 참고 문헌, 등록 특허, 특허 출원 및 서열 수탁 번호 (예를 들어, GenBank 수탁 번호)는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> ZYMEWORKS INC.
<120> STABILIZED CHIMERIC FABS
<130> ZYME033WO
<150> 62/527,561
<151> 2017-06-30
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H3 heavy chain Fab
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Asn Arg Asp Gly Ser Ala Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Val Gly Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr
225
<210> 2
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H3 light chain (lambda)
<400> 2
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ile Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
Ser Thr His Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
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Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 3
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H3 V(lambda)-C(kappa) chimeric light chain
<400> 3
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ile Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
Ser Thr His Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EP6b_B01 heavy chain Fab
<400> 4
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Ala Asn
20 25 30
Ser Tyr Tyr Gly Val Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Gly Ser Ile Ala Tyr Arg Gly Asn Ser Asn Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ala Thr Val Ser Val Asp Ser
65 70 75 80
Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp
85 90 95
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gln Leu Leu Asp Asp Gly Thr
100 105 110
Gly Tyr Gln Trp Ala Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
130 135 140
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
145 150 155 160
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
165 170 175
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
180 185 190
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
195 200 205
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
210 215 220
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
225 230 235 240
<210> 5
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EP6b_B01 light chain (lambda)
<400> 5
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Arg Tyr
20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asp Asn Leu Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Thr Ala Ser Leu Ala Ile Arg Asp Leu Leu
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Trp Asp Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 6
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EP6b_B01 V(lambda)-C(kappa) chimeric light chain
<400> 6
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Arg Tyr
20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asp Asn Leu Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Thr Ala Ser Leu Ala Ile Arg Asp Leu Leu
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Trp Asp Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 7
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAT-2200 heavy chain Fab
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Ile His Gly Val Thr Arg Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Gln Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr
225
<210> 8
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAT-2200 light chain (lambda)
<400> 8
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Ile Val
35 40 45
Ile Phe Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Asp Pro
85 90 95
Tyr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 9
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAT-2200 V(lambda)-C(kappa) chimeric light chain
<400> 9
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Leu Ala Asn Tyr
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Ile Val
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Ile Phe Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Asp Pro
85 90 95
Tyr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 10
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pertuzumab heavy chain Fab
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr
225
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pertuzumab light chain (kappa)
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 12
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D3H44 heavy chain Fab
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Glu Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Leu Ile Asp Pro Glu Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr
225
<210> 13
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D3H44 light chain (kappa)
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Lys Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 14
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG1 Fc
<400> 14
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 15
<211> 681
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG1 Fc
<400> 15
gataagaccc acacctgccc tccctgtcca gctccagaac tgctgggagg acctagcgtg 60
ttcctgtttc cccctaagcc aaaagacact ctgatgattt ccaggactcc cgaggtgacc 120
tgcgtggtgg tggacgtgtc tcacgaggac cccgaagtga agttcaactg gtacgtggat 180
ggcgtggaag tgcataatgc taagacaaaa ccaagagagg aacagtacaa ctccacttat 240
cgcgtcgtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacgggaa ggagtataag 300
tgcaaagtca gtaataaggc cctgcctgct ccaatcgaaa aaaccatctc taaggccaaa 360
ggccagccaa gggagcccca ggtgtacaca ctgccaccca gcagagacga actgaccaag 420
aaccaggtgt ccctgacatg tctggtgaaa ggcttctatc ctagtgatat tgctgtggag 480
tgggaatcaa atggacagcc agagaacaat tacaagacca cacctccagt gctggacagc 540
gatggcagct tcttcctgta ttccaagctg acagtggata aatctcgatg gcagcagggg 600
aacgtgttta gttgttcagt gatgcatgaa gccctgcaca atcattacac tcagaagagc 660
ctgtccctgt ctcccggcaa a 681
<210> 16
<211> 678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H3 heavy chain Fab
<400> 16
caggtccagc tgcaggaatc tggcggagga ctggtcaaac ctggaggctc tctgagactg 60
tcatgtgctg ctagtggctt tactttcagc tcctactgga tgtcttgggt gcgacaggcc 120
cccggcaagg gactggagtg ggtcgcaaac atcaatagag acggatctgc cagttactat 180
gtggatagcg tcaagggccg gttcaccatt tcaagagacg atgctaaaaa cagcctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaagac acagctgtgt actattgcgc acgcgatcgc 300
ggcgtgggat atttcgatct gtggggccgc ggaaccctgg tgaccgtctc atctgctagc 360
actaaggggc cttccgtgtt tccactggct ccctctagta aatccacctc tggaggcaca 420
gctgcactgg gatgtctggt gaaggattac ttccctgaac cagtcacagt gagttggaac 480
tcaggggctc tgacaagtgg agtccatact tttcccgcag tgctgcagtc aagcggactg 540
tactccctgt cctctgtggt caccgtgcct agttcaagcc tgggcaccca gacatatatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc atcaaataca aaagtcgaca agaaggtgga accaaaaagc 660
tgcgataaaa cccataca 678
<210> 17
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H3 light chain (lambda)
<400> 17
cagagcgcac tgactcagcc tgcttccgtg tccggctccc ctgggcagag tattacaatc 60
tcatgcactg gcacctcatc cgacgtgggc gggtacaact ttgtcagctg gtatcagcag 120
cacccaggca aggcccccaa actgatgatc tacgacgtgt ccgatcggcc ttccggggtc 180
tctgacagat tctccggatc taagagtggc aataccgcca gcctgatcat ttccgggctg 240
caggcagacg atgaggccga ttactattgc agctcctatg gatctagttc aacacatgtg 300
atcttcggag gcgggaccaa ggtgacagtc ctggggcagc ctaaagcggc gccctctgtg 360
actctgtttc cccctagctc cgaggaactg caggctaaca aggcaactct ggtgtgtctg 420
attagcgact tctacccagg agctgtgacc gtcgcctgga aggctgattc tagtcccgtg 480
aaagcaggcg tcgagaccac aactcctagt aagcagtcaa acaacaagta cgcagcctca 540
agctatctgt ctctgacacc cgaacagtgg aaaagtcaca ggtcatatag ctgccaggtg 600
actcacgagg gctcaactgt ggagaaaacc gtcgcaccaa ccgaatgttc c 651
<210> 18
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H3 V(lambda)-C(kappa) chimeric light chain
<400> 18
cagagcgcac tgactcagcc tgcatccgtg tccgggtccc ctgggcagag cattactatt 60
tcatgtactg gaacttcttc agacgtgggc gggtacaact tcgtgtcctg gtatcagcag 120
caccccggca aggcacctaa actgatgatc tacgacgtga gcgatcgacc aagcggggtc 180
tccgacagat tttctggaag taaatcaggc aataccgcct ctctgatcat tagtgggctg 240
caggccgacg atgaggctga ttactattgc agctcctatg gatctagtag cacccatgtc 300
attttcggag gcggaacaaa ggtcaccgtc ctgagaaccg tggcggcgcc cagtgtcttc 360
atttttcccc ctagcgacga acagctgaag tctgggacag ccagtgtggt ctgtctgctg 420
aacaacttct accctcgcga ggctaaagtg cagtggaagg tcgataacgc actgcagtcc 480
ggaaattctc aggagagtgt gactgaacag gactcaaaag atagcaccta ttccctgtca 540
agcacactga ctctgagcaa ggccgactac gagaagcata aagtgtatgc ttgtgaagtc 600
acccaccagg ggctgagttc accagtcaca aaatcattca acagagggga gtgc 654
<210> 19
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EP6b_B01 heavy chain Fab
<400> 19
cagctgcagc tgcaggaaag cgggcctggg ctggtgaaac cttccgaaac actgtccctg 60
acttgtactg tgagcggggc atcaattagt gccaactcat actatggcgt gtgggtccga 120
cagagtccag gaaagggact ggagtgggtg gggtccatcg cctacagagg aaacagtaat 180
tcaggcagca catactataa ccctagcctg aagtccaggg ctactgtgag cgtggacagc 240
tccaaaaatc aggtgtcact gcgcctgact agcgtcaccg ccgctgatac cgccctgtac 300
tattgcgctc ggagacagct gctggacgat gggacaggat accagtgggc agccttcgac 360
gtgtggggac aggggacaat ggtgactgtc tctagtgcta gcaccaaggg gccaagcgtg 420
ttcccactgg caccctcaag caaatccacc tctggaggaa cagctgcact gggatgcctg 480
gtgaaggatt atttccccga acctgtgact gtctcttgga atagtggggc actgacttct 540
ggagtgcaca cctttcccgc cgtcctgcag tcctctggac tgtactccct gagttcagtg 600
gtcacagtgc ctagctcctc tctgggcacc cagacataca tctgtaacgt gaaccataag 660
ccatcaaaca ctaaagtcga caagaaggtg gagccaaagt cctgtgacaa gacccataca 720
<210> 20
<211> 648
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EP6b_B01 light chain (lambda)
<400> 20
cagagcgtcc tgactcagcc tccctccgtg tccgaagcac ctcggcagac tgtgactatc 60
tcatgttctg gcaactcatc aaatatcgga aggtacccag tgaactggta tcagcagctg 120
cccggcaagg cacctaaact gctgatctac agtgacaatc tgcggttctc aggggtcccc 180
gatcggttca gcggctccaa gtctgggacc acagccagcc tggctattcg ggacctgctg 240
tccgaggacg aagccgatta ctattgcagt acctgggacg ataccctgga aggatgggtc 300
ttcggcggcg gcacaaaagt caccgtcctg gggcagccaa aggcggcgcc cagtgtcaca 360
ctgtttcccc ctagctccga ggaactgcag gctaacaaag caacactggt gtgtctgatc 420
agcgacttct accctggagc tgtgactgtc gcctggaagg ctgattctag tccagtgaaa 480
gcaggcgtcg agaccacaac tccctctaag cagagtaaca acaagtacgc agcctcaagc 540
tatctgtcac tgaccccaga acagtggaag agccaccgga gctattcctg ccaggtcact 600
cacgaaggct ccactgtcga gaaaaccgtc gctcccaccg aatgttca 648
<210> 21
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EP6b_B01 V(lambda)-C(kappa) chimeric light chain
<400> 21
cagagcgtcc tgactcagcc tccttccgtg tccgaggcac cccgccagac cgtgactatc 60
tcatgttccg gcaactcctc aaatatcgga aggtacccag tgaactggta tcagcagctg 120
cccggcaagg cacctaaact gctgatctac agtgacaatc tgcggttctc aggggtcccc 180
gatcggttca gcggctccaa gtctgggacc acagccagcc tggctattcg ggacctgctg 240
tccgaggacg aagccgatta ctattgcagt acctgggatg ataccctgga aggatgggtc 300
tttggaggag gaactaaagt caccgtgctg agaaccgtgg cggcgcccag tgtcttcatt 360
tttcccccta gcgacgaaca gctgaagtct gggacagcca gtgtggtctg tctgctgaac 420
aacttctacc ctagagaggc taaagtgcag tggaaggtcg ataacgcact gcagtccgga 480
aattctcagg agagtgtgac tgaacaggac tcaaaagata gcacctattc cctgtcaagc 540
acactgactc tgagcaaggc cgactacgag aagcataaag tgtatgcttg tgaagtcacc 600
caccaggggc tgagttcacc agtcacaaaa tcattcaaca gaggggagtg c 651
<210> 22
<211> 678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAT-2200 heavy chain Fab
<400> 22
gaggtgcagc tgctggaatc tggggggggc ctggtgcagc ctggggggtc cctgagactg 60
tcatgtgctg ccagcgggtt tactttcagc tcctacgcta tgtcctgggt gcgacaggca 120
cccgggaagg gactggagtg ggtctctgca atcagtgggt caggcgggag tacttactat 180
gccgacagcg tgaagggacg gttcactatc tcaagagata acagcaagaa caccctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agcagaagac acagccgtgt actattgcgc cagggatctg 300
atccacggag tcactcgcaa ttggggccag gggactctgg tgaccgtctc tagtgctagc 360
acaaaggggc cctctgtgtt tccactggcc ccctcaagca aaagcacatc cggaggaact 420
gcagctctgg gatgtctggt gaaggactac ttcccccagc ctgtgaccgt ctcttggaac 480
agtggagccc tgaccagcgg cgtgcacaca tttcctgctg tcctgcagtc ctctggcctg 540
tactccctga gttcagtggt cacagtgcct agctcctctc tggggaccca gacatatatt 600
tgcaacgtga atcataaacc aagcaacact aaggtcgaca agaaagtgga gcccaagagc 660
tgtgataaaa ctcatacc 678
<210> 23
<211> 648
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAT-2200 light chain (lambda)
<400> 23
aactttatgc tgactcagcc ccactccgtg tccgagagcc ctggcaaaac tgtgactatt 60
tcatgtaccc gatcatctgg aagcctggcc aactactatg tgcagtggta ccagcagagg 120
ccaggcagct cccccactat cgtgattttc gctaacaatc agcggccttc cggcgtccca 180
gacagatttt ccgggtctat cgattctagt tcaaatagtg catcactgac tatttccggg 240
ctgaagaccg aggacgaagc cgattactat tgccagacct acgaccccta ttctgtggtc 300
ttcggcgggg gaaccaagct gacagtgctg ggacagccaa aagcggcgcc cagtgtcaca 360
ctgtttcccc ctagctccga ggaactgcag gctaacaaag caacactggt gtgtctgatc 420
agcgacttct accctggagc tgtgactgtc gcctggaagg ctgattctag tccagtgaaa 480
gcaggcgtcg agaccacaac tccctctaag cagagtaaca acaagtacgc agcctcaagc 540
tatctgtcac tgaccccaga acagtggaag agccaccgga gctattcctg ccaggtcact 600
cacgaaggct ccactgtcga gaaaaccgtc gctcccaccg aatgttca 648
<210> 24
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAT-2200 V(lambda)-C(kappa) chimeric light chain
<400> 24
aactttatgc tgacacagcc tcactctgtg agtgagtcac ccggaaagac cgtcacaatc 60
tcttgcacta ggagctccgg cagcctggca aactactatg tgcagtggta ccagcagcgg 120
cccgggtcta gtcctaccat cgtgattttc gccaacaatc agcgaccatc cggagtccca 180
gaccggttca gcgggtccat cgattcaagc tccaattctg ccagtctgac tattagcggc 240
ctgaaaaccg aggacgaagc tgattactat tgtcagacat acgatccata tagcgtggtc 300
tttggcggag gaactaagct gaccgtgctg agaaccgtgg cggcgcccag tgtcttcatt 360
tttcccccta gcgacgaaca gctgaagtct gggacagcca gtgtggtctg tctgctgaac 420
aacttctacc ctagagaggc taaagtgcag tggaaggtcg ataacgcact gcagtccgga 480
aattctcagg agagtgtgac tgaacaggac tcaaaagata gcacctattc cctgtcaagc 540
acactgactc tgagcaaggc cgactacgag aagcataaag tgtatgcttg tgaagtcacc 600
caccaggggc tgagttcacc agtcacaaaa tcattcaaca gaggggagtg c 651
<210> 25
<211> 681
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pertuzumab heavy chain Fab
<400> 25
gaagtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg 60
tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca 120
cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac 180
aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat 240
ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg 300
gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc 360
tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga 420
actgcagccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg 480
aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgca gtcaagcggg 540
ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat 600
atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag 660
tcttgtgata aaacccatac a 681
<210> 26
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pertuzumab light chain (kappa)
<400> 26
gatattcaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagtgcct cagtgggcga ccgagtcacc 60
atcacatgca aggcttccca ggatgtgtct attggagtcg catggtacca gcagaagcca 120
ggcaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctacc ggtataccgg cgtgccctct 180
agattctctg gcagtgggtc aggaacagac tttactctga ccatctctag tctgcagcct 240
gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag tactatatct acccatatac ctttggccag 300
gggacaaaag tggagatcaa gaggactgtg gccgctccct ccgtcttcat ttttccccct 360
tctgacgaac agctgaaaag tggcacagcc agcgtggtct gtctgctgaa caatttctac 420
cctcgcgaag ccaaagtgca gtggaaggtc gataacgctc tgcagagcgg caacagccag 480
gagtctgtga ctgaacagga cagtaaagat tcaacctata gcctgtcaag cacactgact 540
ctgagcaagg cagactacga gaagcacaaa gtgtatgcct gcgaagtcac acatcagggg 600
ctgtcctctc ctgtgactaa gagctttaac agaggagagt gt 642
<210> 27
<211> 700
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D3H44 heavy chain Fab
<400> 27
gaggtccagc tggtcgagtc tggaggagga ctggtgcagc caggagggag cctgcgactg 60
tcctgcgccg cttctggctt caacatcaag gaatactata tgcactgggt gagacaggca 120
ccaggcaaag gactggagtg ggtgggcctg atcgaccctg aacaggggaa caccatctac 180
gacccaaagt ttcaggatcg ggccactatt agtgctgaca actcaaaaaa taccgcatat 240
ctgcagatga acagcctgag ggcagaggat acagccgtgt actattgcgc ccgggacact 300
gcagcctact tcgattattg gggacagggc acactggtca ctgtgagctc cgctagcact 360
aaggggcctt ccgtgtttcc actggctccc tctagtaaat ccacctctgg aggcacagct 420
gcactgggat gtctggtgaa ggattacttc cctgaaccag tcacagtgag ttggaactca 480
ggggctctga caagtggagt ccatactttt cccgcagtgc tgcagtcaag cggactgtac 540
tccctgtcct ctgtggtcac cgtgcctagt tcaagcctgg gcacccagac atatatctgc 600
aacgtgaatc acaagccatc aaatacaaaa gtcgacaaga aagtggagcc caagagctgt 660
gataaaactc atacctgccc accttgtccg gcgccagaac 700
<210> 28
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D3H44 light chain (kappa)
<400> 28
gacatccaga tgacccagtc ccctagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga cagggtgacc 60
atcacatgcc gggccagcag agatatcaag tcctacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ctaaggtgct gatctactat gccacatctc tggccgaggg agtgccaagc 180
cgcttcagcg gctccggctc tggaaccgac tacaccctga caatctctag cctgcagcca 240
gaggatttcg ccacatacta ttgtctgcag cacggcgagt ctccctggac ctttggccag 300
ggcacaaagg tggagatcaa gcggaccgtg gcggcgccca gtgtcttcat ttttccccct 360
agcgacgaac agctgaagtc tgggacagcc agtgtggtct gtctgctgaa caacttctac 420
cctagagagg ctaaagtgca gtggaaggtc gataacgcac tgcagtccgg aaattctcag 480
gagagtgtga ctgaacagga ctcaaaagat agcacctatt ccctgtcaag cacactgact 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcataaa gtgtatgctt gtgaagtcac ccaccagggg 600
ctgagttcac cagtcacaaa atcattcaac agaggggagt gc 642
<210> 29
<211> 217
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IgG1 Fc sequence 231-447
<400> 29
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Upper IgG1 hinge
<400> 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C(kappa) (CH1) domain of IGKC*01
<400> 31
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lower IgG1 hinge
<400> 32
Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
Claims (61)
- 다음을 포함하는 키메라 이형이량체:
a) 중쇄 불변 도메인 1 (CH1) 서열 및 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 구조체 (H1), 및
b) 카파 경쇄 불변 도메인 (C카파) 서열 및 람다 경쇄 가변 도메인 (V람다) 서열을 포함하는 제1 키메라 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 구조체 (L1), 이때 상기 V람다 서열은 시차주사열량분석 (DSC) 또는 차등적 스캐닝 형광측정법 (DSF)에 의해 측정 시 안정화 아미노산 변형이 없는 대응하는 야생형 키메라 이형이량체와 비교하였을 때 키메라 이형이량체의 용융 온도를 증가시키는 하나 이상의 안정화 아미노산 변형을 포함하며,
이때 H1 및 L1은 제1 에피토프에 결합하는 제1 Fab 영역을 형성하고,
이때 하나 이상의 안정화 아미노산 변형은 잔기 83, 잔기 85, 또는 두 잔기 모두의 치환을 포함하고, 이때 잔기 83은 F, V, I, 또는 A로 치환되고, 잔기 85는 T 또는 V로 치환되고;
이때 아미노산 잔기의 번호매김은 Kabat에 따른다. - 청구항 1에 있어서, V람다 서열은 C카파 서열과 V람다 서열 사이의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 안정화 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 이때 하나 이상의 아미노산 잔기는 잔기 80, 105 및 106으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 잔기 80은 A 또는 P로 치환되고, 잔기 105는 E로 치환되고, 잔기 106은 I로 치환되는, 키메라 이형이량체.
- 청구항 1에 있어서, V람다 서열은 잔기 83, 85, 105 및 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 잔기의 안정화 아미노산 변형을 포함하고, 이때 잔기 83은 F, V, I, 또는 A로 치환되고, 잔기 85는 T 또는 V로 치환되고, 잔기 105는 E로 치환되고, 잔기 106은 I로 치환되는, 키메라 이형이량체.
- 청구항 1에 있어서, 키메라 이형이량체의 V람다 서열이 다음의 안정화 아미노산 변형 중 하나를 포함하는 것인 키메라 이형이량체:
(a) 83F, 105E 및 106AK;
(b) 83F, 105E, V106I 및 106AK;
(c) 80A, 83F, 105E 및 106AK;
(d) 80A, 83F, 105E, 106I 및 106AK;
(e) 80A, 83F, 85T, 105E 및 106AK;
(f) 80A, 83F, 85T, 105E, 106I 및 106AK;
(g) 80P, 83F, 85T, 105E, 106I 및 106AK;
(h) 85T;
(i) 85V;
(j) 83F;
(k) 83F 및 105E;
(l) 83F 및 106I;
(m) 83F 및 85T;
(n) 83F, 85T 및 105E;
(o) 83F, 85V 및 105E;
(p) 83F, 85T, 105E 및 106I;
(q) 83F, 85V, 105E 및 106I;
(r) 83F, 85T, 105E, 106I 및 106AK;
(s) 83V;
(t) 83V 및 105E;
(u) 83V 및 106I;
(v) 83V 및 85T;
(w) 83V, 85T 및 105E;
(x) 83V, 85V 및 105E;
(y) 83V, 85T, 105E 및 106I;
(z) 83I;
(aa) 83I 및 105E;
(bb) 83I 및 85T;
(cc) 83I, 85T 및 105E;
(dd) 83I, 85T, 105E 및 106I;
(ee) 83A;
(ff) 83A 및 105E;
(gg) 83A 및 85T;
(hh) 83A, 85T 및 105E; 또는
(ii) 83A, 85T, 105E 및 106I. - 청구항 1에 있어서, 키메라 이형이량체의 용융 온도가 안정화 아미노산 변형이 없는 대응하는 야생형 키메라 이형이량체와 비교하였을 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9℃만큼 증가되는, 키메라 이형이량체.
- 다음을 포함하는 항체 구조체:
a) 제1 이형이량체, 이때 상기 제1 이형이량체는 청구항 1에 따른 키메라 이형이량체임, 및
b) 스캐폴드
이때 전술한 제1 이형이량체의 H1 및 L1 중 최소한 하나는 링커와 함께, 또는 링커 없이 상기 스캐폴드에 연계된다. - 청구항 6에 있어서, 제2 이형이량체를 더 포함하며, 전술한 제2 이형이량체는 다음을 포함하는 항체 구조체:
i) 중쇄 불변 도메인 1 (CH1) 서열, 및 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 구조체 (H2), 및
ii) 경쇄 불변 도메인 (CL) 서열 및 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함하는 제2 이뮤노글로불린 경쇄 폴리펩티드 구조체 (L2),
이때 H2와 L2는 제2 에피토프에 결합하는 제2 Fab 영역을 형성하고, 그리고 H2 및 L2 중 최소한 하나는 링커와 함께, 또는 링커 없이, 상기 스캐폴드에 연결된다. - 청구항 7에 있어서, 상기 제1 에피토프와 제2 에피토프는 동일한, 항체 구조체.
- 청구항 7에 있어서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 서로 상이한, 항체 구조체.
- 청구항 7에 있어서, 제1 이형이량체, 제2 이형이량체, 또는 두 이형이량체 모두는 경쇄 페어링을 촉진시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 더 포함하는, 항체 구조체.
- 청구항 7에 있어서, 상기 스캐폴드는 제1 중쇄 불변 도메인 3 (CH3) 서열 및 제2 CH3 서열을 포함하는 Fc 영역인, 항체 구조체.
- 청구항 11에 있어서, 상기 제1 CH3 서열 및 제2 CH3 서열은 각각 동종이량체 CH3 도메인과 비교하였을 때, 이형이량체 CH3 도메인 형성을 촉진시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는, 항체 구조체.
- 청구항 11에 있어서, 상기 Fc 영역은 제1 불변 도메인 2 (CH2) 서열과 제2 CH2 서열을 더로 포함하는, 항체 구조체.
- 청구항 11에 있어서, Fc 영역은 인간 Fc, 인간 IgG1 Fc, 인간 IgA Fc, 인간 IgG Fc, 인간 IgD Fc, 인간 IgE Fc, 인간 IgM Fc, 인간 IgG2 Fc, 인간 IgG3 Fc, 또는 인간 IgG4 Fc인, 항체 구조체.
- 청구항 6에 있어서, 상기 링커는 하나 이상의 폴리펩티드 링커인, 항체 구조체.
- 청구항 6에 있어서, 상기 링커는 하나 이상의 항체 힌지 영역을 포함하는, 항체 구조체.
- 청구항 16에 있어서, 상기 링커는 하나 이상의 IgG1 힌지 영역을 포함하는, 항체 구조체.
- 청구항 6에 있어서, 약물에 접합된 항체 구조체.
- 청구항 1에 따른 키메라 이형이량체, 또는 청구항 6에 따른 항체 구조체, 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 따른 키메라 이형이량체, 또는 청구항 6에 따른 항체 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트.
- 청구항 20에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 세트 중 하나 이상을 포함하는 벡터 또는 벡터 세트.
- 청구항 20에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는, 단리된 세포.
- 청구항 1에 따른 키메라 이형이량체 또는 청구항 6에 따른 항체 구조체를 준비하는 방법이며,
(a) 청구항 1에 따른 키메라 이형이량체 또는 청구항 6에 따른 항체 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 세트를 포함하는 숙주 세포를 획득하는 단계;
(b) 상기 키메라 이형이량체 또는 항체 구조체의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 세포 배양물에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
(c) 상기 숙주 세포 배양물로부터 상기 키메라 이형이량체 또는 항체 구조체를 수거하는 단계
를 포함하는 방법. - 삭제
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