JP2023540082A - SARS-CoV-2ワクチン及び抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの混合物に対する抗体を生成する方法であって、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が、SARS-CoV-2開始タンパク質と比較して変化した立体構造動力学を有し、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質がSARS-CoV-2開始タンパク質に類似する立体構造を有する方法を記載する。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、抗体の生成につながる可能性がある免疫応答を誘導するために使用することができ、且つ/又は哺乳動物にワクチン接種するために使用することができる。【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、2020年9月4日に出願された米国仮出願第63/075,043号、2020年12月31日に出願された出願第63/132,943号、及び2021年6月16日に出願された出願第63/211,397号の優先権の利益を主張し、それらの全ては、いかなる目的のためにも参照により全体が本明細書に組み込まれる。
[0001] 本出願は、2020年9月4日に出願された米国仮出願第63/075,043号、2020年12月31日に出願された出願第63/132,943号、及び2021年6月16日に出願された出願第63/211,397号の優先権の利益を主張し、それらの全ては、いかなる目的のためにも参照により全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
[0002] 本出願は、電子フォーマットの配列表とともに提出される。配列表は、2021年9月2日に作成された「2021-09-02_01308-0003-0PCT_Seq_List_ST25.txt」と題するファイルとして提供され、サイズは300,679バイトである。配列表の電子フォーマットの情報は、その全体が参照により本書に組み込まれる。
[0002] 本出願は、電子フォーマットの配列表とともに提出される。配列表は、2021年9月2日に作成された「2021-09-02_01308-0003-0PCT_Seq_List_ST25.txt」と題するファイルとして提供され、サイズは300,679バイトである。配列表の電子フォーマットの情報は、その全体が参照により本書に組み込まれる。
序論
[0003] 抗体を作成する方法は、100年以上前から存在しており、当業者にはルーチン的に使用されている。例えば、Morrison et al.,Science 229:1202(1985);Oi et al.,BioTechniques 4:214(1986);Cabilly et al.,米国特許第4,816,567号;Taniguchi et al.,EP171496;Morrison et al.,EP173494;Neuberger et al.,国際公開第8601533号;Robinson et al.,国際公開第8702671号;Boulianne et al.,Nature 312:643(1984);Neuberger et al.,Nature 314:268(1985)を参照。抗体を生成するための改善された方法は、これらの初期の方法を拡張し、現在市販されている治療用抗体の多くを生成するために使用されている。例えば、ファージディスプレイ及びトランスジェニックマウス、つまりヒト免疫グロブリン遺伝子を含むマウスなどの技術は、完全ヒト抗体を生成するために使用されてきた。しかしながら、特定の抗原は、最新の技術を使用した場合でも、抗体を産生させるために研究者の能力を要求し続けている。
[0003] 抗体を作成する方法は、100年以上前から存在しており、当業者にはルーチン的に使用されている。例えば、Morrison et al.,Science 229:1202(1985);Oi et al.,BioTechniques 4:214(1986);Cabilly et al.,米国特許第4,816,567号;Taniguchi et al.,EP171496;Morrison et al.,EP173494;Neuberger et al.,国際公開第8601533号;Robinson et al.,国際公開第8702671号;Boulianne et al.,Nature 312:643(1984);Neuberger et al.,Nature 314:268(1985)を参照。抗体を生成するための改善された方法は、これらの初期の方法を拡張し、現在市販されている治療用抗体の多くを生成するために使用されている。例えば、ファージディスプレイ及びトランスジェニックマウス、つまりヒト免疫グロブリン遺伝子を含むマウスなどの技術は、完全ヒト抗体を生成するために使用されてきた。しかしながら、特定の抗原は、最新の技術を使用した場合でも、抗体を産生させるために研究者の能力を要求し続けている。
[0004] ヒト体内で細胞媒介性免疫応答を誘導するために、外来タンパク質は通常8~24アミノ酸の長さの小さなペプチドに分解され、抗原提示細胞の表面上での提示のためにMHC分子に結合される。MHCに結合したペプチドはT細胞に提示され、細胞性媒介性免疫応答を引き起こす。
[0005] タンパク質の3次元(3D)構造は、タンパク質分解プロセシング及びエピトープの提示における要因として関係づけられてきた(例えば、Carmicle et al.,Molecular Immunology(2007)vol.44:1159-1168を参照)。さらに、Ohkuriら(Okhuri et al.,J.Immunol.,(2010),vol.185:4199-4205を参照)は、タンパク質の立体構造の安定性が免疫学的に支配的な要因であることを認めている。しかしながら、3D構造が免疫応答にどのように影響するかについては、コンセンサスが得られていない。
[0006] Delamarreら(Delamarre et al.,JEM,(2006),vol 203:2049-2055を参照)は、リソソームタンパク質分解による消化を受けにくいタンパク質の消化されにくい形態が、より免疫原性が高いことを発見し、したがって、タンパク質の安定性を増加させると免疫応答が改善されると結論づけた。例えば、Delamarreらは、タンパク質分解に対する感受性を低下させることによって、タンパク質抗原の免疫原性を改善できることを示した。同様に、Mirano-Bascosら(Mirano-Bascos et al.,J.of Virology,(2010),vol.84:3303-3311を参照)はシステイン残基を変異させて、3つのジスルフィド結合のそれぞれが形成されるのを防ぎ、CD4+ T細胞応答は3つのバリアント全てについて広く低下することを確認した。Mirano-Bascosらは同様に、タンパク質の3D構造が全体的に不安定化すると、抗原提示が減少し、免疫応答が抑制されると結論づけた。他の研究、例えば、Nguyen et al.,Vaccine,(2015),vol.33:2887-2896では、外側ドメインのジスルフィド結合が欠失され、そのような欠失は抗原提示を改善すると期待された。代わりに、エピトープ優位性の典型的なパターンが観察され、著者らは、実質的により強い免疫応答を生成することはできない可能性があると結論づけた。
[0007] 他のグループも同様に、タンパク質の安定化が免疫応答に必要であると結論づけている。例えば、Deressaら(Deressa et al.,PLOS,(2014),vol.9:1-12を参照)は、抗原のアミノ酸配列のわずかな改変でさえ、免疫応答の基本的な定量的及び定性的変化を引き起こすと結論づけた。同様に、Portaら(Porta et al.,PLOS,(2013),vol.9:1-8を参照)は、免疫応答の誘導には安定性が必要であることを報告した。Thomas(Thomas et al.,Human Vaccines & Immunotherapeutics,(2013),vol.9:744-752を参照)などの他のグループも同様に、ペプチドの熱安定性を増加させるとより優れた免疫応答が引き起こされると結論づけている。
[0008] 対照的に、So(So et al.,Immunology,(2001),vol.104:259-268を参照)などの他のグループは、相反する結果を報告している。Soらは、in vivoでのT細胞応答の大きさに対する架橋の影響(例えば、架橋の除去及び架橋の追加)を調査し、そのような架橋を除去すると、良好な抗原プロセシング及び免疫応答の改善をもたらすことを発見した。同様に、Thai et al.,J.Biol.Chem.(2004),vol.279:50257-50266は、タンパク質抗原の免疫原性を高めるために、表面露出可能な残基を変異させると安定性が減少し、立体構造動力学が増加してタンパク質抗原の免疫原性を増加させることを報告した。Thaiらは、単一抗原の投与も対象としている。
[0009] 架橋の除去又は追加が抗原プロセシングを改善するか阻害するかについては、コンセンサスが得られていない。したがって、タンパク質の安定性を増加させる又は減少させると、抗体の広く多様なアレイを含む免疫応答の改善につながるかどうかは、当技術分野では不明確である。
[0010] したがって、以前に得られたものとは異なる、より広いレパートリーの抗体を提供できる、抗体を生成するための新らしい改良された方法を開発する必要性が引き続き存在する。
[0011] この概要は、詳細な説明で以下にさらに説明される概念の選択を簡略化した形で紹介するために提供される。この概要は、特許請求されている主題の主要な特徴又は本質的な特徴を特定することを意図したものではなく、また、特許請求されている主題の範囲を決定する際の補助として使用することを意図したものでもない。本明細書に記載されるように、本発明は、(a)SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(SARS-CoV-2 peptidogenic protein)であって、ここで、前記ペプチド原性タンパク質が、SARS-CoV-2開始タンパク質と比較して変化した立体構造動力学(conformational dynamics)を有し、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が、SARS-CoV-2開始タンパク質と立体構造が類似しており、前記SARS-CoV-2開始タンパク質が、表2に列挙されたタンパク質のうちの少なくとも1つから選択される、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質;又は(b)スパイク断片;又は(c)(a)若しくは(b)をコードするポリヌクレオチド;又は(d)(a)、(b)、及び/若しくは(c)の任意の組み合わせを含む組成物を対象とする。本組成物は、免疫応答を引き起こす方法に使用することができる。例えば、そのような方法は、SARS-CoV-2開始タンパク質に由来するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物を設計することであって、ここで、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、SARS-CoV-2開始タンパク質と比較して変化した立体構造動力学を有し、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、SARS-CoV-2開始タンパク質と立体構造が類似している、設計することと、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を動物に導入することと、免疫応答を生成することとを含む。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質、スパイク断片、及び/又はポリヌクレオチドは、動物に直接(例えば、接種若しくは免疫化によって)導入することができ、又は動物に導入された、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドによってin vivoで発現させることができる。これらのSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片の発現により、免疫応答が引き起こされ、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質と最初のSARS-CoV-2開始タンパク質の両方に対する抗体を生成する。
[0012] 好ましい実施態様では、非表面アミノ酸残基は、SARS-CoV-2開始タンパク質においてより小さなアミノ酸残基で置換される。さらに好ましい実施態様では、より小さいアミノ酸は、アラニン又はグリシンである。他の好ましい実施態様では、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸がSARS-CoV-2開始タンパク質において置換される。さらに他の好ましい実施態様では、少なくとも10個のアミノ酸、少なくとも20個のアミノ酸、少なくとも30個のアミノ酸、少なくとも40個のアミノ酸、又は少なくとも50個のアミノ酸が、SARS-CoV-2開始タンパク質において置換される。さらに他の好ましい実施態様では、複数のアミノ酸置換がタンパク質の混合物にわたって分布している。例えば、一実施態様では、10個の異なる残基を変異させるために、SARS-CoV-2開始タンパク質を10回変異させて、それぞれが単一のアミノ酸置換を有する10個の異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成する。10種類のタンパク質(又は10種類のタンパク質をコードするポリヌクレオチド)のそれぞれを一緒に混合して、動物に接種する。場合によっては、野生型SARS-CoV-2開始タンパク質又はタンパク質断片、すなわち変異のないタンパク質又はタンパク質断片が混合物の一部である。さらに好ましい実施態様では、少なくとも1つのジスルフィド結合が、例えば、システインをアラニン、セリン、及び/又はグリシンなどで置換するなど、SARS-CoV-2開始タンパク質において除去される。さらに好ましい実施態様では、SARS-CoV-2開始タンパク質における少なくとも1つのジスルフィド結合の形成に関与する両方のシステインが、アラニン、セリン、及び/若しくはグリシン、又は好ましくはアラニン若しくはグリシンなどで置換される。さらに好ましい実施態様では、SARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学は、(a)少なくとも1つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシン若しくはセリンで;又は(b)少なくとも1つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリン若しくはスレオニンで;又は(c)少なくとも1つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(d)少なくとも1つのロイシンをアラニン、バリン、グリシン若しくはイソロイシンで;又は(e)少なくとも1つのイソロイシンをアラニン、バリン、ロイシン若しくはグリシンで;又は(f)少なくとも1つのプロリン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンを、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはグリシンで;又は(g)少なくとも1つのアスパラギン酸若しくはアスパラギンをグリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(h)少なくとも1つのグルタミン酸若しくはグルタミンを、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(i)少なくとも1つのリジンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(j)少なくとも1つのアルギニンをリジン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(k)少なくとも1つのヒスチジンをリジン、アルギニン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(l)少なくとも1つのアラニンをグリシンで;又は(m)少なくとも1つの残基を非天然アミノ酸で;及び/又は(n)上記の組み合わせのいずれかで置換することによって変化している。
[0013] さらに好ましい実施態様では、SARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学は、(a)少なくとも1つのトリプトファンをチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(b)少なくとも1つのチロシンをフェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(c)少なくとも1つのフェニルアラニンをチロシン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(d)少なくとも1つのプロリンをメチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(e)少なくとも1つのヒスチジンをフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、リジン、アルギニン、セリン、スレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンで;又は(f)少なくとも1つのメチオニンをイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(g)少なくとも1つのイソロイシンをロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(h)少なくとも1つのロイシンをイソロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(i)少なくとも1つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(j)少なくとも1つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリン若しくはスレオニンで;又は(k)少なくとも1つのアスパラギン酸をグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(l)少なくとも1つのグルタミン酸をアスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(m)少なくとも1つのアラニンをグリシン若しくはプロリンで;又は(n)少なくとも1つのセリンをアラニン若しくはグリシンで;又は(o)少なくとも1つのグリシンをアラニン若しくはプロリンで;又は(p)少なくとも1つのリジンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(q)少なくとも1つのアスパラギンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸で;又は(r)少なくとも1つのグルタミンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸若しくはヒスチジンで;又は(s)少なくとも1つのアルギニンをリジン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(t)少なくとも1つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシン若しくはセリンで;又は(u)疎水性残基をより小さな類似の疎水性残基で;又は(v)少なくとも1つの残基を非天然アミノ酸で;又は(w)上記の組み合わせのいずれかで置換することによって変化している。コンビナトリアルアプローチを使用して、ペプチド原性を増加させる最適な置換を決定してもよい。
好ましい実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、スパイク糖タンパク質SPIKE_SARS2(P0DTC2)(配列番号15)又はSPIKE_SARS(P59594)(配列番号16)から選択される。さらに好ましい実施態様では、スパイクタンパク質は、以下の位置のいずれかで変異している:(A)配列番号15のTrp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/若しくはPhe543;(B)配列番号15のVal308、Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/若しくはLeu585;(C)配列番号15のAla363、Ala397、及び/若しくはAla575;(D)配列番号15のCys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;及び/若しくは(E)配列番号15のAla419、Ile980、Ala903、Leu916、Ala575、Phe1095、Cys1032、Val576、Tyr365、Ile1115、Ile418、Leu387、Cys649、Leu650、Leu585、Ala1080、Ile410、Tyr423、Ala1087、Tyr695、Ala653、Phe201、Ile1081、Phe497、Ala989、Leu552、Val1104、及び/若しくはCys671;並びに/又は(F)配列番号15~16若しくは配列番号43~110における等価な位置。
加えて、さらに好ましい実施態様では、組成物は、以下のうちのいずれか1つを含むか、又はそれからなる:(1)配列番号15のアミノ酸316~594若しくは配列番号16のアミノ酸303~580;(2)以下の部位のいずれか1つにおける少なくとも1つの変異を伴う配列番号15のアミノ酸316~594:(A)Trp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/若しくはPhe543;(B)Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/若しくはLeu585;(C)Ala363、Ala397、及び/若しくはAla575;(D)Cys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;(E)Ala419、Ala575、Val576、Tyr365、Ile418、Leu387、Leu585、Ile410、Tyr423、Phe497、及び/若しくはLeu552;(3)以下の部位のいずれか1つにおける少なくとも1つの変異を伴う配列番号15のアミノ酸319~591:(A)Trp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/若しくはPhe543;(B)Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/若しくはLeu585;(C)Ala363、Ala397、及び/若しくはAla575;(D)Cys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;及び/若しくは(E)Ala419、Ala575、Val576、Tyr365、Ile418、Leu387、Leu585、Ile410、Tyr423、Phe497、及び/若しくはLeu552;(3)以下の部位のいずれか1つにおける少なくとも1つの変異を伴う配列番号15のアミノ酸319~541:(A)Trp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、及び/若しくはPhe497;(B)Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、及び/若しくはVal539;(C)Ala363、及び/若しくはAla397;(D)Cys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;及び/若しくは(E)Ala419、Tyr365、Ile418、Leu387、Ile410、Tyr423、及び/若しくはPhe497;(4)Y365、I402、及び/若しくはV511から選択される少なくとも1つの変異を伴う配列番号15のアミノ酸319~541、319~591、若しくは316~594;(5)Y365L、I402V、及び/若しくはV511Aから選択される少なくとも1つの変異を伴う配列番号15のアミノ酸319~541、319~591、若しくは316~594;又は(6)配列番号15~16若しくは配列番号43~110における等価な断片及び/若しくは変異。
[0014] 好ましい実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の立体構造動力学の変化は、SARS-CoV-2開始タンパク質と比較した融解温度の変化によって、及び/又は安定化のギブズ自由エネルギーの変化を測定することによって測定される。ギブズ自由エネルギーを測定する好ましい方法には、変性剤調節平衡アンフォールディングが含まれるが、これに限定されない。好ましい変性剤は、尿素及び/又はグアニジン塩酸塩である。あるいは、立体構造動力学の変化は、例えば、カテプシン及び/又は他のプロテアーゼによる消化を測定し、その後、質量分析(MS)又はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって混合物を分析するなど、タンパク質分解感受性アッセイの変化を検出することによってアッセイすることができる。
[0015] 好ましい実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質がSARS-CoV-2開始タンパク質に類似する立体構造を有するかどうかを決定することは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質とSARS-CoV-2開始タンパク質の両方における3D立体構造エピトープ(多くの場合、不連続エピトープ)に結合する交差反応性抗体によって測定することができる。抗体結合を測定する方法には、免疫沈降アッセイ、表面プラズマ共鳴、等温滴定熱量測定、斜入射反射差(OI-RD)、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及び/又はプロテインA免疫アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
[0016] さらに好ましい実施態様では、交差反応性を測定するための試験は、結合アッセイによるものである。さらに好ましい実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に結合する抗体(交差反応性抗体を含む)は、10-9M以下、10-8M以下、10-7M以下、及び/又は10-6M以下の解離定数(KD)を有する。
[0017] 好ましい実施態様では、SARS-CoV-2開始タンパク質は、表2に列挙された以下のSARS-CoV-2タンパク質から選択され、以下の位置の1つ又は複数に好ましい変異を有する:
配列番号1
MALNSGSPPAIGPYYENHGYQPENPYPAQPTVVPTVYEVHPAQYYPSPVPQYAPRVLTQASNPVVCTQPKSPSGTVCTSKTKKALCITLTLGTFLVGAALAAGLLWKFMGSKCSNSGIECDSSGTCINPSNWCDGVSHCPGGEDENRCVRLYGPNFILQVYSSQRKSWHPVCQDDWNENYGRAACRDMGYKNNFYSSQGIVDDSGSTSFMKLNTSAGNVDIYKKLYHSDACSSKAVVSLRCIACGVNLNSSRQSRIVGGESALPGAWPWQVSLHVQNVHVCGGSIITPEWIVTAAHCVEKPLNNPWHWTAFAGILRQSFMFYGAGYQVEKVISHPNYDSKTKNNDIALMKLQKPLTFNDLVKPVCLPNPGMMLQPEQLCWISGWGATEEKGKTSEVLNAAKVLLIETQRCNSRYVYDNLITPAMICAGFLQGNVDSCQGDSGGPLVTSKNNIWWLIGDTSWGSGCAKAYRPGVYGNVMVFTDWIYRQMRADG
配列番号2
MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACVVCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVETIRASVCAPCHASCATCQGPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQSSRESPPQQQPPRLPPEVEAGQRLRAGLLPSHLPEVVAGLSCAFIVLVFVTVFLVLQLRSGFSFRGVKVYTMDRGLISYKGLPPEAWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSAL
配列番号3
MAAFSEMGVMPEIAQAVEEMDWLLPTDIQAESIPLILGGGDVLMAAETGSGKTGAFSIPVIQIVYETLKDQQEGKKGKTTIKTGASVLNKWQMNPYDRGSAFAIGSDGLCCQSREVKEWHGCRATKGLMKGKHYYEVSCHDQGLCRVGWSTMQASLDLGTDKFGFGFGGTGKKSHNKQFDNYGEEFTMHDTIGCYLDIDKGHVKFSKNGKDLGLAFEIPPHMKNQALFPACVLKNAELKFNFGEEEFKFPPKDGFVALSKAPDGYIVKSQHSGNAQVTQTKFLPNAPKALIVEPSRELAEQTLNNIKQFKKYIDNPKLRELLIIGGVAARDQLSVLENGVDIVVGTPGRLDDLVSTGKLNLSQVRFLVLDEADGLLSQGYSDFINRMHNQIPQVTSDGKRLQVIVCSATLHSFDVKKLSEKIMHFPTWVDLKGEDSVPDTVHHVVVPVNPKTDRLWERLGKSHIRTDDVHAKDNTRPGANSPEMWSEAIKILKGEYAVRAIKEHKMDQAIIFCRTKIDCDNLEQYFIQQGGGPDKKGHQFSCVCLHGDRKPHERKQNLERFKKGDVRFLICTDVAARGIDIHGVPYVINVTLPDEKQNYVHRIGRVGRAERMGLAISLVATEKEKVWYHVCSSRGKGCYNTRLKEDGGCTIWYNEMQLLSEIEEHLNCTISQVEPDIKVPVDEFDGKVTYGQKRAAGGGSYKGHVDILAPTVQELAALEKEAQTSFLHLGYLPNQLFRTF
配列番号4
MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVSIWLIVFGVVMGVIVVGIVILIFTGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF
配列番号5
MDNKKRLAYAIIQFLHDQLRHGGLSSDAQESLEVAIQCLETAFGVTVEDSDLALPQTLPEIFEAAATGKEMPQDLRSPARTPPSEEDSAEAERLKTEGNEQMKVENFEAAVHFYGKAIELNPANAVYFCNRAAAYSKLGNYAGAVQDCERAICIDPAYSKAYGRMGLALSSLNKHVEAVAYYKKALELDPDNETYKSNLKIAELKLREAPSPTGGVGSFDIAGLLNNPGFMSMASNLMNNPQIQQLMSGMISGGNNPLGTPGTSPSQNDLASLIQAGQQFAQQMQQQNPELIEQLRSQIRSRTPSASNDDQQE
配列番号6
MAAKVFESIGKFGLALAVAGGVVNSALYNVDAGHRAVIFDRFRGVQDIVVGEGTHFLIPWVQKPIIFDCRSRPRNVPVITGSKDLQNVNITLRILFRPVASQLPRIFTSIGEDYDERVLPSITTEILKSVVARFDAGELITQRELVSRQVSDDLTERAATFGLILDDVSLTHLTFGKEFTEAVEAKQVAQQEAERARFVVEKAEQQKKAAIISAEGDSKAAELIANSLATAGDGLIELRKLEAAEDIAYQLSRSRNITYLPAGQSVLLQLPQ
配列番号7
MSTNENANTPAARLHRFKNKGKDSTEMRRRRIEVNVELRKAKKDDQMLKRRNVSSFPDDATSPLQENRNNQGTVNWSVDDIVKGINSSNVENQLQATQAARKLLSREKQPPIDNIIRAGLIPKFVSFLGRTDCSPIQFESAWALTNIASGTSEQTKAVVDGGAIPAFISLLASPHAHISEQAVWALGNIAGDGSVFRDLVIKYGAVDPLLALLAVPDMSSLACGYLRNLTWTLSNLCRNKNPAPPIDAVEQILPTLVRLLHHDDPEVLADTCWAISYLTDGPNERIGMVVKTGVVPQLVKLLGASELPIVTPALRAIGNIVTGTDEQTQVVIDAGALAVFPSLLTNPKTNIQKEATWTMSNITAGRQDQIQQVVNHGLVPFLVSVLSKADFKTQKEAVWAVTNYTSGGTVEQIVYLVHCGIIEPLMNLLTAKDTKIILVILDAISNIFQAAEKLGETEKLSIMIEECGGLDKIEALQNHENESVYKASLSLIEKYFSVEEEEDQNVVPETTSEGYTFQVQDGAPGTFNF
配列番号8
MASTSYDYCRVPMEDGDKRCKLLLGIGILVLLIIVILGVPLIIFTIKANSEACRDGLRAVMECRNVTHLLQQELTEAQKGFQDVEAQAATCNHTVMALMASLDAEKAQGQKKVEELEGEITTLNHKLQDASAEVERLRRENQVLSVRIADKKYYPSSQDSSSAAAPQLLIVLLGLSALLQ
配列番号9
MTTSHMNGHVTEESDSEVKNVDLASPEEHQKHREMAVDCPGDLGTRMMPIRRSAQLERIRQQQEDMRRRREEEGKKQELDLNSSMRLKKLAQIPPKTGIDNPMFDTEEGIVLESPHYAVKILEIEDLFSSLKHIQHTLVDSQSQEDISLLLQLVQNKDFQNAFKIHNAITVHMNKASPPFPLISNAQDLAQEVQTVLKPVHHKEGQELTALLNTPHIQALLLAHDKVAEQEMQLEPITDERVYESIGQYGGETVKIVRIEKARDIPLGATVRNEMDSVIISRIVKGGAAEKSGLLHEGDEVLEINGIEIRGKDVNEVFDLLSDMHGTLTFVLIPSQQIKPPPAKETVIHVKAHFDYDPSDDPYVPCRELGLSFQKGDILHVISQEDPNWWQAYREGDEDNQPLAGLVPGKSFQQQREAMKQTIEEDKEPEKSGKLWCAKKNKKKRKKVLYNANKNDDYDNEEILTYEEMSLYHQPANRKRPIILIGPQNCGQNELRQRLMNKEKDRFASAVPHTTRSRRDQEVAGRDYHFVSRQAFEADIAAGKFIEHGEFEKNLYGTSIDSVRQVINSGKICLLSLRTQSLKTLRNSDLKPYIIFIAPPSQERLRALLAKEGKNPKPEELREIIEKTREMEQNNGHYFDTAIVNSDLDKAYQELLRLINKLDTEPQWVPSTWLR
配列番号10
MAQNLKDLAGRLPAGPRGMGTALKLLLGAGAVAYGVRESVFTVEGGHRAIFFNRIGGVQQDTILAEGLHFRIPWFQYPIIYDIRARPRKISSPTGSKDLQMVNISLRVLSRPNAQELPSMYQRLGLDYEERVLPSIVNEVLKSVVAKFNASQLITQRAQVSLLIRRELTERAKDFSLILDDVAITELSFSREYTAAVEAKQVAQQEAQRAQFLVEKAKQEQRQKIVQAEGEAEAAKMLGEALSKNPGYIKLRKIRAAQNISKTIATSQNRIYLTADNLVLNLQDESFTRGSDSLIKGKK
配列番号11
MESLVLGVNEKTHVQLSLPVLQVRDVLVRGFGDSVEEALSEAREHLKNGTCGLVELEKGVLPQLEQPYVFIKRSDALSTNHGHKVVELVAEMDGIQYGRSGITLGVLVPHVGETPIAYRNVLLRKNGNKGAGGHSYGIDLKSYDLGDELGTDPIEDYEQNWNTKHGSGALRELTRELNGGAVTRYVDNNFCGPDGYPLDCIKDFLARAGKSMCTLSEQLDYIESKRGVYCCRDHEHEIAWFTERSDKSYEHQTPFEIKSAKKFDTFKGECPKFVFPLNSKVKVIQPRVEKKKTEGFMGRIRSVYPVASPQECNNMHLSTLMKCNHCDEVSWQTCDFLKATCEHCGTENLVIEGPTTCGYLPTNAVVKMPCPACQDPEIGPEHSVADYHNHSNIETRLRKGGRTRCFGGCVFAYVGCYNKRAYWVPRASADIGSGHTGITGDNVETLNEDLLEILSRERVNINIVGDFHLNEEVAIILASFSASTSAFIDTIKSLDYKSFKTIVESCGNYKVTKGKPVKGAWNIGQQRSVLTPLCGFPSQAAGVIRSIFARTLDAANHSIPDLQRAAVTILDGISEQSLRLVDAMVYTSDLLTNSVIIMAYVTGGLVQQTSQWLSNLLGTTVEKLRPIFEWIEAKLSAGVEFLKDAWEILKFLITGVFDIVKGQIQVASDNIKDCVKCFIDVVNKALEMCIDQVTIAGAKLRSLNLGEVFIAQSKGLYRQCIRGKEQLQLLMPLKAPKEVTFLEGDSHDTVLTSEEVVLKNGELEALETPVDSFTNGAIVGTPVCVNGLMLLEIKDKEQYCALSPGLLATNNVFRLKGGAPIKGVTFGEDTVWEVQGYKNVRITFELDERVDKVLNEKCSVYTVESGTEVTEFACVVAEAVVKTLQPVSDLLTNMGIDLDEWSVATFYLFDDAGEENFSSRMYCSFYPPDEEEEDDAECEEEEIDETCEHEYGTEDDYQGLPLEFGASAETVRVEEEEEEDWLDDTTEQSEIEPEPEPTPEEPVNQFTGYLKLTDNVAIKCVDIVKEAQSANPMVIVNAANIHLKHGGGVAGALNKATNGAMQKESDDYIKLNGPLTVGGSCLLSGHNLAKKCLHVVGPNLNAGEDIQLLKAAYENFNSQDILLAPLLSAGIFGAKPLQSLQVCVQTVRTQVYIAVNDKALYEQVVMDYLDNLKPRVEAPKQEEPPNTEDSKTEEKSVVQKPVDVKPKIKACIDEVTTTLEETKFLTNKLLLFADINGKLYHDSQNMLRGEDMSFLEKDAPYMVGDVITSGDITCVVIPSKKAGGTTEMLSRALKKVPVDEYITTYPGQGCAGYTLEEAKTALKKCKSAFYVLPSEAPNAKEEILGTVSWNLREMLAHAEETRKLMPICMDVRAIMATIQRKYKGIKIQEGIVDYGVRFFFYTSKEPVASIITKLNSLNEPLVTMPIGYVTHGFNLEEAARCMRSLKAPAVVSVSSPDAVTTYNGYLTSSSKTSEEHFVETVSLAGSYRDWSYSGQRTELGVEFLKRGDKIVYHTLESPVEFHLDGEVLSLDKLKSLLSLREVKTIKVFTTVDNTNLHTQLVDMSMTYGQQFGPTYLDGADVTKIKPHVNHEGKTFFVLPSDDTLRSEAFEYYHTLDESFLGRYMSALNHTKKWKFPQVGGLTSIKWADNNCYLSSVLLALQQLEVKFNAPALQEAYYRARAGDAANFCALILAYSNKTVGELGDVRETMTHLLQHANLESAKRVLNVVCKHCGQKTTTLTGVEAVMYMGTLSYDNLKTGVSIPCVCGRDATQYLVQQESSFVMMSAPPAEYKLQQGTFLCANEYTGNYQCGHYTHITAKETLYRIDGAHLTKMSEYKGPVTDVFYKETSYTTTIKPVSYKLDGVTYTEIEPKLDGYYKKDNAYYTEQPIDLVPTQPLPNASFDNFKLTCSNTKFADDLNQMTGFTKPASRELSVTFFPDLNGDVVAIDYRHYSASFKKGAKLLHKPIVWHINQATTKTTFKPNTWCLRCLWSTKPVDTSNSFEVLAVEDTQGMDNLACESQQPTSEEVVENPTIQKEVIECDVKTTEVVGNVILKPSDEGVKVTQELGHEDLMAAYVENTSITIKKPNELSLALGLKTIATHGIAAINSVPWSKILAYVKPFLGQAAITTSNCAKRLAQRVFNNYMPYVFTLLFQLCTFTKSTNSRIRASLPTTIAKNSVKSVAKLCLDAGINYVKSPKFSKLFTIAMWLLLLSICLGSLICVTAAFGVLLSNFGAPSYCNGVRELYLNSSNVTTMDFCEGSFPCSICLSGLDSLDSYPALETIQVTISSYKLDLTILGLAAEWVLAYMLFTKFFYLLGLSAIMQVFFGYFASHFISNSWLMWFIISIVQMAPVSAMVRMYIFFASFYYIWKSYVHIMDGCTSSTCMMCYKRNRATRVECTTIVNGMKRSFYVYANGGRGFCKTHNWNCLNCDTFCTGSTFISDEVARDLSLQFKRPINPTDQSSYIVDSVAVKNGALHLYFDKAGQKTYERHPLSHFVNLDNLRANNTKGSLPINVIVFDGKSKCDESASKSASVYYSQLMCQPILLLDQALVSDVGDSTEVSVKMFDAYVDTFSATFSVPMEKLKALVATAHSELAKGVALDGVLSTFVSAARQGVVDTDVDTKDVIECLKLSHHSDLEVTGDSCNNFMLTYNKVENMTPRDLGACIDCNARHINAQVAKSHNVSLIWNVKDYMSLSEQLRKQIRSAAKKNNIPFRLTCATTRQVVNVITTKISLKGGKIVSTCFKLMLKATLLCVLAALVCYIVMPVHTLSIHDGYTNEIIGYKAIQDGVTRDIISTDDCFANKHAGFDAWFSQRGGSYKNDKSCPVVAAIITREIGFIVPGLPGTVLRAINGDFLHFLPRVFSAVGNICYTPSKLIEYSDFATSACVLAAECTIFKDAMGKPVPYCYDTNLLEGSISYSELRPDTRYVLMDGSIIQFPNTYLEGSVRVVTTFDAEYCRHGTCERSEVGICLSTSGRWVLNNEHYRALSGVFCGVDAMNLIANIFTPLVQPVGALDVSASVVAGGIIAILVTCAAYYFMKFRRVFGEYNHVVAANALLFLMSFTILCLVPAYSFLPGVYSVFYLYLTFYFTNDVSFLAHLQWFAMFSPIVPFWITAIYVFCISLKHCHWFFNNYLRKRVMFNGVTFSTFEEAALCTFLLNKEMYLKLRSETLLPLTQYNRYLALYNKYKYFSGALDTTSYREAACCHLAKALNDFSNSGADVLYQPPQTSITSAVLQSGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDMLNPNYEDLLIRKSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGKFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELLQNGMNGRTILGSTILEDEFTPFDVVRQCSGVTFQGKFKKIVKGTHHWMLLTFLTSLLILVQSTQWSLFFFVYENAFLPFTLGIMAIAACAMLLVKHKHAFLCLFLLPSLATVAYFNMVYMPASWVMRIMTWLELADTSLSGYRLKDCVMYASALVLLILMTARTVYDDAARRVWTLMNVITLVYKVYYGNALDQAISMWALVISVTSNYSGVVTTIMFLARAIVFVCVEYYPLLFITGNTLQCIMLVYCFLGYCCCCYFGLFCLLNRYFRLTLGVYDYLVSTQEFRYMNSQGLLPPKSSIDAFKLNIKLLGIGGKPCIKVATVQSKMSDVKCTSVVLLSVLQQLRVESSSKLWAQCVQLHNDILLAKDTTEAFEKMVSLLSVLLSMQGAVDINRLCEEMLDNRATLQAIASEFSSLPSYAAYATAQEAYEQAVANGDSEVVLKKLKKSLNVAKSEFDRDAAMQRKLEKMADQAMTQMYKQARSEDKRAKVTSAMQTMLFTMLRKLDNDALNNIINNARDGCVPLNIIPLTTAAKLMVVVPDYGTYKNTCDGNTFTYASALWEIQQVVDADSKIVQLSEINMDNSPNLAWPLIVTALRANSAVKLQNNELSPVALRQMSCAAGTTQTACTDDNALAYYNNSKGGRFVLALLSDHQDLKWARFPKSDGTGTIYTELEPPCRFVTDTPKGPKVKYLYFIKGLNNLNRGMVLGSLAATVRLQAGNATEVPANSTVLSFCAFAVDPAKAYKDYLASGGQPITNCVKMLCTHTGTGQAITVTPEANMDQESFGGASCCLYCRCHIDHPNPKGFCDLKGKYVQIPTTCANDPVGFTLRNTVCTVCGMWKGYGCSCDQLREPLMQSADASTFLNGFAV
配列番号12
MESLVLGVNEKTHVQLSLPVLQVRDVLVRGFGDSVEEALSEAREHLKNGTCGLVELEKGVLPQLEQPYVFIKRSDALSTNHGHKVVELVAEMDGIQYGRSGITLGVLVPHVGETPIAYRNVLLRKNGNKGAGGHSYGIDLKSYDLGDELGTDPIEDYEQNWNTKHGSGALRELTRELNGGAVTRYVDNNFCGPDGYPLDCIKDFLARAGKSMCTLSEQLDYIESKRGVYCCRDHEHEIAWFTERSDKSYEHQTPFEIKSAKKFDTFKGECPKFVFPLNSKVKVIQPRVEKKKTEGFMGRIRSVYPVASPQECNNMHLSTLMKCNHCDEVSWQTCDFLKATCEHCGTENLVIEGPTTCGYLPTNAVVKMPCPACQDPEIGPEHSVADYHNHSNIETRLRKGGRTRCFGGCVFAYVGCYNKRAYWVPRASADIGSGHTGITGDNVETLNEDLLEILSRERVNINIVGDFHLNEEVAIILASFSASTSAFIDTIKSLDYKSFKTIVESCGNYKVTKGKPVKGAWNIGQQRSVLTPLCGFPSQAAGVIRSIFARTLDAANHSIPDLQRAAVTILDGISEQSLRLVDAMVYTSDLLTNSVIIMAYVTGGLVQQTSQWLSNLLGTTVEKLRPIFEWIEAKLSAGVEFLKDAWEILKFLITGVFDIVKGQIQVASDNIKDCVKCFIDVVNKALEMCIDQVTIAGAKLRSLNLGEVFIAQSKGLYRQCIRGKEQLQLLMPLKAPKEVTFLEGDSHDTVLTSEEVVLKNGELEALETPVDSFTNGAIVGTPVCVNGLMLLEIKDKEQYCALSPGLLATNNVFRLKGGAPIKGVTFGEDTVWEVQGYKNVRITFELDERVDKVLNEKCSVYTVESGTEVTEFACVVAEAVVKTLQPVSDLLTNMGIDLDEWSVATFYLFDDAGEENFSSRMYCSFYPPDEEEEDDAECEEEEIDETCEHEYGTEDDYQGLPLEFGASAETVRVEEEEEEDWLDDTTEQSEIEPEPEPTPEEPVNQFTGYLKLTDNVAIKCVDIVKEAQSANPMVIVNAANIHLKHGGGVAGALNKATNGAMQKESDDYIKLNGPLTVGGSCLLSGHNLAKKCLHVVGPNLNAGEDIQLLKAAYENFNSQDILLAPLLSAGIFGAKPLQSLQVCVQTVRTQVYIAVNDKALYEQVVMDYLDNLKPRVEAPKQEEPPNTEDSKTEEKSVVQKPVDVKPKIKACIDEVTTTLEETKFLTNKLLLFADINGKLYHDSQNMLRGEDMSFLEKDAPYMVGDVITSGDITCVVIPSKKAGGTTEMLSRALKKVPVDEYITTYPGQGCAGYTLEEAKTALKKCKSAFYVLPSEAPNAKEEILGTVSWNLREMLAHAEETRKLMPICMDVRAIMATIQRKYKGIKIQEGIVDYGVRFFFYTSKEPVASIITKLNSLNEPLVTMPIGYVTHGFNLEEAARCMRSLKAPAVVSVSSPDAVTTYNGYLTSSSKTSEEHFVETVSLAGSYRDWSYSGQRTELGVEFLKRGDKIVYHTLESPVEFHLDGEVLSLDKLKSLLSLREVKTIKVFTTVDNTNLHTQLVDMSMTYGQQFGPTYLDGADVTKIKPHVNHEGKTFFVLPSDDTLRSEAFEYYHTLDESFLGRYMSALNHTKKWKFPQVGGLTSIKWADNNCYLSSVLLALQQLEVKFNAPALQEAYYRARAGDAANFCALILAYSNKTVGELGDVRETMTHLLQHANLESAKRVLNVVCKHCGQKTTTLTGVEAVMYMGTLSYDNLKTGVSIPCVCGRDATQYLVQQESSFVMMSAPPAEYKLQQGTFLCANEYTGNYQCGHYTHITAKETLYRIDGAHLTKMSEYKGPVTDVFYKETSYTTTIKPVSYKLDGVTYTEIEPKLDGYYKKDNAYYTEQPIDLVPTQPLPNASFDNFKLTCSNTKFADDLNQMTGFTKPASRELSVTFFPDLNGDVVAIDYRHYSASFKKGAKLLHKPIVWHINQATTKTTFKPNTWCLRCLWSTKPVDTSNSFEVLAVEDTQGMDNLACESQQPTSEEVVENPTIQKEVIECDVKTTEVVGNVILKPSDEGVKVTQELGHEDLMAAYVENTSITIKKPNELSLALGLKTIATHGIAAINSVPWSKILAYVKPFLGQAAITTSNCAKRLAQRVFNNYMPYVFTLLFQLCTFTKSTNSRIRASLPTTIAKNSVKSVAKLCLDAGINYVKSPKFSKLFTIAMWLLLLSICLGSLICVTAAFGVLLSNFGAPSYCNGVRELYLNSSNVTTMDFCEGSFPCSICLSGLDSLDSYPALETIQVTISSYKLDLTILGLAAEWVLAYMLFTKFFYLLGLSAIMQVFFGYFASHFISNSWLMWFIISIVQMAPVSAMVRMYIFFASFYYIWKSYVHIMDGCTSSTCMMCYKRNRATRVECTTIVNGMKRSFYVYANGGRGFCKTHNWNCLNCDTFCTGSTFISDEVARDLSLQFKRPINPTDQSSYIVDSVAVKNGALHLYFDKAGQKTYERHPLSHFVNLDNLRANNTKGSLPINVIVFDGKSKCDESASKSASVYYSQLMCQPILLLDQALVSDVGDSTEVSVKMFDAYVDTFSATFSVPMEKLKALVATAHSELAKGVALDGVLSTFVSAARQGVVDTDVDTKDVIECLKLSHHSDLEVTGDSCNNFMLTYNKVENMTPRDLGACIDCNARHINAQVAKSHNVSLIWNVKDYMSLSEQLRKQIRSAAKKNNIPFRLTCATTRQVVNVITTKISLKGGKIVSTCFKLMLKATLLCVLAALVCYIVMPVHTLSIHDGYTNEIIGYKAIQDGVTRDIISTDDCFANKHAGFDAWFSQRGGSYKNDKSCPVVAAIITREIGFIVPGLPGTVLRAINGDFLHFLPRVFSAVGNICYTPSKLIEYSDFATSACVLAAECTIFKDAMGKPVPYCYDTNLLEGSISYSELRPDTRYVLMDGSIIQFPNTYLEGSVRVVTTFDAEYCRHGTCERSEVGICLSTSGRWVLNNEHYRALSGVFCGVDAMNLIANIFTPLVQPVGALDVSASVVAGGIIAILVTCAAYYFMKFRRVFGEYNHVVAANALLFLMSFTILCLVPAYSFLPGVYSVFYLYLTFYFTNDVSFLAHLQWFAMFSPIVPFWITAIYVFCISLKHCHWFFNNYLRKRVMFNGVTFSTFEEAALCTFLLNKEMYLKLRSETLLPLTQYNRYLALYNKYKYFSGALDTTSYREAACCHLAKALNDFSNSGADVLYQPPQTSITSAVLQSGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDMLNPNYEDLLIRKSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGKFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELLQNGMNGRTILGSTILEDEFTPFDVVRQCSGVTFQGKFKKIVKGTHHWMLLTFLTSLLILVQSTQWSLFFFVYENAFLPFTLGIMAIAACAMLLVKHKHAFLCLFLLPSLATVAYFNMVYMPASWVMRIMTWLELADTSLSGYRLKDCVMYASALVLLILMTARTVYDDAARRVWTLMNVITLVYKVYYGNALDQAISMWALVISVTSNYSGVVTTIMFLARAIVFVCVEYYPLLFITGNTLQCIMLVYCFLGYCCCCYFGLFCLLNRYFRLTLGVYDYLVSTQEFRYMNSQGLLPPKSSIDAFKLNIKLLGIGGKPCIKVATVQSKMSDVKCTSVVLLSVLQQLRVESSSKLWAQCVQLHNDILLAKDTTEAFEKMVSLLSVLLSMQGAVDINRLCEEMLDNRATLQAIASEFSSLPSYAAYATAQEAYEQAVANGDSEVVLKKLKKSLNVAKSEFDRDAAMQRKLEKMADQAMTQMYKQARSEDKRAKVTSAMQTMLFTMLRKLDNDALNNIINNARDGCVPLNIIPLTTAAKLMVVVPDYGTYKNTCDGNTFTYASALWEIQQVVDADSKIVQLSEINMDNSPNLAWPLIVTALRANSAVKLQNNELSPVALRQMSCAAGTTQTACTDDNALAYYNNSKGGRFVLALLSDHQDLKWARFPKSDGTGTIYTELEPPCRFVTDTPKGPKVKYLYFIKGLNNLNRGMVLGSLAATVRLQAGNATEVPANSTVLSFCAFAVDPAKAYKDYLASGGQPITNCVKMLCTHTGTGQAITVTPEANMDQESFGGASCCLYCRCHIDHPNPKGFCDLKGKYVQIPTTCANDPVGFTLRNTVCTVCGMWKGYGCSCDQLREPLMQSADASTFLNRVCGVSAARLTPCGTGTSTDVVYRAFDIYNEKVAGFAKFLKTNCCRFQEKDEEGNLLDSYFVVKRHTMSNYQHEETIYNLVKDCPAVAVHDFFKFRVDGDMVPHISRQRLTKYTMADLVYALRHFDEGNCDTLKEILVTYNCCDDDYFNKKDWYDFVENPDILRVYANLGERVRQSLLKTVQFCDAMRDAGIVGVLTLDNQDLNGNWYDFGDFVQVAPGCGVPIVDSYYSLLMPILTLTRALAAESHMDADLAKPLIKWDLLKYDFTEERLCLFDRYFKYWDQTYHPNCINCLDDRCILHCANFNVLFSTVFPPTSFGPLVRKIFVDGVPFVVSTGYHFRELGVVHNQDVNLHSSRLSFKELLVYAADPAMHAASGNLLLDKRTTCFSVAALTNNVAFQTVKPGNFNKDFYDFAVSKGFFKEGSSVELKHFFFAQDGNAAISDYDYYRYNLPTMCDIRQLLFVVEVVDKYFDCYDGGCINANQVIVNNLDKSAGFPFNKWGKARLYYDSMSYEDQDALFAYTKRNVIPTITQMNLKYAISAKNRARTVAGVSICSTMTNRQFHQKLLKSIAATRGATVVIGTSKFYGGWHNMLKTVYSDVETPHLMGWDYPKCDRAMPNMLR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配列番号13
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配列番号14
MESLVPGFNEKTHVQLSLPVLQVRDVLVRGFGDSVEEVLSEARQHLKDGTCGLVEVEKGVLPQLEQPYVFIKRSDARTAPHGHVMVELVAELEGIQYGRSGETLGVLVPHVGEIPVAYRKVLLRKNGNKGAGGHSYGADLKSFDLGDELGTDPYEDFQENWNTKHSSGVTRELMRELNGGAYTRYVDNNFCGPDGYPLECIKDLLARAGKASCTLSEQLDFIDTKRGVYCCREHEHEIAWYTERSEKSYELQTPFEIKLAKKFDTFNGECPNFVFPLNSIIKTIQPRVEKKKLDGFMGRIRSVYPVASPNECNQMCLSTLMKCDHCGETSWQTGDFVKATCEFCGTENLTKEGATTCGYLPQNAVVKIYCPACHNSEVGPEHSLAEYHNESGLKTILRKGGRTIAFGGCVFSYVGCHNKCAYWVPRASANIGCNHTGVVGEGSEGLNDNLLEILQKEKVNINIVGDFKLNEEIAIILASFSASTSAFVETVKGLDYKAFKQIVESCGNFKVTKGKAKKGAWNIGEQKSILSPLYAFASEAARVVRSIFSRTLETAQNSVRVLQKAAITILDGISQYSLRLIDAMMFTSDLATNNLVVMAYITGGVVQLTSQWLTNIFGTVYEKLKPVLDWLEEKFKEGVEFLRDGWEIVKFISTCACEIVGGQIVTCAKEIKESVQTFFKLVNKFLALCADSIIIGGAKLKALNLGETFVTHSKGLYRKCVKSREETGLLMPLKAPKEIIFLEGETLPTEVLTEEVVLKTGDLQPLEQPTSEAVEAPLVGTPVCINGLMLLEIKDTEKYCALAPNMMVTNNTFTLKGGAPTKVTFGDDTVIEVQGYKSVNITFELDERIDKVLNEKCSAYTVELGTEVNEFACVVADAVIKTLQPVSELLTPLGIDLDEWSMATYYLFDESGEFKLASHMYCSFYPPDEDEEEGDCEEEEFEPSTQYEYGTEDDYQGKPLEFGATSAALQPEEEQEEDWLDDDSQQTVGQQDGSEDNQTTTIQTIVEVQPQLEMELTPVVQTIEVNSFSGYLKLTDNVYIKNADIVEEAKKVKPTVVVNAANVYLKHGGGVAGALNKATNNAMQVESDDYIATNGPLKVGGSCVLSGHNLAKHCLHVVGPNVNKGEDIQLLKSAYENFNQHEVLLAPLLSAGIFGADPIHSLRVCVDTVRTNVYLAVFDKNLYDKLVSSFLEMKSEKQVEQKIAEIPKEEVKPFITESKPSVEQRKQDDKKIKACVEEVTTTLEETKFLTENLLLYIDINGNLHPDSATLVSDIDITFLKKDAPYIVGDVVQEGVLTAVVIPTKKAGGTTEMLAKALRKVPTDNYITTYPGQGLNGYTVEEAKTVLKKCKSAFYILPSIISNEKQEILGTVSWNLREMLAHAEETRKLMPVCVETKAIVSTIQRKYKGIKIQEGVVDYGARFYFYTSKTTVASLINTLNDLNETLVTMPLGYVTHGLNLEEAARYMRSLKVPATVSVSSPDAVTAYNGYLTSSSKTPEEHFIETISLAGSYKDWSYSGQSTQLGIEFLKRGDKSVYYTSNPTTFHLDGEVITFDNLKTLLSLREVRTIKVFTTVDNINLHTQVVDMSMTYGQQFGPTYLDGADVTKIKPHNSHEGKTFYVLPNDDTLRVEAFEYYHTTDPSFLGRYMSALNHTKKWKYPQVNGLTSIKWADNNCYLATALLTLQQIELKFNPPALQDAYYRARAGEAANFCALILAYCNKTVGELGDVRETMSYLFQHANLDSCKRVLNVVCKTCGQQQTTLKGVEAVMYMGTLSYEQFKKGVQIPCTCGKQATKYLVQQESPFVMMSAPPAQYELKHGTFTCASEYTGNYQCGHYKHITSKETLYCIDGALLTKSSEYKGPITDVFYKENSYTTTIKPVTYKLDGVVCTEIDPKLDNYYKKDNSYFTEQPIDLVPNQPYPNASFDNFKFVCDNIKFADDLNQLTGYKKPASRELKVTFFPDLNGDVVAIDYKHYTPSFKKGAKLLHKPIVWHVNNATNKATYKPNTWCIRCLWSTKPVETSNSFDVLKSEDAQGMDNLACEDLKPVSEEVVENPTIQKDVLECNVKTTEVVGDIILKPANNSLKITEEVGHTDLMAAYVDNSSLTIKKPNELSRVLGLKTLATHGLAAVNSVPWDTIANYAKPFLNKVVSTTTNIVTRCLNRVCTNYMPYFFTLLLQLCTFTRSTNSRIKASMPTTIAKNTVKSVGKFCLEASFNYLKSPNFSKLINIIIWFLLLSVCLGSLIYSTAALGVLMSNLGMPSYCTGYREGYLNSTNVTIATYCTGSIPCSVCLSGLDSLDTYPSLETIQITISSFKWDLTAFGLVAEWFLAYILFTRFFYVLGLAAIMQLFFSYFAVHFISNSWLMWLIINLVQMAPISAMVRMYIFFASFYYVWKSYVHVVDGCNSSTCMMCYKRNRATRVECTTIVNGVRRSFYVYANGGKGFCKLHNWNCVNCDTFCAGSTFISDEVARDLSLQFKRPINPTDQSSYIVDSVTVKNGSIHLYFDKAGQKTYERHSLSHFVNLDNLRANNTKGSLPINVIVFDGKSKCEESSAKSASVYYSQLMCQPILLLDQALVSDVGDSAEVAVKMFDAYVNTFSSTFNVPMEKLKTLVATAEAELAKNVSLDNVLSTFISAARQGFVDSDVETKDVVECLKLSHQSDIEVTGDSCNNYMLTYNKVENMTPRDLGACIDCSARHINAQVAKSHNIALIWNVKDFMSLSEQLRKQIRSAAKKNNLPFKLTCATTRQVVNVVTTKIALKGGKIVNNWLKQLIKVTLVFLFVAAIFYLITPVHVMSKHTDFSSEIIGYKAIDGGVTRDIASTDTCFANKHADFDTWFSQRGGSYTNDKACPLIAAVITREVGFVVPGLPGTILRTTNGDFLHFLPRVFSAVGNICYTPSKLIEYTDFATSACVLAAECTIFKDASGKPVPYCYDTNVLEGSVAYESLRPDTRYVLMDGSIIQFPNTYLEGSVRVVTTFDSEYCRHGTCERSEAGVCVSTSGRWVLNNDYYRSLPGVFCGVDAVNLLTNMFTPLIQPIGALDISASIVAGGIVAIVVTCLAYYFMRFRRAFGEYSHVVAFNTLLFLMSFTVLCLTPVYSFLPGVYSVIYLYLTFYLTNDVSFLAHIQWMVMFTPLVPFWITIAYIICISTKHFYWFFSNYLKRRVVFNGVSFSTFEEAALCTFLLNKEMYLKLRSDVLLPLTQYNRYLALYNKYKYFSGAMDTTSYREAACCHLAKALNDFSNSGSDVLYQPPQTSITSAVLQSGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDVVYCPRHVICTSEDMLNPNYEDLLIRKSNHNFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCVLKLKVDTANPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNFTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGNFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITVNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCASLKELLQNGMNGRTILGSALLEDEFTPFDVVRQCSGVTFQSAVKRTIKGTHHWLLLTILTSLLVLVQSTQWSLFFFLYENAFLPFAMGIIAMSAFAMMFVKHKHAFLCLFLLPSLATVAYFNMVYMPASWVMRIMTWLDMVDTSLSGFKLKDCVMYASAVVLLILMTARTVYDDGARRVWTLMNVLTLVYKVYYGNALDQAISMWALIISVTSNYSGVVTTVMFLARGIVFMCVEYCPIFFITGNTLQCIMLVYCFLGYFCTCYFGLFCLLNRYFRLTLGVYDYLVSTQEFRYMNSQGLLPPKNSIDAFKLNIKLLGVGGKPCIKVATVQSKMSDVKCTSVVLLSVLQQLRVESSSKLWAQCVQLHNDILLAKDTTEAFEKMVSLLSVLLSMQGAVDINKLCEEMLDNRATLQAIASEFSSLPSYAAFATAQEAYEQAVANGDSEVVLKKLKKSLNVAKSEFDRDAAMQRKLEKMADQAMTQMYKQARSEDKRAKVTSAMQTMLFTMLRKLDNDALNNIINNARDGCVPLNIIPLTTAAKLMVVIPDYNTYKNTCDGTTFTYASALWEIQQVVDADSKIVQLSEISMDNSPNLAWPLIVTALRANSAVKLQNNELSPVALRQMSCAAGTTQTACTDDNALAYYNTTKGGRFVLALLSDLQDLKWARFPKSDGTGTIYTELEPPCRFVTDTPKGPKVKYLYFIKGLNNLNRGMVLGSLAATVRLQAGNATEVPANSTVLSFCAFAVDAAKAYKDYLASGGQPITNCVKMLCTHTGTGQAITVTPEANMDQESFGGASCCLYCRCHIDHPNPKGFCDLKGKYVQIPTTCANDPVGFTLKNTVCTVCGMWKGYGCSCDQLREPMLQSADAQSFLNRVCGVSAARLTPCGTGTSTDVVYRAFDIYNDKVAGFAKFLKTNCCRFQEKDEDDNLIDSYFVVKRHTFSNYQHEETIYNLLKDCPAVAKHDFFKFRIDGDMVPHISRQRLTKYTMADLVYALRHFDEGNCDTLKEILVTYNCCDDDYFNKKDWYDFVENPDILRVYANLGERVRQALLKTVQFCDAMRNAGIVGVLTLDNQDLNGNWYDFGDFIQTTPGSGVPVVDSYYSLLMPILTLTRALTAESHVDTDLTKPYIKWDLLKYDFTEERLKLFDRYFKYWDQTYHPNCVNCLDDRCILHCANFNVLFSTVFPPTSFGPLVRKIFVDGVPFVVSTGYHFRELGVVHNQDVNLHSSRLSFKELLVYAADPAMHAASGNLLLDKRTTCFSVAALTNNVAFQTVKPGNFNKDFYDFAVSKGFFKEGSSVELKHFFFAQDGNAAISDYDYYRYNLPTMCDIRQLLFVVEVVDKYFDCYDGGCINANQVIVNNLDKSAGFPFNKWGKARLYYDSMSYEDQDALFAYTKRNVIPTITQMNLKYAISAKNRARTVAGVSICSTMTNRQFHQKLLKSIAATRGATVVIGTSKFYGGWHNMLKTVYSDVENPHLMGWDYPKCDRAMPNMLRIMASLVLARKHTTCCSLSHRFYRLANECAQVLSEMVMCGGSLYVKPGGTSSGDATTAYANSVFNICQAVTANVNALLSTDGNKIADKYVRNLQHRLYE
CLYRNRDVDTDFVNEFYAYLRKHFSMMILSDDAVVCFNSTYASQGLVASIKNFKSVLYYQNNVFMSEAKCWTETDLTKGPHEFCSQHTMLVKQGDDYVYLPYPDPSRILGAGCFVDDIVKTDGTLMIERFVSLAIDAYPLTKHPNQEYADVFHLYLQYIRKLHDELTGHMLDMYSVMLTNDNTSRYWEPEFYEAMYTPHTVLQAVGACVLCNSQTSLRCGACIRRPFLCCKCCYDHVISTSHKLVLSVNPYVCNAPGCDVTDVTQLYLGGMSYYCKSHKPPISFPLCANGQVFGLYKNTCVGSDNVTDFNAIATCDWTNAGDYILANTCTERLKLFAAETLKATEETFKLSYGIATVREVLSDRELHLSWEVGKPRPPLNRNYVFTGYRVTKNSKVQIGEYTFEKGDYGDAVVYRGTTTYKLNVGDYFVLTSHTVMPLSAPTLVPQEHYVRITGLYPTLNISDEFSSNVANYQKVGMQKYSTLQGPPGTGKSHFAIGLALYYPSARIVYTACSHAAVDALCEKALKYLPIDKCSRIIPARARVECFDKFKVNSTLEQYVFCTVNALPETTADIVVFDEISMATNYDLSVVNARLRAKHYVYIGDPAQLPAPRTLLTKGTLEPEYFNSVCRLMKTIGPDMFLGTCRRCPAEIVDTVSALVYDNKLKAHKDKSAQCFKMFYKGVITHDVSSAINRPQIGVVREFLTRNPAWRKAVFISPYNSQNAVASKILGLPTQTVDSSQGSEYDYVIFTQTTETAHSCNVNRFNVAITRAKVGILCIMSDRDLYDKLQFTSLEIPRRNVATLQAENVTGLFKDCSKVITGLHPTQAPTHLSVDTKFKTEGLCVDIPGIPKDMTYRRLISMMGFKMNYQVNGYPNMFITREEAIRHVRAWIGFDVEGCHATREAVGTNLPLQLGFSTGVNLVAVPTGYVDTPNNTDFSRVSAKPPPGDQFKHLIPLMYKGLPWNVVRIKIVQMLSDTLKNLSDRVVFVLWAHGFELTSMKYFVKIGPERTCCLCDRRATCFSTASDTYACWHHSIGFDYVYNPFMIDVQQWGFTGNLQSNHDLYCQVHGNAHVASCDAIMTRCLAVHECFVKRVDWTIEYPIIGDELKINAACRKVQHMVVKAALLADKFPVLHDIGNPKAIKCVPQADVEWKFYDAQPCSDKAYKIEELFYSYATHSDKFTDGVCLFWNCNVDRYPANSIVCRFDTRVLSNLNLPGCDGGSLYVNKHAFHTPAFDKSAFVNLKQLPFFYYSDSPCESHGKQVVSDIDYVPLKSATCITRCNLGGAVCRHHANEYRLYLDAYNMMISAGFSLWVYKQFDTYNLWNTFTRLQSLENVAFNVVNKGHFDGQQGEVPVSIINNTVYTKVDGVDVELFENKTTLPVNVAFELWAKRNIKPVPEVKILNNLGVDIAANTVIWDYKRDAPAHISTIGVCSMTDIAKKPTETICAPLTVFFDGRVDGQVDLFRNARNGVLITEGSVKGLQPSVGPKQASLNGVTLIGEAVKTQFNYYKKVDGVVQQLPETYFTQSRNLQEFKPRSQMEIDFLELAMDEFIERYKLEGYAFEHIVYGDFSHSQLGGLHLLIGLAKRFKESPFELEDFIPMDSTVKNYFITDAQTGSSKCVCSVIDLLLDDFVEIIKSQDLSVVSKVVKVTIDYTEISFMLWCKDGHVETFYPKLQSSQAWQPGVAMPNLYKMQRMLLEKCDLQNYGDSATLPKGIMMNVAKYTQLCQYLNTLTLAVPYNMRVIHFGAGSDKGVAPGTAVLRQWLPTGTLLVDSDLNDFVSDADSTLIGDCATVHTANKWDLIISDMYDPKTKNVTKENDSKEGFFTYICGFIQQKLALGGSVAIKITEHSWNADLYKLMGHFAWWTAFVTNVNASSSEAFLIGCNYLGKPREQIDGYVMHANYIFWRNTNPIQLSSYSLFDMSKFPLKLRGTAVMSLKEGQINDMILSLLSKGRLIIRENNRVVISSDVLVNN
配列番号15
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
配列番号16
MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCSFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYVWLGFIAGLIAIVMVTILLCCMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
配列番号17
MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADSTQA
配列番号18
MDLFMRFFTLGSITAQPVKIDNASPASTVHATATIPLQASLPFGWLVIGVAFLAVFQSATKIIALNKRWQLALYKGFQFICNLLLLFVTIYSHLLLVAAGMEAQFLYLYALIYFLQCINACRIIMRCWLCWKCKSKNPLLYDANYFVCWHTHNYDYCIPYNSVTDTIVVTEGDGISTPKLKEDYQIGGYSEDRHSGVKDYVVVHGYFTEVYYQLESTQITTDTGIENATFFIFNKLVKDPPNVQIHTIDGSSGVANPAMDPIYDEPTTTTSVPL
配列番号19
MKIILFLTLIVFTSCELYHYQECVRGTTVLLKEPCPSGTYEGNSPFHPLADNKFALTCTSTHFAFACADGTRHTYQLRARSVSPKLFIRQEEVQQELYSPLFLIVAALVFLILCFTIKRKTE
配列番号20
MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPTVYVYSRVKNLNSSEGVPDLLV
配列番号21
MADNGTITVEELKQLLEQWNLVIGFLFLAWIMLLQFAYSNRNRFLYIIKLVFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWVTGGIAIAMACIVGLMWLSYFVASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLRGTIVTRPLMESELVIGAVIIRGHLRMAGHSLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVGTDSGFAAYNRYRIGNYKLNTDHAGSNDNIALLVQ
配列番号22
MMPTTLFAGTHITMTTVYHITVSQIQLSLLKVTAFQHQNSKKTTKLVVILRIGTQVLKTMSLYMAISPKFTTSLSLHKLLQTLVLKMLHSSSLTSLLKTHRMCKYTQSTALQELLIQQWIQFMMSRRRLLACLCKHKKVSTNLCTHSFRKKQVR
配列番号23
MFHLVDFQVTIAEILIIIMRTFRIAIWNLDVIISSIVRQLFKPLTKKNYSELDDEEPMELDYP
配列番号24
MDLFMRIFTIGTVTLKQGEIKDATPSDFVRATATIPIQASLPFGWLIVGVALLAVFQSASKIITLKKRWQLALSKGVHFVCNLLLLFVTVYSHLLLVAAGLEAPFLYLYALVYFLQSINFVRIIMRLWLCWKCRSKNPLLYDANYFLCWHTNCYDYCIPYNSVTSSIVITSGDGTTSPISEHDYQIGGYTEKWESGVKDCVVLHSYFTSDYYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIYNKIVDEPEEHVQIHTIDGSSGVVNPVMEPIYDEPTTTTSVPL
配列番号25
MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ
配列番号26
MKIILFLALITLATCELYHYQECVRGTTVLLKEPCSSGTYEGNSPFHPLADNKFALTCFSTQFAFACPDGVKHVYQLRARSVSPKLFIRQEEVQELYSPIFLIVAAIVFITLCFTLKRKTE
配列番号27
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
配列番号28
MDPNQTNVVPPALHLVDPQIQLTITRMEDAMGQGQNSADPKVYPIILRLGSQLSLSMARRNLDSLEARAFQSTPIVVQMTKLATTEELPDEFVVVTAK
配列番号29
MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV
配列番号30
MFHLVDFQVTIAEILLIIMRTFKVSIWNLDYIINLIIKNLSKSLTENKYSQLDEEQPMEID
配列番号31
MKFLVFLGIITTVAAFHQECSLQSCTQHQPYVVDDPCPIHFYSKWYIRVGARKSAPLIELCVDEAGSKSPIQYIDIGNYTVSCLPFTINCQEPKLGSLVVRCSFYEDFLEYHDVRVVLDFI
配列番号32
MDPKISEMHPALRLVDPQIQLAVTRMENAVGRDQNNVGPKVYPIILRLGSPLSLNMARKTLNSLEDKAFQLTPIAVQMTKLATTEELPDEFVVVTVK
配列番号33
MNELTLIDFYLCFLAFLLFLVLIMLIIFWFSLEIQDLEEPCTKV
配列番号34
MCLKILVRYNTRGNTYSTAWLCALGKVLPFHRWHTMVQTCTPNVTINCQDPAGGALIARCWYLHEGHQTAAFRDVLVVLNKRTN
配列番号35
MLQSCYNFLKEQHCQKASTQKGAEAAVKPLLVPHHVVATVQEIQLQAAVGELLLLEWLAMAVMLLLLCCCLTD
配列番号36
MIELSLIDFYLCFLAFLLFLVLIMLIIFWFSLELQDHNETCHA
配列番号37
MKLLIVLTCISLCSCICTVVQRCASNKPHVLEDPCKVQH
配列番号38
MLPPCYNFLKEQHCQKASTQREAEAAVKPLLAPHHVVAVIQEIQLLAAVGEILLLEWLAEVVKLPSRYCC
配列番号1
MALNSGSPPAIGPYYENHGYQPENPYPAQPTVVPTVYEVHPAQYYPSPVPQYAPRVLTQASNPVVCTQPKSPSGTVCTSKTKKALCITLTLGTFLVGAALAAGLLWKFMGSKCSNSGIECDSSGTCINPSNWCDGVSHCPGGEDENRCVRLYGPNFILQVYSSQRKSWHPVCQDDWNENYGRAACRDMGYKNNFYSSQGIVDDSGSTSFMKLNTSAGNVDIYKKLYHSDACSSKAVVSLRCIACGVNLNSSRQSRIVGGESALPGAWPWQVSLHVQNVHVCGGSIITPEWIVTAAHCVEKPLNNPWHWTAFAGILRQSFMFYGAGYQVEKVISHPNYDSKTKNNDIALMKLQKPLTFNDLVKPVCLPNPGMMLQPEQLCWISGWGATEEKGKTSEVLNAAKVLLIETQRCNSRYVYDNLITPAMICAGFLQGNVDSCQGDSGGPLVTSKNNIWWLIGDTSWGSGCAKAYRPGVYGNVMVFTDWIYRQMRADG
配列番号2
MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACVVCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVETIRASVCAPCHASCATCQGPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQSSRESPPQQQPPRLPPEVEAGQRLRAGLLPSHLPEVVAGLSCAFIVLVFVTVFLVLQLRSGFSFRGVKVYTMDRGLISYKGLPPEAWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSAL
配列番号3
MAAFSEMGVMPEIAQAVEEMDWLLPTDIQAESIPLILGGGDVLMAAETGSGKTGAFSIPVIQIVYETLKDQQEGKKGKTTIKTGASVLNKWQMNPYDRGSAFAIGSDGLCCQSREVKEWHGCRATKGLMKGKHYYEVSCHDQGLCRVGWSTMQASLDLGTDKFGFGFGGTGKKSHNKQFDNYGEEFTMHDTIGCYLDIDKGHVKFSKNGKDLGLAFEIPPHMKNQALFPACVLKNAELKFNFGEEEFKFPPKDGFVALSKAPDGYIVKSQHSGNAQVTQTKFLPNAPKALIVEPSRELAEQTLNNIKQFKKYIDNPKLRELLIIGGVAARDQLSVLENGVDIVVGTPGRLDDLVSTGKLNLSQVRFLVLDEADGLLSQGYSDFINRMHNQIPQVTSDGKRLQVIVCSATLHSFDVKKLSEKIMHFPTWVDLKGEDSVPDTVHHVVVPVNPKTDRLWERLGKSHIRTDDVHAKDNTRPGANSPEMWSEAIKILKGEYAVRAIKEHKMDQAIIFCRTKIDCDNLEQYFIQQGGGPDKKGHQFSCVCLHGDRKPHERKQNLERFKKGDVRFLICTDVAARGIDIHGVPYVINVTLPDEKQNYVHRIGRVGRAERMGLAISLVATEKEKVWYHVCSSRGKGCYNTRLKEDGGCTIWYNEMQLLSEIEEHLNCTISQVEPDIKVPVDEFDGKVTYGQKRAAGGGSYKGHVDILAPTVQELAALEKEAQTSFLHLGYLPNQLFRTF
配列番号4
MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVSIWLIVFGVVMGVIVVGIVILIFTGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF
配列番号5
MDNKKRLAYAIIQFLHDQLRHGGLSSDAQESLEVAIQCLETAFGVTVEDSDLALPQTLPEIFEAAATGKEMPQDLRSPARTPPSEEDSAEAERLKTEGNEQMKVENFEAAVHFYGKAIELNPANAVYFCNRAAAYSKLGNYAGAVQDCERAICIDPAYSKAYGRMGLALSSLNKHVEAVAYYKKALELDPDNETYKSNLKIAELKLREAPSPTGGVGSFDIAGLLNNPGFMSMASNLMNNPQIQQLMSGMISGGNNPLGTPGTSPSQNDLASLIQAGQQFAQQMQQQNPELIEQLRSQIRSRTPSASNDDQQE
配列番号6
MAAKVFESIGKFGLALAVAGGVVNSALYNVDAGHRAVIFDRFRGVQDIVVGEGTHFLIPWVQKPIIFDCRSRPRNVPVITGSKDLQNVNITLRILFRPVASQLPRIFTSIGEDYDERVLPSITTEILKSVVARFDAGELITQRELVSRQVSDDLTERAATFGLILDDVSLTHLTFGKEFTEAVEAKQVAQQEAERARFVVEKAEQQKKAAIISAEGDSKAAELIANSLATAGDGLIELRKLEAAEDIAYQLSRSRNITYLPAGQSVLLQLPQ
配列番号7
MSTNENANTPAARLHRFKNKGKDSTEMRRRRIEVNVELRKAKKDDQMLKRRNVSSFPDDATSPLQENRNNQGTVNWSVDDIVKGINSSNVENQLQATQAARKLLSREKQPPIDNIIRAGLIPKFVSFLGRTDCSPIQFESAWALTNIASGTSEQTKAVVDGGAIPAFISLLASPHAHISEQAVWALGNIAGDGSVFRDLVIKYGAVDPLLALLAVPDMSSLACGYLRNLTWTLSNLCRNKNPAPPIDAVEQILPTLVRLLHHDDPEVLADTCWAISYLTDGPNERIGMVVKTGVVPQLVKLLGASELPIVTPALRAIGNIVTGTDEQTQVVIDAGALAVFPSLLTNPKTNIQKEATWTMSNITAGRQDQIQQVVNHGLVPFLVSVLSKADFKTQKEAVWAVTNYTSGGTVEQIVYLVHCGIIEPLMNLLTAKDTKIILVILDAISNIFQAAEKLGETEKLSIMIEECGGLDKIEALQNHENESVYKASLSLIEKYFSVEEEEDQNVVPETTSEGYTFQVQDGAPGTFNF
配列番号8
MASTSYDYCRVPMEDGDKRCKLLLGIGILVLLIIVILGVPLIIFTIKANSEACRDGLRAVMECRNVTHLLQQELTEAQKGFQDVEAQAATCNHTVMALMASLDAEKAQGQKKVEELEGEITTLNHKLQDASAEVERLRRENQVLSVRIADKKYYPSSQDSSSAAAPQLLIVLLGLSALLQ
配列番号9
MTTSHMNGHVTEESDSEVKNVDLASPEEHQKHREMAVDCPGDLGTRMMPIRRSAQLERIRQQQEDMRRRREEEGKKQELDLNSSMRLKKLAQIPPKTGIDNPMFDTEEGIVLESPHYAVKILEIEDLFSSLKHIQHTLVDSQSQEDISLLLQLVQNKDFQNAFKIHNAITVHMNKASPPFPLISNAQDLAQEVQTVLKPVHHKEGQELTALLNTPHIQALLLAHDKVAEQEMQLEPITDERVYESIGQYGGETVKIVRIEKARDIPLGATVRNEMDSVIISRIVKGGAAEKSGLLHEGDEVLEINGIEIRGKDVNEVFDLLSDMHGTLTFVLIPSQQIKPPPAKETVIHVKAHFDYDPSDDPYVPCRELGLSFQKGDILHVISQEDPNWWQAYREGDEDNQPLAGLVPGKSFQQQREAMKQTIEEDKEPEKSGKLWCAKKNKKKRKKVLYNANKNDDYDNEEILTYEEMSLYHQPANRKRPIILIGPQNCGQNELRQRLMNKEKDRFASAVPHTTRSRRDQEVAGRDYHFVSRQAFEADIAAGKFIEHGEFEKNLYGTSIDSVRQVINSGKICLLSLRTQSLKTLRNSDLKPYIIFIAPPSQERLRALLAKEGKNPKPEELREIIEKTREMEQNNGHYFDTAIVNSDLDKAYQELLRLINKLDTEPQWVPSTWLR
配列番号10
MAQNLKDLAGRLPAGPRGMGTALKLLLGAGAVAYGVRESVFTVEGGHRAIFFNRIGGVQQDTILAEGLHFRIPWFQYPIIYDIRARPRKISSPTGSKDLQMVNISLRVLSRPNAQELPSMYQRLGLDYEERVLPSIVNEVLKSVVAKFNASQLITQRAQVSLLIRRELTERAKDFSLILDDVAITELSFSREYTAAVEAKQVAQQEAQRAQFLVEKAKQEQRQKIVQAEGEAEAAKMLGEALSKNPGYIKLRKIRAAQNISKTIATSQNRIYLTADNLVLNLQDESFTRGSDSLIKGKK
配列番号11
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配列番号12
MESLVLGVNEKTHVQLSLPVLQVRDVLVRGFGDSVEEALSEAREHLKNGTCGLVELEKGVLPQLEQPYVFIKRSDALSTNHGHKVVELVAEMDGIQYGRSGITLGVLVPHVGETPIAYRNVLLRKNGNKGAGGHSYGIDLKSYDLGDELGTDPIEDYEQNWNTKHGSGALRELTRELNGGAVTRYVDNNFCGPDGYPLDCIKDFLARAGKSMCTLSEQLDYIESKRGVYCCRDHEHEIAWFTERSDKSYEHQTPFEIKSAKKFDTFKGECPKFVFPLNSKVKVIQPRVEKKKTEGFMGRIRSVYPVASPQECNNMHLSTLMKCNHCDEVSWQTCDFLKATCEHCGTENLVIEGPTTCGYLPTNAVVKMPCPACQDPEIGPEHSVADYHNHSNIETRLRKGGRTRCFGGCVFAYVGCYNKRAYWVPRASADIGSGHTGITGDNVETLNEDLLEILSRERVNINIVGDFHLNEEVAIILASFSASTSAFIDTIKSLDYKSFKTIVESCGNYKVTKGKPVKGAWNIGQQRSVLTPLCGFPSQAAGVIRSIFARTLDAANHSIPDLQRAAVTILDGISEQSLRLVDAMVYTSDLLTNSVIIMAYVTGGLVQQTSQWLSNLLGTTVEKLRPIFEWIEAKLSAGVEFLKDAWEILKFLITGVFDIVKGQIQVASDNIKDCVKCFIDVVNKALEMCIDQVTIAGAKLRSLNLGEVFIAQSKGLYRQCIRGKEQLQLLMPLKAPKEVTFLEGDSHDTVLTSEEVVLKNGELEALETPVDSFTNGAIVGTPVCVNGLMLLEIKDKEQYCALSPGLLATNNVFRLKGGAPIKGVTFGEDTVWEVQGYKNVRITFELDERVDKVLNEKCSVYTVESGTEVTEFACVVAEAVVKTLQPVSDLLTNMGIDLDEWSVATFYLFDDAGEENFSSRMYCSFYPPDEEEEDDAECEEEEIDETCEHEYGTEDDYQGLPLEFGASAETVRVEEEEEEDWLDDTTEQSEIEPEPEPTPEEPVNQFTGYLKLTDNVAIKCVDIVKEAQSANPMVIVNAANIHLKHGGGVAGALNKATNGAMQKESDDYIKLNGPLTVGGSCLLSGHNLAKKCLHVVGPNLNAGEDIQLLKAAYENFNSQDILLAPLLSAGIFGAKPLQSLQVCVQTVRTQVYIAVNDKALYEQVVMDYLDNLKPRVEAPKQEEPPNTEDSKTEEKSVVQKPVDVKPKIKACIDEVTTTLEETKFLTNKLLLFADINGKLYHDSQNMLRGEDMSFLEKDAPYMVGDVITSGDITCVVIPSKKAGGTTEMLSRALKKVPVDEYITTYPGQGCAGYTLEEAKTALKKCKSAFYVLPSEAPNAKEEILGTVSWNLREMLAHAEETRKLMPICMDVRAIMATIQRKYKGIKIQEGIVDYGVRFFFYTSKEPVASIITKLNSLNEPLVTMPIGYVTHGFNLEEAARCMRSLKAPAVVSVSSPDAVTTYNGYLTSSSKTSEEHFVETVSLAGSYRDWSYSGQRTELGVEFLKRGDKIVYHTLESPVEFHLDGEVLSLDKLKSLLSLREVKTIKVFTTVDNTNLHTQLVDMSMTYGQQFGPTYLDGADVTKIKPHVNHEGKTFFVLPSDDTLRSEAFEYYHTLDESFLGRYMSALNHTKKWKFPQVGGLTSIKWADNNCYLSSVLLALQQLEVKFNAPALQEAYYRARAGDAANFCALILAYSNKTVGELGDVRETMTHLLQHANLESAKRVLNVVCKHCGQKTTTLTGVEAVMYMGTLSYDNLKTGVSIPCVCGRDATQYLVQQESSFVMMSAPPAEYKLQQGTFLCANEYTGNYQCGHYTHITAKETLYRIDGAHLTKMSEYKGPVTDVFYKETSYTTTIKPVSYKLDGVTYTEIEPKLDGYYKKDNAYYTEQPIDLVPTQPLPNASFDNFKLTCSNTKFADDLNQMTGFTKPASRELSVTFFPDLNGDVVAIDYRHYSASFKKGAKLLHKPIVWHINQATTKTTFKPNTWCLRCLWSTKPVDTSNSFEVLAVEDTQGMDNLACESQQPTSEEVVENPTIQKEVIECDVKTTEVVGNVILKPSDEGVKVTQELGHEDLMAAYVENTSITIKKPNELSLALGLKTIATHGIAAINSVPWSKILAYVKPFLGQAAITTSNCAKRLAQRVFNNYMPYVFTLLFQLCTFTKSTNSRIRASLPTTIAKNSVKSVAKLCLDAGINYVKSPKFSKLFTIAMWLLLLSICLGSLICVTAAFGVLLSNFGAPSYCNGVRELYLNSSNVTTMDFCEGSFPCSICLSGLDSLDSYPALETIQVTISSYKLDLTILGLAAEWVLAYMLFTKFFYLLGLSAIMQVFFGYFASHFISNSWLMWFIISIVQMAPVSAMVRMYIFFASFYYIWKSYVHIMDGCTSSTCMMCYKRNRATRVECTTIVNGMKRSFYVYANGGRGFCKTHNWNCLNCDTFCTGSTFISDEVARDLSLQFKRPINPTDQSSYIVDSVAVKNGALHLYFDKAGQKTYERHPLSHFVNLDNLRANNTKGSLPINVIVFDGKSKCDESASKSASVYYSQLMCQPILLLDQALVSDVGDSTEVSVKMFDAYVDTFSATFSVPMEKLKALVATAHSELAKGVALDGVLSTFVSAARQGVVDTDVDTKDVIECLKLSHHSDLEVTGDSCNNFMLTYNKVENMTPRDLGACIDCNARHINAQVAKSHNVSLIWNVKDYMSLSEQLRKQIRSAAKKNNIPFRLTCATTRQVVNVITTKISLKGGKIVSTCFKLMLKATLLCVLAALVCYIVMPVHTLSIHDGYTNEIIGYKAIQDGVTRDIISTDDCFANKHAGFDAWFSQRGGSYKNDKSCPVVAAIITREIGFIVPGLPGTVLRAINGDFLHFLPRVFSAVGNICYTPSKLIEYSDFATSACVLAAECTIFKDAMGKPVPYCYDTNLLEGSISYSELRPDTRYVLMDGSIIQFPNTYLEGSVRVVTTFDAEYCRHGTCERSEVGICLSTSGRWVLNNEHYRALSGVFCGVDAMNLIANIFTPLVQPVGALDVSASVVAGGIIAILVTCAAYYFMKFRRVFGEYNHVVAANALLFLMSFTILCLVPAYSFLPGVYSVFYLYLTFYFTNDVSFLAHLQWFAMFSPIVPFWITAIYVFCISLKHCHWFFNNYLRKRVMFNGVTFSTFEEAALCTFLLNKEMYLKLRSETLLPLTQYNRYLALYNKYKYFSGALDTTSYREAACCHLAKALNDFSNSGADVLYQPPQTSITSAVLQSGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDMLNPNYEDLLIRKSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGKFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELLQNGMNGRTILGSTILEDEFTPFDVVRQCSGVTFQGKFKKIVKGTHHWMLLTFLTSLLILVQSTQWSLFFFVYENAFLPFTLGIMAIAACAMLLVKHKHAFLCLFLLPSLATVAYFNMVYMPASWVMRIMTWLELADTSLSGYRLKDCVMYASALVLLILMTARTVYDDAARRVWTLMNVITLVYKVYYGNALDQAISMWALVISVTSNYSGVVTTIMFLARAIVFVCVEYYPLLFITGNTLQCIMLVYCFLGYCCCCYFGLFCLLNRYFRLTLGVYDYLVSTQEFRYMNSQGLLPPKSSIDAFKLNIKLLGIGGKPCIKVATVQSKMSDVKCTSVVLLSVLQQLRVESSSKLWAQCVQLHNDILLAKDTTEAFEKMVSLLSVLLSMQGAVDINRLCEEMLDNRATLQAIASEFSSLPSYAAYATAQEAYEQAVANGDSEVVLKKLKKSLNVAKSEFDRDAAMQRKLEKMADQAMTQMYKQARSEDKRAKVTSAMQTMLFTMLRKLDNDALNNIINNARDGCVPLNIIPLTTAAKLMVVVPDYGTYKNTCDGNTFTYASALWEIQQVVDADSKIVQLSEINMDNSPNLAWPLIVTALRANSAVKLQNNELSPVALRQMSCAAGTTQTACTDDNALAYYNNSKGGRFVLALLSDHQDLKWARFPKSDGTGTIYTELEPPCRFVTDTPKGPKVKYLYFIKGLNNLNRGMVLGSLAATVRLQAGNATEVPANSTVLSFCAFAVDPAKAYKDYLASGGQPITNCVKMLCTHTGTGQAITVTPEANMDQESFGGASCCLYCRCHIDHPNPKGFCDLKGKYVQIPTTCANDPVGFTLRNTVCTVCGMWKGYGCSCDQLREPLMQSADASTFLNRVCGVSAARLTPCGTGTSTDVVYRAFDIYNEKVAGFAKFLKTNCCRFQEKDEEGNLLDSYFVVKRHTMSNYQHEETIYNLVKDCPAVAVHDFFKFRVDGDMVPHISRQRLTKYTMADLVYALRHFDEGNCDTLKEILVTYNCCDDDYFNKKDWYDFVENPDILRVYANLGERVRQSLLKTVQFCDAMRDAGIVGVLTLDNQDLNGNWYDFGDFVQVAPGCGVPIVDSYYSLLMPILTLTRALAAESHMDADLAKPLIKWDLLKYDFTEERLCLFDRYFKYWDQTYHPNCINCLDDRCILHCANFNVLFSTVFPPTSFGPLVRKIFVDGVPFVVSTGYHFRELGVVHNQDVNLHSSRLSFKELLVYAADPAMHAASGNLLLDKRTTCFSVAALTNNVAFQTVKPGNFNKDFYDFAVSKGFFKEGSSVELKHFFFAQDGNAAISDYDYYRYNLPTMCDIRQLLFVVEVVDKYFDCYDGGCINANQVIVNNLDKSAGFPFNKWGKARLYYDSMSYEDQDALFAYTKRNVIPTITQMNLKYAISAKNRARTVAGVSICSTMTNRQFHQKLLKSIAATRGATVVIGTSKFYGGWHNMLKTVYSDVETPHLMGWDYPKCDRAMPNMLR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配列番号13
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配列番号14
MESLVPGFNEKTHVQLSLPVLQVRDVLVRGFGDSVEEVLSEARQHLKDGTCGLVEVEKGVLPQLEQPYVFIKRSDARTAPHGHVMVELVAELEGIQYGRSGETLGVLVPHVGEIPVAYRKVLLRKNGNKGAGGHSYGADLKSFDLGDELGTDPYEDFQENWNTKHSSGVTRELMRELNGGAYTRYVDNNFCGPDGYPLECIKDLLARAGKASCTLSEQLDFIDTKRGVYCCREHEHEIAWYTERSEKSYELQTPFEIKLAKKFDTFNGECPNFVFPLNSIIKTIQPRVEKKKLDGFMGRIRSVYPVASPNECNQMCLSTLMKCDHCGETSWQTGDFVKATCEFCGTENLTKEGATTCGYLPQNAVVKIYCPACHNSEVGPEHSLAEYHNESGLKTILRKGGRTIAFGGCVFSYVGCHNKCAYWVPRASANIGCNHTGVVGEGSEGLNDNLLEILQKEKVNINIVGDFKLNEEIAIILASFSASTSAFVETVKGLDYKAFKQIVESCGNFKVTKGKAKKGAWNIGEQKSILSPLYAFASEAARVVRSIFSRTLETAQNSVRVLQKAAITILDGISQYSLRLIDAMMFTSDLATNNLVVMAYITGGVVQLTSQWLTNIFGTVYEKLKPVLDWLEEKFKEGVEFLRDGWEIVKFISTCACEIVGGQIVTCAKEIKESVQTFFKLVNKFLALCADSIIIGGAKLKALNLGETFVTHSKGLYRKCVKSREETGLLMPLKAPKEIIFLEGETLPTEVLTEEVVLKTGDLQPLEQPTSEAVEAPLVGTPVCINGLMLLEIKDTEKYCALAPNMMVTNNTFTLKGGAPTKVTFGDDTVIEVQGYKSVNITFELDERIDKVLNEKCSAYTVELGTEVNEFACVVADAVIKTLQPVSELLTPLGIDLDEWSMATYYLFDESGEFKLASHMYCSFYPPDEDEEEGDCEEEEFEPSTQYEYGTEDDYQGKPLEFGATSAALQPEEEQEEDWLDDDSQQTVGQQDGSEDNQTTTIQTIVEVQPQLEMELTPVVQTIEVNSFSGYLKLTDNVYIKNADIVEEAKKVKPTVVVNAANVYLKHGGGVAGALNKATNNAMQVESDDYIATNGPLKVGGSCVLSGHNLAKHCLHVVGPNVNKGEDIQLLKSAYENFNQHEVLLAPLLSAGIFGADPIHSLRVCVDTVRTNVYLAVFDKNLYDKLVSSFLEMKSEKQVEQKIAEIPKEEVKPFITESKPSVEQRKQDDKKIKACVEEVTTTLEETKFLTENLLLYIDINGNLHPDSATLVSDIDITFLKKDAPYIVGDVVQEGVLTAVVIPTKKAGGTTEMLAKALRKVPTDNYITTYPGQGLNGYTVEEAKTVLKKCKSAFYILPSIISNEKQEILGTVSWNLREMLAHAEETRKLMPVCVETKAIVSTIQRKYKGIKIQEGVVDYGARFYFYTSKTTVASLINTLNDLNETLVTMPLGYVTHGLNLEEAARYMRSLKVPATVSVSSPDAVTAYNGYLTSSSKTPEEHFIETISLAGSYKDWSYSGQSTQLGIEFLKRGDKSVYYTSNPTTFHLDGEVITFDNLKTLLSLREVRTIKVFTTVDNINLHTQVVDMSMTYGQQFGPTYLDGADVTKIKPHNSHEGKTFYVLPNDDTLRVEAFEYYHTTDPSFLGRYMSALNHTKKWKYPQVNGLTSIKWADNNCYLATALLTLQQIELKFNPPALQDAYYRARAGEAANFCALILAYCNKTVGELGDVRETMSYLFQHANLDSCKRVLNVVCKTCGQQQTTLKGVEAVMYMGTLSYEQFKKGVQIPCTCGKQATKYLVQQESPFVMMSAPPAQYELKHGTFTCASEYTGNYQCGHYKHITSKETLYCIDGALLTKSSEYKGPITDVFYKENSYTTTIKPVTYKLDGVVCTEIDPKLDNYYKKDNSYFTEQPIDLVPNQPYPNASFDNFKFVCDNIKFADDLNQLTGYKKPASRELKVTFFPDLNGDVVAIDYKHYTPSFKKGAKLLHKPIVWHVNNATNKATYKPNTWCIRCLWSTKPVETSNSFDVLKSEDAQGMDNLACEDLKPVSEEVVENPTIQKDVLECNVKTTEVVGDIILKPANNSLKITEEVGHTDLMAAYVDNSSLTIKKPNELSRVLGLKTLATHGLAAVNSVPWDTIANYAKPFLNKVVSTTTNIVTRCLNRVCTNYMPYFFTLLLQLCTFTRSTNSRIKASMPTTIAKNTVKSVGKFCLEASFNYLKSPNFSKLINIIIWFLLLSVCLGSLIYSTAALGVLMSNLGMPSYCTGYREGYLNSTNVTIATYCTGSIPCSVCLSGLDSLDTYPSLETIQITISSFKWDLTAFGLVAEWFLAYILFTRFFYVLGLAAIMQLFFSYFAVHFISNSWLMWLIINLVQMAPISAMVRMYIFFASFYYVWKSYVHVVDGCNSSTCMMCYKRNRATRVECTTIVNGVRRSFYVYANGGKGFCKLHNWNCVNCDTFCAGSTFISDEVARDLSLQFKRPINPTDQSSYIVDSVTVKNGSIHLYFDKAGQKTYERHSLSHFVNLDNLRANNTKGSLPINVIVFDGKSKCEESSAKSASVYYSQLMCQPILLLDQALVSDVGDSAEVAVKMFDAYVNTFSSTFNVPMEKLKTLVATAEAELAKNVSLDNVLSTFISAARQGFVDSDVETKDVVECLKLSHQSDIEVTGDSCNNYMLTYNKVENMTPRDLGACIDCSARHINAQVAKSHNIALIWNVKDFMSLSEQLRKQIRSAAKKNNLPFKLTCATTRQVVNVVTTKIALKGGKIVNNWLKQLIKVTLVFLFVAAIFYLITPVHVMSKHTDFSSEIIGYKAIDGGVTRDIASTDTCFANKHADFDTWFSQRGGSYTNDKACPLIAAVITREVGFVVPGLPGTILRTTNGDFLHFLPRVFSAVGNICYTPSKLIEYTDFATSACVLAAECTIFKDASGKPVPYCYDTNVLEGSVAYESLRPDTRYVLMDGSIIQFPNTYLEGSVRVVTTFDSEYCRHGTCERSEAGVCVSTSGRWVLNNDYYRSLPGVFCGVDAVNLLTNMFTPLIQPIGALDISASIVAGGIVAIVVTCLAYYFMRFRRAFGEYSHVVAFNTLLFLMSFTVLCLTPVYSFLPGVYSVIYLYLTFYLTNDVSFLAHIQWMVMFTPLVPFWITIAYIICISTKHFYWFFSNYLKRRVVFNGVSFSTFEEAALCTFLLNKEMYLKLRSDVLLPLTQYNRYLALYNKYKYFSGAMDTTSYREAACCHLAKALNDFSNSGSDVLYQPPQTSITSAVLQSGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDVVYCPRHVICTSEDMLNPNYEDLLIRKSNHNFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCVLKLKVDTANPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNFTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGNFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITVNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCASLKELLQNGMNGRTILGSALLEDEFTPFDVVRQCSGVTFQSAVKRTIKGTHHWLLLTILTSLLVLVQSTQWSLFFFLYENAFLPFAMGIIAMSAFAMMFVKHKHAFLCLFLLPSLATVAYFNMVYMPASWVMRIMTWLDMVDTSLSGFKLKDCVMYASAVVLLILMTARTVYDDGARRVWTLMNVLTLVYKVYYGNALDQAISMWALIISVTSNYSGVVTTVMFLARGIVFMCVEYCPIFFITGNTLQCIMLVYCFLGYFCTCYFGLFCLLNRYFRLTLGVYDYLVSTQEFRYMNSQGLLPPKNSIDAFKLNIKLLGVGGKPCIKVATVQSKMSDVKCTSVVLLSVLQQLRVESSSKLWAQCVQLHNDILLAKDTTEAFEKMVSLLSVLLSMQGAVDINKLCEEMLDNRATLQAIASEFSSLPSYAAFATAQEAYEQAVANGDSEVVLKKLKKSLNVAKSEFDRDAAMQRKLEKMADQAMTQMYKQARSEDKRAKVTSAMQTMLFTMLRKLDNDALNNIINNARDGCVPLNIIPLTTAAKLMVVIPDYNTYKNTCDGTTFTYASALWEIQQVVDADSKIVQLSEISMDNSPNLAWPLIVTALRANSAVKLQNNELSPVALRQMSCAAGTTQTACTDDNALAYYNTTKGGRFVLALLSDLQDLKWARFPKSDGTGTIYTELEPPCRFVTDTPKGPKVKYLYFIKGLNNLNRGMVLGSLAATVRLQAGNATEVPANSTVLSFCAFAVDAAKAYKDYLASGGQPITNCVKMLCTHTGTGQAITVTPEANMDQESFGGASCCLYCRCHIDHPNPKGFCDLKGKYVQIPTTCANDPVGFTLKNTVCTVCGMWKGYGCSCDQLREPMLQSADAQSFLNRVCGVSAARLTPCGTGTSTDVVYRAFDIYNDKVAGFAKFLKTNCCRFQEKDEDDNLIDSYFVVKRHTFSNYQHEETIYNLLKDCPAVAKHDFFKFRIDGDMVPHISRQRLTKYTMADLVYALRHFDEGNCDTLKEILVTYNCCDDDYFNKKDWYDFVENPDILRVYANLGERVRQALLKTVQFCDAMRNAGIVGVLTLDNQDLNGNWYDFGDFIQTTPGSGVPVVDSYYSLLMPILTLTRALTAESHVDTDLTKPYIKWDLLKYDFTEERLKLFDRYFKYWDQTYHPNCVNCLDDRCILHCANFNVLFSTVFPPTSFGPLVRKIFVDGVPFVVSTGYHFRELGVVHNQDVNLHSSRLSFKELLVYAADPAMHAASGNLLLDKRTTCFSVAALTNNVAFQTVKPGNFNKDFYDFAVSKGFFKEGSSVELKHFFFAQDGNAAISDYDYYRYNLPTMCDIRQLLFVVEVVDKYFDCYDGGCINANQVIVNNLDKSAGFPFNKWGKARLYYDSMSYEDQDALFAYTKRNVIPTITQMNLKYAISAKNRARTVAGVSICSTMTNRQFHQKLLKSIAATRGATVVIGTSKFYGGWHNMLKTVYSDVENPHLMGWDYPKCDRAMPNMLRIMASLVLARKHTTCCSLSHRFYRLANECAQVLSEMVMCGGSLYVKPGGTSSGDATTAYANSVFNICQAVTANVNALLSTDGNKIADKYVRNLQHRLYE
CLYRNRDVDTDFVNEFYAYLRKHFSMMILSDDAVVCFNSTYASQGLVASIKNFKSVLYYQNNVFMSEAKCWTETDLTKGPHEFCSQHTMLVKQGDDYVYLPYPDPSRILGAGCFVDDIVKTDGTLMIERFVSLAIDAYPLTKHPNQEYADVFHLYLQYIRKLHDELTGHMLDMYSVMLTNDNTSRYWEPEFYEAMYTPHTVLQAVGACVLCNSQTSLRCGACIRRPFLCCKCCYDHVISTSHKLVLSVNPYVCNAPGCDVTDVTQLYLGGMSYYCKSHKPPISFPLCANGQVFGLYKNTCVGSDNVTDFNAIATCDWTNAGDYILANTCTERLKLFAAETLKATEETFKLSYGIATVREVLSDRELHLSWEVGKPRPPLNRNYVFTGYRVTKNSKVQIGEYTFEKGDYGDAVVYRGTTTYKLNVGDYFVLTSHTVMPLSAPTLVPQEHYVRITGLYPTLNISDEFSSNVANYQKVGMQKYSTLQGPPGTGKSHFAIGLALYYPSARIVYTACSHAAVDALCEKALKYLPIDKCSRIIPARARVECFDKFKVNSTLEQYVFCTVNALPETTADIVVFDEISMATNYDLSVVNARLRAKHYVYIGDPAQLPAPRTLLTKGTLEPEYFNSVCRLMKTIGPDMFLGTCRRCPAEIVDTVSALVYDNKLKAHKDKSAQCFKMFYKGVITHDVSSAINRPQIGVVREFLTRNPAWRKAVFISPYNSQNAVASKILGLPTQTVDSSQGSEYDYVIFTQTTETAHSCNVNRFNVAITRAKVGILCIMSDRDLYDKLQFTSLEIPRRNVATLQAENVTGLFKDCSKVITGLHPTQAPTHLSVDTKFKTEGLCVDIPGIPKDMTYRRLISMMGFKMNYQVNGYPNMFITREEAIRHVRAWIGFDVEGCHATREAVGTNLPLQLGFSTGVNLVAVPTGYVDTPNNTDFSRVSAKPPPGDQFKHLIPLMYKGLPWNVVRIKIVQMLSDTLKNLSDRVVFVLWAHGFELTSMKYFVKIGPERTCCLCDRRATCFSTASDTYACWHHSIGFDYVYNPFMIDVQQWGFTGNLQSNHDLYCQVHGNAHVASCDAIMTRCLAVHECFVKRVDWTIEYPIIGDELKINAACRKVQHMVVKAALLADKFPVLHDIGNPKAIKCVPQADVEWKFYDAQPCSDKAYKIEELFYSYATHSDKFTDGVCLFWNCNVDRYPANSIVCRFDTRVLSNLNLPGCDGGSLYVNKHAFHTPAFDKSAFVNLKQLPFFYYSDSPCESHGKQVVSDIDYVPLKSATCITRCNLGGAVCRHHANEYRLYLDAYNMMISAGFSLWVYKQFDTYNLWNTFTRLQSLENVAFNVVNKGHFDGQQGEVPVSIINNTVYTKVDGVDVELFENKTTLPVNVAFELWAKRNIKPVPEVKILNNLGVDIAANTVIWDYKRDAPAHISTIGVCSMTDIAKKPTETICAPLTVFFDGRVDGQVDLFRNARNGVLITEGSVKGLQPSVGPKQASLNGVTLIGEAVKTQFNYYKKVDGVVQQLPETYFTQSRNLQEFKPRSQMEIDFLELAMDEFIERYKLEGYAFEHIVYGDFSHSQLGGLHLLIGLAKRFKESPFELEDFIPMDSTVKNYFITDAQTGSSKCVCSVIDLLLDDFVEIIKSQDLSVVSKVVKVTIDYTEISFMLWCKDGHVETFYPKLQSSQAWQPGVAMPNLYKMQRMLLEKCDLQNYGDSATLPKGIMMNVAKYTQLCQYLNTLTLAVPYNMRVIHFGAGSDKGVAPGTAVLRQWLPTGTLLVDSDLNDFVSDADSTLIGDCATVHTANKWDLIISDMYDPKTKNVTKENDSKEGFFTYICGFIQQKLALGGSVAIKITEHSWNADLYKLMGHFAWWTAFVTNVNASSSEAFLIGCNYLGKPREQIDGYVMHANYIFWRNTNPIQLSSYSLFDMSKFPLKLRGTAVMSLKEGQINDMILSLLSKGRLIIRENNRVVISSDVLVNN
配列番号15
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
配列番号16
MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCSFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYVWLGFIAGLIAIVMVTILLCCMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
配列番号17
MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADSTQA
配列番号18
MDLFMRFFTLGSITAQPVKIDNASPASTVHATATIPLQASLPFGWLVIGVAFLAVFQSATKIIALNKRWQLALYKGFQFICNLLLLFVTIYSHLLLVAAGMEAQFLYLYALIYFLQCINACRIIMRCWLCWKCKSKNPLLYDANYFVCWHTHNYDYCIPYNSVTDTIVVTEGDGISTPKLKEDYQIGGYSEDRHSGVKDYVVVHGYFTEVYYQLESTQITTDTGIENATFFIFNKLVKDPPNVQIHTIDGSSGVANPAMDPIYDEPTTTTSVPL
配列番号19
MKIILFLTLIVFTSCELYHYQECVRGTTVLLKEPCPSGTYEGNSPFHPLADNKFALTCTSTHFAFACADGTRHTYQLRARSVSPKLFIRQEEVQQELYSPLFLIVAALVFLILCFTIKRKTE
配列番号20
MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPTVYVYSRVKNLNSSEGVPDLLV
配列番号21
MADNGTITVEELKQLLEQWNLVIGFLFLAWIMLLQFAYSNRNRFLYIIKLVFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWVTGGIAIAMACIVGLMWLSYFVASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLRGTIVTRPLMESELVIGAVIIRGHLRMAGHSLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVGTDSGFAAYNRYRIGNYKLNTDHAGSNDNIALLVQ
配列番号22
MMPTTLFAGTHITMTTVYHITVSQIQLSLLKVTAFQHQNSKKTTKLVVILRIGTQVLKTMSLYMAISPKFTTSLSLHKLLQTLVLKMLHSSSLTSLLKTHRMCKYTQSTALQELLIQQWIQFMMSRRRLLACLCKHKKVSTNLCTHSFRKKQVR
配列番号23
MFHLVDFQVTIAEILIIIMRTFRIAIWNLDVIISSIVRQLFKPLTKKNYSELDDEEPMELDYP
配列番号24
MDLFMRIFTIGTVTLKQGEIKDATPSDFVRATATIPIQASLPFGWLIVGVALLAVFQSASKIITLKKRWQLALSKGVHFVCNLLLLFVTVYSHLLLVAAGLEAPFLYLYALVYFLQSINFVRIIMRLWLCWKCRSKNPLLYDANYFLCWHTNCYDYCIPYNSVTSSIVITSGDGTTSPISEHDYQIGGYTEKWESGVKDCVVLHSYFTSDYYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIYNKIVDEPEEHVQIHTIDGSSGVVNPVMEPIYDEPTTTTSVPL
配列番号25
MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ
配列番号26
MKIILFLALITLATCELYHYQECVRGTTVLLKEPCSSGTYEGNSPFHPLADNKFALTCFSTQFAFACPDGVKHVYQLRARSVSPKLFIRQEEVQELYSPIFLIVAAIVFITLCFTLKRKTE
配列番号27
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
配列番号28
MDPNQTNVVPPALHLVDPQIQLTITRMEDAMGQGQNSADPKVYPIILRLGSQLSLSMARRNLDSLEARAFQSTPIVVQMTKLATTEELPDEFVVVTAK
配列番号29
MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV
配列番号30
MFHLVDFQVTIAEILLIIMRTFKVSIWNLDYIINLIIKNLSKSLTENKYSQLDEEQPMEID
配列番号31
MKFLVFLGIITTVAAFHQECSLQSCTQHQPYVVDDPCPIHFYSKWYIRVGARKSAPLIELCVDEAGSKSPIQYIDIGNYTVSCLPFTINCQEPKLGSLVVRCSFYEDFLEYHDVRVVLDFI
配列番号32
MDPKISEMHPALRLVDPQIQLAVTRMENAVGRDQNNVGPKVYPIILRLGSPLSLNMARKTLNSLEDKAFQLTPIAVQMTKLATTEELPDEFVVVTVK
配列番号33
MNELTLIDFYLCFLAFLLFLVLIMLIIFWFSLEIQDLEEPCTKV
配列番号34
MCLKILVRYNTRGNTYSTAWLCALGKVLPFHRWHTMVQTCTPNVTINCQDPAGGALIARCWYLHEGHQTAAFRDVLVVLNKRTN
配列番号35
MLQSCYNFLKEQHCQKASTQKGAEAAVKPLLVPHHVVATVQEIQLQAAVGELLLLEWLAMAVMLLLLCCCLTD
配列番号36
MIELSLIDFYLCFLAFLLFLVLIMLIIFWFSLELQDHNETCHA
配列番号37
MKLLIVLTCISLCSCICTVVQRCASNKPHVLEDPCKVQH
配列番号38
MLPPCYNFLKEQHCQKASTQREAEAAVKPLLAPHHVVAVIQEIQLLAAVGEILLLEWLAEVVKLPSRYCC
[0018] 本明細書で使用される場合、「標的」は、本明細書に記載の改善されたペプチド原性を有するように改変することができる、表2に開示される特別に選択されたタンパク質である。第1列は、配列表に提供される配列に対応する配列番号を列挙する。第2列は、各標的の「タンパク質名」を列挙し、第3列は、第2列に列挙された各標的の機能、発現及び配列情報の両方について公に知られ、確立された説明を提供する、当技術分野で使用される固有の「目録」番号(UniProt参照番号は、Genome Reference Consortium(GRC)によって作成された、参照ゲノムアセンブリに対するプロテオームのマッピングを提供する)である「UniProt参照番号」を提供する。各標的に対応する配列情報を含むこの公開情報(2020年4月にUniProtデータベース(uniprot.org)から取得)は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。表2は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成するために変異させることができる各標的タンパク質の特定の残基の位置と、各位置で置換することができる特定のアミノ酸を記載している。好ましい実施態様では、各標的タンパク質において、複数の置換を、配列表の列挙された位置で、及び表2に示されるように、行うことができる。さらなる好ましい実施態様では、各標的タンパク質について表2に示される残基のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又はそれ以上を任意の組み合わせで、実施例1の最後の2つの段落に記載されているように、表2に指定されたアミノ酸を使用して、第2列に記載のそれぞれの開始標的タンパク質において変更することができる。変異を複数の位置及び/又は標的タンパク質に広げることによって、及びこれらの変異した分子を混合することによって、免疫カクテルを作成することができる。
[0019] 例えば、免疫原性を高めるためにSARS-CoV-2のスパイクタンパク質(表2に開示)を操作する方法を評価する際に、本明細書に開示したような方法を適用して、試験され得る置換の優先順位付きの短いリストを作成した。
A.芳香族残基の変異
コアには多くの芳香族残基が存在する。適度な大きさの空洞(約3炭素の体積)を、深刻な立体衝突を起こさずに作成するには、表2に示すように、TyrとPheをLeuに、PheをTrpに置換することを提案する。好ましい変異には、SARS-CoV-2スパイクタンパク質において以下の位置に位置する変異が挙げられるが、これらに限定されない:配列番号15のTrp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/又はPhe543。
コアには多くの芳香族残基が存在する。適度な大きさの空洞(約3炭素の体積)を、深刻な立体衝突を起こさずに作成するには、表2に示すように、TyrとPheをLeuに、PheをTrpに置換することを提案する。好ましい変異には、SARS-CoV-2スパイクタンパク質において以下の位置に位置する変異が挙げられるが、これらに限定されない:配列番号15のTrp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/又はPhe543。
B.脂肪族残基(Ala、Cys、及びProを除く)の変異
コア内又はコアの周囲には、埋もれたMet、Leu、Ile、及びValアミノ酸残基もある。これらを表2に示す位置でAlaに変異させることを提案する。これにより、上記の変異と同様に、3~4個の炭素が除去されるため、パッキング欠陥が生じる。SARS-CoV-2スパイクタンパク質における好ましい変異は、以下の位置に位置する変異が挙げられるが、これらに限定されるものではない:配列番号15のVal308、Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/又はLeu585。
コア内又はコアの周囲には、埋もれたMet、Leu、Ile、及びValアミノ酸残基もある。これらを表2に示す位置でAlaに変異させることを提案する。これにより、上記の変異と同様に、3~4個の炭素が除去されるため、パッキング欠陥が生じる。SARS-CoV-2スパイクタンパク質における好ましい変異は、以下の位置に位置する変異が挙げられるが、これらに限定されるものではない:配列番号15のVal308、Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/又はLeu585。
C.アラニンの変異
同程度の数の埋もれたアラニンが存在する。ここで好ましい置換はGlyであり、これは折り畳まれていない状態のコンフォメーションエントロピーを増大させ、それによって折り畳まれた状態を不利にする。一般に、このような変異は、通常、球状タンパク質の安定化自由エネルギーにおいて約1.5±1.0kcalの減少しかもたらさないが、残基がアルファヘリックスなどの二次構造要素にある場合には、その効果は拡大する可能性がある。このクラスにおける予想される変異も表2に示されている。好ましい変異には、以下の位置に位置するSARS-CoV-2スパイクタンパク質の変異が挙げられるが、これらに限定されない:配列番号15のAla363、Ala397、及び/又はAla575。
同程度の数の埋もれたアラニンが存在する。ここで好ましい置換はGlyであり、これは折り畳まれていない状態のコンフォメーションエントロピーを増大させ、それによって折り畳まれた状態を不利にする。一般に、このような変異は、通常、球状タンパク質の安定化自由エネルギーにおいて約1.5±1.0kcalの減少しかもたらさないが、残基がアルファヘリックスなどの二次構造要素にある場合には、その効果は拡大する可能性がある。このクラスにおける予想される変異も表2に示されている。好ましい変異には、以下の位置に位置するSARS-CoV-2スパイクタンパク質の変異が挙げられるが、これらに限定されない:配列番号15のAla363、Ala397、及び/又はAla575。
D.システインの変異
表面のジスルフィドは一般に還元的アンフォールディングを促進するため、溶媒露出ジスルフィドはそのままにしておくことが望ましいと考えられる。そこで、埋もれた、又は部分的に埋もれたジスルフィドを除去するために、システインからアラニンへの二重変異体を提案する。例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質では、以下の変異を提案する:配列番号15のCys336Ala/Cys361Ala、及び/又はCys379Ala/Cys432Ala。
表面のジスルフィドは一般に還元的アンフォールディングを促進するため、溶媒露出ジスルフィドはそのままにしておくことが望ましいと考えられる。そこで、埋もれた、又は部分的に埋もれたジスルフィドを除去するために、システインからアラニンへの二重変異体を提案する。例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質では、以下の変異を提案する:配列番号15のCys336Ala/Cys361Ala、及び/又はCys379Ala/Cys432Ala。
候補変異のさらなる優先順位付けのための一般的な考慮事項:
A.T細胞エピトープの生成。目的は、ファゴソーム/リソソーム内でアンフォールドするであろう抗原の割合を適切なキネティクスで増加させ、抗原ペプチドを徹底的にタンパク質分解プロセシングし、APCのMHCII受容体にロードできる時間枠内に置くことである。
A.T細胞エピトープの生成。目的は、ファゴソーム/リソソーム内でアンフォールドするであろう抗原の割合を適切なキネティクスで増加させ、抗原ペプチドを徹底的にタンパク質分解プロセシングし、APCのMHCII受容体にロードできる時間枠内に置くことである。
B.比較的低い特定の接触順序を持つ残基(すなわち、一次アミノ酸配列で近くにある3次元構造の他の残基としか接触しない残基)の変異と、遷移状態を不安定にする高φ値の変異の回避。接触順序は、タンパク質内の全ての残基間接触を決定し(適切な制約を使用)、接触する残基の全てのペア間のポリペプチド鎖の線形分離を集計し(タンパク質鎖の総長に正規化)、これらの成分の距離を合計することによって計算することができるタンパク質のグローバルなトポロジー特性である。高接触順序のタンパク質は、アミノ酸のペア間でより長距離の相互作用を示し、一般に、よりゆっくりと折り畳まれる(Plaxco et al,J.Mol.Biol.277:985[1998];Shi et al,BMC Bioinformatics 9:255[2008])。
[0019] 変異させる残基候補のリスト(上記)の優先順位付けフィルターとして、各候補残基の3D構造における特定の接触情報をランク付けし、接触順序への寄与が最も低い残基を選択することができる。本質的に、このランキングは、変異している残基とそれが3D構造で接触する他の残基との間で(一次アミノ酸配列において)より小さいループサイズを持つ傾向がある残基を特定する。その根拠は次の通りである:(i)フォールディング遷移状態を安定化させる残基の変異は、フォールディング速度を低下させ、アンフォールディング速度の増加を嫌う傾向がある(すなわち、「高φ値」残基-Fersht & Daggett,Cell 108:573[2002];Chiti et al,Nature Struct.Biol.6:1005[1999])、及び(ii)フォールディング遷移状態においてネイティブなフォールドトポロジーを確立するのに関与する残基は、より長い範囲の相互作用を示す傾向がある。我々の優先順位付け手順は、高Φ値の残基のように、主に非局所的な接触を持つ、これらの残基を重要視しないことを目的としている。
[0020] したがって、ポリペプチド配列において近位にある他の残基とほとんど局所的に接触している残基に最初の変異誘発の取り組みを集中させることは、フォールディング速度の過度の増加を回避しながら、アンフォールディング速度を増加させる(したがって、リソソーム抗原プロセシングを促進する)変異に有利に働くはずである。抗原の局所的に影響力のある変異は、表面の可鍛性を促進することによって、免疫原性の面でも追加の利益をもたらす可能性がある。このことは、B細胞の成熟過程で抗原パッチの拡大を促進し、あるいは、一次B細胞選択の段階で、これまでナイーブB細胞と反応しなかった抗原タンパク質表面の領域で、新しいB細胞エピトープをアンマスクする可能性があると仮定している。
[0021] 以下は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の優先順位付けされた変異の短いリストであり、その全てが40アミノ酸以下の平均的な特定の残基間接触ループサイズを示している:配列番号15のAla419、Ile980、Ala903、Leu916、Ala575、Phe1095、Cys1032、Val576、Tyr365、Ile1115、Ile418、Leu387、Cys649、Leu650、Leu585、Ala1080、Ile410、Tyr423、Ala1087、Tyr695、Ala653、Phe201、Ile1081、Phe497、Ala989、Leu552、Val1104、及び/又はCys671。
[0022] さらに、表2は埋もれたシステイン残基を具体的に列挙しているが、当業者であれば、表2で特定されたシステインとのジスルフィド結合対にある溶媒露出システインの変異も具体的に企図されることを理解するであろう。通常、埋もれたシステインとジスルフィド結合で対になっている溶媒露出システインを変異させることで、対になっていないシステイン残基を残すことが回避され、異常なジスルフィド結合形成、スクランブリング、及びオリゴマー化を防止するであろう。
[0023] 上記の変異及び/又は表2に開示されている変異のいずれかの組み合わせが具体的に企図される。例えば、コアとなる疎水性空洞を作成する変異を、ジスルフィド変異体バックグラウンドにおいて配置することができる。変異体のコレクションのアンフォールディング特性が確立され、適切なサブセットが選択されれば、各変異体抗原は、免疫原性について動物で個別に試験することができる。次に、最も有望な変異抗原の様々な組み合わせを含むカクテルを構築し、免疫原性についても試験することができる。
[0024] さらに好ましい実施態様では、SARS-CoV-2スパイクタンパク質において、以下の部位の変異が好ましい:
A. 配列番号15のTrp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/若しくはPhe543;
B. 配列番号15のVal308、Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/若しくはLeu585;
C. 配列番号15のAla363、Ala397、及び/若しくはAla575;
D. 配列番号15のCys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;並びに/又は
E. 配列番号15のAla419、Ile980、Ala903、Leu916、Ala575、Phe1095、Cys1032、Val576、Tyr365、Ile1115、Ile418、Leu387、Cys649、Leu650、Leu585、Ala1080、Ile410、Tyr423、Ala1087、Tyr695、Ala653、Phe201、Ile1081、Phe497、Ala989、Leu552、Val1104、及び/若しくはCys671。
A. 配列番号15のTrp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/若しくはPhe543;
B. 配列番号15のVal308、Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/若しくはLeu585;
C. 配列番号15のAla363、Ala397、及び/若しくはAla575;
D. 配列番号15のCys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;並びに/又は
E. 配列番号15のAla419、Ile980、Ala903、Leu916、Ala575、Phe1095、Cys1032、Val576、Tyr365、Ile1115、Ile418、Leu387、Cys649、Leu650、Leu585、Ala1080、Ile410、Tyr423、Ala1087、Tyr695、Ala653、Phe201、Ile1081、Phe497、Ala989、Leu552、Val1104、及び/若しくはCys671。
[0025] さらに好ましい実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、スパイク糖タンパク質の断片である。好ましくは、断片は、図3に示すように(配列番号15~16及び43~110)、配列番号15のアミノ酸316~594、配列番号16のアミノ酸303~580、又はコロナウイルスの他の既知のスパイク糖タンパク質における同等の断片からなる。この切断断片は、本明細書に記載されているように、それ自体をワクチンとして使用することもできるし、以下の部位のいずれかでの変異と組み合わせることができる:(A)配列番号15のTrp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/又はPhe543;(B)配列番号15のIle326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576,及び/又はLeu585;(C)配列番号15のAla363、Ala397,及び/又はAla575;(D)配列番号15のCys336Ala/Cys361Ala,及び/又はCys379Ala/Cys432Ala;(E)配列番号15のAla419、Ala575、Val576、Tyr365、Ile418、Leu387、Leu585、Ile410、Tyr423、Phe497、及び/又はLeu552。最も好ましい実施態様では、断片は、配列番号15のY365、I402、及び/又はV511などの変異を含む。さらにより好ましい実施態様では、断片は、配列番号15の次の変異Y365L、I402V、及び/又はV511Aを含む。
[0026] さらに好ましい実施態様では、配列番号15のアミノ酸319~591を含む、又はそれらからなる切断型スパイクタンパク質は、以下の部位で好ましい変異と組み合わされている:(A)配列番号15のTrp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/若しくはPhe543;(B)配列番号15のIle326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/若しくはLeu585;(C)配列番号15のAla363、Ala397、及び/若しくはAla575;(D)配列番号15のCys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;並びに/又は(E)配列番号15のAla419、Ala575、Val576、Tyr365、Ile418、Leu387、Leu585、Ile410、Tyr423、Phe497、及び/若しくはLeu552。最も好ましい実施態様では、断片は、配列番号15のY365、I402、及び/又はV511などの変異を含む。さらにより好ましい実施態様では、断片は、配列番号15の次の変異Y365L、I402V、及び/又はV511Aを含む。
[0027] さらに好ましい実施態様では、配列番号15のアミノ酸319~541を含む、又はそれらからなる切断型スパイクタンパク質は、以下の部位で好ましい変異と組み合わされている:(A)配列番号15のTrp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、及び/若しくはPhe497;(B)配列番号15のIle326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、及び/若しくはVal539;(C)配列番号15のAla363及び/又はAla397;(D)配列番号15のCys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;並びに/又は(E)配列番号15のAla419、Tyr365、Ile418、Leu387、Ile410、Tyr423、及び/若しくはPhe497。最も好ましい実施態様では、断片は、配列番号15のY365、I402、及び/又はV511などの変異を含む。さらにより好ましい実施態様では、断片は、配列番号15の次の変異Y365L、I402V、及び/又はV511Aを含む。
[0028] 好ましい実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又は配列番号15のアミノ酸316~594若しくは配列番号16のアミノ酸303~580からなる断片をコードするポリヌクレオチドの混合物をin vitroで合成することができる。ポリヌクレオチドはまた、好ましくはDNA又はmRNAのいずれかを含み得る。好ましい実施態様では、ポリヌクレオチドはin vitroで転写された(IVT)mRNAである。IVT mRNAを含むmRNAは、ポリ(A)テイル及び/又は5’キャップをさらに含むことができる。別の好ましい実施態様では、mRNAは、結合型in vitro転写/翻訳(IVTT)の使用によるものを含め、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成するためにin vitroで翻訳され得る。
[0029] ポリヌクレオチドの混合物は、同じSARS-CoV-2開始タンパク質若しくは複数のSARS-CoV-2開始タンパク質若しくは複数の関連するSARS-CoV-2開始タンパク質のいずれかに由来する異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又は配列番号15のアミノ酸316~594若しくは配列番号16のアミノ酸303~580からなる断片をコードする配列を含むことができる。さらなる実施態様では、ポリヌクレオチドは、SARS-CoV-2タンパク質の混合物をコードし、ここで、混合物のタンパク質成分の1つはSARS-CoV-2開始タンパク質であり、他の成分は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又は配列番号15のアミノ酸316~594若しくは配列番号16のアミノ酸303~580からなる断片である。さらに好ましい実施態様では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを細胞又は臓器に標的化するターゲティング構成成分と会合することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ターゲティング構成成分と会合していないものであってもよい。また、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター配列を含み得る。
[0030] これらのポリヌクレオチドの混合物、並びにポリヌクレオチドの混合物を発現する動物(遺伝子改変又は遺伝子改変されていない)も企図される。好ましい実施態様では、動物は哺乳動物であり、さらに好ましい実施態様では、哺乳動物は、ヒト、マウス、ウサギ、ラマ、又はウシである。
[0031] さらに好ましい実施態様では、本方法は、免疫応答を誘導する。免疫応答は、in vivo、ex vivo、及び/又はin vitroで起こり得る。
[0032] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片をコードするポリヌクレオチドは、限定されないが、ポリヌクレオチドの混合物又はコードされたタンパク質の混合物を含み、注射によって動物に送達することができる。好ましい実施態様では、注射は、動物の筋肉内で行われる。ポリヌクレオチド/コード化タンパク質の動物への送達は、ワクチン接種の目的、研究、又は抗体開発に使用することができる。
[0033] さらに好ましい実施態様では、記載された方法によって産生された抗体が回収され、単離される。好ましい実施態様では、抗体は、完全ヒト抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ラクダ抗体、ヒト化抗体、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。好ましい実施態様では、ポリクローナル抗体は、さらに単一の単離抗体種に分画される。他の好ましい実施態様では、産生された抗体は、例えば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、又はパニング技法などによって親和性成熟される。
[0034] また、本明細書に記載の方法によって産生される抗体をコードするポリヌクレオチドも企図される。ポリヌクレオチドをコードするこれらの抗体はまた、異種プロモーター及び/又はベクター配列を含み得る。
[0035] 本明細書に記載されるように、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物並びに/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくは配列番号15のアミノ酸316~594若しくは配列番号16の303~580からなる断片をコードするポリヌクレオチドの混合物は、哺乳動物にワクチン接種するために使用することができる。
[0036] さらに好ましい実施態様では、本発明は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又は断片をプロセシングする方法であって、ここで、該方法は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又は配列番号15のアミノ酸316~594若しくは配列番号16のアミノ酸303~580からなる断片を抗原提示細胞に導入することであって、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、SARS-CoV-2開始タンパク質と比較して変化した立体構造動力学を有し、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、SARS-CoV-2開始タンパク質に類似する立体構造を有する、導入することと;抗原提示細胞が、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に由来するT細胞エピトープをプロセシング及び提示できるようにすることとを含む、方法である。
[0037] 好ましい実施態様では、抗原提示細胞は、樹状細胞、B細胞、単球又はマクロファージである。さらに好ましい実施態様では、本方法はin vitro又はex vivoで実施される。さらに好ましい実施態様では、抗原提示細胞は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされ、且つ/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又は配列番号15のアミノ酸316~594若しくは配列番号16のアミノ酸303~580からなる断片と接触させて配置される。さらに好ましい実施態様では、抗原提示細胞は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質若しくはSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び/又は配列番号15のアミノ酸316~594若しくは配列番号16のアミノ酸303~580からなる断片の食作用又は飲作用を受ける。
発明の詳細な説明
概要
[0041] 本明細書では、タンパク質の3-D立体構造を維持しつつSARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学を変化させることを通してタンパク質の「ペプチド原性潜在力(petidogenic potency)」を使用することによって抗体の生成を増強することを含む、免疫応答を生成する新規の方法を記載している。あるいは、配列番号15のアミノ酸316~594又は配列番号16のアミノ酸303~580からなる断片(「スパイク断片」の例)も、ワクチンとして使用する場合など、抗体を生成するために使用することができる。次いで、これらのSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片は、ワクチンとして使用して免疫応答を開始する、及び/又は抗体を生成するのに使用することができる。
概要
[0041] 本明細書では、タンパク質の3-D立体構造を維持しつつSARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学を変化させることを通してタンパク質の「ペプチド原性潜在力(petidogenic potency)」を使用することによって抗体の生成を増強することを含む、免疫応答を生成する新規の方法を記載している。あるいは、配列番号15のアミノ酸316~594又は配列番号16のアミノ酸303~580からなる断片(「スパイク断片」の例)も、ワクチンとして使用する場合など、抗体を生成するために使用することができる。次いで、これらのSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片は、ワクチンとして使用して免疫応答を開始する、及び/又は抗体を生成するのに使用することができる。
[0042] したがって、一実施態様では、本発明は、免疫応答を引き起こす方法であって、ここで、前記方法は、SARS-CoV-2開始タンパク質及び/又はスパイク断片に由来するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物を設計することであって、ここで、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、SARS-CoV-2開始タンパク質と比較して変化した立体構造動力学を有し、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、SARS-CoV-2開始タンパク質と立体構造が類似している、設計することと、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片を動物に導入し、免疫応答を生成することとを含む、方法を対象とする。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片は、動物に直接(例えば、接種若しくは免疫化によって)導入することができ、又は動物に導入された、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドによってin vivoで発現させることができる。これらのSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片の発現により、免疫応答が引き起こされ、好ましくはSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質と最初のSARS-CoV-2開始タンパク質の両方に対する抗体を生成する。
[0043] ポリヌクレオチドの導入は、例えば、直接又は樹状細胞のex vivoトランスフェクションを最初に行った後に行うことができる。さらに、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片をコードするポリヌクレオチドを生成し、動物内に導入することができる。次いで、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片を動物内で産生して、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に対する抗体を生成することができる。本明細書に記載された方法は、タンパク質の免疫原性に大きな影響を与える可能性を有する。タンパク質において変化する好ましい生物物理学的及び生化学的特性には、タンパク質の立体構造動力学、熱力学的安定性、MHC-II結合、及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質のプロテアーゼ感受性が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載される方法は、異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(同じ又は異なるSARS-CoV-2開始タンパク質のいずれかに由来する)に対する交差反応性抗体を同時に生成するのに使用することもでき、これは、抗体が動物において単回注射によって得ることができる抗体のレパートリーとして現在生成されている方式を大きく変える可能性を有し、抗体開発及びワクチン接種の有効性を合理化する可能性を有する。
[0044] 我々は、タンパク質の立体構造動力学が、免疫応答を開始するタンパク質の能力にとって重要であることを認識している。抗原が免疫化後にin vivoで効率的にペプチド断片を生成する傾向を、我々は「ペプチド原性」と呼んだ。タンパク質混合物として直接投与されるか又はポリヌクレオチドの混合物によって動物内で同時に発現させることができるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物を設計するためにSARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学を変更する能力を有することは、費用効果の高い方法で単回注射で広いレパートリーの抗体を生成する可能性を有する。
[0045] したがって、本明細書に開示されるように、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片の混合物で動物を免疫化すると、免疫系を強く刺激し、抗原提示細胞と接触させたときに、より強く、より良好な免疫応答を生成することができる。
[0046] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片の混合物(又はコンビナトリアルカクテル)による免疫化は、ペプチドを生成するタンパク質抗原(複数可)へのタンパク質分解攻撃の複雑さのために有利である。例えば、異なるアミノ酸配列を有する複数の異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を提供すると、適切な時間枠における所定のペプチド(T細胞エピトープ)の生成に最適な「チューニング変異(複数可)」が別のペプチドの生成に最適な変異とは異なり得る環境が作り出される。例えば、樹状細胞などの一部の細胞は、活性化期の間にT細胞応答を媒介する。これらの細胞が、この活性化ウィンドウの外(例えば、活性化の前又は後)に抗原を提示された場合、T細胞応答は引き起こされない可能性がある。したがって、T細胞は、免疫応答を引き起こすためには適切な時期に抗原を提示される必要があり、この時期は抗原提示細胞におけるタンパク質分解(例えば、プロテオリシス)の速度に支配される。抗原を混合物として与えることによって、異なる複数のSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が単一細胞によってエンドサイトーシスされ、これにより、その細胞によって産生され且つ提示されるペプチドの多様性が理論的に最大化される。さらに、増加した立体構造動力学を有するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、免疫応答を最大化すると期待される改善されたMHCクラスII結合をもたらす可能性がある。例えば、安定しすぎていて、したがって、プロテアーゼ分解が阻害され、それによってそれに続くペプチド提示が低下して、適応免疫における免疫応答の減弱をもたらすために比較的非免疫原性である、及び/又は良好なワクチン構成成分ではないタンパク質では、そのようなタンパク質は、SARS-CoV-2開始タンパク質と比較して類似する立体構造を維持しつつ立体構造動力学を変化させたSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物を生成するために本明細書に記載される通りに改変され得る。
[0047] 好ましい実施態様では、試験SARS-CoV-2開始タンパク質とも呼ばれるSARS-CoV-2開始タンパク質を系統的に変異させて、対応する折り畳みタンパク質の三次元構造を著しく変化させずに、SARS-CoV-2開始タンパク質の熱力学的安定性を変化させて、SARS-CoV-2開始タンパク質と本質的に同じ3D(立体構造)表面エピトープを提示しつつペプチド原性が増加したSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成することができる。
[0048] したがって、SARS-CoV-2開始タンパク質の免疫原性を、その立体構造動力学を変化させることによって増加させて多数のSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成し、次いでこれを動物内に同時に導入することができることによって、強い免疫応答を発生させ、より広いレパートリーのポリクローナル抗体を産生させ、単一の単離された種にさらに分画する(例えば、そのそれぞれのコード化mRNAを介して分子的にクローニングすることによって)ことができる可能性を有する。
定義
[0049] 別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、ペプチド化学、細胞培養及びファージディスプレイ、核酸化学及び生化学の分野などの当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学的手法、遺伝学的手法、生化学的手法には標準的な手法が使用されており(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology(1999)4th ed.,John Wiley & Sons,Inc.)、それらは参照により本明細書に組み入れられる。
[0049] 別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、ペプチド化学、細胞培養及びファージディスプレイ、核酸化学及び生化学の分野などの当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学的手法、遺伝学的手法、生化学的手法には標準的な手法が使用されており(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology(1999)4th ed.,John Wiley & Sons,Inc.)、それらは参照により本明細書に組み入れられる。
[0050] 本明細書で使用される場合、「ペプチド原性(peptidogenicity)」とは、免疫応答をもたらすために使用することができる多様なペプチドの堅牢なセットを効率的に産生するタンパク質の傾向を指す。ペプチド原性を測定するための様々なアッセイが存在する(例えば、Soら、図2c-d;Thaiら、図7c-f;及びDelamarreら、図1b-c、4b-c及び5a-bを参照)。
[0051]本明細書で使用される場合、「SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(SARS-CoV-2 peptidogenic protein)」とは、SARS-CoV-2開始タンパク質に類似する立体構造を維持しつつ、SARS-CoV-2開始タンパク質配列と比較してその立体構造動力学を変化させるようにそのアミノ酸配列が改変されている変異されたSARS-CoV-2タンパク質を指す。このようなSARS-CoV-2開始タンパク質の例を表2に示す。好ましくは、SARS-CoV-2開始タンパク質は、スパイクタンパク質である。
[0052] 本明細書で使用される場合、受容体結合ドメイン(「RBD」)は、その細胞侵入受容体へのウイルスの結合に関与する当技術分野で認められたドメインを含み、これはスパイクタンパク質内にも見られ、配列番号15のアミノ酸319~541及び配列番号16のアミノ酸306~527として特定される。
[0053] 本明細書で使用される場合、「スパイク断片」は、コロナウイルスによってコードされるスパイクタンパク質内に含まれるRBDドメインを含むスパイクタンパク質のアミノ酸断片であって、これは、配列番号15のアミノ酸316~594及び/又は配列番号16のアミノ酸303~580に対応するものをいう。図3は、他の既知のコロナウイルスがコードするスパイクタンパク質において、この相当する断片のアミノ酸の始まりと終わりを示している。新たに同定されたコロナウイルスが発見された場合、図3のアライメントを繰り返すことによって、この同じスパイク断片を容易に同定できることが特に企図される。さらに好ましい実施態様では、異なるコロナウイルスに由来するスパイク断片又はそのような断片をコードするポリヌクレオチドの混合物が、本明細書に記載のように使用される。
[0054] 本明細書で使用される場合、「非表面残基」は、SARS-CoV-2タンパク質の3D構造に関して表面に露出できない残基、例えば、天然SARS-CoV-2タンパク質の3D構造の内部で埋もれている残基である。好ましい実施態様では、「非表面」残基はLee及びRichardsの方法によって定義されており(例えば、Lee B et al.,J.Mol.Biol.(1971);55(3):379-IN4.dx.doi.org/10.1016/0022-2836(71)90324-X.を参照)、天然タンパク質中の残基の相対的溶媒露出度は50%未満、40%未満、30%未満、25%未満、20%未満、10%未満、5%未満、若しくは0%であり、又は同じ方法によって、絶対的溶媒露出表面積と完全に伸張したAla-X-Alaトリペプチドの表面積の差(例えば、Gready JE et al.,Protein Science.(1997);6(5):983-98.doi:10.1002/pro.5560060504.を参照)は40Å2よりも大きい、50Å2よりも大きい、60Å2よりも大きい、70Å2よりも大きい、80Å2よりも大きい、90Å2よりも大きい、100Å2よりも大きい、110Å2よりも大きい、又は120Å2よりも大きい。さらなる好ましい実施態様では、「非表面」残基は、当業者に周知の構造分析ソフトウェアパッケージによって計算される場合、10Å2未満、5Å2未満、2.5Å2未満、又は1Å2未満の溶媒露出表面積を有する残基として定義される(例えば、UCSF Chimera(例えば、Pettersen EF et al.,J.Comput.Chem.(2004);25(13):1605-12.Epub 2004/07/21を参照)、PyMol(例えば、Schrodinger,LLC.The PyMOL Molecular Graphics System,Version 1.8.2015を参照)、等。
[0055] 本明細書で使用される場合、「SARS-CoV-2開始タンパク質」又は「試験SARS-CoV-2開始タンパク質」は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を導き出すために使用される「最初の」又は「基準」SARS-CoV-2タンパク質のアミノ酸配列を指す。いくつかの例では、「SARS-CoV-2開始タンパク質」は、さらに修飾されたSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質であり得、SARS-CoV-2開始タンパク質のN及び/又はC末端欠失を含み得る。
[0056] 本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、タンパク質をプロセシングした後に抗原提示細胞によって引き起こされる液性免疫応答及び/又は細細胞媒介性免疫応答を指す。液性免疫応答では、Bリンパ球が天然の未プロセシング抗原と反応する抗体を産生する。これらの抗原抗体反応は、場合によっては、補体カスケードを活性化する細胞表面抗原含むことがあり、この補体カスケードはそれらの抗原を持つ細胞の溶解を引き起こす。細胞媒介性免疫応答では、Tリンパ球は、異物として認識されたプロセシングされたペプチド抗原の存在下でマクロファージを動員する。活性化されたTリンパ球は外来抗原を持つ細胞を直接攻撃することもできる。
[0057] 本明細書で使用される場合、「抗原提示細胞」とは、タンパク質をペプチドに分解(「プロセシング」)し、ペプチドをMHC対立遺伝子、好ましくは主要なHLA複合体クラスI又はクラスII分子と共に細胞表面上に提示することができる細胞を指す。抗原提示細胞の例としては、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、及び単球が挙げられるが、これらに限定されない。
[0058] 本明細書で使用される場合、「立体構造動力学」とは、タンパク質分子中の互いに関する原子又は原子群の空間配置でのタンパク質構造の現象関連立体構造変化及び柔軟性として定義される。立体構造動力学は、「呼吸」運動を含み、タンパク質分子内で共有結合的結合により結合しており、固有の復元力に支配されるが、水素結合、ファンデルワールス力、及び静電相互作用などの非共有結合相互作用により調節される原子の振動、曲げ、ねじれ、回転、及び他の許容される運動モードを含む。これらの運動は、サブピコ秒以下の時間尺度でタンパク質の幾何配置を微妙に変化させることができ、立体構造状態の膨大な多様性をマイクロ秒からミリ秒の時間尺度でもたらすことができる。タンパク質の立体構造分子動力学は、コンピューターシミュレーションを使用して研究されることがよくある。例えば、Shaw et al(2010)Science 330,341を参照。また、本明細書で使用されるように、SARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学は、化学修飾、アミノ酸置換、及び欠失、挿入、トランケーションなどの他の変異、又はそれらの任意の組み合わせによって変化させることができる。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の立体構造動力学が野生型タンパク質に関して変化していると述べることは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の1つ又は複数のアミノ酸置換が、野生型タンパク質と比較して変化した立体構造動力学をもたらすことを意味する。
[0059] 本明細書で使用される場合、「熱力学的安定性」は、エネルギーが放出又は消費されないか、又は最小限のエネルギーしか放出又は消費されず、したがって、熱エネルギーの変化は存在しないか最小限に抑えられ、系が所与のセットの実験条件下でその最低のエネルギー状態にある化学系という観点から定義される。また、本明細書で使用される場合、「熱力学的安定性の減少」又は「減少した熱力学的安定性」とは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の熱力学的安定性に関するパラメータが同じ条件下で測定されたSARS-CoV-2開始タンパク質のパラメータに比べて減弱していることを意味し、この減少はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質において、化学修飾、アミノ酸置換、及び他の遺伝子変異を介したSARS-CoV-2開始タンパク質の分子構造に対する変更によって達成することが可能であるが、これらに限定されない。熱力学的安定性の減少を測定する方法は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されており、融解温度及び尿素又はグアニジニウム塩酸塩誘導平衡アンフォールディング(変性)などのパラメータの測定を取り入れたプロトコルが含まれる。これらのパラメータは、通常、平衡又は準平衡の条件下で、タンパク質のアンフォールディング反応を温度又は変性剤濃度の関数としてモニターすることによって到達される。折り畳まれた状態の濃度と比べて折り畳まれていない状態の濃度を測定することによってアンフォールディング反応をモニターするための方法としては、UV吸収、蛍光、及び円偏光二色性が挙げられるが、これらに限定されない。このアプローチにより、同じ条件下で測定されたSARS-CoV-2開始タンパク質の安定化自由エネルギーに対する変異タンパク質の安定化自由エネルギー(ギブズ自由エネルギー)の計算が可能になる。自由エネルギーの差は、通常、ΔΔG=ΔG変異体-ΔG標準(例えば、wt)によって表され、式中、ΔG変異体及びΔG標準(例えば、wt)はそれぞれ変異と「標準」(例えば、wt又は野生型)タンパク質の安定化自由エネルギーであり、ΔΔGは差である。ΔΔG>0は標準タンパク質より安定性の低い変異タンパク質を示し、ΔΔG<0は標準タンパク質より安定性の高い変異タンパク質を示している。
[0060] 本明細書で使用される場合、タンパク質の非表面残基を変異させた(及び、結果的にその全体的立体構造動力学を潜在的に改変した)後に、抗体がSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質とSARS-CoV-2開始タンパク質の両方と交差反応するのを可能にするように3-D構造が十分に維持されている場合には、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質はSARS-CoV-2開始タンパク質に「類似する立体構造」を有する。「交差反応性」は、本明細書に記載されるような、又は当技術分野で周知である結合アッセイにより測定することができ、解離定数(KD)、オフレート(koff)、及び/又はオンレート(kon)に基づく「結合親和性」として測定される。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、SARS-CoV-2開始タンパク質と同一の3-D構造を有する必要はなく、たとえ結合親和性が同一でない可能性があるとしても、抗体が両方のタンパク質を認識することを可能にする類似の3D立体構造エピトープ(不連続エピトープを含む)を示す十分に類似する構造であればよい。
[0061] 本発明において、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質、スパイク断片、及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。このように、用語抗体には、抗体分子全体だけでなく、抗体断片、並びに抗体及び抗体断片のバリアント(融合タンパク質などの誘導体を含む)も包含する。本出願において用語「抗体」によって説明される分子の例は、単鎖Fv(scFv)、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、Fv、及びVL又はVHドメインのいずれかを含む、あるいはそれからなる断片を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される用語「単鎖Fv」又は「scFv」は、抗体のVHドメインに連結された抗体のVLドメインを含むポリペプチドを指す。Carter(2006)Nature Rev.Immunol.6:243を参照。
[0062] さらに、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、又はキメラ抗体、単鎖抗体、ラクダ科抗体、Fab断片、F(ab’)断片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、ドメイン抗体及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を含むがこれらに限定されない。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスのものであり得る。
[0063] 最も好ましくは、抗体は、ヒト抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリー及びヒト抗体を産生するように遺伝子操作された異種マウス又は他の生物から単離された抗体を含む。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を製造するためのいくつかの技術並びにそのような抗体を製造するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば、PCT公報国際公開第98/24893号;国際公開第92/01047号;国際公開第96/34096号;国際公開第96/33735号;欧州特許第0598877号;米国特許第5,413,923号;同5,625,126号;同5,633,425号;同5,569,825号;同5,661,016号;同5,545,806号;同5,814,318号;同5,885,793号;同5,916,771号;及び同5,939,598号;並びにLonberg and Huszar,Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995)を参照。
[0064] ヒト抗体又は「ヒト化」キメラモノクローナル抗体は、本明細書に記載の技術又はその他当技術分野で公知の技術を使用して製造することができる。例えば、キメラ抗体を製造するための方法は当技術分野では公知である。概説については、以下の参考文献:Morrison et al.,Science 229:1202(1985);Oi et al.,BioTechniques 4:214(1986);Cabilly et al.,米国特許第4,816,567号;Taniguchi et al.,EP171496;Morrison et al.,EP173494;Neuberger et al.,国際公開第8601533号;Robinson et al.,国際公開第8702671号;Boulianne et al.,Nature 312:643(1984);Neuberger et al.,Nature 314:268(1985)を参照。
[0065] 本発明の抗体は、一価、二価、三価又は多価であり得る。例えば、一価scFvは化学的に又は別のタンパク質若しくは物質との会合によって多量体化することができる。ヘキサヒスチジンタグ又はFlagタグに融合されているscFvは、Ni-NTAアガロース(Qiagen)を使用して又は抗Flag抗体(Stratagene,Inc.)を使用して多量体化することができる。
[0066] 本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又はそれ以上の多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質、複数のSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質、SARS-CoV-2開始タンパク質、及び/又はスパイク断片に特異的であってもよく、又は多重特異性抗体は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、及び/若しくはSARS-CoV-2開始タンパク質の両方並びに異種ポリペプチドなどの異種エピトープ若しくは固体支持体材料に特異的であってもよい。例えば、PCT公報国際公開第93/17715号;国際公開第92/08802号;国際公開第91/00360号;国際公開第92/05793号;Tutt,et al.,J.Immunol.147:60-69(1991);米国特許第4,474,893号;同第4,714,681号;同第4,925,648号;同第5,573,920号;同第5,601,819号;Kostelny et.al.,J.Immunol.148:1547-1553(1992)を参照。本明細書で使用される用語「断片」とは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2開始タンパク質のアミノ酸配列のうちの少なくとも5アミノ酸残基、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも15アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、少なくとも25アミノ酸残基、少なくとも30アミノ酸残基、少なくとも35アミノ酸残基、少なくとも40アミノ酸残基、少なくとも45アミノ酸残基、少なくとも50アミノ酸残基、少なくとも60アミノ残基、少なくとも70アミノ酸残基、少なくとも80アミノ酸残基、少なくとも90アミノ酸残基、少なくとも100アミノ酸残基、少なくとも125アミノ酸残基、少なくとも150アミノ酸残基、少なくとも175アミノ酸残基、少なくとも200アミノ酸残基又は少なくとも250アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施態様では、断片は、約8~24アミノ酸残基又は約5~30アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドを指すこともある。好ましい実施態様では、スパイク断片は、配列番号15のアミノ酸316~594又は配列番号16のアミノ酸303~580からなる。
[0067] 本明細書で使用される用語「融合タンパク質」とは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片、SARS-CoV-2開始タンパク質、及び/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体のアミノ酸配列並びに1つ又は複数の異種ペプチド及び/若しくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む、あるいはそれからなるポリペプチドを指す。ワクチン適用では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片に融合された異種ポリペプチド配列は、好ましくはウイルスタンパク質由来である。
[0068] 本明細書で使用される用語「宿主細胞」とは、核酸分子をトランスフェクトされた特定の対象細胞、及びそのような細胞の子孫又は潜在的子孫を指す。子孫は、後継世代で起こり得る突然変異若しくは環境の影響若しくは発生段階又は核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組込みに起因して、核酸分子をトランスフェクトされた親細胞と同一でない場合がある。
[0069] 「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の化学的性質(例えば、サイズ、電荷、立体的特徴[例えば、ベータ分岐している対ベータ分岐していない]、極性[親水性対疎水性]、芳香族対非芳香族など)を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換である。特定の置換が「保存的」と見なされるかどうかは、置換が起こる折り畳まれたタンパク質の構造的状況にも依存し得る。アミノ酸の側鎖は、ある点では化学的に類似していても、別の点では化学的に非類似であることがあり、状況は、その特定の置換がいかに「保存的」である(すなわち、最も破壊的ではない)かという点において、これらの特性のうちのどれが支配しているかを決定し得る。化学的に類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン)、非極性側鎖(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。一部の側鎖は、生理的に適切なpH範囲でpH依存性であるハイブリッド特性を持っている。例えば、ヒスチジン(pKa~6)は、pH6未満ではより正電荷になり(塩基性)、pH7.5以上では極性であるが実質的に非電荷になる。
システイン(pKa~8.5)は、pH8未満では実質的に非電荷で(特に極性はない)がpH9では負電荷を帯びている(酸性)。チロシンフェノール側鎖も、より高いpHでは部分的にイオン化し、負電荷を帯びている。さらに、タンパク質の残りの部分の局所的静電環境(状況)は、これらの有効なpH値を実質的に移動させることができる。さらに、酸性タンパク質のシステインチオレート側鎖は、酸化型グルタチオンなどの中間的なジスルフィド含有化合物を含むチオールジスルフィド交換を介して、別のタンパク質のシステインチオールと反応して分子内ジスルフィド結合を形成することができ、このような結合は高度に疎水性である(非極性)。さらに、天然に存在する及び/又は天然に存在しないアミノ酸の両方を、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片に使用することができる。
システイン(pKa~8.5)は、pH8未満では実質的に非電荷で(特に極性はない)がpH9では負電荷を帯びている(酸性)。チロシンフェノール側鎖も、より高いpHでは部分的にイオン化し、負電荷を帯びている。さらに、タンパク質の残りの部分の局所的静電環境(状況)は、これらの有効なpH値を実質的に移動させることができる。さらに、酸性タンパク質のシステインチオレート側鎖は、酸化型グルタチオンなどの中間的なジスルフィド含有化合物を含むチオールジスルフィド交換を介して、別のタンパク質のシステインチオールと反応して分子内ジスルフィド結合を形成することができ、このような結合は高度に疎水性である(非極性)。さらに、天然に存在する及び/又は天然に存在しないアミノ酸の両方を、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片に使用することができる。
[0070] 変異は、コード配列の全て又は一部に沿って部位特異的様式で又は無作為に導入することができる。変異体のライブラリーは、特定の残基部位に単一アミノ酸置換、2つのアミノ酸置換、3つのアミノ酸置換、4つのアミノ酸置換など、最大で19のアミノ酸置換を導入するように設計することができる。さらに他の実施態様では、変異体のライブラリーは、所与の残基部位に19を超えるアミノ酸置換(天然及び非天然アミノ酸を含む)を導入するように設計することができる。さらに、ライブラリーは、2つの部位、3つの部位、4つの部位などで複数の変異を同時に生成するように組み合わせて設計することができる。変異誘発後、コードされたタンパク質はルーチン的に発現されてよく、コードされたタンパク質の立体構造動力学及び/又はペプチド原性は、本明細書に記載の技術又は当該技術分野で公知の技術をルーチン的に改変することによって決定することができる。得られた変異タンパク質は、変化した熱力学的安定性について、又はペプチド原性について、又はSARS-CoV-2開始タンパク質及び/又はスパイク断片に類似する立体構造についてスクリーニング及び評価することができる。あるいは、設計されたライブラリーからの発現されたタンパク質「出力」は、タンパク質の特性について事前にスクリーニングすることなく、動物を免疫化するために使用することができる。
[0071] 本明細書で使用される場合、「患者」又は「治療に適した対象」は、げっ歯類(例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス(mouse))、マウス(murine)(例えば、マウス(mouse))、イヌ(canine)(例えば、イヌ(dog))、ネコ(feline)(例えば、ネコ(cat))、ウマ(equine)(例えば、ウマ(horse))、霊長類、サル(simian)(例えば、サル(monkey)又は類人猿)、サル(monkey)(例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル)、類人猿(例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル)、又はヒトなどの哺乳動物であり得る。他の実施態様では、非ヒト哺乳動物、特に、ヒトにおける治療的有効性を実証するためのモデルとして従来から使用されている哺乳動物(例えば、マウス(murine)、霊長類、ブタ、イヌ(canine)、ラクダ、ラマ、又はウサギ)を用いてもよい。
[0072] 本発明の他の態様及び実施態様は、用語「含む(comprising)」を用語「からなる(consisting of)」に置き換えた本明細書に記載の態様及び実施態様と、用語「含む(comprising)」を用語「から本質的になる(consisting essentially of)」に置き換えた上記記載の態様及び実施態様とを提供する。
[0073] 本明細書で使用される場合、「及び/又は」は、他を含むか又は含まずに、2つ以上の特定の特徴又は構成成分のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「A、B及び/又はC」は、それぞれが個別に記載されているのと同様に、(i)A、(ii)B、(iii)C、(iv)A及びB、(v)A及びC、(vi)B及びC、並びに(vii)A及びB及びCのそれぞれの具体的な開示と解釈されるべきである。
タンパク質の立体構造動力学を変化させる方法
[0074] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片は、当技術分野で周知の標準的な分子生物学的変異誘発技術を使用して生成することができる。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片は、例えば、エラー・プローンPCR、無作為ヌクレオチド挿入若しくは欠失、又は組換え前の他の方法など、当技術分野で周知である無作為変異誘発によって生成することができる。
[0074] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片は、当技術分野で周知の標準的な分子生物学的変異誘発技術を使用して生成することができる。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片は、例えば、エラー・プローンPCR、無作為ヌクレオチド挿入若しくは欠失、又は組換え前の他の方法など、当技術分野で周知である無作為変異誘発によって生成することができる。
[0075] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片を生成するために、タンパク質操作を用いてもよい。当業者に公知である組換えDNA技術を使用して、単一若しくは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、又は融合タンパク質を含むSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片を作り出すことができる。このようなSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、本明細書に記載されるSARS-CoV-2開始タンパク質に類似する立体構造を維持しつつ変化した立体構造動力学を有するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に対してスクリーニングすることができる。
[0076] 例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片の立体構造動力学を増加させるために、以下の表、表1は、Loladze et al.,J.Mol.Biol.320,343-357(2002)の表1及び2からのタンパク質の範囲の例示的なアミノ酸置換についてのギブズ自由エネルギーの平均変化を示している[注:この論文は変異体と野生型タンパク質の間のギブズ自由エネルギーを表す場合は非標準的慣例を使用しており、すなわち、不安定化を示すためにマイナスの値(ΔΔG=ΔG(変異体)-ΔG(WT))を使用している;標準的慣例はプラスの変化が不安定化を示していることである(ΔΔG=ΔG(WT)-ΔG(変異体)、上記を参照)]。例えば、Val及びLeu(及び他のより大きな非極性アミノ酸残基)は、Ala、Thr、Asn、及び/又はGlyなどのより小さなアミノ酸残基で置換することができる。さらに、天然タンパク質構造におけるGluの埋没部位は、Leu、Val、Asn、Thr、Ser、Ala、及び/又はGlyで置換することができる。示されている単一部位アミノ酸置換のタイプは、一般に、SARS-CoV-2開始タンパク質の全体的な立体構造にほとんど影響を与えない。
[0077] タンパク質のコアにおいて立体構造動力学を増加させる不安定化変異を記載している別の例示的な論文は、Kim et al(1993)Protein Sci.2:588-596である。この研究で、著者らは、変異Phe22->Ala(2.1kcal/mol)、Tyr23->Ala(7.0kcal/mol)、Tyr35->Gly(5.7kcal/mol)、Asn43->Gly(6.0kcal/mol)、及びPhe45->Ala(7.2kcal/mol)は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤(BPTI)をpH3.5で、BPTIの全体的な3D構造を著しく破壊することなく、括弧内に示すそれぞれの量だけ不安定化することを示している。
[0078] さらに、当技術分野で公知の一般規則に従って選択された遺伝子の欠失、挿入、逆転、反復、及びタイプ置換は、活性にほとんど影響を与えないはずである。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作成する方法に関するガイダンスは、Bowie,J.U.et al.,“Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions,”Science 247:1306-1310(1990)に提供されており、ここで、著者らは、アミノ酸配列の変化に対する寛容を研究するためには2つの主なアプローチがあることを示している。第1の方法は、突然変異が自然淘汰によって受け入れられ、あるいは拒絶される進化の過程に依拠するものである。第2のアプローチは、クローニングされた遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入する遺伝子操作及び機能性を維持する配列を同定するための選択又はスクリーニングを使用する。
[0079] 著者らが述べているように、これらの研究により、タンパク質はアミノ酸の置換に対して驚くほど寛容であることが明らかになった。著者らは、どのアミノ酸変化がタンパク質のある特定の位置で許容される可能性が高いかをさらに示している。例えば、ほとんどの埋もれたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は一般にほとんど保存されていない。他のそのような表現型的にサイレントな置換は、上記のBowie,J.U.、及びそこに引用された参考文献に記載されている。典型的に保存的置換として見られるのは、脂肪族アミノ酸であるAla、Val、Leu及びIleの間の互いの置換;ヒドロキシル含有残基、SerとThrの相互交換;酸性残基、AspとGluの交換;側鎖アミド含有残基、AsnとGlnの間の置換;塩基性アミノ酸、LysとArgの交換;並びに芳香族残基、PheとTyrの間の置換である。
[0080] さらに好ましい実施態様では、SARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学は、(a)少なくとも1つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシン若しくはセリンで;又は(b)少なくとも1つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリン若しくはスレオニンで;又は(c)少なくとも1つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(d)少なくとも1つのロイシンをアラニン、バリン、グリシン若しくはイソロイシンで;又は(e)少なくとも1つのイソロイシンをアラニン、バリン、イソロイシン若しくはグリシンで;又は(f)少なくとも1つのプロリン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンを、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはグリシンで;又は(g)少なくとも1つのアスパラギン酸をグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンで;(h)少なくとも1つのグルタミン酸をアスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(i)少なくとも1つのリジンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(j)少なくとも1つのアルギニンをリジン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(k)少なくとも1つのヒスチジンをリジン、アルギニン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはグルタミンで;又は(l)少なくとも1つのアラニンをグリシン若しくはプロリンで;又は(m)少なくとも1つのアスパラギンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸で;又は(n)少なくとも1つのグルタミンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸若しくはヒスチジンで;又は(o)少なくとも1つのグリシンをアラニン若しくはプロリンで;又は(p)少なくとも1つの残基を非天然アミノ酸で;又は(q)(a)~(p)の任意の組み合わせで置換することによって変化している。さらに好ましい実施態様では、SARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学は、(a)少なくとも1つのトリプトファンをチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(b)少なくとも1つのチロシンをフェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(c)少なくとも1つのフェニルアラニンをチロシン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(d)少なくとも1つのプロリンをメチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(e)少なくとも1つのヒスチジンをフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、リジン、アルギニン、セリン、スレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンで;又は(f)少なくとも1つのメチオニンをイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(g)少なくとも1つのイソロイシンをロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(h)少なくとも1つのロイシンをイソロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(i)少なくとも1つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(j)少なくとも1つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリン若しくはスレオニンで;又は(k)少なくとも1つのアスパラギン酸をグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(l)少なくとも1つのグルタミン酸をアスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(m)少なくとも1つのアラニンをグリシン若しくはプロリンで;又は(n)少なくとも1つのセリンをアラニン若しくはグリシンで;又は(o)少なくとも1つのグリシンをアラニン若しくはプロリンで;又は(p)少なくとも1つのリジンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(q)少なくとも1つのアスパラギンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸で;又は(r)少なくとも1つのグルタミンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸若しくはヒスチジンで;又は(s)少なくとも1つのアルギニンをリジン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(t)少なくとも1つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシン若しくはセリンで;又は(u)疎水性残基をより小さな類似の疎水性残基で;又は(v)少なくとも1つの残基を非天然アミノ酸で;又は(w)上記の組み合わせのいずれかで置換することによって変化している。いくつかの実施態様では、疎水性残基が置換の標的とされる。
[0081]機能、立体構造、及び/又は構造に必須であり、タンパク質の表面対内部に位置する SARS-CoV-2開始タンパク質のアミノ酸は、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発(Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989))などの当技術分野で公知の方法によって同定することができる。後者の手順では、分子内の全ての残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異分子は、SARS-CoV-2開始タンパク質に類似する立体構造を維持しつつ、変化した立体構造動力学を有する分子に対して試験される。
[0082] 追加の実施態様では、SARS-CoV-2開始タンパク質のアミノ酸配列は1つ又は複数のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30又は50アミノ酸)を上記の置換アミノ酸(保存的又は非保存的置換のいずれか)で置換してSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片を生成する。例えば、SARS-CoV-2開始タンパク質の活性に関与しない位置及び/又はタンパク質構造の内部での置換は、容易に行うことができる。リガンド-受容体結合に極めて重要である部位も、結晶化、核磁気共鳴又は光親和性標識((Smith et al.,J.Mol.Biol.224:899-904(1992);及びde Vos et al.Science 255:306-312(1992))などの構造解析によって決定することができる。
[0083] 当業者に公知であるコンビナトリアル変異誘発及び合成的DNA合成アプローチを用いる組換えDNA技術を使用して、単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、付加又は融合タンパク質を含むSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片を作り出すこともできる。次いで、そのような改変ポリペプチドは、SARS-CoV-2開始タンパク質に類似する立体構造を維持しつつ、変化した立体構造動力学に対してスクリーニングしてもよい。
[0084] このようにして、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片は、1つ又は複数のアミノ酸残基が欠失、付加、又は置換されて、変化した立体構造動力学を有するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成するように作成することができる。例えば、タンパク質の疎水性「コア」の残基は、コアに空洞を作り出しパッキングを破壊するためにより小さな側鎖(上記を参照)を有する非極性残基で置換することができ、システイン残基は、ジスルフィド架橋(タンパク質コアにしばしば見出される)を除去するために、欠失させるか又は他のアミノ酸残基で置換することができる。いくつかの実施態様では、例えば、システインをアラニン、セリン、及び/又はグリシンなどで置換するなど、少なくとも1つのジスルフィド結合がSARS-CoV-2開始タンパク質において除去される。さらに好ましい実施態様では、少なくとも1つのジスルフィド結合の形成に関与する両方のシステインが、アラニン、セリン、及び/若しくはグリシン、又は好ましくはアラニン若しくはグリシンなどで置換される。
[0085] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは、実質的に精製されているさらに、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、B細胞活性化のために安定した3D立体構造エピトープを提示し、合成されたペプチド(化学合成などによる)は同時投与することができ、これによりMHC-II提示のためにエピトープを最適化することができる。あるいは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及びペプチドは、ポリヌクレオチドの混合物によって発現させることができる。さらに他の実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片は、野生型SARS-CoV-2開始タンパク質及び合成ペプチド(複数可)と組み合わせて、免疫応答を誘発することができる。
[0086] いくつかの実施態様では、ポリペプチド分解の速度は、ペプチドの最適な混合物を生成し、適切な時間枠で、抗原提示細胞上に提示されたペプチドの最大の多様性を可能にするように調整され得る。
[0087] 抗原の混合物(コンビナトリアルカクテルなど)を用いた免疫化は、提示用のペプチドを生成するタンパク質抗原(複数可)に対するタンパク質分解攻撃の複雑さのために有利である。したがって、適切な時間枠における所定のペプチド(T細胞エピトープ)の生成に最適な「チューニング変異(複数可)」は別のペプチドの生成に最適な変異とは異なる場合がある。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片を混合物として与えることにより、多数の異なる変異体SARS-CoV-2タンパク質が単一細胞又は複数細胞によってエンドサイトーシスされ得、これにより、その細胞によって産生され提示されるペプチドの多様性が最大化される。あるいは、スパイク断片を単独でワクチンとして投与することも可能である。
[0088] 対象が、同じ全体的な表面特徴(すなわち、交差反応するB細胞エピトープ)を有するが、異なる立体構造動力学を有する2つ以上の異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質で免疫化されるコンビナトリアル免疫化は、T細胞エピトープの多様性を富ませる。単回接種(タンパク質ベースとヌクレオチドベースの両方)で何百又は何千もの異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を含むこのコンビナトリアルアプローチは、B細胞エピトープレパートリーを大幅に増加させることができる。その理由は混合物中の全ての分子が野生型様立体構造を維持しつつ、1つ又は複数の固有のT細胞エピトープに寄与できるからである。いくつかの態様では、野生型立体配置が維持されるため、B細胞エピトープレパートリーは、アンサンブル中の最も安定な(且つおそらく野生型様の)分子に偏っている。
ペプチド原性タンパク質は、SARS-CoV-2開始タンパク質に類似する立体構造を有する
[0089] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が「SARS-CoV-2開始タンパク質に類似する立体構造」を有するかどうかの運用試験は、交差反応性抗体、特に、立体構造(3D)エピトープを認識する抗体がSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質とSARS-CoV-2開始タンパク質の両方に特異的に結合するかどうかである。本発明では、「交差反応性」又は「交差反応性抗体」は、解離定数(KD)、オフレート(koff)、及び/又はオンレート(kon)に基づいて測定することができる「結合親和性」の観点から定義される。
[0089] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が「SARS-CoV-2開始タンパク質に類似する立体構造」を有するかどうかの運用試験は、交差反応性抗体、特に、立体構造(3D)エピトープを認識する抗体がSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質とSARS-CoV-2開始タンパク質の両方に特異的に結合するかどうかである。本発明では、「交差反応性」又は「交差反応性抗体」は、解離定数(KD)、オフレート(koff)、及び/又はオンレート(kon)に基づいて測定することができる「結合親和性」の観点から定義される。
[0090] 例えば、交差反応性抗体は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質とSARS-CoV-2開始タンパク質の両方に5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M若しくは10-8M以下の解離定数又はKDで結合する。さらにより好ましくは、交差反応性抗体は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質とSARS-CoV-2開始タンパク質の両方に5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、若しくは10-14M以下の解離定数KDで結合する。本発明は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質の解離定数又はKDが、個々の列挙された値のそれぞれの間の範囲のいずれか1つに含まれることを包含する。さらに、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に結合する抗体のKDはSARS-CoV-2開始タンパク質に関するそのKDと同一でなくてもよいことが特に企図されており、好ましい実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に結合する抗体のKDはSARS-CoV-2開始タンパク質へのその結合のKDよりも小さい。操作上、この場合のKDは、抗原に対する抗体の機能的親和性を指すことが理解される。機能的又は「見かけの」親和性は、抗原に結合できる複数の相互作用部位(例えば、Fabアーム)を含む多価抗体において増強され得る(「結合活性効果」)。
[0091] さらに、交差反応性抗体は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質とSARS-CoV-2開始タンパク質の両方に、5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1若しくは10-3sec-1以下のオフレート(koff)で結合する。より好ましくは、交差反応性抗体は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質とSARS-CoV-2開始タンパク質の両方に、5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1、又は10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1若しくは10-7sec-1以下のオフレート(koff)で結合する。本発明は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質のオフレート(koff)が、個々の列挙された値のそれぞれの間の範囲のいずれか1つに含まれることを包含する。さらに、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に対する抗体のkoffはSARS-CoV-2開始タンパク質のkoffと同一でなくてもよいことが特に企図されており、好ましい実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質への抗体の結合についての(koff)はSARS-CoV-2開始タンパク質への抗体の結合についての(koff)よりも大きい。
[0092] 交差反応性を試験するためのアッセイは、本明細書に記載されているか、又は当技術分野で公知である。例えば、結合アッセイは、溶液中(例えば、Houghten,Bio/Techniques 13:412-421(1992))、ビーズ上(例えば、Lam,Nature 354:82-84(1991))、チップ上(例えば、Fodor,Nature 364:555-556(1993))、細菌上(例えば、米国特許第5,223,409号)、芽胞上(例えば、特許第5,571,698号;同第5,403,484号;及び同第5,223,409号)、プラスミド上(例えば、Cull et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869(1992))又はファージ上(例えば、Scott and Smith,Science 249:386-390(1990);Devlin,Science 249:404-406(1990);Cwirla et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382(1990);及びFelici,J.Mol.Biol.222:301-310(1991))で実施することができる。このようなアッセイの例は、以下の実施例にさらに記載されている。
ワクチンとしての使用
[0093] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片並びに/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチドの混合物は、動物をワクチン接種するために使用され得る。このワクチン接種は、スパイク断片及び/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に対する抗体の産生につながる可能性がある。上記の治療に適した対象は、げっ歯類(例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス(mouse))、マウス(murine)(例えば、マウス(mouse))、イヌ(canine)(例えば、イヌ(dog))、ネコ(feline)(例えば、ネコ(cat))、ウマ(equine)(例えば、ウマ(horse))、霊長類、サル(simian)(例えば、サル(monkey)又は類人猿)、サル(monkey)(例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル)、類人猿(例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル)、又はヒトなどの哺乳動物であり得る。好ましい実施態様では、対象はヒトである。他の実施態様では、非ヒト哺乳動物、特に、ヒトにおける治療的有効性を実証するためのモデルとして従来から使用されている哺乳動物(例えば、マウス、霊長類、ブタ、イヌ、又はウサギ動物)を用いてもよい。
[0093] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片並びに/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチドの混合物は、動物をワクチン接種するために使用され得る。このワクチン接種は、スパイク断片及び/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に対する抗体の産生につながる可能性がある。上記の治療に適した対象は、げっ歯類(例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス(mouse))、マウス(murine)(例えば、マウス(mouse))、イヌ(canine)(例えば、イヌ(dog))、ネコ(feline)(例えば、ネコ(cat))、ウマ(equine)(例えば、ウマ(horse))、霊長類、サル(simian)(例えば、サル(monkey)又は類人猿)、サル(monkey)(例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル)、類人猿(例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル)、又はヒトなどの哺乳動物であり得る。好ましい実施態様では、対象はヒトである。他の実施態様では、非ヒト哺乳動物、特に、ヒトにおける治療的有効性を実証するためのモデルとして従来から使用されている哺乳動物(例えば、マウス、霊長類、ブタ、イヌ、又はウサギ動物)を用いてもよい。
[0094] いくつかの実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片は、ワクチンに使用される、キメラ融合タンパク質、例えば、別のタンパク質、例えばウイルスコートタンパク質に融合されたタンパク質である。成分ワクチンの一部としてウイルスコートタンパク質に融合したペプチド原性タンパク質を送達するために使用され得るウイルスの例としては、最も広く使用され研究されているもののうち、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター(例えばアデノウイルス血清型5(Ad5))、ワクシニアウイルス、アルファウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルス(VsV)ベクター、カナリアポックスウイルスベクター及び麻疹ウイルスベクターが挙げられる。
[0095] ワクチン接種戦略は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片に対するメモリーB細胞及びメモリーT細胞の発生を可能にするために、本明細書に記載の対象へのSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片並びに/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチドの1つ又は複数の投与に基づくことができる。ワクチン接種は、予防的又は治療的に実施され得る。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、同じSARS-CoV-2開始タンパク質又は複数のSARS-CoV-2開始タンパク質のいずれかに由来し得る。予防的ワクチン接種戦略は、病原体に対する予防的適応免疫を発達させる際に対象の免疫系を刺激することを目的としているが、治療的ワクチン接種戦略の目標は、疾患がすでに確立された後、又は対象に存在する臨床状況を改善するために実施される。
[0096] タンパク質分解プロセシングは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片などの抗原が、エンドサイトーシス及びエンドソームのリソソームとの融合後抗原提示細胞においてプロセシングされることを含む。次いで、エンドソームはクラスII MHC分子を含むゴルジ装置由来のエキソサイトーシス小胞とマージして、それに生じたペプチドが結合する。次いで、MHC-ペプチド複合体は原形質膜に輸送され、そこで抗原はCD4+ T細胞への提示に利用可能である。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片のタンパク質分解プロセシングに制限があると、ペプチド生成物の多様性の狭小化を促進する可能性があり、そのためクラスII MHC分子が安定した結合パートナーを選択するための選択肢が少なくなり、主要抗原決定基の現象を悪化させる可能性がある。免疫応答性はクラスII MHC対立遺伝子の遺伝学によって支配されるため、免疫優位性が高まると、今度は集団における非応答者の割合が増加することになる。したがって、本明細書に記載のSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片並びに/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチドの混合物を使用するワクチンは、エンドソーム内タンパク質分解プロセシングから生じる抗原ペプチドの多様性を増加させるはずであり、したがってワクチンの有効性を増加させることが期待される。
[0097] 例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片をコードするポリヌクレオチドは、動物に直接導入することもできる。例えば、米国特許第5,676,954号;同第6,875,748号;同第5,661,133号;Sahin et al.,Nat Rev Drug Discov,2014 Oct;13(10):759-80;Kariko et al.,Mol Ther,2008 Nov;16(11):1833-40;Kariko et al.,Nucleic Acid Res,2011,Nov;39(21):e142;米国特許第6,511,832号を参照。一例として、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片の混合物をコードするDNA配列などのポリヌクレオチドが宿主動物に直接注射され、ポリヌクレオチドが核内に入り、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片を生成するためにmRNAに転写される。ポリヌクレオチドは、発現ベクター(例えばプラスミド)又は組換えウイルスベクターを含むDNAワクチンとして提供され得、ここで、例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片の混合物をコードするDNA配列が、それらの発現に適切な転写及び翻訳制御シグナルを有する構築物に含まれる。当業者は、DNAワクチンで使用するための適切な発現ベクター及びウイルスベクターをよく知っているであろう。このようなベクターについては、例えば、Kutzler et al.Nat.Rev.Genet.9(10):776-788(2008)に詳細に議論されている。DNAワクチンは、適切なアジュバントとともに処方され得、且つ/又はリポソーム(例えば、カチオン性リポソーム)、脂質無機ナノ粒子(LION)、及び脂質-核酸ナノ粒子(LNP)複合体などの様々な送達ビヒクルに組み込まれ得る(Bruun et al.,Int.J.Nanomedicine 10:5995-6008(2015)。他の場合では、DNAワクチンは「裸の」DNAワクチンであり得る。
[0098] 同様に、ポリヌクレオチドは、in vitroで転写されたmRNA(IVT mRNA)などのmRNA配列であってもよい。本質的に、合成mRNAは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片を発現するように操作でき、理想的には、mRNAは核に入ることなく細胞の細胞質で翻訳される。細胞質では、mRNAはリボソームによって解読され、SARS-CoV-2のペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片に翻訳される。ポリヌクレオチドは、発現ベクター又は組換えウイルスベクターを含むRNAワクチンとして提供され得る。いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、インタクトなウイルスRNAポリメラーゼ複合体(典型的にはアルファウイルス由来)をコードするウイルス由来レプリコン(repRNA)ワクチンとして提供され得るが、構造タンパク質遺伝子は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片(Xiong et al.,Science 243:1188-1191(1989))をコードするmRNA配列と置き換えられることになるだろう。DNAワクチンと同様に、例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片の混合物をコードするmRNA配列を含むワクチンは、適切なアジュバントと共に処方され、且つ/又はリポソーム及びLNPなどの様々な送達ビヒクルに組み込まれてもよく、又は裸の形態で投与されてもよい。
[0099] どちらの方法でも、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片がポリヌクレオチドから発現され、その後プロセシングされ、タンパク質による免疫化と同様に抗体を生成するために使用される。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片をコードするポリヌクレオチドは、遺伝的コドン縮退及び標準的なDNA合成技術を使用して合成することができる。同じペプチド原性タンパク質、同じSARS-CoV-2開始タンパク質に由来する異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質、及び/又は異なるSARS-CoV-2開始タンパク質に由来する異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードする異なるポリヌクレオチドの混合物を使用することができる。
[00100] 特に興味深いのは、SARS-CoV-2による重篤で生命を脅かす感染に特に罹りやすい患者集団である高齢者において強い防御免疫応答を達成できるワクチンである(Erasmus et al.,Sci.Transl.Med.12:555(2020);Pfizer Press release:“Pfizer and BioNTech Choose Lead mRNA Vaccine Candidate Against COVID-19 and Commence Pivotal Phase 2/3 Global Study”,27 July 2020;Walsh et al,medRxiv preprint doi:https://doi.org/10.1101/2020.08.17.20176651 2020年8月20日に投稿されたバージョン;Koff & Williams,New Engl.J.Med.383:805(2020))。液胞ATPaseの機能不全とその結果としてのリソソームpHの上昇は、高齢者によく見られる(Colacurcio & Nixon,Ageing Res.Rev.32:75)。リソソームにおいて酸性pHは主要なタンパク質変性剤であり、分解性リソソームプロテアーゼ(カテプシン)は酸性pHの活性最適値を有するため、リソソーム内pHの上昇はタンパク質分解プロセシングを妨げる。基質タンパク質のペプチド原性の増加は、この傾向に対抗し、高齢の個体の抗原提示細胞(APC)によるより効率的な抗原プロセシングにつながり、免疫応答を強化するはずである。強力なCD4+及びCD8+ T細胞応答を達成するための特定のアジュバント(リポソームベースのAS01Bアジュバント系など)及びその他の戦略の使用は、高齢患者において強力で防御的な免疫応答を達成するためにも採用され得る(Weinberger,Immunity & Ageing 15:3(2018))。
抗体を生成するためのSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の使用
[00101] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片はまた、当業者に周知の方法、例えば当技術分野で説明されている方法によって抗体を生成するために使用することができる。例えば、Sutcliffe et al.,上記を参照;Wilson et al.,上記を参照;Chow et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914(1985);及びBittle et al.,J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985)を参照。in vivo免疫化が使用される場合、動物は、本明細書に記載される、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、並びに/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするSARS-CoV-2ポリヌクレオチドで免疫化され得る。
[00101] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片はまた、当業者に周知の方法、例えば当技術分野で説明されている方法によって抗体を生成するために使用することができる。例えば、Sutcliffe et al.,上記を参照;Wilson et al.,上記を参照;Chow et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914(1985);及びBittle et al.,J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985)を参照。in vivo免疫化が使用される場合、動物は、本明細書に記載される、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、並びに/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするSARS-CoV-2ポリヌクレオチドで免疫化され得る。
[00102] ウサギ、ラット、マウス、ラマ、ラクダ、及び/又はウシなどの動物は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片、並びにSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片をコードするポリヌクレオチドで免疫化することができる。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片又は担体タンパク質と、フロイントアジュバント又は免疫応答を刺激することが知られている他のアジュバントを約100マイクログラム含有するエマルジョンの腹腔内及び/又は皮内注射を使用してもよい。例えば、固体表面に直接又は間接的に(例えば、ビオチン化AviTagを介して)吸着した遊離ペプチド原性タンパク質を使用するELISAアッセイによって検出できる抗ペプチド原性タンパク質抗体の有用な力価を提供するために、例えば約2週間の間隔で数回のブースター注射を必要とする場合がある。免疫された動物からの血清中の抗ペプチド原性タンパク質抗体の力価は、例えば、当技術分野で周知の方法に従って固体支持体上のSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片への吸着及び選択された抗体の溶出によって抗ペプチド原性タンパク質抗体を選択することによって増加させることができる。このような選択は、SARS-CoV-2開始タンパク質を使用して行うこともできる。
[00103] さらに、開示された方法によって生成された抗体は、例えば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ又はリボソームディスプレイなどのディスプレイ技術を使用して親和性成熟させることができる。一例では、ファージ粒子表面に提示された単鎖抗体分子(「scFv」)は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質に免疫特異的に結合するscFvを同定するためにスクリーニングされる。本発明は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質。及び/又はスパイク断片、及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質に免疫特異的に結合することが確認されているscFvとその部分の両方を包含する。そのようなscFvは、例えば、scFvのVH及び/又はVLドメインをコードするヌクレオチド配列を、定常ドメイン配列を含み、免疫グロブリン分子の発現を指示するように操作されている発現ベクターに挿入することにより、ルーチン的に免疫グロブリン分子に「変換する」ことができる。
発現系
[00104] 抗体コード配列と、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片のコード配列と、適切な転写及び翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を使用することができる。これらの方法には、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体(例えば、抗体全体、抗体の重鎖若しくは軽鎖、抗体の重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン、又はその一部、重鎖若しくは軽鎖のCDR、単鎖Fv、又はそれらの断片若しくはバリアント))のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ(例えば、PCT公開国際公開第86/05807号;PCT公開国際公開第89/01036号、及び米国特許第5,122,464号を参照)、抗体の可変ドメインは重鎖全体、軽鎖全体、又は重鎖と軽鎖全体の両方の発現のためにそのようなベクターにクローニングしてもよい。
[00104] 抗体コード配列と、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片のコード配列と、適切な転写及び翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を使用することができる。これらの方法には、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体(例えば、抗体全体、抗体の重鎖若しくは軽鎖、抗体の重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン、又はその一部、重鎖若しくは軽鎖のCDR、単鎖Fv、又はそれらの断片若しくはバリアント))のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ(例えば、PCT公開国際公開第86/05807号;PCT公開国際公開第89/01036号、及び米国特許第5,122,464号を参照)、抗体の可変ドメインは重鎖全体、軽鎖全体、又は重鎖と軽鎖全体の両方の発現のためにそのようなベクターにクローニングしてもよい。
[00105] 発現ベクター(複数可)は、従来の技術により宿主細胞にトランスフェクトすることができ、トランスフェクトされた細胞は、次に従来の技術により培養され、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはバリアントスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体のいずれかを生成する。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結した、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体(例えば、抗体全体、その重鎖若しくは軽鎖、若しくはその一部、又は本発明の単鎖抗体、若しくはその断片若しくはバリアント)を含有する宿主細胞を含む。好ましい実施態様では、抗体分子全体の発現のために、以下に詳述するように、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞内で共発現させてもよい。
[00106] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を発現するために、種々の宿主発現ベクター系が利用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が生産され、続いて精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換又はトランスフェクトされると、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を発現し得る細胞も表す。これらは、配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA若しくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、E.coli、B.subtilis)などの微生物;コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、Saccharomyces、Pichia);コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクターが感染した昆虫細胞系(例えば、バキュロウイルス);組換えウイルス発現ベクターが感染した若しくはコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV);又は哺乳動物細胞のゲノムに由来する(例えば、メタロチオネインプロモーター)若しくは哺乳動物ウイルスに由来する(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)プロモーターを含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3細胞)を含むがこれらに限定されない。好ましくは、Escherichia.coliなどの細菌細胞、より好ましくは真核細胞が、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又は組換え抗体分子のいずれかの発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせることで、効果的な発現系である(Foecking et al.,Gene 45:101(1986);Cockett et al.,Bio/Technology 8:2(1990))。
[00107] 細菌系では、使用目的に応じていくつかの発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、大量のタンパク質(SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対する抗体)を産生しようとする場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターは、融合タンパク質が産生されるようにコード配列が個々にベクター中にlac Zコード領域とインフレームでライゲートされてもよいE.coli発現ベクターpUR278(Ruther et al.,EMBO 1.2:1791(1983));pINベクター(Inouye & Inouye,Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985);Van Heeke & Schuster,J.Biol.Chem.24:5503-5509(1989));及び同類のものを含むがこれらに限定されない。pGEXベクターを使用して、外来ポリペプチドをグルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させてもよい。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着及び結合の後、遊離のグルタチオンの存在下での溶出により溶解した細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をGST部分から放出できるように、トロンビン又は第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
[00108] 昆虫系では、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)をベクターとして使用して、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を発現させてもよい。ウイルスはSpodoptera frugiperda細胞内で増殖する。コード配列は、ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)に個別にクローニングされ、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置かれてもよい。
[00109] 哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のコード配列はアデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三連リーダー配列にライゲートされ得る。次いで、このキメラ遺伝子は、in vitro又はin vivoの組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。
[00110] ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1又はE3)への挿入により、生存可能であり感染した宿主においてSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を発現することができる組換えウイルスが得られるであろう(例えば、Logan & Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 1:355-359(1984)を参照)。
[00111] 挿入されたコード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要な場合がある。これらのシグナルは、ATG開始コドン及び隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、全インサートの翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方で、様々な起源のものであってよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写終結因子などを含めることにより増強され得る(例えば、Bittner et al.,Methods in Enzymol.153:51-544(1987)を参照)。
[00112] さらに、挿入された配列の発現を調節する、又は遺伝子産物を所望の特定の様式で改変しプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のそのような修飾(例えば、グリコシル化)及びプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質や遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的且つ特異的なメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実にするために、適切な細胞株又は宿主系を選ぶことができ、この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞を使用してもよい。そのような哺乳動物宿主細胞は、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、NSO、MDCK、293、3T3、W138、並びに、特に、例えば、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及びT47Dなどの乳がん細胞株、並びに、例えば、CRL7O3O及びHsS78Bstなどの正常な乳腺細胞株を含むがこれらに限定されない。
[00113] 組換えタンパク質の長期的且つ高収率の生産のためには、安定した発現が好ましい。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を安定的に発現する細胞株を操作してもよい。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するよりはむしろ、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など)によって制御されるポリヌクレオチド及び選択可能マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来ポリヌクレオチドの導入に続いて、操作された細胞を濃縮培地で1~2日間増殖させておいてもよく、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーにより、選択に対して耐性を与えられ、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組み込み、増殖して細胞増殖巣を形成するのが可能になり、次にクローニングして細胞株に拡大させることができる。この方法を、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を発現する細胞株を操作するために有利に使用してもよい。
[00114] 単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al.,Cell 11:223(1977))、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992))、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al.,Cell 22:8 17(1980))遺伝子を含むがこれらに限定されないいくつかの選択系を使用してもよく、これらの遺伝子はそれぞれtk-、hgprt-又はaprt-細胞において用いることができる。さらに、以下の遺伝子:メトトレキセート耐性を与えるdhfr(Wigler et al.,Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980);O’Hare et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981));ミコフェノール酸耐性を与えるgpt(Mulligan & Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981));アミノグリコシドG-418耐性を与えるneo(Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy,12:488-505(1993);Wu and Wu,Biotherapy 3:87-95(1991);Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993);Mulligan,Science 260:926-932(1993);及びMorgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993);TIB TECH 11(5):155-2 15(May;1993))及びハイグロマイシン耐性を与えるhygro(Santerre et al.,Gene 30:147(1984))について代謝拮抗剤耐性を選択基準として使用することができる。組換えDNA技術の分野で一般に公知の方法をルーチン的に適用して所望の組換えクローンを選択してもよく、そのような方法は、例えば、Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990);及びChapters 12 and 13,Dracopoli et al.(eds),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley & Sons,NY(1994);Colberre-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1(1981)に記載されている。
[00115] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体の発現レベルはベクター増幅により増加させることができる(概説については、Bebbington and Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Vol.3.(Academic Press,New York,1987)を参照)。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を発現しているベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加するであろう。増幅された領域はコード配列と関連しているために、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体の産生も増加するであろう(Crouse et al.,Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。
[00116] ベクター配列に含めることができる他のエレメントは、異種シグナルペプチド(分泌シグナル)、膜アンカー配列、イントロン、選択的スプライシング部位、翻訳開始及び停止シグナル、インテイン、ビオチン化部位及び翻訳後修飾を促進する他の部位、精製タグ、他のタンパク質又はペプチドへの融合体をコードする配列、配列内リボソーム再進入部位によって分離される別々のコード領域、例えば、選択可能性(例えば、抗生物質耐性)又は分別性(例えば、蛍光)を付与する「マーカー」タンパク質をコードする配列、修飾ヌクレオチド、並びに他の公知のポリヌクレオチドシス作用性の特徴を含むが、これらの例に限定されない。
[00117] 抗体の場合、宿主細胞は、本発明の2つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第1のベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第2のベクターで同時トランスフェクトされ得る。2つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択可能マーカーを含有していてもよい。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現させることができる単一のベクターを使用することもできる。そのような状況では、軽鎖は好ましくは重鎖の前に配置されて、過剰な有毒の遊離重鎖を回避する(Proudfoot,Nature 322:52(1986);Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2 197(1980))。重鎖及び軽鎖のコード配列は、cDNA又はゲノムDNA又は合成DNA配列を含み得る。
[00118] 例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片(scFv、及び抗体断片又はそのバリアント(例えば、本発明の抗体の重鎖若しくは軽鎖若しくはその一部、又は本発明の単鎖抗体)を含むか、あるいはそれらからなる他の分子を含む)を使用して産生される抗体の組換え発現は、抗体又はその断片若しくはバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター(複数可)の構築を必要とする。本発明の抗体分子(例えば、抗体全体、抗体の重鎖若しくは軽鎖、又はそのバリアント若しくは部分(必須ではないが、好ましくは、重鎖若しくは軽鎖可変ドメインを含む))をコードするポリヌクレオチドが得られたら、抗体分子を産生するためのベクター(複数可)を、当技術分野で周知の技術を用いた組換えDNA技術によって製造することができる。したがって、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現させることによって抗体を調製する方法が本明細書に記載される。
[00119] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体が組換え発現により産生されると、それは、タンパク質の精製のための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性(特に、プロテインA親和性及び特異的抗原に対する免疫親和性により)、及びサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、差次的可溶性により、又はタンパク質の精製のための他の任意の標準技術により精製されてもよい。さらに、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体は、精製を容易にするために本明細書に記載される又は当技術分野で他に公知の異種ポリペプチド配列に融合させてもよい。
[00120] 一例では、本明細書に記載されるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体は、免疫グロブリン(IgA、IgE、IgG、IgM)の定常ドメイン若しくはその部分(CH1、CH2、CH3、又はその任意の組み合わせ及びその部分)、又はアルブミン(組換えヒトアルブミン又はその断片若しくはバリアントを含むがこれらに限定されない(例えば、1999年3月2日発行の米国特許第5,876,969号、欧州特許第0413622号及び1998年6月16日発行の米国特許第5,766,883号を参照))と融合させて、キメラポリペプチドを得てもよい。このような融合タンパク質は、精製を容易にすることができ、in vivoでの半減期を増加させる可能性がある。これは、ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメイン及び哺乳動物免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の定常領域の様々なドメインからなるキメラタンパク質について示されている。例えば、EP394,827;Traunecker et al.,Nature,331:84-86(1988)を参照。上皮性関門を通過して免疫系までの抗原の増強された送達は、IgG又はFe断片などのFcRn結合パートナーにコンジュゲートされた抗原(例えば、インスリン)について実証されている(例えば、PCT公開国際公開第96/22024号及び国際公開第99/04813号を参照)。IgG部分のジスルフィド結合によるジスルフィド連結二量体構造を有するIgG融合タンパク質は、単量体ポリペプチド又はその断片単独よりも他の分子と結合しそれを中和することがより効率的であることも見出されている。例えば、Fountoulakis et al.,J.Biochem.,270:3958-3964(1995)を参照。本明細書に記載されるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片又は抗体をコードする核酸は、発現されたポリペプチドの検出及び精製を補助するために、エピトープタグ(例えば、赤血球凝集素(「HA」)タグ又はフラッグタグ)として目的の遺伝子と組み換えることもできる。例えば、Janknechtらにより記載される系は、ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする(Janknecht et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8972-897)。この系では、目的の遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレームが6つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド内にサブクローニングされる。このタグは、融合タンパク質のマトリックス結合ドメインとして機能する。組換えワクシニアウイルスが感染している細胞由来の抽出物はNi2+ニトリロ酢酸アガロースカラムにロードされ、ヒスチジンタグ付きタンパク質はイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出させることができる。
製剤
[00121] 本明細書に記載されるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を、1つ又は複数の薬学的に許容される担体、アジュバント、添加物、希釈剤、充填剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、潤滑剤、又は当業者に周知の他の材料と共に含んでもよい。適切な材料は、無菌で発熱物質を含まないもので、適切な等張性と安定性を有するものである。例としては、無菌生理食塩水(例えば、0.9%NaCl)、水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール若しくは同類の物又はそれらの組み合わせが挙げられる。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性化合物の有効性を妨げないものでなければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、以下に論じるように、ボーラス、注入、注射、又は任意の他の適切な経路による投与経路に依存するであろう。組成物は、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝化剤又は同類の物などの補助物質をさらに含有してもよい。適切な担体、添加物などは、標準的な医薬品テキスト、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th edition,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1990に見出すことができる。
[00121] 本明細書に記載されるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を、1つ又は複数の薬学的に許容される担体、アジュバント、添加物、希釈剤、充填剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、潤滑剤、又は当業者に周知の他の材料と共に含んでもよい。適切な材料は、無菌で発熱物質を含まないもので、適切な等張性と安定性を有するものである。例としては、無菌生理食塩水(例えば、0.9%NaCl)、水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール若しくは同類の物又はそれらの組み合わせが挙げられる。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性化合物の有効性を妨げないものでなければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、以下に論じるように、ボーラス、注入、注射、又は任意の他の適切な経路による投与経路に依存するであろう。組成物は、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝化剤又は同類の物などの補助物質をさらに含有してもよい。適切な担体、添加物などは、標準的な医薬品テキスト、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th edition,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1990に見出すことができる。
[00122] 本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益/リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症がなく、対象(例えば、ヒト)の組織に接触させて使用するのに適している化合物、材料、組成物、及び/又は剤形に関係する。各担体、添加物などは、製剤の他の成分と適合するという意味でも「許容できる」ものでなければならない。
[00123] いくつかの実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体は、投与前の再構成のために凍結乾燥形態で提供されてもよい。例えば、凍結乾燥試薬は、対象への投与の前に、減菌水で再構成し、生理食塩水と混合されてもよい。
[00124] さらに、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体の「カクテル」が具体的に企図される。例えば、異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、又は同じSARS-CoV-2開始タンパク質に由来する異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチドの混合物を使用して免疫応答を開始することができる。あるいは、異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、又は異なる開始材料に由来する異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチドの混合物を使用して免疫応答を開始することもできる。そして最後に、単一のペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片及び/若しくはSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生された抗体を投与することができる。
[00125] 製剤は、好都合には単位剤形で提供され得、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。そのような方法は、活性化合物を、1つ又は複数の副成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体担体又は微粉固体担体又はその両方と均一且つ密接に会合させ、次いで必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
[00126] 製剤は液体剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤、シロップ剤、錠剤、ロゼンジ剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、アンプル剤、坐剤、膣坐剤、軟膏剤、ゲル剤、ペースト剤、クリーム剤、スプレー剤、ミスト剤、フォーム剤、ローション剤、油剤、ボーラス剤、舐剤、又はエアゾル剤の形態であってもよい。
[00127] 任意に、他の治療用又は予防用の薬剤を薬学的組成物又は製剤に含んでいてもよい。
[00128] 治療は、ヒト又は動物(例えば、獣医学的用途)のいずれであっても、任意の治療及び療法であってもよく、何らかの所望の治療効果、例えば、状態の進行の抑制又は遅延が達成されるものであり、治療効果は進行速度の減少、進行速度の停止、状態の改善、状態の治癒若しくは寛解(部分的又は全体的であるかを問わない)、状態の1つ又は複数の症状及び/若しくは徴候の予防、遅延、軽減若しくは停止、又は治療のない場合に予想されるよりも長い対象若しくは患者の生存期間の延長が挙げられる。
[00129] 予防的措置(すなわち、予防)としての治療も含まれる。例えば、疾患の発生又は再発を受けやすいか又はそのリスクがある対象は本明細書に記載されるように治療され得る。そのような治療は、対象において疾患の発生又は再発を予防又は遅延し得る。
[00130] 本明細書で使用される用語「治療的有効量」は、合理的な利益/リスク比に見合った、ある所望の治療効果を生み出すのに有効な、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体の量に関係する。
[00131] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体の適切な投与量は、患者によって異なり得ることが理解されるであろう。最適投与量を決定することは一般に、投与の任意のリスク又は有害な副作用に対する治療上の利益のレベルのバランスをとることが必要になるであろう。選択される投与量レベルは、投与経路、投与時間、活性化合物、他の薬物、化合物、及び/若しくは組み合わせて使用される物質の排泄速度、並びに患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態、及び/若しくはスパイク過去の病歴を含むがこれらに限定されない様々な要因に依存するであろう。ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体の量及び投与経路は、最終的には医師の裁量によるが、一般的には、実質的に害になる又は有害な副作用を引き起こさずに治療部位における活性化合物の濃度を達成するべきである。
[00132] 一般に、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片の好適な用量は、約1~100ugの範囲にある。好ましい実施態様では、これらのタンパク質、又はこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一次接種の後、好ましくは3~4週間後に二次用量が投与されるという免疫化スケジュールで投与される。必要に応じて、さらに3~4週間後に3回目の用量を投与することができる。また、決定された年間スケジュールで注射が与えられる、ブースタースケジュールを実施する必要がある場合もある。
[00133] あるいは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片に対して産生される抗体の投与量は、ヒトの体重に対して計算する必要があり、40kg体重あたり500~1500mgの範囲であることが望ましい。
[00134] in vivoでの投与は、1回用量で、連続して又は断続的に(例えば、適切な間隔を置いて分割用量で)実施することができる。投与の最も効果的な手段及び投与量を決定する方法は当業者には周知であり、治療のために使用される製剤、治療の目的、治療されている標的細胞、及び治療されている対象によって異なるであろう。単回又は複数回投与は、医師により選択されている用量レベル及びパターンを用いて行うことができる。
[00135] 「同時」投与とは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体が、単回用量で同じ投与経路により対象に投与されることを意味する。
[00136] 「分離」投与とは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体が、同時に起こる2つの異なる投与経路により対象に投与されることを意味する。これは、例えば、一方の薬剤が注入又は非経口的に投与され、他方が注入又は非経口投与の経過中に経口的に与えられる場合に起こり得る。
[00137] 「逐次」とは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体が、対象において、第2の薬剤が投与される時点で、最初に投与される薬剤の活性が存在し継続しているという条件で、異なる時点で投与されることを意味する。好ましくは、逐次投薬は、2つの薬剤のうちの第2の薬剤が、第1の薬剤から、48時間以内に、好ましくは24時間以内に、例えば、12、6、4、2又は1時間以内に投与されるように起こるであろう。
[00138] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、並びに/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体の複数用量が投与され得る。例えば、2、3、4、5又は5よりも多い用量を、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、並びに/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体の投与後に投与され得る。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、並びに/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体の投与は、最初の投与後長時間続いてもよい。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を用いた治療は、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1か月間又は少なくとも2か月間続けてもよい。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を用いた治療は、治療応答を達成するのに必要な限り継続してもよい。
[00139] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体及びこれらの分子を含む組成物は、経口(例えば、経口摂取により);並びに、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、くも膜下腔内、脊髄内、嚢内、嚢下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、及び胸骨内を含む注射による;例えば、皮下に又は筋肉内にデポーの移植による非経口を含むがこれらに限定されない、全身的/末梢的か所望の作用部位であるかに関わらず、任意の都合の良い投与経路によって対象に投与され得る。通常、投与は静脈内投与で行われるが、腹腔内、皮下、経皮、経口、鼻腔、筋肉内など他の都合の良い経路も排除しない。
[00140] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を含む薬学的組成物は、意図される投与経路に適した適切な投与単位製剤に製剤化されてもよい。
[00141] 経口投与(例えば、摂取による)に適した製剤は、カプセル剤、カシェ剤、又は錠剤などの別々の単位として提示されてもよく、それぞれが、散剤若しくは顆粒剤として;水性若しくは非水性液体での溶液剤若しくは懸濁剤として、又は水中油液体乳剤若しくは油中水液体乳剤として;ボーラス剤として;舐剤として;又はペースト剤として所定量の活性化合物を含有している。
[00142] 錠剤は、従来の手段、例えば、任意選択で1つ又は複数の副成分と一緒に圧縮又は成形により製造されてもよい。圧縮錠剤は、適切な機械で活性化合物を、任意選択で1つ又は複数の結合剤(例えば、ポビドン、ゼラチン、アカシア、ソルビトール、トラガント、ヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤又は希釈剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロース、リン酸水素カルシウム);潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ);崩壊剤(例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム);表面活性又は分散又は湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム);及び保存剤(例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、ソルビン酸)と混合して、粉末又は顆粒などの流動性形態で圧縮することによって調製してもよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を適切な機械で成形することによって作製することができる。錠剤は任意選択でコーティング又は切り込みを入れてもよく、例えば、所望の放出プロファイルを提供するように様々な割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用して、その中の活性化合物の徐放又は制御放出を提供するように製剤化してもよい。錠剤は任意選択で、胃以外の腸の部分で放出させるように腸溶コーティングを施すことができる。
[00143] 非経口投与(例えば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む注射による)に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌薬、及び製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性等張で発熱物質を含まない無菌注射液;並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液、並びに化合物を標的の血液構成成分又は1つ若しくは複数の臓器に標的化するように設計されているリポソーム又は他の微小粒子系を含む。このような製剤で使用するのに適した等張ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、又は乳酸リンゲル注射液が挙げられる。典型的には、溶液中の活性化合物の濃度は、約1ng/ml~約10μg/ml、例えば約10ng/ml~約1μg/ml、約1μg/ml~約10mg/ml、約10μg/ml~約1mg/ml、約1mg/ml~約20mg/ml、約10mg/ml~約120mg/ml、又は生物学的製剤(例えばタンパク質、抗体など)の投与に適した他の任意の濃度である。製剤は、単回用量又は複数回用量が密封された容器、例えば、アンプル及びバイアルで提供されてもよく、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水を加えるだけで済むフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存することができる。即席注射液及び懸濁液は無菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製してもよい。製剤は、活性化合物を血液成分又は1つ若しくは複数の臓器に対して標的化するように設計されたリポソーム又は他の微小粒子系の形態であってもよい。
[00144] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、及び/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体を含む組成物は、それに続く希釈のために濃縮物の形態で調製されてもよく、又は投与の準備が整った分割用量の形態でもよい。あるいは、試薬は、ヒト又は動物対象への投与前に混合するために、キット内で別々に提供されてもよい。
[00145] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、及び/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体は、単独で又は他の治療と組み合わせて、個々の状況に応じて同時に又は逐次に、投与され得る。例えば、本明細書に記載される、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片をコードするポリヌクレオチド、又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片に対して産生される抗体は、1つ又は複数の追加の活性化合物と組み合わせて投与されてもよい。
[00146] 本発明の様々なさらなる態様及び実施態様は、本開示の観点から当業者には明らかであろう。
[00147] 本出願は、文脈上別段の要求がない限り、上記の態様及び上に記載される実施態様のいずれかの互いの組み合わせ全てを開示していることを理解されたい。同様に、本出願は、文脈から別段の要求がない限り、好ましい特徴及び/又は任意の特徴の全ての組み合わせを、単独で、又は他の態様のいずれかと一緒に開示する。
[00148] 上記の実施態様の修正、さらなる実施態様及びその修正は、本開示を読めば当業者には明らかであり、したがって、これらは本発明の範囲内である。本明細書で言及された全ての文書及び配列データベースエントリーは、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、以下の実施例を参照して、以下にさらに説明される。
実施例
実施例1:ペプチド原性抗原の生成
[00149] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成するために、SARS-CoV-2開始タンパク質は、そのコア残基で修飾(例えば、1つ又は複数の変異)されてその立体構造動力学を変化させることができる。複数の異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を設計及び発現させて、ウサギなどの動物を免疫化し、ポリクローナル抗体応答を生成することができる。あるいは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを動物に直接投与して、in vivoでSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成することができる。応答は、2つの相補的かつ相互に補強される方法によってモニターされる(Georgiou et al,2014;図2):(a)免疫した動物の血液、脾臓、及び骨髄からB細胞を精製し、重鎖及び軽鎖の可変領域コードするmRNAからcDNAを単離し、このレパートリーをディープDNAシークエンシングによって分析すること;並びに(b)固体の支持体に付着させた抗原を使用して免疫血清からポリクローナルFab又は(Fab’)2断片を免疫親和性精製し、溶出させたFab/(Fab’)2をプロテアーゼで消化し、得られたペプチドをLC/MS/MSを使用してシークエンシングすること。
実施例1:ペプチド原性抗原の生成
[00149] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成するために、SARS-CoV-2開始タンパク質は、そのコア残基で修飾(例えば、1つ又は複数の変異)されてその立体構造動力学を変化させることができる。複数の異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を設計及び発現させて、ウサギなどの動物を免疫化し、ポリクローナル抗体応答を生成することができる。あるいは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを動物に直接投与して、in vivoでSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成することができる。応答は、2つの相補的かつ相互に補強される方法によってモニターされる(Georgiou et al,2014;図2):(a)免疫した動物の血液、脾臓、及び骨髄からB細胞を精製し、重鎖及び軽鎖の可変領域コードするmRNAからcDNAを単離し、このレパートリーをディープDNAシークエンシングによって分析すること;並びに(b)固体の支持体に付着させた抗原を使用して免疫血清からポリクローナルFab又は(Fab’)2断片を免疫親和性精製し、溶出させたFab/(Fab’)2をプロテアーゼで消化し、得られたペプチドをLC/MS/MSを使用してシークエンシングすること。
[00150] 具体的には、立体構造はSARS-CoV-2開始タンパク質と類似しているが、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の立体構造動力学が変化している、様々なSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド)での試験動物(ウサギ)の免疫を実施することができる。次世代DNAシークエンシング技術を用いて、動物における体液性応答を包括的に特徴付けすることができる。Bリンパ球から免疫グロブリンV領域をクローニングし、超並列ディープシーケンスにかけることができる(5~8)。これと併せて、同じ試験動物からのポリクローナル抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製し、次にプロテアーゼ消化し、LC-MS/MSに供して、ペプチド配列を決定することができる(9、10)。これら2つのデータセットの比較により、ポリクローナル応答を構成する個々の抗体のレパートリーが明らかになる(9)。
[00151] 例えば、生物物理学的に非常によく特徴付けられている小さな哺乳動物のタンパク質を試験抗原として使用することができる。好ましい例としては、ウシ膵臓トリプシン阻害剤及び/又はアルツハイマー病アミロイド前駆体タンパク質クニッツドメインが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、例えばP.falciparumのスポロゾイト抗原のような、満たされていないワクチンのニーズに関連する抗原も、この方法で生成して試験することができる。さらに、構成成分タンパク質の立体構造動力学に関する合成ワクチンの最適化(又は再最適化)(おそらく、単一の成分を、異なるコア不安定化変異を持つ同じ抗原のいくつかのバージョンの組み合わせカクテルに置き換える)も生成することができる。臨床試験においてこれらの新しいワクチンを試験するには、上記の手順と同様に、血液由来のB細胞V領域レパートリーの同様のDNA配列分析と免疫親和性精製ポリクローナル抗体ペプチドのプロテオミクス特性解析を使用して、ワクチン接種を受けた個体のモニタリングが必要になる可能性がある。
[00152] 本明細書に記載の本発明の実施態様に従って使用することができる抗原の他の好ましい例としては、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV-2)、好ましくは表2に記載のそれらの抗原、並びに類人猿、サル、トリ、ブタ、ラクダ、及び他の動物に感染する関連ウイルスからの抗原又はそれ由来の抗原が含まれるが、これらに限定されない。
[00153] 好ましい実施態様では、表2に列挙されるタンパク質抗原のいずれか1つを、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を誘導するための、SARS-CoV-2開始タンパク質として使用することができる。さらに、表2に列挙されている複数の抗原を、ワクチンとして使用される複数の異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を誘導し、抗体の産生を含む免疫応答を生成するための、SARS-CoV-2開始タンパク質として使用することができる。
[00154] さらに、異なるタンパク質抗原の組み合わせをSARS-CoV-2開始タンパク質として使用することができる。
[00156] Loladze et al(J.Mol.Biol.320,343-357(2002))で議論されているように、次のアミノ酸置換は、熱力学的安定性(例えば、ギブズ自由エネルギーに反映される)を低下させ、SARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学を変化させることができる。例えば、Val及びLeu(及び他のより大きな非極性アミノ酸残基)は、Ala、Thr、Asn、及び/又はGlyなどのより小さなもので置換することができる。さらに、SARS-CoV-2開始タンパク質におけるGluの埋没部位は、Leu、Val、Asn、Thr、Ser、Ala、及び/又はGlyで置換することができる。これらの単一部位アミノ酸置換により、SARS-CoV-2開始タンパク質より安定性は低いものの、類似する立体構造を有するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が生成されると予想される。
[00157] あるいは、SARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学は、(a)少なくとも1つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシン若しくはセリンで;又は(b)少なくとも1つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリン若しくはスレオニンで;又は(c)少なくとも1つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(d)少なくとも1つのロイシンをアラニン、バリン、グリシン若しくはイソロイシンで;又は(e)少なくとも1つのイソロイシンをアラニン、バリン、ロイシン若しくはグリシンで;又は(f)少なくとも1つのプロリン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンを、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはグリシンで;又は(g)少なくとも1つのアスパラギン酸若しくはアスパラギンをグリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンで;又は(h)少なくとも1つのグルタミン酸若しくはグルタミンを、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(i)少なくとも1つのリジンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(j)少なくとも1つのアルギニンをリジン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(k)少なくとも1つのヒスチジンをリジン、アルギニン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(l)少なくとも1つのアラニンをグリシンで;又は(m)少なくとも1つの残基を非天然アミノ酸で;及び/又は(n)上記の組み合わせのいずれかで置換することによって変化している。
[00158] さらに好ましい実施態様では、SARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学は、(a)少なくとも1つのトリプトファンをチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(b)少なくとも1つのチロシンをフェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(c)少なくとも1つのフェニルアラニンをチロシン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(d)少なくとも1つのプロリンをメチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(e)少なくとも1つのヒスチジンをフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、リジン、アルギニン、セリン、スレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンで;又は(f)少なくとも1つのメチオニンをイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(g)少なくとも1つのイソロイシンをロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(h)少なくとも1つのロイシンをイソロイシン、バリン、アラニン若しくはグリシンで;又は(i)少なくとも1つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(j)少なくとも1つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリン若しくはスレオニンで;又は(k)少なくとも1つのアスパラギン酸をグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(l)少なくとも1つのグルタミン酸をアスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(m)少なくとも1つのアラニンをグリシン若しくはプロリンで;又は(n)少なくとも1つのセリンをアラニン若しくはグリシンで;又は(o)少なくとも1つのグリシンをアラニン若しくはプロリンで;又は(p)少なくとも1つのリジンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(q)少なくとも1つのアスパラギンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸で;又は(r)少なくとも1つのグルタミンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸若しくはヒスチジンで;又は(s)少なくとも1つのアルギニンをリジン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は(t)少なくとも1つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシン若しくはセリンで;又は(u)疎水性残基をより小さな類似の疎水性残基で;又は(v)少なくとも1つの残基を非天然アミノ酸で;又は(w)上記の組み合わせのいずれかで置換することによって変化している。コンビナトリアルアプローチを使用して、免疫原性を高める最適な置換を決定することができる。
実施例2:好ましいスパイクタンパク質ワクチン。
[00159] 好ましい実施態様では、スパイクタンパク質の特定の断片が、他のCOVID-19ワクチンについて公表された有効性結果と比較して、他のワクチンがRBDドメインの異なる領域を含む場合であっても、予想外に改善されたワクチン接種結果を提供することが確認された。さらに、図1及び2に示すように、スパイク断片の混合物を本明細書に記載の変異と組み合わせた場合、さらに良好な結果が得られた。具体的には、配列番号15のアミノ酸316~594を含むか、又はそれらからなる断片は、予想外に実質的に改善された結果を提供した。この断片はスパイクタンパク質内に存在し、SARS-CoV-2とその細胞侵入受容体ACE2との結合に関与するRBDドメイン(Lan et al.,Nature 581:215-220(2020);Hurlburt et al.,Nat.Commun.11:5413(2020))を含んでいる。RBDは、SARS-CoV及びMERS-CoVのスパイクタンパク質の最も免疫原性の高い領域であることがわかっており(Du et al.,Nat.Rev.MicroBiol.7:226-236(2009)、ワクチンにRBDを含めることで、ウイルスのRBDを標的とする免疫応答を誘発して、ウイルスの宿主細胞への侵入を防止又は中和することができる(Du et al.,Nat.Commun.7:13473(2016)。さらに、RBDはスパイクタンパク質の非RBD領域よりも保存されていないが、SARS-CoV-2とSARSの間で同一のアミノ酸が見出され、SARS-CoV-2変異体を含む異なるコロナウイルスに対して交差反応性を提供し得るRBDの保存エピトープを標的とする抗体を誘発する可能性を提供すると認識されている((Duら、上記を参照)。
[00159] 好ましい実施態様では、スパイクタンパク質の特定の断片が、他のCOVID-19ワクチンについて公表された有効性結果と比較して、他のワクチンがRBDドメインの異なる領域を含む場合であっても、予想外に改善されたワクチン接種結果を提供することが確認された。さらに、図1及び2に示すように、スパイク断片の混合物を本明細書に記載の変異と組み合わせた場合、さらに良好な結果が得られた。具体的には、配列番号15のアミノ酸316~594を含むか、又はそれらからなる断片は、予想外に実質的に改善された結果を提供した。この断片はスパイクタンパク質内に存在し、SARS-CoV-2とその細胞侵入受容体ACE2との結合に関与するRBDドメイン(Lan et al.,Nature 581:215-220(2020);Hurlburt et al.,Nat.Commun.11:5413(2020))を含んでいる。RBDは、SARS-CoV及びMERS-CoVのスパイクタンパク質の最も免疫原性の高い領域であることがわかっており(Du et al.,Nat.Rev.MicroBiol.7:226-236(2009)、ワクチンにRBDを含めることで、ウイルスのRBDを標的とする免疫応答を誘発して、ウイルスの宿主細胞への侵入を防止又は中和することができる(Du et al.,Nat.Commun.7:13473(2016)。さらに、RBDはスパイクタンパク質の非RBD領域よりも保存されていないが、SARS-CoV-2とSARSの間で同一のアミノ酸が見出され、SARS-CoV-2変異体を含む異なるコロナウイルスに対して交差反応性を提供し得るRBDの保存エピトープを標的とする抗体を誘発する可能性を提供すると認識されている((Duら、上記を参照)。
[00160] 本明細書に開示される特定のスパイク断片は、RBDを利用する他のワクチンよりも予想外に優れた活性を有すると同定された。SARS-CoV-2のスパイク断片は、以下の断片を包含するものとして示されている:
>sp|P0DTC2| 配列番号15のアミノ酸316-594
SNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGG (配列番号39)
>sp|P0DTC2| 配列番号15のアミノ酸316-594
SNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGG (配列番号39)
[00161] さらに、この同じ断片を特定の変異で操作することができる。さらに優れた活性を示した好ましい3つの変異として、Y365L、I402V、及びV511Aを挙げることができる。
SARS-CoV-2 Y365Lスパイク断片
SNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADLSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGG (配列番号40)
SARS-CoV-2 I402Vスパイク断片
SNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVVRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGG (配列番号41)
SARS-CoV-2 V511Aスパイク断片
SNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVAVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGG (配列番号42)
SARS-CoV-2 Y365Lスパイク断片
SNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADLSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGG (配列番号40)
SARS-CoV-2 I402Vスパイク断片
SNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVVRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGG (配列番号41)
SARS-CoV-2 V511Aスパイク断片
SNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVAVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGG (配列番号42)
[00162] このスパイク断片は、ワクチンとして直接使用することも、変異(上記のようなもの)と組み合わせて、タンパク質の安定性と立体構造動力学を変化させることもできる。この特異的な断片は(変異と併せて)ポリクローナル抗体レパートリーの多様性の増加、及び埋もれた又は部分的に閉塞されたB細胞エピトープのマスキング解除につながる可能性があると考えられている。
[00163] 切断された構築物は、残りのスパイクタンパク質を構成するN末端及びC末端の伸長部分が除去されるため、完全長のwtスパイクタンパク質と比較してT細胞エピトープのセットの多様性が低くなる可能性があると予測される。しかし、マイクロキャビティを形成するコア疎水基におけるアミノ酸置換によって得られる抗原断片の立体構造の柔軟性を高めるアプローチは、APCによる抗原断片T細胞エピトープペプチドの産生と提示を促進することで補償し、それによってこのドメインの免疫原性を高めるはずである。
[00164] 他の者がスパイクタンパク質の類似の断片を示唆しているが(例えば、Wrapp D,Wang N,Corbett KS,Goldsmith JA,Hsieh C-L,Abiona O,Graham BS,McLellan JS.Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.Science.2020;367(6483):1260-3.doi:10.1126/science.abb2507に記載されるスパイク構築物319-591及びAmanat F,Stadlbauer D,Strohmeier S,Nguyen THO,Chromikova V,McMahon M,Jiang K,Arunkumar GA,Jurczyszak D,Polanco J,Bermudez-Gonzalez M,Kleiner G,Aydillo T,Miorin L,Fierer DS,Lugo LA,Kojic EM,Stoever J,Liu STH,Cunningham-Rundles C,Felgner PL,Moran T,Garcia-Sastre A,Caplivski D,Cheng AC,Kedzierska K,Vapalahti O,Hepojoki JM,Simon V,Krammer F.A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.Nature Medicine.2020;26(7):1033-6.doi:10.1038/s41591-020-0913-5に記載されるスパイク構築物319-541)、本明細書で提案する断片は、改善された特性を有することが期待される。
[00165] アミノ酸316~594の好ましい切断型スパイクタンパク質と組み合わせることができる変異の好ましい部位は、以下から選択される:配列番号15の、A)Trp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/若しくはPhe543;(B)Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/若しくはLeu585;(C)Ala363、Ala397、及び/若しくはAla575;(D)Cys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;(E)Ala419、Ala575、Val576、Tyr365、Ile418、Leu387、Leu585、Ile410、Tyr423、Phe497、及び/若しくはLeu552、又は配列番号16の対応する変異。
[00166] さらに好ましい実施態様では、アミノ酸319~591を含む、又はそれらからなる切断型スパイクタンパク質は、以下の好ましい部位で変異と組み合わされる:配列番号15の、(A)Trp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/若しくはPhe543;(B)Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/若しくはLeu585;(C)Ala363、Ala397、及び/若しくはAla575;(D)Cys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;及び/又は(E)Ala419、Ala575、Val576、Tyr365、Ile418、Leu387、Leu585、Ile410、Tyr423、Phe497、及び/若しくはLeu552、又は配列番号16の対応する変異。
[00167] さらに好ましい実施態様では、アミノ酸319~541を含む、又はそれらからなる切断型スパイクタンパク質は、以下の好ましい部位で変異と組み合わされる:配列番号15の、(A)Trp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、及び/若しくはPhe497;(B)Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、及び/若しくはVal539;(C)Ala363、及び/若しくはAla397;(D)Cys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;及び/又は(E)Ala419、Tyr365、Ile418、Leu387、Ile410、Tyr423、及び/若しくはPhe497、又は配列番号16の対応する変異。
[00168] そのような1つの実験において、BALB/cマウスは、アジュバントとしてミョウバンを用いて、3μgの野生型抗原、又は野生型抗原と2つの変異型抗原の等しい割合での3μg混合物(すなわち、wt抗原1μg+各変異型抗原1μg)のどちらかで2回免疫した(プライム+2°ブースト)。ELISAでは、天然の野生型RBD316-594断片をC末端タグを介してウェルに固定化し、誘発されたポリクローナル抗体が野生型RBDの立体構造エピトープに結合できるようにした。追加免疫後の様々な時点におけるマウス抗血清の反復(n)ELISAから得られた最大半量力価の幾何平均を計算した。図1に示すように、スパイク断片と2つの変異体Y365L及びV511A(上述)のタンパク質混合物を用いた免疫化は、スパイク断片のみを用いた免疫化と比較して、RBD特異的抗IgG抗体価の有意な増加を誘発した。
[00169] 同様に、図2は、抗原断片の混合物(スパイク断片+2つの変異体[上記])による免疫化も、等モル濃度のスパイク断片単独での免疫化又はモック免疫マウスと比較して、スパイク断片特異的メモリーB細胞産生の増加をもたらしたことを示している。
実施例3:立体構造動力学の変化を測定するアッセイ
[00170] 立体構造動力学の変化は、当技術分野で知られている標準的な方法によって測定することができる。好ましい実施態様では、立体構造動力学の変化は、尿素誘導性平衡アンフォールディング研究及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質と比較した場合のギブズ自由エネルギーにおける、融解温度の変化を測定することによって示すことができる。
[00170] 立体構造動力学の変化は、当技術分野で知られている標準的な方法によって測定することができる。好ましい実施態様では、立体構造動力学の変化は、尿素誘導性平衡アンフォールディング研究及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質と比較した場合のギブズ自由エネルギーにおける、融解温度の変化を測定することによって示すことができる。
[00171] 融解温度の変化は、以下のプロトコルで示すことができる。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(0.20mg/ml)及びSARS-CoV-2開始タンパク質(対照として)を、Jascoのプログラム可能なペルチェ素子によって1度x分-1の加熱速度で制御される、0.1cm石英キュベット内で10℃から72℃に加熱する。209nmでの二色性活性及び光電子増倍管電圧(PMTV)は、0.5℃ごとに並行して連続的にモニターされる。全ての熱スキャンは、異なる温度での溶媒の寄与に対して補正される。融解温度(Tm)値は、温度に関して209nmで楕円率の一次導関数をとることによって計算される。全ての変性実験は、三連で実施される(Lori et al.,PLoS One,5;8(6):e64824(2013)を参照)。
[00172] 尿素誘導性平衡アンフォールディングにおける変化は、以下のプロトコルによって示すことができる。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(最終濃度40ug/ml)及びSARS-CoV-2開始タンパク質(対照として)を、0.2M NaCl及び2mM DTT(非ジスルフィド含有タンパク質用)の存在下で、25mM Tris/HCl、pH7.5中の漸増濃度の尿素(0~8M)中で10℃でインキュベートする。10分後、平衡に達し、内因性蛍光発光、287nmでの吸光度、及び/又は遠紫外線CDスペクトル(0.5cmキュベット)が、10℃で並行して記録される。アンフォールディングの可逆性を試験するために、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、25mM Tris/HCl、pH7.5中、2mM DTT及び0.2M NaClの存在下で、0.4mg/mlタンパク質濃度で7.0M尿素中で10℃でアンフォールドされる。10分後、尿素濃度を減少させて含有するアンフォールディングに使用したのと同じ緩衝剤の溶液に、アンフォールディング混合物を10℃で10倍希釈することにより、リフォールディングを開始する。最終タンパク質濃度は、40ug/mlである。15分間から24時間のインキュベーション期間後、内因性蛍光発光、287nmでの吸光度、及び/又はCDスペクトルは、10℃での尿素濃度の関数として記録される(Lori et al.,PLoS One,5;8(6):e64824(2013)を参照)。
[00173] ギブズ自由エネルギーの変化は、以下のプロトコルで示すことができる。ギブズ自由エネルギーを測定するために、示差走査熱量測定(DSC)実験が、VP-DSC(Microcal Inc.,Northampton,MA)機器でスキャン速度1.5deg/分で実施される。可能な場合、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の温度誘導性アンフォールディングが、第1及び第2のDSCスキャンを比較することによって可逆性に関して確認される。フォールディングとアンフォールディングの可逆性は、本明細書に記載のSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の要件ではないことが理解される。タンパク質の部分モル熱容量Cp,pr(T)は、試料(タンパク質溶液を含有する)と参照(対応する緩衝液を含有する)細胞との間の実験的に測定された見かけの熱容量差ΔCpapp(T)から得られる。タンパク質濃度は、既知のモル吸光係数を用いて分光光度計で測定される。2状態モデルに従う熱容量プロファイルの分析は、非直線回帰ルーチンNLREG及び社内で作成されたスクリプトを使用して行われる。参照条件下での標準熱力学的関数は、以下のように計算される:
[00174] 式中、ΔH(T)、ΔS(T)、及びΔG(T)はそれぞれ、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のエンタルピー、エントロピー及びギブズエネルギー関数であり、ΔHcalは転移温度Tmにおけるアンフォールディングのエンタルピー、及びΔCpはアンフォールディングの熱容量である(Loladze et al.,J.Mol.Biol.320,343-357(2002)を参照)。
実施例4:ペプチド原性を測定するアッセイ
[00175] 本明細書に記載されるようにSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のプロセシングに関与し得る細胞内状態の1つは、タンパク質分解である。タンパク質分解におけるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の差次的安定性の影響は、いくつかのin vitro又はex vivoのアッセイのうちの1つを使用して決定することができる。
[00175] 本明細書に記載されるようにSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のプロセシングに関与し得る細胞内状態の1つは、タンパク質分解である。タンパク質分解におけるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の差次的安定性の影響は、いくつかのin vitro又はex vivoのアッセイのうちの1つを使用して決定することができる。
(a)カテプシンLタンパク質分解
[00176] 一実施態様では、タンパク質分解に対するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の挙動の検査は、それらを、タンパク質抗原プロセシングに決定的に重要であることが公知である酵素の1つであるカテプシンLの作用に供することによって測定される(Hsieh,C.S.,deRoos,P.,Honey,K.,Beers,C.,and Rudensky,A.Y.(2002)J.Immunol.168,2618-2625)。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のタンパク質分解に対する感受性は、リソソームカテプシンLを用いて評価される。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(0.5ug/ul)は、37℃で様々な時間、50mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.5中で様々な量(例えば、1.5m単位)の酵素とインキュベートされる。消化は、0.1% TFAを使用して停止され、タンパク質分解はC18逆相カラム(Vydac,Hesperia,CA)における逆相HPLCによってモニターされる。タンパク質分解産物の溶出は、0.1% TFAを含有するアセトニトリル/水の直線勾配で実施される。
[00176] 一実施態様では、タンパク質分解に対するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の挙動の検査は、それらを、タンパク質抗原プロセシングに決定的に重要であることが公知である酵素の1つであるカテプシンLの作用に供することによって測定される(Hsieh,C.S.,deRoos,P.,Honey,K.,Beers,C.,and Rudensky,A.Y.(2002)J.Immunol.168,2618-2625)。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のタンパク質分解に対する感受性は、リソソームカテプシンLを用いて評価される。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(0.5ug/ul)は、37℃で様々な時間、50mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.5中で様々な量(例えば、1.5m単位)の酵素とインキュベートされる。消化は、0.1% TFAを使用して停止され、タンパク質分解はC18逆相カラム(Vydac,Hesperia,CA)における逆相HPLCによってモニターされる。タンパク質分解産物の溶出は、0.1% TFAを含有するアセトニトリル/水の直線勾配で実施される。
(b)アルファ-キモトリプシン及びカルボキシペプチダーゼYを使用するタンパク質分解
[00177] 別の実施態様では、タンパク質分解に対するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の挙動の検査は、それらをα-キモトリプシン及びカルボキシペプチダーゼYの作用に供することによって測定される。アルファ-キモトリプシンは、芳香族アミノ酸のカルボキシル末端で切断するエンドペプチダーゼである;カルボキシペプチダーゼYは、カルボキシル末端からアミノ酸を順次除去するエキソペプチダーゼである。これらの酵素によるタンパク分解消化は、不安定な立体構造に対して特異的であるため、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の立体構造の安定性が、タンパク分解消化に対するそれらの耐性/感受性を決定する。0.5mlの20mM HEPES緩衝食塩水pH7.5中の1mg/mlでのSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が、100ugのウシ膵臓からのアルファ-キモトリプシン及び酵母からのカルボキシペプチダーゼYで37℃でインキュベートされる。各インキュベーションは様々な時点で終了され、消化された試料は-20℃で分析するまで保存される。試料は、15%アクリルアミドゲルに通す還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分析され、次いで可視化のためにクーマシーブリリアントブルーで染色される。
[00177] 別の実施態様では、タンパク質分解に対するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の挙動の検査は、それらをα-キモトリプシン及びカルボキシペプチダーゼYの作用に供することによって測定される。アルファ-キモトリプシンは、芳香族アミノ酸のカルボキシル末端で切断するエンドペプチダーゼである;カルボキシペプチダーゼYは、カルボキシル末端からアミノ酸を順次除去するエキソペプチダーゼである。これらの酵素によるタンパク分解消化は、不安定な立体構造に対して特異的であるため、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の立体構造の安定性が、タンパク分解消化に対するそれらの耐性/感受性を決定する。0.5mlの20mM HEPES緩衝食塩水pH7.5中の1mg/mlでのSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が、100ugのウシ膵臓からのアルファ-キモトリプシン及び酵母からのカルボキシペプチダーゼYで37℃でインキュベートされる。各インキュベーションは様々な時点で終了され、消化された試料は-20℃で分析するまで保存される。試料は、15%アクリルアミドゲルに通す還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分析され、次いで可視化のためにクーマシーブリリアントブルーで染色される。
(c)リソソーム抽出物を使用したタンパク質分解
[00178] 別の実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のタンパク質分解に対する挙動の検査は、それらを骨髄由来樹状細胞のリソソーム抽出物の作用に供することによって測定される。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、骨髄由来樹状細胞からの粗製リソソーム抽出物からの等量のタンパク質の存在下で、様々な濃度でインキュベートされる。混合物は、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液、0.5% TritonX-100、及び2mMジチオスレイトール中pH4.5でインキュベートされる。各インキュベーションは様々な時点で終了され、消化された試料は-20℃で分析するまで保存される。試料は、SDS-PAGEによって分析される。実験は、水酸化アルミニウムなどのアジュバントにおけるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の事前吸着がある場合及び無い場合で反復される。骨髄由来樹状細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子中で培養される骨髄から、抗CD11cマイクロビーズを使用して精製される。例えば、Delamarreらの図4を参照。
[00178] 別の実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のタンパク質分解に対する挙動の検査は、それらを骨髄由来樹状細胞のリソソーム抽出物の作用に供することによって測定される。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、骨髄由来樹状細胞からの粗製リソソーム抽出物からの等量のタンパク質の存在下で、様々な濃度でインキュベートされる。混合物は、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液、0.5% TritonX-100、及び2mMジチオスレイトール中pH4.5でインキュベートされる。各インキュベーションは様々な時点で終了され、消化された試料は-20℃で分析するまで保存される。試料は、SDS-PAGEによって分析される。実験は、水酸化アルミニウムなどのアジュバントにおけるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の事前吸着がある場合及び無い場合で反復される。骨髄由来樹状細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子中で培養される骨髄から、抗CD11cマイクロビーズを使用して精製される。例えば、Delamarreらの図4を参照。
(d)骨髄由来樹状細胞による内部移行後のタンパク質分解
[00179] 別の実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のタンパク質分解に対する挙動の検査は、それらを製造者のプロトコルに従ってFITCで標識し、骨髄由来樹状細胞をFITC-タンパク質とインキュベートし、FITC+、CD11c+細胞のパーセンテージを経時的に測定することによって測定される。骨髄由来樹状細胞は、0.5mg/mlのFITC標識SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を1時間ロードされ、洗浄され、次に37℃で様々な時間培養される。次いで、FACSを使用して、0時間でのFITC+、CD11c+細胞のパーセンテージを引き算した各時点でのFITC+、CD11c+細胞のパーセンテージを決定する。これは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のタンパク質分解のパーセンテージを表す。実験は、水酸化アルミニウムなどのアジュバントにおけるFITC標識SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の事前吸着がある場合及び無い場合で反復される。
[00179] 別の実施態様では、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のタンパク質分解に対する挙動の検査は、それらを製造者のプロトコルに従ってFITCで標識し、骨髄由来樹状細胞をFITC-タンパク質とインキュベートし、FITC+、CD11c+細胞のパーセンテージを経時的に測定することによって測定される。骨髄由来樹状細胞は、0.5mg/mlのFITC標識SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を1時間ロードされ、洗浄され、次に37℃で様々な時間培養される。次いで、FACSを使用して、0時間でのFITC+、CD11c+細胞のパーセンテージを引き算した各時点でのFITC+、CD11c+細胞のパーセンテージを決定する。これは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のタンパク質分解のパーセンテージを表す。実験は、水酸化アルミニウムなどのアジュバントにおけるFITC標識SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の事前吸着がある場合及び無い場合で反復される。
実施例5:抗体産生及び配列決定
[00180] 抗体レパートリーのIg-seqは、以前に記載されたプロトコル(10、29)に若干の修正を加えて従うことができる。B細胞は、過剰免疫したウサギの血清、脾臓、又はその他の組織から分離することができる。シークエンシングライブラリーの複雑さを低減させるために、この集団を選別して、CD19+CD3-CD27+CD38intメモリーB細胞又は標的抗原を認識するB細胞を濃縮することができる(5、30、31)。次いで、これらの細胞は溶解され、mRNAが標準方法を使用して単離され、IgH又はIgL定常領域に特異的な3’プライマーでの5’RACEを使用してcDNAに逆転写される(9、32)。次いで、cDNAライブラリーは、必要なペアエンドアダプター配列及び任意選択のバーコードを含むプライマーで増幅され、鋳型の定量及び複数の読み取りの平均化によって誤差補正が可能となる(8、9)。
[00180] 抗体レパートリーのIg-seqは、以前に記載されたプロトコル(10、29)に若干の修正を加えて従うことができる。B細胞は、過剰免疫したウサギの血清、脾臓、又はその他の組織から分離することができる。シークエンシングライブラリーの複雑さを低減させるために、この集団を選別して、CD19+CD3-CD27+CD38intメモリーB細胞又は標的抗原を認識するB細胞を濃縮することができる(5、30、31)。次いで、これらの細胞は溶解され、mRNAが標準方法を使用して単離され、IgH又はIgL定常領域に特異的な3’プライマーでの5’RACEを使用してcDNAに逆転写される(9、32)。次いで、cDNAライブラリーは、必要なペアエンドアダプター配列及び任意選択のバーコードを含むプライマーで増幅され、鋳型の定量及び複数の読み取りの平均化によって誤差補正が可能となる(8、9)。
[00181] 抗体配列の完全な決定には、天然のVH-VL対を同定することが必要である。各VH及びVL配列は別々のmRNAによってコードされているため、クローンのシークエンシングはmRNAの単離、逆転写、及びオーバーラップ伸長又は連鎖PCRの前に、ナノリットル容量以下のウェル(5)又はマイクロエマルジョン(9)中で単一B細胞を単離することによって実施され得る。別の方法として、内因性VH-VL対は、LC-MS/MSの前に、精製されたFabを部分的に架橋することによって同定することができる。これは、適切な条件下で、鎖間架橋を形成するFab重鎖及び軽鎖の一部分を生じ、生じたペプチド質量を使用して天然の対形成が決定される。
[00182] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片の混合物に対する応答において生じた抗体を同定するために、配列情報を、高分解能の質量分析からのデータと組み合わせることができる。プロテインAで精製されたIgGをパパインで消化し、2つのFabをFcドメインから放出させることができる。次いで、これらは、固体の支持体上に固定化されたSARS-CoV-2のペプチド原性タンパク質又はスパイク断片又は野生型タンパク質を使用して調製されたカスタムカラム上で免疫親和性精製することができ、溶出させたFabはタンパク分解消化され、ペプチド生成物は質量分析に供される。得られたペプチド質量を完全抗体シークエンシングデータと比較して、抗原を認識するCDR配列を同定することができる。IgG VH及びVL配列の対形成は、タンパク分解消化の前に、免疫親和性精製されたFabの化学的な架橋によって達成することができる;Youngらは、このアプローチの実現可能性を実証した(33)。
実施例6:SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物を使用した免疫化
[00183] ワクチン接種プロトコルの一部として、哺乳動物で抗体を産生する方法は、当技術分野で周知である。一例として、ペプチド原性タンパク質に対するポリクローナル抗血清は、病原菌フリーなウサギをSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の合計500μgの混合物で2か月の期間にわたって免疫することによって生じる。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をPBSに溶解し、等容量のフロイントアジュバントで乳化することができる。最終的なブースター後、ウサギの血清を分離してポリクローナル抗血清の力価を決定することができる。モノクローナル抗体を得るために、4~6週齡のBalb/cマウスを、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(例えば、最初の注射に対してはフロイント完全アジュバント、その後の免疫化に対してはフロイント不完全アジュバント中に溶解させた10~100μg/注射で2週間間隔で4回)で免疫することができる。脾細胞が単離され、Sp2/0ミエローマ細胞などの融合細胞株と融合され、続いて限界希釈される。増殖中のクローンは、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用してスクリーニングされる。96セルプレートは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質又は対照タンパク質でコーティングされる。培養上清が添加され、続いて洗浄され、検出のため標識抗マウス抗体が添加される。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質特異的抗体産生ハイブリドーマの限界希釈クローニング後、安定したハイブリドーマを得ることができる。各細胞から上清が収集され、プロテインAセファロースカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、モノクローナル抗体を精製することができる。
[00183] ワクチン接種プロトコルの一部として、哺乳動物で抗体を産生する方法は、当技術分野で周知である。一例として、ペプチド原性タンパク質に対するポリクローナル抗血清は、病原菌フリーなウサギをSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の合計500μgの混合物で2か月の期間にわたって免疫することによって生じる。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をPBSに溶解し、等容量のフロイントアジュバントで乳化することができる。最終的なブースター後、ウサギの血清を分離してポリクローナル抗血清の力価を決定することができる。モノクローナル抗体を得るために、4~6週齡のBalb/cマウスを、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(例えば、最初の注射に対してはフロイント完全アジュバント、その後の免疫化に対してはフロイント不完全アジュバント中に溶解させた10~100μg/注射で2週間間隔で4回)で免疫することができる。脾細胞が単離され、Sp2/0ミエローマ細胞などの融合細胞株と融合され、続いて限界希釈される。増殖中のクローンは、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用してスクリーニングされる。96セルプレートは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質又は対照タンパク質でコーティングされる。培養上清が添加され、続いて洗浄され、検出のため標識抗マウス抗体が添加される。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質特異的抗体産生ハイブリドーマの限界希釈クローニング後、安定したハイブリドーマを得ることができる。各細胞から上清が収集され、プロテインAセファロースカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、モノクローナル抗体を精製することができる。
[00184] 特にワクチン接種プロトコルの一部として、ヒトで抗体を産生するために、ポリクローナル抗血清の生成について上述したものと同様のアプローチがとられ得る。しかしながら、当業者は、フロインドのアジュバントの代わりに代替のアジュバント系を利用する必要性を認識するであろう。例えば、好適な代替アジュバントとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アモルファスヒドロキシリン酸アルミニウム(AAHS)及び硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)などのアルミニウム化合物、モノホスホリル脂質A(MPL)ベースのアジュバント、スクアレンを含む水中油型(O/W)エマルジョン、シトシンホスホグアニン(CpG)オリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性核酸が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、例えば、高齢者及び/又は免疫不全集団などの感受性のある患者集団では、特定のアジュバント(例えば、リポソームベースのAS01Bアジュバント系)、及びさらに強力なCD4+及びCD8+ T細胞応答を達成するためのその他の戦略の使用も、これらの影響を受けやすい患者において強力で防御的な免疫応答を達成するために採用される可能性がある(Weinberger,Immunity & Aging 15:3(2018))。
実施例7:ARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物を使用した免疫化の別の例
[00185] 追加の動物モデルにおいて、5匹のマウス(C57BL/6J;Jackson Labs)の群を、ヒトワクチンに最も一般的に使用されるアジュバントであるミョウバン中に乳化した、エンドトキシンを含まないSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質と野生型開始タンパク質の5μg混合物で皮下免疫(一次)することができる。3週間後、又は任意で1回以上のその後のブースト(二次)免疫化の3週間後に、マウスを血抜きし、ペプチド原性抗体及び/又は野生型タンパク質抗原特異的抗体の存在を、ELISA(ウェル上に直接又は間接的に(ビオチン化タグ及びストレプトアビジンを介して)コーティングされた野生型SARS-CoV-2タンパク質抗原への血清中の抗体の直接的な結合)によって血清を力価測定することによって決定することができる。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が、SARS-CoV-2開始タンパク質と類似の立体構造を有することを確認するために、競合阻害アッセイが実施され、このアッセイでは、SARS-CoV-2開始タンパク質及びSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の力価測定した量が、SARS-CoV-2開始タンパク質コーティングプレートに添加される前に、血清とプレインキュベートされる。これにより、免疫学的プローブで、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の3D構造が、操作した変異によって損なわれていないことの追加の証拠が提供される。
[00185] 追加の動物モデルにおいて、5匹のマウス(C57BL/6J;Jackson Labs)の群を、ヒトワクチンに最も一般的に使用されるアジュバントであるミョウバン中に乳化した、エンドトキシンを含まないSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質と野生型開始タンパク質の5μg混合物で皮下免疫(一次)することができる。3週間後、又は任意で1回以上のその後のブースト(二次)免疫化の3週間後に、マウスを血抜きし、ペプチド原性抗体及び/又は野生型タンパク質抗原特異的抗体の存在を、ELISA(ウェル上に直接又は間接的に(ビオチン化タグ及びストレプトアビジンを介して)コーティングされた野生型SARS-CoV-2タンパク質抗原への血清中の抗体の直接的な結合)によって血清を力価測定することによって決定することができる。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が、SARS-CoV-2開始タンパク質と類似の立体構造を有することを確認するために、競合阻害アッセイが実施され、このアッセイでは、SARS-CoV-2開始タンパク質及びSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の力価測定した量が、SARS-CoV-2開始タンパク質コーティングプレートに添加される前に、血清とプレインキュベートされる。これにより、免疫学的プローブで、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の3D構造が、操作した変異によって損なわれていないことの追加の証拠が提供される。
[00186] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片がより良好な二次抗体応答をもたらすかどうかを決定するために、マウスの群を上記のように免疫することができ、一次免疫化の6週後、それらに二度目の免疫化を行うことができる。二次免疫化の1週間後、マウスを出血させ、抗原特異抗体応答が上記のようにELISAによって決定される。マウス樹状細胞は強い抗体応答を生成することができるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片でin vitroでパルスされ、24時間後にMHCIIによって提示されるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質由来ペプチドが単離され、それらの質量が液体クロマトグラフィー及び質量分析(LC/MS)によって分析される。これらの研究では、in vivoでの樹状細胞発生を駆動するサイトカインであるFLT-3Lを発現する、マウス腫瘍株を以前に注射されたマウスから精製された、多数(>107)の樹状細胞が必要である(これらのマウスの脾臓は樹状細胞で満たされる;Segura et al,2009)。質量分析によるMHCIIペプチドのピーク同定及び定量化を可能にするために、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片は、DCに対するフィーディング前に、13C及び15Nなどの安定同位体で生合成的に標識することができる(組換えタンパク質の生産の間--上記を参照)(Hoedt et al 2014)。
実施例8:SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードする配列を使用した免疫化
[00187] ポリヌクレオチドを動物に直接注射する方法は、当技術分野で十分に説明されている。例えば、米国特許第5,676,954号;同第6,875,748号;同第5,661,133号を参照。簡潔には、遺伝コードの公知の縮重を使用して、本明細書に記載されるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドを、標準的なDNA合成技術を使用して合成することができる。次いで、ポリヌクレオチド(複数可)を、例えばマウスなどの動物に直接注射することができる。具体的には、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドの混合物を、拘束された覚醒マウス(Harlan Sprague Dawley,Indianapolis,Indからの雌6-12週齢BALB/c又はNude,nu/nu)の四頭筋に注射することができる。一実施態様では、マイクロピペットチップから切ったプラスチックカラーでフィットさせた使い捨ての無菌のプラスチックインスリンシリンジ及び28G1/2針(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,N.J.,カタログ番号329430)を使用して、50μlの溶液中のポリヌクレオチド50μgを、Hartikka,J.,et al.,Hum.Gene Ther.7:1205-1217(1996)に記載のように、マウスに注射することができる。
[00187] ポリヌクレオチドを動物に直接注射する方法は、当技術分野で十分に説明されている。例えば、米国特許第5,676,954号;同第6,875,748号;同第5,661,133号を参照。簡潔には、遺伝コードの公知の縮重を使用して、本明細書に記載されるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドを、標準的なDNA合成技術を使用して合成することができる。次いで、ポリヌクレオチド(複数可)を、例えばマウスなどの動物に直接注射することができる。具体的には、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドの混合物を、拘束された覚醒マウス(Harlan Sprague Dawley,Indianapolis,Indからの雌6-12週齢BALB/c又はNude,nu/nu)の四頭筋に注射することができる。一実施態様では、マイクロピペットチップから切ったプラスチックカラーでフィットさせた使い捨ての無菌のプラスチックインスリンシリンジ及び28G1/2針(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,N.J.,カタログ番号329430)を使用して、50μlの溶液中のポリヌクレオチド50μgを、Hartikka,J.,et al.,Hum.Gene Ther.7:1205-1217(1996)に記載のように、マウスに注射することができる。
[00188] あるいは、6週齢のSprague Dawley雌マウス(体重20~25g)は、注射前の24時間前から、その飲料水中に5000ppmのZnOSO4を与えることができる。この量の亜鉛は、メタロチオネインプロモーターを活性化できることが示されている。次いで、各マウスは、25ゲージ針での尾静脈穿刺によって静脈内に、総体積30μl中に150μgリポソーム(Lipofection TM)と複合化させた30μgのSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドを注射される。一実施態様では、マウスに注射されるポリヌクレオチド混合物は、同じSARS-CoV-2開始タンパク質に関連する異なるSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードする。あるいは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のライブラリーは、ライブラリーが異なるSARS-CoV-2開始タンパク質に関連するポリヌクレオチドの混合物によってコードされ得る。動物の管理は、研究を通して維持されるべきであり、“Guide for the Use and Care of Laboratory Animals”,Institute of Laboratory Animal Resources,Commission on Life Sciences,National Research Council,National Academy Pressに準拠して実施されるべきである。
[00189] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードする注射されたポリヌクレオチドが動物の細胞に送達された後、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質がin vivoで発現される。次いで、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に特異的な抗体の産生を刺激することができる。これらの抗体を単離し、ポリクローナル混合物として使用することも、単一種又はモノクローナルにさらに単離することもできる。in vivoでの外来抗原に対する免疫応答及び抗体の産生のプロセスは、当技術分野で周知である。抗体生成の従来のプロトコルとは異なり、本明細書に記載されるプラットホーム発明により、複数のSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(それらが同じSARS-CoV-2開始タンパク質に依存しているかどうかにかかわらず)に対する抗体群を同時に産生させることを可能にする。このポリヌクレオチドの混合物を使用した複数のタンパク質に対する抗体の同時産生は、抗体産生が現在実施されている方法を変える可能性を秘めている。
実施例9:SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするmRNAを使用した免疫化
[00190] インビトロで転写された(IVT)mRNAを動物に直接注射する方法も、当技術分野で周知である。例えば、Sahin et al.,Nat Rev Drug Discov,2014 Oct;13(10):759-80;Kariko et al.,Mol Ther,2008 Nov;16(11):1833-40;Kariko et al.,Nucleic Acid Res,2011,Nov;39(21):e142;米国特許第6,511,832号を参照。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードする直線化したDNAプラスミド鋳型を使用することができる。全てのmRNAは、5’と3’の非翻訳領域、オープンリーディングフレーム、長いポリ(A)テイルを含むように設計することができ、これらはmRNA分子が細胞内に移行した後の翻訳活性と安定性を決定するのに役立つ。
[00190] インビトロで転写された(IVT)mRNAを動物に直接注射する方法も、当技術分野で周知である。例えば、Sahin et al.,Nat Rev Drug Discov,2014 Oct;13(10):759-80;Kariko et al.,Mol Ther,2008 Nov;16(11):1833-40;Kariko et al.,Nucleic Acid Res,2011,Nov;39(21):e142;米国特許第6,511,832号を参照。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードする直線化したDNAプラスミド鋳型を使用することができる。全てのmRNAは、5’と3’の非翻訳領域、オープンリーディングフレーム、長いポリ(A)テイルを含むように設計することができ、これらはmRNA分子が細胞内に移行した後の翻訳活性と安定性を決定するのに役立つ。
[00191] 例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするmRNA(ポリ(A)テイルを含む)は、プソイドウリジンの三リン酸誘導体及び5-メチルシチジン(m5C)(TriLink)を使用して合成し、修飾ヌクレオシド含有RNAを生成することができる。転写反応に、非可逆性キャップ類似体(New England Biolabs、Beverly、MA)である、6mmol/lの3’-O-Me-m7GpppGを補充し、グアノシン三リン酸の濃度を下げることにより、5’キャップをmRNAに付加することができる。転写物の精製は、Turbo DNase(Ambion,Austin,TX)消化、続いてLiCl沈殿及び75%エタノール洗浄によって行うことができる。水中で再構成されるRNAの濃度は、光学密度を260nmで測定することによって決定することができる。修飾ヌクレオチドの転写物への効率的な取り込みは、HPLC分析によって決定することができる。全てのRNA試料は、品質保証のために変性アガロースゲル電気泳動によって分析することができる。次いで、リポフェクチン(Invitrogen,Carlsbad,CA)及びmRNAは、トランスフェクションを増強するためリン酸緩衝液中に複合化される。RNA-リポフェクチンの50μlの複合体を組み立てるために、最初に10μg/μlウシ血清アルブミン(Sigma,St.Louis,MO)を含有する0.4μlリン酸カリウム緩衝液(0.4mol/l、pH6.2)を6.7μl DMEMに添加し、次にそこに0.8μlリポフェクチンを混合し、試料を10分間インキュベートする。別々のチューブにおいて、0.25~3μgのRNAがDMEMに添加され、最終容量を3.3μlにする。希釈されたRNAは、リポフェクチンミックスに添加され、10分間インキュベートされる。最後に、RNA-リポフェクチン複合体は、38.8μl DMEMを添加することによってさらに希釈される。
[00192] 次いで、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするRNAを、本明細書に記載されるマウスモデルに注射することができる。一般に、1μlのリポフェクチン及びSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードする異なる量のポリヌクレオチドを有する60μlの最終容量を含む組成物は、27G1/2針を付けた1ml注射器(Becton Dickinson、San Diego、CA)を使用して側静脈に注射される。あるいは、ポリヌクレオチドは、筋肉内、皮内、鼻腔内、皮下、静脈内、気管内、及びクモ膜下腔内送達を介して注射することができる。ポリヌクレオチドが細胞内に送達された後、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質はin vivoで合成される。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質によって引き起こされる免疫応答と、その後の動物における抗体の産生が、本明細書に記載される。
実施例10:ファージディスプレイを使用するペプチド原性タンパク質に対する親和性成熟抗体
[00193] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を提示させること及び本明細書の実施例に記載されているような抗原提示細胞によるプロセシングを受けさせることによって、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に対して抗体がひとたび産生されると、得られた抗体はディスプレイアプローチを使用して成熟させることができる。例えば、標的特異的な抗体をコードするB細胞mRNAに由来するscFv又はFabをディスプレイするファージのライブラリーは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に対して又はSARS-CoV-2開始タンパク質に対して免疫特異的に結合するscFv又はFabをディスプレイするファージを同定するアッセイにおいてスクリーニングすることができる。固定化ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2開始タンパク質に結合するscFv又はFabをディスプレイするファージは、固定化ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2開始タンパク質におけるパニング及び固定化SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2開始タンパク質への結合についてのELISAによる評価後に、同定することができる。これらのアッセイのためにプレートに固定化されたSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2開始タンパク質は、Moore et al.,Science 285:260-263に記載されているようにバキュロウイルス発現構築物で感染させたSf9細胞の上清から又はHEK293細胞からの上清から精製することができる。次いで、同定されたscFv又はFabのそれぞれを配列決定することができる。
[00193] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を提示させること及び本明細書の実施例に記載されているような抗原提示細胞によるプロセシングを受けさせることによって、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に対して抗体がひとたび産生されると、得られた抗体はディスプレイアプローチを使用して成熟させることができる。例えば、標的特異的な抗体をコードするB細胞mRNAに由来するscFv又はFabをディスプレイするファージのライブラリーは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質に対して又はSARS-CoV-2開始タンパク質に対して免疫特異的に結合するscFv又はFabをディスプレイするファージを同定するアッセイにおいてスクリーニングすることができる。固定化ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2開始タンパク質に結合するscFv又はFabをディスプレイするファージは、固定化ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2開始タンパク質におけるパニング及び固定化SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2開始タンパク質への結合についてのELISAによる評価後に、同定することができる。これらのアッセイのためにプレートに固定化されたSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2開始タンパク質は、Moore et al.,Science 285:260-263に記載されているようにバキュロウイルス発現構築物で感染させたSf9細胞の上清から又はHEK293細胞からの上清から精製することができる。次いで、同定されたscFv又はFabのそれぞれを配列決定することができる。
[00194] 固有のscFv又はFabsの各々の特異性を決定するために、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2開始タンパク質及び対照ウェルに対して、各scFv又はFabsについて、ファージELISAを実施することができる。固有のscFv又はFabの1つを表すファージミドを含む個々のE.coliコロニーを、ウェルあたり100μlの2TYAG培地(アンピシリン及びグルコースを添加したトリプトン+酵母培養液)を含む96ウェルプレートに接種することができる。プレートは、37℃で4時間、振盪しながらインキュベートする。次いで、M13K07ヘルパーファージはMOI10まで各ウェルに添加され、プレートはさらに37℃で1時間インキュベートされる。プレートは、2000rpmで10分間、卓上型遠心分離機において遠心分離される。上清が除去され、細胞ペレットは100μlの2TYAK(アンピシリンとカナマイシンを添加したトリプトン+酵母培養液)中に再懸濁され、30℃で一晩振盪してインキュベートされる。
[00195] 翌日、プレートは2000rpmで10分間遠心分離され、各ウェルから100μlのファージを含む上清が新しい96ウェルプレートに慎重に移される。20μlの6xMPBS(PBSに溶解したドライミルク)が各ウェルに添加され、ELISAの前にファージをプレブロックするため室温で1時間インキュベートされる。
[00196] フレキシブル96ウェルプレート(Falcon)は、PBS中のSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質(直接的又は間接的に、1mg/mlで)、PBS中のBSA(1g/ml)、又はPBS単独で4℃で一晩コーティングされる。コーティング後、溶液がウェルから除去され、プレートがMPBS中で室温で1時間ブロッキングされる。プレートはPBSで3回洗浄され、次いで50μlのプレブロッキングされたファージが各ウェルに添加される。プレートは、室温で1時間インキュベートされ、次いでPBSTを3回交換し、続いてPBSを3回交換して洗浄される。各ウェルに、MPBS中に1~5000倍に希釈した抗遺伝子VIII-HRPコンジュゲート(Pharmacia)50μlが添加され、プレートは室温で1時間インキュベートされる。各プレートはPBSTで3回洗浄され、その後PBSで3回洗浄される。次いで、3% MPBS中に1/50に希釈されたHRP標識抗マウス抗体(DAKO EnVision)50μlが添加され、室温で1時間インキュベートされる。次いで、各プレートは、PBSTで3回洗浄され、続いてPBSで3回洗浄される。次いで、50μlのTMB基質が各ウェルに添加され、室温で30分間又は発色するまでインキュベートされる。反応は、25μlの0.5M H2SO4の添加によって停止される。発生したシグナルは、マイクロタイタープレートリーダー(Bio-Rad 3550)を使用して450nmでの吸光度(A450)を読み取ることによって測定される。
[00197] scFv又はFabsのIgG1フォーマットへの変換は、以下のように実施することができる。我々がIgG分子に変換することを望むscFv又はFabのVHドメイン及びVLドメインは、完全な重鎖又は軽鎖分子が、適切な宿主細胞にトランスフェクトされた場合に、これらのベクターから発現できるように、適切な重鎖(ヒトIgG1、IgG2など)又は軽鎖(ヒトカッパ又はヒトラムダ)の定常領域のヌクレオチド配列を含むベクターにクローニングすることができる。さらに、クローニングされた重鎖と軽鎖の両方が1つの細胞株において(1つ又は2つのベクターから)発現されると、細胞培養培地に分泌される完全な機能的抗体分子へと組み立てることができる。scFv又はFabを従来の抗体分子に変換する方法は、当技術分野で周知である。
[00198] 発酵培養液からのIgGの精製は、抗体産生のために一般に使用される従来技術の組み合わせを用いて実施される。典型的に、培養の収穫物は、精製スキームを開始する前に、細胞及び細胞細片を除去するために清澄化される。これは、通常、収穫物の遠心分離又は濾過のいずれかを使用して達成されるであろう。清澄化の後、抗体は、典型的に捕捉され、プロテインAセファロースにおいてアフィニティークロマトグラフィーを使用して著しく精製されるであろう。抗体は、塩基性pHでプロテインAセファロースに結合させられ、マトリックスの洗浄後にpHの低減によって溶出される。次いで、抗体のさらなる精製がゲル濾過によって達成される。抗体と異なる分子量を有する構成成分を除去するだけでなく、この工程を使用して所望の最終的な製剤緩衝液に緩衝液交換することもできる。
実施例11:抗体の特徴付け及び交差反応性を測定するために使用されるアッセイ
[00199] 抗体(SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片に対して交差反応する又は抗体を産生するかのいずれにせよ)(scFv又はFab及び抗体断片又はそのバリアントを含む他の分子、あるいはscFv又はFab及び抗体断片又はそのバリアントからなる他の分子を含む)は、様々なアッセイにおいてスクリーニングされ得、そのうちのいくつかを、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質に結合する抗体を同定するために以下に記載する。
[00199] 抗体(SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片に対して交差反応する又は抗体を産生するかのいずれにせよ)(scFv又はFab及び抗体断片又はそのバリアントを含む他の分子、あるいはscFv又はFab及び抗体断片又はそのバリアントからなる他の分子を含む)は、様々なアッセイにおいてスクリーニングされ得、そのうちのいくつかを、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/若しくはスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質に結合する抗体を同定するために以下に記載する。
[00200] 1つの特定のアッセイにおいて、ビオチン化タンパク質(SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質のいずれか)に結合する、抗体(SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片に対して交差反応する又は抗体を産生するかのいずれにせよ)は、ストレプトアビジンコート磁気ビーズ上に捕捉することができる。このアッセイは、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質を中和及び/又は結合する抗体(SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片に対して交差反応する又は抗体を産生する)を同定するために適用され得る。さらに、抗体は、本明細書に記載されているか、又は当技術分野において公知である中和アッセイにおいてアッセイされ得る。例えば、抗体は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質がIM9細胞に結合するのを阻害する能力について試験され得る。このアッセイでは、標識されたペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質(例えば、ビオチン化された)を抗体とインキュベートして、タンパク質-抗体複合体を形成させる。インキュベーション後、タンパク質-抗体試料のアリコートは、IM9細胞に添加される。結合は、当技術分野において公知の技術を使用して決定され得る。例えば、ストレプトアビジン-デルフィアの添加後、ビオチン化タンパク質(SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質のいずれでも)のIM9細胞への結合を蛍光光度計を使用して検出することができる。ビオチン化されたタンパク質は、そのタンパク質を中和する抗体によって結合されなければ、細胞に結合し、検出することができる。したがって、IM9細胞に結合するビオチン化タンパク質の量を(タンパク質が無関係な抗体とプレインキュベートされる又は全く抗体なしでプレインキュベートされる対照試料と比較して)減少させる抗体は、タンパク質に結合して中和するものとして同定される。
[00201] 交差反応性を分析し、且つ/又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片に対して産生された抗体を特徴付けるために使用できるその他の免疫アッセイには、ほんの数例を挙げると、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及びプロテインA免疫アッセイなどの技術を使用する競合的及び非競合的なアッセイシステムが挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイはルーチン的なものであり、当技術分野において周知されている(例えば、Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New Yorkを参照)。
[00202] 例示的な免疫アッセイが、以下に簡潔に記載される(ただし、限定することを意図していない)。免疫沈降プロトコルは、一般に、プロテインホスファターゼ及び/又はプロテアーゼ阻害剤(例えば、EDTA、PMSF、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム)を補充されたRIPA緩衝液(1% NP-40又はTriton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、0.15M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.2、1%トラジロール)などの溶解緩衝液中で細胞を溶解すること、目的の交差反応性抗体を細胞溶解物に添加すること、4℃で一定期間(例えば、1~4時間)インキュベートすること、プロテインA及び/又はプロテインGセファロースビーズを細胞溶解物に添加すること、4℃で約1時間又はそれ以上インキュベートすること、ビーズを溶解緩衝液中で洗浄すること、並びにビーズをSDS/試料緩衝液中に再懸濁することを含む。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質を免疫沈降させる目的の抗体の能力は、例えば、ウェスタンブロット分析又は質量分析により評価することができる。当業者は、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質への抗体の結合を増加させ、バックグラウンドを減少させる(例えば、セファロースビーズで細胞溶解物をプレクリアする)ように改変することができるパラメータについて知識があるであろう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる議論については、例えば、Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 10.16.1を参照。
[00203] ウエスタンブロット分析は、一般にタンパク質試料を調製すること、ポリアクリルアミドゲル(例えば、抗原の分子量に依存して8%-20% SDS-PAGE)におけるタンパク質試料の電気泳動法、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、PVDF又はナイロンなどの膜に移すこと、膜をブロッキング溶液(例えば、3% BSA又は無脂肪ミルクを有するPBS)中でブロッキングすること、膜を洗浄緩衝液(例えば、PBS-Tween20)中で洗浄すること、膜をブロッキング緩衝液中に希釈した一次抗体(目的の抗体)でブロッキングすること、膜を洗浄緩衝液中で洗浄すること、膜をブロッキング緩衝液中に希釈した酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)又は放射性分子(例えば、32P又は1211)にコンジュゲートされた二次抗体(これは一次抗体、例えば抗ヒト抗体を認識する)でブロッキングすること、膜を洗浄緩衝液中で洗浄すること、及び抗原の存在を検出することを含む。当業者は、検出されるシグナルを増加させ、バックグラウンドノイズを減少させるために変更できるパラメータについて知識があるであろう。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる議論については、例えば、例えば、Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 10.8.1を参照。
[00204] さらなる例では、ELISAは、ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質を調製すること、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルをSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質で(直接的又は間接的に)コーティングすること、ウェルに結合しなかったSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質を洗い流すこと、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)などの検出可能な化合物にコンジュゲートされた目的の抗体をウェルに添加すること、一定期間インキュベートすること、非結合抗体又は非特異的結合抗体を洗浄除去すること、並びにウェルをコーティングするSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質に特異的に結合した抗体の存在を検出することを含む。ELISAでは、目的の抗体は検出可能な化合物にコンジュゲートさせる必要はなく、代わりに、検出可能な化合物にコンジュゲートした二次抗体(これは目的の抗体を認識する)が、ウェルに添加され得る。
[00205] さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングされてもよい。この場合、検出可能な分子は、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)などの検出可能な化合物に結合したSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質であり得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるために変更することができるパラメータ、及び当技術分野で知られているELISAの他のバリエーションについて知識があるであろう。ELISAに関するさらなる議論については、例えば、Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 11.2.1を参照。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質に対する抗体の結合親和性及び抗体-タンパク質相互作用のオフレートは、競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの一例は、標識SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質(例えば、3H又は125I)と目的の抗体との、増加する量の非標識SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質の存在下でのインキュベーション、並びに標識SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質に結合した抗体の検出を含む放射免疫アッセイである。SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質に対する本発明の抗体の親和性並びに結合オフレートは、スキャッチャードプロット解析によるデータから決定することができる。二次抗体との競合は、放射免疫アッセイを使用して決定することもできる。この場合、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質は、標識化合物(例えば、3H又は125I)にコンジュゲートされた目的の抗体と、増加する量の非標識二次抗ペプチド原性タンパク質抗体の存在下でインキュベーションされる。
[00206] 好ましい実施態様では、BIAcore動態解析を使用して、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質に対する抗体結合のオンレート及びオフレートを決定することができる。BIAcore動態解析は、表面に抗体が固定化されたチップからのSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質及び/又はスパイク断片及び/又はSARS-CoV-2開始タンパク質の結合と解離を分析することを含む。
実施例12:ワクチン接種
[00207] さらに、本明細書に記載のSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物を、ワクチンとして使用することができる。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のリン酸緩衝食塩水(PBS、155mM NaCl、1mM KH2PO4、3mM Na2HPO3)中の320ug/mLの濃度は、等容量のMontanide ISA 51で無菌的に乳化されて、最終ワクチン濃度の160ug/mLが得られる。エマルジョンは、Omni Mixer-ESホモジナイザー(Omni International,Warren-ton,VA)を使用して、室温で6分間6000rpmで400mL容器中に体積200mLの混合物をホモジナイズすることによって達成される。各ワクチンは、包括的な品質管理分析を受けて、一般的な安全性、純度、同一性、完全性、及び均一な油中水型液滴サイズが保証される。2~8℃で保存されたワクチンの安定性は、ヒト免疫化の終了後4~10か月まで、ワクチン安全性、効力、均一性、純度、及び完全性を検証するために、マウス免疫原性試験並びに物理的及び生化学的なアッセイを使用して定期的に評価される。160ug/mLペプチド原性タンパク質ワクチンは、免疫化前に、PBS/ISA51(アジュバント対照ワクチン)で希釈され、10ug/mL又は40ug/mLの最終用量形態となる。異なる程度の希釈の結果として、これらのワクチンは、2つの異なる比率のワクチン含有組成物対ワクチンを含有しない組成物、すなわち、それぞれ1:15及び1:3の比率の10ug/mL及び40ug/mL製剤を含んでいた。試験ワクチン及び対照ワクチンは、高度に粘稠性であり、均一性を保証するために操作の前後でボルテックスを行う必要がある。ワクチンは、針と注射器によって筋肉内に投与することができる。ワクチン誘導性T細胞応答が、適格な細胞内サイトカイン染色アッセイの手段によってさらに評価される。末梢血単核細胞は、インターロイキン-2、インターフェロン-γ、又は腫瘍壊死因子(TNF)を産生する、トータル及びメモリーCD4及びCD8 T細胞の比率を決定するために定量される。
[00207] さらに、本明細書に記載のSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物を、ワクチンとして使用することができる。例えば、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質のリン酸緩衝食塩水(PBS、155mM NaCl、1mM KH2PO4、3mM Na2HPO3)中の320ug/mLの濃度は、等容量のMontanide ISA 51で無菌的に乳化されて、最終ワクチン濃度の160ug/mLが得られる。エマルジョンは、Omni Mixer-ESホモジナイザー(Omni International,Warren-ton,VA)を使用して、室温で6分間6000rpmで400mL容器中に体積200mLの混合物をホモジナイズすることによって達成される。各ワクチンは、包括的な品質管理分析を受けて、一般的な安全性、純度、同一性、完全性、及び均一な油中水型液滴サイズが保証される。2~8℃で保存されたワクチンの安定性は、ヒト免疫化の終了後4~10か月まで、ワクチン安全性、効力、均一性、純度、及び完全性を検証するために、マウス免疫原性試験並びに物理的及び生化学的なアッセイを使用して定期的に評価される。160ug/mLペプチド原性タンパク質ワクチンは、免疫化前に、PBS/ISA51(アジュバント対照ワクチン)で希釈され、10ug/mL又は40ug/mLの最終用量形態となる。異なる程度の希釈の結果として、これらのワクチンは、2つの異なる比率のワクチン含有組成物対ワクチンを含有しない組成物、すなわち、それぞれ1:15及び1:3の比率の10ug/mL及び40ug/mL製剤を含んでいた。試験ワクチン及び対照ワクチンは、高度に粘稠性であり、均一性を保証するために操作の前後でボルテックスを行う必要がある。ワクチンは、針と注射器によって筋肉内に投与することができる。ワクチン誘導性T細胞応答が、適格な細胞内サイトカイン染色アッセイの手段によってさらに評価される。末梢血単核細胞は、インターロイキン-2、インターフェロン-γ、又は腫瘍壊死因子(TNF)を産生する、トータル及びメモリーCD4及びCD8 T細胞の比率を決定するために定量される。
[00208] SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを患者に投与することによって、ワクチンとして使用することもできる。
引用文献
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Claims (36)
- a. SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質であって、ここで、前記ペプチド原性タンパク質が、SARS-CoV-2開始タンパク質と比較して変化した立体構造動力学を有し、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が、SARS-CoV-2開始タンパク質と立体構造が類似しており、前記SARS-CoV-2開始タンパク質が、表2に列挙されたタンパク質のうちの少なくとも1つから選択される、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質;又は
b. スパイク断片;又は
c. (a)若しくは(b)をコードするポリヌクレオチド;又は
d. (a)、(b)、及び/若しくは(c)の任意の組み合わせ
を含む組成物。 - 変化した立体構造動力学が、
a. SARS-CoV-2開始タンパク質の3-D構造を調べ、SARS-CoV-2開始タンパク質の非表面アミノ酸残基を同定し、SARS-CoV-2開始タンパク質中の少なくとも1つの非表面アミノ酸残基を置換して、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成すること;又は
b. SARS-CoV-2開始タンパク質の3-D構造のモデルを調べ、SARS-CoV-2開始タンパク質の非表面アミノ酸残基を同定し、SARS-CoV-2開始タンパク質中の少なくとも1つの非表面アミノ酸残基を置換して、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成すること;又は
c. 異なる種由来のSARS-CoV-2開始タンパク質にオルソロガスなタンパク質にわたって保存されたアミノ酸相同性のパターンを比較して、SARS-CoV-2開始タンパク質の非表面アミノ酸残基を同定し、SARS-CoV-2開始タンパク質中の少なくとも1つの非表面アミノ酸残基を置換して、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成すること;又は
d. SARS-CoV-2開始タンパク質の少なくとも1つの非表面アミノ酸残基を置換して、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質を生成すること;又は
e. 少なくとも1つの非表面アミノ酸残基をより小さなアミノ酸残基で置換すること;又は
f. 少なくとも1つの非表面アミノ酸残基をアラニン若しくはグリシンで置換すること;又は
g. SARS-CoV-2開始タンパク質中の少なくとも1つのジスルフィド結合を除去すること
によって得られる、請求項1に記載の組成物。 - SARS-CoV-2開始タンパク質において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個のアミノ酸が置換される、請求項1又は2のいずれかに記載の組成物。
- SARS-CoV-2開始タンパク質の立体構造動力学が、
a. 少なくとも1つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシン若しくはセリンで;又は
b. 少なくとも1つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリン若しくはスレオニンで;又は
c. 少なくとも1つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシン若しくはイソロイシンで;又は
d. 少なくとも1つのロイシンをアラニン、バリン、グリシン、若しくはイソロイシンで;又は
e. 少なくとも1つのイソロイシンをアラニン、バリン、ロイシン、若しくはグリシンで;又は
f. 少なくとも1つのプロリンをメチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、若しくはグリシンで;又は
g. 少なくとも1つのメチオニンをアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはグリシンで;又は
h. 少なくとも1つのフェニルアラニンをチロシン、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはグリシンで;又は
i. 少なくとも1つのチロシンをフェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはグリシンで;又は
j. 少なくとも1つのトリプトファンをチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはグリシンで;又は
k. 少なくとも1つのアスパラギン酸をグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、若しくはイソロイシンで;又は
l. 少なくとも1つのアスパラギンをグリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸で;又は
m. 少なくとも1つのグルタミン酸をアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、若しくはイソロイシンで;又は
n. 少なくとも1つのグルタミンをグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、若しくはイソロイシンで;又は
o. 少なくとも1つのリジンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、若しくはイソロイシンで;又は
p. 少なくとも1つのアルギニンをリシン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、若しくはイソロイシンで;又は
q. 少なくとも1つのヒスチジンをフェニルアラニン、チロシン、リジン、アルギニン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、ロイシン、メチオニン若しくはイソロイシンで;又は
r. 少なくとも1つのアラニンをグリシン又はプロリンで;又は
s. 少なくとも1つのグリシンをアラニン若しくはプロリンで;又は
t. 少なくとも1つのセリンをアラニン若しくはグリシンで;又は
u. 少なくとも1つの残基を非天然アミノ酸で;又は
v. 上記の組み合わせのいずれか
で置換することによって変化している、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。 - SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が、スパイク糖タンパク質P0DTC2 Spike_SARS2(配列番号15)又はP59594 Spike_CVHSA(配列番号16)から選択される、請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。
- スパイクタンパク質が、以下の位置:
(A)配列番号15のTrp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/若しくはPhe543;
(B)配列番号15のVal308、Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/若しくはLeu585;
(C)配列番号15のAla363、Ala397、及び/若しくはAla575;
(D)配列番号15のCys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;
(E)配列番号15のAla419、Ile980、Ala903、Leu916、Ala575、Phe1095、Cys1032、Val576、Tyr365、Ile1115、Ile418、Leu387、Cys649、Leu650、Leu585、Ala1080、Ile410、Tyr423、Ala1087、Tyr695、Ala653、Phe201、Ile1081、Phe497、Ala989、Leu552、Val1104、及び/若しくはCys671;又は
(F)又は配列番号15~16若しくは配列番号43~110における等価な位置
のいずれかで変異している、請求項5に記載の組成物。 - 組成物が、以下:
a. 配列番号15のアミノ酸316~594若しくは配列番号16のアミノ酸303~580;
b. 以下の部位のいずれか1つにおける少なくとも1つの変異を伴う配列番号15のアミノ酸316~594:A)Trp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/若しくはPhe543;(B)Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/若しくはLeu585;(C)Ala363、Ala397、及び/若しくはAla575;(D)Cys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;(E)Ala419、Ala575、Val576、Tyr365、Ile418、Leu387、Leu585、Ile410、Tyr423、Phe497、及び/若しくはLeu552;
c. 以下の部位のいずれか1つにおける少なくとも1つの変異を伴う配列番号15のアミノ酸319~591:(A)Trp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、Phe497、及び/若しくはPhe543;(B)Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、Val539、Leu552、Ala575、Val576、及び/若しくはLeu585;(C)Ala363、Ala397、及び/若しくはAla575;(D)Cys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;及び/又は(E)Ala419、Ala575、Val576、Tyr365、Ile418、Leu387、Leu585、Ile410、Tyr423、Phe497、及び/若しくはLeu552;
d. 以下の部位のいずれか1つにおける少なくとも1つの変異を伴う配列番号15のアミノ酸319~541:(A)Trp353、Tyr365、Phe392、Phe400、Tyr423、及び/若しくはPhe497;(B)Ile326、Val350、Ile358、Ala363、Leu387、Val395、Ala397、Val401、Ile402、Ile410、Ile418、Ala419、Leu425、Val433、Ile434、Ala435、Leu492、Val510、Val511、Val512、Leu513、Val524、及び/若しくはVal539;(C)Ala363、及び/若しくはAla397;(D)Cys336Ala/Cys361Ala、及び/若しくはCys379Ala/Cys432Ala;及び/又は(E)Ala419、Tyr365、Ile418、Leu387、Ile410、Tyr423、及び/若しくはPhe497;
e. アミノ酸Y365、I402、及び/若しくはV511における少なくとも1つの変異を伴う配列番号15のアミノ酸319~541、319~591、若しくは316~594;
f. Y365L、I402V、及び/若しくはV511Aから選択される少なくとも1つの変異を伴う配列番号15のアミノ酸319~541、319~591、若しくは316~594;又は
g. 配列番号15~16若しくは配列番号43~110における等価な断片及び/若しくは変異
のうちのいずれか1つを含むか、又はそれからなる、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。 - SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の立体構造動力学の変化が、
a. SARS-CoV-2開始タンパク質と比較した融解温度の変化;又は
b. 安定化のギブズ自由エネルギー若しくはタンパク質分解感受性アッセイの変化;又は
c. 安定化のギブズ自由エネルギーの変化が、尿素若しくはグアニジニウム塩酸塩アンフォールディングなどの変性剤調節平衡アンフォールディングによって測定される、ギブズ自由エネルギーの変化
によって測定される、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。 - 類似の立体構造が、
a. SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質とSARS-CoV-2開始タンパク質の両方に結合する交差反応性抗体;又は
b. 交差反応性が、免疫沈降アッセイ、表面プラズモン共鳴、等温滴定熱量測定、斜入射反射差(OI-RD)、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及び/又はプロテインA免疫アッセイによって測定される、(a)の交差反応性抗体;又は
c. 交差反応性が結合アッセイによって測定される、(a)の交差反応性抗体;又は
d. 10-9M以下の解離定数(KD)を有する、(a)の交差反応性抗体;又は
e. 10-8M以下、10-7M以下、若しくは10-6M以下の解離定数(KD)を有する、(a)の交差反応性抗体;
によって測定される、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。 - 変異が、表2に列挙された変異のうちの少なくとも1つから選択される、請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物。
- 組成物が動物に直接投与される、請求項1~10のいずれか一項に記載の組成物。
- SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が、
a. 同じSARS-CoV-2開始タンパク質;又は
b. 複数のSARS-CoV-2開始タンパク質;又は
c. 複数の関連するSARS-CoV-2開始タンパク質
に由来する、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物。 - 請求項1~12のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与する方法。
- 前記方法が、さらに、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの混合物を対象に投与することと、ポリヌクレオチドの混合物を動物に導入することであって、SARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質が当該ポリヌクレオチドから発現される、導入することとを含む、請求項13に記載の方法。
- ポリヌクレオチドが、
a. in vitroで合成される;又は
b. DNA;又は
c. in vitroで転写された(IVT)mRNA;又は
d. ポリ(A)テイルを含むIVT mRNA;又は
e. 5’キャップを含むIVT mRNA
である、請求項14に記載の方法。 - ポリヌクレオチドが、
a. いかなるターゲティング構成成分とも会合していない;又は
b. ポリヌクレオチドを細胞若しくは臓器に標的化することができるターゲティング構成成分と会合している;又は
c. ポリヌクレオチドを細胞若しくは臓器に標的化することができるターゲティング構成成分と会合しており、当該ターゲティング構成成分がベクターである
請求項14又は15に記載の方法。 - 請求項1~12のいずれか一項に記載の組成物を含む動物。
- 動物が哺乳動物、ヒト、マウス、ウサギ、ラマ、又はウシである、請求項17に記載の動物。
- 動物が組成物を注射されている、請求項13~16のいずれか一項に記載の方法又は請求項17若しくは18のいずれかに記載の動物。
- 組成物が、
a. 動物の筋肉内に直接注射される;
b. 動物内に複数回注射される
請求項13~16のいずれか一項に記載の方法又は請求項17若しくは18のいずれかに記載の動物。 - 前記方法が免疫応答を生成する、請求項13~16又は19~20のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫応答が抗体の生成を含む、請求項21に記載の方法。
- 抗体を単離することをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 抗体が、完全ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、及び/又はポリクローナル抗体である、請求項23に記載の方法。
- 請求項22~24のいずれか一項に記載の方法によって産生される抗体。
- ポリクローナル抗体が、単一の単離された抗体種を得るためにさらに分画される、請求項25に記載の方法。
- 請求項26に記載の方法によって産生される単離された抗体。
- 抗体が親和性成熟している、請求項13~16及び19~26のいずれか一項に記載の方法又は請求項27に記載の抗体。
- 親和性成熟が、
a. ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、若しくはリボソームディスプレイ;又は
b. パニング技法
によって起こる、請求項28に記載の方法又は抗体。 - 請求項28又は29のいずれかに記載の方法によって産生される抗体。
- 請求項25、27、又は30のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 異種プロモーターをさらに含む、請求項31に記載のポリヌクレオチド。
- ベクター配列をさらに含む、請求項31又は32のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1~12又は31~33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- ペプチド原性タンパク質又はSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドの混合物であって、前記ペプチド原性タンパク質が表2に示されるタンパク質から選択される、混合物。
- ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、
a. 同じSARS-CoV-2開始タンパク質に由来するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードする;又は
b. 複数のSARS-CoV-2開始タンパク質に由来するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードする;又は
c. 複数の関連するSARS-CoV-2開始タンパク質に由来するSARS-CoV-2ペプチド原性タンパク質の混合物をコードする;又は
d. in vitroで合成される;又は
e. DNAである;又は
f. in vitroで転写された(IVT)mRNAである;又は
g. ポリ(A)テイルを含むIVT mRNAである;又は
h. 5’キャップを含むIVT mRNA
である、請求項35に記載のペプチド原性タンパク質又はポリヌクレオチドの混合物。
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