JP2022542003A - 免疫原 - Google Patents

Abstract

ＲＳＶに対するワクチン組成物の調製に有用なポリペプチドを提供する。被験体におけるサブドミナント抗体応答を増強する方法も開示する。【選択図】図１

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り 発行日 ２０２０年５月１５日 刊行物 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６８，ｅａａｙ５０５１（２０２０）；ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｙ５０５１

本発明は、免疫応答を引き起こすために免疫原として使用され得るポリペプチドに関する。本発明は、上記ポリペプチドを含むワクチン組成物に更に関する。本発明の態様は、被験体においてサブドミナント（subdominant）抗体応答を増強する方法に更に関する。本発明のまた更なる態様は、標的ペプチドの複雑及び／又は不連続な構造配置を模倣するためにペプチド、好ましくは免疫原を設計する方法に関する。

過去数十年にわたって、ワクチン接種が感染性疾患を抑制及び根絶するために重要な対抗策となっている。しかしながら、多くの病原体（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス等）が、抗体応答を開始する免疫系を回避することで、再感染に対する広範かつ強力な防御を与えることができず、場合によっては疾患の増進を媒介する。ヒトＢ細胞の詳細なプロファイリングにより、自然感染によって出現する強力な中和抗体が明らかとなることが多いが、概してサブドミナントである。次世代ワクチンの大きな課題は、確立された免疫優勢階層を克服し、抗体応答を極めて重要な中和エピトープに焦点化することである。

ワクチン接種は、感染性疾患の負荷を軽減するのに最も成功した医学的介入の１つであることが証明されており、ワクチンにより誘導される免疫の主要な関連要因は、感染を阻止する中和抗体の誘導である。しかしながら、不活性化又は弱毒化された病原体の配合に依存する従来のワクチンアプローチは、多数の重要な病原体に対する防御免疫を誘導することができず、新規のワクチン開発戦略が至急必要とされている。免疫原設計のための構造ベースのアプローチが、抗体媒介中和に感受性を有する構造的に明確なエピトープに対して焦点化された抗体応答を誘発する有望な戦略として現れている。

近年、ハイスループットＢ細胞技術の進歩により、ＨＩＶ－１、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ジカウイルス、デング熱ウイルス等を含む、数十年にわたって従来のワクチン開発手段に対抗していた種々の病原体に対する驚くほど多くの強力な中和抗体（ｎＡｂ）が明らかとなった。これらの抗体の多くは、それらのウイルス標的タンパク質との複合体で構造的に特性評価され、中和感受性のエピトープの原子的詳細が明らかにされている。詳細な機能及び構造の研究と併せた大規模な抗体単離の活動により、抗体媒介中和の影響を受けやすいエピトープを詳しく説明し、合理的な構造ベースのワクチン設計アプローチのロードマップを与えるウイルス融合タンパク質の包括的な抗原マップが得られている。

中和抗体によって定義されるエピトープをワクチン開発に活用する概念的フレームワークは、一般に逆ワクチン学と称される。逆ワクチン学に端を発するアプローチは、過去１０年間に多数の面白い進歩をもたらしたが、このような焦点化された抗体応答を誘発する免疫原の設計は依然として困難である。構造ベースの免疫原設計アプローチの成功例としては、ポストフュージョン（postfusion）立体配座と比較して優れた血清中和力価をもたらす、ＲＳＶＦのプレフュージョン（prefusion）状態（ｐｒｅＲＳＶＦ）での立体配座安定化が挙げられる。インフルエンザの場合、広域中和抗体（ｂｎＡｂ）の標的となる幾つかのエピトープがヘマグルチニン（ＨＡ）ステムドメインにおいて特定され、ＨＡステムのみの免疫原は、完全長ＨＡよりも広範な中和抗体応答を誘発した。一般に、これらのアプローチは、抗体応答をウイルスタンパク質の特定の立体配座又はサブドメインに焦点化することを目的としている。より積極的なアプローチにおいて、Correia et al.は、ＲＳＶ抗原部位ＩＩを提示する合成免疫原をコンピューターにより設計し、非ヒト霊長類において単一エピトープによって媒介されるＲＳＶ中和活性の誘導の原理証明を行った。

新規のタンパク質を第一原理から設計する努力により、ｄｅ ｎｏｖｏタンパク質の構造的特徴を制御する様々な規則が明らかとなった（１～４）。コンピューターによるアプローチを用いた機能の設計は、高精度エネルギー関数を必要とし、不正確にモデル化されるか又は無視された極めて重要なパラメーター（例えば分子環境、配座動力学）を伴い得るため、はるかに困難なものとなっている。それにもかかわらず、設計されたタンパク質に、他のタンパク質に結合することによって機能を果たす構造モチーフを付与することにより、分子認識事象の設計において大幅な進歩が見られた。稀な例外を除いて、移植される結合モチーフは、線状ヘリックスセグメント等の既存のタンパク質構造によく見られるものであり、大幅な骨格の調節なしにかかるモチーフをグラフトすることが可能であった（５～８）。一般に、タンパク質機能は、タンパク質構造の単一の規則的セグメントが有するのではなく、全体構造の規定のトポロジー特徴によって支持される幾つかの、多くの場合、不規則な構造要素の三次元配置から生じる（９，１０）。そのため、所望の機能を果たすことができる不規則なマルチセグメントの複雑な構造モチーフをｄｅ ｎｏｖｏ設計タンパク質に付与する、コンピューターによるアプローチを開発することが本分野には最も重要である。

機能性タンパク質設計の期待が高まっている重要な領域は、免疫応答の調節、特にｉｎ ｖｉｖｏでの中和抗体（ｎＡｂ）の誘導であった（１１）。規定のエピトープを標的とするｎＡｂの誘導は、依然としてワクチン開発にとって最重要の課題である。多くのｎＡｂ－抗原相互作用の構造的理解の高まりにより、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、デング熱ウイルス等に対する免疫原の合理的設計の鋳型が得られている。この構造的知識の拡大にもかかわらず、これら及び他の病原体には、依然として効果的なワクチンはなく、ナイーブ及び曝露前の免疫系の両方において重要な中和エピトープに対する抗体応答を効率的に導く次世代ワクチンの必要性が強調される。実際に、規定のエピトープ特異性を有する抗体応答の誘発は、改変ウイルスタンパク質に由来する免疫原にとって長年の課題となっている。

抗体応答の焦点化に対するｄｅ ｎｏｖｏ設計アプローチがCorreiaらによって示されている（１１）。コンピューターによるタンパク質設計を用いて、臨床的に承認されたモノクローナル抗体の標的となる線状ヘリックス－ターン－ヘリックスモチーフであるＲＳＶＦ抗原部位ＩＩを異種タンパク質スキャフォールドに移植した。エピトープ焦点化免疫原は、反復ブースティング免疫化後に非ヒト霊長類（ＮＨＰ）においてｉｎ ｖｉｖｏでｎＡｂを誘発した。コンピューターにより設計された免疫原を用いた機能的抗体の誘導についての原理証明が実証されてはいるが、構造的に複雑なエピトープへのコンピューターによるアプローチの適用性の欠如及び免疫原性研究において観察された一貫性のない中和力価という幾つかの大きなボトルネックが生じている。

これらの限界に対処するために、本発明者らはここで、２つの不規則かつ不連続なＲＳＶ中和エピトープ（図１に示す部位０（１２）及びＩＶ（１３））を模倣するエピトープ焦点化免疫原を設計し、ｄｅ ｎｏｖｏ設計タンパク質におけるこれらの構造的に困難なモチーフの提示を可能にする２つのコンピューターによる設計方法を紹介する。以前に設計された部位ＩＩ免疫原を含むカクテル製剤は、３つ全てのエピトープに対して指向された防御閾値を超える一貫した中和レベルをｉｎ ｖｉｖｏで生じた。提示の設計戦略は、タンパク質を操作して不規則かつ不連続な結合部位を安定化するための青写真を与え、誘導される抗体特異性の微調整を必要とする病原体に対するワクチン設計、より一般的には複雑な機能モチーフを提示するｄｅ ｎｏｖｏタンパク質の設計に適用可能である。

本発明の第１の態様によれば、複数種の非自然発生の免疫原性ポリペプチドを含み、該免疫原性ポリペプチドの少なくとも１種が、フォールディングされて標的病原体の複雑及び／又は不連続な中和エピトープを模倣する三次構造を有するアミノ酸配列を有する模倣ペプチドを含む、標的病原体に対するワクチン組成物が提供される。

「模倣する」とは、アミノ酸配列の三次構造が、上記標的病原体に由来する複雑及び／又は不連続な中和エピトープの三次構造をほぼ再現することを意味し、少なくとも、上記標的病原体に由来する複雑及び／又は不連続な中和エピトープを標的とする中和抗体が模倣ペプチドに結合することができる程度まで２つの三次構造間に十分な類似性が見られるのが好ましい。最も好ましい実施の形態においては、模倣ペプチドに結合する抗体の親和性及びアビディティのいずれか、好ましくは両方が、標的病原体に由来するエピトープに結合する抗体の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上である。

本発明は、病原体に由来する複雑又は不連続なエピトープが模倣ペプチドによって模倣されることを可能にする本明細書に開示される設計原理及びペプチドに基づく。本明細書の実施例においては、病原体はＲＳＶである。それぞれが本明細書に記載されるように設計されても、又は設計された免疫原と他の免疫原との組合せであってもよい、組成物中の免疫原の組合せを使用することで、病原体に対して十分な免疫応答をもたらす様々な免疫応答を誘発し得ることが見出された。或る特定の実施の形態においては、ワクチン組成物を用いて初期のサブドミナント中和抗体応答を増強することができる（例えば、かかるサブドミナント応答は病原体への初期曝露に応答して生じ得る；応答がサブドミナントであるため、その後の曝露の際に病原体を中和するのに不十分な場合がある。本明細書に記載のワクチン組成物によるサブドミナント応答の増強は、病原体へのその後の曝露の際に中和応答を生じる可能性がある）。

好ましい実施の形態において、上記複数種の非自然発生の免疫原性ポリペプチドの各々は、フォールディングされて上記標的病原体の複雑及び／又は不連続な中和エピトープを模倣するアミノ酸配列を有する模倣ペプチドを含む。上記複雑及び／又は不連続な中和エピトープの各々が重複しないのが好ましい。単一の模倣ペプチドを使用する（他の免疫原も存在する）実施の形態においては、免疫原の各々が非重複エピトープを提示することが好ましい。しかしながら、必ずしも全ての免疫原が模倣ペプチドを含むとは限らず、免疫原の少なくとも１つが自然発生免疫原であってもよい。このようにして、複数の別個の抗体応答を単一の病原体に対して誘発することができる。複合免疫応答は、単一の免疫原に対する個々の免疫応答の誘発と比較して相乗的であり得る。

好ましい実施の形態において、また本明細書の実施例に記載されるように、上記標的病原体はＲＳＶである。しかしながら、本明細書に説明される設計原理を用いて、他の病原体、特に、例えばサブドミナント中和抗体応答を誘発する傾向があるため、及び／又は強力な中和エピトープではなく株特異的エピトープの抗体標的化を生じる表面分子の頻繁な突然変異のために従来のワクチン設計に耐性を示し得る病原体に対するワクチンを調製することができる。他の潜在的に好適な標的病原体の例としては、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、デング熱ウイルスが挙げられる。

標的病原体がＲＳＶである場合、複雑及び／又は不連続な中和エピトープは、好ましくはＲＳＶ部位０、部位ＩＩ及び部位ＩＶからなる群より選択され、より好ましくは、部位０及びＩＶの両方からのエピトープが使用され、最も好ましくは全てのＲＳＶ部位０、ＩＩ及びＩＶからのエピトープが使用される。

好ましくは、ＲＳＶ部位０を標的とする模倣ペプチドは、表４又は表６、好ましくは表６から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、最も好ましくはＳ０＿２．１２６ペプチド配列を含むか又はそれのみからなる。ＲＳＶ部位ＩＶを標的とする模倣ペプチドは、表３又は表５、好ましくは表５から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれのみからなることができ、最も好ましくはＳ４＿２．４５ペプチド配列を含むか又はそれのみからなる。ＲＳＶ部位ＩＩを標的とする模倣ペプチドは、Sesterhenn et al 2019（PLoS Biol. 2019 Feb; 17(2): e3000164, doi: 10.1371/journal.pbio.3000164）に記載されるＦＦＬ＿００１又はＦＦＬＭペプチド（好ましくはＦＦＬＭペプチド）を含むか又はそれのみからなることができる。ＦＦＬＭペプチドは、アミノ酸配列ＡＳＲＥＤＭＲＥＥＡＤＥＤＦＫＳＦＶＥＡＡＫＤＮＦＮＫＦＫＡＲＬＲＫＧＫＩＴＲＥＨＲＥＭＭＫＫＬＡＫＱＮＡＮＫＡＫＥＡＶＲＫＲＬＳＥＬＬＳＫＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＱＶＬＱＦＡＤＤＡＥＡＥＩＤＱＬＡＡＤＡＴＫＥＦＴＧ（配列番号１）を有し、本明細書においてＳ２＿１又はＳ２＿１．２とも称される。

本発明の或る特定の実施の形態において、免疫原性ペプチドは、複雑及び／又は不連続な中和エピトープの模倣を補助するように模倣ペプチドを提示するスキャフォールド、好ましくはペプチドスキャフォールドを含むことができる。例えば、設計された模倣配列は、スキャフォールド配列に線状に融合させることができる。代替的には、模倣配列を２つ以上の構造フレームワーク要素（例えばヘリックス、シート等）に非線状にグラフト又は融合して、模倣配列を所望の構造形式で提示させることができる。模倣配列自体が、特に複数の構造要素上に提示される場合に複数の配列を含んでいてもよい。スキャフォールドが複数の免疫原性ペプチドを含むナノ粒子を形成してもよく、該ナノ粒子は可溶性であるのが好ましい。好ましい実施の形態においては、スキャフォールドは、ＲＳＶＮ及びフェリチンから選択され得る。

本発明のワクチン組成物は、標的病原体に由来するネイティブ免疫原を含むワクチン組成物と組み合わせて提供することができる。これらは、別個に（別個の組成物として）又はともに（単一のワクチン組成物として）提供することができる。本明細書に記載される複数のワクチン組成物を含むキットも本発明によって提供される。例えば、病原体がＲＳＶである場合、ネイティブ免疫原は、付加的なＲＳＶ由来のタンパク質又は糖タンパク質、最も好ましくはＲＳＶＦ糖タンパク質又はＲＳＶＦタンパク質前駆体（例えば、コアペプチド配列又はｐｒｅＲＳＶＦ）であってもよい。ＲＳＶＦタンパク質配列の例は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢデータベースにエントリＡ０Ａ１１０ＢＦ１６（Ａ０Ａ１１０ＢＦ１６＿ＨＲＳＶ）として与えられる。「ネイティブ免疫原」への言及が、免疫原が病原体から直接得られることを必要とせず、明らかに他の発現系又は合成源を使用することができることに留意されたい。免疫原が病原体内又は病原体上に存在する場合の免疫原と同じ配列／立体配置を有することが意図される。ワクチンが別個の組成物として提供される場合、ワクチンをプライム：ブーストスケジュールで投与することができ（すなわち、「プライム」投与としてのネイティブ免疫原ワクチンの投与に続く、その後の「ブースト」としての他のワクチンの投与）、かかるスケジュールは、プライムワクチンに応答して見られる初期のサブドミナント中和免疫応答を増強すると考えられる。本発明の或る特定の実施の形態においては、ワクチン組成物（ネイティブ免疫原を含まない）を、以前にネイティブ免疫原に曝露された被験体に投与することができる。かかる投与スケジュールは、別個のプライム投与を必要とすることなく、プライム：ブーストスケジュールと同様の効果を有すると考えられる。スケジュールは、複数回のブーストワクチン接種を施すことを含んでいてもよい。プライム及び最初のブーストワクチン接種は、任意の好適なスケジュールに従って施すことができ、例えば、２回のワクチン接種を１週間、２週間、３週間、４週間又はそれ以上の間隔を空けて施すことができる。複数回のブーストワクチン接種を施す場合、これらも任意の好適なスケジュールに従って施すことができ、例えば、２回のワクチン接種を１週間、２週間、３週間、４週間又はそれ以上の間隔を空けて施すことができる。２回のブーストワクチン接種を施すのが好ましい。

本発明の特に好ましい一実施の形態において、本明細書に記載されるＳ０＿２．１２６ペプチド配列及び本明細書に記載されるＳ４＿２．４５ペプチド配列を含むワクチン組成物が提供される。組成物は、Sesterhenn et al 2019に記載されるＦＦＬ＿００１又はＦＦＬＭペプチドを更に含んでいてもよい（ＦＦＬＭは、本明細書においてＳ２＿１又はＳ２＿１．２とも称される）。Ｓ０＿２．１２６及びＳ４＿２．４５ペプチド配列のいずれか又は好ましくは両方が、フェリチンにコンジュゲートしていてもよい。ＦＦＬ＿００１又はＦＦＬＭペプチド配列は、ＲＳＶＮにコンジュゲートしていてもよい。

本明細書に記載されるワクチン組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体及び／又はアジュバントを更に含んでいてもよい。アジュバントはＡＳ０４、ＡＳ０３、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ等であり得る。

本明細書に記載されるワクチン組成物は、経口、筋肉内、非経口、皮下、鼻腔内、口腔内、肺内、直腸又は静脈内投与を含むが、これらに限定されない任意の経路によって投与することができる。

ａ）上記ワクチン組成物を被験体に投与することと、ｂ）上記投与の前に、ＲＳＶ由来のタンパク質若しくは糖タンパク質、好ましくはＲＳＶＦ糖タンパク質を含む更なるワクチン組成物を投与することとを含むか、又は任意の上記の請求項のワクチン組成物を、以前にＲＳＶ感染に曝された被験体に投与する、ＲＳＶに対して被験体を免疫化する方法に使用される、上記標的病原体がＲＳＶである、本明細書に記載されるワクチン組成物が提供される。

本明細書に記載されるペプチド配列、本明細書に記載されるペプチド配列をコードする核酸配列、及びかかる核酸配列を含むベクターが本発明によってまた更に提供される。ワクチン組成物の製造における本明細書に記載されるペプチド配列の使用が更に提供される。本明細書に記載されるワクチン組成物を投与することを含む、被験体にワクチン接種する方法も提供される。

本発明の更なる態様は、
模倣すべき標的ペプチドの複雑及び／又は不連続な構造配置を決定する工程と、
アミノ酸配列を有する予備模倣ペプチドを特定する工程と、
上記予備模倣ペプチドのアミノ酸配列の推定構造配置を、該配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析によって決定する工程と、
上記予備模倣ペプチドに対して指向性進化を行い、上記ペプチドの様々な変異体を生成する工程と（好ましくは、指向性進化は、変異体を生成する突然変異誘発及び該変異体の発現によって行われ得る）、
上記標的ペプチドに見られる所望の特性の改善を示す上記ペプチドの変異体を選択する工程と（上記特性は、例えば抗体等の標的に対する結合親和性；熱安定性；酵素に対する感受性又は耐性であり得る）、
を含む、標的ペプチド（好ましくは免疫原）の複雑及び／又は不連続な構造配置を模倣するペプチド（ここでも好ましくは免疫原）を設計する方法を提供する。

上記方法は、改善を有する上記変異体を複数特定する工程と、該複数の変異体から変異の組合せを有する更なるペプチドを得る工程とを更に含むことができる。変異体の更なる生成及び選択のために上記方法を更に繰り返してもよい。

予備模倣ペプチドを特定する工程は、所望の標的ペプチドに対して構造的類似性を有するペプチドをペプチドデータベースから選択することを含むことができ、又は上記工程は、上記予備模倣ペプチドが所望の標的ペプチドに対して構造的類似性を有するように、上記標的ペプチドのアミノ酸配列と１つ以上の構造ペプチド要素とを組み合わせることを含むことができる。

本明細書に記載されるＴｏｐｏＢｕｉｌｄｅｒ設計プロトコルを少なくとも部分的に参照する、記載の設計プロトコルが本明細書においてまた更に提供される。該設計プロトコルにおいては、理想的な二次構造要素の配置をパラメトリックにサンプリングした後、ループセグメント（例えばループ、シート、ヘリックス等の構造要素）によって連結し、構造モチーフの所望の立体配座を安定化し得るトポロジーをアセンブルする。次いで、これらのトポロジーを多様化し、フォールディング及び設計段階により構造多様性及び配列多様性を高める。これにより２つの設計目標を達成することが可能である：（１）そのネイティブ四次環境を模倣するエピトープを安定化する、安定したトポロジーをｄｅ ｎｏｖｏ構築すること；（２）トポロジーの二次構造配置を微調整して、フォールド安定性を最大化し、高親和性の抗体結合のためにエピトープ提示を最適化すること。

ここで、本発明のこれら及び他の態様を、以下の図面を参照して詳細に説明する。

３つの遠位エピトープに焦点化されたＲＳＶ中和抗体を誘発する合成免疫原のコンピューターによる設計の概念的概要を示す図である。（Ａ）部位０、ＩＩ及びＩＶを強調したプレフュージョンＲＳＶＦ構造（ＰＤＢ ４ＪＨＷ）。部位ＩＩの免疫原は、以前に報告されている（１１）。（Ｂ）コンピューターによるタンパク質設計戦略。アプローチ１：設計鋳型を部位０／ＩＶとの緩やかな構造的類似性に基づいてＰＤＢにおいて特定し、続いてｉｎ ｓｉｌｉｃｏフォールディング及び設計、並びに指向性進化による配列最適化を行った。アプローチ２：タンパク質トポロジーをモチーフの構造制約に合わせるためにモチーフ中心の設計のｄｅ ｎｏｖｏ設計アプローチを開発した。下：異なるアプローチによる設計された免疫原のコンピューターによるモデル。（Ｃ）３つの合成免疫原ナノ粒子のカクテル製剤は、３つの非重複エピトープに焦点化された中和抗体（ｎＡｂ）を誘発する。 ＲＳＶＦ合成免疫原のコンピューターによる鋳型設計及び生物物理学的特性評価を示す図である。（Ａ）タンパク質設計戦略。部位０及びＩＶと構造的類似性を有する鋳型をＰＤＢにおいて特定し、続いてｉｎ ｓｉｌｉｃｏフォールディング、設計及び指向性進化による最適化を行った。付加的なｉｎ ｓｉｌｉｃｏフォールディング及び設計工程が、指向性進化によって明らかとなった切断鋳型配列に部位０を導入するために必要であった。中間体及び最終設計（Ｓ０＿１．３９及びＳ４＿１．５）のコンピューターによるモデルを示す。（Ｂ）Ｓ０＿１．３９（上）及びＳ４＿１．５（下）の２０℃で測定されたＣＤスペクトルは、設計モデルの予想二次構造含量と一致する。（Ｃ）５ｍＭ ＴＣＥＰ還元剤の存在下、２０８ｎｍでＣＤによって測定された熱融解曲線。（Ｄ）標的抗体Ｄ２５（上）及び１０１Ｆ（下）に対するＳＰＲによって測定された結合親和性。ＣＤ＝円偏光二色性、Ｔ_ｍ＝融解温度。ＳＰＲ＝表面プラズモン共鳴。 エピトープ焦点化免疫原のモチーフ中心のｄｅ ｎｏｖｏ設計を示す図である。（Ａ）理想的な二次構造要素（ＳＳＥ）をＲＳＶＦエピトープの周囲にアセンブルし、同じトポロジー内の異なる配向をサンプリングし、続いてｉｎ ｓｉｌｉｃｏフォールディング及び設計を１回行った。更なる詳細については図１２を参照されたい。Ｒｏｓｅｔｔａ ａｂｉｎｉｔｉｏシミュレーションを各トポロジーについて行い、設計された構造へとフォールディングする傾向を評定し、フォールディング性スコアを返す。次いで、選択された設計を酵母表面上に提示させ、その後のディープシークエンシングのために２つの異なる選択圧下で選別する。（Ｂ）高選択圧及び低選択圧下での選別された集団のエンリッチメント分析。Ｄ２５及び５Ｃ４結合の両方について高度に富化された配列は、部位０スキャフォールドの極めて重要なコア位置に収束配列特徴を示す。（Ｃ）３つ全ての設計されたトポロジー変異を、高親和性結合及びキモトリプシンに対する耐性についてスクリーニングし、安定にフォールディングされたタンパク質を選択した。エンリッチメント分析により、プロテアーゼ消化に耐性があり、１０１Ｆに高親和性で結合する、設計されたヘリックス配向の１つ（Ｓ４＿２＿ｂｂ２）への強い選好性が明らかとなった（緑色）。（Ｄ）高い熱安定性を示す最良の設計（Ｓ０＿２．１２６、上及びＳ４＿２．４５、下）についてＣＤによって測定された熱融解曲線。（Ｅ）ＳＰＲによって測定されたＤ２５に対するＳ０＿２．１２６（上）及び１０１Ｆ抗体に対するＳ４＿２．４５の解離定数（Ｋ_Ｄ）。 ｄｅ ｎｏｖｏ設計された免疫原の構造特性評価を示す図である。（Ａ）１０１Ｆ Ｆａｂに結合したＳ４＿２．４５（橙色）の結晶構造は、設計モデル（灰色、ＲＭＳＤ＝１．５Å）と厳密に一致する。（Ｂ）Ｓ０＿２．１２６のＮＭＲ構造アンサンブル、Ｄ２５エピトープを紫色で強調する。ＮＭＲ構造は、設計モデルとよく一致している（２．８Åの骨格ＲＭＳＤ）。（Ｃ）Ｄ２５ Ｆａｂに結合したＳ０＿２．１２６（紫色）の結晶構造は、設計モデル（灰色、ＲＭＳＤ＝１．３Å）と非常によく似ている。（Ｄ）ネイティブｐｒｅＲＳＶＦ部位０／ＩＶ及び設計された免疫原の重合せは、エピトープのサブオングストローム（sub-angstrom）模倣を示す。設計されたスキャフォールドは、ｐｒｅＲＳＶＦの形状制約に適合する（表面表示）。（Ｅ）開始エピトープ構造（ｐｒｅＲＳＶＦ、部位ＩＶペプチド）と比較した、Ｄ２５（上）及び１０１Ｆ（下）と設計された免疫原との間の界面側鎖相互作用のクローズアップ図。 合成免疫原がマウス及びＮＨＰにおいて中和血清応答を誘発し、既存の免疫を部位０及びＩＩに焦点化することを示す図である。（Ａ～Ｃ）マウスにおけるＴｒｉｖａｘ２免疫化研究。（Ａ）単一免疫原又はＴｒｉｖａｘ２カクテルによる３回の免疫化後のｐｒｅＲＳＶＦ交差反応性血清レベル（５６日目）。（Ｂ）競合物としてＤ２５、モタビズマブ及び１０１Ｆ ＩｇＧを用いたＳＰＲ競合アッセイによって測定される、Ｔｒｉｖａｘ２で免疫化した５匹の代表的なマウスについて示される血清特異性は、全ての部位に対して一様に均衡の取れた応答を示す。（Ｃ）Ｔｒｉｖａｘ２成分を個別に及びカクテルとして用いて免疫化したマウスの５６日目のＲＳＶ中和力価。点線（ＩＣ_５０＝１００）は防御閾値を示す。（Ｄ～Ｋ）ＮＨＰにおけるＴｒｉｖａｘ１免疫化研究。（Ｄ）ＮＨＰ免疫化スキーム。（Ｅ）群１のｐｒｅＲＳＶＦ交差反応性血清レベル。（Ｆ）血清抗体は、ＳＰＲ競合アッセイによって測定されるように７匹全ての動物において３つ全ての抗原部位を標的とする。（Ｇ）群１のＲＳＶ中和力価。（Ｈ）群２（灰色）及び３（青色）におけるｐｒｅＲＳＶＦ力価。（Ｉ）群２及び３のＲＳＶ中和力価。（Ｊ）ＳＰＲ競合アッセイによって測定された部位特異的抗体レベル。部位０及び部位ＩＩ特異的力価は、Ｔｒｉｖａｘ１ブースティング後に２と比較して群３において有意に高かった（ｐ＜０．０５、マン－ホイットニーＵ検定）。（Ｋ）部位０、ＩＩ、ＩＶ特異的スキャフォールドを用いた９１日目の血清の枯渇後のＲＳＶ中和曲線。中和活性の６０％が群３において競合するが、対照群２においては有意な減少は観察されない。 機能モチーフの構造の複雑性の増大により、既知の構造に見られる設計可能な鋳型の数が決まることを示す図である。合計１７５３９個の構造を含むｎｒＰＤＢ３０データベースに対してＭＡＳＴＥＲ検索｛Zhou, 2015 ＃１４３１｝を行い、構造の複雑性が増大する異なる中和エピトープ（構造内で青色とする）についての一致数を照会した。データベースの修復率をｙ軸にプロットする。一致を１８０残基未満のタンパク質サイズについてフィルタリングした。縦線（橙色）は、特定された最初の１０個のスキャフォールドのＲＭＳＤカットオフを示す。モチーフの二次構造組成を以下によって表す：Ｅ － ストランド；Ｌ － ループ；Ｈ － ヘリックス；ｘ － 鎖切断。 Ｓ４＿１設計シリーズのコンピューターによる設計及び実験的最適化を示す図である。Ａ）Ｓ４＿１．１の鋳型特定及びコンピューターによる設計。ＲＳＶＦ抗原部位ＩＶは、ｐｒｅＲＳＶＦの小さな埋め込みドメインに位置する。この切除されたドメインは、Ｒｏｓｅｔｔａ ａｂｉｎｉｔｉｏ予測においてフォールディングファネルを示すことができず、大腸菌（E. coli）において組み換え発現させることができなかった。切除されたドメインを鋳型として使用することで、このトポロジーを、Ｒｏｓｅｔｔａ ＦｕｎＦｏｌＤｅｓを用いてフォールディング及び配列設計し、ａｂｉｎｉｔｉｏフォールディングシミュレーションにおいて強い漏斗状のエネルギー地形を示す設計Ｓ４＿１．１を得た。Ｂ）飽和突然変異誘発によるＳ４＿１．１の実験的最適化。飽和突然変異誘発ライブラリーを、一度に１つが縮重コドン「ＮＮＫ」によってコードされる２０個のアミノ酸のいずれかに突然変異することを可能として、部位ＩＶエピトープの近位にある１１個の位置についてオーバーハングＰＣＲを用いて構築した。ライブラリー（サイズ １１個の位置×３２個のコドン＝３５２）を酵母にて形質転換し、設計を細胞表面に提示させた。細胞を１２５ｎＭの１０１Ｆ抗体で標識することによって選択を行った。次いで、１０１Ｆ抗体に高親和性で結合する上位１％のクローンを、示されるように下位９９％とともに選別した。２つの集団の次世代シークエンシング後に、エンリッチメント値を各配列変異体について計算した。Ｃ）網羅的突然変異スキャニングデータのバイオインフォマティクス分析。ｌｏｇ（エンリッチメント）を各配列変異体についてヒートマップとして示す。白色は欠測データを示す。他の位置について見られる他のあまり顕著でないエンリッチメントとともに、位置２０がアルギニン及びリジンについて最も高いエンリッチメントを示した。 Ｓ４＿１設計シリーズの実験的特性評価を示す図である。Ａ）上：１０１Ｆ抗体に対するコンピューターによる初期設計Ｓ４＿１．１についての表面プラズモン共鳴測定により、８５μＭ超の解離定数が明らかとなった。中央：低い親和性にもかかわらず、Ｒ２９Ｓ突然変異体により、対象のエピトープへの結合が特異的であることが明らかとなった。下：Ｓ４＿１．１の円偏光二色性スペクトル。Ｂ）上：網羅的突然変異スキャニングスクリーンにおいて特定されたＳ４＿１．１の単一及び複合突然変異の解離定数。Ｋ２０／Ｅ２４二重突然変異体（Ｓ４＿１．５と命名した）は、３５ｎＭの結合親和性を示した（中央）。下：Ｓ４＿１．５の円偏光二色性スペクトル。 Ｓ０＿１設計シリーズのコンピューターによる設計及び実験的最適化を示す図である。Ａ）鋳型特定及び設計。ＭＡＳＴＥＲを用いて、抗原部位０を提示し、安定化する設計鋳型となる設計ヘリックスリピートタンパク質（ＰＤＢ ＩＤ：５ＣＷＪ）を特定した（詳細については方法を参照されたい）。Ｄ２５抗体との衝突を回避するためにＮ末端の２９残基を切断し、Ｒｏｓｅｔｔａ ＦｕｎＦｏｌＤｅｓを用いてＳ０＿１．１を設計した。設計プロセスの詳細については方法を参照されたい。Ｂ）Ｓ０＿１．１をベースとして、コンビナトリアル配列ライブラリーを構築し、酵母表面ディスプレイを用いてスクリーニングした。高親和性結合クローンの３回連続の選別後に、個々のコロニーをシークエンシングした。位置１００の終止コドンへの突然変異がよく見られ、発現収率が増大した切断変異体が生じた。Ｃ）切断変異体のモデルを２回目のｉｎ ｓｉｌｉｃｏフォールディング及び設計の鋳型とした。鋳型のＮ末端の１４残基を更に切断し、残基１及び４３の間にジスルフィド結合を導入し、Ｓ０＿１．３９を得た。設計選択プロセスの全詳細については方法を参照されたい。 Ｓ０＿１設計シリーズの生物物理学的特性評価を示す図である。上：円偏光二色性スペクトル。中央：Ｄ２５及び５Ｃ４に対する表面プラズモン共鳴測定。下：サイズ排除クロマトグラフィーと組み合わせた多角度光散乱。Ａ）Ｓ０＿１．１は、１．４μＭのＫＤでＤ２５に結合し、５Ｃ４への結合は検出可能でなかった。結合相互作用がエピトープに対して特異的であることを検証するために、ノックアウト突然変異体（Ｎ３０Ｙ）を生成し、結合相互作用がないことを観察した。Ｂ）Ｓ０＿１．１７は、Ｄ２５に対して２７０ｎＭのＫＤを示し、５Ｃ４への結合を示さなかった。Ｃ）Ｓ０＿１．３９は、５ｎＭのＫＤで５ Ｄ２４及び５Ｃ４に結合する。全ての設計がヘリックスタンパク質に典型的なＣＤスペクトルを示し、溶液中でモノマーとして挙動した（上列及び下列）。 プレフュージョンＲＳＶＦと比較した、コンピューターにより設計された免疫原の形状模倣を示す図である。Ａ）プレフュージョンＲＳＶＦ（ＰＤＢ ４ＪＨＷ）に重ね合わせ、表面表示（灰色）で示される、設計された免疫原（Ｓ２＿１．２、Ｓ０＿２．１２６、Ｓ４＿２．４５）。（Ｂ，Ｃ）表面表示で示されるＳ０＿１．３９及びＳ４＿１．５とＲＳＶＦとのクローズアップ図。Ｓ０＿１．３９設計に使用される設計鋳型は、ネイティブ環境（ｐｒｅＲＳＶＦ）における部位０エピトープの形状制約に違反する。部位０は、ｐｒｅＲＳＶＦにおいては抗体結合に自由にアクセス可能であるが、Ｓ０＿１．３９のＣ末端ヘリックスは、そのアクセス可能性を制約する（濃い灰色の表面）。（Ｄ）以前に設計された部位ＩＩ抗原に使用される設計鋳型は、部位ＩＩの四次環境を遵守した。（Ｅ，Ｆ）エピトープの形状制約を遵守し、自然発生設計鋳型と比較してエピトープ安定化を改善するためにｄｅ ｎｏｖｏ鋳型を構築した。 理想的なＳＳＥ及び対象のモチーフをアセンブルするコンピューターによるｄｅ ｎｏｖｏ方法を示す図である。 部位ＩＶ免疫原のｄｅ ｎｏｖｏ骨格アセンブリを示す図である。部位ＩＶエピトープを、ｄｅ ｎｏｖｏ構築された３つの逆平行βストランド及びこのβシートに対して様々な配向でのヘリックスパッキングによって安定化した（ｂｂ１～ｂｂ３）。各骨格を、設計モデルに近い低エネルギー状態へとフォールディングされる能力についてＲｏｓｅｔｔａ ａｂｉｎｉｔｉｏシミュレーションにおいてシミュレートし、Ｓ４＿２＿ｂｂ２及びｂｂ３が、設計されたフォールドへとフォールディングする傾向がより強いことが示された。 ｄｅ ｎｏｖｏ部位ＩＶ設計の生物物理学的特性評価を示す図である。酵母ディスプレイ選択アッセイにおいてプロテアーゼ耐性及び１０１Ｆへの結合について富化されたＳ４＿２設計シリーズの１３個の設計について円偏光二色性スペクトル及び１０１Ｆに対するＳＰＲセンサーグラムを示す。 Ｓ４＿２．４５（Ａ，Ｃ，Ｅ）及びＳ０＿２．１２６（Ｂ，Ｄ，Ｆ）の生物物理学的特性評価を示す図である。Ａ，Ｂ：Ｓ４＿２．４５及びＳ０＿２．１２６は、ＳＥＣ－ＭＡＬＳプロファイルによって示されるように溶液中で単量体である。Ｃ，Ｄ：２５℃での円偏光二色性スペクトル。Ｅ，Ｆ：Ｓ４＿２．４５（Ｅ）及びＳ０＿２．１２６（Ｆ）についての１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルの２Ｄ ＮＭＲは、よく分散し、設計が溶液中で良好にフォールディングされることが確認された。 部位０を安定化するためのｄｅ ｎｏｖｏトポロジーアセンブリを示す図である。部位０エピトープを支持するために３つのカスタマイズされたヘリックス配向をアセンブルし（Ｓ０＿２＿ｂｂ１～ｂｂ３）、設計されたトポロジーへとフォールディングする能力についてＲｏｓｅｔｔａ ａｂｉｎｉｔｉｏシミュレーションにおいて評価した。Ｓ０＿２＿ｂｂ３が漏斗状のエネルギー地形を示し、その後の配列設計に選択した。 （Ａ）ｄｅ ｎｏｖｏ部位０スキャフォールドのＤ２５及び５Ｃ４結合についての結合親和性測定。酵母ディスプレイ選択後に首尾よく発現及び精製された、富化された設計のＳＰＲセンサーグラム。（Ｂ）実験的に特性評価された配列の配列アラインメント。 部位特異的ヒト中和抗体のパネル及びヒト血清に対する設計された免疫原の結合親和性を示す図である。Ａ）プレフュージョンＲＳＶＦ（青色）と比較した、様々な部位特異的中和抗体のパネルに対するＳ０＿１．３９（灰色）及びＳ０＿２．１２６（黒色）の結合親和性（ＫＤ、Ｆａｂを分析物として流すＳＰＲによって決定される）。部位０について示す抗体は５Ｃ４、Ｄ２５（１）、ＡＤＩ－１４４９６、ＡＤＩ－１８９１６、ＡＤＩ－１５６０２、ＡＤＩ－１８９００及びＡＤＩ－１９００９（２）である。部位ＩＶについては、結合親和性を１０１Ｆ（３）、ＡＤＩ－１５６００（２）、１７Ｅ１０、６Ｆ１８及び２Ｎ６（４）に対して試験し、Ｓ４＿１．５（灰色）及びＳ４＿２．４５（黒色）をプレフュージョンＲＳＶＦと比較した。第１世代及びプレフュージョンＲＳＶＦと比較してより高い第２世代設計（Ｓ０＿２．１２６及びＳ４＿２．４５）の結合親和性は、設計された免疫原におけるそれぞれの抗原部位の大幅に改善されたネイティブに近いエピトープ模倣を示す。Ｂ）プレフュージョンＲＳＶＦに対して血清陽性の５０人の健常なヒト成人から得られた血清との設計された免疫原のＥＬＩＳＡ反応性。Ｓ０＿２．１２６及びＳ４＿２．４５の両方が、第１世代設計と比較して有意に増大した反応性を示し、血清レベルでのエピトープ模倣の改善が確認された（^＊ｐ＜０．０５及び^＊＊ｐ＜０．０１、ウィルコクソン検定）。 天然タンパク質に対するＳ０＿２．１２６ Ｒｏｓｅｔｔａスコアの比較を示す図である。Ｓ０＿２．１２６と同じサイズ範囲（５７±５残基）のタンパク質構造をＣＡＴＨデータベースからダウンロードし、７０％の配列相同性によってフィルタリングし、Ｓ０＿２．１２６と同様のサイズの天然タンパク質の代表的なデータベースを得た（ｎ＝１０１３個の構造）。次いで、タンパク質を最小化し、Ｒｏｓｅｔｔａによってスコアリングして、それらの回転半径、タンパク質内空洞（cavities：キャビティ）（空洞）及びコアパッキング（ｐａｃｋｓｔａｔ）を計算した。１０１３個の天然タンパク質におけるこれらのスコア項目の分布をプロットし（青色のヒストグラム）、Ｓ０＿２．１２６についての同じスコアを橙色で示す。Ｓ０＿２．１２６のＮＭＲ構造を（Ａ）に示し、Ｓ０＿２．１２６のコンピューターによるモデルを（Ｂ）に示し、Ｓ０＿２．１２６が、同様の回転半径にもかかわらず、同様のサイズの天然タンパク質と比較して相当の空洞容積及び非常に低いコアパッキングを示すことが示される。 ＲＳＶＦ三量体と複合した部位特異的抗体の電子顕微鏡分析を示す図である。（Ａ）リガンド非結合ＲＳＶＦ（黒色の線）、並びに１０１Ｆ（緑色の線）、Ｄ２５（青色の線）、Ｍｏｔａ（紫色の線）及び３つ全ての（１０１Ｆ、Ｄ２５、Ｍｏｔａ － 赤色の線）Ｆａｂと複合したＲＳＶＦの重ね合わせたサイズ排除プロファイル。（Ｂ～Ｆ）リガンド非結合ＲＳＶＦ三量体（Ｂ）及び１０１Ｆ（Ｃ）、Ｄ２５（Ｄ）、Ｍｏｔａ（Ｅ）又は３つ全ての（１０１Ｆ、Ｄ２５、Ｍｏｔａ（Ｆ））Ｆａｂと複合したＲＳＶＦの代表的な参照なし２Ｄクラス平均。Ｆａｂに結合した完全飽和ＲＳＶＦ三量体、及び準化学量論的なクラスが観察される。（Ｇ）左パネル：３コピーの１０１Ｆ、Ｄ２５及びＭｏｔａ Ｆａｂが明らかに結合したＲＳＶＦ三量体の参照なし２Ｄクラス平均。右パネル：個々のＦａｂとのＲＳＶＦの既存の構造（ＰＤＢ ＩＤ ４ＪＨＷ、３ＱＷＯ及び３Ｏ４５）に基づく１０１Ｆ、Ｄ２５及びＭｏｔａ Ｆａｂが結合したＲＳＶＦ三量体の予測構造。１０１Ｆ、Ｄ２５及びＭｏｔａと複合したＲＳＶＦの予測構造を用いて、Ｃｒｙｏｓｐａｒｃ２において２Ｄクラス平均をシミュレートし、３つ全てのタイプのＦａｂによりシミュレートされた２Ｄクラス平均を中央のパネルに示す。Ｆａｂには以下のように色を付ける：赤色 － １０１Ｆ；青色 － Ｍｏｔａ；緑色 － Ｄ２５。スケールバー － １００Å。 Ｔｒｉｖａｘ１ ＲＳＶＮナノ粒子の組成及びＥＭ分析を示す図である。Ａ）Ｔｒｉｖａｘ１は、環状構造を有する自己集合ＲＳＶＮナノ粒子に融合した等モル量の部位ＩＩ、０及びＩＶエピトープ焦点化免疫原を含む（ｎ＝１０又は１１個のサブユニット）。部位ＩＩ－ＲＳＶＮナノ粒子は、以前に記載されている（５）。ナノ粒子－免疫原融合タンパク質のコンピューターによるモデルを示す。Ｂ，Ｃ）Ｓ０＿１．３９－ＲＳＶＮ及びＳ４＿１．５－ＲＳＶＮナノ粒子のネガティブ染色電子顕微鏡法により、設計された免疫原の融合時に環状構造が維持されることが確認される。 Ｔｒｉｖａｘ２フェリチンナノ粒子のＥＭ分析を示す図である。Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ）フェリチンナノ粒子に融合したＳ０＿２．１２６及びＳ４＿２．４５のネガティブ染色電子顕微鏡法（Ａ，Ｄ）及び３Ｄ再構築（Ｂ，Ｅ）。Ｃ）Ｓ０＿２．１２６が首尾よく多量体化されており、抗体結合部位がアクセス可能であることを示す、Ｓ０＿２．１２６モノマー（赤色）と比較した、５Ｃ４抗体へのＳ０＿２．１２６ナノ粒子の結合親和性（青色）。Ｆ）スキャフォールドが多量体化され、エピトープが抗体結合にアクセス可能であることを示す、単量体Ｓ４＿２．４５（赤色）と比較した、フェリチンナノ粒子上で多量体化した場合の１０１Ｆ抗体へのＳ４＿２．４５の結合（青色）。 Ｔｒｉｖａｘ１を用いたマウス免疫化研究を示す図である。Ａ）個別に、２つのカクテルとして、また３つのカクテル（Ｔｒｉｖａｘ１）として配合したエピトープ焦点化免疫原のＲＳＶＦ交差反応性。Ｂ）設計された免疫原及びその組合せで免疫化したマウスのＲＳＶ中和血清力価。 独立研究所によるＮＨＰ中和力価の確認を示す図である。指定の時点からの血清が、Ｖｅｒｏ－１１８細胞株及びＧＦＰ読出しを用いる異なるＲＳＶ中和アッセイにおいてＲＳＶ中和について独立研究所によって試験された。方法の詳細については（６）を参照されたい。 設計された免疫原とのＮＨＰ血清反応性を示す図である。Ａ）異なる時点で測定されたＮＨＰ群１（Ｔｒｉｖａｘ１で免疫化）のＥＬＩＳＡ力価。全ての動物が９１日目にＴｒｉｖａｘ１免疫原に対して応答し、部位ＩＶ免疫原の反応性は、部位０及び部位ＩＩの反応性と比較して低かった。Ｂ）ＮＨＰ群２（灰色、ＲＳＶＦプライム）及び３（青色、ＲＳＶＦプライム、Ｔｒｉｖａｘ１ブースト）のＥＬＩＳＡ力価（免疫化スケジュールについては図５を参照されたい）。プライミング免疫化後に、全ての動物が設計された免疫原との検出可能な交差反応性を発現し、設計されたスキャフォールドがＲＳＶＦによってプライミングされた関連抗体を認識することが示された。

図６～図２５の説明文のみについての参照文献：
1. J. S. McLellan et al., Structure of RSV fusion glycoprotein trimer bound to a prefusion specific neutralizing antibody. Science 340, 1113-1117 (2013).
2. M. S. Gilman et al., Rapid profiling of RSV antibody repertoires from the memory B cells of naturally infected adult donors. Sci Immunol 1, (2016).
3. J. S. McLellan et al., Structure of a major antigenic site on the respiratory syncytial virus fusion glycoprotein in complex with neutralizing antibody 101F. J Virol 84, 12236-12244 (2010).
4. J. J. Mousa et al., Human antibody recognition of antigenic site IV on Pneumovirus fusion proteins. PLoS Pathog 14, e1006837 (2018).
5. F. Sesterhenn et al., Boosting subdominant neutralizing antibody responses with a computationally designed epitope-focused immunogen. PLoS Biol 17, e3000164 (2019).
6. E. Olmedillas et al., Chimeric Pneumoviridae fusion proteins as immunogens to induce cross-neutralizing antibody responses. EMBO Mol Med 10, 175-187 (2018).

構造的に複雑なエピトープを有する免疫原のｄｅ ｎｏｖｏ設計
構造的に複雑な機能部位を有するタンパク質の設計は、コンピューターによるタンパク質設計の分野で依然として殆ど対処されていない課題である。本発明者らは、特に構造的によく研究されているＲＳＶ中和エピトープの正確な模倣体を設計し、免疫化研究においてそれらの機能性を評価しようとした。抗原部位０及びＩＶ（図１）を選択したが、これらはどちらも強力なｎＡｂの標的となり、以前にコンピューターによるタンパク質設計アルゴリズムによって扱われていた機能モチーフとは構造的に異なる。抗原部位０は、１７残基のキンク（kinked）αヘリックス及び７残基の無秩序ループからなる構造的に複雑かつ不連続なエピトープを提示し、ｎＡｂ Ｄ２５及び５Ｃ４の標的となるが（１２，１４）、部位ＩＶは、不規則な６残基のバルジ（bulged）βストランドを提示し、ｎＡｂ １０１Ｆの標的となる（１３）。

構造モチーフを模倣するタンパク質のコンピューターによる設計は、これまで、自然発生構造に由来する又はｄｅ ｎｏｖｏ構築された適合するタンパク質スキャフォールドを初めに特定し、これを次いでモチーフをグラフトするための設計鋳型とすることによって行われていた（５，６，８，１５，１６）。部位０及びＩＶの構造の複雑性を考えると、このアプローチでは、緩い構造基準とでも、いかなる有望な一致も得られなかった（図６）。

このため、部位ＩＶについては、本発明者らは、エピトープを含む免疫グロブリンフォールドに類似した小さな構造ドメインをｐｒｅＲＳＶＦ構造から切除することができることに気付き、これがその歪んだネイティブエピトープ構造を維持する保守的アプローチであると仮定した（図７）。切除されたドメインは、Ｒｏｓｅｔｔａ ａｂｉｎｉｔｉｏシミュレーションにおいてフォールディングファネルを示さず、大腸菌において発現させることができなかったため、Ｒｏｓｅｔｔａ ＦｕｎＦｏｌＤｅｓ（１７）を用いたｉｎ ｓｉｌｉｃｏフォールディング及び設計を行い、安定性及びエピトープ模倣性について配列を最適化した（図２ａ）。部位ＩＶについて最良のコンピューターによる設計（Ｓ４＿１．１）は、８５μＭ超のＫ_Ｄで１０１Ｆ標的抗体に結合した。結合親和性を改善するために、選択位置について網羅的突然変異スキャニングライブラリーを生成し、より高親和性のクローンを選別し、次世代シークエンシングを用いて、高親和性結合について富化された位置及びアミノ酸を特定した（図７）。組み換え発現させたタンパク質において富化された位置の組合せを抗体結合について試験し、３５ｎＭのＫ_Ｄで標的抗体に結合し、設計された二次構造含量に対応する円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示し、６５℃まで熱安定性である二重突然変異体（Ｓ４＿１．５）を得た（図２ｂ～図２ｄ及び図８）。

部位０の不連続な構造は、ドメイン切除及び安定化アプローチに適していなかった。エピトープのヘリックスセグメントを模倣し、同時にループセグメントにグラフトすることができる鋳型構造を検索し、設計されたヘリックスリピートタンパク質を設計鋳型として選択した（ＰＤＢ ５ｃｗｊ）（図２ａ及び図９）（１８）。標的抗体Ｄ２５との衝突を回避するために、５ｃｗｊ鋳型のＮ末端２９残基を切断し、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏフォールディング及び設計シミュレーションを行い、部位０エピトープの提示を可能にする局所的及び大域的な変更をスキャフォールドに対して行った（図２ａ）。試験した９つの配列のうち、２つが大腸菌において首尾よく発現され、溶液中でモノマーとして挙動した（図１０）。Ｓ０＿１．１と命名された最良の設計は、標的親和性よりも４桁低い１．４μＭのＫ_ＤでＤ２５標的抗体に結合した（図１０）（１９）。酵母ディスプレイを用いた複数回の指向性進化後に、富化され、大幅に増大した発現収率を示し、Ｄ２５に対する親和性が約５倍増大した、Ｃ末端が２９残基切断された配列（Ｓ０＿１．１７）を発見した（図９及び図１０）。この切断された構造をｉｎ ｓｉｌｉｃｏフォールディング及び設計の新たな鋳型として使用した。最終的に、この多段階プロセスにより、更に１３残基切断され、Ｄ２５に５ｎＭで結合した設計であるＳ０＿１．３９が得られた（図２ｄ）。Ｓ０＿１．３９は、５Ｃ４抗体とも結合し（図１０）、５Ｃ４－ｐｒｅＲＳＶＦ相互作用と同一の５ｎＭの親和性で部位０と異なる配向から係合することが示された（１９）。

抗体結合に適した立体配座での不規則かつ複雑な結合モチーフの安定化という点で設計の主要目的が達成されたが、全体的戦略では、その一般的有用性に関して重大な限界が示された。設計鋳型として多数の構造を利用可能であるにもかかわらず、機能性タンパク質の設計に実際に有用なものの数は、モチーフの構造の複雑性とともに極端に限られてくる。上記のように、最適以下の設計鋳型は、高親和性結合を有する配列が特定されるまで設計プロセスに対する広範な骨格柔軟性及び複数回の指向性進化を必要とする。さらに、開始トポロジーが設計されたタンパク質の全体形状を決定するが、これはモチーフの正確な安定化について最適以下である可能性があり、設計された機能を妨げる望ましくない三次立体障害に対抗する可能性がある。特に、免疫原の設計については、病原体が提示するタンパク質と交差反応し得る機能的抗体の誘導を最大化するために、エピトープのネイティブ様アクセス可能性を維持することが有利である。鋳型ベースの設計アプローチがどのようにこれらの基準を満たさない可能性があるかについての実例は、ｐｒｅＲＳＶＦ及びＳ０＿１．３９における部位０エピトープの四次環境の比較であり、このトポロジーが、幾つかのモノクローナル抗体の結合を可能にはするが、かかる環境を模倣しないことが示される（図１１）。

これらの限界を克服するために、複雑な機能モチーフを安定化するためにオーダーメードのトポロジーを生成する、鋳型なしの設計プロトコルであるＴｏｐｏＢｕｉｌｄｅｒを開発した。ＴｏｐｏＢｕｉｌｄｅｒにおいては、理想的な二次構造要素の配置をパラメトリックにサンプリングし、これを次いでループセグメントによって連結し、構造モチーフの所望の立体配座を安定化することができるトポロジーをアセンブルする。次いで、これらのトポロジーを多様化し、Ｒｏｓｅｔｔａ ＦｕｎＦｏｌｄＤｅｓを用いたフォールディング及び設計段階により構造多様性及び配列多様性を高める（全詳細については図１２及び方法を参照されたい）。このアプローチについては、利用可能な構造鋳型を用いる本発明者らの以前の設計では満たされなかった２つの新たな設計目標を定義した：（１）そのネイティブ四次環境を模倣するエピトープを安定化する、安定したトポロジーをｄｅ ｎｏｖｏ構築すること；（２）トポロジーの二次構造配置を微調整して、フォールド安定性を最大化し、高親和性の抗体結合のためにエピトープ提示を最適化すること。

抗原部位ＩＶを提示するために、Ｓ４＿２フォールドと称される、４本の逆平行鎖及び１つのヘリックスを有するβシートから構成されるフォールドを設計した（図３ａ）。Ｓ４＿２トポロジーにおいて、３つの異なるヘリックス二次構造要素をパラメトリックにサンプリングし、配向及び長さを変化させ、βシートに対するパッキング相互作用を最大化することによって３つの異なる構造変異体（Ｓ４＿２＿ｂｂ１～３）を生成した。３つの構造変異体のうち２つ（Ｓ４＿２＿ｂｂ２及びＳ４＿２＿ｂｂ３）から生成した配列は、Ｒｏｓｅｔｔａ ａｂｉｎｉｔｉｏシミュレーションにおいて設計された構造を回復する強い傾向を示した（図３ａ及び図１３）。

コンピューターにより設計された配列の規定のセットを、酵母ディスプレイを用いてスクリーニングし、１０１Ｆへの結合、及び部分的にフォールディングされていないタンパク質を消化する効果的な方法である非特異的プロテアーゼキモトリプシンに対する耐性という２つの選択圧をかけた（５，２０，２１）。異なる条件下で選別された集団のディープシークエンシングから、Ｓ４＿２＿ｂｂ２ベースの設計が、フォールディング及び１０１Ｆ結合について厳しい選択条件下で強く富化されることが明らかとなり、設計鋳型における微妙なトポロジー差異が機能及び安定性に対して大きな影響を与える可能性があることが示された。１５個のＳ４＿２＿ｂｂ２設計変異体を発現させ、１４個を首尾よく精製し、生化学的特性評価した。この設計は、α／β ＣＤスペクトルの混合を示し、１ｎＭ～１μＭの範囲の親和性で１０１Ｆに結合した（図１４）。最良の変異体であるＳ４＿２．４５（Ｋ_Ｄ＝１ｎＭ）は、よくフォールディングされ、ＣＤ及びＮＭＲによると７５℃のＴ_ｍで熱安定性であった（図３ｄ及び図２０）。

同様に、部位０エピトープの三次構造を提示する最小ｄｅ ｎｏｖｏトポロジーを構築した。このトポロジーの選択は、部位０のアクセス可能性をトポロジー的に制約したＳ０＿３９天然鋳型とは対照的に、部位０が、そのネイティブ環境のｐｒｅＲＳＶＦにおいて様々な角度から抗体結合にアクセス可能であるということ（１４）によって動機付けられた（図１１）。鋳型をｄｅ ｎｏｖｏ構築することによって、ネイティブ四次制約を模倣し、部位０特異的モノクローナル抗体に対する結合親和性を改善しようと試みた。

ｐｒｅＲＳＶＦの形状制約においてトポロジー空間を検証し、両方のエピトープセグメントを支持する３つの異なるヘリックス配向を構築した。Ｒｏｓｅｔｔａ ａｂｉｎｉｔｉｏによる設計された配列の評価から、３つのトポロジーのうち１つ（Ｓ０＿２＿ｂｂ３）をベースとして生成した配列のみが漏斗状のエネルギー地形を示すことが示された（図１６）。Ｓ０＿２＿ｂｂ３をベースとするコンピューターにより設計された配列のセットを、酵母において２つの部位０特異的抗体（Ｄ２５及び５Ｃ４）の選択圧下でスクリーニングし、エピトープの完全性を確実にした。二重富化クローンのディープシークエンシング及びその後の配列分析から、２８位のバリンが、２つのエピトープセグメント間に形成される空洞を保持し、両方の抗体への結合を確実にするのに不可欠であることが明らかとなった（図３ｂ）。

更なる生化学的特性評価のために３個～２１個の位置が異なる５つの配列を選択した（図１７）。最良の溶液挙動を有する設計（Ｓ０＿０２．１２６）は、殆どヘリックスのタンパク質のＣＤスペクトルを示し、還元条件下であっても極めて高い熱安定性（Ｔ_ｍ＝８１℃、図３ｄ）及びよく分散したＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトル（図１５）を有していた。驚くべきことに、Ｓ０＿０２．１２６は、ｐｒｅＲＳＶＦ－Ｄ２５相互作用（１５０ｐＭ）と同様の約５０ｐＭの親和性でＤ２５に結合し、Ｋ_Ｄ＝４ｎＭで５Ｃ４に結合した（図３ｅ及び図１８）。

全体として、ＴｏｐｏＢｕｉｌｄｅｒを用いたトポロジーアセンブリによって生成した設計の特性は、利用可能な構造鋳型を用いたものと比較して結合親和性及び熱安定性の改善を示した。この設計及びスクリーニング手順によって、提示されるウイルスエピトープをより良好に模倣するスキャフォールドが得られたか、又はむしろ選択時に使用される抗体に対して高度に最適化されたインターフェースを有する配列が明らかになったかを調査するために、部位特異的抗体のパネルに対するＳ４＿２．４５及びＳ０＿２．１２６の親和性を決定した。Ｓ４＿２．４５及びＳ０＿２．１２６は、第１世代の設計と比較して、様々な部位特異的抗体のパネルに対して大きな親和性の改善を示し、ｐｒｅＲＳＶＦに対する抗体と非常によく似た幾何平均親和性を示した（図１８）。かかる結果を踏まえて、トポロジー的に設計された免疫原が、鋳型ベースの設計と比較して改善された部位ＩＶ及び０の模倣体であると結論付けた。

ｄｅ ｎｏｖｏ設計されたトポロジーは、予測された構造を採用する
コンピューターによる設計アプローチの構造精度を評価するために、１０１Ｆと複合したＳ４＿２．４５の結晶構造を２．６Åの分解能で解明した。この構造は、本発明者らの設計モデルと１．５Åの全原子ＲＭＳＤで厳密に一致した。エピトープは、０．１３５ÅのＲＭＳＤで模倣され、１０１Ｆとの本質的相互作用を全て保持した（図４ａ）。重要なことには、構造データから、多くのタンパク質間相互作用に見られる共通モチーフである（２２）、不規則なβストランドが完全にｄｅ ｎｏｖｏ設計されたタンパク質においてサブオングストローム精度で提示されることが確認された。

次に、Ｓ０＿２．１２６の非結合構造をＮＭＲによって解明することで、設計されたフォールドの精度を確認し、平均構造とモデルとの骨格ＲＭＳＤは２．８Åであった（図４ｂ）。さらに、Ｄ２５に結合したＳ０＿２．１２６の結晶構造を３．０Åの分解能で解明した。この構造は、設計モデルに対する１．５Åの全ＲＭＳＤ及びプレフュージョンＲＳＶＦと比較して不連続エピトープ全体で０．９ÅのＲＭＳＤを示した（図４ｃ及び図４ｄ）。本発明者らの知る限りでは、これが原子レベルの精度で２つのセグメントの構造的に不規則な結合モチーフを提示する、初めてのコンピューターによりｄｅ ｎｏｖｏ設計されたタンパク質である。Ｓ０＿２．１２６は、ネイティブタンパク質と比較して、大きなコア空洞のために並外れて低いパッキングを示したが（図１９）、非常に高い熱安定性を保持していた。コア空洞は、抗体結合に不可欠であったため、構造的に困難なモチーフを受け入れ、機能に必要とされる空洞を保存する低分子タンパク質を設計するｄｅ ｎｏｖｏアプローチの可能性が強調される（２）。注目すべきは、ＴｏｐｏＢｕｉｌｄｅｒの制御及び正確さのレベルのために、設計された抗原はどちらも、機能的抗体の誘発の改善に重要であり得る構造的特徴である、それらのネイティブ環境のｐｒｅＲＳＶＦにおけるそれぞれのエピトープの形状制約を遵守した（図１１）。

設計された免疫原のカクテルは、ｉｎ ｖｉｖｏで中和抗体を誘発する
最後に、設計された抗原が抗体応答をｉｎ ｖｉｖｏで誘発する能力について評価しようとした。部位０、ＩＩ及びＩＶ免疫原をカクテル製剤中で組み合わせる本発明者らの論理的根拠は、電子顕微鏡分析によって検証されるように３つ全ての部位が重複しないため（図２０）、より広範な抗体応答をｉｎ ｖｉｖｏで誘導し得ることである。免疫原性を増大させるために、各免疫原を自己集合タンパク質ナノ粒子上で多量体化した。１０個又は１１個のサブユニットを有する自己集合環状構造であり、部位ＩＩ免疫原の効果的な担体であることが以前に示されている（２３）、ＲＳＶ核タンパク質（ＲＳＶＮ）を選び、等モル量のＳ０＿１．３９、Ｓ４＿１．０５及びＳ２＿１．２免疫原ナノ粒子を含有する三価免疫原カクテル（「Ｔｒｉｖａｘ１」、図２１）を配合した。ＲＳＶＮへのＳ０＿２．１２６及びＳ４＿２．４５の融合により、難溶性のナノ粒子が得られたため、フェリチン粒子を５０％の占有率（約１２コピー）で多量体化に使用し、Ｓ２＿１．２がＲＳＶＮに含まれ、残りの免疫原がフェリチンに含まれる第２のカクテル（「Ｔｒｉｖａｘ２」、図２２）を作製した。

Ｔｒｉｖａｘ１は、マウスにおいて低レベルのＲＳＶＦ交差反応性抗体を誘発し、血清は、殆どの動物においてＲＳＶ中和活性を示さなかった（図２３）。対照的に、Ｔｒｉｖａｘ２は、強いレベルのＲＳＶＦ交差反応性血清レベルを誘導し、応答は３つ全てのエピトープに対して均衡が取れていた（図５ａ、図５ｂ）。驚くべきことに、Ｔｒｉｖａｘ２免疫化は、１０匹のうち６匹のマウスにおいて防御閾値を超えるＲＳＶ中和活性を生じた（図５ｃ）。注目すべきことに、これらの結果から、ウイルス中和エピトープを模倣するｄｅ ｎｏｖｏ設計されたタンパク質から構成されるワクチン候補が、複数の特異性を標的とする強い抗体応答をｉｎ ｖｉｖｏで誘導し得ることが示される。このことは、マウスが従来、スキャフォールドベースの設計アプローチによって中和抗体を誘導することが困難なモデルであったことを考えると、重要な発見である（１１，１５）。

並行して、ＮＨＰにおける三価免疫原カクテルの可能性を試験しようとした。以前に設計された部位ＩＩ免疫原は、ＮＨＰにおいて有望であったが、誘導された中和力価は低く、動物間で一貫性がなく、４匹のうち２匹の動物において中和抗体を誘発するために最大５回の免疫化が必要であった（１１）。図５ｄに詳述するように７匹のＲＳＶナイーブＮＨＰをＴｒｉｖａｘ１で免疫化した。マウスとは対照的に、ＮＨＰは、全ての動物において強いレベルのＲＳＶＦ交差反応性血清力価を発現し（図５ｅ）、誘導された抗体は、３つ全てのエピトープに対して指向された（図５ｆ）。驚くべきことに、７匹のうち６匹のＮＨＰが、単回のブースティング免疫化後に防御閾値を超えるＲＳＶ中和血清レベルを示す（平均ＩＣ_５０＝３１２）ことが見出された（図５ｇ）。中和力価は、８４日目に最大となり（ＩＣ_５０中央値＝４０８）、防御閾値の４倍であり（１９）、測定値は独立研究所によって確認された（図２４）。

ナイーブ動物における免疫化研究は、設計された免疫原を試験するのに重要であるが、ＲＳＶ、インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス等の標的病原体に対するワクチン開発の最重要の課題は、より高品質であり、長期防御を媒介する可能性がある規定の中和エピトープに対して広範な特異性の既存の免疫を焦点化するか又は作り変えることである（２３）。広範な特異性の血清応答を模倣するために、１３匹のＮＨＰをプレフュージョンＲＳＶＦで免疫化した。全ての動物が、強いｐｒｅＲＳＶＦ特異的力価及び全てのエピトープ焦点化免疫原との交差反応性を発現し、エピトープ特異的抗体が感作され、設計された免疫原によって認識されることが示された（図２５）。群２（６匹の動物）を、続いてエピトープ特異的抗体の動態を経時的に追跡するための対照群とし、群３（７匹の動物）をＴｒｉｖａｘ１で３回ブーストした（図５ｄ）。ｐｒｅＲＳＶＦ特異的抗体及び中和力価は、どちらの群においても２８日目に最大となり、１１９日目まで維持された（図５ｈ、図５ｉ）。部位特異的抗体レベルの分析により、部位０、ＩＩ及びＩＶ応答が対照群において動的であり、それぞれ２８日目及び９１日目に部位ＩＩが３７％から１３％まで低下し、部位０が１７％から４％まで低下することが示された（図５ｊ）。対照的に、部位ＩＶ特異的応答は、同じ期間にわたって１３％から４３％まで増大した。Ｔｒｉｖａｘ１ブースティング免疫化は、ｐｒｅＲＳＶＦ特異的血清応答の大きさを有意に変化させなかったが、プライミング動物における血清特異性を作り変えた。部位ＩＩ特異的力価は、非ブースト対照群と比較して６．５倍高く（９１日目）（８４％対１３％、ｐ＝０．０２、マン－ホイットニー）、これらの抗体は、非ブースト群における部位０特異的抗体の急速な低下とは異なり、Ｔｒｉｖａｘ１ブースティング後に維持された（２５％対４％、ｐ＝０．０２、マン－ホイットニー）（図５ｊ）。対照的に、部位ＩＶ特異的応答は、どちらの群においても同様のレベルまで増大し、群２及び３においてそれぞれ４３％及び４０％であった。驚くべきことに、プールした血清からの部位０、ＩＩ及びＩＶ特異的抗体の枯渇後に、非ブースト対照群における僅か７％の低下と比較して、群３における中和活性の６０％の低下が観察され、Ｔｒｉｖａｘ１ブースティングが広範な特異性の血清応答を、ＲＳＶ中和について主に部位０、ＩＩ及びＩＶ特異的抗体に依存する、より焦点化された応答へと作り変えることが示された（図５ｋ）。

全体として、どちらの設計戦略も、カクテル製剤により中和抗体を誘導する複雑な中和エピトープに対して抗原を生じ、エピトープ焦点化ワクチン接種戦略において複数の、理想的には重複しないエピトープを含めることの強い論理的根拠を与えると結論付けた。第１世代の免疫原は、生物物理学的パラメーターによると劣っており、マウスにおいて中和を誘導することができなかったが、ＮＨＰにおける２つの異なる免疫学的シナリオ下では成功し、生物物理学的特性が改善され、エピトープの正確な模倣を示した第２世代が今回、マウスにおいて中和抗体を誘導し得ることが示される。これは、小動物モデルにおいて異なるナノ粒子、製剤及び送達経路を最適化し、試験することを今回可能にすることから重要な工程であり、これらの第２世代免疫原がＮＨＰにおいて中和血清応答を誘導するのに優れていると証明されることが予見される。

論考及び結論
ここで、構造的に複雑なエピトープの正確な模倣体を設計するためのコンピューターによるタンパク質設計戦略を紹介し、マウス及びＮＨＰの両方でカクテル製剤において中和抗体応答を誘発する、それらの機能性を検証した。

完全な骨格柔軟性を有する既存の鋳型のコンピューターによる設計によって、不規則かつ不連続なエピトープが異種スキャフォールドにおいて首尾よく安定化されることが示された。しかしながら、この設計戦略は、広範なｉｎ ｖｉｔｒｏ進化最適化を必要とし、得られるスキャフォールドは、それらの生化学的及び生物物理学的特性に関して最適以下のままであった。加えて、設計されたタンパク質の正確なトポロジー制御がないことは、移植部位の局所的模倣に加えて、特異的なトポロジー類似性を必要とする機能性タンパク質の設計にとって大きな制限となる。例えば、部位０免疫原の設計鋳型は、対象のエピトープの四次環境を模倣せず、これがマウスにおいて誘導される機能的抗体の低いレベルに寄与していた可能性がある。これらの制限を克服するために、タンパク質フォールドを対象の機能部位に直接合わせるモチーフ中心の設計アプローチであるＴｏｐｏＢｕｉｌｄｅｒを開発した。本発明者らの方法は、安定したスキャフォールドトポロジーを初めに構築し、第２の工程において結合モチーフを付与する（５）、これまで用いられていたｄｅ ｎｏｖｏ設計アプローチと比較して、構造的に複雑なモチーフに対して大きな利点を有する。第一に、安定したタンパク質の適合（多くの場合、不安定化）によって機能部位に対応させるのではなく、設計プロセスの初めからトポロジーを機能モチーフの構造要件に合わせることが可能である。第二に、トポロジーアセンブリ及び微調整により、コンピューターによるタンパク質設計努力においてよく用いられるような指向性進化による更なる最適化を必要とすることなく、単回のスクリーニングにおいて安定にフォールディングされ、高親和性で結合する最適な骨格配向及び配列を選択することが可能であった（５，２４，２５）。総合すると、本発明者らのアプローチは、通常はタンパク質に多様な生化学的機能（例えば、結合又は触媒作用）を付与するのに必要とされる不規則かつ不連続な構造モチーフを提示するｄｅ ｎｏｖｏタンパク質のコンピューターによる設計を可能にし、これにより、機能性タンパク質のｄｅ ｎｏｖｏ設計のための新たな手段がもたらされた。

本発明者らの設計研究の機能面においては、これらの免疫原が、カクテル製剤としてマウス及びＮＨＰにおいて中和血清レベルを一貫して誘発することがｉｎ ｖｉｖｏで示された。ワクチン接種による焦点化された中和抗体応答の誘発は、従来のワクチン開発努力を妨げた病原体に対するワクチンにとって依然として中心的な目標である。ＲＳＶをモデル系として用いることで、コンピューターにより設計された抗原のカクテルが、ナイーブ動物において中和血清レベルを強く誘発し得ることが示された。これらの中和レベルは、エピトープ焦点化免疫原に関する以前のいかなる報告よりもはるかに優れており（１１）、複数の非重複エピトープが関与するエピトープ焦点化ワクチン接種戦略について強い論理的根拠を与える。また、ＮＨＰにおいて非ナイーブレパートリーの性質を劇的に作り変えるそれらの能力は、効果的なワクチンが必要とされている病原体を標的とする多くの次世代ワクチンにとって重要な課題に対処するものである。このカテゴリーの重要な病原体は、インフルエンザウイルスであり、ヘマグルチニンステム領域に見られる交差防御ｎＡｂ（２７）ではなく、株特異的抗体特異性を優先する、確立された免疫優勢階層（２６）を克服することが課題である。株特異的エピトープに取り囲まれた規定の広く防御的なエピトープを標的とするサブドミナントｎＡｂを選択的にブーストする能力は、交差中和抗体が誘発後に何年間も持続することが示されていることを考えると、ワクチン開発の長年の課題を克服する可能性がある（２８）。エピトープ焦点化免疫原の興味深い将来の用途は、この技術を免疫系の改変成分と結び付け、モノクローナル治療用抗体をｉｎ ｖｉｖｏで発現する養子移入した改変Ｂ細胞の抗体産生を刺激するために使用され得る（２９）。

全体として、この研究は、従来のワクチン開発アプローチから逃れた病原体に対するエピトープ焦点化ワクチン接種戦略の設計のための青写真を与える。提示の設計戦略は、免疫原の設計以外にも、規定の構造特性を有する新規の機能性タンパク質の設計に適用可能な複雑な結合部位を安定化するタンパク質のｄｅ ｎｏｖｏ設計への扉を開く。

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方法
鋳型ベースのエピトープ焦点化免疫原のコンピューターによる設計
部位０
抗原部位０を伴う構造セグメントは、抗体Ｄ２５に結合したプレフュージョン安定化ＲＳＶＦ Ｄｓ－Ｃａｖ１結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：４ＪＨＷ）から抽出した（１）。エピトープは、２つのセグメント：キンクヘリックスセグメント（残基１９６～２１２）及び７残基ループ（残基６３～６９）からなる。

ＭＡＳＴＥＲソフトウェア（２）を用いて、１４１９２０個のタンパク質構造を含むＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ、２０１８年８月より）の構造検索を行い、部位０モチーフと局所的に構造的類似性を有する鋳型スキャフォールドを選択した。２．５Å未満のＣα ＲＭＳＤ閾値を用いた最初の検索においては、局所的模倣及び大域的トポロジー特徴の両方の点でいかなる使用可能な構造的一致も得られなかった。２回目の検索を、かなりの局所的類似性を有するものではなく、モチーフに適合するトポロジーを優先する一致に検索を偏らせるために、エピトープをネイティブ環境で支持する追加の構造要素をクエリーモチーフの一部として含めて行った。含まれる追加の構造要素は、ｐｒｅＲＳＶＦ構造において部位０と直接接触する２つの埋もれたヘリックスであった（４ＪＨＷ残基７０～８８及び２１２～２２９）。検索により、初めに５Åの骨格ＲＭＳＤ下で７６００の一致が得られ、これを続いて、長さ５０残基～１６０残基のタンパク質、高い二次構造含量、及び抗体結合のためのエピトープのアクセス可能性についてフィルタリングした。残りの一致を手動で検査し、抗原部位０のネイティブ立体配座の提示に適した鋳型スキャフォールドを選択した。続いて、クエリーに対するＲＭＳＤが４．４Å（部位０セグメントのみについては２．８２Å）の８つの規則的ヘリックスからなる、コンピューターにより設計された、高度に安定したヘリックスリピートタンパク質（３）（ＰＤＢ ＩＤ：５ＣＷＪ）を選択した。Ｄ２５抗体との立体衝突を回避するために、５ＣＷＪ鋳型構造のＮ末端を２９残基切断し、７つのヘリックスから構成される構造トポロジーを得た。

Ｒｏｓｅｔｔａ ＦｕｎＦｏｌＤｅｓ（４）を用いて、切断した５ＣＷＪトポロジーをフォールディングし、Ｄ２５が認識するグラフト化部位０エピトープを安定化するように設計した。２５０００個の設計を生成し、Ｒｏｓｅｔｔａエネルギースコア（ＲＥ）によって上位３００個を選択し、低いパッキングスコア、歪んだ二次構造要素及び満たされていない埋もれた原子のような明白な欠陥を示す設計骨格を切り捨てた。上位３００個の設計から、Ｒｏｓｅｔｔａ ＦａｓｔＤｅｓｉｇｎ（５）を用いる構造緩和及び設計の追跡反復サイクルのために３個を残し、合計１００個の設計配列を生成した。

Ｒｏｓｅｔｔａエネルギースコアによる最良の９つの設計を大腸菌において組み換え発現させた。同じ骨格に由来する２つの設計配列が首尾よく発現及び精製された。最良の変異体をＳ０＿１．１と命名し、酵母表面ディスプレイを用いる実験的最適化に供した（図９及び図１０）。ライブラリーの１つにおいて、発現及び結合について富化された切断配列（Ｓ０＿１．１７）が発見され、これを２回目のコンピューターによる設計の鋳型とした（図９及び図１０）。Ｒｏｓｅｔｔａ ＦｕｎＦｏｌＤｅｓ（４）を用いて２５０００回のフォールディング及び設計シミュレーションを行った。総Ｒｏｓｅｔｔａエネルギースコアにより最良の３００個のデコイを抽出し、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｒｅｌａｘアプリケーション（６）を用いて緩和した。平均総ＲＥを計算し、設計集団の平均（ＲＥ＝－１５５．２）よりも低いエネルギースコア、０．７Å未満の緩和後のエピトープのＲＭＳＤドリフト及び６０Å^３未満の空洞容積を示す設計を選択した。最良のスコアの５つのデコイの１つを選択し、エピトープ安定化に寄与しないＮ末端の１４残基を切断し、残基１と４３との間にジスルフィド結合を導入した。４つの配列を実験的に試験した（Ｓ０＿１．３７～４０）。結合が最良の変異体であるＳ０＿１．３９は、５ｎＭの親和性で抗体Ｄ２５に結合し、重要なことには、５Ｃ４抗体とも結合した（Ｋ_Ｄ＝５ｎＭ）。

部位ＩＶ
設計シミュレーションを行った時点で、部位ＩＶ特異的ｎＡｂと複合した完全なＲＳＶＦタンパク質の構造は利用可能でなかったが、１０１Ｆ ｎＡｂが認識するこの部位のペプチドエピトープは、以前に報告されている（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｏ４１）（７）。

結晶化ペプチドエピトープは、ＲＳＶＦタンパク質の残基４２９～４３４に相当する。１０１Ｆ結合ペプチドエピトープは構造的に、バルジストランドを示し、１０１Ｆの認識が線状βストランドを超えて拡大し、抗原部位ＩＶに位置する他の残基と接触することが幾つかの研究により示唆されている（８）。エピトープの明らかな構造の単純さにもかかわらず、設計可能なスキャフォールドの構造検索により有望な開始鋳型を得ることはできなかった。しかしながら、ＲＳＶＦの抗原部位ＩＶが個々のドメインに内蔵され、これを潜在的に切除し、可溶性のフォールディングされたタンパク質として設計し得ることに気付いた。これらの接触を最大にするために、初めに一見内蔵されている領域を、βサンドイッチを形成し、部位ＩＶを有するＲＳＶＦプレフュージョン構造（ＰＤＢ ＩＤ：４ＪＨＷ、残基：４０２～４５９）から切断した。Ｒｏｓｅｔｔａ ＦａｓｔＤｅｓｉｇｎを用いて、この最小トポロジーのコア位置を最適化し、本発明者らの初期設計：Ｓ４＿ｗｔを得た。しかしながら、Ｓ４＿ｗｔは、Ｒｏｓｅｔｔａ ａｂ ｉｎｉｔｉｏシミュレーションにおいて漏斗状のエネルギー地形を示さず、大腸菌において発現を得ることはできなかった。

Ｓ４＿ｗｔの立体配座及び安定化を改善する目的で、Ｒｏｓｅｔｔａ ＦｕｎＦｏｌＤｅｓを用いて、部位ＩＶエピトープの立体配座を固定したままで、このトポロジーのフォールディング及び設計を行った。２５０００回のシミュレーションのうち、ＲＥスコア及び全体的ＲＭＳＤにより上位１％のデコイを手動検査に選択し、１２個の設計配列を大腸菌における組み換え発現に選択した。

ＴｏｐｏＢｕｉｌｄｅｒ － モチーフ中心のｄｅ ｎｏｖｏ設計
部位０及び部位ＩＶ等の構造的に複雑なモチーフを受け入れるのに適した開始鋳型の限られたアベイラビリティを考慮して、鋳型なしの設計プロトコルを開発し、ＴｏｐｏＢｕｉｌｄｅｒと命名した。既存のトポロジーをエピトープに対応するように適合させることとは対照的に、設計目標は、理想的な二次構造（βストランド及びαヘリックス）を用いてエピトープ周囲のタンパク質スキャフォールドをゼロから構築することである。長さ、配向及び３Ｄ位置決めは、そのネイティブ環境から抽出されるエピトープに関する各二次構造について、ユーザーによって定義される。構築されたトポロジーは、以下の基準を満たすように設計された：（１）二次構造とエピトープとの間の接触秩序が高く、安定したフォールディング及びエピトープのネイティブ立体配座での正確な安定化を可能にする低分子球状タンパク質、（２）コンテクスト模倣、すなわちエピトープのネイティブ状況での形状制約の遵守（図１２）。トポロジーをアセンブルするために、αヘリックス間のデフォルト距離を１１Åに設定し、隣接βストランドについては５Åとした。各々の不連続な構造スケッチについて、二次構造要素間の接続性を定義し、適当な骨格の幾可学的形状を維持しながら所与の距離をカバーし得る最小の残基数で二次構造要素を接続するループ長を選択した。

部位０については、（１）タンパク質にコアを与え、（２）二次構造間の適当な接続性を可能にするために、エピトープループセグメントに先行するＳ０＿１．３９の短いヘリックスを維持し、第３のヘリックスをエピトープの裏側に配置した。

設計された支持αヘリックスについて合計３つの異なる配向（部位０が形成する平面に対して４５°、０°及び－４５°）を試験した（図３及び図１６）。

部位ＩＶの場合、１０１Ｆへの既知の結合領域（残基４２８Ｆ～４３４Ｆ）をプレフュージョンＲＳＶＦ（ＰＤＢ ４ＪＷＨ）から抽出した。エピトープと対をなす３本の逆平行βストランドと埋もれた側のαヘリックスとを１０１Ｆエピトープの周囲にアセンブルした。３つの異なる立体配置（βシートに対して４５°、（－４５°，０°，１０°）及び－４５°）をαヘリックスについてパラメトリックにサンプリングした（図３）。

構造スケッチを用いて、Ｒｏｓｅｔｔａ ＦｕｎＦｏｌＤｅｓ（４）フォールディング軌道を導くためにＣ！距離制約を生成した。およそ２５０００本の軌道を各スケッチについて生成した。新たに生成した骨格をレイヤーベースのＦａｓｔＤｅｓｉｇｎ（５）に更に供し、すなわち、各アミノ酸位置に、その露出度及び二次構造のタイプに基づいてレイヤー（「コア」、「境界」、「表面」及び「シート」又は「ヘリックス」の組合せ）を割り当て、その位置で許容されるアミノ酸の種類が決定付けられた。

配列設計の反復サイクル後に、制約のないＦａｓｔＲｅｌａｘ（９）（すなわち、側鎖再パッキング及び骨格最小化）を設計全体に適用し、それらのエピトープ領域の立体配座安定性を評価した。各緩和サイクル後に、エピトープ領域の構造変化を評価した（エピトープＲＭＳＤドリフト）。エピトープＲＭＳＤドリフトが１．２Åを超える設計は切り捨てた。設計を部位０については０．５、部位ＩＶ設計シリーズについては０．６のカットオフ、及び５０Å^３未満の空洞容積で疎水性コアパッキング（ｐａｃｋｓｔａｔスコア）によってもランク付けし、選択した。このコンピューターによるプロトコルから１０００個～１００００個の設計配列が生成した。配列プロファイルを設計について評価し、重複オリゴをアセンブルすることによって重要な位置をコンビナトリアルにコード化した。ＰＣＲアセンブリ後に、ライブラリーを酵母にて形質転換し、プロテアーゼ消化アッセイによって評定される抗体結合及び安定性についてスクリーニングした（１０～１２）。

マウス免疫化
全ての動物実験が、スイスの動物福祉に関する規制（動物プロトコル番号３０７４）に従い、ヴォー州獣医局（Veterinary Authority of the Canton of Vaud）（スイス）によって承認されている。雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（６週齢）をJanvier labsから購入した。免疫原を氷上で融解し、同量のアジュバント（２％Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Invivogen又はＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ、Sigma）と混合し、３０分間インキュベートした。合計１０μｇの免疫原（Ｔｒｉｖａｘ免疫化のための等モル比の各免疫原）を含有する１００μｌのワクチン製剤をマウスに皮下注射した。免疫化は０日目、２１日目及び４２日目に行った。１００μｌ～２００μｌの血液を０日目、１４日目及び３５日目に採取した。５６日目にマウスを安楽死させ、心臓穿刺によって採血した。

ＮＨＰ免疫化
２１匹のアフリカミドリザル（ＡＧＭ、３歳～４歳）を、各性別に少なくとも２匹の動物を含む３つの実験群に分けた。ＥＬＩＳＡによりＡＧＭがプレフュージョンＲＳＶＦ（ｐｒｅＲＳＶＦ）に対して血清反応陰性であることを事前スクリーニングした。各動物について０．５ｍｌのＰＢＳ中５０μｇのｐｒｅＲＳＶＦ又は３００μｇのＴｒｉｖａｘ１を含有し、０．５ｍｌのアラムアジュバント（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Invivogen）と混合したワクチンを注射の１時間前に調製した。０日目、２８日目、５６日目及び８４日目にＡＧＭを筋肉内免疫化した。１４日目、２８日目、３５日目、５６日目、６３日目、８４日目、９１日目、１０５日目及び１１９日目に血液を採取した。

ＲＳＶ中和アッセイ
ＲＳＶ中和アッセイは、以前に記載されているように行った（１３）。簡潔に述べると、Ｈｅｐ２細胞をＣｏｒｎｉｎｇ ９６ウェル組織培養プレート（Sigma）において１０％ＦＢＳ（Gibco）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Gibco）及びペニシリン－ストレプトマイシン（Gibco）を添加した１００μｌの最小必須培地（ＭＥＭ、Gibco）中に４００００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩成長させた。フェノールレッドを含まないＭＥＭ（Ｍ０、Life Technologies、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加）中で熱不活性化血清の段階希釈物を調製し、８００ｐｆｕ／ウェル（最終ＭＯＩ ０．０１）のＲＳＶ－Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ遺伝子を有するＡ２株）とともに３７℃で１時間インキュベートした。血清－ウイルス混合物をＨｅｐ２細胞層に添加し、４８時間インキュベートした。１μｇ／ｍｌルシフェリン（Sigma）及び２ｍＭ ＡＴＰ（Sigma）を添加した溶解バッファーに細胞を溶解させ、発光シグナルをTecanのＩｎｆｉｎｉｔｅ ５００プレートリーダーで読み取った。中和曲線をプロットし、１／Ｙ^２で重み付けしたＧｒａｐｈＰａｄ可変勾配フィッティングモデルを用いてフィッティングした。

血清分画
単量体Ｔｒｉｖａｘ１免疫原（Ｓ２＿１、Ｓ０＿１．３９及びＳ４＿１．５）を用いて、免疫化血清中の部位０、ＩＩ及びＩＶ特異的抗体を枯渇させた。ＨｉｓＰｕｒ（商標） Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂スラリー（Thermo Scientific）を、１０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳで洗浄した。およそ１ｍｇの各免疫原をＮｉ－ＮＴＡ樹脂に固定化し、続いて２回の洗浄工程を行い、非結合スキャフォールドを除去した。同じ群内の全ての動物からプールした６０μｌの血清を洗浄バッファーで６００μｌの最終容量まで希釈し、５００μｌのＮｉ－ＮＴＡ樹脂スラリーとともに４℃で一晩インキュベートした。対照として、同量の血清を、スキャフォールドを含まないＮｉ－ＮＴＡ樹脂とともにインキュベートした。樹脂を１３０００ｒｐｍで５分間ペレットダウンし（pelleted down）、上清（枯渇血清）を回収した後、中和アッセイに使用した。

部位飽和突然変異誘発ライブラリー（ＳＳＭ）
Ｓ４＿１．１設計モデルにおけるエピトープの周囲の１１個の選択位置を、一度に１つの突然変異を可能として２０種全てのアミノ酸に突然変異させて、ＳＳＭライブラリーをオーバーハングＰＣＲによってアセンブルした。１１個のライブラリーは各々、選択位置に縮重コドン「ＮＮＫ」を有するプライマー（表１）によってアセンブルした。１１個全てのライブラリーをプールし、ＥＢＹ－１００酵母株に１×１０^６個の形質転換体という形質転換効率で形質転換した。

コンビナトリアルライブラリー
タンパク質コア内の疎水性アミノ酸のコンビナトリアルサンプリングのために、選択位置に縮重コドンを有する複数の重複プライマー（表２）をアセンブルすることによってコンビナトリアル配列ライブラリーを構築した。理論的多様性は、１×１０^６～５×１０^６であった。プライマーを混合し（各１０μＭ）、ＰＣＲ反応（５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長時間、２５サイクル）においてアセンブルした。完全長アセンブル産物を増幅するために、完全長産物に特異的なフォワード及びリバースプライマーを用いて第２のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を脱塩し、ＥＢＹ－１００酵母株に少なくとも１×１０^７個の形質転換体という形質転換効率で形質転換した（１４）。

タンパク質の発現及び精製
設計されたスキャフォールド
設計されたタンパク質の全ての遺伝子をTwist BioscienceからＤＮＡフラグメントとして購入し、ギブソンアセンブリによってｐＥＴ１１ｂ又はｐＥＴ２１ｂ細菌発現ベクターのいずれかにクローニングした。プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Merck）に形質転換し、ＬＢ培地中で一晩成長させた。タンパク質発現のために、前培養物を１００倍希釈し、ＯＤ_６００が０．６に達するまで３７℃で成長させ、続いて１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して、発現を誘導した。培養物を２２℃で１２時間～１６時間後に採取した。ペレットを溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ）に再懸濁し、１５秒間の超音波処理後に４５秒間の休止の間隔で合計１２分間にわたって氷上で超音波処理した。溶解物を遠心分離（２００００ｒｐｍ、２０分間）によって清澄化し、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーに続く、ＰＢＳバッファー中のＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（GE Healthcare）でのサイズ排除によって精製した。

抗体 － ＩｇＧ及びＦａｂ構築物
ＩｇＧの重鎖のｃＤＮＡをコードするプラスミドをGenscriptから購入し、ｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１ベクター（Invivogen）にクローニングした。抗体フラグメント（Ｆａｂ）の重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列をTwist Bioscienceから購入し、ギブソンアセンブリによってｐＨＬｓｅｃ哺乳動物発現ベクター（Addgene、＃９９８４５）に別個にクローニングした。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に重鎖及び軽鎖を１：１の比率でトランスフェクトし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Gibco）中で７日間培養した。上清を遠心分離によって回収し、ＩｇＧ発現については１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラム（GE Healthcare）、Ｆａｂ精製については５ｍｌのｋａｐｐａ－ｓｅｌｅｃｔカラム（GE Healthcare）を用いて精製した。結合した抗体／Ｆａｂを０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ２．７）で溶出させ、即座に１Ｍ Ｔｒｉｓエチルアミンバッファー（ｐＨ９）によって中和し、ＰＢＳにバッファー交換した。

プレフュージョン安定化ＲＳＶＦ
熱安定化ｐｒｅＲＳＶＦタンパク質をコードする構築物は、Joyceらによって報告されたｓｃ９－１０ ＤＳ－Ｃａｖ１ Ａ１４９Ｃ Ｙ４５８Ｃ Ｓ４６Ｇ Ｅ９２Ｄ Ｓ２１５Ｐ Ｋ４６５Ｑ変異体（ＤＳ２と称される）に相当する（１５）。配列を哺乳動物細胞発現にコドン最適化し、２つのＣ末端Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩ及び１つの８×Ｈｉｓタグが隣接したｐＨＣＭＶ－１ベクターにクローニングした。発現及び精製を以前に記載されているように行った（１３）。

ナノリングベースの免疫原
ヒトＲＳＶ株Ｌｏｎｇ、ＡＴＣＣ ＶＲ－２６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ９１１２６２．１）に由来する完全長Ｎ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ２８ａ＋にＮｃｏＩ－ＸｈｏＩ部位でクローニングして、ｐＥＴ－Ｎプラスミドを得た。部位０、ＩＩ及びＩＶエピトープを提示する免疫原を、それぞれｐＥＴ－Ｓ０＿１．３９－Ｎ、ｐＥＴ－Ｓ２＿１．２－Ｎ及びｐＥＴ－Ｓ４＿１．５－ＮとしてｐＥＴ－ＮプラスミドにＮｃｏＩ部位でクローニングした。ナノリング融合タンパク質の発現及び精製を以前に記載されているように行った（１３）。

フェリチンベースの免疫原
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）フェリチンをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＱＡＢ３３５１１．１）を哺乳動物発現用のｐＨＬｓｅｃベクターにＮ末端６×Ｈｉｓタグとともにクローニングした。設計された免疫原（Ｓ０＿２．１２６及びＳ４＿２．４５）の配列を、ＧＧＧＧＳリンカーを挟んでフェリチン遺伝子の上流にクローニングした。他の免疫原－ナノ粒子融合構築物について以前に記載されているように、１：１の化学量論比の「裸の」フェリチン及び免疫原－フェリチンをＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に共トランスフェクトすることによってフェリチン微粒子免疫原を作製した（１６）。トランスフェクションの７日後に上清を回収し、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（GE）でのサイズ排除によって精製した。

ネガティブ染色透過電子顕微鏡法
サンプル調製
ＲＳＶＮ及びフェリチンをベースとしたナノ粒子を０．０１５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。サンプルを炭素被覆銅グリッド（EMS，Hatfield，PA，United States）に３分間吸着させ、脱イオン水で洗浄し、新たに調製した０．７５％ギ酸ウラニルで染色した。

データ取得
２００ｋＶで動作するＦ２０電子顕微鏡（Thermo Fisher）下でサンプルを観察した。デジタル画像を、直接検出器カメラＦａｌｃｏｎ ＩＩＩ（Thermo Fisher）を用いて４０９８×４０９８ピクセルの設定で収集した。自動データ収集前に、グリッド上の染色サンプルの均一性及び被覆率を初めに低倍率モードで可視化した。自動データ収集は、ＥＰＵソフトウェア（Thermo Fisher）を用いて、２Åのピクセルサイズに相当する５００００倍の公称倍率及び－１μｍ～－２μｍのデフォーカス範囲で行った。

画像処理
ＣＴＦＦＩＮＤ４プログラム（１７）を用いて、収集した各画像のコントラスト伝達関数を推定した。およそ１０００個の粒子を、ＳＣＩＰＩＯＮフレームワーク（１８）内のインストール済みパッケージＸＭＩＰＰを用いて手動で選択した。手動で選抜した粒子をＸＭＩＰＰ自動選抜ユーティリティの入力とし、少なくとも１００００個の粒子を得た。選択された粒子を１００ピクセルのボックスサイズで抽出し、ＲＥＬＩＯＮ－３．０ Ｂｅｔａスイート（１９）を用いてＣＴＦ補正を行わない３回の参照なしの２Ｄ分類に供した。

ＲＳＶＦ－Ｆａｂ複合体形成及びネガティブ染色ＥＭ
２０μｇのＲＳＶＦ三量体を８０μｇのＦａｂ（モタビズマブ、Ｄ２５又は１０１Ｆ）とともに４℃で一晩インキュベートした。３つ全てのモノクローナルＦａｂとの複合体形成のために、各Ｆａｂを８０μｇ使用した。ＴＢＳバッファー中にてＡｋｔａ Ｐｕｒｅシステムを用いるＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００カラム（GE Healthcare）で複合体を精製した。複合体を含有する主画分をネガティブ染色ＥＭに直接使用した。ＲＳＶＦ及びＦａｂの精製複合体を、およそ０．０２ｍｇ／ｍｌで炭素被覆銅グリッドに堆積させ、２％ギ酸ウラニルで染色した。２００ｋＶで動作する電界放出ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０電子顕微鏡で画像を収集した。Ｏｒｉｕｓ電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Gatan Inc.）を用い、３４４８３倍の較正倍率で画像を取得し、２．７１Åのピクセルサイズを得た。ＲＳＶＦと単一Ｆａｂとの複合体については、Ｃｒｙｏｓｐａｒｃ２（２０）を用いておよそ２０００個の粒子を手動で選択した。２０クラスを可能として粒子画像の２回の２Ｄ分類を行った。ＲＳＶＦとＤ２５、モタビズマブ及び１０１Ｆ Ｆａｂとの複合体については、Ｒｅｌｉｏｎ ３．０（１９）を用いておよそ３３００００個の粒子を選抜し、続いてＣｒｙｏｓｐａｒｃ２にインポートし、５０クラスを可能として２回の２Ｄ分類を行った。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合親和性の決定
ＳＰＲ測定は、ＨＢＳ－ＥＰ＋をランニングバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、GE Healthcare）としてＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（GE Healthcare）で行った。リガンドをアミンカップリングによってＣＭ５チップ（GE Healthcare ＃２９１０４９８８）上に固定化した。およそ２０００反応単位（ＲＵ）のＩｇＧを固定化し、設計された単量体タンパク質を２倍段階希釈で分析物として注入した。１２０秒間の接触時間後の４００秒間の解離時間で流量を３０μｌ／分とした。各注入後に、３Ｍ塩化マグネシウム（固定化リガンドとして１０１Ｆ）又はｐＨ４．０の０．１Ｍグリシン（固定化リガンドとしてモタビズマブ及びＤ２５ ＩｇＧ）を用いて表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ分析ソフトウェア（GE Healthcare ＃２９３１０６０４）において１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いてデータをフィッティングした。

ＳＰＲによる血清抗体特異性の精査
免疫化動物からのバルク血清におけるエピトープ特異的抗体応答を定量化するために、モノクローナル抗体（Ｄ２５、モタビズマブ及び１０１Ｆ）を用いて以前に記載されているようにＳＰＲ競合アッセイを行った（１３）。簡潔に述べると、およそ４００ＲＵのプレフュージョンＲＳＶＦをアミンカップリングによってＣＭ５チップ上に固定化し、ランニングバッファー中の１０倍希釈した血清を注入して、全応答（ＲＵ_{非ブロッキング表面}）を測定した。５０ｍＭ ＮａＯＨを用いたチップ再生後に、飽和量のＤ２５、モタビズマブ又は１０１Ｆ ＩｇＧのいずれかを注入することによって部位０／ＩＩ／ＩＶエピトープをブロッキングし、血清を再び注入して、残留応答（ＲＵ_{ブロッキング表面}）を定量化した。Δ血清応答（ΔＳＲ）を以下のように算出した：
ΔＳＲ＝ＲＵ_{（非）ブロッキング表面}－ＲＵ_{ベースライン}
ブロッキング率を各部位について以下のように算出した：
ブロッキング率（％）＝（１－（ΔＳＲ_{ブロッキング表面}／ΔＳＲ_{非ブロッキング表面}））×１００

ＳＥＣ－ＭＡＬＳ
オンライン多角度光散乱（ＭＡＬＳ）デバイス（ｍｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ、Wyatt）によるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、溶液中のタンパク質のオリゴマー状態及び分子量を決定した。精製タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、１００μｌのサンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ３００／１０ ＧＬカラム（GE Healthcare）に０．５ｍｌ／分の流量で注入し、ＵＶ２８０及び光散乱シグナルを記録した。ＡＳＴＲＡソフトウェア（バージョン６．１、Wyatt）を用いて分子量を決定した。

円偏光二色性
遠紫外円偏光二色性スペクトルを、１ｍｍ光路長キュベットにおいてＪａｓｃｏ－８１５分光計を用いて測定した。タンパク質サンプルを１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中で３０μＭのタンパク質濃度に調製した。１９０ｎｍ～２５０ｎｍの波長を２０ｎｍ／分の走査速度及び０．１２５秒の応答時間で記録した。全てのスペクトルを２回平均化し、バッファーの吸収に対して補正した。温度勾配融解（Temperature ramping melts）を２．５ｍＭ ＴＣＥＰ還元剤の存在下又は非存在下にて２℃／分の増分で２５℃から９０℃まで行った。熱変性曲線を大域的曲線最小値での楕円率の変化によってプロットし、融解温度（Ｔ_ｍ）を算出した。

酵母表面ディスプレイ
設計されたタンパク質の変異体をコードする線状ＤＮＡフラグメントのライブラリーを、Chaoらによって以前に記載されているプロトコルに基づいて線状化ｐＣＴｃｏｎ２ベクター（Addgene ＃４１８４３）とともに形質転換した（１４）。形質転換手順により、概して約１０^７個の形質転換体が得られた。形質転換細胞を誘導の前にＳＤＣＡＡ培地中で２回継代した。細胞表面発現を誘導するために、細胞を７０００ｒ．ｐ．ｍ．で１分間遠心分離し、誘導培地（ＳＧＣＡＡ）で洗浄し、１００ｍｌのＳＧＣＡＡにＳＧＣＡＡ １ｍｌ当たり１×１０^７細胞の細胞密度で再懸濁した。細胞をＳＧＣＡＡ培地において３０℃で一晩成長させた。誘導細胞を冷洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．０５％ＢＳＡ）で洗浄し、様々な濃度の標的ＩｇＧ又はＦａｂ（１０１Ｆ、Ｄ２５及び５Ｃ４）を用いて４℃で標識した。１時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄バッファーで２回洗浄した後、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ｃＭｙｃ抗体及びＰＥコンジュゲート抗ヒトＦｃ（BioLegend、＃３４２３０３）又はＰＥコンジュゲート抗Ｆａｂ（Thermo Scientific、＃ＭＡ１－１０３７７）とともに更に３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ソニー株式会社のＳＨ８００フローサイトメーターを「超純度」モードで用いて選別した。選別した細胞をＳＤＣＡＡ培地中で回収し、３０℃で１日～２日間成長させた。安定にフォールディングされたタンパク質を選択するために、誘導細胞をＴＢＳバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で３回洗浄し、１μＭキモトリプシンを含有する０．５ｍｌのＴＢＳバッファーに再懸濁した。３０℃で５分間インキュベートした後、１ｍｌの洗浄バッファーを添加することによって反応をクエンチし、続いて５回の洗浄工程を行った。次いで、細胞を上記のように一次及び二次抗体で標識した。

ＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレート（Thermo ScientificのＮｕｎｃ ＭｅｄｉＳｏｒｐプレート）を、１００μｌの総量のコーティングバッファー（１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９）中５０ｎｇ／ウェルの精製抗原（組み換えＲＳＶＦ又は設計された免疫原）を用いて４℃で一晩コーティングした。一晩のインキュベーション後に、ウェルをブロッキングバッファー（５％スキムミルクを含有するＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）（Sigma））を用いて室温で２時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。３倍段階希釈物を調製し、二連でプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後に抗マウス（abcam、＃９９６１７）又は抗サル（abcam、＃１１２７６７）ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を、ブロッキングバッファーでそれぞれ１５００倍又は１００００倍に希釈し、１時間インキュベートした。更に５回の洗浄工程を行った後、１００μｌ／ウェルのＰｉｅｒｃｅ ＴＭＢ基質（Thermo Scientific）を添加した。同量の２Ｍ硫酸を添加することによって反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２プレートリーダーで測定し、バックグラウンドの２倍のシグナルを生じる血清希釈率の逆数として抗原特異的力価を決定した。

ＮＭＲ
ＮＭＲ用のタンパク質サンプルは、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、５０ｍＭ塩化ナトリウム中にて５００μＭのタンパク質濃度で調製した。全てのＮＭＲ実験を、ＣＰＴＣ ^１Ｈ，^１３Ｃ，^１５Ｎ ５ｍｍクライオプローブ及びＡｖａｎｃｅ ＩＩＩコンソールを備える１８．８Ｔ（８００ＭＨｚのプロトンラーモア周波数）のBrukerの分光計において行った。骨格共鳴帰属のための実験は、^１３Ｃ及び^１５Ｎで二重標識した０．５ｍＭサンプルに対して取得される標準三重共鳴スペクトルＨＮＣＡ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ及びＨＮＣＡＣＢであった（２１）。側鎖帰属は、同じサンプルに対して取得されるＨＣＣＨ－ＴＯＣＳＹ実験と^１５Ｎ標識サンプルに対して取得されるＨＮＨＡ、ＮＯＥＳＹ－^１５Ｎ－ＨＳＱＣ及びＴＯＣＳＹ－^１５Ｎ－ＨＳＱＣとによって得られた。ＮＯＥＳＹ－^１５Ｎ－ＨＳＱＣを、非標識サンプルに対して収集された２Ｄ ＮＯＥＳＹとともに構造計算に用いた。骨格帰属のスペクトルは、^１５Ｎ次元においては４０増分、^１３Ｃ次元においては１２８増分で取得し、線形予測を用いることによって１２８ポイント及び２５６ポイントで処理した。ＨＣＣＨ－ＴＯＣＳＹは、^１３Ｃ次元において６４～１２８増分で記録し、２倍のポイント数で処理した。^１５Ｎ分解ＮＯＥＳＹ及びＴＯＣＳＹスペクトルは、^１５Ｎ次元において６４増分、間接^１Ｈ次元において１２８増分で取得し、２倍のポイント数で処理した。^１Ｈ－^１Ｈ ２Ｄ－ＮＯＥＳＹ及び２Ｄ ＴＯＣＳＹスペクトルを間接次元において２５６増分で取得し、５１２ポイントで処理した。ＮＯＥＳＹスペクトルの混合時間は１００ｍｓであり、ＴＯＣＳＹスピンロックは６０ｍｓであった。異核^１Ｈ－^１５Ｎ ＮＯＥは、６４回のスキャン及び６秒間の飽和時間を用いて１２８の^１５Ｎ増分で測定し、２５６ポイントで処理した。全てのサンプルを、サンプルの分解を防ぐために１０％^２Ｈ_２Ｏ及び０．２％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）中で調製した。

全てのスペクトルをBrukerのＴｏｐＳｐｉｎ ３．０で取得及び処理し（標準パルスプログラムによる取得）、プログラムＣＡＲＡ（http://cara.nmr.ch/doku.php/home）によって手動で分析し、骨格及び側鎖共鳴帰属を得た。ＮＯＥＳＹスペクトル（^１５Ｎ分解ＮＯＥＳＹ及び２Ｄ ＮＯＥＳＹ）のピーク選抜及び帰属は、Ｃｙａｎａ ２．１（２４）と組み合わせたプログラムＵＮＩＯ－ＡＴＮＯＳ／ＣＡＮＤＩＤ（２２、２３）により、両方のプログラムの標準設定を用いて自動的に行った。Ｔａｌｏｓ－ｎ（２５）による化学シフトから導かれた二面角によって実行を補完した。

Ｘ線結晶化及び構造決定
複合体Ｄ２５ ＦａｂとＳ０＿２．１２６との共結晶化
４℃で一晩のインキュベーション後に、Ｓ０＿２．１２６／Ｄ２５ Ｆａｂ複合体を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ２６ ６００（GE Healthcare）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、続いて約１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５、ＭＷＣＯ ３０００）。結晶を、１０％ＰＥＧ ８０００、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び２００ｍＭ酢酸カルシウムを含有する１μｌのリザーバー溶液と混合した１μｌの精製タンパク質を含有する液滴中でシッティングドロップ蒸気拡散法を用いて２９１Ｋで成長させた。

凍結保護のために、２０％エチレングリコールを含有する母液に結晶を短時間通した。

Ｓ０＿２．１２６／Ｄ２５ Ｆａｂ複合体のデータ収集及び構造決定
回折データをＥＳＲＦビームラインＩＤ３０Ｂで記録した。ＸＤＳ（２６）によってデータ統合を行い、Ｉ／σ＝１での高分解能カットを適用した。データセットには、１／２、０、１／２の疑似並進対称性に対応するパターソン関数の強い原点外（off-origin）ピーク（原点に対して８８％の高さ）が含まれていた。構造は、ＰＨＡＳＥＲ（２７）を用いた分子置換法によって、Ｄ２５構造（１）（ＰＤＢ ＩＤ ４ＪＨＷ）を検索モデルとして用いて決定した。手動モデル構築はＣｏｏｔ（２８）、及びＰｈｅｎｉｘ（２９）における自動精錬を用いて行った。数回の自動精錬及び手動構築の後に、ペア精錬（paired refinement）（３０）によって最終精錬のための分解能カットオフを決定した。

複合体１０１Ｆ ＦａｂとＳ４＿２．４５との共結晶化
Ｓ４＿２．４５とＦ１０１ Ｆａｂとの複合体を、２つのタンパク質を２：１のモル比にて４℃で１時間混合し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ－７５カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを行うことによって調製した。Ｓ４＿２．４５と１０１Ｆ Ｆａｂとの複合体をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検証した。複合体を続いて６ｍｇ／ｍｌ～８ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて結晶を２０℃で成長させた。Ｓ４＿２．４５／１０１Ｆタンパク質複合体を０．２Ｍ酢酸マグネシウム、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ８０００を含有する同量のウェル溶液と混合した。ネイティブ結晶を０．２Ｍ酢酸マグネシウム、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ８０００及び１５％グリセロールの抗凍結剤溶液に移し、続いて液体窒素中で瞬間冷却を行った。

Ｓ４＿２．４５／１０１Ｆ Ｆａｂ複合体のデータ収集及び構造決定
ＳＬＡＣ国立加速器研究所のＳＳＲＬ施設ＢＬ９－２ビームラインで回折データを収集した。結晶は空間群Ｐ３２２１に属していた。回折データを初めにＸ線検出器ソフトウェア（ＸＤＳ）によって２．６Åに処理した（表９）。プログラムＰＨＥＮＩＸ ＰＨＡＳＥＲを用い、１０１Ｆ Ｆａｂモデル（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｏ４１）及びＳ４＿２．４５のエピトープ領域とペプチド結合構造（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｏ４１）とを重ね合わせることで生成したＳ４＿２．４５／１０１Ｆ Ｆａｂのコンピューターによるモデルを用いて分子置換検索を行い、明確な分子置換解を得た。初期精錬により４２．４３％のＲ_ｆｒｅｅ及び３２．２５％のＲ_ｗｏｒｋが得られ、Ｐｈｅｎｉｘ Ｒｅｆｉｎｅを用いて複雑な構造を精錬し、続いてプログラムＣＯＯＴにより手動の再構築を行った。最終精錬統計値、ネイティブデータ及び位相決定統計値を表９にまとめる。

設計プールの次世代シークエンシング
選別後に酵母細胞を一晩成長させ、ペレット化し、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＩＩ（Zymo Research）を用い、製造業者の説明書に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。設計された変異体のコード配列を、ベクター特異的プライマー対を用いて増幅し、オーバーハングＰＣＲを用いてＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプターを付加し、ＰＣＲ産物を脱塩した（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット、Qiagen）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ２×１５０ｂｐペアエンドシークエンシング（３００サイクル）を用いて次世代シークエンシングを行い、４５万～５８万リード／サンプルを得た。

バイオインフォマティクス分析のために、配列を正確なリーディングフレームにおいて翻訳し、エンリッチメント値を各配列について計算した。エンリッチメント値Ｅは、以下のように定義した：
Ｅ_Ｓｅｑ＝カウント_Ｓｅｑ（高選択圧）／カウント_Ｓｅｑ（低選択圧）

高選択圧は、それぞれの標的抗体の低い標識濃度（図３に示すように１００ｐＭ Ｄ２５、１０ｎＭ ５Ｃ４又は２０ｐＭ １０１Ｆ）又はより高濃度のキモトリプシンプロテアーゼ（０．５μＭ）に相当する。低選択圧は、図３に示すように抗体による高い標識濃度（１０ｎＭ Ｄ２５、１μＭ ５Ｃ４又は２ｎＭ １０１Ｆ）又はプロテアーゼ消化がないことに相当する。両方の選別条件において少なくとも１回のカウントを有する配列のみを分析に含めた。

表

方法セクションの参照文献：
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14. G. Chao et al., Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat Protoc 1, 755-768 (2006).
15. M. G. Joyce et al., Iterative structure-based improvement of a fusion-glycoprotein vaccine against RSV. Nat Struct Mol Biol 23, 811-820 (2016).
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Claims (14)

1. 複数種の非自然発生の免疫原性ポリペプチドを含み、該免疫原性ポリペプチドの少なくとも１種が、フォールディングされて標的病原体の複雑及び／又は不連続な中和エピトープを模倣する三次構造を有するアミノ酸配列を有する模倣ペプチドを含む、標的病原体に対するワクチン組成物。
2. 前記複数種の非自然発生の免疫原性ポリペプチドの各々が、フォールディングされて前記標的病原体の複雑及び／又は不連続な中和エピトープを模倣するアミノ酸配列を有する模倣ペプチドを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
3. 前記複雑及び／又は不連続な中和エピトープの各々が重複しない、請求項２に記載のワクチン組成物。
4. 前記標的病原体がＲＳＶである、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
5. 前記複雑及び／又は不連続な中和エピトープがＲＳＶ部位０、部位ＩＩ及び部位ＩＶからなる群より選択される、請求項４に記載のワクチン組成物。
6. 前記免疫原性ペプチドが表３～表６に記載のペプチド、好ましくは表５又は表６から選択される、請求項５に記載のワクチン組成物。
7. 前記免疫原性ペプチドが、前記複雑及び／又は不連続な中和エピトープの模倣を補助するように前記模倣ペプチドを提示するスキャフォールド、好ましくはペプチドスキャフォールドを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
8. 前記スキャフォールドがＲＳＶＮ及びフェリチンから選択される、請求項７に記載のワクチン組成物。
9. 前記標的病原体に由来するネイティブ免疫原を含むワクチン組成物と組み合わせた、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
10. 本明細書に記載されるＳ０＿２．１２６ペプチド配列及び本明細書に記載されるＳ４＿２．４５ペプチド配列を含み、任意にＦＦＬ＿００１又はＦＦＬＭペプチドを更に含む、ワクチン組成物。
11. ａ）前記ワクチン組成物を被験体に投与することと、ｂ）前記投与の前に、ＲＳＶ由来のタンパク質若しくは糖タンパク質、好ましくはＲＳＶＦ糖タンパク質を含む更なるワクチン組成物を投与することとを含むか、又は請求項１～１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物を、以前にＲＳＶ感染に曝された被験体に投与する、ＲＳＶに対して被験体を免疫化する方法に使用される、前記標的病原体がＲＳＶである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
12. 模倣すべき標的ペプチドの複雑及び／又は不連続な構造配置を決定する工程と、
    アミノ酸配列を有する予備模倣ペプチドを特定する工程と、
    前記予備模倣ペプチドのアミノ酸配列の推定構造配置を、該配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析によって決定する工程と、
    前記予備模倣ペプチドに対して指向性進化を行い、前記ペプチドの様々な変異体を生成する工程と（好ましくは、指向性進化は、変異体を生成する突然変異誘発及び該変異体の発現によって行われ得る）、
    前記標的ペプチドに見られる所望の特性の改善を示す前記ペプチドの変異体を選択する工程と（前記特性は、例えば抗体等の標的に対する結合親和性；熱安定性；酵素に対する感受性又は耐性であり得る）、
    を含む、標的ペプチドの複雑及び／又は不連続な構造配置を模倣するペプチドを設計する方法。
13. 改善を有する前記変異体を複数特定する工程と、該複数の変異体から変異の組合せを有する更なるペプチドを得る工程とを更に含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記予備模倣ペプチドを特定する工程が、所望の標的ペプチドに対して構造的類似性を有するペプチドをペプチドデータベースから選択することを含み、又は前記工程が、前記予備模倣ペプチド配列が前記所望の標的ペプチドに対して構造的類似性を有するように、前記標的ペプチドのアミノ酸配列と１つ以上の構造ペプチド要素とを組み合わせることを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。

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