JP6594306B2 - キメラ表面タンパク質を有するロタウイルス粒子 - Google Patents
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Description
この出願は、2013年7月8日に出願された欧州特許出願第13175637.1号の利益を主張する。上記出願の教示全体は、参考として本明細書に援用される。
参照により本明細書に組み込まれ、出願当初の本出願の一部を形成する配列表の電子コピーをここに提出する。
この発明は、National Institutes of Healthにより付与された助成金第P01−GM062580号およびAI−89618号の下、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
ウイルス粒子
ロタウイルスは、5種の公知の型(ロタウイルスA〜E)を含むReoviridae科の中の二本鎖RNAウイルスの属である。ロタウイルスは小児胃腸炎の主要な原因である。ロタウイルスは、エンベロープを有さない三層正二十面体の粒子である。感染性三層粒子(TLP)またはビリオンは、非感染性二層粒子(DLP)から、DLPが殻タンパク質VP7およびスパイクタンパク質VP4で被覆されることによって形成される。VP7は三量体であり、被覆された粒子の外側はそのような三量体260個によって装飾されている。DLPは同心性のVP2およびVP6の正二十面体タンパク質層で構成され、直径が約700Åであり、11本の二本鎖RNAゲノムセグメント、ウイルスポリメラーゼ(VP1)、およびキャップ形成酵素(VP3)をカプシドで包む(encapsidate)。細胞の感染の間に、低カルシウム環境(おそらくエンドソーム区画内)でロタウイルス粒子の外層を形成するVP4およびVP7タンパク質は、DLPから解離し(これは「脱外被」と称されるプロセスである)、ウイルスRNA転写機構を含有するDLPを細胞質に送達する。そこで、DLPは、11本のmRNA種のコピーを合成し、それにキャップを形成し、それを放出する。
一態様では、本発明は、共有結合で異種タンパク質と連結したロタウイルス表面タンパク質を含むキメラ表面タンパク質に関する。ロタウイルス表面タンパク質は、リンカー配列を介して異種タンパク質と連結することができる。特定の実施形態では、異種タンパク質を外面に露出した部分であるロタウイルス表面タンパク質の可撓性ループに挿入する。いくつかの場合には、リンカー配列および/または異種タンパク質によりよく適応させるために、ロタウイルス表面タンパク質の部分を欠失させる。例えば、短いN末端およびC末端の短縮(≦10アミノ酸)は、一般にはロタウイルスVP7タンパク質のロタウイルスDLPを再外被形成する能力に影響を及ぼさない。さらに、VP7タンパク質がDLPの再外被形成に使用された場合には、ウイルス粒子から離れて伸長する表面ループを形成するアミノ酸配列は必ずしも必要でない。欠失がVP7タンパク質のDLPを再外被形成する能力に影響を及ぼすかどうかは、組換えによって発現させたVP7タンパク質をDLPの存在下でインキュベートし、再外被形成されたウイルス粒子の形成を観察することによって評価することができる。
本発明の実施に適するウイルス粒子の外層は、一般には、いくつかの異なる外面タンパク質を含む。主要な表面タンパク質は、ウイルス粒子の表面の大部分を覆っているので、異種タンパク質の提示に特に適している。例えば、ロタウイルスの外面(スパイクを除く)は、ホモ三量体を形成する780コピーのVP7タンパク質によって形成される。ホモ三量体を形成する主要な表面タンパク質を用いたウイルス粒子の選択が本発明の実施に特に好ましい。
三量体ロタウイルス表面タンパク質を使用して多くの異種タンパク質を提示することができるが、ただし、三量体の集合の間の単量体間の立体的な障害を回避するために、適切な長さのリンカーおよび/または表面タンパク質内の適切な挿入部位を選択する。異種タンパク質が他のマウントされた異種タンパク質の隣接する体積と重複する体積を形成しない限りは、異種タンパク質のサイズに上限はない。異種タンパク質を三量体ロタウイルス表面タンパク質上に提示するためにアダプター系を使用することが好ましい。高次オリゴマーまたは凝集体を形成する、可溶性ではない異種タンパク質は一般には本発明の実施に適するとは考えられない。
本発明の一部の実施形態では、アダプター系を使用して異種タンパク質をロタウイルス粒子上に提示する。アダプター系は、一般には2つのアダプター分子で構成される。第1のアダプター分子は、異種タンパク質が提示されるように選択されたロタウイルス表面タンパク質と共有結合で連結している。第2のアダプター分子は、異種タンパク質と共有結合で連結している。第1のアダプター分子および第2のアダプター分子は互いと相互作用して安定な複合体を形成する。
リンカー配列は、異なるタンパク質に由来するドメインを分離し、これらのドメインが適正にフォールディングされることを可能にする。多くのリンカー配列が当技術分野で公知である(参考文献18を参照されたい)。ロタウイルス表面タンパク質および/または異種タンパク質をアダプター配列から分離するためにリンカー配列を含めることができる。あるいは、ロタウイルス表面タンパク質および異種タンパク質が同じタンパク質の2つの部分を形成する場合、リンカー配列によって両方の部分を互いから分離することができる。
本発明の一部の実施形態では、ロタウイルス表面タンパク質および異種タンパク質を、異種シグナルペプチド配列を含むようにさらに改変し、好ましくはネイティブなシグナルペプチド配列を置き換える。異種シグナルペプチドを使用することは、改変ロタウイルス表面タンパク質およびロタウイルスDLPを再外被形成するための異種タンパク質を大量に調製するために使用する発現系においてより高い発現レベルを達成するために有利であり得る。したがって、異種シグナルペプチドは、選択された発現系において高レベルで発現することが公知であるタンパク質に由来する。例えば、HIVコンセンサスシグナル配列またはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)のシグナルペプチドはヒト細胞における発現に特に適している。昆虫細胞における発現のためには、バキュロウイルスgp64シグナルペプチドまたはミツバチメリチンシグナル配列を使用することができる。一般には、リンカーは、効率的なシグナルペプチド切断を保証するために異種シグナルペプチド配列の後ろに配置する。一般に、シグナルペプチドは選択された発現系に対して内在性であるシグナルペプチダーゼによって除去され、したがって、最終的なタンパク質(すなわち、発現系から回収されるロタウイルス表面タンパク質および異種タンパク質)には存在しない。
本発明は、キメラ表面タンパク質が発現系において大量に発現するようにプロモーター配列と作動的に連結した本発明のキメラ表面タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸にも関する。
本発明は、本発明の核酸によりコードされるタンパク質を発現させるための発現系にも関する。
本発明は、ロタウイルス表面タンパク質の全部または一部および第1のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第1の核酸構築物、ならびに第2の核酸構築物を含むキットであって、第2の核酸構築物が、第2のアダプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および多重クローニング部位を含み、異種タンパク質のコード領域を多重クローニング部位に挿入することにより、異種タンパク質および第2のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームがもたらされ、キメラ融合タンパク質の第1のアダプターポリペプチドと融合タンパク質の第2のアダプターポリペプチドが互いと相互作用して安定な複合体を形成する、キットをさらに提供する。
ロタウイルスDLPの再外被形成には、1つまたは2つの組換えウイルスタンパク質、外層タンパク質VP7、または外層スパイクタンパク質VP4と一緒になった外層タンパク質VP7のみが必要である。VP4およびVP7の発現および精製は、それぞれ参考文献20および21に詳しく記載されている。
ロタウイルスは、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、マウス、イヌ、ネコ、トリならびにアダックス、サイガ、オジロヌー、ハイイログマ、およびアカカンガルーなどの外来動物種を含めた多数の動物種において見いだされている。したがって、ある特定の細胞型のそれらの増殖に対する適合性は、選択されたウイルスの宿主域に依存する。確立された細胞培養系における高収量の増殖を可能にするウイルスを選択することが好ましい。
ロタウイルスDLPは、精製したロタウイルス粒子から外層タンパク質を取り除くことによって調製する。ロタウイルス粒子は、ウイルス粒子をEDTAまたはEGTAなどのカルシウムキレート化剤の存在下でインキュベートすることによって脱外被させることができる。ロタウイルス粒子の脱外被に適した緩衝液は、20mMのTris、pH8、100mMのNaClおよび1mMのEDTAを含有する[2]。ロタウイルス粒子は、熱ショックによっても脱外被させることができる。生じたDLPは、2つの連続的な前もって形成したCsCl勾配(ρ=1.25〜1.50g/cm3)でバンド形成させることによって精製することができる。
ロタウイルスDLPの再外被形成は、pH4.5および6.5を含むpH範囲で起こるが、pH5から5.5の間(好ましくはpH5.2)が最も効率的である。再外被形成は、4℃および37℃を含む温度で起こるが、37℃よりも4℃から30℃の間の方が効率的である。
本発明のいくつかの態様では、キメラ表面タンパク質の一部を形成する(例えば、2つの部分からなるアダプター系を介してロタウイルス表面タンパク質と非共有結合で結合することによって)異種タンパク質と異種タンパク質に特異的に結合する分子との間で形成される複合体の構造を研究するために、キメラ表面タンパク質を使用する。
構造決定のためにcryo−EMを使用することは、X線結晶構造解析などのより伝統的な手法と比較して、いくつかの利点を有する。具体的には、cryo−EMでは、解析される試料に対して純度、均一性および量に関して課される要件は厳しくはない。重要なことに、cryo−EMは、構造決定に適した結晶を形成しない標的に適用することができる。
cryo−EMによって得られる画像を解析して、単一粒子の顕微鏡写真を同定する。単一粒子の選択は、SIGNATUREなどのソフトウェアツールを利用して行うことができる[26]。各顕微鏡写真の非点収差焦点はずし(astigmatic defocus)、検体傾斜軸、および傾斜角度を、コンピュータプログラムCTFTILTを使用して決定することができる[23]。各粒子について、元の画像におけるその座標に応じて別々の焦点はずし値を得ることにより、ロタウイルス粒子の単一粒子の顕微鏡写真を平均することによって得られるcryo−EM密度マップのデータの品質が改善される。
X線結晶構造解析の代わりにcryo−EMを使用することにより、迅速な構造決定が容易になる。X線結晶構造解析と比較して、cryo−EMでは、解析される試料の純度、均一性および量に関して課される要件は厳しくはない。これらの特性により、cryo−EMが、特に抗原ドリフトを受ける病原体に対するワクチン用の免疫原の設計に関して魅力的なものになる。
さらなる態様では、本発明は、医薬の調製における、本発明のキメラ表面タンパク質を含むロタウイルス粒子の使用に関する。具体的には、本発明のキメラ表面タンパク質を含むロタウイルス粒子をヒトワクチン接種に適した免疫原性組成物に使用することができる。例えば、キメラ表面タンパク質を、患者に投与した際に防御免疫応答を惹起する異種タンパク質が提示されるように設計することができる。
ロタウイルスは、定義済みの宿主域を有する種々の動物株が存在するので、特に有用である。例えば、いくつかの株はウシに特異的であり、他の株はサルに特異的である。大多数の動物株は、一般には、ヒトに感染する株とは抗原性が異なり、したがって、大部分はヒトでは疾患を引き起こすことができない。したがって、一般には、ヒトは、これらのロタウイルス株に対して、これらの動物株をヒトワクチン接種のための免疫原性組成物のベクターとして使用した際にキメラ表面タンパク質に対する免疫応答に干渉し得るいかなる既存の免疫も有さない。さらに、これらのウイルスはヒトでは自然に弱毒化される。
免疫原性組成物に含まれる改変ロタウイルス粒子は、上記の方法のいずれかを使用して調製することができる。ネイティブなロタウイルス粒子を増殖させ、精製することができる。次いで、精製されたロタウイルス粒子を脱外被してDLPを調製することができ、次いでそれを、病原体由来の抗原を含むキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成させることができる。
本発明の免疫原性組成物は、凍結乾燥したロタウイルス粒子を含む第1の容器および凍結乾燥したロタウイルス粒子の即時再懸濁用の溶液を含む第2の容器を含むキットの形態で提供することができる。凍結乾燥したロタウイルス粒子は、凍結乾燥の間ロタウイルス粒子を安定化するために、スクロース、デキストラン、ソルビトールおよびアミノ酸などの1種または複数の凍結乾燥保護剤(lyoprotectant)を含んでよい。
免疫原性組成物は、粘膜免疫応答を刺激するために使用することができる。したがって、免疫原性組成物は、経口的にまたは気管内に投与することができる。本発明の免疫原性組成物に含まれる改変ロタウイルス粒子の表面上に提示される病原体由来の抗原に応じて、筋肉内注射などの他の投与経路を選択することができる。
「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)」ならびに「からなる(consisting)」を包含し、例えば、Xを「含む(comprising)」組成物は、Xから排他的になってもよく、追加的な何かを含み、例えばX+Yであってもよい。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
異種タンパク質と連結したロタウイルス表面タンパク質を含むキメラ表面タンパク質を含む組成物であって、前記ロタウイルス表面タンパク質が、2つの部分からなるアダプター系によって前記異種タンパク質と非共有結合で連結しており、前記アダプター系の一方の部分が前記ロタウイルス表面タンパク質と連結し、前記アダプターの他方の部分が前記異種タンパク質と連結し、それにより、前記アダプター系の両部分が互いと安定な複合体を形成している、組成物。
(項目2)
前記アダプターの一方の部分が第1のアダプターポリペプチドによって形成され、前記アダプターの他方の部分が第2のアダプターポリペプチドによって形成され、前記第1のアダプターポリペプチドと前記第2のアダプターポリペプチドが互いと相互作用して安定な複合体を形成している、項目1に記載のキメラ表面タンパク質。
(項目3)
前記第1のアダプターポリペプチドが、任意選択でリンカー配列を介して前記ロタウイルス表面タンパク質と融合しており、前記第2のアダプターポリペプチドが、任意選択でリンカー配列を介して前記異種タンパク質と融合している、項目2に記載のキメラ表面タンパク質。
(項目4)
前記第1のアダプターポリペプチドおよび前記第2のアダプターポリペプチドが7アミノ酸反復配列を含む、項目2または3に記載のキメラ表面タンパク質。
(項目5)
項目1から4までのいずれか一項に記載のキメラ表面タンパク質を含むロタウイルス粒子。
(項目6)
医薬として使用するための、項目5に記載のロタウイルス粒子。
(項目7)
(a)ロタウイルス表面タンパク質、第1のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、ならびに
(b)異種タンパク質、第2のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
を含む、核酸組成物であって、
任意選択で、前記オープンリーディングフレームはプロモーター配列と作動的に連結している、核酸組成物。
(項目8)
前記アダプターポリペプチドが7アミノ酸反復配列を含む、項目7に記載の核酸組成物。
(項目9)
(a)ロタウイルス表面タンパク質および第1のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第1の核酸、ならびに第2のアダプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および多重クローニング部位を含む第2の核酸であって、異種タンパク質のコード領域を前記多重クローニング部位に挿入することにより、前記異種タンパク質および前記第2のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームがもたらされる、第2の核酸、あるいは
(b)ロタウイルス表面タンパク質および第1のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第1の核酸、ならびに異種タンパク質および第2のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする第2の核酸
を含む、キットであって、
前記第1のアダプターポリペプチドと前記第2のアダプターポリペプチドとが安定な複合体を形成することができ、
任意選択で、前記キットは、前記ロタウイルス表面タンパク質と同じ種のロタウイルスに由来するかまたは異なるロタウイルス種に由来するロタウイルス粒子をさらに含む、キット。
(項目10)
項目5に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、外層を含むロタウイルス粒子を、培養培地中で成長させた細胞において増殖させるステップ、前記ロタウイルス粒子を前記培養培地から精製するステップ、前記外層を前記ロタウイルス粒子から取り除いてロタウイルス二層粒子(DLP)を得るステップ、および前記ロタウイルスDLPを項目1から4までのいずれか一項に記載のキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成して項目5に記載のロタウイルス粒子をもたらすステップを含む、方法。
(項目11)
項目5に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、外層を含むロタウイルス粒子を、培養培地中で成長させた細胞において増殖させるステップ、前記ロタウイルス粒子を前記培養培地から精製するステップ、前記外層を前記ロタウイルス粒子から取り除いてロタウイルスDLPを得るステップ、ならびに、前記ロタウイルスDLPを、三量体形成性ロタウイルス表面タンパク質、7アミノ酸反復配列、および任意選択でリンカー配列を含む第1の融合タンパク質を用いて再外被形成するステップ、ならびに、再外被形成された前記ロタウイルスDLPを、三量体形成性異種タンパク質、7アミノ酸反復配列、および任意選択でリンカー配列を含む第2の融合タンパク質と混合して項目5に記載のロタウイルス粒子をもたらすステップを含む、方法。
(項目12)
項目5に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、三量体形成性ロタウイルス表面タンパク質、7アミノ酸反復配列、および任意選択でリンカー配列を含む第1の融合タンパク質を含むロタウイルス粒子を、三量体形成性異種タンパク質、7アミノ酸反復配列、および任意選択でリンカー配列を含む第2の融合タンパク質と混合するステップを含む、方法。
(項目13)
異種タンパク質の構造を決定するための方法であって、前記方法は、(i)ロタウイルスDLPを、異種タンパク質の全部または一部を含むキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成して、前記キメラ表面タンパク質を提示しているロタウイルス粒子の懸濁物をもたらすステップ、(ii)前記懸濁物を凍結させるステップ、(iii)cryo−EMを使用して前記ロタウイルス粒子を画像化して複数の顕微鏡写真を得るステップ、および(iv)前記複数の顕微鏡写真を解析して前記キメラ表面タンパク質の3次元モデルを得るステップを含む、方法。
(項目14)
分子との複合体中の異種タンパク質の構造を決定するための方法であって、前記方法は、(i)ロタウイルスDLPを、異種タンパク質の全部または一部を含むキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成して、前記キメラ表面タンパク質を提示しているロタウイルス粒子の懸濁物をもたらすステップ、(ii)前記懸濁物に、前記異種タンパク質に特異的に結合する分子を添加するステップであって、前記分子が前記キメラ表面タンパク質と複合体を形成するステップ、(iii)前記懸濁物を凍結させるステップ、(iv)cryo−EMを使用して前記ロタウイルス粒子を画像化して複数の顕微鏡写真を得るステップ、および(vi)前記複数の顕微鏡写真を解析して前記分子と複合体を形成した前記キメラ表面タンパク質の3次元モデルを得るステップを含む、方法。
(項目15)
前記分子が、タンパク質性分子、例えば(a)前記異種タンパク質に特異的に結合する抗体もしくはその断片、または(b)細胞表面受容体であって、ここで前記異種タンパク質がウイルス細胞侵入タンパク質であり、かつ前記タンパク質性分子に前記ウイルス細胞侵入タンパク質が結合する、細胞表面受容体である、項目14に記載の方法。
改変組換えVP7、HAおよびHIV gp140タンパク質のための発現ベクターの構築
アカゲザルロタウイルス(RRV)G3株の野生型VP7遺伝子を標準の手順によってpFastBacDualベクター(Invitrogen(商標))のBamH I制限部位とNot I制限部位の間にクローニングした。VP7コード配列の5’末端側、開始コドンの前にコザック配列(GCCACC;配列番号19)を設計した。VP7コード配列の改変を逆PCRによって行った。プライマーの末端に関連する改変を含有する、適切なアニーリング温度のプライマーを設計した。図1Aは、ロタウイルスコード配列に加えた種々の改変を示す。
安定なVP7−HA複合体の調製
HA−VP7複合体を作製するために、1mL当たり2×106個の密度のHi5細胞に0.5%VP7バキュロウイルスおよび1.0%HAバキュロウイルスを5.0%熱失活FBS(Sigma−Aldrich)の存在下で感染させた。感染の5日後に、細胞を4000×gで45分遠心沈殿することによって培地を採取した。上清を、Cogent M Tangential Flow Filtration System(Millipore)において、10KDaのカットオフのフィルターを使用して、1×TNC(20mMのTris、pH8.0、100mMのNaCl、および1.0mMのCaCl2;0.02%アジ化ナトリウムを補充した)8リットルに対してダイアフィルトレーションした。緩衝液を交換した試料に1.0mMのPMSFを補充し、JA10ローター(Beckman(商標))において10,000RPMで1時間遠心分離することによって清澄化した。StrepTactin(登録商標)カラム(IBA(商標))、その後、NiNTAカラム(Qiagen(商標))、およびSuperose 6カラム(Amersham(商標))によってタンパク質複合体を上清から精製した。
安定なHIV gp140−VP7複合体の調製
それぞれ配列番号22、26、32および36ならびに配列番号64、66、68および70のタンパク質をコードする改変VP7およびgp140遺伝子を、哺乳動物細胞において発現させるために、pVRC8400およびpVRC−IRES−Puroベクターに、Sal IとNot Iの間にサブクローニングした。VP7遺伝子のシグナルペプチドをヒトtPAシグナルペプチドに変え、gp140遺伝子のシグナルペプチドをHIVコンセンサスシグナルペプチド配列に変えた。生じた改変VP7タンパク質および改変gp140タンパク質は、それぞれ配列番号42〜45ならびに配列番号65、67、69および71のアミノ酸配列を有する。改変VP7タンパク質と改変gp140タンパク質の以下の組合せについて同時発現および複合体の形成を試験した:配列番号42+65、配列番号42+67、配列番号43+65、配列番号43+67、配列番号44+69、配列番号44+71、配列番号45+69、配列番号45+71。
FabおよびFvの調製
モノクローナル抗体CR6261は、インフルエンザHAタンパク質の膜近位ステム内の高度に保存されたヘリックス領域を認識する[67]。CR6261 sHgL Fab断片についての構造因子および座標はProtein Data Bankに受託4EVNの下に寄託されており(先の出願の出願日に入手可能なバージョンで参考として本明細書に援用される)、以前に記載されている[68]。
DLPの調製
アカゲザルロタウイルス血清型G3をMA−104細胞に感染させることによって増幅した。簡単に述べると、10%ウシ胎仔血清(HyClone(商標) Laboratories)、10mMのHEPES、pH7.0、2mMのL−グルタミン、および100単位/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを補充したM199培地(Gibco(登録商標))中でMA104細胞を成長させた。細胞を維持し、10−スタック細胞培養チャンバー(Corning(商標))またはローラーボトルにスケールアップした。細胞がコンフルエントになったら、ロタウイルス接種および増幅のために培地を1μg/mLのブタ膵臓トリプシン(Sigma−Aldrich(登録商標))を補充した無血清MA199と交換した。感染の約36〜42時間後に、感染させたMA104細胞の培地を採取し、後で使用するために−80℃で保管した。
HA−VP7複合体を用いたDLPの再外被形成
実施例5で得られたDLPと実施例1で調製された改変ロタウイルスVP7タンパク質を混合し、5〜10mMのCaCl2の存在下、4℃で少なくとも1時間インキュベートした。生じた粒子を陰性染色し、EMを使用して可視化した。各粒子を覆う単一のVP7層が観察され、これにより、改変VP7タンパク質によりDLPの再外被形成ができることが確認された(図3B)。
HA−VP7−抗体複合体の3次元画像再構築
高分解能cryo−EMは、特に多数の分子複合体の迅速な構造解明が必要とされる分野で大きな分子複合体を解析するための最適な方法としてのX線結晶構造解析と置き換わる潜在性がある。そのような分野の1つは、抗原ドリフトにより免疫優性表面抗原であるHAタンパク質の配列に急速な変化が生じるインフルエンザのワクチン設計である。広範に防御的なモノクローナル抗体が以前に同定されており、これらの抗体の多くは、急速な変化を受けない保存されたエピトープを認識する。新興のインフルエンザ株に対する防御剤としてのそれらの適合性を調査するために、これらの広範な中和性抗HA抗体をHAタンパク質の種々の改変体に対してスクリーニングする必要がある。
ロタウイルスDLP上にマウントしたHA−VP7タンパク質複合体を用いた免疫化研究
雌6〜8週齢BALB/cマウスを、それぞれカルシウムを含有する緩衝液100μl中に製剤化した3つの異なる製剤のうちの1つを用いて、3週間の間隔で3回、筋肉内に(IM)免疫化する。第1群にはロタウイルスDLP上にマウントした製剤化HA−VP7タンパク質複合体を与え、第2群には、精製HAを与え、第3群にはVP7で再外被形成されたDLPと混合した精製HAを与える。マウスの第4群には緩衝液100μlを模擬注射する。実験は、各群に対して様々な用量を含み得る。等価な量の抗原を使用して、種々の形式の相当する用量の抗原に対する免疫応答を比較することができる。あるいは、等価な量の総タンパク質を使用して、種々の量の総タンパク質に対する免疫応答を比較することができる。
アジュバントを用いた場合と用いていない場合の、ロタウイルスDLP上にマウントしたHA−VP7タンパク質複合体を用いた免疫化研究
雌BALB/cマウスを、0日目、21日目、および42日目に、以下の表4に示されている通り0.3〜15μgの精製抗原H1N1赤血球凝集素(HA)タンパク質複合体を用いて、後部四頭筋に2回、両側に50μlを筋肉内注射することにより免疫化する。
Claims (22)
- 異種タンパク質と連結した三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質を含むキメラ表面タンパク質複合体であって、前記三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質が、2つの部分からなるアダプター系によって前記異種タンパク質と非共有結合で連結しており、前記アダプター系の一方の部分が前記三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質に融合された第1のアダプターポリペプチドによって形成され、前記アダプターの他方の部分が前記異種タンパク質に融合された第2のアダプターポリペプチドによって形成され、それにより、前記アダプター系の両部分が互いと安定な複合体を形成しており、前記キメラ表面タンパク質複合体は、二層ロタウイルス粒子をin vitroにおいて前記キメラ表面タンパク質複合体を用いて再外被形成することによってロタウイルス粒子の外層の一部になり得る、キメラ表面タンパク質複合体。
- 前記第1のアダプターポリペプチドが、リンカー配列を介して三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質に融合される、請求項1に記載のキメラ表面タンパク質複合体。
- 前記第2のアダプターポリペプチドが、リンカー配列を介して前記異種タンパク質に融合される、請求項1または2に記載のキメラ表面タンパク質複合体。
- 前記第1のアダプターポリペプチドおよび前記第2のアダプターポリペプチドが7アミノ酸反復配列を含む、請求項1から3までのいずれか一項に記載のキメラ表面タンパク質複合体。
- 請求項1から4までのいずれか一項に記載のキメラ表面タンパク質複合体を含むロタウイルス粒子。
- 異種タンパク質と連結した三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質を含むキメラ表面タンパク質複合体を含む組成物であって、前記三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質が、2つの部分からなるアダプター系によって前記異種タンパク質と非共有結合で連結しており、前記アダプター系の一方の部分が前記三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質に融合された第1のアダプターポリペプチドによって形成され、前記アダプターの他方の部分が前記異種タンパク質に融合された第2のアダプターポリペプチドによって形成され、それにより、前記アダプター系の両部分が互いと安定な複合体を形成しており、前記キメラ表面タンパク質複合体は、二層ロタウイルス粒子をin vitroにおいて前記キメラ表面タンパク質複合体で再外被形成することによってロタウイルス粒子の外層の一部になり得る、組成物。
- 前記第1のアダプターポリペプチドが、リンカー配列を介して三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質に融合される、請求項6に記載の組成物。
- 前記第2のアダプターポリペプチドが、リンカー配列を介して前記異種タンパク質に融合される、請求項6または7に記載の組成物。
- (a)三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質および第1のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、ならびに
(b)異種タンパク質および第2のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
を含む、核酸組成物であって、
前記第1のアダプターポリペプチドおよび前記第2のアダプターポリペプチドが互いと安定な複合体を形成し、したがって、キメラ表面タンパク質複合体をもたらすことができ、前記キメラ表面タンパク質複合体は、二層ロタウイルス粒子をin vitroにおいて前記キメラ表面タンパク質複合体を用いて再外被形成することによってロタウイルス粒子の外層の一部になり得る、核酸組成物。 - (a)の前記オープンリーディングフレームがさらにリンカー配列をコードする、請求項9に記載の核酸組成物。
- (b)の前記オープンリーディングフレームがさらにリンカー配列をコードする、請求項9または10に記載の核酸組成物。
- 前記オープンリーディングフレームがプロモーター配列と作動的に連結している、請求項9から11までのいずれか一項に記載の核酸組成物。
- 前記アダプターポリペプチドが7アミノ酸反復配列を含む、請求項9から12までのいずれか一項に記載の核酸組成物。
- (a)(i)三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質および第1のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第1の核酸、ならびに(ii)第2のアダプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および多重クローニング部位を含む第2の核酸であって、異種タンパク質のコード領域を前記多重クローニング部位に挿入することにより、前記異種タンパク質および前記第2のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームがもたらされる、第2の核酸、あるいは
(b)(i)三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質および第1のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第1の核酸、ならびに(ii)異種タンパク質および第2のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする第2の核酸
を含む、キットであって、
前記第1のアダプターポリペプチドと前記第2のアダプターポリペプチドとが安定な複合体を形成し、したがって、キメラ表面タンパク質複合体をもたらすことができ、前記キメラ表面タンパク質複合体は、二層ロタウイルス粒子をin vitroにおいて前記キメラ表面タンパク質複合体を用いて再外被形成することによってロタウイルス粒子の外層の一部になり得る、キット。 - 前記キットは、前記三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質と同じ種のロタウイルスに由来するかまたは異なるロタウイルス種に由来するロタウイルス粒子をさらに含む、請求項14に記載のキット。
- 請求項5に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、
外層を含むロタウイルス粒子を、培養培地中で成長させた細胞において増殖させるステップ、
前記ロタウイルス粒子を前記培養培地から精製するステップ、
前記外層を前記ロタウイルス粒子から取り除いてロタウイルス二層粒子(DLP)を得るステップ、および
前記ロタウイルスDLPを請求項1から4までのいずれか一項に記載のキメラ表面タンパク質複合体を用いて再外被形成して請求項5に記載のロタウイルス粒子をもたらすステップを含む、方法。 - 請求項5に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、
外層を含むロタウイルス粒子を、培養培地中で成長させた細胞において増殖させるステップ、
前記ロタウイルス粒子を前記培養培地から精製するステップ、
前記外層を前記ロタウイルス粒子から取り除いてロタウイルスDLPを得るステップ、ならびに、
前記ロタウイルスDLPを、三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質、7アミノ酸反復配列を含む第1のアダプターポリペプチドを含む第1の融合タンパク質を用いて再外被形成するステップ、ならびに、
再外被形成された前記ロタウイルスDLPを、三量体形成性異種タンパク質、7アミノ酸反復配列を含む第2のアダプターポリペプチドを含む第2の融合タンパク質と混合して請求項5に記載のロタウイルス粒子をもたらすステップを含む、方法。 - 前記第1の融合タンパク質がさらにリンカー配列を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の融合タンパク質がさらにリンカー配列を含む、請求項17または18に記載の方法。
- 請求項5に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、三量体形成性ロタウイルスVP7表面タンパク質、7アミノ酸反復配列を含む第1のアダプターポリペプチドを含む第1の融合タンパク質を含むロタウイルス粒子を、三量体形成性異種タンパク質、7アミノ酸反復配列を含む第2のアダプターポリペプチドを含む第2の融合タンパク質と混合するステップを含む、方法。
- 前記第1の融合タンパク質がさらにリンカー配列を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記第2の融合タンパク質がさらにリンカー配列を含む、請求項20または21に記載の方法。
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