CN116615235A - 融合前稳定的hmpv f蛋白 - Google Patents

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贾森·麦克莱伦
谢庆林
斯科特·鲁什
王念双
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Abstract

本文提供了工程化hMPV F蛋白。在一些方面，所述工程化F蛋白表现出增强的构象稳定性和/或抗原性。还提供了使用所述工程化F蛋白作为诊断剂、在筛选平台使用所述工程化F蛋白和/或在疫苗组合物中使用所述工程化F蛋白的方法。

Description

融合前稳定的HMPV F蛋白
相关申请的引用
本申请要求2020年10月9日提交的美国临时申请号63/089,978的优先权权益，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
序列表的引用
本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式经由EFS-Web提交并且特此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2021年10月7日，名为UTFBP1250WO_ST25.txt，并且大小为50.6千字节。
背景技术
1.技术领域
本公开总体上涉及医学、病毒学、免疫学和蛋白质工程领域。更具体地，本公开涉及工程化的人偏肺病毒(hMPV)F蛋白及其在药物设计和疫苗配制中的用途。
2.相关技术的描述
人偏肺病毒(hMPV)是肺病毒科的一种呼吸道病毒，其在2001年被发现之前已经在人类中传播了至少半个世纪(van den Hoogen等人，2001)。到5岁时感染几乎无处不在，而再次感染仍然是终生的负担(van den Hoogen等人，2001)。然而，婴儿(6-12个月)、老年人和免疫功能低下的人群因肺炎和毛细支气管炎等更严重的疾病而住院的风险增加(Deffrasnes等人，2007)。尽管hMPV带来了疾病负担，但尚无疫苗或治疗剂被批准用于预防或治疗。作为肺病毒科的一员——最近从副粘病毒科的一个亚科进化而来——hMPV是一种有包膜的负义RNA病毒。此家族内的病毒编码三种表面表达的膜蛋白。对于hMPV，这些是小疏水(SH)、附着(G)和融合(F)蛋白(Shafagati&Williams,2018)。
作为I类病毒融合糖蛋白，hMPV F首先被翻译为单个多肽前体(F0)。蛋白水解切割将F0转化为二硫键连接的F2和F1亚基(图1A)。然后，三个F2/F1异二聚体结合成亚稳态融合前三聚体，构成蛋白质的活性形式。在细胞培养中，这种蛋白水解激活可以通过添加胰蛋白酶来实现，胰蛋白酶在一元切割位点切割蛋白质(van den Hoogen等人，2001；Skiadopoulos等人，2006；Schickli等人，2005)。在自然感染期间，hMPV F0被胰蛋白酶样细胞外丝氨酸蛋白酶(诸如TMPRSS2)切割，尽管这种情况在生产细胞与靶细胞中发生的程度尚未明确(Shirogane等人，2008)。成熟F1亚基的N端含有称为融合肽的疏水序列，其位于融合前F三聚体的内腔内(Battles等人，2017)。对于其他I类融合蛋白，诸如人呼吸道合胞病毒F(RSVF)和流感血凝素(HA)，已表明三聚体不稳定并且可以瞬时张开或“呼吸”(Bangaru等人，2019；Watanabe等人，2019；Gilman等人，2019)。最近描述了一种靶向hMPV F三聚体界面的人抗体，表明融合前hMPV F在体内经历了这种瞬时开放(Huang等人，2020)。为了促进膜融合，亚稳态融合前F蛋白经历了实质性的构象变化，将融合肽释放并延伸到宿主细胞膜中。这种不稳定的前发夹中间体折叠回自身形成高度稳定的六螺旋束，其由N端和C端七肽重复区(分别为HRA和HRB)的三聚体构成，称为融合后构象(Más等人，2016)。鉴于其在病毒进入中的关键作用，hMPV候选疫苗通常包括F蛋白。换句话说，hMPV的潜在疫苗接种策略是通过靶向其融合(F)糖蛋白，该糖蛋白对病毒感染至关重要。然而，仍然需要可用于鉴定候选药物和用于刺激对F蛋白的有效免疫反应的稳定F蛋白。
发明内容
因此，本文提供了热稳定的hMPV F融合前构象变体。引入配对胱氨酸突变以引入二硫键改善了蛋白质的表达和热稳定性。单独的疏水、静电相互作用和电荷减少突变也是有益的。此外，组合多个有益突变进一步改善了所需的蛋白质特征。
在一个实施方案中，本文提供了包含偏肺病毒(MPV)F蛋白胞外结构域的工程化蛋白质，所述偏肺病毒(MPV)F蛋白胞外结构域与(i)SEQ ID NO:1、2和4-7中的任一者的氨基酸19-489，或者(ii)SEQ ID NO:3的氨基酸19-484具有至少90％的同一性，所述工程化蛋白质包含至少一个相对于SEQ ID NO:1-7中的任一者的序列的突变，所述至少一个突变包含在对应于以下的位置处的取代：K166、N342、A/D185、K188、T49、V262、H435、E26、G439、N46、L158、A161、L50、V162、E51、R163、V104、N457、L110、N322、A113、D336、A116、A338、A140、A147、S291、S443、S293、S444、S355、V442、T365、V463、S22、G53、V169、E305、L302、V47、A159、T127、N153、G121、I/F258、G106、A107、T160、I128、A190、V118、Q426、L165、V191、S149、I137、V/I122、S192、T317、L105、L134、A117、S347、G261、I268、S470、L473、S265、L460、F48、Q455、V231、A374、I217、S376、G366、S194、L219 A344、A86、T114、V148、D461、L66、L73、N145、Q195、E453和/或H368。在一些方面，所述工程化蛋白质与(i)SEQ ID NO:1、2和4-7中的任一者的氨基酸19-489，或(ii)SEQ ID NO:3的氨基酸19-484具有至少95％的同一性。SEQ ID NO:1对应于BV-115变体序列。SEQ ID NO:2对应于JSM-1147变体序列。SEQ ID NO:3对应于DW-1变体序列。SEQ ID NO:4对应于hMPV A1 NL/1/00毒株F蛋白(GenBank:AAK62968.2)。SEQ IDNO:5对应于hMPV A2 NL/00/17毒株F蛋白(GenBank:ACJ70115.1)。SEQ ID NO:6对应于hMPVB1 NL/1/99毒株F蛋白(GenBank:AY525843.1)。SEQ ID NO:7对应于hMPV B2 TN/99/419毒株F蛋白(GenBank:AAS92882.1)。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于A/D185P的脯氨酸取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于RQSR(SEQ ID NO:4-7中的任一者的残基99-102；SEQ ID NO:9)至RRRR(SEQ ID NO:1-3中的任一者的残基99-102；SEQ ID NO:10)的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于A/D185P的脯氨酸取代和对应于RQSR(SEQ ID NO:4-7中的任一者的残基99-102；SEQ ID NO:9)至RRRR(SEQ ID NO:1-3中的任一者的残基99-102；SEQID NO:10)的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于SEQ ID NO:1-7中的任一者的残基87-104至GGGGSGGGGSR(SEQ ID NO:8)的取代。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于以下的配对半胱氨酸取代：E26C和G439C；N46C和L158C；T49C和A161C；L50C和V162C；E51C和R163C；E51C和K166C；V104C和N457C；L110C和N322C；A113C和D336C；A116C和A338C；A140C和A147C；S291C和S443C；S293C和S443C；S293C和S444C；S355C和V442C；T365C和V463C；S22C和H435C；G53C和K166C；G53C和V169C；E305C和N457C；S291C和L302C；V47C和A159C；T127C和N153C；G121C和I/F258C；F48C和T160C；和/或T365C和Q455C。在一些方面，所述工程化蛋白质包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于以下的配对半胱氨酸取代：A116C和A338C；T365C和V463C；T127C和N153C；T365C和Q455C；V104C和N457C；L110C和N322C；或A140C和A147C。在一些方面，所述工程化蛋白质包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于A140C和A147C的配对半胱氨酸取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于V104C和N457C的配对半胱氨酸取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于L110C和N322C的配对半胱氨酸取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于T365C和V463C的配对半胱氨酸取代。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含在对应于L219和/或V231的位置处的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于L219K和/或V231I的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于T127C和N153C的配对半胱氨酸取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于L110C和N322C的配对半胱氨酸取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于A140C和A147C的配对半胱氨酸取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于G366S的取代。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含在对应于Q426、T49、L187、L473和/或S347的位置处的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于Q426W、T49E、L187F、L473F和/或S347Q的取代。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于A116C和A338C的配对半胱氨酸取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于T365C和V463C的配对半胱氨酸取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于T127C和N153C的配对半胱氨酸取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于T365C和Q455C的配对半胱氨酸取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含至少一个额外的工程化二硫键。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含在对应于以下的位置处的空腔填充取代：G106、A107、T160、L158、I128、A190、V118、Q426、L165、V191、T160、S149、I137、S149、V169、N46、T49、V/I122、S192、T317、V162、L105、L134、A117、S347、V47、G261、I268、S470、V231、A374、I217和/或S355。在一些方面，所述工程化蛋白质包含在对应于以下的位置处的空腔填充取代：L105、V118、I137、S149、L158、L165或Q426。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于L105I或L105W的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于L158W的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于V118F或V118M的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于Q426W的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于L165F的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于S149V或S149I的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含在对应于I137的位置处的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于I137L的取代。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含选自由以下组成的组的空腔填充取代：G106W、A107F、T160M、L158W、I128F、A190M、V118F、V118M、Q426W、L165F、V191I、T160V、S149V、I137L、S149I、V169I、N46V、T49I、V/I122L、S192L、T317L、V162F、V162W、L105I、L105F、L105W、L134I、A117M、S347M、S347K、S347Q、V47M、G261M、I268M、S470Y、V231I、A374V、I217V和/或S355F。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含选自由以下组成的组的脯氨酸取代：A86P、A107P、A113P、T114P、V148P、S443P、D461P、L130P、L141P、K142P、E146P、L151P、N153P、V162P、A/D185P、D186P、L187P、K188P、N342P和A344P。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含在对应于S376、G366和/或S194的位置处的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于S376T、G366S和/或S194Q的取代。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含在对应于K166的位置处的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于K166E的取代。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含在对应于H435的位置处的调节pH敏感性的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于H435E、H435D或H435N的取代。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含在对应于L66、L73、N145、Q195、E453、L66、K188、H368、D461、T49和/或V262的位置处的静电相互作用取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于L66N、L73E、N145E、Q195K、E453Q、L66D、K188R、H368R、D461E、T49E和/或V262D的取代。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于L110C、T127C、A140C、A147C、N153C、L219K、V231I、N322C、T365C、E453Q和/或V463C的取代。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于T127C、N153C、A185P、T365C、V463C、L219K和V231I的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于T127C、N153C、A185P、T365C、V463C、L219K、V231I和RQSR(SEQ ID NO:1-7中的任一者的残基99-102)至RRRR(SEQID NO:10)的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于T127C、N153C、T365C、V463C、L219K和V231I的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含与SEQ ID NO:14或16至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的多肽序列。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于L110C、T127C、A140C、A147C、N153C、A185P、L219K、V231I、N322C、T365C、N368H、E453Q和V463C的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于L110C、T127C、A140C、A147C、N153C、A185P、L219K、V231I、N322C、T365C、N368H、E453Q、V463C和RQSR(SEQ ID NO:1-7中的任一者的残基99-102)至RRRR(SEQ ID NO:10)的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于L110C、T127C、A140C、A147C、N153C、L219K、V231I、N322C、T365C、N368H、E453Q和V463C的取代。在一些方面，所述工程化蛋白质包含与SEQ ID NO:15或17至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的多肽序列。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含对应于SEQ ID NO:1-7中的任一者的残基87-104至GGGGSGGGGSR(SEQ ID NO:8)的取代。
在一些方面，所述工程化蛋白质可包含表1中公开的任何一组取代。在一些方面，所述工程化蛋白质可包含表1中公开的任何一组取代与对应于A/D185P的脯氨酸取代的组合。在一些方面，所述工程化蛋白质可包含表1中公开的任何一组取代与对应于RQSR(SEQID NO:4-7中的任一者的残基99-102；SEQ ID NO:9)至RRRR(SEQ ID NO:1-3中的任一者的残基99-102；SEQ ID NO:10)的取代的组合。在一些方面，所述工程化蛋白质可包含表1中公开的任何一组取代与对应于A/D185P的脯氨酸取代和对应于RQSR(SEQ ID NO:4-7中的任一者的残基99-102；SEQ ID NO:9)至RRRR(SEQ ID NO:1-3中的任一者的残基99-102；SEQ IDNO:10)的取代的组合。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含至少一个工程化二硫键、至少一个空腔填充取代和至少一个脯氨酸取代的组合。
在一些方面，所述工程化蛋白质与SEQ ID NO:1-3中的任一者的氨基酸序列具有至少95％的同一性。在一些方面，所述工程化hMPV F蛋白胞外结构域与SEQ ID NO:3具有95％的同一性。
在一些方面，所述工程化蛋白质与三聚化结构域融合或缀合至三聚化结构域。在一些方面，所述工程化蛋白质与三聚化结构域融合或缀合至三聚化结构域。在一些方面，所述三聚化结构域包含T4纤维蛋白(fibritin)三聚化结构域。
在一些方面，所述工程化蛋白质与跨膜结构域融合或缀合至跨膜结构域。在一些方面，所述工程化蛋白质与跨膜结构域融合。在一些方面，所述跨膜结构域包含偏肺病毒(MPV)F蛋白跨膜结构域。
在一些方面，所述工程化蛋白质包含N端信号序列。在一些方面，所述N端信号序列是MSWKVMIIISLLITPQHG(SEQ ID NO:6或7的残基1-18；SEQ ID NO:11)。在一些方面，所述N端信号序列是MSWKVVIIFSLLITPQHG(SEQ ID NO:1-5中的任一者的残基1-18)。
在一个实施方案中，本文提供了工程化偏肺病毒(MPV)F蛋白三聚体，其包含至少一个根据本发明的工程化蛋白质实施方案中任一项所述的亚基。在一些方面，相对于野生型偏肺病毒(MPV)F亚基的三聚体，所述三聚体稳定在融合前构象。在一些方面，所述三聚体包含至少一个在亚基之间的工程化二硫键。在一些方面，所述至少一个在亚基之间的工程化二硫键是通过对应于S316C和D421C的取代形成的。
在一个实施方案中，本文提供了药物组合物，其包含药学上可接受的载体；以及(i)如本发明工程化蛋白质实施方案中任一项所述的工程化蛋白质，或(ii)如工程化三聚体实施方案中任一项所述的工程化三聚体。在一些方面，所述药物组合物还包含佐剂。
在一个实施方案中，本文提供了核酸分子，其包含编码如本发明工程化蛋白质实施方案中任一项所述的工程化蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些方面，所述核酸包含DNA表达载体。在一些方面，所述核酸包含mRNA。
在一个实施方案中，本文提供了预防受试者的偏肺病毒(MPV)感染或与偏肺病毒感染相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如本发明药物组合物实施方案中任一项所述的药物组合物或如本发明核酸分子实施方案中任一项所述的核酸分子。
在一个实施方案中，本文提供了组合物，其包含与抗体结合的如本发明实施方案中任一项所述的工程化蛋白质。
通过下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应理解的是，尽管指示本发明的优选实施方案，但是详细描述和具体实施例仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步展示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1A-图1B.用于hMPV F稳定化的有益取代。(图1A)hMPV F蛋白胞外结构域的示意图。二硫键联和N-糖基化位点突出显示。指示F1和F2的开始和结束的残基编号显示在条形下方。(图1B)处于融合前构象的三聚体hMPV F胞外结构域的侧视图(PDB ID:5WB0)。一个原体(protomer)显示为带状图，而另外两个显示为白色分子表面。每个插图对应于取代所处的抗原位点。
图2A-图2D.单取代hMPV F变体的表征。(图2A)纯化的个别变体的相对表达，通过SEC峰分数的曲线下面积(AUC)计算。变体按设计分组。水平虚线表示计算的基础构建体的AUC浓度，将其归一化为100％以进行比较。(图2B)纯化的F变体的尺寸排阻色谱(SEC)，按设计(脯氨酸、极性、空腔填充和二硫键)分组。垂直虚线表示hMPV F基础构建体的峰保留体积。(图2C)二硫键变体的热稳定性的差示扫描荧光法(DSF)分析。垂直虚线表示基础构建体的解链温度。(图2D)hMPV F基础构建体和单取代F变体的SDS-PAGE分析。分子量标准以kDa为单位显示在左侧。
图3A-图3D.显示各种F蛋白取代变体表达的电泳凝胶图像：(图3A)空腔突变、(图3B)二硫键突变、(图3C)脯氨酸突变和(图3D)静电突变。分子量标准以kDa为单位显示在左侧。
图4A-图4F.多取代hMPV F变体的表征。(图4A-图4C)来自三个迭代循环的纯化的多取代hMPV F变体的SEC。垂直虚线表示hMPV F基础构建体的峰保留体积。(图4D)多取代F变体的热稳定性的DSF分析。垂直虚线表示基础构建体的解链温度。(图4E)从1LFreeStyle293-F细胞培养物中纯化的DS-CavEs2的SEC迹线。(图4F)通过生物层干涉测量法测量的热处理或长期储存的DS-CavEs2与MPE8 Fab的结合。垂直虚线表示关联事件的结束。未处理的DS-CavEs2作为对照包括在内。
图5.F蛋白取代变体热稳定性的差示扫描荧光法(DSF)分析。垂直虚线表示JSM-1147的第一解链温度。
图6.纯化的F蛋白取代变体的尺寸排阻色谱。垂直虚线表示BaseCon的特征峰保留体积。
图7A-图7C.与融合前优选的抗体MPE8结合的工程化hMPV F变体。(图7A)与MPE8Fab结合的hMPV F变体(DSx2)的原子模型的侧视图，显示为带状图。为清楚起见，省略了MPE8 Fab的恒定区。DSx2中两个二硫键取代的侧链以棒状突出显示。(图7B)MPE8轻链CDR和F蛋白的抗原位点II/V的结合界面的放大视图。(图7C)MPE8重链CDR和F的结合界面的放大视图。CDR3的主链针对抗原位点III进行堆积，所述抗原位点III突出显示为透明表面。形成极性相互作用的关键残基以棒状显示。
图8A-图8B.hMPV F DS-CavEs2的结构表现出融合前构象。(图8A)处于融合前构象的apo hMPV F变体(DS-CavEs2)的原子模型的侧视图。模型(砖红带)叠加融合前F结构(银带，PDB ID:5WB0)。引入的取代的侧链以棒状突出显示。每个插图对应于进行叠加的抗原位点。(图8B)与MPE8 Fab复合的DS-CavEs2的代表性2D类平均(class average)。
图9.hMPV F DSx2与相关的PDB结构5WB0的结构比较。来自PDBID:5WB0(hMPV F)的单个原体和hMPV F DSx2的叠加。
具体实施方式
人偏肺病毒(hMPV)融合(F)蛋白对于病毒进入至关重要，并且是中和抗体和疫苗开发的关键靶标。融合前构象被认为是最佳的疫苗抗原，但先前描述的融合前F蛋白表达不佳且不很稳定。在这里，hMPV F的结构用于指导设计和表征工程化hMPV F蛋白。在一些方面，实施方案的工程化hMPV F蛋白稳定在膜融合之前存在的构象。例如，此类工程化蛋白质可用于刺激抗hMPV F蛋白特异性免疫反应。在其他方面，工程化F蛋白可用于检测样品中的F蛋白结合抗体。因此，本文提供的工程化蛋白质允许更有效的方法，所述方法用于针对hMPV的疫苗接种以及用于实现用于检测例如生物样品中的抗hMPV F蛋白抗体的新测定方法。
I.本公开的方面
hMPV F蛋白，类似于其他I类融合蛋白，很容易被宿主因素触发，并从亚稳态融合前状态转变为高度稳定的融合后状态。与使用融合后蛋白相比，使用融合前稳定蛋白作为疫苗原(诸如DS-Cav1)已证明在动物模型中触发更高的中和效价。这激发了使用hMPV F的融合前结构(PDB ID:5WB0)作为战略性引入突变(一次一个)的指导，特别是在前后转变期间经历实质构象变化的区域。就像最近在工程化SARS-CoV-2刺突上取得的成功一样，多个脯氨酸取代增加了蛋白质表达，同时保留了融合前构象的F。A107P在融合肽中的作用与HexaPro的F817P取代非常相似(Hsieh等人，2020)，可能是通过对融合肽施加刚性并且还在融合前构象加帽螺旋。有趣的是，将Ala置换为Phe(RSV F上的等效残基)相对于基础构建体略微降低了蛋白质表达(表1)。HRB处的D461P也可能具有与A107P或A113P相同的功能，所述A107P或A113P是融合肽内最有效的脯氨酸取代。抗原位点V处有三个脯氨酸取代，导致蛋白质产量增加。鉴于这些残基的侧链部分暴露在三聚体表面，它们被认为不是疫苗抗原的最佳选择。
原体间或亚基间盐桥的实施倾向于以比原体内盐桥更有效的方式有效地使三聚体病毒蛋白保持处于相对紧凑的构象。例如，gp41的K588E突变与gp120的K62或K492发生静电相互作用，这有利于HIV-1Env保持融合前的闭合构象(Rutten等人，2018)。在目前的设计中，F1亚基的L219K取代可以与F2亚基的E80或F1亚基的D209形成盐桥；F2亚基的73E取代也可以与邻近F1亚基的R198形成盐桥。两种变体都增强了表达并在SEC中具有更长的保留时间，暗示I类融合蛋白的盐桥设计具有惊人相似的作用。另一方面，原体内盐桥设计，诸如变体N145E，消除了hMPV F的表达(表1)。同样，这种类型的盐桥不能很好地稳定SARS-CoV-2刺突。减少由原体界面处的电荷簇引起的排斥是另一种防止三聚体开放的方法。在靠近三聚体基部的HRB区域发现了电荷簇(E453/D454)。因此，用电子等排(isosteric)Gln置换Glu453可减少由负电荷簇引起的电荷排斥。类似于RSV F的E487Q取代或Ebola GP的K588F取代(McLellan等人，2013；Rutten等人，2020)，这种变体使hMPV F成为更紧凑的三聚体并保留了天然四级结构，如SEC洗脱曲线所示(图2B)。
空腔填充方法对于稳定松散堆积的融合前构象的病毒蛋白也非常有效。例如，Cav1变体中的S190F取代很好地填充了位点V与位点II之间的空腔；V207L取代，仅添加单个CH2，很好地填充了位点之间的口袋(pocket)φ。具有最高表达的变体之一，V231I，令人惊讶地位于结构域IIIb(位点II)，所述区域在前后转变期间不会经历构象变化。另外两个增强表达的取代(S149I、I137L)都位于结构域IIIa(位点V)，似乎相互堆积以稳定高度灵活的α2和β3。
在用于稳定hMPV F的策略中，也许引入二硫键的成功率最高。L110C/N322C取代被设计成将融合肽捕获在中央空腔中，而T365C/V463C取代被设计成将HRB锁定在膜近端区域。通过将融合肽或HRB粘附到在前后转变期间保持恒定的区域，F蛋白保留在融合前构象，并且其热稳定性显著提高。这种方法已成功用于若干种I类病毒融合蛋白(McLellan等人，2013；Stewart-Jones等人，2018；Sanders等人，2013)。该设计让人联想到RSV F的DS变体和HIV-1Env的SOSIP。相反，T127C/N153C或A140C/A147C取代代表了不同类型的二硫键设计策略。这些二硫键位于经历构象变化的区域(例如，结构域IIIa(位点V))，但它们似乎通过防止中央螺旋附近的HRA重新折叠来稳定融合前状态。这类似于用于uenza病毒3F蛋白的Q162C/L168C取代(Stewart-Jones等人，2018)，表明这种类型的二硫键设计可能是稳定I类病毒融合蛋白的通用方法。它们可以防止HRA的重新折叠并可能迫使它折叠回融合前构象。限制在前后转变期间经历构象变化的区域处的二级结构的局部灵活性的类似二硫键设计也已成功应用于SARS-CoV-2刺突。有趣的是，V104C/N457C取代防止F被弗林蛋白酶消化，导致SDS-PAGE上的单一种类的F0。由于二硫键设计，融合肽附近的弗林蛋白酶切割位点可能被埋在中央空腔中。这种变体可能适用于疫苗抗原的无蛋白酶生产。
结合多种增加蛋白质表达和稳定性的有益修饰已被证明是产生优化的融合前抗原的有效策略(Joyce等人，2016；Krarup等人，2015；McLellan等人，2013；Rutten等人，2020；Rutten等人，2018；Jiachen等人，2021；Hsieh等人，2020)。在这里，结合多种有益的修饰导致了最好的构建体之一，DS-CavEs2，其包括二硫键、空腔填充和静电稳定化的设计。DS-CavEs2具有高10倍的蛋白质表达，增强的热稳定性，并在热应激和4℃长期储存后保留融合前表位。在位点V处引入两个二硫键取代，在位点II处引入空腔填充取代，以及在融合肽附近引入另一个二硫键不会扰乱hMPV F膜远端一半的构象(图8A)，其在RSV F中具有最有效的中和表位(Graham等人，2017；Gilman等人，2016)。相反，T365C/V463C取代改变了α10螺旋的相对位置。然而，此膜近端区域不太可能具有免疫原性，并且尚未发现靶向RSV F中此区域的中和抗体。
另一种版本的DS-CavEs2的弗林蛋白酶位点被柔性甘氨酸-丝氨酸(GS)接头或聚甘氨酸接头置换，生成单链形式的融合前F三聚体。在一些实施方案中，接头具有序列GGSGGS(SEQ ID NO:12)或GGGGGG(SEQ ID NO:13)。鉴于不需要弗林蛋白酶来重组制成此构建体，所述设计对于疫苗抗原的工业生产可能更具成本效益。
值得注意的是，两种融合前稳定的F构建体都结晶为单体，即使与MPE8复合时也是如此，所述MPE8识别跨越相邻原体的表位。其他组还结晶了与识别不同抗原位点的抗体结合的单体hMPV F(Huang等人，2020；Wen等人，2012)。鉴于三聚体F粒子能够通过nsEM可视化(图8B)，这些数据表明hMPV F三聚体与解离的单体处于平衡状态，即使在与三聚化基序融合时也是如此。这与最近的结果一致，表明若干种I类病毒融合蛋白经历三聚体开放或“呼吸”，并且已经分离出天然存在的抗体，这些抗体与流感HA和hMPV F的三聚体界面结合(Bangaru等人，2019；Watanabe等人，2019；Gilman等人，2019)。
已知融合前稳定的I类病毒融合蛋白可在动物和人中引发高中和抗体效价，通常比融合后抗原诱导的中和抗体效价高一个数量级(Crank等人，2019；McLellan等人，2013；Stewart-Jones等人，2018)。先前的研究显示融合前和融合后hMPV F蛋白的免疫原性几乎没有差异(Battles等人，2017)，但这些研究是使用10μg抗原剂量和现在已知已被一些量的融合前样蛋白污染的融合后F蛋白进行的，所述融合前样蛋白尚未采用融合后构象。预计融合前稳定的hMPV F抗原将在小鼠中引发比融合后F蛋白更高的中和抗体效价。与先前的hMPV F研究相比，这些结果与融合前稳定的病毒蛋白的其他免疫原性研究更一致(Crank等人，2019；van den Hoogen等人，2002；Stewart-Jones等人，2018)。此处描述的稳定的蛋白质应加速hMPV F候选疫苗的开发，并促进有效且反应广泛的单克隆抗体的分离，这些单克隆抗体可用于高危人群的被动预防。
II.定义
应理解，以上概述和以下详述都仅是示例性和解释性的，并且不限制所要求保护的本发明。在本申请中，除非另有具体说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其它形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。另外，除非另有具体说明，否则术语诸如“元件”或“组分”既涵盖包含一个单元的元件和组分，又涵盖包含多于一个亚单元的元件和组分。此外，术语“部分”的使用可包括部分的一部分或整个部分。
如本文说明书所用，“一个(种)”可意指一个(种)或多个(种)。如本文在权利要求书中所用，当与词语“包含(包括)”结合使用时，词语“一个(种)”可意指一个(种)或多于一个(种)。
权利要求书中使用术语“或”用于意指“和/或”，除非明确地指出仅是指备选项或备选项为相互排斥的，尽管本公开支持仅是指备选项和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可意指至少第二个或更多个。
如本文所用的术语“约”当指代诸如量、时距等的可测量值时，意在涵盖从指定值至多±10％的变化。除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示成分、特性诸如分子量、反应条件等的数量的数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求书中所阐述的数值参数为近似值，其可根据所公开的主题要寻求获得的所需特性而变化。在最低限度并且不试图限制对权利要求书范围的等效范围的原则的应用，每个数值参数均应当至少根据报告的有意义的数字的数值和通过应用普通四舍五入技术来解读。尽管阐述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在特定实施例中所阐述的数值尽可能准确地进行报告。然而，任何数值固有地包含必然由在其各自的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。
如本文所用，就指定组分而言的“基本上不含”在本文用于意指任一指定组分均未有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何无意污染导致的指定组分的总量因此远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不可以检测到任何量的指定组分的组合物。
术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其片段，其可以与完整抗体竞争以特异性结合靶抗原，并且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异性抗体。“抗体”是一种抗原结合蛋白。完整抗体将通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况下可包含较少的链，诸如可仅包含重链的天然存在于骆驼科动物中的抗体。抗体可以仅来源于单一来源，也可以是“嵌合的”，即抗体的不同部分可以来源于两种不同的抗体，如下文进一步描述的。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割在杂交瘤中产生。除非另有说明，否则术语“抗体”除了包括包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，其实例如下所述。此外，除非明确排除，否则抗体分别地包括单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(本文有时称为“抗体缀合物”)，及其片段。在一些实施方案中，所述术语还涵盖肽体(peptibody)。
天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。每个此类四聚体通常由相同的两对多肽链构成，每对具有一条全长“轻”链(在某些实施方案中，约25kDa)和一条全长“重”链(在某些实施方案中，约50-70kDa)。每条链的氨基端部分通常包括通常负责抗原识别的具有约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分通常界定可负责效应子功能的恒定区。人轻链通常分为κ轻链和λ轻链。重链通常分为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM的亚类包括但不限于IgM1和IgM2。IgA类似地细分为亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，通常，可变区和恒定区由具有约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，而重链还包括具有约10个以上氨基酸的“D”区。参见，例如，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.编辑，第2版，Raven Press,N.Y.(1989))(出于所有目的以引用的方式整体并入)。每对轻链/重链的可变区通常形成抗原结合位点。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，通常包括重链中的大约氨基端的120至130个氨基酸和轻链中的约100至110个氨基端氨基酸。在某些实施方案中，不同抗体的可变区甚至在同一物种的抗体之间也在氨基酸序列方面有很大差异。抗体的可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性。
可变区通常表现出由三个超变区接合的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构，也称为互补决定区或CDR。来自每对两条链的CDR通常由框架区对齐，这可以实现与特定表位的结合。从N端到C端，轻链和重链可变区通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸到每个结构域的分配通常根据Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))，Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)或Chothia等人，Nature,342:878-883(1989)的定义。
在某些实施方案中，抗体重链在不存在抗体轻链的情况下结合抗原。在某些实施方案中，抗体轻链在不存在抗体重链的情况下结合抗原。在某些实施方案中，抗体结合区在不存在抗体轻链的情况下结合抗原。在某些实施方案中，抗体结合区在不存在抗体重链的情况下结合抗原。在某些实施方案中，单个可变区在不存在其他可变区的情况下特异性结合抗原。
在某些实施方案中，CDR的明确描述和构成抗体结合位点的残基的鉴定是通过解析抗体的结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来完成的。在某些实施方案中，这可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任一种来实现，诸如X射线晶体学。在某些实施方案中，可以采用各种分析方法来鉴定或粗略估计CDR区。此类方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和contact定义。
Kabat定义是对抗体中残基进行编号的标准，并且通常用于鉴定CDR区。参见，例如，Johnson&Wu,Nucleic Acids Res.,28:214-8(2000)。Chothia定义类似于Kabat定义，但Chothia定义考虑了某些结构环区域的位置。参见，例如，Chothia等人，J.Mol.Biol.,196:901-17(1986)；Chothia等人，Nature,342:877-83(1989)。AbM定义使用了整合的一套由Oxford Molecular Group生产的对抗体结构进行建模的计算机程序。参见，例如，Martin等人，Proc Natl Acad Sci(USA),86:9268-9272(1989)；“AbMTM,A Computer Program forModeling Variable Regions of Antibodies,”Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd.。AbM定义使用知识数据库和从头计算方法的组合对来自一级序列的抗体的三级结构进行建模，诸如由Samudrala等人，“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a CombinedHierarchical Approach,”PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194-198(1999)所描述的那些。contact定义基于对可用的复杂晶体结构的分析。参见，例如，MacCallum等人，J.Mol.Biol.,5:732-45(1996)。
按照惯例，重链中的CDR区通常称为H1、H2和H3，并按从氨基端到羧基端的方向顺序编号。轻链中的CDR区通常称为L1、L2和L3，并按从氨基端到羧基端的方向顺序编号。
术语“轻链”包括全长轻链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基端。轻链包括κ链和λ链。
术语“重链”包括全长重链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基端，而CH结构域位于羧基端，其中CH3最接近多肽的羧基端。重链可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
双特异性或双功能抗体通常是人工杂交抗体，具有两对不同的重链/轻链和两个不同的结合位点。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括但不限于杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见，例如，Songsivilai等人，Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.,148:1547-1553(1992)。
术语“抗原”是指能够诱导适应性免疫反应的物质。具体而言，抗原是作为适应性免疫反应受体的靶标的物质。通常，抗原是与抗原特异性受体结合但自身不能在体内诱导免疫反应的分子。抗原通常是蛋白质和多糖，少数也是脂质。如本文所用，抗原还包括免疫原和半抗原。
“Fc”区包含两个包含抗体的CH1结构域和CH2结构域的重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用结合在一起。
“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺少恒定区。
“特异性结合特定多肽或特定多肽上的表位”或“对特定多肽或特定多肽上的表位具有特异性”的抗体是结合所述特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的抗体。例如，本发明的hMPV F蛋白特异性抗体对hMPV F蛋白具有特异性。在一些实施方案中，与hMPV F蛋白结合的抗体的解离常数(Kd)为≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更少，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。
当在竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的上下文中使用时，术语“竞争”意指抗原结合蛋白之间的竞争，如通过测定所确定，在所述测定中，被测试的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)阻止或抑制(例如，减少)参考抗原结合蛋白(例如，配体或参考抗体)与共同抗原(例如，hMPV F或其片段)的特异性结合。许多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见，例如，Stahli等人，1983,Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见，例如，Kirkland等人，1986,J.Immunol.137:3614-3619)固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见，例如，Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Press)；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见，例如，Morel等人，1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见，例如，Cheung等人，1990,Virology 176:546-552)；和直接标记RIA(Moldenhauer等人，1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，此类测定涉及使用结合到固体表面或细胞的纯化抗原，所述固体表面或细胞带有未标记的测试抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白中的任一种。竞争性抑制是通过确定在测试抗原结合蛋白的存在下结合到固体表面或细胞的标记的量来测量的。通常测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定鉴定的抗原结合蛋白(竞争性抗原结合蛋白)包括与参考抗原结合蛋白结合相同表位的抗原结合蛋白和结合与参考抗原结合蛋白结合的表位足够近的相邻表位以发生位阻的抗原结合蛋白。在本文的实施例中提供了关于用于确定竞争性结合的方法的额外细节。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，它将抑制(例如，减少)参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多。在一些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。
如本文所用，术语“表位”是指抗体结合的抗原上的特定原子组或氨基酸组。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由来自抗原的连续氨基酸序列形成，并根据其一级结构与抗体相互作用。另一方面，构象表位由抗原氨基酸序列的不连续部分构成，并根据抗原的3D结构与抗体相互作用。通常，表位的长度大约为五或六个氨基酸。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则它们可以结合抗原内的相同表位。
术语“宿主细胞”意指已经用核酸序列转化或能够用核酸序列转化并由此表达感兴趣的基因的细胞。所述术语包括亲代细胞的后代，无论后代在形态或基因组成上是否与原始亲代细胞相同，只要存在感兴趣的基因即可。
术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或者两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列所确定。“同一性百分比”意指比较的分子中氨基酸或核苷酸之间的相同残基的百分比，并根据所比较的分子中的最小者的大小来计算。对于这些计算，比对中的空位(如果有的话)优选地由特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在以下中描述的那些：ComputationalMolecular Biology,(Lesk,A.M.编辑),1988,New York:Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.编辑),1993,New York:Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,SequenceAnalysis in Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence AnalysisPrimer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑),1991,New York:M.Stockton Press；以及Carillo等人，1988,SIAM J.Applied Math.48:1073。
在计算同一性百分比时，被比较的序列通常以给出序列之间的最大匹配的方式进行比对。可用于确定同一性百分比的计算机程序的一个实例是GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res.12:387；Genetics Computer Group,University ofWisconsin,Madison,Wis.)。计算机算法GAP用于比对要确定序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。比对序列以得到其各自氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配跨度”，如由算法所确定)。将空位开放惩罚(计算为3×平均对角线，其中“平均对角线”是所用比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是通过特定的比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的分数或数字)和空位扩展惩罚(通常是空位开放惩罚的1/10倍)，以及比较矩阵诸如PAM 250或BLOSUM 62与所述算法结合使用。在某些实施方案中，标准比较矩阵(参见，Dayhoff等人，1978,Atlasof Protein Sequence and Structure 5:345-352，关于PAM 250比较矩阵；Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919，关于BLOSUM 62比较矩阵)也由所述算法使用。
可用于使用GAP程序来确定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的参数的实例可见于Needleman等人，1970,J.Mol.Biol.48:443-453中。
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可能导致仅匹配两个序列的一个短区域，并且这个小比对区域可能具有非常高的序列同一性，即使两个全长序列之间没有显著关系。因此，如果需要，可以调整选择的比对方法(GAP程序)以产生跨越靶多肽的至少50个或其他数目的连续氨基酸的比对。
如本文所用，术语“连接”是指经由分子内相互作用例如共价键、金属键和/或离子键或分子间相互作用例如氢键或非共价键的缔合。
术语“可操作地连接”是指元件的布置，其中如此描述的组件被配置以便执行它们通常的功能。因此，可操作地连接至多肽的给定信号肽指导多肽从细胞中分泌。在启动子的情况下，可操作地连接至编码序列的启动子将指导编码序列的表达。启动子或其他控制元件不需要与编码序列相邻，只要它们起到指导其表达的作用即可。例如，在启动子序列与编码序列之间可存在插入的未翻译但已转录的序列，并且启动子序列仍可被认为与编码序列“可操作地连接”。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物两者。构成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括溴尿苷和肌苷衍生物等碱基修饰，2',3'-双脱氧核糖等核糖修饰，以及硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯和氨基磷酸酯等核苷酸间键联修饰。
如本文所用，“载体”是指引入宿主细胞中从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体还可以包括一种或多种治疗基因和/或可选择标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达不同于细胞天然的核酸和/或蛋白质。载体任选地包括有助于实现核酸进入细胞的材料，诸如病毒粒子、脂质体、蛋白质涂层等。
术语“多肽”或“蛋白质”意指具有天然蛋白质的氨基酸序列的大分子，即由天然存在且非重组的细胞产生的蛋白质；或者它是由遗传工程化或重组的细胞产生的，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。所述术语还包括氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸是相应天然存在的氨基酸和聚合物的化学类似物。术语“多肽”和“蛋白质”具体涵盖具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的hMPV F蛋白结合蛋白、抗体或序列。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白质相比具有氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失的多肽。与天然蛋白质相比，此类片段还可含有修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段的长度约为五至500个氨基酸。例如，片段的长度可为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能片段，包括结合结构域。在hMPV F蛋白结合抗体的情况下，有用的片段包括但不限于CDR区、重链和/或轻链的可变结构域、抗体链的一部分或仅其包括两个CDR的可变区等。
用于本发明的药学上可接受的载体是常规的。Remington’sPharmaceuticalSciences,E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)描述了适用于药物递送本文公开的融合蛋白的组合物和制剂。通常，载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含作为媒介物的可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，散剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规无毒固体载体可包括例如药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体之外，待施用的药物组合物可以含有少量无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨糖醇月桂酸酯。
如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后形式。在许多实施方案中，受试者是人类。受试者可以是患者，其是指呈现给医疗提供者以诊断或治疗疾病的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可能罹患或易患疾病或病症，但可能或可能不表现出所述疾病或病症的症状。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指有效治疗疾病或疾患的药物的剂量或浓度。例如，关于使用本文公开的单克隆抗体或其抗原结合片段治疗病毒感染。
如本文所用，疾患的“治疗(treating/treatment)”包括预防或减轻疾患、减缓疾患的发作或发展速度、降低发展疾患的风险、预防或延迟与疾患相关的症状的发展、减少或结束与疾患相关的症状、使疾患完全或部分消退、治愈疾患，或其某种组合。
III.hMPV F蛋白
人偏肺病毒(hMPV)是肺病毒科的一种负义包膜病毒，并且于2001年被发现，但在被发现之前已经传播了至少半个世纪。hMPV融合(F)蛋白是由病毒基因组编码的三种表面糖蛋白之一。作为I类融合，hMPV F首先被翻译为单个多肽前体(F0)。最初是非功能性的，蛋白水解切割事件对于形成通过二硫键共价连接的F1和F2亚基是必需的。F2多肽的新N端含有疏水序列，所述序列在最终融合病毒和宿主细胞膜的过程中被插入到宿主细胞膜中。在某种意义上说，无论是在转运途中还是在膜表面，F蛋白都与自身缔合形成亚稳态三聚体，这被称为融合前构象。hMPV融合蛋白在细胞外被胰蛋白酶样蛋白酶切割。一个未知的触发事件发生，影响F蛋白经历显著的构象变化，将融合肽延伸到宿主细胞膜中，然后折叠回自身以形成六螺旋束，这被称为融合后构象。延长的中间体与融合后构象之间的能量差提供了膜融合所需的能量。
从历史上看，副粘病毒融合蛋白的结构已分为数个结构域，通常将第一个解析的融合前蛋白分为头部、颈部和茎部。将三个通用结构域(DI、DII和DIII)分配给附加结构的融合前结构的命名法仍在继续。由于肺病毒科先前是副粘病毒的亚科，所以它们也保留了这个惯例。hMPV的结构域被模糊地分成相同的三个结构域，同时还定义了另外两个七肽重复区。七肽重复区A(HRA)在位于DIIIa内的F1的N端处，并且七肽重复区B在定义结构域区域外的C端且在蛋白质的跨膜结构域之前。然而，转变用于呼吸道合胞病毒(RSV)(肺病毒科的另一个成员)的抗原位点命名法，由于其结构相似，融合蛋白可用于更精确地描述蛋白质区域。当融合肽从三聚体的内腔释放时，DIIIa经历最大的构象重排，并且当融合肽插入靶膜时，HRA形成三线圈束(three-coil bundle)。HRB最终在HRA束的外部缔合，形成融合后构象的6HB。
处于其融合前构象的I类融合蛋白的稳定化最近在临床试验中作为疫苗抗原产生了有希望的结果，RSV疫苗和SARS-冠状病毒-2疫苗都使用这种方法(Baden等人，2020；Keech等人，2020；Williams等人，2020；Crank等人，2019)。RSV与hMPV共享约33％的序列同一性，并且两种融合前结构高度相似(Battles等人，2017；van den hoogen等人，2002)。基于其解析的融合前结构，一些不同的策略已被用于稳定处于其融合前构象的RSV F，包括引入脯氨酸、二硫键和空腔填充取代(Joyce等人，2016；Krarup等人，2015；McLellan等人，2013)。对于DS-Cav1，通过疏水残基取代更优化地填充内腔，并在融合肽区域引入二硫键。对于PR-DM，引入脯氨酸残基以防止环区域重新排列成在融合后构象中看到的扩展的α螺旋。在RSV F中，电荷排斥区域也被鉴定并减少。同样，解析的融合前结构允许通过将两个脯氨酸取代(S-2P)引入铰链区来稳定冠状病毒。在HIV(SOSIP)和流感领域内也有一些实例，其中工程化稳定化突变已产生性能良好的融合前试剂。
最近，从RSV F研究中获得的知识被用于稳定融合前构象的hMPV F。首先，将F2/F1切割位点序列‘RQSR’取代为多元‘RRRR’序列，以实现生产细胞中弗林蛋白酶样蛋白酶的有效切割。然后，模拟RSV F稳定化策略(Krarup等人，2015)，将脯氨酸引入F1中膜远端三聚体顶端的螺旋-环-螺旋区域。这种工程化策略允许获得hMPV F的三聚体融合前晶体结构，但蛋白质表达不佳，表明需要进一步工程化(Battles等人，2017)。此外，先前的血清耗竭测定和小鼠免疫实验表明，融合前hMPV F与融合后hMPV F之间没有显著的抗原差异(Battles等人，2017)。相比之下，融合前RSV F引发比融合后RSV F更稳健的中和抗体反应，并且血清耗竭实验证明人血清中的大部分RSV中和活性仅与融合前构象结合(Sastre等人，2005；Magro等人，2012)。这些数据表明需要更稳定的融合前hMPV F构建体来研究这些不一致的结果。
为此，本文已通过F蛋白编码序列的突变证明了F蛋白稳定化策略。已发表的融合前hMPV F结构用于指导额外氨基酸取代的工程化。发现多个有益取代的组合对所需的蛋白质特征具有加性效应。本文分析和提供的突变在下表1中详述。如实施例中详述的那样表达突变体蛋白质，并测定产生的蛋白质和三聚体复合物的量。
表1.F蛋白取代和突变。
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IV.药物制剂
本公开提供了包含工程化hMPV F蛋白的药物组合物。此类组合物可用于刺激免疫反应，诸如疫苗制剂的一部分。
在编码工程化hMPV F蛋白的核酸分子用于药物组合物的情况下，所述核酸分子可包含共价连接在一起的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸或其类似物或者由其组成。如本文所述的核酸分子通常含有磷酸二酯键，但是在一些情况下，可包括核酸类似物，所述核酸类似物可具有至少一个不同的键联，例如，氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺键联以及肽核酸主链和键联。可制备天然存在的多核苷酸和类似物的混合物；或者，可制备不同多核苷酸类似物的混合物，以及天然存在的多核苷酸和类似物的混合物。核酸分子可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可能被非核苷酸组分打断。多核苷酸可在聚合之后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。所述术语还包括双链分子和单链分子两者。除非另有说明或要求，否则术语多核苷酸涵盖双链形式和已知或预测构成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。核酸分子由四种核苷酸碱基的特定序列构成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，并且当多核苷酸为RNA时，胸腺嘧啶为尿嘧啶(U)。因此，术语“核酸序列”是核酸分子的字母顺序表示。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。
在一些实施方案中，本公开的核酸包含一个或多个修饰的核苷，所述修饰的核苷包含修饰的糖部分。相对于仅包含有包含天然存在的糖部分的核苷的寡核苷酸，包含一个或多个糖修饰的核苷的此类化合物可具有希望的特性，诸如增强的核酸酶稳定性或增大的与靶核酸的结合亲和力。在一些实施方案中，修饰的糖部分为取代的糖部分。在一些实施方案中，修饰的糖部分为糖替代物。此类糖替代物可包含对应于取代的糖部分的那些取代的一个或多个取代。
在一些实施方案中，修饰的糖部分为包含一个或多个非桥联糖取代基的取代的糖部分，包括但不限于在2’位置和/或5’位置处的取代基。适用于2'-位置的糖取代基的实例包括但不限于：2'-F、2'-OCH3(“OMe”或“O-甲基”)和2'-O(CH2)2OCH3(“MOE”)。在某些实施方案中，2'位置处的糖取代基选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代基、O-烯丙基、O--C1-C10烷基、O--C1-C10取代的烷基；OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)和O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H或者取代或未取代的C1-C10烷基。5’-位置处的糖取代基的实例包括但不限于：5'-甲基(R或S)；5'-乙烯基和5'-甲氧基。在一些实施方案中，取代的糖包含多于一个非桥联糖取代基，例如，T-F-5'-甲基糖部分(对于另外的5',2'-双取代的糖部分和核苷，参见，例如，PCT国际申请WO 2008/101157)。
包含2'-取代的糖部分的核苷称为2'-取代的核苷。在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基基团：卤代基、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O、S或N(Rm)-烷基；O、S或N(Rm)-烯基；O、S或N(Rm)-炔基；O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)或O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H、氨基保护基或者取代或未取代的C1-C10烷基。这些2'-取代基基团可被独立地选自以下的一个或多个取代基基团进一步取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基(NO2)、硫醇、硫代烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含选自以下的2'-取代基基团：F、NH2、N3、OCF3、O--CH3、O(CH2)3NH2、CH2—CH＝CH2、O--CH2—CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O--(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和N-取代的乙酰胺(O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H、氨基保护基或者取代或未取代的C1-C10烷基。
在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的2'-取代基基团：F、OCF3、O--CH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(CH3)2、--O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和O--CH2--C(＝O)--N(H)CH3。
在一些实施方案中，2'-取代的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的2'-取代基基团：F、O--CH3和OCH2CH2OCH3。
在一些实施方案中，本公开的核苷包含一个或多个未修饰的核碱基。在某些实施方案中，本公开的核苷包含一个或多个修饰的核碱基。
在一些实施方案中，修饰的核碱基选自：如本文所定义的通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、大小膨胀的碱基和氟化碱基。5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代基、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代基具体地为5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤、通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、大小膨胀的碱基以及氟化碱基，如本文所定义。另外的修饰的核碱基包括三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷([5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G形夹诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的核碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮置换的那些。另外的核碱基包括公开于美国专利3,687,808中的那些、公开于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,Kroschwitz,J.I.编辑,John Wiley&Sons,1990,858-859中的那些。
教导某些上述的修饰的核碱基以及其它修饰的核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653和6,005,096，所述专利中的每一个均以引用的方式整体并入本文。
还可在寡核苷酸上的其它位置处做出额外的修饰，特别是在3'端核苷酸上的糖的3'位置和5'端核苷酸的5'位置。例如，本公开的配体缀合的寡核苷酸的一种额外的修饰涉及使一个或多个额外的非配体部分或缀合物化学连接至寡核苷酸，这增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。此类部分包括但不限于脂质部分诸如胆固醇部分、胆酸、硫醚例如己基-5-三苯甲基硫醇、硫代胆固醇、脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯、多胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈基部分，或十八胺或者己氨基-羰基-氧基胆固醇部分。在一些方面，编码嵌合hMPV/RSV F蛋白的核酸分子是修饰的RNA，例如像修饰的mRNA。修饰的(m)RNA考虑某些化学修饰，这些化学修饰赋予mRNA增加的稳定性和低免疫原性，从而促进治疗上重要的蛋白质的表达。例如，N1-甲基-假尿苷(N1mΨ)在翻译能力方面优于其他几种核苷修饰及其组合。在一些实施方案中，本文所用的(m)RNA分子可将尿嘧啶置换为假尿嘧啶，诸如1-甲基-3′-假尿苷酰基碱基(1-methyl-3′-pseudouridylyl base)。在一些实施方案中，一些尿嘧啶被置换，但在其他实施方案中，所有尿嘧啶都已被置换。(m)RNA可包含5'帽、5'UTR元件、任选密码子优化的开放阅读框、3'UTR元件和聚(A)序列和/或聚腺苷酸化信号。
核酸分子，无论是天然的还是修饰的，都可以作为裸露的核酸分子或在诸如脂质纳米颗粒的递送媒介物中被递送。脂质纳米颗粒可包含与脂质纳米颗粒的重量比为约5:1至约1:100的一种或多种核酸。在一些实施方案中，核酸与脂质纳米颗粒的重量比为约5:1、2.5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100，或其中可推出的任何值。
在一些实施方案中，本文使用的脂质纳米颗粒可含有一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种脂质。这些脂质可包括甘油三酯、磷脂、类固醇或固醇、聚乙二醇化脂质或具有可电离基团诸如烷基胺和一个或多个疏水基团诸如C6或更大的烷基的基团。
在本公开的一些方面，脂质纳米颗粒与一种或多种类固醇或类固醇衍生物混合。在一些实施方案中，类固醇或类固醇衍生物包括任何类固醇或类固醇衍生物。如本文所用，在一些实施方案中，术语“类固醇”是一类具有四环17碳环结构的化合物，其可进一步包含一个或多个取代基，包括烷基、烷氧基、羟基、氧代基、酰基，或者两个或更多个碳原子之间的双键。
在本公开的一些方面，脂质纳米颗粒与一种或多种聚乙二醇化脂质(或PEG脂质)混合。在一些实施方案中，本公开包括使用任何已附接PEG基团的脂质。在一些实施方案中，PEG脂质是甘油二酯，其还包含附接至甘油基团的PEG链。在其他实施方案中，PEG脂质是含有一个或多个C6-C24长链烷基或烯基或C6-C24脂肪酸基团的化合物，所述基团附接至具有PEG链的接头基团。PEG脂质的一些非限制性实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG神经酰胺缀合、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺、PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。在一些实施方案中，PEG修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或PEG修饰的二肉豆蔻酰-sn-甘油。在一些实施方案中，PEG修饰通过脂质的PEG组分的分子量来测量。在一些实施方案中，PEG修饰具有约100至约15,000的分子量。在一些实施方案中，分子量为约200至约500、约400至约5,000、约500至约3,000或约1,200至约3,000。PEG修饰的分子量为约100、200、400、500、600、800、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,250、2,500、2,750、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、12,500至约15,000。美国专利5,820,873、WO 2010/141069或美国专利8,450,298教导了可用于本公开的脂质的一些非限制性实例，所述专利以引用的方式并入本文。
在本公开的一些方面，脂质纳米颗粒与一种或多种磷脂混合。在一些实施方案中，还包含磷酸酯基团的任何脂质。在一些实施方案中，磷脂是含有一个或两个长链C6-C24烷基或烯基、甘油或鞘氨醇、一个或两个磷酸酯基团和任选的有机小分子的结构。在一些实施方案中，有机小分子是氨基酸、糖或氨基取代的烷氧基，诸如胆碱或乙醇胺。在一些实施方案中，磷脂是磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，磷脂是二硬脂酰磷脂酰胆碱或二油酰磷脂酰乙醇胺。在一些实施方案中，使用其他两性离子脂质，其中两性离子脂质定义具有正电荷和负电荷两者的脂质和脂质样分子。
在本公开的一些方面，提供了包含含有亲脂性和阳离子组分的化合物的脂质纳米颗粒，其中阳离子组分是可电离的。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质含有一个或多个在生理pH下质子化但在高于8、9、10、11或12的pH下可去质子化且不带电荷的基团。可电离的阳离子基团可以含有一种或多种能够在生理pH下形成阳离子基团的可质子化的胺。阳离子可电离脂质化合物还可以进一步包含一种或多种脂质组分，诸如两种或更多种具有C6-C24烷基或烯基碳基团的脂肪酸。这些脂质基团可通过酯键联附接或可通过迈克尔加成(Michael addition)进一步添加到硫原子上。在一些实施方案中，这些化合物可以是树枝状聚合物(dendrimer)、树枝状化合物(dendron)、聚合物或其组合。
在本公开的一些方面，提供了包含含有亲脂性和阳离子组分的化合物的组合物，其中阳离子组分是可电离的。在一些实施方案中，可电离的阳离子脂质是指具有可获得电荷(pKa)的氮原子的脂质和脂质样分子。这些脂质在文献中可以称为阳离子脂质。这些具有氨基的分子通常具有2至6个疏水链，通常是烷基或烯基诸如C6-C24烷基或烯基，但可具有至少1个或多于6个尾(tail)。
在一些实施方案中，药物组合物中封装有核酸分子的脂质纳米颗粒的量为约0.1％重量/重量至约50％重量/重量、约0.25％重量/重量至约25％重量/重量、约0.5％重量/重量至约20％重量/重量、约1％重量/重量至约15％重量/重量、约2％重量/重量至约10％重量/重量、约2％重量/重量至约5％重量/重量，或约6％重量/重量至约10％重量/重量。在一些实施方案中，药物组合物中封装有核酸分子的脂质纳米颗粒的量为约0.1％重量/重量、0.25％重量/重量、0.5％重量/重量、1％重量/重量、2.5％重量/重量、5％重量/重量、7.5％重量/重量、10％重量/重量、15％重量/重量、20％重量/重量、25％重量/重量、30％重量/重量、35％重量/重量、40％重量/重量、45％重量/重量、50％重量/重量、55％重量/重量、60％重量/重量、65％重量/重量、70％重量/重量、75％重量/重量、80％重量/重量、85％重量/重量、90％重量/重量至约95％重量/重量，或其中可推出的任何范围。
在一些方面，本公开包括一种或多种配制到药物组合物中的糖。在一些实施方案中，本文使用的糖是糖类。这些糖类可用于充当冻干保护剂，所述冻干保护剂防止药物组合物在干燥过程期间不稳定。这些水溶性赋形剂包括碳水化合物或糖类诸如二糖诸如蔗糖、海藻糖或乳糖，三糖诸如包含果糖、葡萄糖、半乳糖的棉子糖，多糖诸如淀粉或纤维素，或者糖醇诸如木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。在一些实施方案中，这些赋形剂在室温下是固体。糖醇的一些非限制性实例包括赤藓糖醇、苏糖醇、阿糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇、肌醇、庚七醇(volemitol)、异麦芽酮糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽三糖醇(maltotritol)、麦芽四糖醇(maltotetraitol)或多糖醇(polyglycitol)。
在一些实施方案中，药物组合物中糖的量为约25％重量/重量至约98％重量/重量、40％重量/重量至约95％重量/重量、50％重量/重量至约90％重量/重量、50％重量/重量至约70％重量/重量，或约80％重量/重量至约90％重量/重量。在一些实施方案中，药物组合物中糖的量为约10％重量/重量、15％重量/重量、20％重量/重量、25％重量/重量、30％重量/重量、35％重量/重量、40％重量/重量、45％重量/重量、50％重量/重量、52.5％重量/重量、55％重量/重量、57.5％重量/重量、60％重量/重量、62.5％重量/重量、65％重量/重量、67.5％重量/重量、70％重量/重量、75％重量/重量、80％重量/重量、82.5％重量/重量、85％重量/重量、87.5％重量/重量、90％重量/重量至约95％重量/重量，或其中可推出的任何范围。
在一些实施方案中，药学上可接受的聚合物是共聚物。药学上可接受的聚合物可以进一步包含一个、两个、三个、四个、五个或六个分离的不同类型的聚合物亚单元的亚单元。这些聚合物亚单元可包括聚氧丙烯、聚氧乙烯或类似的亚单元。特别地，药学上可接受的聚合物可以包含至少一种疏水亚单元和至少一种亲水亚单元。特别地，所述共聚物可以在疏水单元的每一侧具有亲水亚单元。所述共聚物可具有亲水亚单元聚氧乙烯和疏水亚单元聚氧丙烯。
在一些实施方案中，表达盒用于表达工程化hMPV F蛋白，用于后续纯化和递送至细胞/受试者，或者直接用于基于病毒的递送方法。本文提供的是表达载体，其含有一种或多种编码工程化hMPV F蛋白的核酸。
表达需要在载体中提供适当的信号，并包括各种调节元件，诸如来自病毒来源和哺乳动物来源两者的增强子/启动子，所述调节元件驱动工程化hMPV F蛋白在细胞中表达。在整个本申请中，术语“表达盒”意在包括任何类型的遗传构建体，其含有编码基因产物的核酸，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录和翻译，即，在启动子的控制之下。“启动子”是指由细胞的合成机制或引入的合成机制所识别的、启动基因的特异性转录所需的DNA序列。短语“处于转录控制之下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶起始和基因表达。“表达载体”意在包括包含在能够复制的遗传构建体中的表达盒，因此包括复制起点、转录终止信号、多聚腺苷酸区、可选择标志物和多用途克隆位点中的一个或多个。
此处将使用术语启动子指代一组转录控制模块，所述一组转录控制模块簇集在RNA聚合酶II的起始位点周围。关于启动子如何组织的许多思考源自对几种病毒启动子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元的那些。这些研究，通过更多近期工作的补充，已显示启动子由离散的功能模块构成，每个功能模块由大约7-20bp的DNA组成，并含有转录激活物或阻遏蛋白的一个或多个识别位点。
每个启动子中至少一个模块的功能是定位RNA合成的起始位点。这个的最有名的实例是TATA盒，但在一些缺少TATA盒的启动子，诸如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子中，与起始位点重叠的离散元件本身有助于确定起始位置。
另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些启动子元件位于起始位点上游30-110bp的区域，但是近期已表明许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在tk启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加至相隔50bp。取决于启动子，似乎个别元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
在某些实施方案中，病毒启动子诸如人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶可以用于获得感兴趣的编码序列的高水平表达。还设想使用本领域众所周知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子实现感兴趣的编码序列的表达，条件是表达水平对于给定目的是足够的。通过采用具有众所周知的特性的启动子，可以优化转染或转化后感兴趣的蛋白质的表达水平和模式。此外，选择响应于特定生理信号而被调节的启动子可以允许基因产物的诱导型表达。
增强子是增加来自位于同一DNA分子的远处位置的启动子的转录的遗传元件。增强子的组织方式很像启动子。也就是说，它们由许多单独元件构成，每个元件都与一个或多个转录蛋白结合。增强子与启动子之间的基本区别是操作性的。整个增强子区域必须能够远距离刺激转录；这对于启动子区域或其组成元件不是必须的。另一方面，启动子必须具有一个或多个在特定位点和特定方向上指导RNA合成起始的元件，而增强子缺乏这些特异性。启动子和增强子通常是重叠和相邻的，似乎通常具有非常类似的模块组织。
以下是可以在表达构建体中与编码感兴趣的基因的核酸组合使用的启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动基因的表达。如果提供适当的细菌聚合酶，那么无论是作为递送复合物的一部分还是作为另外的遗传表达构建体，真核细胞都可以支持由某些细菌启动子造成的细胞质转录。
启动子和/或增强子可以是例如免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、T细胞受体、HLA DQ a和/或DQβ、β-干扰素、白介素-2、白介素-2受体、MHC II类5、MHC II类HLA-Dra、β-肌动蛋白、肌肉肌酸激酶(MCK)、前白蛋白(转甲状腺素蛋白)、弹性蛋白酶I、金属硫蛋白(MTII)、胶原蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白、t-珠蛋白、β-珠蛋白、c-fos、c-HA-ras、胰岛素、神经细胞粘附分子(NCAM)、α1-抗胰蛋白酶、H2B(TH2B)组蛋白、小鼠和/或I型胶原蛋白、葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白A(SAA)、肌钙蛋白I(TN I)、血小板衍生生长因子(PDGF)、SV40、多瘤病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒(CMV)和长臂猿白血病病毒。
在采用cDNA插入物的情况下，人们通常将期望包括聚腺苷酸化信号以实现基因转录物的正确聚腺苷酸化。可以采用任何聚腺苷酸化序列，诸如人生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。还设想为表达盒的元件的是终止子。这些元件可以用于增强消息水平，并最大程度减少从盒通读(read through)到其他序列中。
有多种可以将表达载体引入细胞的方式。在某些实施方案中，表达构建体包含病毒或来源于病毒基因组的工程化构建体。某些病毒经由受体介导的内吞作用进入细胞、整合到宿主细胞基因组中并且稳定且高效地表达病毒基因的能力使它们成为将外来基因转移到哺乳动物细胞中的有吸引力的候选者。这些病毒对外来DNA序列的容量相对较低，并且具有受限的宿主谱。此外，它们在允许细胞中的致癌潜力和细胞病变效应引起了安全问题。它们仅可以容纳至多8kB的外来遗传物质，但可以很容易地被引入多种细胞系和实验室动物中。
一种用于体内递送的方法涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意在包括那些含有足以(a)支持构建体的包装以及(b)表达已克隆于其中的工程化hMPV F蛋白的腺病毒序列的构建体。在这种情况下，表达不需要合成基因产物。
表达载体包含遗传工程化形式的腺病毒。了解腺病毒(一种36kB的线性双链DNA病毒)的遗传组织允许用至多7kB的外来序列取代大片腺病毒DNA。与逆转录病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以附加体方式复制而没有潜在的遗传毒性。此外，腺病毒结构稳定，并且在广泛扩增后未检测到基因组重排。腺病毒几乎可以感染所有上皮细胞，无论其细胞周期阶段如何。到目前为止，腺病毒感染似乎只与轻度疾病有联系，诸如人的急性呼吸道疾病。
腺病毒特别适合用作基因转移载体，因为它具有中等大小的基因组、易于操纵、高效价、广泛的靶细胞范围和高感染性。病毒基因组的两端含有100-200个碱基对的反向重复序列(ITR)，它们是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区域含有不同的转录单位，这些转录单位按病毒DNA复制的开始划分。E1区域(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组和一些细胞基因的转录的蛋白质。E2区域(E2A和E2B)的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白质的合成。这些蛋白质参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭。晚期基因的产物，包括大部分病毒衣壳蛋白，仅在对主要晚期启动子(MLP)发出的单个初级转录物进行显著处理后才表达。MLP(位于16.8m.u.)在感染后期特别有效，并且从此启动子发出的所有mRNA都具有5'-三联前导(TPL)序列，这使得它们成为翻译的优选mRNA。在一个系统中，重组腺病毒是由穿梭载体与前病毒载体之间的同源重组产生的。由于两个前病毒载体之间可能发生重组，因此可以从此过程中产生野生型腺病毒。因此，从个别斑块中分离出单个病毒克隆并检查其基因组结构至关重要。
当前复制缺陷型腺病毒载体的产生和繁殖依赖于一种命名为293的独特辅助细胞系，所述细胞系通过Ad5 DNA片段从人胚肾细胞转化而来并且组成型表达E1蛋白。由于E3区域在腺病毒基因组中是可有可无的，目前的腺病毒载体在293细胞的帮助下，在E1、D3或两个区域携带外来DNA。在自然界中，腺病毒可以包装大约105％的野生型基因组，提供约2kb额外DNA的容量。结合E1和E3区中可替换的大约5.5kb的DNA，目前的腺病毒载体的最大容量在7.5kb以下，或为约载体总长度的15％。超过80％的腺病毒病毒基因组保留在载体骨架中，并且是载体传播细胞毒性的来源。此外，E1缺失病毒的复制缺陷是不完整的。
辅助细胞系可来源于人细胞，诸如人胚肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或其他人胚胎间充质细胞或上皮细胞。或者，辅助细胞可以来源于其他哺乳动物物种的细胞，这些哺乳动物物种的细胞对人腺病毒是允许的。此类细胞包括例如Vero细胞或其他猴胚胎间充质细胞或上皮细胞。如上所述，优选的辅助细胞系是293。
本公开的腺病毒是复制缺陷型的，或至少是条件性复制缺陷型的。腺病毒可以具有42种不同的已知血清型或A-F亚群中的任一种。C亚群的5型腺病毒是一种示例性起始材料，其可用于获得用于本公开的条件性复制缺陷型腺病毒载体。
其他病毒载体可用作本公开中的表达构建体。可以采用来源于病毒诸如痘苗病毒、腺相关病毒(AAV)和疱疹病毒的载体。它们为各种哺乳动物细胞提供了数种有吸引力的特征。
在实施方案、特定实施方案中，载体是AAV载体。AAV是一种感染人和其他一些灵长类动物物种的小病毒。目前还不知道AAV会导致疾病。所述病毒引起非常温和的免疫反应，进一步支持其明显缺乏致病性。在许多情况下，AAV载体整合到宿主细胞基因组中，这可能对某些应用很重要，但也可能产生不良后果。使用AAV的基因治疗载体可以感染分裂细胞和静止细胞两者，并在不整合到宿主细胞基因组的情况下持续以染色体外状态存在，尽管在天然病毒中确实发生了一些病毒携带的基因整合到宿主基因组中。这些特征使AAV成为创建用于基因治疗的病毒载体以及创建同基因人疾病模型的非常有吸引力的候选者。最近使用AAV进行视网膜基因治疗的人体临床试验显示出前景。AAV属于依赖性细小病毒属，而其又属于细小病毒科。所述病毒是一种小型(20nm)复制缺陷型无包膜病毒。
由于许多特征，野生型AAV引起了基因治疗研究人员的极大兴趣。其中最主要的是病毒明显缺乏致病性。它还可以感染非分裂细胞，并能够在人19号染色体的特定位点(命名为AAVS1)稳定地整合到宿主细胞基因组中。此特征使它比逆转录病毒更容易预测，逆转录病毒存在随机插入和突变发生的威胁，有时会导致癌症的发展。AAV基因组最常整合到所提到的位点，而随机并入到基因组中的频率可以忽略不计。然而，作为基因治疗载体的AAV的开发通过从载体DNA中去除rep和cap消除了这种整合能力。所需基因连同驱动基因转录的启动子一起插入反向末端重复序列(ITR)之间，在单链载体DNA被宿主细胞DNA聚合酶复合物转化为双链DNA后，有助于在细胞核中形成多联体。基于AAV的基因治疗载体在宿主细胞核中形成附加多联体。在非分裂细胞中，这些多联体在宿主细胞的生命周期内保持完整。在分裂细胞中，AAV DNA通过细胞分裂丢失，因为附加DNA不与宿主细胞DNA一起复制。AAV DNA随机整合到宿主基因组中是可检测的，但发生的频率非常低。AAV也表现出非常低的免疫原性，似乎仅限于产生中和抗体，而它们不诱导明确定义的细胞毒性反应。这一特征连同感染静止细胞的能力表明它们在作为人类基因治疗载体方面优于腺病毒。
AAV基因组由单链脱氧核糖核酸(ssDNA)构成，有正义或负义，长约4.7千碱基。基因组包含在DNA链两端的反向末端重复序列(ITR)和两个开放阅读框(ORF)：rep和cap。前者由编码AAV生命周期所需的Rep蛋白的四个重叠基因构成，而后者含有重叠的衣壳蛋白核苷酸序列：VP1、VP2和VP3，它们相互作用形成二十面体对称的衣壳。
反向末端重复(ITR)序列每个包含145个碱基。它们之所以如此命名是因为它们的对称性，这被证明是AAV基因组有效增殖所需要的。这些序列赋予它们这种特性的特征是它们形成发夹的能力，这有助于所谓的自启动(self-priming)，所述自启动允许第二条DNA链的不依赖于引物酶的合成。ITR也被证明是AAV DNA整合到宿主细胞基因组(人第19条染色体)中并从其进行拯救两者，以及是AAV DNA的有效包壳和完全组装的脱氧核糖核酸酶抗性AAV粒子的生成的组合所需要的。
关于基因治疗，ITR似乎是治疗基因旁边顺式所需的唯一序列：结构(cap)和包装(rep)蛋白可以反式递送。有了这个假设，许多方法被建立用于有效生产含有报告基因或治疗基因的重组AAV(rAAV)载体。然而，还公布了ITR并不是有效复制和包壳顺式所需的唯一元件。一些研究小组已经在rep基因的编码序列内部确定了一个序列，称为顺式作用Rep依赖性元件(CARE)。当顺式存在时，CARE被证明可以增强复制和包壳。
在一些方面，本公开提供了含有一种或多种盐的药物组合物。盐可以是无机钾盐或钠盐，诸如氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠。药物组合物可包含一种或多种磷酸盐以产生磷酸盐缓冲溶液。磷酸盐缓冲溶液可包含磷酸盐中的每一种以将溶液缓冲至约6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0或其中可推出的任何范围的pH。
在一些方面，本公开包括一种或多种配制到药物组合物中的赋形剂。“赋形剂”是指药学上可接受的载体，它们是相对惰性的物质，用于促进向受试者施用或递送API或用于促进将API加工成药物制剂，这些药物制剂可在药学上用于递送至受试者的作用部位。此外，这些化合物可用作稀释剂以便获得可容易地测量或施用于患者的剂量。赋形剂的非限制性实例包括聚合物、稳定剂、表面活性剂、表面改性剂、溶解增强剂、缓冲剂、包封剂、抗氧化剂、防腐剂、非离子润湿剂或澄清剂、粘度增加剂和吸收增强剂。
在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦监管机构或州政府批准或者在美国药典或其它通常认可的药典中列出用于动物并且更具体地用于人。术语“载体”是指治疗剂借以施用的稀释剂、赋形剂或媒介物。这样的药物载体可以是无菌液体，诸如水，并且可以优选地包括佐剂。当药物组合物通过注射诸如肌肉内注射施用时，水是一种具体的载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。其他合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
如果需要，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。口服制剂可包括标准载体，诸如药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药剂的实例描述于“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中。此类组合物将含有预防或治疗有效量的抗体或其片段，优选为纯化形式，连同合适量的载体以便提供用于对患者进行适当施用的形式。制剂应适合施用方式，可以是口服、静脉内、动脉内、颊内、鼻内、雾化、支气管吸入或通过机械通气递送。
如本文所述，本公开的工程化蛋白质可以配制用于肠胃外施用，例如配制用于经由皮内、静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内或甚至腹膜内途径注射。或者可以通过局部途径将抗体直接施用至粘膜，例如通过滴鼻剂、吸入或通过雾化器。药学上可接受的盐包括酸性盐和与例如像氢氯酸或磷酸的无机酸或者诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸的有机酸形成的盐。用游离羧基形成的盐也可以来源于例如像氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁的无机碱和诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。
通常，本公开的组合物的成分在标明活性剂的量的密封容器诸如安瓿或小袋中例如作为干冻干粉末或无水浓缩物以单位剂量形式单独提供或混合在一起提供。当组合物通过输注施用时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。当组合物通过注射施用时，可以提供装有无菌注射用水或盐水的安瓿，以便可以在施用之前混合成分。
本公开的组合物可以配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，诸如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐，以及与阳离子形成的盐，诸如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些盐。
剂量可以通过单剂量方案或多剂量方案进行。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可以通过相同或不同的途径给予各种剂量。多剂量通常将间隔至少1周(例如，约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)施用。
本文公开的组合物可用于治疗儿童和成人两者。因此，人受试者可以小于1岁、1-5岁、5-16岁、16-55岁、55-65岁或至少65岁。
优选的施用途径包括但不限于肌肉内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内和眼内注射。特别优选的施用途径包括肌肉内、皮内和皮下注射。
V.免疫检测方法
在又其他实施方案中，本公开涉及用于结合、纯化、去除、量化和以其他方式一般检测hMPV F蛋白结合抗体的免疫检测方法。虽然这些方法可以在传统意义上应用，但另一种用途将是疫苗储备的质量控制和监测，其中抗体可用于评估抗原的量或完整性(即长期稳定性)。或者，所述方法可用于筛选各种抗体以获得适当/所需的反应性特性。
一些免疫检测方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和蛋白质印迹等。特别地，还提供了用于检测和量化hMPV F蛋白结合抗体的竞争性测定。一般而言，免疫结合方法包括获得疑似含有hMPV F蛋白结合抗体的样品，并在有效允许形成免疫复合物的条件下使样品与根据本公开的抗原接触(视情况而定)。
这些方法包括用于从样品中检测或纯化hMPV F蛋白结合抗体或hMPV F蛋白的方法。抗原将优选连接至诸如柱基质形式的固体支持物，并且怀疑含有hMPV F蛋白结合抗体的样品将被应用于固定的抗原。不需要的组分将从柱上洗掉，留下与固定的抗原免疫复合的hMPV F蛋白结合抗体，然后通过从柱上去除抗原来收集hMPV F蛋白结合抗体。
免疫结合方法还包括用于检测和量化样品中hMPV F蛋白或相关组分的量以及检测和量化结合过程期间形成的任何免疫复合物的方法。在这里，人们将获得怀疑含有hMPVF蛋白的样品，并使样品与结合hMPV F蛋白或其组分的抗体接触，然后检测和量化在特定条件下形成的免疫复合物的量。在抗原检测方面，分析的生物样品可以是任何怀疑含有hMPVF蛋白的样品，诸如组织切片或标本、均质处理的组织提取物、生物流体(例如，鼻拭子)，包括血液和血清或分泌物，诸如粪便或尿液。
在有效条件下使选定的生物样品与抗原接触并且持续足以允许形成免疫复合物(初级免疫复合物)的时间段通常大约是简单地将抗原组合物添加到样品中并将混合物孵育足够长以供抗原与hMPV F蛋白结合抗体形成免疫复合物(即，与hMPV F蛋白结合抗体结合)的一段时间。这一时间之后，通常将洗涤样品-抗体组合物，诸如组织切片、ELISA板、斑点印迹或蛋白质印迹，以去除任何非特异性结合的抗体种类，只允许那些特异性结合在初级免疫复合物内的抗体被检测到。
通常，免疫复合物形成的检测是本领域众所周知的并且可以通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于标记或标志物的检测，诸如那些放射性、荧光、生物和酶标签中的任一种。有关使用此类标记的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。当然，如本领域已知，通过使用二级结合配体诸如二级抗体和/或生物素/亲和素配体结合排列，人们可能会发现额外的优势。
用于检测的抗体本身可以与可检测标记连接，其中然后人们将简单地检测此标记，从而允许确定组合物中初级免疫复合物的量。或者，可以通过对抗体具有结合亲和力的二级结合配体来检测结合在初级免疫复合物内的一级抗体。在这些情况下，二级结合配体可以与可检测标记连接。二级结合配体本身通常是抗体，因此可称为“二级”抗体。在有效条件下使初级免疫复合物与标记的二级结合配体或抗体接触并且持续足以允许形成二级免疫复合物的时间段。然后通常洗涤二级免疫复合物以去除任何非特异性结合的标记二级抗体或配体，然后检测二级免疫复合物中剩余的标记。
其他方法包括通过两步法检测初级免疫复合物。二级结合配体诸如对抗体具有结合亲和力的抗体用于形成二级免疫复合物，如上所述。在洗涤之后，再次在有效条件下使二级免疫复合物与对二级抗体具有结合亲和力的三级结合配体或抗体接触并且持续足以允许形成免疫复合物(三级免疫复合物)的时间段。三级配体或抗体与可检测标记连接，从而允许检测由此形成的三级免疫复合物。如果需要，此系统可以提供信号放大。
一种免疫检测方法使用两种不同的抗体。第一种生物素化抗体用于检测靶抗原，然后第二种抗体用于检测复合生物素上附着的生物素。在所述方法中，待测试样品首先在含有第一步抗体的溶液中孵育。如果存在靶抗原，那么一些抗体会与抗原结合形成生物素化的抗体/抗原复合物。然后通过在链霉亲和素(或亲和素)、生物素化的DNA和/或互补生物素化的DNA的连续溶液中孵育来扩增抗体/抗原复合物，其中每一步都向抗体/抗原复合物添加额外的生物素位点。重复扩增步骤，直到达到合适的扩增水平，此时将样品在含有抗生物素的第二步抗体的溶液中孵育。此第二步抗体被标记，例如像用酶标记，所述酶可用于通过使用色原底物的组织酶学检测抗体/抗原复合物的存在。通过适当的扩增，可以产生宏观可见的缀合物。
另一种已知的免疫检测方法利用免疫PCR(聚合酶链反应)方法。PCR方法类似于Cantor方法直至与生物素化的DNA一起孵育，但是，不是使用多轮链霉亲和素和生物素化的DNA孵育，而是用释放抗体的低pH或高盐缓冲液洗掉DNA/生物素/链霉亲和素/抗体复合物。然后将所得洗涤溶液用于用合适的引物与适当的对照进行PCR反应。至少在理论上，PCR的巨大扩增能力和特异性可用于检测单个抗原分子。
1.ELISA
就其最简单和直接的意义而言，免疫测定是结合测定。某些优选的免疫测定是本领域已知的各种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也特别有用。然而，将容易理解检测不限于此类技术，并且也可以使用蛋白质印迹、斑点印迹、FACS分析等。
在一个示例性ELISA中，本公开的抗体被固定到表现出蛋白质亲和力的选定表面上，诸如聚苯乙烯微量滴定板中的孔。然后，将怀疑含有hMPV F蛋白的测试组合物添加到孔中。在结合以及洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物之后，可以检测结合的抗原。可通过添加与可检测标记连接的另一种抗hMPV F蛋白抗体来实现检测。这种类型的ELISA是一种简单的“夹心ELISA”。检测也可以通过添加二级抗hMPV F蛋白抗体，随后添加对二级抗体具有结合亲和力的三级抗体来实现，其中三级抗体与可检测标记连接。
在另一个示例性ELISA中，将怀疑含有hMPV F蛋白的样品(例如，可能感染的细胞)固定到孔表面上，然后使其与本公开的抗hMPV F蛋白抗体接触。在结合以及洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物之后，检测结合的抗hMPV F蛋白抗体。当初始抗hMPV F蛋白抗体与可检测标记相连时，可直接检测免疫复合物。同样，可以使用对一级抗hMPV F蛋白抗体具有结合亲和力的二级抗体来检测免疫复合物，其中二级抗体与可检测标记连接。
无论采用何种形式，ELISA都具有某些共同特征，诸如包被、孵育和结合、洗涤以去除非特异性结合的物质以及检测结合的免疫复合物。这些在下面描述。
在用抗原或抗体包被板时，人们通常将板的孔与抗原或抗体的溶液一起孵育过夜或指定的小时数。然后将洗涤板的孔以去除未完全吸附的物质。然后用非特异性蛋白质“包被”孔的任何剩余可用表面，所述非特异性蛋白质关于测试抗血清是抗原中性的。这些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。所述涂层允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，从而减少由抗血清非特异性结合到表面上引起的背景。
在ELISA中，可能更习惯使用二级或三级检测手段而不是直接程序。因此，在蛋白质或抗体与孔结合后，用非反应性材料包被以降低背景，并洗涤以去除未结合的材料，使固定表面与待测试的生物样品在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下接触。然后免疫复合物的检测需要标记的二级结合配体或抗体，以及与标记的三级抗体或三级结合配体结合的二级结合配体或抗体。
“在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下”意指所述条件优选地包括用诸如BSA、牛丙种球蛋白(BGG)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)/Tween的溶液稀释抗原和/或抗体。这些添加的剂也有助于减少非特异性背景。
“合适的”条件还意指孵育在足以允许有效结合的温度下或持续足以允许有效结合的时间段。孵育步骤通常为约1至2至4小时左右，温度优选近似25℃至27℃，或可在约4℃左右过夜。
在ELISA中的所有孵育步骤之后，洗涤接触的表面以便去除未复合的物质。优选的洗涤程序包括用诸如PBS/Tween或硼酸盐缓冲液的溶液洗涤。在测试样品与最初结合的物质之间形成特异性免疫复合物以及随后的洗涤之后，甚至可以确定微量免疫复合物的出现。
为了提供检测手段，二级或三级抗体将具有相关标记以允许检测。优选地，这将是在与适当的显色底物一起孵育后将产生显色的酶。因此，例如，人们将希望在有利于进一步的免疫复合物形成的发展的条件(例如，在室温下在含PBS的溶液诸如PBS-Tween中孵育2小时)下，使一级和二级免疫复合物与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体接触持续一段时间或使两者在一起孵育持续一段时间。
在与标记抗体一起孵育以及随后洗涤以去除未结合的物质之后，量化标记的量，例如通过在过氧化物酶作为酶标记的情况下与显色底物诸如尿素、或溴甲酚紫、或2,2'-联氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、或H2O2一起孵育。然后通过例如使用可见光谱分光光度计测量产生的颜色的程度来实现量化。
2.蛋白质印迹
蛋白质印迹(或者蛋白质免疫印迹)是一种分析技术，用于检测给定组织匀浆或提取物样品中的特定蛋白质。它使用凝胶电泳根据多肽的长度(变性条件)或蛋白质的3-D结构(天然/非变性条件)来分离天然或变性蛋白质。然后将蛋白质转移到膜(通常是硝酸纤维素或PVDF)，在那里使用对靶蛋白具有特异性的抗体探测(检测)所述蛋白质。
样品可取自整个组织或细胞培养物。在大多数情况下，首先使用搅拌器(对于较大的样品体积)、使用匀浆器(较小的体积)或通过超声处理对固体组织进行机械分解。也可以通过上述机械方法之一打开细胞。可以采用各种去污剂、盐和缓冲液来促进细胞裂解以及溶解蛋白质。通常添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止样品被其自身的酶消化。组织制备通常在低温下进行，以避免蛋白质变性。
使用凝胶电泳分离样品的蛋白质。可以通过等电点(pI)、分子量、电荷或这些因素的组合来分离蛋白质。分离的性质取决于样品的处理和凝胶的性质。这是确定蛋白质的一种非常有用的方式。也可以使用二维(2-D)凝胶，将蛋白质从单个样品中分散到二维中。蛋白质在第一维中根据等电点(它们具有中性净电荷的pH)进行分离，并在第二维中根据它们的分子量进行分离。
为了使蛋白质可用于抗体检测，将它们从凝胶内移动到由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜上。将膜放置在凝胶上面，并且在上面放置一叠滤纸。整个堆叠放置在缓冲溶液中，缓冲溶液通过毛细管作用使纸向上移动，从而带来蛋白质。另一种转移蛋白质的方法称为电印迹，它使用电流将蛋白质从凝胶拉到PVDF或硝酸纤维素膜中。蛋白质从凝胶内移动到膜上，同时保持它们在凝胶内的组织。作为这种印迹过程的结果，蛋白质暴露在薄的表面层上以供检测(见下文)。选择这两种膜是因为它们具有非特异性蛋白质结合特性(即，与所有蛋白质的结合效果均等)。蛋白质结合基于疏水相互作用，以及膜与蛋白质之间的带电相互作用。硝酸纤维素膜比PVDF便宜，但脆弱的多，不能很好地经受反复探测。蛋白质从凝胶转移到膜的均匀性和整体有效性可以通过用考马斯亮蓝或丽春红染料对膜进行染色来检查。一旦转移，就使用标记的一级抗体或未标记的一级抗体检测蛋白质，然后使用与一级抗体的Fc区结合的标记的蛋白A或标记的二级抗体进行间接检测。
3.免疫组织化学
本公开的抗体还可与为通过免疫组织化学(IHC)研究而制备的新鲜冷冻和/或福尔马林固定、石蜡包埋的组织块结合使用。由这些微粒标本制备组织块的方法已成功用于各种预后因素的先前IHC研究，并且为本领域技术人员所熟知(Brown等人，1990；Abbondanzo等人，1990；Allred等人，1990)。
简而言之，冷冻切片可以通过以下步骤来制备：在室温下在小塑料胶囊中的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将50ng冷冻的“粉碎”组织再水化；通过离心对颗粒进行造粒；将它们重悬在粘性包埋介质(OCT)中；通过离心再次翻转胶囊和/或造粒；在-70℃异戊烷中速冻；切割塑料胶囊和/或取出冷冻的组织圆筒；将组织圆筒固定在低温切片机卡盘上；和/或由胶囊切出25-50个连续切片。或者，整个冷冻组织样品可用于连续切片。
可以通过类似的方法制备永久切片，所述类似的方法涉及以下步骤：在塑料微量离心管中将50mg样品再水化；造粒；在10％福尔马林中重悬固定4小时；洗涤/造粒；重悬在温暖的2.5％琼脂中；造粒；在冰水中冷却以使琼脂变硬；从试管中取出组织/琼脂块；将块浸润和/或包埋在石蜡中；和/或切出多达50个连续永久切片。同样，可以替代整个组织样品。
4.免疫检测试剂盒
在又其他实施方案中，本公开涉及与上述免疫检测方法一起使用的免疫检测试剂盒。由于抗体可用于检测hMPV F蛋白，因此试剂盒中可包括抗体。因此，免疫检测试剂盒将在合适的容器装置中包括结合hMPV F蛋白的一级抗体和任选的免疫检测试剂。或者，hMPVF蛋白抗原可用于检测hMPV F蛋白结合抗体。在这种情况下，免疫检测试剂盒因此将在合适的容器装置中包括hMPV F蛋白抗原。
在某些实施方案中，抗体或抗原可以预先结合到固体支持物诸如柱基质和/或微量滴定板的孔上。试剂盒的免疫检测试剂可以采用多种形式中的任一种，包括那些与抗体缔合或连接的可检测标记。还考虑了与二级结合配体缔合或附接至二级结合配体的可检测标记。示例性二级配体是那些对一级抗体具有结合亲和力的二级抗体。
用于本试剂盒的其他合适的免疫检测试剂包括双组分试剂，其包含对一级抗体具有结合亲和力的二级抗体，连同对二级抗体具有结合亲和力的三级抗体，其中三级抗体与可检测标记连接。如上所述，许多示例性标记在本领域中是已知的并且所有这样的标记都可以结合本公开使用。
试剂盒可进一步包括合适等分的hMPV F蛋白组合物，无论是标记的还是未标记的，如可用于准备用于检测测定的标准曲线。试剂盒可以含有抗体-标记缀合物，其形式可以是完全缀合的形式，也可以是中间体的形式，或者作为待由试剂盒的使用者缀合的单独的部分。试剂盒的组分可以包装在水性介质中或以冻干形式包装。
试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他可以放置或优选地合适地等分抗体的容器装置。本公开的试剂盒通常还将包括用于密闭封闭地容纳抗体、抗原和任何其他试剂容器用于商业销售的装置。此类容器可以包括所需小瓶保持在其中的注塑或吹塑的塑料容器。
5.流式细胞术和FACS
本公开的抗体也可用于流式细胞术或FACS。流式细胞术是一种基于激光或阻抗的技术，用于许多检测测定，包括细胞计数、细胞分选、生物标志物检测和蛋白质工程。所述技术将细胞悬浮在流体流中，并使它们通过电子检测设备，这允许同时对每秒多达数千个粒子的物理和化学特征进行多参数分析。流式细胞术通常用于病症的诊断，但在基础研究、临床实践和临床试验中还有许多其他应用。
荧光激活细胞分选(FACS)是一种特殊类型的细胞计数。它提供了一种用于根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物一次一个细胞地分选到两个或更多个容器中的方法。一般来说，所述技术涉及夹带在狭窄、快速流动的液体流中心的细胞悬浮液。安排流动使得细胞之间相对于它们的直径有很大的分离。振动机制导致细胞流分裂成单个液滴。就在细胞流分裂成液滴之前，细胞流通过荧光测量站，在荧光测量站中测量了每个细胞的荧光。一个充电环就放置在细胞流分裂成液滴的点。在测量荧光强度之前立即将电荷置于环上，而相反的电荷在液滴分裂离开细胞流时被捕获在液滴上。带电的液滴然后落下通过静电偏转系统，所述系统根据液滴的电荷将其转移到容器中。
在某些实施方案中，为了在流式细胞术或FACS中使用，将本公开的抗体用荧光团标记，然后允许结合感兴趣的细胞，所述感兴趣的细胞在流式细胞仪中进行分析或通过FACS机器进行分选。
VI.实施例
包括以下实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解的是，下面的实施例中所公开的技术代表了发明人在本发明的实践中发现良好发挥作用的技术，因此可以视为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员应当理解的是，根据本公开，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。
材料和方法
蛋白质表达和纯化。将所有hMPV F变体通过Gibson组装构建到含有His和StrepTag II标签的质粒中，并通过DNA测序验证。使用以4:1比率编码F变体和弗林蛋白酶的质粒通过聚乙烯亚胺(PEI)共转染FreeStyle 293F细胞(ThermoFisher)。在转染之后三小时，添加几夫碱(kifunensine)至终浓度为5μM，而对于大规模转染，添加pluronic F-68至终浓度为0.1％体积/体积。在转染之后六天，将过滤除菌的上清液应用于StrepTactin柱(IBA)以进行初步纯化，然后应用于Superose 6 10/300或Superdex 200 10/300尺寸排阻柱(SEC)(GE Healthcare)以获得SEC缓冲液(2mM Tris pH 8.0、200mM NaCl和0.03％NaN3)中的单分散级分。对于初始变体筛选和表征，从40mL细胞培养物中纯化了单取代和组合取代的hMPV F变体。使用Superose 6 16/600柱纯化DS-CavEs2的大规模表达。
通过PEI将编码MPE8重链和轻链的质粒以1:1的比率共转染到FreeStyle 293F细胞中。在重链的铰链区之前引入终止密码子以生成MPE8的抗原结合片段(Fab)。为了纯化MPE8 Fab，首先将过滤除菌的上清液应用于CaptureSelectTMIgG-CH1亲和基质(ThermoFisher)，然后应用于Superdex 200柱(GE Healthcare)以获得PBS缓冲液中的单分散级分。将所有蛋白质样品浓缩至5至10mg/ml，然后在液氮中快速冷冻，然后储存在-80℃下。
差示扫描荧光法。在白色、不透明的96孔板(VWR)中，将终浓度为1μΜ的纯化hMPV变体与5倍终浓度的SYPRO橙色蛋白凝胶染色剂(ThermoFisher)混合。然后使用RocheLightCycler 480II通过连续荧光扫描(λex＝465nm,λem＝580nm)测量混合物，其中升温速率为4.4℃/分钟，并且温度范围为25℃至95℃。数据绘制为解链曲线的导数。
通过生物层干涉法进行MPE8结合分析。为了检查hMPV F在各种温度应激下的表位完整性，将DS-CavEs2等分试样在热循环仪中在37℃、50℃或70℃下孵育30min，或在4℃下保持2.5个月，然后使用Octet RED96e(FortéBio)通过BLI测试MPE8结合。简而言之，使用抗人Fab-CH1第二代(FAB2G)生物传感器(FortéBio)在由10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.005％体积/体积Tween 20和1mg/ml BSA构成的缓冲液中捕获等量的浓度为30nM的MPE8Fab，然后，将MPE8捕获生物传感器浸入50nM的热处理DS-CavEs2中以测量缔合率。在600s的缔合步骤之后，在仅含有缓冲液的孔中进行600s的解离步骤。结合曲线与基线对齐并减去缓冲液。
负染色EM。将融合后hMPV F在70℃下热处理10min，然后应用于已在Solarus 950等离子清洁器(Gatan)中用4:1比率的O2/H2等离子清洁45秒的CF-400-Cu网格(ElectronMicroscopy Sciences)。使用甲胺钨酸盐(Nanoprobes)对网格进行染色。将融合前稳定的hMPV F在1X PBS中与两倍摩尔过量的MPE8 Fab在室温下一起孵育30min。将hMPV-F:Fab复合物在2mM Tris pH 8.0、200mM NaCl和0.02％NaN3中稀释至浓度为0.03mg/mL，然后沉积在CF-400-Cu网格上。在配备Ceta 16M检测器(Thermo Fisher Scientific)的Talos F200CTEM显微镜中，以92,000倍的放大倍数(对应于的校准像素大小)对网格进行成像。CTF估计和粒子拾取在cisTEM中进行(Grant等人，2018)。然后将粒子导出到cryoSPARCv2.15.0以进行2D分类(Punjani等人，2017)。
融合前稳定的F以及与MPE8复合的X射线晶体学。通过将500nl的DS-CavEs2(10mg/ml)与500nl的含有0.1M MES pH 6.0和12％(体积/体积)PEK 20k的储液器溶液混合，通过悬滴蒸汽扩散(hanging-drop vapor diffusion)产生DS-CavEs2晶体。将晶体浸泡在补充有20％甘油的储液器中，并在液氮中冷冻。在SBC光束线19ID(Advanced Photon Source,Argonne National Laboratory)处收集的衍射数据。通过将100nl的复合物(5.4mg/ml)与50nl的含有10％(体积/体积)异丙醇、0.1M HEPES pH 7.5和20％(重量/体积)PEG4000的储液器溶液混合，通过坐滴蒸汽扩散(sitting-drop vapor diffusion)使与MPE8 Fab复合的DSx2的晶体生长。将晶体直接在液氮中冷冻，不添加冷冻保护剂。在SBC光束线19ID(Advanced Photon Source,Argonne National Laboratory)处收集单晶的衍射到/>的衍射数据。将数据编索引并且在iMOSFLM中整合(Battye等人，2011)，之后使用Aimless合并和缩放数据(Evans&Murshudov,2013)。在Phaser(McCoy等人，2007)中进行分子置换，然后分别在Coot(Emsley&Cowtan,2004)和Phenix(Adams等人，2002)中对模型进行多轮模型构建和改进。数据收集和改进统计数据可见表2。
表2.结晶数据收集和改进统计数据
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括号中的值适用于最高分辨率壳层。
酶联免疫吸附测定。将一组hMPV F融合前特异性单克隆抗体(MFP10、Ac967、Ac1025和MPE8)(Corti等人，2013)或非融合前特异性抗体(MF11,MF14)(Battles等人，2017)在4℃下单独固定在96孔微量滴定板上过夜。在使用含1％BSA的PBS的封闭步骤后，从4ng开始，将热处理或未处理的融合后hMPV F的连续稀释液在室温下应用于抗体包被的孔1h。通过用含0.1％Tween-20的PBS洗涤三次去除未结合的F。然后通过添加与辣根过氧化物酶(HRP)(Bio-Rad)缀合的抗His标签mAb检测结合的F，然后用含0.1％Tween-20的PBS洗涤三次。然后添加HRP底物(Sigma)进行显色，并使用ELISA读板器在492nm处读取光密度。
实施例1–融合前稳定的hMPV F的基于结构的设计
与其他I类病毒融合糖蛋白一样，融合前hMPV F蛋白呈现为亚稳态，并且在触发期间容易转化为稳定的融合后构象。为了将F蛋白稳定在融合前状态，在三聚体顶端的螺旋-环-螺旋区域引入脯氨酸取代A185P。这种取代允许获得hMPV的融合前结构，但这种构建体的低表达水平阻碍了作为候选疫苗的潜在应用。因此，还使用了H368N取代，先前显示所述取代增加了蛋白质表达(Schowalter等人，2009)，类似于先前描述的融合前稳定的F蛋白BV-115(Battles等人，2017)。从这个基础构建体，基于hMPV F的融合前(PDB ID:5WB0)和融合后(PDB ID:5L1X)结构设计了97种变体，然后表达了每种变体并在产量、单分散性、热稳定性和抗原性方面对它们进行表征。说明性变体示出在表3中。所采用的策略包括二硫键以锁定在前后转变期间大幅移动的区域，包括疏水残基以填充内腔，包括极性残基以对抗内部电荷不平衡，以及包括脯氨酸取代以有利于F1的融合前构象且不利于其重新折叠。在转变期间移动超过的区域在图1A中以蓝色突出显示(Battles等人，2017)，并且每个类别的最佳取代示出在图1B中。总体而言，具有单取代的36种变体增加了蛋白质表达，其中许多变体表现出更高的热稳定性。
表3.说明性F蛋白变体。
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实施例2–单取代F变体
42种个别变体的表达概况总结于图2A中，并且来自每个设计类别的选定变体的尺寸排阻色谱(SEC)迹线示出在图2B中。应注意，通过此实施例，括号中提供的蛋白质产量的倍数变化值与设计每个构建体时确定的原始值相关。表3中给出的值来自实验，其中所有构建体都被重新表达和平行纯化，并且将SEC色谱图上的曲线下面积与每个实验的基础构建体对照进行比较。在重新表达中，所有构建体的表达都比原始表达好。原始表达中基础构建体的低产量是原始值中较高倍数产量值的主要原因。
设计、表达且表征了九种具有脯氨酸取代的变体。九种变体中的六种增强了蛋白质表达(图2A、图2B)。两种变体A107P和A113P均位于融合肽内，并且相对于基础构建体在蛋白质产量方面分别增加2.9倍和1.9倍[增加5.1倍和3.3倍](图2B)。值得注意的是，A107P表现出SEC峰相对于基础构建体向右移动，表明三聚体结构更紧凑(图2B)。A344P是在结构域I(位点I)处设计用于加帽螺旋的唯一取代，显示蛋白质产量增加2倍，但Tm略微降低约0.6℃。D461P的设计也尝试在HRB加帽α10，这导致蛋白质产量增加1.8倍[增加2.2倍]，并且SEC峰相对于基础构建体向右移动，表明三聚体结构更紧凑。最后，T114P、E146P和V148P都增加了蛋白质表达。
将盐桥工程改造到MPV F蛋白中以中和内部电荷不平衡。L73E和L219K分别使蛋白质表达增加1.5倍和1.4倍[2.6倍和1.4倍](图2A、图2B)，并且两者都显示更长的在SEC中的保留时间。引入了一对取代L66D/K188R，使表达增加1.6倍。E453Q的蛋白质产量增加1.9倍[增加2.8倍]，而且在SEC上的三聚体峰也显著向右移动，表明三聚体可能处于相对封闭的构象(图2C)。此外，几种空腔填充变体显示出对稳定F蛋白的有益作用。例如，结构域IIIb(位点II)处的V231I使蛋白质表达增加2.7倍[3.6倍](图2A、图2B)。另一种变体S376T也显示出相对于基础构建体在蛋白质产量方面增加2.4倍。其他两种变体S149I和G366S显示出相对于基础构建体在蛋白质表达方面增加2.3倍和1.7倍[增加2.3倍和2.9倍]，并在SEC上洗脱为单分散峰。
测试了hMPV F的融合前稳定二硫桥，以提高蛋白质表达和热稳定性。两个实例L110C/N322C和T365C/V463C分别显示相对于基础构建体在蛋白质产量方面增加2.5倍和1.7倍[增加2.8倍和2.4倍]并且在Tm方面增加5.6℃和6.2℃(图2A、图2B、图2C)。与基础构建体相比，变体A116C/A338C也提高了热稳定性，但没有增加表达。另一方面，A140C/A147C和T127C/N153C均位于结构域IIIa(位点V)处(即，在α2、α3、β3和β4内(图1B))，并且分别使蛋白质表达显著增加3.1倍和2.8倍[6.0倍和4.8倍](图2A、图2B)。T127C/N153C适度改善了热稳定性(图2C)。相对于基础构建体，V104C/N457C变体显示弗林蛋白酶切割减少(图2D)，Tm增加4℃，并且显示蛋白质表达水平降低(图2B、图2C)。总体而言，42种变体中约有20种增加了蛋白质表达(图2A)，其中6种变体表现出增加的热稳定性。
实施例3–多取代F变体
单取代的组合被工程改造到三种不同的变体中，这些变体含有两个二硫键、一个二硫键与一个空腔填充，或者一个二硫键与一个盐桥。由于取代T365C/V463C在热稳定性方面的显著改进，所有三种组合变体中都包括取代T365C/V463C。所有三种变体(T127C/N153C/T365C/V463C、V231I/T365C/V463C、L219K/T365C/V463C)相对于其亲本构建体T365C/V463C的蛋白质产量进一步增加了1.2倍、1.9倍、1.2倍，并且含有两个二硫键的变体的Tm相对于亲本T365C/V463C构建体进一步增加了1.7℃，并且相对于基础构建体增加了6.4℃(图4A、图4D)。T127C/N153C/T365C/V463C变体被命名为DSx2，而L219K或V231I被进一步工程改造到其中。与DSx2相比，DSx2/L219K和DSx2/V231I显示出额外的1.1倍和1.6倍增加(图4B、图6)。此外，含有所有有益突变的变体(T127C/N153C/T365C/V463C/L219K/V231I)自1L的FreeStyle 293-F细胞产生16mg蛋白质，在所有构建体中表现出最高的表达水平，与DSx2相比额外增加1.8倍，并且具有60.7℃的Tm(图4D、图5)。此变体被重命名为DS-CavEs，并且将另外一个二硫键设计(L110C/N322C)进一步工程改造到DS-CavEs中以生成名为MM-1的五取代变体(T127C/N153C/T365C/V463C/L219K/V231I/L110C/N322C)。对于MM-1，蛋白质表达相对于DS-Cav Es降低了25％，并显示出Tm的显著提高(67.6℃)。另一个名为MM-1H的变体(T127C/N153C/T365C/V463C/L219K/V231I//L110C/N322C/N386H)是通过相对于MM-1将H368N恢复为野生型His368制成的。对于MM-1H，蛋白质表达相对于DS-CavEs降低了25％，并显示出增加的Tm(65.2℃)(图4C、图4D)。这种由于引入L110C/N322C增强的热稳定性可能对疫苗抗原非常有利。由于额外二硫键显示的益处，基于其作为单取代的有利表达概况探索了A140C/A147C的引入(图2B)。这种称为MM-4H的构建体表现出表达产量的最小差异和1.0℃的Tm增加(图4C、图4D)。
此外，将A140C/A147C和E453Q取代引入MM-1H，这也对应于将E453Q引入MM-4H并命名为DS-CavEs2。DS-CavEs-2的大规模表达自1L的FreeStyle 293-F细胞产生15.7mg融合前稳定的F(图4E)。DS-CavEs2的抗原表面保存完好。DS-CavEs2对融合前特异性抗体MPE8的亲和力(Wen等人，2017)与基础构建体的亲和力相当，在50℃孵育30min之后保持不变(图4F)。根据nsEM分析，DS-CavEs2呈现折叠良好的融合前三聚体，并且每个原体都被MPE8 Fab结合。具有额外取代的DS-CavEs2将表达增强了超过10倍，并表现出最高的热稳定性(Tm 71.8℃)(图4D)，具有正确的融合前构象，表明疫苗开发的潜力。
实施例4–MPE8结合的DSx2构建体的晶体结构
对于组合突变DSx2构建体，获得了与融合前特异性抗体MPE8复合的蛋白质的晶体结构，以确定多取代对hMPV F构象的影响。蛋白质复合物在空间群P2中结晶，并且使X射线衍射至分辨率在模型构建和改进之后，最初发现所述结构的Rwork和Rfree分别为19.68％和23.5％，这在进一步改进结构后分别提高到21.3％和24.2％(表2)。与先前确定的hMPV F结构(PDBID:5WB0)相比，DSx2保留了融合前构象，427个Cα残基的整体RMSD为(图9)。
实施例5–MPE8结合的DS-CavEs2的结构
DS-CavEs2的晶体结构由空间群P21的晶体确定为分辨率为 (表2)。在不存在MPE8的情况下，DS-CavEs2保留了融合前构象，与PDBID:5WB0共享的428个Cα原子的RMSD为(图8A)。对于所有二硫键取代(Cys127/Cys153、Cys140/Cys147、Cys110/Cys322、Cys365/Cys463)和空腔填充取代(I231)，观察到明确的电子密度。DS-CavEs2的膜远端一半(位点II、V和/>)与先前的hMPV F结构(PDBID:5WB0)的叠加揭示了抗原位点IV向中心3倍轴的显著移动(图8A)。两个结构的位点IV的叠加表明，在连接F蛋白上半部分和下半部分的两条长β链(β1和β22)的中心处有一个刚体弯曲(图8A)。与DSx2结构类似，位点V处的两个二硫键取代并没有改变局部构象。相反，Cys365/Cys463取代将α10螺旋从中心3倍轴拉开，并由此改变HRB的向下轨迹(图8A)。对与DS-CavEs2复合的MPE8进行了负染色电子显微镜(nsEM)分析。在2D类平均(class averaging)之后，多个类显示DS-CavEs2为由两个或三个MPE8Fab结合的折叠良好的融合前三聚体，表明DS-CavEs2可以采用三聚体构象(图8B)。
实施例6–作为免疫原的融合前稳定的hMPV F变体
为研究融合前稳定的hMPV F变体是否作为免疫原发挥作用，BALB/c小鼠将用佐有CpG(相隔三周)的融合前(例如，基础构建体、DSx2和DS-CavEs2)或融合后F抗原进行免疫。将在第二次免疫之后10天收集血清。预计融合前稳定的F构建体将引发相对于融合后F抗原更高的针对hMPV A1和/或hMPV B1的中和抗体效价。
***
本文公开并且要求保护的所有方法可以根据本公开在无需过度实验的情况下进行和实施。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行描述，但对本领域技术人员将显而易见的是，可对本文所述的方法和所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地，将显而易见的是，化学和生理学相关的某些剂可替代本文所述的剂，同时将实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改都被认为是在如由所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
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序列表
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<130> UTFB.P1250WO
<140> 尚未可知
<141> 2021-10-07
<150> US 63/089,978
<151> 2020-10-09
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BV-115
<400> 1
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<220>
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<223> DW-1
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420 425 430
Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro
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Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe
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Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile
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Leu Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln
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His His His His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
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<211> 539
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人偏肺病毒(Human metapneumovirus)
<400> 5
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<213> 人偏肺病毒(Human metapneumovirus)
<400> 6
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<213> 人偏肺病毒(Human metapneumovirus)
<400> 7
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<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工多肽序列
<400> 9
Arg Gln Ser Arg
1
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工多肽序列
<400> 10
Arg Arg Arg Arg
1
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工多肽序列
<400> 11
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<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工多肽序列
<400> 12
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
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<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工多肽序列
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 14
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DS-CavEs
<400> 14
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355 360 365
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Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val
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Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln
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450
<210> 15
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DS-CavEs2
<400> 15
Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr Glu Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe Thr Leu
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Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu
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Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe Gly Ile
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Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro
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Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Cys
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Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala
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Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val
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Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln
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His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys
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435 440 445
Ile Glu Asn Ser Gln Ala
450
<210> 16
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工多肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(84)
<223> Xaa为Gly或Ser
<400> 16
Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr Glu Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe Thr Leu
20 25 30
Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu
35 40 45
Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg
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100 105 110
Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu
115 120 125
Ala Val Ser Thr Leu Gly Cys Gly Val Arg Val Leu Ala Thr Ala Val
130 135 140
Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn
145 150 155 160
Lys Asn Lys Cys Asp Ile Pro Asp Leu Lys Met Ala Val Ser Phe Ser
165 170 175
Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn
180 185 190
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Lys Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu
195 200 205
Leu Ala Arg Ala Ile Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys
210 215 220
Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe Gly Ile
225 230 235 240
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245 250 255
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Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp
275 280 285
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290 295 300
Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala
305 310 315 320
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Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys
355 360 365
Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln
370 375 380
Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val
385 390 395 400
Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln
405 410 415
His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys
420 425 430
Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Cys Phe Glu Ser
435 440 445
Ile Glu Asn Ser Gln Ala
450
<210> 17
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工多肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(84)
<223> Xaa为Gly或Ser
<400> 17
Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr Glu Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe Thr Leu
20 25 30
Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu
35 40 45
Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg
50 55 60
Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Cys Gly Val Ala Thr
85 90 95
Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Cys Ile Arg Leu
100 105 110
Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Cys Leu Lys Lys Thr Asn Glu
115 120 125
Cys Val Ser Thr Leu Gly Cys Gly Val Arg Val Leu Ala Thr Ala Val
130 135 140
Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn
145 150 155 160
Lys Asn Lys Cys Asp Ile Pro Asp Leu Lys Met Ala Val Ser Phe Ser
165 170 175
Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn
180 185 190
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Lys Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu
195 200 205
Leu Ala Arg Ala Ile Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys
210 215 220
Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe Gly Ile
225 230 235 240
Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro
245 250 255
Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro
260 265 270
Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp
275 280 285
Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Cys
290 295 300
Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala
305 310 315 320
Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile
325 330 335
Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Cys Gly Arg His Pro Ile
340 345 350
Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys
355 360 365
Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln
370 375 380
Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val
385 390 395 400
Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln
405 410 415
His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys
420 425 430
Phe Pro Gln Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Cys Phe Glu Ser
435 440 445
Ile Glu Asn Ser Gln Ala
450

Claims (79)

1.一种工程化蛋白质，其包含与(i)SEQ ID NO:1、2和4-7中的任一者的氨基酸19-489，或者(ii)SEQ ID NO:3的氨基酸19-484具有至少90％的同一性的偏肺病毒(MPV)F蛋白胞外结构域，所述工程化蛋白质包含至少一个相对于SEQ ID NO:1-7中的任一者的序列的突变，所述至少一个突变在对应于以下的位置处包含取代：K166、N342、A/D185、K188、T49、V262、H435、E26、G439、N46、L158、A161、L50、V162、E51、R163、V104、N457、L110、N322、A113、D336、A116、A338、A140、A147、S291、S443、S293、S444、S355、V442、T365、V463、S22、G53、V169、E305、L302、V47、A159、T127、N153、G121、I/F258、G106、A107、T160、I128、A190、V118、Q426、L165、V191、S149、I137、V/I122、S192、T317、L105、L134、A117、S347、G261、I268、S470、L473、S265、L460、F48、Q455、V231、A374、I217、S376、G366、S194、L219 A344、A86、T114、V148、D461、L66、L73、N145、Q195、E453和/或H368。
2.如权利要求1所述的工程化蛋白质，其包含对应于A/D185P的脯氨酸取代。
3.如权利要求1所述的工程化蛋白质，其包含对应于RQSR(SEQ ID NO:1-7中的任一者的残基99-102)至RRRR(SEQ ID NO:10)的取代。
4.如权利要求1所述的工程化蛋白质，其包含对应于A/D185P的脯氨酸取代和对应于RQSR(SEQ ID NO:1-7中的任一者的残基99-102)至RRRR(SEQ ID NO:10)的取代。
5.如权利要求1所述的工程化蛋白质，其包含SEQ ID NO:1-7中的任一者的残基87-104至GGGGSGGGGSR(SEQ ID NO:8)的取代。
6.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于以下的配对半胱氨酸取代：E26C和G439C；N46C和L158C；T49C和A161C；L50C和V162C；E51C和R163C；E51C和K166C；V104C和N457C；L110C和N322C；A113C和D336C；A116C和A338C；A140C和A147C；S291C和S443C；S293C和S443C；S293C和S444C；S355C和V442C；T365C和V463C；S22C和H435C；G53C和K166C；G53C和V169C；E305C和N457C；S291C和L302C；V47C和A159C；T127C和N153C；G121C和I/F258C；F48C和T160C；和/或T365C和Q455C。
7.如权利要求6所述的工程化蛋白质，其包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于以下的配对半胱氨酸取代：A116C和A338C；T365C和V463C；T127C和N153C；T365C和Q455C；V104C和N457C；L110C和N322C；或A140C和A147C。
8.如权利要求7所述的工程化蛋白质，其包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于A140C和A147C的配对半胱氨酸取代。
9.如权利要求7所述的工程化蛋白质，其包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于V104C和N457C的配对半胱氨酸取代。
10.如权利要求7所述的工程化蛋白质，其包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于L110C和N322C的配对半胱氨酸取代。
11.如权利要求7所述的工程化蛋白质，其包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于T365C和V463C的配对半胱氨酸取代。
12.如权利要求11所述的工程化蛋白质，其还包含在对应于L219和/或V231的位置处的取代。
13.如权利要求11所述的工程化蛋白质，其还包含对应于L219K和/或V231I的取代。
14.如权利要求11-13中任一项所述的工程化蛋白质，其还包含对应于T127C和N153C的配对半胱氨酸取代。
15.如权利要求11-13中任一项所述的工程化蛋白质，其还包含对应于L110C和N322C的配对半胱氨酸取代。
16.如权利要求11-15中任一项所述的工程化蛋白质，其还包含对应于A140C和A147C的配对半胱氨酸取代。
17.如权利要求11-16中任一项所述的工程化蛋白质，其还包含对应于G366S的取代。
18.如权利要求11所述的工程化蛋白质，其还包含在对应于Q426、T49、L187、L473和/或S347的位置处的取代。
19.如权利要求11所述的工程化蛋白质，其还包含在对应于Q426、T49、L187、L473和/或S347的位置处的取代。
20.如权利要求11所述的工程化蛋白质，其还包含对应于Q426W、T49E、L187F、L473F和/或S347Q的取代。
21.如权利要求7所述的工程化蛋白质，其包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于A116C和A338C的配对半胱氨酸取代。
22.如权利要求7所述的工程化蛋白质，其包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于T365C和V463C的配对半胱氨酸取代。
23.如权利要求7所述的工程化蛋白质，其包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于T127C和N153C的配对半胱氨酸取代。
24.如权利要求7所述的工程化蛋白质，其包含工程化二硫键，所述工程化二硫键包含对应于T365C和Q455C的配对半胱氨酸取代。
25.如权利要求7所述的工程化蛋白质，其还包含至少一个额外的工程化二硫键。
26.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含在对应于以下的位置处的空腔填充取代：G106、A107、T160、L158、I128、A190、V118、Q426、L165、V191、T160、S149、I137、S149、V169、N46、T49、V/I122、S192、T317、V162、L105、L134、A117、S347、V47、G261、I268、S470、V231、A374、I217和/或S355。
27.如权利要求26所述的工程化蛋白质，其包含在对应于以下的位置处的空腔填充取代：L105、V118、I137、S149、L158、L165或Q426。
28.如权利要求27所述的工程化蛋白质，其包含对应于L105I或L105W的取代。
29.如权利要求27所述的工程化蛋白质，其包含对应于L158W的取代。
30.如权利要求27所述的工程化蛋白质，其包含对应于V118F或V118M的取代。
31.如权利要求27所述的工程化蛋白质，其包含对应于Q426W的取代。
32.如权利要求27所述的工程化蛋白质，其包含对应于L165F的取代。
33.如权利要求27所述的工程化蛋白质，其包含对应于S149V或S149I的取代。
34.如权利要求33所述的工程化蛋白质，其还包含在对应于I137的位置处的取代。
35.如权利要求34所述的工程化蛋白质，其包含对应于I137L的取代。
36.如权利要求26所述的工程化蛋白质，其包含选自由以下组成的组的空腔填充取代：G106W、A107F、T160M、L158W、I128F、A190M、V118F、V118M、Q426W、L165F、V191I、T160V、S149V、I137L、S149I、V169I、N46V、T49I、V/I122L、S192L、T317L、V162F、V162W、L105I、L105F、L105W、L134I、A117M、S347M、S347K、S347Q、V47M、G261M、I268M、S470Y、V231I、A374V、I217V和/或S355F。
37.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含选自由以下组成的组的脯氨酸取代：A86P、A107P、A113P、T114P、V148P、S443P、D461P、L130P、L141P、K142P、E146P、L151P、N153P、V162P、A/D185P、D186P、L187P、K188P、N342P和A344P。
38.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含在对应于S376、G366和/或S194的位置处的取代。
39.如权利要求38所述的工程化蛋白质，其包含对应于S376T、G366S和/或S194Q的取代。
40.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含在对应于K166的位置处的取代。
41.如权利要求40所述的工程化蛋白质，其包含对应于K166E的取代。
42.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含在对应于H435的位置处的调节pH敏感性的取代。
43.如权利要求42所述的工程化蛋白质，其包含对应于H435E、H435D或H435N的取代。
44.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含在对应于L66、L73、N145、Q195、E453、L66、K188、H368、D461、T49和/或V262的位置处的静电相互作用取代。
45.如权利要求44所述的工程化蛋白质，其包含对应于L66N、L73E、N145E、Q195K、E453Q、L66D、K188R、H368R、D461E、T49E和/或V262D的取代。
46.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含对应于L110C、T127C、A140C、A147C、N153C、L219K、V231I、N322C、T365C、E453Q和/或V463C的取代。
47.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含对应于T127C、N153C、A185P、T365C、V463C、L219K和V231I的取代。
48.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含对应于T127C、N153C、A185P、T365C、V463C、L219K、V231I和RQSR(SEQ ID NO:1-7中的任一者的残基99-102)至RRRR(SEQID NO:10)的取代。
49.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含对应于T127C、N153C、T365C、V463C、L219K和V231I的取代。
50.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含对应于L110C、T127C、A140C、A147C、N153C、A185P、L219K、V231I、N322C、T365C、N368H、E453Q和V463C的取代。
51.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含对应于L110C、T127C、A140C、A147C、N153C、A185P、L219K、V231I、N322C、T365C、N368H、E453Q、V463C和RQSR(SEQ ID NO:1-7中的任一者的残基99-102)至RRRR(SEQ ID NO:10)的取代。
52.如权利要求1-5中任一项所述的工程化蛋白质，其包含对应于L110C、T127C、A140C、A147C、N153C、L219K、V231I、N322C、T365C、N368H、E453Q和V463C的取代。
53.如权利要求6-52中任一项所述的工程化蛋白质，其包含对应于SEQ ID NO:1-7中的任一者的残基87-104至GGGGSGGGGSR(SEQ ID NO:8)的取代。
54.如权利要求1-53中任一项所述的工程化蛋白质，其包含至少一个工程化二硫键、至少一个空腔填充取代和至少一个脯氨酸取代的组合。
55.如权利要求1-54所述的工程化蛋白质，其中所述工程化蛋白质包含与SEQ ID NO:14或16至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的多肽序列。
56.如权利要求1-54所述的工程化蛋白质，其中所述工程化蛋白质包含与SEQ ID NO:15或17至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的多肽序列。
57.如权利要求1-56中任一项所述的工程化蛋白质，其与SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
58.如权利要求1-56中任一项所述的工程化蛋白质，其包含与SEQ ID NO:3具有95％同一性的工程化hMPV F蛋白胞外结构域。
59.如权利要求1-58中任一项所述的工程化蛋白质，其中所述蛋白质与三聚化结构域融合或缀合至三聚化结构域。
60.如权利要求59所述的工程化蛋白质，其中所述蛋白质与三聚化结构域融合。
61.如权利要求60所述的工程化蛋白质，其中所述三聚化结构域包含T4纤维蛋白三聚化结构域。
62.如权利要求1-58中任一项所述的工程化蛋白质，其中所述蛋白质与跨膜结构域融合或缀合至跨膜结构域。
63.如权利要求62所述的工程化蛋白质，其中所述蛋白质与跨膜结构域融合。
64.如权利要求62所述的工程化蛋白质，其中所述跨膜结构域包含偏肺病毒(MPV)F蛋白跨膜结构域。
65.如权利要求1-62中任一项所述的工程化蛋白质，其包含N端信号序列。
66.如权利要求65所述的工程化蛋白质，其中所述N端信号序列是MSWKVMIIISLLITPQHG(SEQ ID NO:11)。
67.一种工程化偏肺病毒(MPV)F蛋白三聚体，其包含至少一个根据权利要求1-66中任一项所述的亚基。
68.如权利要求67所述的工程化三聚体，其中相对于野生型偏肺病毒(MPV)F亚基的三聚体，所述三聚体稳定在融合前构象。
69.如权利要求67所述的工程化三聚体，其中所述三聚体包含至少一个在亚基之间的工程化二硫键。
70.如权利要求69所述的工程化三聚体，其中所述至少一个在亚基之间的工程化二硫键选自：S316C和D421C。
71.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体；以及(i)如权利要求1-66中任一项所述的工程化蛋白质，或(ii)如权利要求67-70中任一项所述的工程化三聚体。
72.如权利要求71所述的组合物，其还包含佐剂。
73.一种核酸分子，其包含编码如权利要求1-66中任一项所述的工程化蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列。
74.如权利要求73所述的核酸，其中所述核酸包含DNA表达载体。
75.如权利要求73所述的核酸，其中所述核酸包含mRNA。
76.一种预防受试者的偏肺病毒(MPV)感染或与偏肺病毒感染相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求71-72中任一项所述的药物组合物或如权利要求73-75中任一项所述的核酸分子。
77.如权利要求71-72中任一项所述的药物组合物或如权利要求73-75中任一项所述的核酸分子，其用于治疗或预防受试者的偏肺病毒(MPV)感染或与偏肺病毒感染相关的疾病。
78.如权利要求71-72中任一项所述的药物组合物或如权利要求73-75中任一项所述的核酸分子在制造用于治疗或预防偏肺病毒(MPV)感染或与偏肺病毒感染相关的疾病的药物中的用途。
79.一种组合物，其包含与抗体结合的如权利要求1-66中任一项所述的工程化蛋白质或如权利要求67-70中任一项所述的工程化三聚体。
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