ES2733279T3 - Partículas de rotavirus con proteínas de superficie quiméricas - Google Patents

Abstract

Un complejo proteico quimérico que comprende una proteína de superficie VP7 de rotavirus formadora de trímeros unida a una proteína heteróloga, en donde la proteína de superficie VP7 de rotavirus está unida a la proteína heteróloga de manera no covalente mediante un sistema adaptador de dos partes, donde una parte del sistema adaptador es formado por un primer polipéptido adaptador que se fusiona con la proteína de superficie VP7 del rotavirus, opcionalmente a través de una secuencia enlazadora, y la otra parte del adaptador está formado por un segundo polipéptido adaptador que se fusiona con la proteína heteróloga, opcionalmente a través de una secuencia enlazadora, por lo que ambas partes del sistema adaptador forman un complejo estable entre sí y el complejo proteico quimérico puede convertirse en parte de la capa externa de una partícula de rotavirus mediante la recubierta in vitro de partículas de rotavirus de doble capa.

Description

DESCRIPCION

Partículas de rotavirus con proteínas de superficie quiméricas

REFERENCIA CRUZADA A APLICACIONES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Europea No. 13175637.1, presentada el 8 de julio de 2013.

LISTADO DE SECUENCIAS

Se adjunta una copia electrónica de una lista de secuencias que se incorpora aquí como referencia y forma parte de la solicitud tal como se presenta.

APOYO DEL GOBIERNO

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos. Con los números de subvención P01-GM062580 y AI-89618 otorgados por los Institutos Nacionales de la Salud. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere al uso de partículas de rotavirus para exhibir una proteína heteróloga, sola o en complejo con otra molécula. La invención se refiere adicionalmente a métodos que emplean estas partículas de rotavirus modificadas para determinar rápidamente la estructura de la proteína heteróloga o el complejo usando microscopía de crioelectrones (crio-EM). La invención también se refiere a un método para inmunizar un paciente, en donde el método comprende administrar al paciente las partículas de rotavirus modificadas de la invención.

ANTECEDENTES

La familia de Reoviridae comprende un grupo estructuralmente relacionado de virus. Los miembros de esta familia de virus pueden provocar infecciones del sistema gastrointestinal y los tractos respiratorios en los mamíferos y aves. Algunos virus de esta familia también pueden infectar plantas.

Los Reoviridae son virus de ARN de doble hebra, no envueltos constituidos de una cápside icosahédrica que se compone típicamente de una capa exterior de proteína y una o más capas interiores de proteína. El género Rotavirus forma parte de la familia Reoviridae. Los rotavirus forman partículas de virus de tres capas. La capa exterior de una partícula de rotavirus consiste de una proteína de envoltura VP7, y una proteína pico, VP4; la capa intermedia consiste de VP6; y la capa interior se forma por VP2. La partícula de virus de tres capas es infecciosa, después de la activación por tripsina. Durante la entrada de células de rotavirus, la capa exterior de las partículas del virus se remueve por un mecanismo llamado “eliminación del recubrimiento”, y la partícula de doble capa entra al citoplasma. Durante la entrada de las células, el rotavirus penetra una membrana celular, posiblemente una membrana endosómica. La partícula de rotavirus de doble capa está transcripcionalmente activa. En el citoplasma, transcribe el genoma, extruyendo el ARN a través de los poros en su superficie. Los nuevos transcriptos se usan para fabricar proteínas de rotavirus y segmentos de genoma de ARN de doble hebra nuevos, que se empacan en las partículas reovíricas recientemente formadas.

Para algunos Reoviridae, el proceso de eliminación del recubrimiento se puede simular in vitro usando partículas reovíricas purificadas. En el caso de los rotavirus, la quelación de calcio o choque térmico provoca la eliminación del recubrimiento de las partículas reovíricas in vitro. Una vez que la capa exterior de proteínas se ha removido, las partículas de doble capa de rotavirus resultante se pueden “recubrir” con versiones recombinantemente expresadas de las proteínas que forman la capa exterior. Al recubrir con VP4 y VP7 recombinantes, se pueden formar partículas de rotavirus recubiertas infecciosas que se asemejan estrechamente a viriones maduros. Al recubrir con VP7 se pueden formar partículas sin picos, de tres capas, solas, que son mínimamente infecciosas. Al modificar genéticamente las regiones de codificación de las proteínas individuales de la capa exterior y al expresarlas recombinantemente, las propiedades de las proteínas que constituyen la capa exterior se pueden estudiar en experimentos de recubrimiento sin requerir la producción de virus completamente recombinantes. Para describir estos tipos de experimentos, se ha acuñado el término “genética de recubrimiento”.

En el caso de los reovirus, el estado metaestable de la partícula subvírica infecciosa ha permitido el uso de microscopía de crioelectrones (crio-EM) en elucidar la base estructural para el mecanismo cebador que se usa por los reovirus para entrar a sus células hospederas. Similarmente, se han usado partículas de rotavirus recubiertas in vitro para estudiar las interacciones moleculares en el ensamblaje de rotavirus y eliminación del recubrimiento usando la crio-EM. La presente invención se basa en los avances tecnológicos que se llevaron a cabo por estos estudios de recubrimiento y crio-EM.

Peralta et al., 2009, Virology Journal 6:192 describes the use of rotavirus V2 and VP6 proteins to display epitopes on the surface of double layered VLPs.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

La combinación de crio-EM de alta resolución en combinación con genética de recubrimiento ha hecho posible hacer avanzar el uso del modelo de rotavirus más allá del estudio de los rotavirus mismos. Los inventores han encontrado que las partículas de rotavirus se pueden usar para la rápida determinación de estructura de las proteínas triméricas heterólogas que se muestran sobre la superficie de las partículas de rotavirus modificadas. Las partículas de rotavirus modificadas para mostrar proteínas triméricas heterólogas sobre su superficie también son útiles en producir una amplia gama de vacunas novedosas.

La presente invención proporciona partículas de rotavirus que comprenden una proteína de superficie quimérica compuesta de una proteína de superficie de rotavirus ligada a una proteína heteróloga. Un aspecto de la invención, la proteína de superficie de rotavirus se liga a la proteína heteróloga a través de una secuencia ligadora. En otro aspecto de la invención, la proteína de superficie de rotavirus se liga a la proteína heteróloga a través de un sistema adaptador. En un aspecto preferido de la invención, la proteína heteróloga se liga no covalentemente a la proteína de superficie de rotavirus por un sistema adaptador de dos partes, donde una parte del sistema adaptador se liga a la proteína de superficie de rotavirus y la otra parte del sistema adaptador se liga a la proteína heteróloga, mediante lo cual ambas partes del sistema adaptador forman un complejo estable uniendo de esta manera no covalentemente la proteína heteróloga a la proteínas de superficie de rotavirus. La proteína de superficie quimérica puede ser parte de la capa exterior de la partícula de rotavirus al recubrir in vitro las partículas de rotavirus de doble capa (DLPs) con ella.

La invención proporciona además un primer ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína de superficie de rotavirus modificada que comprende una proteína de superficie de rotavirus, un primer polipéptido adaptador y, opcionalmente, una secuencia ligadora. La invención también proporciona un segundo ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína heteróloga, un segundo polipéptido adaptador y, opcionalmente, una secuencia ligadora. El primer polipéptido adaptador y el segundo polipéptido adaptador son capaces de formar un complejo estable. Típicamente, el marco de lectura abierto en los ácidos nucleicos de la invención se liga operacionalmente a una secuencia promotora. En algunas modalidades, el polipéptido adaptador comprende una secuencia de repetición héptada. Una célula que contiene un ácido nucleico de la invención también se proporciona. Los ácidos nucleicos y las células que contienen los mismos se pueden usar para preparar las proteínas de superficie quiméricas de la invención.

La invención se refiere adicionalmente a un kit que comprende la primera y segunda secuencias de ácido nucleico de la invención. En algunas modalidades, un kit de acuerdo con la invención puede comprender un primer ácido nucleico que codifica una proteína de superficie de rotavirus modificada que comprende una proteína de superficie de rotavirus y un primer polipéptido adaptador, y un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido adaptador y un sitio de clonación múltiple, mediante lo cual la inserción de una región de codificación para una proteína heteróloga en el sitio de clonación múltiple produce un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión que comprende la proteína heteróloga y el segundo polipéptido adaptador, en donde el primer polipéptido adaptador y el segundo polipéptido adaptador son capaces de formar un complejo estable. Los kits de la invención pueden comprender además una partícula de rotavirus. La partícula de rotavirus se puede derivar de la misma especie de rotavirus de la cual la proteína de superficie de rotavirus se derivó o de una especie diferente. Por ejemplo, el rotavirus rhesus VP7 se puede usar para recubrir las DLPs preparadas de rotavirus de bovino y viceversa.

Las partículas de rotavirus que comprenden una proteína de superficie quimérica se pueden preparar por varios métodos. Un método preferido de la invención implica hacer propagar una partícula de rotavirus nativa que comprende una capa exterior y una célula desarrollada en un medio de cultivo, purificar las partículas del medio de cultivo, remover la capa exterior de la partícula para obtener un DLP de rotavirus, y recubrir la DLP rotavirus con una o más proteínas de superficie quiméricas para formar una partícula de rotavirus que comprende la proteína o proteínas de superficie quiméricas. Una partícula de rotavirus nativa es una partícula de tres capas, en donde la tercera capa más exterior forma la cubierta exterior de la partícula de rotavirus.

En un aspecto particular, la invención se refiere una primera proteína de fusión que comprende una proteína de superficie de rotavirus que forma trímeros, una secuencia de repetición héptada, y opcionalmente una secuencia ligadora. La invención proporciona además una segunda proteína de fusión que comprende una proteína heteróloga que forma trímeros, una secuencia de repetición héptada y opcionalmente una secuencia ligadora. La primera proteína de fusión y la segunda proteína de fusión son capaces de formar un complejo estable a través de las secuencias de repetición héptadas comprendidas en cada una de ellas. En algunas modalidades, la invención proporciona una proteína de superficie quimérica formada por la primera proteína de fusión y la segunda proteína de fusión. La proteína de superficie quimérica se puede mostrar sobre la superficie de una partícula de rotavirus.

En un aspecto de la invención, las partículas de rotavirus que comprenden una proteína de superficie quimérica se usan para determinar la estructura de una proteína heteróloga que forma una porción de la proteína de superficie quimérica. Por ejemplo, la invención proporciona un método para obtener un modelo tridimensional de una proteína de superficie quimérica, en donde el método comprende los pasos de (i) recubrir un DLP de rotavirus con una proteína de superficie quimérica que comprende todo o parte de una proteína heteróloga para producir una suspensión de partículas de rotavirus que muestran la proteína de superficie quimérica, (ii) congelar la suspensión, (iii) formar en imagen las partículas de rotavirus usando crio-EM para obtener una pluralidad de micrografías, y (iv) analizar la pluralidad de micrografías para obtener un modelo tridimensional de la proteína de superficie quimérica. En algunas modalidades, el paso (i) se puede subdividir en dos pasos, particularmente (a) un paso de recubrimiento en el cual la DLP de rotavirus se recubre con una proteína de superficie de rotavirus que comprende un primer adaptador para formar partículas de rotavirus y (b) un paso de ligación en el cual la DLP de rotavirus se incuba en presencia de una proteína heteróloga que comprende un segundo adaptador mediante lo cual se forma un complejo entre el primer adaptador y el segundo adaptador que da por resultado una proteína de superficie quimérica que se muestra en las partículas de rotavirus. En algunos casos, el método se puede modificar para determinar la estructura de una proteína heteróloga ligada a una molécula que se liga específicamente a la proteína heteróloga. El método modificado comprende los pasos de (i) recubrir una DLP de rotavirus con una proteína de superficie quimérica que comprende todo o parte de una proteína heteróloga para producir una suspensión de partículas de rotavirus que muestran la proteína de superficie quimérica, (ii) agregar a la suspensión una molécula que se liga específicamente a la proteína heteróloga, en donde la molécula forma un complejo con la proteína de superficie quimérica, (iii) congelar la suspensión, (iv) formar en imagen las partículas de rotavirus usando crio-EM para obtener una pluralidad de micrografías, y (v) analizar la pluralidad de micrografías para obtener un modelo tridimensional de la proteína de superficie quimérica combinada con la molécula. La molécula puede ser una molécula proteínica. Por ejemplo, la molécula proteínica puede ser todo o parte de un receptor o anticuerpo que liga específicamente la proteína heteróloga. Alternativamente, la molécula proteínica puede ser un polipéptido o péptido que se liga específicamente la proteína heteróloga. En otras modalidades, la molécula es una molécula no proteínica. Por ejemplo, la molécula no proteínica puede ser un ácido nucleico

En un aspecto adicional, las partículas de rotavirus preparadas de acuerdo con la invención se usan como un medicamento. En una modalidad, la invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende una partícula de rotavirus que comprende la proteína de superficie quimérica de la invención. La invención se refiere además a un método para tratar a un paciente en necesidad del mismo que comprende administrar al paciente la partícula de rotavirus de la invención, por ejemplo en la forma de una composición inmunogénica de la invención.

El concepto subyacente de la invención se puede extender a otras proteínas heterólogas (triméricas o no triméricas) y otros virus (en reovirus particulares) o ensamblajes (por ejemplo partículas similares a virus, jaulas de ferritina, etc.) al adaptar los métodos descritos en la presente.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Partículas víricas

El Rotavirus es un género de virus de ARN de doble hebra en la familia Reoviridae que comprende cinco tipos conocidos (Rotavirus A-E). Los rotavirus son una causa principal de gastroenteritis de la niñez. El rotavirus es una partícula icosahédrica de tres capas, no envuelta. Una partícula de tres capas infecciosa (TLP) o virión se forma de una partícula de doble capa no infecciosa (DLP) al recubrir DLP con una proteína de envoltura VP7 y la proteína pico VP4. La VP7 es un trímero, y 260 de tales trímeros decoran el exterior de la partícula recubierta. La DLP, que se compone de capas de proteínas icosahédricas VP2 y VP6 concéntricas es de aproximadamente 700 A en diámetro y encapsida 11 segmentos de genoma de ARN de doble hebra, la polimerasa vírica (VP1), y una enzima de terminación (VP3). Durante la infección de una célula, las proteínas VP4 y VP7, que forman la capa exterior de la partícula de rotavirus, se disocian de la DLP en un medio ambiente bajo en calcio (probablemente en el compartimiento endosómico) - un proceso referido como “eliminación del recubrimiento” - y suministran el DLP que contiene la maquinaria de transcripción de ARN viral en el citoplasma. En ese punto, la DLP se sintetiza, se termina y libera copias de las 11 especies de ARNm.

La disociación o “eliminación del recubrimiento” de VP4 y VP7 de una partícula de rotavirus se puede llevar a cabo in vitro al incubar partículas de rotavirus en presencia de un quelante de calcio tal como EDTA o EGTA o por choque térmico. Las DLPs resultantes se pueden recubrir in vitro con VP4 y VP7 recombinantemente expresadas para formar partículas de rotavirus completamente infecciosas. Las partículas recubiertas de esta forma son muy ordenadas y proporcionan imágenes de crio-EM de alta resolución y mapas de densidad. Usando las TLPs reconstituidas in vitro, se ha usado el crio-EM para estudiar las interacciones moleculares en el ensamblaje de rotavirus y la separación en una resolución comparable con aquella de cristalografía de rayos X (ver las referencias 1 y 2).

Los inventores muestran en la presente que una proteína trimérica heteróloga (tal como hemaglutinina de influenza) se puede unir a la proteína VP7 trimérica, formando de esta manera una proteína de superficie quimérica que puede proyectarse desde la superficie de una DLP de rotavirus adecuadamente recubierta, por lo tanto haciendo posible determinar la estructura de la proteína heteróloga con los mismos métodos de crio-EM que han proporcionado previamente estructuras de resolución casi atómicas del rotavirus y sus subpartículas. El método hace posible por primera vez desarrollar un ensayo de alto rendimiento para la determinación de estructura de los complejos de antígeno-anticuerpo. Esto no fue previamente posible debido a las limitaciones de la cristalografía de rayos X, que ha sido el método de elección para determinar la estructura de los complejos de antígeno-anticuerpo.

En principio, cualquier partícula de virus icosahédrica no envuelta que comprende una capa interior y una capa exterior se puede usar para practicar los métodos de la invención. Por ejemplo, la muestra de una proteína de superficie quimérica que comprende todo o parte de la proteína heteróloga es casi imposible usando cualquiera virus icosahédrico por el cual un sistema de genética inversa para la producción de las partículas de virus se ha establecido. Un sistema de genética inversa basada en plásmido que consiste de diez constructos de ADNc de reovirus se ha establecido para los reovirus de mamífero (ver referencia 3). La simetría octamérica de las jaulas de ferritina también tiene ejes de simetría de 3 veces y es adecuado para la práctica de esta invención. Otras proteínas que se ensamblan en las estructuras regulares, particuladas con ejes de simetría de 3 veces pueden ser adecuadas para la práctica de esta invención.

Idealmente, la capa exterior de la partícula de virus de un virus icosahédrico no envuelto se puede remover o separar, por ejemplo por tratamiento por proteasa o bajo condiciones bajas en calcio, para producir partículas subvíricas que comprenden la capa(s) interior solamente y se pueden recubrir con proteínas de capa exterior recombinantemente producidas. El re-ensamblaje o recubrimiento in vitro de las partículas subvíricas para completar las partículas reovíricas por la adición de la proteína(s) de capa exterior recombinantemente expresada es particularmente ventajoso en casos donde la presencia de las proteínas de superficie quimérica interferiría con el ensamblaje apropiado del virus propagado en el cultivo celular usando un procedimiento de genética inversa. Además, solo los vectores de expresión para las proteínas de capa exterior necesitan ser construidas, removiendo la necesidad por un sistema de genética inversa basada en plásmidos eficiente para estar en su lugar. El virus nativo se puede propagar simplemente en células de cultivo de tejido, y las partículas reovíricas se pueden separar de la capa exterior y volverse a ensamblar in vitro usando proteínas de capa exterior recombinantemente expresadas. De esta manera, usando un método que depende del recubrimiento in vitro de las partículas subvíricas para completar las partículas reovíricas elimina la necesidad para transfectar grandes números de plásmidos y remueve el paso de propagación adicional necesario típicamente para producir grandes números de partículas de virus del sistema de genética inversa basado en plásmido, haciendo tal método más amable para aplicaciones de alto rendimiento. De acuerdo con el conocimiento de los inventores, todos los virus icosahédricos no envueltos conocidos donde la capa exterior de la partícula de virus se puede separar y la partícula subvírica se puede recubrir con proteínas de capa exterior recombinantemente expresadas para formar partículas de virus infecciosas que pertenecen a la familia de Reoviridae. Esta familia se subdivide de dos subfamilias, Sedoreovirinae y Spinareovirinae, que comprenden seis y nueve géneros, respectivamente. La subfamilia Sedoreovirinae comprende los géneros Cardoreovirus, Mimoreovirus, Orbivirus, Phytoreovirus, Rotavirus, y Seadornavirus. La subfamilia Spinareovirinae comprende los géneros Aquareovirus, Coltivirus, Cypovirus, Dinovernavirus, Fijivirus, Idnoreovirus, Mycoreovirus, Orthoreovirus, y Oryzavirus.

De manera preferente, la partícula de virus usada en practicar la invención tiene tres o algunas proteínas de capa exterior. De manera más preferente, la capa exterior de la partícula de virus se puede formar por una proteína de capa exterior individual, que es la proteína de superficie exterior usada en la preparación de la proteína de superficie quimérica. Un bajo número de proteínas de capa exterior es ventajoso debido a que algunas proteínas necesitan ser expresadas recombinantemente para recubrir las partículas subvíricas después de la separación.

El rotavirus tiene dos proteínas de capa exterior, VP4 y VP7, pero solamente la VP7 es una proteína de envoltura que es requerida para formar la capa exterior de una partícula de rotavirus. En muchos casos, solo el recubrimiento de las DLPs de rotavirus con una proteína de capa exterior, VP7, es suficiente a fin de practicar la invención.

Complejos de proteínas quiméricas

Como concepto fundamental de la invención, la proteína de superficie de rotavirus se liga no covalentemente a la proteína heteróloga a través de un sistema adaptador. En un aspecto preferido de la invención, la proteína heteróloga se liga no covalentemente a la proteína de superficie de rotavirus por un sistema adaptador de dos partes, donde una parte del sistema adaptador se liga a la proteína de superficie de rotavirus y la otra parte del sistema adaptador se liga a la proteína heteróloga, mediante lo cual ambas partes del sistema adaptador forman un complejo estable uniendo no covalentemente de esta manera la proteína heteróloga a la proteína de superficie de rotavirus. El sistema adaptador se compone típicamente de un primer polipéptido adaptador y un segundo polipéptido adaptador. El primer polipéptido adaptador se fusiona a la proteína de superficie de rotavirus, opcionalmente a través de la secuencia ligadora. El segundo polipéptido adaptador se fusiona a la proteína heteróloga, opcionalmente a través de una secuencia ligadora. El primero y segundo polipéptidos adaptadores interactúan entre sí para formar un complejo estable uniendo por lo tanto no covalentemente la proteína de superficie de rotavirus a la proteína heteróloga, formando de esta manera la proteína de superficie quimérica.

Proteína de superficie vírica

La capa exterior de una partícula de virus adecuada para practicar la invención comprende típicamente de varias proteínas de superficie exterior diferentes. La proteína de superficie principal es particularmente adecuada para mostrar una proteína heteróloga, ya que cubre la mayoría de la superficie de la partícula de virus. Por ejemplo, la superficie exterior del rotavirus (excluyendo los picos) se forma por 780 copias de la proteína VP7, que forma homotrímeros. La elección de una partícula vírica con una proteína de superficie principal que forma homotrímeros es particularmente preferida para practicar la invención.

En una modalidad específica, la proteína de superficie vírica les una proteína de superficie de rotavirus. En otra modalidad específica, la proteína de superficie vírica es una glicoproteína.

Aunque no se reivindica como parte de la invención, en principio, otros virus con proteínas de la superficie viral pueden ser adecuados para los métodos descritos en el presente documento, incluidos los ortorrevirus. Por ejemplo, la cápside viral exterior de la aquareovirus se forma por 200 trímeros de una proteína designada VP5. En los ortoreovirus de mamífero, la capa exterior de una partícula reoviral infecciosa contiene 600 copias de la proteína de penetración de membrana trimérica pl, que es llamada con la proteína chaperona a3 (también presente en 600 copias) formando de esta manera un heterohexámero.

Proteína Heteróloga

Muchas proteínas heterólogas se pueden mostrar usando una proteína de superficie de rotavirus trimérica, proporcionaron un ligador de longitud apropiada y/o un sitio de inserción apropiado dentro de la proteína de superficie que se eligen para evitar el impedimento estérico entre los monómeros durante el ensamblaje del trímero. No existe límite de tamaño superior para la proteína heteróloga siempre y cuando la proteína heteróloga no forme un volumen que se traslape con los volúmenes vecinos de otras proteínas heterólogas montadas. De manera preferente se usa un sistema adaptador para mostrar la proteína heteróloga sobre la proteína de superficie de rotavirus trimérica. Las proteínas heterólogas que no son solubles, forman oligómeros de orden superior o agregados que no se consideran típicamente adecuados en practicar la invención. Cualquiera de los problemas de tamaño debido al impedimento estérico se puede superar al dirigir un ligador apropiado o sistema adaptador.

En el contexto de la proteína heteróloga, el término “heterólogo” significa típicamente que la proteína no es una proteína de rotavirus. En algunas modalidades, la expresión “proteína heteróloga” puede significar que la proteína no se derive de la misma cepa de rotavirus que se usa para mostrar la proteína.

Las proteínas de superficie triméricas son particularmente útiles para mostrar proteínas heterólogas triméricas. Ejemplos de proteínas heterólogas triméricas incluyen proteínas de entrada de células víricas triméricas y otras proteínas de superficie vírica triméricas. En particular aquellas que se orientan por anticuerpos neutralizantes. Ejemplos específicos son la hemaglutinina de influenza (HA), virus de inmunodeficiencia humana (HIV) gp140, la glicoproteína del virus del Ébola, la glicoproteína del virus de la rabia (RVG), la proteína Env de virus de encefalitis de artritis caprina, la proteína F del virus sincitial respiratorio (RSV), la proteína gB y sus complejos encontrados en los virus de herpes simple humanos y citomegalovirus humano (HCMV) etc.

En algunas modalidades, la proteína de superficie de rotavirus y/o la proteína heteróloga incluye una etiqueta de trimerización para ayudar en ensamblaje del complejo de heterohexámeros formado por la proteína de superficie de rotavirus trimérica y la proteína heteróloga trimérica. La etiqueta de trimerización, etiquetas de trimerización basadas particularmente en bobina enrollada (por ejemplo GCN4, [10]), también puede servir como módulos estructurales para extender el espacio disponible para una proteína heteróloga que se muestra sobre la superficie de una partícula de rotavirus recubierta con una proteína VP7 de rotavirus modificada. Otra etiqueta de trimerización adecuada se puede derivar de la fibritina T4 de bacteriófago [11].

Las proteínas heterólogas que no son triméricas pueden interactuar con una etiqueta de trimerización presente en las proteínas de superficie de rotavirus. Como ejemplo, si la proteína heteróloga tiene una a-hélice accesible que podría interactuar con la a-hélice es de una etiqueta de trimerización basada en una súper hélice, esa proteína heteróloga podría ligar la etiqueta de trimerización. Si no existe impedimento estérico, hasta tres de tales proteínas heterólogas podrían ligar la etiqueta de trimerización simultáneamente, formando un atado de seis hélices. Si menos de tres de tales proteínas heterólogas se ligan, el atado de seis hélices sería incompleto, conteniendo las tres hélices interiores contribuidas por la etiqueta de trimerización presente en la proteína de rotavirus pero solo una o dos de las hélices exteriores del atado. La proteína heteróloga no trimérica podría tener 1, 2, 4, o más unidades (es decir ser un monómero, dímero, tetrámero, u otro oligómero), con la condición de que al menos una de las subunidades tuvieron una a-hélice que podría interactuar con la etiqueta de trimerización presente en la proteína de superficie de rotavirus.

Una proteína heteróloga monomérica puede incluir múltiples a-hélices arregladas tal que más de una hélice podría interactuar con las a-hélices de la etiqueta de trimerización presente en la proteína de superficie de rotavirus, formando un atado de seis hélices completo o parcial.

Tetrámeros (o estructuras de orden superior) en donde al menos tres de los monómeros contienen a-hélices adecuadamente arregladas podrían asociarse con la etiqueta de trimerización unida a la proteína de superficie de rotavirus para formar un atado de seis hélices. En ciertas modalidades, los tetrámeros (o estructuras de orden superior), en donde al menos dos de los monómeros contiene a-hélices adecuadamente arregladas, podrían asociarse con la etiqueta de trimerización asociada con la proteína de superficie de rotavirus para formar un atado de seis hélices parcial, perdiendo una de las hélices exteriores. Las subunidades de la proteína heteróloga pueden ser idénticas (es decir, un homodímero, o motrímero, homotetrámero, etc.), o no pueden ser idénticas (es decir, un heterodímero, heterotrímero, heterotetrámero, etc.).

Si la etiqueta de trimerización presente en la proteína de superficie de rotavirus no es una súper hélice ahelicoidal, el elemento estructural de interacción en la proteína heteróloga podría tener una estructura secundaria que liga la etiqueta de trimerización pero no es a-helicoidal.

De manera preferente, la proteína heteróloga no es un anticuerpo que se liga específicamente a una proteína de superficie de rotavirus.

Sistema adaptador

Un sistema adaptador para mostrar la proteína heteróloga en una partícula de rotavirus. El sistema adaptador se compone típicamente de dos moléculas adaptadoras. La primera molécula adaptadora se liga covalentemente a la proteína de superficie de rotavirus que se eligió para mostrar una proteína heteróloga. La segunda molécula adaptadora se liga covalentemente a la proteína heteróloga. La primera molécula adaptadora y la segunda molécula adaptadora interactúan entre sí para formar un complejo estable.

Los sistemas adaptadores se componen típicamente de dos polipéptidos adaptadores. El primer polipéptido adaptador se fusiona a la proteína de superficie de rotavirus que se eligió para mostrar una proteína heteróloga. El segundo polipéptido adaptador se fusiona a la proteína heteróloga. El primer polipéptido adaptador y el segundo polipéptido adaptador pueden interactuar entre sí para formar un complejo estable.

Son conocidos muchos polipéptidos que se asocian entre sí para formar un complejo estable. En algunos casos, estos polipéptidos se derivaran de diferentes proteínas, por ejemplo un receptor y un ligando o un anticuerpo y un antígeno. En otros casos, estos polipéptidos se pueden derivar de la misma proteína tal como las dos secuencias de repetición héptadas de VIH gp41.

Los sistemas adaptadores adecuados que no se dependen de las interacciones entre dos polipéptidos adaptadores también se pueden contemplar. Por ejemplo, la proteína de superficie de rotavirus se puede modificar para incluir un sitio de glicosilación específico, y la proteína heteróloga se puede modificar para incluir un dominio de lectina que reconoce específicamente el glicano en el sitio de glicosilación. Ejemplos de lectinas que reconocen estructuras de glicano específicas son bien conocidos en la técnica.

Otro sistema adaptador adecuado que no depende de las interacciones entre dos polipéptidos adaptadores es el sistema de estreptavidina-biotina. La estreptavidina monomérica que se ha mutado para prevenir la formación de tetrámeros y para mejorar la solubilidad se usa de manera preferente [12]. La estreptavidina monomérica se puede fusionar a la proteína de superficie de rotavirus que se eligió para mostrar una proteína heteróloga. Para que se presente la formación compleja, la proteína heteróloga se biotiniliza. La biotinilación enzimática es preferida ya que permite que la biotina se ligué específicamente a un residuo de aminoácido presente en la proteína que se va a biotinilar. Por ejemplo, la proteína heteróloga se puede modificar por la inserción de un “AviTag” o “Péptido Aceptor” (AP), que se puede biotinilar específicamente por una biotina ligasa (por ejemplo, BirA) en presencia de biotina y ATP (ver referencia 13 para detalles).

Otro sistema adaptador que no depende de las interacciones entre dos polipéptido adaptadores puede incluir un anticuerpo o ligado a un hapteno (por ejemplo, ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraácetico (DOTA)). Alternativamente, los quelantes DTPA y DOTA se pueden coordinar con iones de metal para formar complejos.

El uso de un sistema adaptador no es esencial para practicar la invención. Sin embargo, el uso de un sistema adaptador se puede referir para conservar óptimamente las características estructurales de la proteína heteróloga, en particular de las proteínas de superficie triméricas de otros virus que se van a demostrar en una partícula de rotavirus. El uso de un sistema adaptador es particularmente ventajoso debido a que la proteína de superficie de rotavirus que se ha modificado contiene un primer adaptador necesario para ser preparado solo una vez y se puede usar subsecuentemente con cualquier proteína heteróloga que se ha modificado para contener un segundo adaptador compatible.

Una ventaja adicional de usar un sistema adaptador es que la expresión y purificación se pueden optimizar separadamente para cada uno de los componentes de la proteína de superficie quimérica. En la mayoría de casos, la inserción de una secuencia de polipéptidos adaptadora no cambiará esas características de la proteína de superficie o de la proteína heteróloga que son relevantes para su expresión o purificación. De esta manera los sistemas de expresión existentes y los métodos de purificación se pueden usar típicamente sin modificación para preparar grandes cantidades de la proteína de superficie vírica que comprende el primer polipéptido adaptador y la proteína heteróloga que comprende el segundo polipéptido adaptador. En contraste, una proteína de superficie quimérica compuesta de una proteína de superficie vírica ligada covalentemente a una proteína heteróloga tendrá probablemente las características que difieren sustancialmente de las características de la proteína de superficie vírica o la proteína heteróloga cada una por sí misma.

Las proteínas de superficie de rotavirus y muchas proteínas de superficie de reovirales forman trímeros. De esta manera, en un aspecto de la invención, el sistema adaptador de elección forma de manera preferente un complejo trimérico. Se prefieren particularmente sistemas adaptadores en donde el primero polipéptido adaptador y el segundo polipéptido adaptador comprenden secuencias de repetición héptadas y forman estructuras ahelicoidales que permiten la formación de atados de seis hélices. De manera más preferente, tres copias del segundo polipéptido adaptador forman un trímero de súper hélice interior, mientras que tres copias del primer polipéptido adaptador se empacan en las hendiduras en la superficie de este trímero completando el atado de seis hélices. Sin embargo, también puede ser posible lo inverso, en cuyo caso tres copias del primer polipéptido adaptador forma un trímero de súper hélice interior, mientras que tres copias del segundo polipéptido adaptador se empacan en las hendiduras en la superficie de este trímero. Varios pares de polipéptidos que comprenden secuencias de repetición héptadas y forman atados de seis hélices son conocidos en la técnica. Estos se derivan típicamente de proteínas de fusión vírica. Debido a la simetría y estabilidad rotacional de sus atados de seis hélices, las proteínas de fusión vírica son la fuente preferida para las secuencias de polipéptidos adaptadoras.

Una de las proteínas de fusión víricaes más completamente estudiadas es la glicoproteína de envoltura del virus de inmunodeficiencia humano 1 (VIH-1). El ectodominio de la glicoproteína de envoltura VIH -1 consiste de gp120 y gp41. gp41 media la fusión entre las membranas virales y celulares. gp41 comprende dos secuencias de repetición héptadas, “región helicoidal 1” (HR1) y “región helicoidal 2” (HR2), que pueden formar un atado de seis hélices en la proteína nativa [14]. En una modalidad preferida, el primer polipéptido adaptador, y el segundo polipéptido adaptador del sistema adaptador corresponden a gp41 HR2 (SEQ ID NO: 1) y gp41 HR1 (SEQ ID NO: 2), respectivamente. En una modalidad preferida adicional, el primer polipéptido adaptador y el segundo polipéptido adaptador del sistema adaptador corresponden a la proteína del virus Nipah F HR2 (SEQ iD NO: 3) y HR1 (SEQ ID NO: 4), respectivamente. Sin embargo, se conocen varias otras proteínas de fusión vírica que pueden ser una fuente de polipéptidos HR1 y HR2 de interacción que se pueden usar para preparar el primero y segundo polipéptidos adaptadores. Estos incluyen la hemaglutinina 2 de influenza (HA2), las subunidad transmembrana (TM) del virus de leucemia de murino Moloney (Mo-MLV), la proteína F paramixovirus (incluyendo proteína F paramixovirus aviar, por ejemplo proteína F del virus Hendra) por ejemplo del virus sincitial respiratorio (RSV) y virus de enfermedad de Newcastle (NDV), la proteína pico de coronavirus (por ejemplo las proteínas pico de virus de hepatitis de ratón y SARS-CoV), la proteína ZEBRA del virus de Epstein-Barr, la proteína de fusión 5 del virus de simio etc. (ver referencias 14, 15, 16 y 17).

Donde la proteína heteróloga sola comprende secuencias de repetición héptadas y estas secuencias son compatibles con la secuencia de repetición héptada comprendida en una proteína de superficie de rotavirus modificada, la adición de las secuencias de repetición héptadas a la proteína heteróloga pueden no ser necesarias. En tal caso, las secuencias de repetición héptadas nativas de la proteína heteróloga pueden forman un atado de seis hélices con la secuencia de repetición héptada de la proteína de superficie de rotavirus modificada y la proteína heteróloga puede no ser necesaria ser modificada por la adición de una secuencia de repetición héptada que es extraña a la proteína heteróloga.

Por ejemplo, cualquiera de las proteínas de fusión víricaes listadas en lo anterior contienen secuencias de repetición héptadas de interacción, y estas secuencias de repetición héptadas nativas pueden ser capaces de interactuar con las secuencias de repetición héptadas en una proteína de superficie de rotavirus modificada para contener las secuencias de repetición héptadas. En algunas modalidades, puede ser preferido depender de las secuencias de repetición héptadas heterólogas a la proteína de fusión vírica, en particular donde el sistema adaptador de dos partes se eligen para permitir un procedimiento modular donde la misma proteína de superficie de rotavirus modificada se usa para mostrar varias proteínas heterólogas diferentes.

Son conocidos otros dominios de proteínas que comprenden secuencias de repetición héptadas que forman atados de seis hélices. Estas incluyen el dominio CARD de Apaf-1 y RAIDD, dominio efector de muerte de FADD y el dominio de muerte de p75 y Fas. Otras fuentes de secuencias de péptido que forman atados de seis hélices incluyen las SNAREs y GCN4-pII. Cualquiera de estos dominios o subsecuencias de péptidos se pueden adaptar del mismo modo para el uso en la presente invención. Por ejemplo, las tres hélices N-terminal y las tres hélices C-terminal del dominio CARD se pueden usar para el primero polipéptido adaptador y el segundo polipéptido adaptador, respectivamente, para formar un sistema adaptador adecuado para las proteínas de superficie monoméricas o diméricas.

Otros sistemas adaptadores basados en péptidos también se pueden usar. Por ejemplo, una porción de ligación a anticuerpo o antígeno del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab, un scFv, un anticuerpo de dominio (DAb)) que liga la proteína heteróloga que se desea mostrar en la superficie del virus se puede insertar en la proteína de superficie de rotavirus. El anticuerpo o porción de ligación a antígeno del mismo puede reconocer un epítopo específico que ya sea se puede insertar en la proteína heteróloga (por ejemplo, en la forma de una etiqueta de péptido) o puede estar naturalmente presente en la proteína heteróloga.

En algunas modalidades, un sistema adaptador de dos partes adecuado requiere la modificación de la proteína heteróloga solamente. Por ejemplo, en una modalidad de la invención, la proteína de superficie de rotavirus es una glicoproteína. En tal caso, una proteína heteróloga se puede modificar para contener un dominio de lectina que liga específicamente el glicano en la glicoproteína. Por ejemplo, la proteína VP7 del rotavirus se puede modificar por la introducción de un solo sitio de glicosilación en la porción de superficie expuesta de la proteína de modo que el domino de lectina de la proteína heteróloga modificada se liga específicamente al glicano en la proteína VP7 modificada.

Alternativamente, la proteína heteróloga se puede modificar para contener un dominio de ligación a antígeno de un anticuerpo que es específico para un epítopo en el antígeno de superficie de rotavirus. Por ejemplo, la proteína heteróloga se puede fusionar a un fragmento Fab de un anticuerpo que liga el antígeno de superficie de rotavirus con alta afinidad.

Secuencia ligadora

Las secuencias ligadoras separan los dominios derivados de diferentes proteínas y permiten que estos dominios se plieguen apropiadamente. Son conocidas en la técnica muchas secuencias ligadoras (ver referencia 18). Una secuencia ligadora se puede incluir para separar la proteína de superficie de rotavirus y/o la proteína heteróloga de la secuencia adaptadora. Alternativamente, donde la proteína de superficie de rotavirus y la proteína heteróloga forman dos partes de la misma proteína, ambas partes se pueden separar entre sí por una secuencia ligadora.

Tanto los ligadores rígidos como flexibles son conocidos. Una secuencia típica de un ligador flexible se compone de repeticiones de los aminoácidos G y S. Por ejemplo, el ligador puede tener la siguiente secuencia: GS, GSG, SGG, ^g G^s GG (SEQ ID NO: 5) o GSGS^g S^gT (S^eQ ID NO: 6). En algunas modalidades, la misma secuencia se repite múltiples veces (por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco o seis veces) para crear un ligador más largo. En otras modalidades, un solo aminoácido tal como S o G se pueden usar como un ligador. Un ligador rígido se puede componer de varis repeticiones de la secuencia de aminoácidos EAAAR (SEQ ID NO: 7).

Cuando se elige una secuencia ligadora, se debe tomar cuidado para seleccionar un ligador hidrofíli evitar la agregación de la proteína de superficie de rotavirus modificada o la proteína heteróloga.

Típicamente, el ligador es insensible a la proteasa pero en algunas modalidades el ligador contiene un sitio de escisión de proteasa. Los sitos de escisión de proteasa pueden ser útiles para remover etiquetas que se incluyen para supresión/purificación de por ejemplo una proteína de superficie de rotavirus modificada de la invención. Los sitios de escisión de proteasa también pueden ser útiles para exponer una secuencia de aminoácidos que se ha insertado en una proteína de superficie de rotavirus modificada para que la secuencia de aminoácidos sea más accesible en la superficie exterior de la proteína de superficie de rotavirus modificada después de la escisión con una proteasa específica de sitio. Por ejemplo, un sitio de escisión de proteasa se puede usar para exponer un polipéptido adaptador para mejorar su ligación al polipéptido adaptador correspondiente de un sistema adaptador de dos partes que se ha fusionado a una proteína heteróloga que se va a mostrar sobre la superficie de una partícula de rotavirus. En algunas modalidades, el uso de una escisión de proteasa para exponer un polipéptido adaptador que forma parte de una proteína de superficie de rotavirus modificada puede evitar la necesidad de secuencias ligadoras adicionales y de esta manera reducir el número de secuencias de aminoácidos adicionales que necesitan ser insertadas en una proteína de superficie de rotavirus modificada a fin de formar un complejo estable con una proteína heteróloga.

Los sitios de escisión de proteasa para una proteasa específica se pueden encontrar en una variedad de proteínas. Por ejemplo, la cascada de coagulación de sangre y la cascada de complementación contiene una variedad de proteasas muy específicas que reconocen los sitos de escisión en las proteínas más allá de la cadena abajo en la cascada. Usualmente, las enzimas en las etapas tempranas de una cascada son más específicas que las son las posteriores. Por ejemplo, el factor X es más específico que la trombina. Si la trombina se usa, los sitos de escisión sensibles a la trombina más preferida son aquellos encontrados en el fibrinógeno, factor X, y protrombina.

Ejemplos adicionales de proteasas de la cascada de coagulación de sangre, sus proteínas objetivo y sitios de escisión específicos se listan en la siguiente Tabla 1. La porción subrayada de la secuencia mostrada en la Tabla 1 es el sito de escisión mínimo que necesita ser incluido para la que la proteasa reconozca el objetivo.

Tabla 1

Otras proteasas que se han usado para escindir las proteínas de fusión incluyen enterocinasa, colagenasa, quimosina, urocinasa, renina, proteasa de Rinovirus 3C, proteasa del Virus de Marca del Tabaco (TEV), factor Xa, trombina, furina, y ciertas peptidasas señal (ver por ejemplo referencia 5).

De manera preferente el sitio de escisión se coloca de tal manera en el constructo final que cualquier etiqueta que se ha agregado a la proteína de superficie de rotavirus o la proteína heteróloga se puede remover fácilmente.

En algunas modalidades, el ligador contiene una etiqueta para detección y/o purificación. Muchas etiquetas para facilitar la detección de las proteínas son conocidas en la técnica. Las etiquetas de péptido frecuentemente usadas incluyen etiqueta FLAG (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 12), etiqueta HA (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 13), etiqueta His (por ejemplo HHHHHH; SEQ ID NO: 14), etiqueta Myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 15), etiqueta Strep I (AWRHPQFGG; SEQ ID NO: 16), etiqueta Strep II (NWSHPQFEK; SEQ ID NO: 17), y etiqueta de proteína C (EDQVDPRLIDGK; SEQ ID NO: 18). Las etiquetas His son preferidas ya que permiten la fácil detección por los anticuerpos anti-His y permiten la purificación de la proteína etiquetada usando una columna de níquel. La etiqueta Strep II permite una purificación simple y fácil de las proteínas recombinantemente expresadas que usan columnas de estreptavidina. En algunos casos, se usan etiquetas de proteínas. Por ejemplo, una etiqueta de glutationa-S-transferasa se puede incluir para permitir la fácil purificación de una proteína de la invención usando una columna que comprende glutationa inmovilizada. Se puede usar una etiqueta de proteína fluorescente verde si se requiere una fácil detección por microscopia de fluorescencia.

Una etiqueta (por ejemplo una etiqueta de proteína C) se incluye como parte de la secuencia ligadora pero las etiquetas usadas típicamente por ejemplo para la detección y purificación de proteínas no interfieren con la fusión y plegamiento de la proteína etiqueta y se exponen generalmente en la superficie. Por lo tanto una etiqueta puede proporcionar propiedades ventajosas sobre otras secuencias ligadoras artificialmente diseñadas.

En otras modalidades, una secuencia ligadora puede comprender una secuencia de epítopos. La inclusión de una secuencia de epítopos pueden ser útiles para empacar los fragmentos de anticuerpos que reconocen el epítopo para estabilizar adicionalmente el complejo formado por una proteína de superficie de rotavirus modificada y una proteína heteróloga a través de un sistema adaptador de dos partes. La estabilización del complejo puede ser particularmente importante para lograr imágenes de alta resolución para estudios estructurales.

Péptido señal

La proteína de superficie de rotavirus y la proteína heteróloga se modifican adicionalmente para comprender una secuencia de péptido señal heteróloga, reemplazando de manera preferente la secuencia de péptido señal nativa. El uso de un péptido señal heterólogo puede ser ventajoso para lograr niveles de expresión más altos en el sistema de expresión usado para preparar grandes cantidades de la proteína de superficie de rotavirus modificada y la proteína heteróloga para recubrir las DLPs de rotavirus. Por consiguiente, el péptido señal heterólogo se derivará de una proteína que se sabe se va a expresar en altos niveles en el sistema de expresión elegido. Por ejemplo, la secuencia señal consenso de HIV o péptido señal del activador de plasminógeno de tejido humano (tPA) son particulares adecuadas para la expresión en las células humanas. Para la expresión en las células de insecto, el péptido señal gp64 de Baculovirus o la secuencia señal de melitina de abeja de la miel se pueden usar. Típicamente, un ligador se coloca después de la secuencia de péptido señal heteróloga a fin de garantizar la eficiente escisión de péptido señal. Generalmente, el péptido señal se remueve por una peptidasa señal endógena al sistema de expresión elegido para que no esté presente en la proteína final (es decir la proteína de superficie de rotavirus y la proteína heteróloga recuperada del sistema de expresión).

Ácidos nucleicos

La invención también se refiere a ácidos nucleicos que comprenden un marco de lectura abierto que codifica una proteína de superficie quimérica de la invención ligada operacionalmente a una secuencia promotora tal que la proteína de superficie quimérica se expresa en grandes cantidades en un sistema de expresión.

La invención también se refiere a un constructo de ácido nucleico que codifica una proteína de superficie de rotavirus modificada, que comprende todo o una porción de una proteína de superficie de rotavirus, un primer polipéptido adaptador y, opcionalmente, una secuencia ligadora. La invención se refiere además a un ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína heteróloga, un segundo polipéptido adaptador, y, opcionalmente, una secuencia ligadora, en donde el marco de lectura abierto se liga operacionalmente a una secuencia promotora tal que la proteína de fusión se expresa en grandes cantidades en un sistema de expresión. En una modalidad, la invención se refiere a un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido adaptador, opcionalmente, una secuencia ligadora y un sitio de clonación múltiple, en donde la inserción de una región de codificación para una proteína heteróloga en el sito de clonación múltiple produce un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión que comprende la proteína heteróloga y el segundo polipéptido adaptador. El constructo de ácido nucleico comprende además una secuencia promotora que puede conducir la expresión de la proteína de fusión que comprende la proteína heteróloga y el segundo polipéptido adaptador en un sistema de expresión.

El primer polipéptido adaptador y el segundo polipéptido adaptador forman parten de un sistema adaptador de dos partes de modo que la proteína de fusión que comprende la proteína heteróloga y el segundo polipéptido adaptador y la proteína de superficie de rotavirus modificada que comprende el primer polipéptido adaptador forman un complejo estable entre sí.

En un aspecto particular, la invención se refiere a una composición de ácido nucleico que comprende a) un ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína de superficie de rotavirus modificada que comprende una proteína de superficie de rotavirus VP7, un primer polipéptido adaptador y, opcionalmente, un conector; en el que opcionalmente el marco de lectura abierto está vinculado operativamente a una secuencia promotora; y

(b) un ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína heteróloga, un segundo polipéptido adaptador y, opcionalmente, un enlazador; en el que opcionalmente el marco de lectura abierto está vinculado operativamente a una secuencia promotora;

en donde los polipéptidos adaptadores primero y segundo son capaces de formar un complejo estable entre sí. Sistemas de expresión

La invención también se refiere a sistemas de expresión para expresar las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos de la invención.

En una modalidad, se usa un primer sistema de expresión para expresar una proteína de superficie de rotavirus modificada que comprende todo o una porción de una proteína de superficie de rotavirus. Un primer polipéptido adaptador y, opcionalmente, una secuencia ligadora. Un segundo sistema de expresión se usa para expresar una proteína de fusión que comprende una proteína heteróloga, un segundo polipéptido adaptador, y, opcionalmente, una secuencia ligadora. Opcionalmente, se usa un tercer sistema de expresión para expresar una o más proteína(s) de rotavirus que, junto con la proteína de superficie de rotavirus, forma(n) la capa exterior de una partícula de rotavirus. El primero y segundo polipéptidos adaptadores interactúa entre sí para formar un complejo estable. El primer sistema de expresión comprende un primer constructo de ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica la proteína de superficie de rotavirus modificada, en donde el marco de lectura abierto se liga operacionalmente a una secuencia promotora. El segundo sistema de expresión comprende un segundo constructo de ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica la proteína de fusión, en donde el marco de lectura abierto se liga operacionalmente a una secuencia promotora. El tercer sistema de expresión que comprende uno o más vector(s) de expresión para la una o más proteína(s) de rotavirus. La proteína de superficie de rotavirus modificada y la proteína de fusión y opcionalmente la una o más proteína(s) de rotavirus después se purifican. La proteína de superficie de rotavirus modificada y la proteína de fusión se pueden mezclar en relaciones apropiadas para formar una proteína de superficie quimérica. La proteína de superficie quimérica y opcionalmente la una o más proteína(s) de rotavirus después se usa para recubrir las DLPs de rotavirus para forma partículas de rotavirus que muestran la proteína heteróloga sobre su superficie. Alternativamente, las DLPs de rotavirus se recubren con la proteína de superficie de rotavirus modificada y opcionalmente la una o más proteína(s) de rotavirus para formar partículas de rotavirus. Las partículas de rotavirus después se pueden mezclar con las proteínas de fusión para permitir la formación de un complejo entre el primer polipéptido adaptador y el segundo polipéptido adaptador que produce una proteína de superficie quimérica de modo que la proteína heteróloga se muestra sobre la superficie de las partículas de rotavirus.

En otra modalidad, la invención se refiere a un sistema de expresión que comprende (i) un primero constructo de ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína de superficie de rotavirus modificada que comprende todo o una porción de una proteína de superficie de rotavirus, un primer polipéptido adaptador y, opcionalmente, una secuencia ligadora, en donde el marco de lectura abierto se liga operacionalmente a una secuencia promotora, y (ii) un segundo constructo de ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína heteróloga, un segundo polipéptido adaptador, y, opcionalmente, una secuencia ligadora, en donde el marco de lectura abierto se liga operacionalmente a una secuencia promotora. En algunos casos, el sistema de expresión comprende además un vector de expresión para una o más proteína(s) de rotavirus que, junto con la proteína de superficie de rotavirus, forma(n) la capa exterior de la partícula de rotavirus.

El sistema de expresión puede ser una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de protozoario, una célula de insecto o una célula de mamífero. El uso de células bacterianas o células de levadura como sistemas de expresión es menos preferido, y en particular donde la glicosilación apropiada de las proteínas expresadas se desea.

Kits

La invención proporciona adicionalmente kits que comprende un primer constructo de ácido nucleico que codifica una proteína de superficie de rotavirus modificada que comprende todo o una porción de una proteína de superficie de rotavirus y un primer polipéptido adaptador, y un segundo constructo de ácido nucleico, en donde el segundo constructo de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido adaptador y un sitio de clonación múltiple, y en donde la inserción de una región de codificación para una proteína heteróloga en el sitio de clonación múltiple produce un maco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión que comprende la proteína heteróloga y un segundo polipéptido adaptador, en donde el primer polipéptido adaptador de la proteína de fusión quimérica y el segundo polipéptido adaptador de la proteína de fusión interactúan entre sí para formar un complejo estable.

La invención se refiere adicionalmente a kits que comprenden un primer constructo de ácido nucleico que codifica una proteína de superficie de rotavirus modificada que comprende todo o una porción de una proteína de superficie de rotavirus y un primer polipéptido adaptador, y un segundo constructo de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende todo o una porción de una proteína heteróloga y un segundo polipéptido adaptador, en donde el primer polipéptido adaptador de la proteína de superficie de rotavirus modificada y el segundo polipéptido adaptador de la proteína de fusión interactúan entre sí para formar un complejo estable, produciendo de esta manera una proteína de superficie quimérica.

Los kits pueden comprender además una partícula de rotavirus. La partícula de rotavirus puede ser ya sea de la misma especie de la cual la proteína de superficie de rotavirus se derivó o de una especie diferente. Por ejemplo, la VP7 de rotavirus de rhesus se puede usar para recubrir las DLPs preparadas de rotavirus de bovino y viceversa. El rotavirus se le puede eliminar el recubrimiento y recubrir con la proteína de superficie quimérica. Alternativamente, los kits pueden comprender DLPs para recubrimiento con la proteína de superficie quimérica. Las DLPs de rotavirus se pueden preparar al eliminar el recubrimiento de las partículas de rotavirus nativas o al expresar recombinantemente las proteínas de envoltura interior de rotavirus VP2 y VP6.

Expresión recombinante de proteínas de capa exterior

El recubrimiento de las DLPs de rotavirus requiere solamente una o dos proteínas virales recombinantes, la proteína de capa exterior VP7 o la proteína de capa exterior VP7 junto con la proteína pico de capa exterior VP4. La expresión y purificación de VP4 y VP7 se describen con detalle en las referencias 20 y 21, respectivamente.

Las proteínas de capa exterior incluyendo la proteína de superficie quimérica de la invención se pueden producir usando sistemas de expresión convencionales conocidos por la persona experta. A fin de garantizar el plegamiento correcto, y en algunos casos la glicosilación apropiada, los sistemas de expresión diferentes a los sistemas de expresión procariotas o de levadura son preferidos. Por ejemplo, las células de mamífero tales como células CHO o células 293 se pueden usar para sobreexpresar las proteínas de capa exterior necesarias para el recubrimiento de las DLPs de rotavirus. Alternativamente, el protozoario Leishmania tarentolae se puede usar para expresar las proteínas de capa exterior. Los sistemas de células de insecto también son adecuados para la expresión de las proteínas de capa exterior. Por ejemplo, las líneas de células de insecto Sf9, Sf21 y Hi-5 son adecuadas para las sobreexpresión de las proteínas glicosiladas. En algunos casos, son preferidos los sistemas de células de insecto basados en baculovirus. Los sistemas de expresión descritos en las referencias 2, 4 y 5 son particularmente adecuados en practicar la invención.

Varias formas para recubrir y purificar las proteínas de capa exterior sobreexpresadas son conocidas en la técnica. Típicamente se usa una serie de pasos cromatográficos para purificar las proteínas sobreexpresadas de los extractos citoplásmicos o el sobrenadante de las células que se usó como el sistema de expresión. Por ejemplo la afinidad de lecitina, inmunoafinidad y cromatografía de exclusión de tamaño se pueden usar. Si la proteína de cubierta exterior se ha etiquetado con una etiqueta de péptido o proteína, esta etiqueta se puede usar ventajosamente para purificación. Sin un sitio de escisión de proteasa está presente en la secuencia que precede la etiqueta, la etiqueta se puede remover después de la purificación usando una proteasa que reconoce específicamente el sitio de escisión de proteasa.

En algunos casos, una preparación cruda de las proteínas de capa exterior recombinante expresadas se puede usar para la reacción de recubrimiento. Por ejemplo, los lisados de células usados para expresar las proteínas de capa exterior se pueden preparar usando una solución amortiguadora de lisis y/o la alteración mecánica de las células (por ejemplo, por raspado o sonicación de las células). Cualquier resto celular se remueve por centrifugación, y el sobrenadante que contiene una preparación cruda de las proteínas de capa exterior recombinantes se puede usar en una reacción de recubrimiento. La preparación cruda se puede concentrar usando ultrafiltración antes de ser usada en una reacción de recubrimiento.

Donde una proteína heteróloga se liga no covalentemente a una proteína de superficie de rotavirus por un sistema adaptador de dos partes que comprende un primer polipéptido adaptador y un segundo polipéptido adaptador, la proteína de superficie de rotavirus fusionada al primer polipéptido adaptador y la proteína heteróloga fusionada al segundo polipéptido adaptador se expresan separadamente en diferentes células. La expresión separada puede ser preferible debido a que ambas proteínas se pueden purificar separadamente usando protocolos de purificación conocidos para cada una de las proteínas. Después de la purificación, las proteínas se pueden mezclar en las relaciones apropiadas requeridas para el recubrimiento de las DLPs de rotavirus. Por ejemplo, la relación molar de VP7 y VP4 en la capa exterior de rotavirus es 13:1. La relación molar de la proteína VP7 modificada que comprende el primer polipéptido adaptador y la proteína heteróloga que comprende el segundo polipéptido adaptador es típicamente 1:1. Alternativamente, las DLPs se recubren con la proteína de capa exterior de rotavirus para formar partículas de rotavirus. Las partículas de rotavirus después se mezclan con la proteína heteróloga para permitir la formación de un complejo entre el primer polipéptido adaptador y el segundo polipéptido adaptador para que la proteína heteróloga se muestre sobre la superficie de las partículas de rotavirus.

Alternativamente, tanto la proteína de superficie de rotavirus como la proteína heteróloga se pueden expresar en la misma célula. La co-expresión da por resultado la formación de un complejo estable de la proteína de superficie de rotavirus y la proteína heteróloga mediada por el sistema adaptador de dos partes (ver lo anterior para detalles). Donde la secuencia ligadora que conecta la secuencia adaptadora a la proteína de superficie de rotavirus o a la proteína heteróloga que contiene etiqueta, esta etiqueta se puede usar para purificar el complejo de las células/sobrenadante celular del sistema de expresión.

Para ser capaz de recubrir una partícula de núcleo retroviral con una proteína de superficie quimérica que comprende todo o parte de una proteína heteróloga, no todas las proteínas necesitan ser proporcionadas para formar una capa exterior. Por ejemplo, la capa exterior de un retrovirus de mamífero se forma de |^j1, a1 y a3. A fin de recubrir las partículas de núcleo reovíricas para los propósitos de la invención, proporcionar típicamente una versión recombinante de j l es suficiente para formar las partículas reovíricas. Opcionalmente, las versiones recombinantes de a1 y a3 también se pueden proporcionar. Las proteínas recombinantes se pueden preparar con uno de los sistemas de expresión mencionados en lo anterior y después se pueden purificar usando protocolos conocidos.

Propagación de partículas reovíricas

Los rotavirus se han descubierto en un gran número de especies animales incluyendo ganado, cerdos, caballos, conejos, ratones, perros, gatos, aves y especies de animales exóticos tales como addax, saiga, gnu de cola blanca, oso grizzli y canguro rojo. Por consiguiente, la idoneidad de un cierto tipo de célula para su propagación depende de intervalo de hospedero del virus elegido. De manera preferente, se elige un virus que permite la propagación de alto rendimiento en los sistemas de cultivo celulares establecidos.

Por ejemplo, la línea de células MA104 se puede usar para propagar el rotavirus de rhesus. El rotavirus se puede recubrir al lisar las células infectadas, por ejemplo por congelamiento o descongelamiento de las células MA104 infectadas en el medio. Los restos celulares se eliminan de los lisados por centrifugación de baja velocidad, y las partículas reovíricas se concentran al formarlas en pelotillas usando ultracentrifugación o por ultrafiltración. La suspensión concentrada de partículas reovíricas se puede purificar adicionalmente usando la centrifugación en gradiente CsCl [2]. Una solución amortiguadora adecuada para la preparación del gradiente de CsCl es TNC (Tris 20 mM pH 8.0, NaCl 100 mM, CaCl21 mM).

De manera preferente, se usa una célula bien caracterizada para la propagación de rotavirus. Los rotavirus humanos, de bovino y de mono rhesus se pueden propagar en las células Vero. Una línea de células Vero adecuadas (CCL81) se puede obtener de la Recolección de Cultivo de Tipo Americano (ATCC).

Similarmente, los miembros de la familia Reoviridae se han aislado de una gama de mamíferos, aves, reptiles, peces, crustáceos, insectos, garrapatas, arácnidos, plantas y hongos. Los sistemas de cultivo también se han establecido para otros virus en la familia Reoviridae. Por ejemplo, el virus de enanismo desigual del arroz stunt virus (RRSV) se puede preparar en cantidades suficientes de hojas de arroz infectadas [7]. Las células C6/36 se pueden usar para propagar el virus Banna (BAV) [22]. Las células L de ratón, en particular la línea de células L929, y las células de eritroleucemia de murino (MEL) se pueden usar para propagar las cepas de reovirus de mamífero tipo 1 Lang (TIL) y tipo 3 Dearing (T3D) [5]. El aquareovirus de la carpa herbívora (GCRV) se puede propagar en el cultivo de células de riñón de Ctenopharyngodon idellus (CIK) [8].

Las partículas de virus se pueden recubrir típicamente de los sobrenadantes celulares o células lisadas. Por ejemplo, cualquier resto celular se puede remover por centrifugación de baja velocidad, las partículas reovíricas se forman en pelotillas del sobrenadante usando ultracentrifugación. Las pelotillas contienen partículas de virus que se pueden purificar adicionalmente si es necesario.

Preparación de la DLP

Las DLPs de rotavirus se preparan al remover las proteínas de capa exterior de las partículas de rotavirus purificadas. Las partículas de rotavirus se les pueden eliminar el recubrimiento al incubar varias partículas en presencia de un quelante de calcio tal como EDTA o EGTA. Una solución amortiguadora adecuada para eliminar el recubrimiento de las partículas de rotavirus contiene Tris 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM y EDTA 1 mM [2]. Las partículas de rotavirus también se les pueden eliminar el recubrimiento por choque térmico. Las DLPs resultantes se pueden purificar para agrupamiento en los gradientes CsCl preformados sucesivos (p = 1.25 a 1.5035 g/cm3).

El método de elección paras remover las proteínas de capas exterior depende de la partícula vírica elegida. Por ejemplo, las partículas de reovirus de mamífero se pueden separar de núcleo al incubar la partícula con aquimotripsina (CHT) durante dos horas a 37°C [4].

Los métodos anteriores se pueden adaptar en otros virus en la familia Reoviridae dependiendo de la sensibilidad de sus proteínas de capas exteriores al tratamiento de proteasa o condiciones bajas en calcio.

En algunos casos, la partícula subvírica se puede recubrir al lisar las células que se usaron para propagar el virus. La partícula subvírica después se puede recubrir de los lisados celulares, por ejemplo, por un gradiente CsCl como se describe para el virus Banna [22].

Alternativamente, las DLPs o partículas subvíricas se pueden preparar al expresar recombinantemente las proteínas virales relevantes en uno de los sistemas de expresión descritas en lo anterior. Por ejemplo, las proteínas de envoltura interior de rotavirus VP2 y VP6 se pueden expresar recombinantemente de partículas similares a virus que se asemejan a las DLPs.

Recubrimiento

El recubrimiento de las DLPs rotavirus se presenta en un intervalo de pH incluyendo pH 4.5 y 6.5, pero es más eficiente entre pH 5 y 5.5 (de manera preferente pH 5.2). El recubrimiento se presenta en temperaturas incluyendo 4°C y 37°C, pero es más eficiente entre 4°C y 30°C que en 37°C.

El recubrimiento de las partículas de núcleo reovíricas se puede hacer típicamente bajo condiciones que imitan las condiciones bajo las cuales el ensamblaje de las partículas reovíricas se presenta en la célula. Por ejemplo, las partículas de núcleo de ortoreovirus de mamífero se pueden recubrir a 37°C. Sin embargo, los parámetros individuales tales como pH y temperatura pueden requerir optimización adicional para el re-ensamblaje eficiente de las partículas reovíricas de los núcleos virales purificados y las proteínas de capa exterior recombinantemente expresadas.

Las partículas de virus recubiertas se pueden recubrir por centrifugación en gradiente CsCl. La purificación en gradiente CsCl se puede repetir una segunda vez para incrementar la pureza de las partículas de virus recubiertas.

Donde un sistema adaptador se usa para mostrar una proteína heteróloga sobre la superficie de una partícula de rotavirus recubierta, las DLPs de rotavirus se pueden recubrir con una proteína de superficie de rotavirus que comprende un primer polipéptido adaptador. La proteína heteróloga que comprende un segundo polipéptido adaptador, que forma un complejo estable con el primer polipéptido adaptador, se puede agregar subsecuentemente a las partículas de virus recubiertas. Esto puede ser ventajoso donde el recubrimiento con el complejo formado por la proteína heteróloga y la proteína de superficie de rotavirus sería menos eficiente, por ejemplo debido al tamaño de la proteína heteróloga. Alternativamente, un complejo entre la proteína heteróloga y la proteína de superficie de rotavirus a través de los polipéptidos adaptadores se pueden formar primero, y este complejo se puede agregar a las DLPs de rotavirus para el recubrimiento.

Formación de complejos

En algunos aspectos de la invención, la proteína de superficie quimérica se usa para estudiar la estructura de los complejos formados entre la proteína heteróloga que forma parte de la proteína de superficie quimérica (por ejemplo al ser ligado no covalentemente a una proteína de superficie de rotavirus a través de un sistema adaptador de dos partes) y una molécula que se liga específicamente a la proteína heteróloga.

En un aspecto la molécula es una molécula proteínica. La molécula proteínica es típicamente de otra proteína tal como un receptor o ligando que interactúa con la proteína heteróloga o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reconoce un epítopo encontrado sobre la superficie de la proteínas heteróloga. Por ejemplo, un complejo hexamérico de una proteína de superficie de rotavirus trimérica ligada a una proteína de entrada de célula vírica trimérica (por ejemplo, proteína VIH gpl40 o RSV F) que se muestra sobre la superficie de la partícula de rotavirus se puede usar para estudiar la interacción entre la proteína de entrada de célula vírica y su receptor de superficie de célula hospedera.

Las condiciones óptimas para la formación de complejos entre la proteína heteróloga y la molécula proteínica dependen de la naturaleza de la interacción. Las interacciones de receptor-ligando pueden requerir diferentes condiciones de interacciones de anticuerpo-antígeno. Típicamente, la formación de complejos se lleva a cabo a temperatura ambiente en una solución amortiguada (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato).

En una modalidad, la molécula proteínica se agrega a una suspensión de las partículas de rotavirus recubiertas que muestran la proteína de superficie quimérica. La solución amortiguada puede contener componentes adicionales tales como Ca2+ para prevenir la eliminación del recubrimiento de las partículas de rotavirus y opcionalmente uno o más inhibidores de proteasa para bloquear la degradación de las proteínas. Después de la incubación de la molécula proteínica en presencia de las partículas de rotavirus recubiertas, los complejos recientemente formados de las moléculas proteínicas ligadas a las partículas de rotavirus se pueden separar de cualquiera de las moléculas proteínicas no ligadas por centrifugación o ultrafiltración. Sin embargo, la remoción de moléculas proteínicas no ligadas puede no es necesario si las partículas de rotavirus recubiertas se usan para análisis crio-EM.

Alternativamente, la molécula proteínica y la proteína de superficie quimérica se incuban conjuntamente para permitir que se presente la formación de complejos. Primero, la proteína heteróloga y el antígeno de superficie de rotavirus se pueden incubar conjuntamente para formar la proteína de superficie quimérica. Una vez que la proteína de superficie quimérica se ha formado, se agrega la molécula proteínica. El complejo de la molécula proteínica y la proteína de superficie quimérica después se pueden agregar a las DLPs de rotavirus para formar las partículas de rotavirus, opcionalmente en presencia de cualquiera de las proteínas de rotavirus adicionales que, conjuntamente con la proteína de superficie de rotavirus, forman la capa exterior de una partícula de rotavirus nativa.

En un aspecto particular de la invención, la proteína de superficie quimérica de la invención se usa para determinar la estructura de un complejo de antígeno-anticuerpo. En este aspecto de la invención, la proteína heteróloga se puede derivar de un patógeno tal como un virus o una bacteria. Por ejemplo, un antígeno inmunodominante se puede elegir como la proteína heteróloga para estudiar qué partes de la proteína se fijan como objetivo por los anticuerpos durante una respuesta inmunitaria contra el antígeno. De manera preferente, la proteína heteróloga es una proteína de superficie vírica trimérica tal como hemaglutinina de virus de influenza, virus sincitial respiratorio F, o VIH gpl40. Para determinar la estructura de un complejo de antígeno-anticuerpo, el uso de un fragmento Fab en lugar del anticuerpo de longitud completa se prefiere típicamente para evitar el impedimento estérico entre las proteínas de superficie quiméricas vecinas y para garantizar la ocupación máxima del epítopo encontrado en la proteína heteróloga.

En otro aspecto de la invención, la formación de complejos entre una proteína heteróloga y una molécula no proteínica se puede estudiar. Una molécula no proteínica puede ser un ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN), un polisacárido u oligosacárido (por ejemplo, un glicano). Por ejemplo, la proteína heteróloga puede ser un factor de transcripción u otra proteína de ligación a ADN que forma un complejo con una secuencia de ADN específica. Alternativamente, la proteína heteróloga puede ser una lecitina que forma un complejo con un glicano.

Crio-EM

Usando la crio-EM para la determinación de estructura tiene varias ventajas sobre procedimientos más tradicionales tales como cristalografía de rayos X. En particular, la crio-EM pone menos requisitos riguroso en la muestra que se va a analizar con respecto a la pureza, homogeneidad y cantidad. De manera importante, la crio-EM se puede aplicar para objetivos que no forman cristales adecuados para la determinación de la estructura.

Una suspensión de partículas de rotavirus recubiertas no purificadas o purificadas, ya sea solas o en complejo con una molécula proteínica tal como un anticuerpo o molécula no proteínica tal como un ácido nucleico, se puede aplicar a rejillas de carbono para formación en imágenes por crio-EM. Las rejillas recubiertas se congelan instantáneamente, usualmente en etanol líquido, para conservar las partículas en la suspensión en un estado congelado-hidratado. Las partículas más grandes se pueden verificar por criofijación. La muestra vitrificada se puede cortar en secciones delgadas (típicamente de 40 a 200 nm de grueso) en un crio-ultramicrotomo, y las secciones se pueden colocar en rejillas de microscopio electrónico para formar en imágenes.

La calidad de los datos obtenidos de las imágenes se puede mejorar al usar iluminación paralela y mejor alineación de microscopio para obtener resoluciones tan altas como H3.3 A. En tal alta resolución, es posible la construcción del modelo ab initio de las estructuras de átomo completo. Sin embargo, la formación en imágenes en menor resolución podrían ser suficientes en donde los datos estructurales en la solución atómica en la partícula de rotavirus elegida o estrechamente relacionada y la proteína heteróloga seleccionada o un homólogo cercanos son disponibles para la modelación comparativa limitada (ver a continuación).

Para mejorar adicionalmente la calidad de los datos, el microscopio se puede alinear cuidadosamente para revelar los anillos de función de transferencia de constante visibles (CTF) más allá de 1/3 A-1 en la transformada de Fourier de las imágenes de la película de carbono registradas las mismas condiciones usadas para la formación de imágenes. Los valores de desenfoque para cada micrografía después se pueden determinar usando el software tal como CTFFIND [23]. El tamaño del pixel final del mapa de densidad se puede calibrar usando, por ejemplo, el virus del mosaico de tabaco (TMV).

Las descripciones útiles para aplicar la crio-EM a los estudios estructurales de las partículas de rotavirus se encuentran en las referencias 24 y 25.

Análisis de formación de imágenes y determinación de estructura

Las imágenes obtenidas por crio-EM se analizan para identificar las micrografías de partículas individuales. La selección de partículas individuales se puede hacer con la ayuda de herramientas de software tal como SIGNATURE [26]. El desenfoque astigmático, eje de inclinación de espécimen, y ángulo de inclinación para cada micrografía se puede determinar usando el programa de Computadora CTFTILT [23]. La obtención de los valores de desenfoque separados para cada partícula de acuerdo con su coordenada de la imagen original mejora la calidad de los datos del mapa de densidad crio-EM que se obtiene al promediar las micrografías de partícula individual de las partículas de rotavirus.

El ajuste de los modelos atómico conocidos dentro de un mapa de densidad de crio-EM es un procedimiento común para construir modelos de estructuras complejas tales como partículas reovíricas. Son disponibles una variedad de herramientas de ajuste de computación que varían de localización de cuerpo rígido simple de estructuras de proteínas, tales como [27], Foldhunter [28] y Mod-EM [29], para la formación de complejos y algoritmos de ajuste flexibles dinámicos similares a NMFF [30], Flex-EM [31], MDFF [32] y DireX [33, 34], que transforman las estructuras conocidas a un mapa de densidad.

Cuando un modelo atómico no es conocido, se pueden usar mapa de densidad crio-EM de la construcción y/o evaluación de los modelos estructurales de una galería de modelos potenciales que se construyen in silico (ver referencias 29, 35, 36, 37 y 38). Una estructura de plantilla relacionada puede ser conocida para la moderación comparativa limitada o, para la modelación ab initio limitada, el plegamiento que se modela debe ser relativamente pequeño. Por ejemplo, una estructura inicial se puede obtener usando IMIRS [39]. La alineación y reconstrucción adicional se puede llevar a cabo con FREALIGN [40] usando una estructura de rotavirus conocida y una estructura conocida de la proteína heteróloga o un homólogo cercano como plantilla.

La información estructural y funcional significativa se puede obtener directamente del mapa de densidad mismo. Por ejemplo, en resoluciones de 5-10 A, algunos elementos de estructura secundarios son visibles en los mapas de densidad crio-EM: las a-hélices parecen como cilindros, mientras que las p-hojas parecen como placas curvadas, delgadas. Estos elementos de estructura secundarias se pueden identificar y cuantificar confiablemente usando herramientas de reconocimiento de característica para describir una estructura de proteína o inferior en la función de las proteínas individuales. En las resoluciones casi atómicas (3-5 A), la inclinación de las a-hélices, separación de las p-hebra, así como las densidades que las conectan, se pueden visualizar no ambiguamente (ver, por ejemplo, las referencias 41, 42, 43 y 44).

La construcción de modelo de novo en crio-EM comprende el reconocimiento de característica, análisis de secuencia, correspondencia de elemento de estructura secundaria, colocación de Ca y optimización del modelo. Se pueden usar varias aplicaciones de software, por ejemplo, EMAN para la segmentación y manipulación del mapa de densidad [45], SSEHunter [46] para detectar los elementos de estructura secundarios, la visualización en la quimera de UCSF [47] y la manipulación atómica en Coot [48,49].

Los programas de identificación de estructura secundaria como SSEHunter proporcionan un mecanismo semi-automatizado para detectar y mostrar elementos de estructura secundaria visualmente observables en un mapa de densidad [46]. El registro de los elementos de estructura secundaria en una secuencia y estructura, combinados con la información geométrica y biofísica, se puede usar para anclar la cadena principal de la proteína en el mapa de densidad [41, 43]. Esta correspondencia de secuencia a estructura se relaciona con los elementos de estructura secundarios observados en la densidad para aquellos predichos en la secuencia. El kit de herramienta de modelación GORGON acopla la predicción de estructura secundaria basada en secuencia con la detección de característica y las técnicas de modelación geométricas para generar los modelos de cadena principal de proteína iniciales [50]. Los métodos de modelación automáticos tales como EM-IMO (optimización modular de microscopía electrónica, -iterativa) se pueden usar para construir, modificar y refinar las estructuras locales de los modelos de proteínas usando mapas de crio-EM como una limitante [51].

Una vez que se ha determinado la correspondencia usando el elemento de estructura secundaria, los átomos Ca se pueden asignar a la densidad que comienza con las a-hélices y es seguido por las p-hebras y bucles. Por ejemplo, al tomar ventaja de los golpes claros para los átomos de Ca, los modelos Ca se pueden construir usando la utilidad Baton build en los programas de cristalográficos O [52] y/o Coot [48]. Las posiciones de Ca se pueden ajustar iterativamente tal que ajustan la densidad mientras que mantienen óptimamente las geometrías razonables y eliminan los choques dentro del modelo. Los modelos de átomo completo grueso se pueden refinar en una manera pseudocristalográfica usando CNS [53]. Los modelos se pueden optimizar adicionalmente usando software de modelación computacional tal como Rosetta [36]. Los modelos de átomo completa también se pueden construir con la ayuda de otras herramientas computacionales tal como REMO [54]. La calidad de un modelo se puede confirmar por comparación visual del modelo con el mapa de densidad. El análisis de factor R/Rfree pseudocristalográfico [55] proporciona una medición del acuerdo entre las amplitudes del factor de estructura observadas y calcadlas y se puede usar para confirmar que el modelo atómico obtenido proporciona un buen ajuste a los mapas de densidad crio-EM. La geometría de modelo de proteínas se puede verificar por PROCHECK [56].

Métodos de clasificación para el diseño de inmunógeno

Usando la crio-EM en lugar de la cristalografía de rayos X facilita la rápida determinación de estructura. En comparación con la cristalografía de rayos X, la crio-EM pone menos requisitos astringentes en la pureza, homogeneidad y cantidad de la muestra que se va a analizar. Estas características hacen la crio-EM atractiva en el contexto del diseño de inmunógeno para vacunas, particularmente contra patógenos que se someten a la deriva antigénica.

Teniendo más información estructural especialmente acerca de los epítopos compartidos por las variantes del mismo patógeno o patógenos estrechamente relacionados puede permitir el diseño racional de inmunógenos, que se pueden usar en vacunas que proporcionan amplia protección contra un gran número de variantes de un gran número de patógeno o patógenos estrechamente relacionados. Tales así llamadas vacunas “universales” se cree que son más económicas que las vacunas tradicionales debido a que harían superfluo e incluir varias variantes del mismo patógeno o patógenos estrechamente relacionados en la misma composición de vacuna (como es el caso, por ejemplo, para las vacunas de la polio actualmente disponibles así como para vacunas de conjugados estreptocócicos y meningocócicos) o proporcionan más composiciones de vacuna cada año para tomar en cuenta la deriva antigénica que se presentó en la población de patógenos en la estación previa (como es el caso para las vacunas de influenza).

El diseño racional de un inmunógeno para vacunación contra un patógeno diverso implica la identificación de esas regiones de una proteína inmunodominante que se conservan entre diversas variantes/subtipos del mismo patógeno o entre los patógenos estrechamente relacionados. El uso de partículas de rotavirus para mostrar proteínas heterólogas en las proteínas de superficie de rotavirus quimérica hace posible determinar rápidamente un gran número de estructuras en un tiempo relativamente corto. Por lo tanto los métodos de la invención pueden ser particularmente útiles en la identificación de epítopos conservados de proteínas inmunogénicas.

Al determinar la estructura de inmunógenos en el complejo con anticuerpos o fragmentos de ligación a antígeno correspondientes que se han encontrado que son inducidos contra un número de variantes/subtipos del mismo patógeno y/o contra patógenos estrechamente relacionados, regiones conservadas en inmunógeno inmunodominante de esta patógeno y/o patógenos estrechamente relacionados se pueden identificar. En una modalidad, la invención por lo tanto se refiere a un método para obtener un modelo tridimensional de un inmunógeno combinado con un anticuerpo en donde el método comprende los pasos de (i) recubrir una DLP de rotavirus con una proteína de superficie quimérica que comprende el inmunógeno para producir una suspensión de partículas de rotavirus que muestran la proteína de superficie quimérica, (ii) agregar a la suspensión o anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se liga específicamente al inmunógeno, en donde el anticuerpo o fragmento forma un complejo con la proteína de la superficie quimérica, (iii) congelar la suspensión, (iv) formar en imágenes las partículas de rotavirus usando crio-EM para obtener una pluralidad de micrografías, y (vi) analizar la pluralidad de micrografías para obtener un modelo tridimensional del inmunógeno formado en complejo con el anticuerpo. El inmunógeno es típicamente heterólogo a la partícula de rotavirus. El modelo tridimensional del inmunógeno formado en complejo con el anticuerpo se puede usar para definir el epítopo sobre la superficie del inmunógeno que es reconocido por el anticuerpo.

Este método se puede usar para identificar el epítopo ligado por un anticuerpo que tiene actividad ampliamente neutralizante contra un número de patógenos relacionados o variantes de un patógeno que surgen debido a la deriva antigénica. Alternativamente, este método se puede usar para identificar el epítopo ligado por un anticuerpo que puede reconocer un epítopo que interfiere por ejemplo con la función de una proteína de entrada de células víricas y se puede usar para prevenir o inhibir la propagación del virus. Un anticuerpo que se liga a una configuración tridimensional específica de una proteína también puede ser útil como un reactivo de control de calidad durante la fabricación de la proteína, por ejemplo para excluir lotes de una proteína fabricada que contiene un número grande de copias desnaturalizadas o plegadas de manera errónea de esta proteína. Este método se puede emplear adicionalmente para identificar epítopos que son particularmente útiles cuando se ligan por un anticuerpo que se usa como un reactivo de diagnóstico (por ejemplo, epítopos que son específicos a un patógeno particular en grupo de patógenos estrechamente relacionados).

Al repetir el método para obtener un modelo tridimensional de un inmunógeno formado en complejo con un anticuerpo para un panel de anticuerpos o sus fragmentos de ligación a antígeno correspondientes que se ha encontrado que se inducen en respuesta a la infección por un número de variantes/subtipos del mismo patógeno y/o contra patógenos estrechamente relacionados, el epítopo de cada anticuerpo sobre la superficie del inmunógeno se puede identificar. Una vez que el epítopo de cada anticuerpo en el panel se ha identificado, esta información se puede usar para el diseño racional de un inmunógeno. Para ejemplo, el método se puede usar para identificar los epítopos de un panel de anticuerpos que se ha descubierto tienen actividad neutralizante contra un número de variantes/subtipos del mismo patógeno y/o contra patógenos estrechamente relacionados para diseñar un inmunógeno que proporciona actividad neutralizante amplia contra un gran número de variantes/subtipos del mismo patógeno y/o patógenos estrechamente relacionados.

Alternativamente, el método descrito en lo anterior se puede emplear para mapear el repertorio de epítopos reconocidos por los anticuerpos que se inducen en respuesta a la inmunización con una vacuna existente. Al mapear los epítopos reconocidos más comúnmente por estos anticuerpos, se pueden identificar epítopos inmunodominantes. Esta información se puede usar ventajosamente para utilizar adicionalmente una vacuna existente. Por ejemplo, donde una vacuna existente se compone de un patógeno inactivado, una versión optimizada de la vacuna también puede incluir solamente las porciones inmunodominantes del patógeno (por ejemplo, en la forma de una vacuna de subunidad que comprende versiones recombinantes de los antígenos o epítopos inmunodominantes identificados). El entendimiento de los determinantes estructurales de los epítopos de anticuerpos inmunodominantes, obtenidos usando esta técnica, se puede aplicar para preparar antígenos que se han diseñado para hacer los epítopos más útiles (tales como epítopos ampliamente neutralizantes) inmunodominantes.

Ejemplo de mapeo de epítopos para ayudar en el diseño de inmunógenos son conocidos en la técnica pero se han limitado generalmente a un pequeño número de epítopos en un inmunógeno debido a los esfuerzos implicados en obtener datos estructurales para los complejos de inmunógeno-anticuerpo por cristalografía de rayos X. Solo frecuentemente se somete a prueba un anticuerpo (ver referencias 57, 58 y 59). La presente invención por primera vez permite obtener información estructural para complejos de inmunógenos-anticuerpo usando un procedimiento de alto rendimiento. La invención es particularmente útil para anticuerpos que solo se asocian débilmente con el inmunógeno y de esta manera presentan mayores retos para la cristalización.

Varios enfoques para diseñar inmunógenos que sean ampliamente protectores contra un número de variantes del mismo patógeno o patógenos estrechamente relacionados son conocidos en la técnica. En años recientes, se han hecho muchos esfuerzos para diseñar vacunas “universales” contra el virus de influenza y VIH (ver referencias 60, 61 y 62). El diseño racional de un inmunógeno modificado se ha impedido por la falta de datos estructurales para guiar el proceso. El uso de partículas de rotavirus para mostrar proteínas heterólogas en las proteínas de superficie de rotavirus quiméricas hace posible determinar rápidamente como las modificaciones de la secuencia de aminoácidos de una proteína afectan su estructura tridimensional. Las modificaciones de aminoácidos que cambian la estructura de una proteína pueden afectar su capacidad de formar cristales. De esta manera, la información estructural para evaluar el impacto de estas modificaciones puede no ser fácilmente disponible debido a que la proteína modificada puede no cristalizarse bajo las mismas condiciones como la proteína no modificada. Puesto que el uso de crio-EM no depende de la formación de los cristales para la determinación de las estructuras de proteína y, además, no requieren ninguna adaptación de la configuración experimental básica para diferentes tipos de proteínas, es posible la rápida caracterización estructural de las proteínas modificadas.

Una vez que un epítopo en una proteína inmunogénica de un patógeno se ha identificado que está presente en un número de variantes/subtipos del mismo patógeno y/o en muchos patógenos estrechamente relacionados, esta información se puede usar para diseñar una vacuna universal. En algunos casos, esto puede requerir la modificación del inmunógeno, particularmente donde una región conservada comprende un epítopo compartido no es fácilmente accesible a los anticuerpos en la proteína nativa, ya que la pobre accesibilidad del epítopo se traduce usualmente en pobre inmunogenicidad. Al modificar el inmunógeno de tal manera que retenga el epítopo nativo que se puede reconocer por un anticuerpo, pero haciendo el epítopo más accesible, el inmunógeno modificado puede producir una respuesta de anticuerpo que es protectora contra un amplio intervalo de variantes/subtipos del mismo patógeno o de patógenos estrechamente relacionados. Además del mapeo de los epítopos de los anticuerpos madurados por afinidad, los epítopos reconocidos por los ancestros no mutados de estos anticuerpos, una vez deducido de los experimentos de clonación de repertorios de células B, se puede mapear por esta técnica. Esta información podría ayudar en el diseño de inmunógenos que amplifican selectivamente un anticuerpo ancestral no mutado deseado y después dirigir su maduración por afinidad a un anticuerpo amplia y potentemente neutralizante.

Los inmunógenos candidato que se han modificado de un inmunógeno nativo (a fin de preparar una vacuna universal o por otras razones) se puede someter a prueba para presencia de un epítopo nativo de interés usando los métodos de la invención. En una modalidad particular, la invención por lo tanto se refiere adicionalmente a un método para determinar las diferencias estructurales entre dos variantes de una proteína heteróloga, donde el método comprende los pasos de (i) recubrir una DLP de rotavirus con una primera proteína de superficie quimérica que comprende una primera variantes de la proteína heteróloga para producir una suspensión de una primera partícula de rotavirus que muestra la primera proteína de superficie quimérica, (ii) congelar la suspensión, (iii) formar en imagen la primera partícula de rotavirus usando crio-EM para obtener una pluralidad de macrófagos, (iv) analizar la pluralidad de macrófagos para obtener un modelo tridimensional de la primera proteína de superficie quimérica, (v) repetir los pasos (i)-(iv) con una segunda de proteína de superficie quimérica que comprende una segunda variante de la proteína heteróloga en donde la primera y segunda proteína de superficie quimérica son idénticas entre sí aparte de la diferencia entre la primera variante y la segunda variante, y (vi) comparar el modelo tridimensional de la primera proteína de superficie quimérica al modelo tridimensional de la segunda proteína de superficie quimérica para determinar las diferencias estructurales entre la primera variante y la segunda variante de la proteína heteróloga. Este método se puede repetir para variantes adicionales de la misma proteína heteróloga para proporcionar un arreglo de clasificación para la identificación de una variante con ciertas características estructurales deseadas.

En algunos casos, las estructuras del inmunógeno nativo y de una pluralidad de inmunógenos modificados cada uno formado en complejo con un anticuerpo que reconoce un epítopo se puede determinar. La comparación de la estructura de los inmunógenos modificados al inmunógeno nativo ayudará a seleccionar inmunógenos candidatos que conservar mejor el epítopo nativo para prueba adicional in vivo.

Composiciones inmunogénicas

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de partículas de rotavirus que comprenden la proteína de superficie quimérica de la invención en la preparación de un medicamente. En particular, las partículas de rotavirus que comprenden la proteína de superficie quimérica de la invención se pueden usar en composiciones inmunogénicas adecuadas para vacunación humana. Por ejemplo, la proteína de superficie quimérica se puede diseñar para mostrar una proteína heteróloga que induce una respuesta inmunitaria protectora cuando se administra a un paciente.

El uso de virus quiméricos para inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno derivado de patógenos es bien conocido en la técnica. Tradicionalmente, este procedimiento requiere el rediseño del genoma del virus hospedero que se selecciona como un vector para antígeno derivado de patógeno. Tal procedimiento tiene un número de limitaciones. Típicamente, el genoma del virus se modifica para contener un gen derivado de patógeno que codifica el antígeno. El tamaño del genoma del virus de elección puede limitar por lo tanto el tamaño del antígeno derivado de patógeno que se puede expresar. Similarmente, la inserción de un gen que codifica el antígeno derivado de patógeno puede interferir con la propagación del virus sin limitar los rendimientos que se pueden lograr. Por lo tanto la preparación de virus quiméricos necesita ser optimizada para antígeno derivado de patógeno.

La creación de un virus quimérico con una nueva proteína de superficie que usa genética recombinante para alterar el genoma del virus hospedero al insertar una región de codificación para un antígeno derivado de patógeno podría cambiar potencialmente el intervalo de hospedero del virus quimérico y por lo tanto tiene consecuencias impredecibles en la patogenicidad de los virus recientemente creados. Por lo tanto se tienen que tomar pasos adicionales para proporcionar un virus quimérico suficientemente atenuado que no sea capaz de replicarse en el sujeto que se va a vacunar.

La presente invención supera los problemas asociados con el procedimiento tradicional debido a que permite la preparación de una clase de proteína de superficie quimérica que se puede usar para recubrir DLPs de rotavirus. Las partículas de rotavirus recubiertas no contienen ninguna información genética para el antígeno derivado de patógeno. De esta manera después de la infección inicial de una célula hospedera con las partículas de rotavirus recubiertas, no se forman virus de progenie que llevan el antígeno derivado de patógeno.

El uso de un sistema adaptador de dos partes reduce adicionalmente el número de pasos de optimización. Una vez que una proteína de rotavirus modificada fusionada a un primer polipéptido adaptador se ha preparado, cualquier antígeno derivado de patógeno conocido se puede fusionar a un segundo polipéptido adaptador que forma un complejo estable con el primer polipéptido adaptador. Esto elimina cualquier necesidad para la ingeniería genética del rotavirus. En muchos casos, la expresión y purificación del antígeno derivado de patógeno no se afecta por la presencia del segundo polipéptido adaptador en el antígeno derivado de patógeno, de modo que no se requiere modificación de métodos de expresión y purificación existentes para el antígeno. Los protocolos existentes para recubrir las DLPs de rotavirus con una proteína de superficie quimérica que comprende la proteína de rotavirus modificada ligada al antígeno derivado de patógeno a través del sistema adaptador de dos partes se puede usar para preparar partículas de rotavirus que comprenden la proteína de superficie quimérica. Estas partículas de rotavirus después se pueden incluir en composiciones inmunogénicas para inducir una respuesta inmunitaria contra el antígeno derivado de patógeno.

La plataforma de vacuna es particularmente útil al preparar composiciones inmunogénicas en las cuales las partículas de rotavirus comprenden una proteína de superficie quimérica trimérica que contiene una proteína de entrada de células víricas triméricas heterólogas. Las proteínas de entrada de células víricas triméricas son los antígenos de superficie inmunodominantes de muchos virus. Con las excepciones del antígeno de superficie de hepatitis B y la proteína L1 de virus de papiloma humano, ambas de las cuales forman partículas similares a virus, e influenza HA, que forma rosetas, vacunas de subunidad basadas en los antígenos de superficie vírica inmunodominantes han fallado típicamente para dar por resultado vacunas clínicamente efectivas. Al mostrar estos antígenos de superficie vírica en su conformación nativa en las partículas de rotavirus, se pueden preparar composiciones inmunogénicas que inducen una respuesta inmunitaria protectora contra el virus del cual el antígeno de superficie se derivó originalmente.

Ejemplos específicos de la proteína de entrada de células víricas triméricas incluyen influenza HA, HIV gp140, la glicoproteína del virus del Ébola, glicoproteína del virus de la rabia, la proteína Env del virus de encefalitis de artritis caprina, la proteína RSV F, el gB y opcionalmente su complejo con otras proteínas del virus de herpes simple humano y de HCMV.

Partículas de rotavirus

Los rotavirus son particularmente útiles debido a que existen varias cepas animales que tienen un intervalo de hospedero definido. Por ejemplo, algunas cepas son específicas para vacas y otras para monos. La mayoría de cepas animales son antigénicamente distintas de aquellas cepas que infectan típicamente los humanos y por lo tanto son mucho más incapaces de provocar una enfermedad en los humanos. Por lo tanto los humanos no tienen típicamente ninguna inmunidad preexistente a estas cepas de rotavirus que podrían interferir con una respuesta inmunitaria contra la proteína de superficie quimérica cuando estas cepas animales se usan como vectores en las composiciones inmunogénicas para la vacunación humana. Además, estos virus son naturalmente atenuados en los humanos.

Además, dos vacunas de rotavirus atenuado, vivo patentadas se comercializan actualmente: RotarixMR y RotaTeqMR. RotarixMR contiene la cepa de rotavirus humano atenuado RIX4414, que se hizo pasar 26 veces en células de Riñón de Mono Verde Primario (AGMK) y se propagó en células Vero. RotaTeqMR contiene una combinación de cinco cepas reordenantes de rotavirus de bovino (BRV)-rotavirus humano (HRV), diseñadas como G1, G2, G3, G4, y P1, respectivamente, que también se propagan en las células Vero. Todos los reordenantes se componen del fondo del genoma de la cepa BRV WC3 (G6P7[5]) que expresa proteínas VP7 o VP4 humanas.

La vacuna basada en rotavirus rhesus previamente patentada (RRV) RotaShieldMR consiste de rotavirus reordenantes RRV (G3P5B[3]) y 3 RRV-HRV. Cada reordenante deriva 10 genes de RRV y un solo gen de HRV que codifica una proteína VP7 para la especificidad 1, 2, o 4 del serotipo G (G1P5B[3], G2P5B[3], y G4P5B[3]).

Adicionalmente, la seguridad de las cepas de rotavirus de bovino (NCDV RIT4237 G6P6) y de simio (cepa RRV MMU18006 G3P5B) monovalentes para el uso como vacuna se ha establecido.

La inmunización, seguridad clínica y experiencia de fabricación con estas cepas de vacuna se puede aplicar directamente a las partículas de rotavirus de la invención. Por ejemplo, cualquiera de los rotavirus contenidos en las vacunas de rotavirus patentadas se podría usar para preparar las DLPs para el recubrimiento con la proteína de superficie quimérica de la invención.

Preparación

Las partículas de rotavirus modificadas incluidas en las composiciones inmunogénicas se pueden preparar usando cualquiera de los métodos descritos en lo anterior. Las partículas de rotavirus nativas se pueden propagar y purificar. Las partículas de rotavirus purificadas después se les pueden eliminar el recubrimiento para preparar las DLPs que después se pueden recubrir con una proteína de superficie quimérica que comprende un antígeno derivado de patógeno.

Típicamente, una proteína de rotavirus modificada fusionada a un primer polipéptido adaptador se agrega a las DLPs para formar partículas de rotavirus. La adición de proteínas de rotavirus adicionales que, junto con la proteína de superficie de rotavirus, forman la capa exterior de una partícula de rotavirus nativa es opcional. Las partículas de rotavirus después se vuelven a incubar con un antígeno derivado de patógeno fusionado a un segundo polipéptido adaptador que forma un complejo estable con el primer polipéptido adaptador para proporcionar la proteína de superficie quimérica.

Formulaciones

La composición inmunogénica de la invención se puede proporcionar en la forma de un kit que comprende un primer recipiente que comprende partículas de rotavirus liofilizadas y un segundo recipiente que comprende una solución para la resuspensión extemporánea de las partículas de rotavirus liofilizadas. Las partículas de rotavirus liofilizadas pueden comprender uno o más lioprotector tales como sacarosa, dextrano, sorbitol y aminoácidos para estabilizar las partículas de rotavirus durante la liofilización.

Alternativamente, la composición inmunogénica se proporciona en un solo recipiente que comprende las partículas de rotavirus en suspensión. Donde la composición inmunogénica es para inyección, se puede proporcionar en una jeringa.

Cualquier solución puede contener uno o más excipiente(s).

Las soluciones son típicamente basadas en agua. Por lo tanto el agua purificada puede formar el excipiente principal. Por ejemplo, la dilución de las partículas de rotavirus para proporcionar la concentración final deseada se llevará a cabo usualmente con agua para inyección (WFI).

La solución contiene típicamente una solución amortiguadora. Por lo tanto los excipientes adicionales incluyen agentes amortiguadores y reguladores de pH tales como citrato de sodio, monohidrato de fosfato diácido de sodio, e hidróxido de sodio. Los antiácidos tales como carbonato de calcio se pueden agregar para prevenir la inactivación del virus durante el pasaje a través del estómago si la composición inmunogénica se administra oralmente. Un regulador de acidez tal como adipato de disodio también se puede incluir, de manera preferente en lugar del antiácido.

En algunos casos, un agente espesante tal como xantano puede estar presente como un excipiente adicional.

Un agente tensoactivo, en particular un agente tensoactivo no iónico tal como polisorbato 80, también puede estar presente.

Otros excipientes incluyen, sacarosa, sorbitol, sales inorgánicas, aminoácidos y vitaminas.

Las composiciones tendrán generalmente una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, de manera preferente entre 240-360 mOsm/kg, y estarán de manera más preferente dentro del intervalo de 280-320 mOsm/kg.

El pH de una composición de la invención será generalmente entre 5.0 y 7.5, y más típicamente entre 5.0 y 6.0 para estabilidad óptima.

Las composiciones de la invención contienen de manera preferente <1 EU (unidad de endotoxina, una medición estándar; 1 EU es igual a 0.2 ng de la Endotoxina de estándar de referencia FDA EC 2 “RSE”) por dosis, y de manera preferente <0.1 EU por dosis. Las composiciones de la invención están de manera preferente sin gluten. Adicionalmente, las composiciones de la invención son preferiblemente estériles.

Administración

Las composiciones inmunogénicas se pueden usar para estimular una respuesta inmunitaria de la mucosa. Por lo tanto las composiciones inmunogénicas se pueden administrar oral o intratraquealmente. Otras vías de administración tales como inyección intramuscular se pueden elegir dependiendo del antígeno derivado de patógeno mostrado sobre la superficie de la partícula de rotavirus modificada incluida en la composición inmunogénica de la invención.

General

El término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste” por ejemplo una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo X Y.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente” por ejemplo una composición que esta “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Donde sea necesario, la palabra “sustancialmente” se puede omitir de la definición de la invención.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10% o x dos derivaciones estándares del valor. En ciertas modalidades, “aproximadamente” se entiende como variación aceptable y tolerancia dentro de la técnica específica. A menos que sea claro a partir del contexto, todos los términos numéricos en la presente se entiende que se modifican por aproximadamente. El término “anticuerpo” incluye fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos de ligación a antígeno (Fabs), fragmentos variables de cadena individual (scFv), etc. El término “porción de ligación a antígeno” de un anticuerpo (o “porción de anticuerpo”) incluye fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad para ligarse específicamente a un antígeno. Se ha mostrado que la función de ligación a antígeno de un anticuerpo se puede llevar a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de ligación abarcados dentro del término “porción de ligación a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb [63], que consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinadora de complementariedad aislada (CDR). Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, se puede unir, usando métodos recombinantes, por un ligador sintético que les permite ser fabricados como una cadena de proteínas individual en la cual las regiones VL y VH se parean para formar moléculas monovalentes (conocida como Fv de cadena individual (scFv); ver por ejemplo referencias 64 y 65. Tales anticuerpos de cadena individual también se proponen para ser abarcados dentro del término “porción de ligación a antígeno” de un anticuerpo.

Como se usa en la presente, “o” se usa para ser exclusiva y es intercambiable con “y/o”, al menos que se indique claramente de otra manera por el contexto.

Como se usa en la presente “un” y “el” se entiende que incluyen tanto singular como plural a menos que se indique claramente de otra manera por el contexto.

A menos que se establezca específicamente, un proceso que comprende un paso para mezclar dos o más componentes no requiere ningún orden específico de mezclado. Estos componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Donde existan tres componentes entonces dos componentes se pueden combinar entre sí, y después la combinación se puede combinar con el tercer componente, etc.

Donde los materiales animales (y particularmente de bovino) se usan en el cultivo de células para la preparación de material para la administración a animales, especialmente humanos, se deben obtener de fuentes que se estén libres de encefalopatías espongiformes admisibles (TSEs), y en particular libres de encefalopatía espongiforme de bovino (BSE). En general, cuando los productos se preparan para administración a animales, y especialmente a humanos, se prefiere cultivar células en ausencia total de materiales derivados de animales.

Donde un sustrato de células se usa para el reordenamiento o procedimientos de genética inversa, es de manera preferente que haya sido aprobado para uso en la producción de vacunas humanas por ejemplo como en Ph Eur general capítulo 5.2.3 [66],

La identidad entre las secuencias de polipéptidos se determina de manera preferente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como es implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando una búsqueda de espacio de afinidad con parámetros de penalización de abertura de espacio =12 y penalización de =1.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figuras 1A: Vista general esquemática de las modificaciones hechas a (A) la proteína VP7 de rotavirus y (B) la proteína heteróloga. HR1 y HR2 forman parte de un sistema adaptador de dos partes para ligar no covalentemente la proteína heteróloga a la proteína VP7 de rotavirus. Las secuencias de péptido señal heterólogas sirven el propósito de lograr altos niveles de expresión en los sistemas de expresión elegidos. Las etiquetas de afinidad permiten la fácil purificación. El sitio de reconocimiento de proteasa P1 se puede usar para remover la etiqueta de afinidad A1 después de la purificación. El segundo conjunto de sitios de reconocimiento de afinidad y proteasa (A2 y P2) se pueden reemplazar por las secuencias ligadoras adecuadas y pueden servir como una secuencia espaciadora que puede ser necesaria para mostrar la proteína heteróloga grande. La etiqueta de trimerización es opcional y se puede usar en ayudar en la formación de trímeros de algunas proteínas heterólogas que después facilita la ligación a la proteína VP7 de rotavirus trimérica. La etiqueta de trimerización, particularmente las etiquetas de trimerización basadas particularmente en superhélice (por ejemplo GCN4), también pueden servir como módulos estructurales para extender el espacio disponible para una proteína heteróloga que se muestra sobre la superficie de una partícula de rotavirus recubierta con una proteína VP7 de rotavirus modificada.

Figura 2: Vista general esquemática del complejo formado por una proteína VP7 de rotavirus trimérica modificada y una proteínas heteróloga trimérica. La proteína VP7 de rotavirus se liga no covalentemente a la proteína heteróloga a través de un sistema adaptador de dos partes, donde una parte del sistema adaptador (HR2) se liga a la proteína VP7 de rotavirus y la otra parte del sistema adaptador (HR1) se liga a la proteína heteróloga. HR1 y HR2 forman un atado de seis hélices que da por resultado un complejo estable para unir no covalentemente la proteína heteróloga a la proteína VP7 de rotavirus. La proteína de superficie quimérica puede ser parte de la capa exterior de la partícula de rotavirus por las de DLPs de recubrimiento in vitro.

Figuras 3: Micrografías electrónicas de (Figura 3A) DLPs purificadas, (Figura 3B) DLPs recubiertas con la proteína VP7 de rotavirus y (Figura 3C) DLPs recubiertas con la proteína VP7 que muestra el virus de influenza HA como la proteína heteróloga. Las partículas se tiñeron negativamente antes de la adquisición de la imagen.

Figuras 4: (Figura 4A) Gel de acrilamida teñido con Coomassie después de SDS-PAGE. La línea 1 muestra el marcador de peso molecular (MW). La línea 2 se cargó con las DLPs purificadas usadas en la reacción de recubrimiento (DLP). La línea 3 se cargó con el complejo de proteínas VP7-HA purificado (pro) usado para el recubrimiento de las DLPs. La línea 4 se cargó con la mezcla de entrada de DLPs, a la proteína VP7 modificada y la proteína HA para la reacción de recubrimiento (inp). Las líneas 5-7 se cargaron con las bandas observadas después de la purificación de las partículas recubiertas en un gradiente CsCl (bandas 1 y 2 t banda superior). Las líneas 8-14 se cargan con las mismas muestras en el mismo orden como en las líneas 1-7, pero no se agregó agente reductor a las muestras antes de la SDS-PAGE. (Figura 4B) las DLPs de rotavirus recubiertas con el complejo de proteína VP7-HA en una gradiente CsCl. Las bandas 1 y 2 y la banda superior corresponden a las muestras cargadas en las líneas 5-7 en el panel A. Las posiciones donde las partículas recubiertas y las DLPs típicamente migrarían, se indican por flechas punteadas.

Figuras 5: Sección transversal a través de una reconstrucción tridimensional de la DLP de rotavirus recubierta con una proteína VP7 modificada (Figura 5A) que muestra HA, (Figura 5B) que muestra HA con fragmentos ScFv ligados del anticuerpo CR6261, y (Figura 5C) que muestra HA con fragmentos de Fab ligados del anticuerpo CR6261. El CR6261 reconoce una región helicoidal sumamente conservada en el tallo próximo a la membrana de HA1/HA2. La reconstrucción se basa en las imágenes adquiridas al llevar a cabo la crio-EM en las DLPs recubiertas.

Figura 6: Superposición de una DLP (blanco) en una reconstrucción tridimensional de una DLP recubierta con la proteína VP7 de rotavirus modificada y el virus de influenza HA como la proteína heteróloga modificada. La reconstrucción se basa en las imágenes adquiridas al llevar a cabo la crio-EM en las DLPs recubiertas.

Figura 7: Detalle de la reconstrucción tridimensional de una partícula de rotavirus que muestra el virus de influenza HA ligado a los fragmentos Fab del anticuerpo CR6261. Las partículas de rotavirus se prepararon al recubrir las DLPs con una proteína VP7 modificada que contiene una secuencia adaptadora (HR2). La proteína HA no se ligó covalentemente a la proteína VP7 modificada a través de una secuencia de repetición héptada HR1 C-terminal fusionada que forma un atado de seis hélices con las secuencias de repetición héptadas HR2 de la proteína VP7. CR6261 se liga en el extremo próximo a la membrana de cada subunidad HA (HA1 y HA2). La reconstrucción se basa en las imágenes adquiridas al llevar a cabo la crio-EM en las DLPs recubiertas.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION

Ejemplo 1: Construcción del vector de expresión para las proteínas VP7, HA y HIV gpl40 recombinantes modificadas

El gen de VP7 de tipo natural de la cepa G3 de rotavirus rhesus (RRV) se clonó en un vector pFastBacDual (InvitrogenMR) entre los sitios de restricción BamH I y Not I a través de procedimientos estándares. Una secuencia Kozak (GCCACC; SEQ ID NO: 19) se diseñó en el extremo 5' antes del codón de inicio de la secuencia de codificación VP7. Las modificaciones de la secuencia de codificación VP7 se llevaron a cabo por PCR invertida. Se diseñaron cebadores de temperaturas de recocido apropiadas que contienen las modificaciones relevantes en los extremos de los cebadores. La Figura 1A muestra las diversas modificaciones que se agregaron a la secuencia de codificación de rotavirus.

La proteína final codificada por la secuencia de codificación VP7 modificada tiene las siguiente siguientes características: los primeros 21 aminoácidos codifican la secuencia señal de melitina de abeja para la expresión de la proteína modificada en las células de insecto. El péptido señal de proteína VP7 se ha removido. Se pueden usar otras secuencias señal como sea apropiado, tal como la secuencia señal consenso HIV o el péptido señal del activador de plasminógeno de tejido humano (htPA) para la expresión de células humanas. (b) Residuos de aminoácidos 22 a 33 forman una etiqueta de afinidad opcional (Strep-tag II más un ligador para una escisión de péptido señal más eficiente) para los propósitos de purificación de proteínas y se puede reemplazar por cualquiera de otras etiquetas de afinidad, tales como His-tag, etiqueta HA, etiqueta FLAG, etc. (c) Residuos de aminoácidos 34 a 40 forman una secuencia de reconocimiento de proteasa TEV para la escisión de la etiqueta de afinidad y se pueden reemplazar por las secuencias de reconocimiento de cualquiera de otras proteasas, tales como la proteasa PreScissionMR (es decir proteasa de Rhinovirus 3C), factor Xa, enterocinasa, trombina, furina, etc. (d) Residuos de aminoácidos 41 a 136 son las secuencias de la porción N-terminal VP7 de rotavirus de rhesus (residuos de aminoácidos VP7 51 a 146). (e) El residuo de aminoácido 137 es un ligador de un aminoácido y se puede reemplazar por otra secuencia ligadora apropiada. (f) Residuos de aminoácidos 138 a 165 son parte de la repetición C-héptada de la cepa HIV gp41 HXB2 y se podría reemplazar por secuencias de repetición héptadas de otros retrovirus, paramixovirus, etc., siempre y cuando la secuencia de reemplazo sea compatible con las secuencias de repetición héptadas usadas en los constructos de proteína HA o gpl40 modificados (ver a continuación). (g) Residuos de aminoácidos 166 a 187 son una secuencia de reconocimiento de factor Xa proteasa seguido por una etiqueta C de proteína flanqueada por ligadores; esta modificación es opcional y se puede reemplazar por otras secuencias, tal como un epítopo diseñado o simplemente una secuencia ligadora tal como GGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 20) o GGSGGSGGSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 21). La presentación de un epítopo puede ser útil para empacar fragmentos de anticuerpo que reconocen el epítopo para estabilizar adicionalmente los ensamblajes mostrados (incluyendo la proteína heteróloga) para el propósito de estudios estructurales. Como se dice, el diseño para los estudios estructurales es muy complejo que el diseño para presentar antígenos. (h) Los residuos de aminoácidos 188 a 367 son la porción C-terminal de la CP7 de rotavirus de rhesus (residuos de aminoácidos VP7 147 a 326). La proteína VP7 modificada codificada por esta secuencia de codificación modificada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

Se prepararon constructos alternativos que contienen algunas de las modificaciones descritas en el párrafo anterior. Por ejemplo, algunos de estos constructos incluyen una etiqueta de epítopo adicional que es reconocida por el anticuerpo anti-HIV 2F5 (por ejemplo SEQ ID NO: 29 y 31). En otros constructos, la repetición C-héptada de la cepa HIV gp41 HXB2 se reemplazó con la repetición C-héptada del virus Nipah (por ejemplo SEQ ID NO: 32-41). La longitud de la secuencia de longitud héptada se varió en algunos constructos (por ejemplo SEQ ID NO: 27 y 28). Similarmente, el ligador que conecta la secuencia de repetición C-héptada y el resto de la secuencia de codificación de la proteína VP7 se acortó en algunos de los constructos (ver por ejemplo SEQ ID NO: 24-26). Se resumen las diversas variantes en la Tabla 1. La secuencia de proteína VP7 modificada de SEQ ID NO: 22 se incluye como secuencia de referencia. Las secuencias en la Tabla 1 se muestran de la N-terminal a la C-terminal.

Tabla 1

(Continuado)

(Continuado)

Los ADNs que consisten de tanto el vector como los genes modificados se generaron por PCR. Los productos de PCR se purificaron en gel y se sometieron a un tratamiento de T4 polinucleótido cinasa para generar extremos fosforilados. La ligación de extremo redondo después se llevó a cabo para el ADN resultante al incubar el ADN con cantidades apropiadas de T4 ligasa durante 2 horas o durante la noche a temperatura ambiente. Los productos de ligación después se crearon con Dpn I durante 30 minutos a 37°C antes de ser usados para transformar las células DH5a a través de los protocolos estándares.

Típicamente tres a cuatro colonias se eligieron y se desarrollaron cultivos celulares durante la noche para preparar ADN plásmido usando el Kit Miniprep (QiagenMR). Los plásmidos se examinaron por electroforesis en gel de agarosa y se confirmaron las secuencias correctas por secuenciación de ADN. Los plásmidos de las secuencias correctas se usaron para transformar las células competentes DHlOBac a través de los procedimientos estándares. Dos a tres colonias blancas se seleccionaron para cada constructo y se desarrollaron cultivos celulares durante la noche para la extracción del ADN bácmido recombinante por precipitación de isopropanol/etanol (Solución I: Tris 15 mM, pH 8.0, EDTA 10 mM, y 100 pg/mL de RNasa A; Solución II: NaOH 0.2 M y 1% de SDA; y Solución III: acetato de potasio 3 M, pH 5.5; todos esterilizados por filtro). Los bácmidos purificados se examinaron por PCR usando los cebadores MI3 y los ADN correctos se usaron para transfectar las monocapas de las células sf9 en placas de 6 pocillos, cada pocillo sembrado con 1 millón de células. Los virus P1 se recolectaron 5 días postransfección y los virus P2 se produjeron al infectar las células sf9 (densidad de 1.5-2 millón/mL) con 0.05-0.1% de virus P1. Los virus P2 se cosecharon 5-7 días pos-infección y se usaron para la expresión de la proteína.

Los constructos de proteínas VP7 modificados descritos en lo anterior se pueden usar para mostrar las proteínas heterólogas formadoras de trímeros con la proteína heteróloga formadora de trímeros correspondientemente modificada (ver Figura 1B para una vista general esquemática de las modificaciones adecuadas). Como se muestra en la Figura 2, las secuencias de repetición héptadas HR2 de la proteína VP7 modificada y las secuencias de repetición héptadas HR1 de la proteína heteróloga formadora de trímeros correspondientemente modificada forman un complejo estable a través de un atado de seis hélices de las cuales las superficies como un adaptador para el montaje no covalente de la proteína heteróloga en la proteína VP7 de rotavirus. La proteína de hemaglutinina de influenza A (HA) y la proteína de fusión gpl40 de HIV-1 se eligieron como ejemplos para las proteínas heterólogas formadoras de trímeros.

El gen HA del virus de influenza A H1N1 Solomon Islands 2006 se clonó en un vector pFastBac LICMR (Life TechnologiesMR) por medio del método de clonación independiente de ligación (LIC). El vector pFastBac LICMR se creó al insertar un sitio LIC en un vector pFastBacl (Invitrogen). Una secuencia Kozak (SEQ ID NO: 19) se diseñó en el extremo 5' del codón de inicio antes de la secuencia de codificación. La modificación en la secuencia de codificación del gen HA se introdujo por PCR invertida.

La proteína final codificada por la secuencia de codificación HA modificada tiene las siguientes características: (a) los primeros 38 aminoácidos codifican el péptido señal Baculoviral gp64 para la expresión de la proteína modificada en las células de insecto. El péptido señal de la proteína HA se ha removido. Otra secuencia señal se puede usar como apropiadas, tal como la secuencia señal consenso de HIV o el péptido señal de la tPA humana para la expresión en las células humanas. (b) Residuos de aminoácidos 42 a 47 forman una etiqueta de afinidad opcional (His-tag más un ligador para una escisión de péptido de señal más eficiente para propósitos de purificación de proteínas y se puede reemplazar por cualquier otra etiqueta de afinidad, tal como etiqueta HA, etiqueta FLAG, etc. (c) Los residuos de aminoácidos 48 a 54 forman una secuencia de reconocimiento de proteasa TEV para la escisión de etiqueta de afinidad. Una secuencia ligadora también se incluye. La secuencia de reconocimiento de proteasa TEV se puede reemplazar por la secuencia de reconocimiento de cualquier otra proteasa, tal como la proteasa PreScission™ (Le. Proteasa de Rhinovirus 3C, GE HealthcareMR, Life Sciences), factor Xa, enterocinasa, trombina, furina, etc. (d) Residuos de aminoácidos 55 a 381 son las secuencias de la porción HA1 de la hemaglutinina de la cepa Solomon Islands 2006 de influenza A, que se podría modificar/mutar como sea apropiado o ser reemplazado por aquel de cualquier otra de las cepas de influenza como se muestra a continuación. (e) Residuos de aminoácidos 382 a 386 son la secuencia de reconocimiento de la enterocinasa diseñada entre HA1 y HA2 para propósitos de escisión. Este sitio es opcional y se puede reemplazar por la secuencia de reconocimiento del Factor Xa, proteasa TEV, u otros como sea apropiado. (f) Residuos de aminoácidos 387 a 565 son la secuencia de la porción HA2 de HA. (g) Residuos de aminoácidos 566 a 595 son una etiqueta de trimerización de la fibrina del bacteriófago T4 (Foldon), que es opcional y se puede reemplazar por cualquier otra etiqueta de trimerización o secuencias ligadoras. (h) Residuos de aminoácidos 596 a 629 son parte de la N-héptada de la cepa HIV gp41 HXB2 y se puede reemplazar por otras secuencias de repetición héptadas adecuadas por ejemplo de cualquier otro retrovirus, paramixovirus, etc. La numeración de las secuencias de aminoácidos HA usadas en la descripción de la secuencia de codificación HA modificada es de acuerdo con GenBank ID ABU50586.1 (incorporada en la presente a manera de referencia en la versión disponible en la fecha de la presentación de la solicitud de prioridad). La secuencia de aminoácidos de ese constructo se muestra en SEQ ID NO: 46.

Se prepararon constructos alternativos que contienen algunas de las modificaciones descritas en el párrafo anterior. Por ejemplo, el dominio de trimerización se omitió de los constructos alternativos (por ejemplo SEQ ID NO: 48 y 49). En algunos constructos, la secuencia de reconocimiento de enterocinasa se reemplazó por la secuencia de reconocimiento de Factor Xa (por ejemplo SEQ ID NO: 52). Este constructo tampoco incluyó un ligador entre la secuencia de codificación HA y la secuencia de repetición C-héptada. En otros constructos, tanto el dominio de trimerización como la secuencia de reconocimiento de enterocinasas se omitieron (SEQ ID NO: 51). La repetición N-héptada del virus Nipah se usó algunas veces en lugar de la repetición N-héptada de la cepa HIV gp41 HXB2 (ver por ejemplo SEQ ID NO: 47 y 49). La longitud de la secuencia de repetición héptada varió en algunos constructos (por ejemplo SEQ ID NO: 54, 56 y 58). En otros constructos, la longitud del ligador que conecta la secuencia de codificación HA a la secuencia de repetición N-héptada varió (ver por ejemplo SEQ ID NO: 56 y 58). Los genes HA modificados de H3 Wisconsin 2005 (ver SEQ ID NOs: 60 y 61) y H5 Vietnam 2004 (ver 15 SEQ ID N^os: 62 y 63) se optimizaron con codón y se sintetizaron por GeneArtMR (Life TechnologiesMR) antes de que se incluyera en los constructos modificados. La numeración de las secuencias de aminoácidos HA usadas en las descripciones de estos constructos es de acuerdo con GenBank IDs AAT73274.1 y ACV49644.1 (ambos incorporados en la presente a manera de referencia en versiones disponibles en la fecha de la presentación de la solitud de pérdida), respectivamente. La estructura de estas secuencias de codificación HA modificadas se resume en la Tabla 2. La secuencia de proteína HA modificadas de SEQ ID NO: 46 se excluye como la secuencia de referencia. Las secuencias en la Tabla 2 se muestran de N-terminal a la C-terminal.

Tabla 2

(Continuado)

Cada uno de los tres genes HA modificados se subclonaron en pFastBacDualMR (Life TechnologiesMR) entre los sitios Sal I y Not I. Los baculovirus recombinantes que llevan los genes HA modificados se crearon siguiendo los procedimientos similares como aquellos descritos para VP7.

Los genes gpl40 modificados del serotipo HIV-1 clado A 1992 Uganda 037.8 y clado C 1997 se utilizaron con codón y se sintetizaron por GeneArtMR (Life TechnologiesMR). Los genes modificados se subclonaron en pFastBacDualMR (Life TechnologiesMR) entre los sitios Sal I y Not I.

La proteína final codificada por la secuencia de codificación gpl40 modificada de la cepa HIV-1 clado A tiene las siguientes características: (a) Los primeros 21 aminoácidos que codifican el péptido señal de melitina de abeja para la expresión de la proteína modificada en las células de insecto. El péptido señal gpl40 se ha removido. Otra secuencia señal se pueden usar como apropiadas, tal como la secuencia señal de consenso HIV o el péptido señal de tPA humana para la expresión en las células de mamífero/humanas. (b) Residuos de aminoácidos 22 a 29 forman una etiqueta de afinidad opcional (etiqueta His más un ligador para la escisión de péptido señal más eficiente) para propósitos de purificación de proteínas y se pueden reemplazar por cualquier otras etiquetas de afinidad, tales como etiqueta HA, etiqueta FLAG, etc. (c) Residuos de aminoácidos 30 a 36 forman una secuencia de reconocimiento de proteasa TEV para la escisión de la etiqueta de afinidad y se pueden reemplazar por las secuencias de reconocimiento de cualquier otra proteasa, tal como la proteasa PreScissionMR (es decir proteasa de Rhinovirus 3C, GE HealthcareMR, Life Sciences), factor Xa, enterocinasa, trombina, furina, etc. (d) Residuos de aminoácidos 37 a 685 en la secuencia de codificación gpl40 de la cepa de VIH 1992 Uganda 037.8 que se podría modificar/mutar como sea apropiado o se reemplace por aquella de las otras cepas HIV/SIV. (e) Residuos de aminoácidos 686 a 694 son un ligador y se pueden reemplazar por cualquiera de otras secuencias ligadoras apropiadas. (f) Residuos de aminoácidos 695 a 721 son una etiqueta de trimerización de fribritina T4 de bacteriófago (Foldon), que es opcional o se puede reemplazar por cualquier otra etiqueta de trimerización o secuencias ligadoras. (g) Residuos de aminoácidos 722 a 755 son parte de la repetición N-héptada de la cepa HIV gp41 HXB2 y se puede reemplazar por otras secuencias de repetición héptadas adecuadas por ejemplo de cualquier otros retrovirus, 25 paramixovirus, etc. La secuencia de aminoácidos de este constructo se muestra en SEQ ID NO: 64.

Se prepararon constructos alternativos que contienen algunas de las modificaciones posibles indicadas en el párrafo anterior. Por ejemplo, algunos de los constructos no incluyen la etiqueta de trimerización, y la secuencia ligadora entre la región de codificación gpl40 y la repetición N-héptada se ha cortado (por ejemplo SEQ ID NO: 66 y 67). Otros constructos son adaptados para la expresión en las células de mamífero por el reemplazo del péptido señal (por ejemplo SEQ ID NO: 65 y 67). En algunos constructos, la repetición N-héptada de la cepa HIV gp41 HXB2 se ha reemplazado con la repetición N-héptada del virus Nipah (SEQ ID NO: 68-71 y 76-79), en otros, la secuencia de codificación gpl40 del serotipo HIV-1 clado A 1992 Uganda 037.8 se ha reemplazado con la secuencia de codificación gpl40 de HIV-1 clado C 1997 (SEQ ID NO: 72-79). La numeración para clado A y C gpl40 es de acuerdo con GenBank ID AAB05027.1 y AF286227.1 (ambos incorporados en la presente a manera de referencia en las versiones disponibles en la fecha de la presentación de la solicitud de prioridad), respectivamente.

Las diversas variantes se resumen en la Tabla 3. La secuencia de proteína gpl40 modificada de SEQ ID NO: 64 también se incluye como secuencia de referencia. Las secuencias en la Tabla 3 se muestran de N-terminal a la C-terminal.

Tabla 3

(continuado)

Ejemplo 2: Preparación de complejos VP7-HA estables

Para producir los complejos HA-VP7, células Hi5 en la densidad de 2xl06/mL se infectaron con 0.5% de baculovirus VP7 y 1.0% de baculovirus HA en presencia de 5.0% de FBS inactivado con calor (Sigma-Aldrich). El medio se recolectó 5 días pos-infección al centrifugar las células a 4000xg durante 45 minutos. El sobrenadante se diafiltró contra 8 litros de 1x TNC (Tris 20 mM, pH 8.0, NaCl 100 mM, y CaCl2 1.0 mM; se complementó con 0.02% de azida de sodio) usando un filtro de corte de línea de 10 KDa en un Sistema de Filtración de Flujo Tangencial Cogent M (Millipore). Las muestras intercambiadas con solución amortiguadora se complementaron con PMSF 1.0 mM y se clarificaron por centrifugación durante 1 hora a 10,000 RPM en un rotor JA10 (BeckmanMR). Los complejos de proteínas se purificaron del sobrenadante por una columna StrepTactinMR (IBAMR), seguido por una columna NiNTA (QiagenMR), y una columna Superose 6 (AmershamMR).

Los complejos HA-VP7 purificados se trataron con 0.002% (p/p) de enterocinasa a 4°C durante 48 horas. La escisión de ^hA0 en HA1 y HA2 se examinó por SDS-PAGE. La enterocinasa se inactivó al agregar 1x de un comprimido de inhibidor de proteasa completo sin EDTA. La muestra se complementó con una solución amortiguadora de reducción oxidación (10:1 de relación molar de GSH y GSSG) en una concentración final de 0.2­ 0.5 mM y se trataron con proteasa TEV (1/50-200, p/p) ya sea a temperatura ambiente durante 4 horas o a 4°C durante la noche. La remoción de las etiquetas también se examinó por SDS-PAGE.

Ejemplo 3: Preparación de complejos HIV gp140-VP7 estables

Los genes VP7 y gpl40 modificados que codifican las proteínas de SEQ ID NOs: 22, 26, 32 y 36 y SEQ ID NOs: 64, 66, 68 y 70, respectivamente se subclonaron en vectores pVRC8400 y pYRC-IRES-Puro entre Sal I y Not I para la expresión en las células de mamífero. El péptido señal para el gen YP7 se cambió a un péptido señal tPA humano y el péptido señal para el gen gpl40 se cambió a la secuencia de péptido de señal consenso VIH. Las proteínas VP7 modificadas resultantes y las proteínas gpl40 modificadas tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 42-45 y SEQ ID NOs: 65, 67, 69 y 71, respectivamente. La co-expresión y formación en complejo se sometieron a prueba para las siguientes combinaciones de la proteína VP7 modificada y la proteína gpl40 modificada: SEQ ID NOs. 42 65, SEQ ID NOs. 42 67, SEQ ID 10 NOs. 43 65, SEQ ID NOs. 43 67, SEQ ID NOs. 44 69, SEQ ID NOs. 44 71, SEQ ID NOs. 45 69, SEQ ID NOs. 45 71.

Los complejos HIV gpl40-VP7 se expresaron al co-transfectar células 293T con un plásmido que aloja el gen gpl40-HRl y otro que aloja el gen VP7-HR2. La transfección transitoria se hizo al seguir los protocolos estándares usando polietilenimina (PEI, 25KDa, lineal o ramificada). Para el mayor rendimiento de proteínas, se seleccionaron líneas de células estables contra puromicina. En resumen, 70% de células T 293 confluentes se transfectaron con una mezcla de LipofectoamineMR 2000 (InvitrogenMR) y la versión pVRC-IRES-puro de los dos plásmidos (relación en masa 2:1 de lipofectamina al ADN total) siguiendo los procedimientos estándares. A las 20 horas pos-transfección, el medio se reemplazó con DMEM (GibcoMR) complementado con 10% de Suero Bovino Fetal (Atlas), 1% de GlutaMAXMR (GibcoMR), 100 unidades/mL de penicilina/estreptomicina (GibcoMR), y 2 pg/mL de puromicina (GibcoMR). El medio se mantuvo fresco al cambiarlo cada tres a cuatro días hasta que se forman colonias (visible a simple vista). Las colonias individuales se eligieron y se cultivaron en placas de 24 pocillos para las pruebas de expresión de escala pequeña. Las colonias que alojan tanto genes se seleccionaron basado en la detección de ambas proteínas en el análisis de western blot. La colonia con el rendimiento más alto del complejo se aumentó y se guardó como solución madre en nitrógeno líquido. Las células se aumentaron en un medio que contiene puromicina y la expresión de la proteína se podría llevar a cabo usando ya sea cultivos de células adherentes o de suspensión en un medio 293 Freestyle (GibcoMR) complementado con 5% de FBS inactivado con calor (Sigma-AldrichMR). El medio se recolectó después de 5 días al centrifugar las células a 4000xg durante 45 minutos. La diafiltración y purificación de proteínas se llevó a cabo siguiendo los mismos procedimientos como se describe para los complejos HA-VP7.

Ejemplo 4: Preparación de Fabs y Fvs

El anticuerpo monoclonal CR6261 reconoce una región helicoidal sumamente conservada en el tallo próximo a la membrana de la proteína HA de influenza [67]. Los factores de estructura y coordenadas para el fragmento CR6261 sHgL Fab se depositaron con el banco de datos de proteínas bajo el acceso 4EVN (incorporado en la presente a manera de referencia en la versión disponible en la fecha de la presentación de la solicitud de prioridad) y se ha descrito previamente [68].

La secuencia de codificación para el fragmento de ligación a antígeno (Fab) y el fragmento variable de cadena individual (scFv) del anticuerpo monoclonal CR6261 se clonaron en el vector pVRC-IRES-Puro entre Sal I y Not I siguiendo los procedimientos estándares como se describe en lo anterior. El péptido señal tPA humano se usó para la secreción eficiente en estos constructos en los sistemas de expresión de mamífero. Las secuencias de aminoácidos de los constructos finales se muestran en SEQ ID NOs: 81-83. Un scFv del anticuerpo monoclonal CR6261 para la expresión en las células bacterianas también se preparó (ver SEQ ID NO: 80).

Los Fabs se expresaron por transfección transitoria de las células 293T en botellas giratorias. Para cada botella giratoria, 125 pg de cada uno de ADN plásmido purificado que aloja los genes de cadena pesada y ligeras se mezclaron en 12.5 mL de DMEM no suplementado (GibcoMR) y se incubaron en la vitrina durante 15 minutos. El PEI (500pg, lineal o ramificado) también se diluyeron en 12.5 mL de DMEM no suplementado y se incubaron en la vitrina durante 15 minutos antes de ser agregados gota a gota y ser mezclados bien en la mezcla de ADN. El total de 25 mL de la mezcla se incubó en la vitrina durante 15 minutos extras para permitir un complejo de ADN-PEI para formarse antes de ser agregados a las células a 50-70% de confluencia en las botellas giratorias. Las células se incubaron por más de 5 horas con el complejo de DNA-PEI a 37°C, y el medio se reemplazó por 250 mL del medio FreeStyleMR (GibcoMR) complementado con 100 unidades/mL de penicilina/estreptomicina. El medio se recolectó 5 días pos-transfección, y los Fabs se purificaron usando una resina de afinidad CaptureSelectMR Le Kappa o Le Lambda, seguido por cromatografía de exclusión de tamaño en una columna S200 (AmershamMR).

Los ScFvs se expresaron ya sea en las células 293 T como proteínas secretadas o en el E. coli como cuerpos de inclusión, de los cuales la proteína después se extrajo y se volvió a replegar. Los mismos procedimientos de transfección transitoria como se describe en lo anterior se siguieron para la expresión de células de mamífero. Para la expresión de E. coli, la expresión de proteínas se indujo durante aproximadamente 5 horas usando IPTG 1 mM en una densidad celular de 0.6~0.8 O.D.600nm. Las células se recolectaron, se lavaron con 1x de PBS, y se lisaron por sonicación sobre hielo. Los cuerpos de inclusión se extrajeron después de la remoción de las fracciones solubles de las células por centrifugación durante 15 minutos a 20000xg. Los cuerpos de inclusión se disolvieron en Tris 100 mM, pH 7.5, urea 8 M, y p-mercaptoetanol 10 mM, se clarificaron por centrifugación (20 minutos a 40000xg), y sobrenadantes se purificó sobre una columna de NiNTA. La muestra eluída, también en la forma desnaturaliza, se diluyó en la solución amortiguadora de replegamiento (Tris 100 mM pH 7.5, arginina 1 M, NaCl 500 mM, 10% de glicerol, y EDTA 1 mM) gota a gota a 4°C a una concentración de proteínas final menor que 0.1 mg/mL. La muestra replegada se dializó contra Tris 20 mM, pH 7.5, NaCl 100 mM cuatro veces, cada vez 20 volúmenes. La muestra dializada después se clarificó a centrifugación a 10,000 rpm en un rotor JA10 (BeckmanMR) y el sobrenadante se hizo pasar a través de una columna NiNTA para concentrar la proteína. Las fracciones eluídas después se combinaron, se concentraron y se purificaron adicionalmente sobre una columna de exclusión de tamaño S200 (AmershamMR).

Ejemplo 5: Preparación de DLP

El serotipo de rotavirus rhesus G3 se amplificó al infectar células MA-104. Brevemente, las células MA104 se desarrollaron en un medio M199 (GibcoMR) complementado con 10% de suero bovino fetal (HyCloneMR Laboratories), HEPES 10 mM, pH 7.0, L-glutamina 2 mM, y 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina. Las células se mantuvieron y se aumentaron a una cámara de cultivo de 10 células apiladas (CorningMR) o botellas giratorias. Cuando las células fueron confluentes, el medio se reemplazó por MA199 sin suero complementado con 1 pg/mL de tripsina pancreática porcina (Sigma-AldrichMR) para inoculación y amplificación del rotavirus. El medio de las células MA104 infectadas se recolectó a aproximadamente 36-42 horas pos-infección y se almacenó a -80°C para uso futuro.

El medio congelado de las células MA104 infectadas se descongeló a 4°C durante la noche. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a baja velocidad a x g durante aproximadamente 10 minutos. El sobrenadante resultante se filtró a través de papel de Filtro WhatmanMR para remover los restos celulares residuales antes de que se hiciera pasar adicionalmente a través de una unidad de filtro Expressplus 0.45 pm (MilliporeMR) bajo vacío. Las partículas del virus después se formaron en pelotillas a 45,000 rpm durante 1 hora a 4°C en un rotor 45Ti (BeckmanMR).

La pelotilla se volvió a suspender en un total de 10 mL de solución amortiguadora lx TNE (Tris 20 mM, pH 8.0, NaCl 100 mM, y EDTA 1 mM), se hizo pasar por ondas sonoras brevemente, y se extrajo dos veces con Freon 113 (Sigma-AldrichMR). La fase acuosa se recubrió y se concentró en aproximadamente 1 mL en un dispositivo de filtración de centrifuga AmiconMR (línea de corte 100 KDa) a 3000xg durante aproximadamente 10 minutos. La muestra concentrada se volvió a suspender por pipeteo arriba y abajo un par de veces y se recubrió sobre un gradiente CsCl preformado en lx TNE (1.26 a 1.45 g/mL de densidad como es determinado por la refractometría). Las muestras se centrifugaron a 55000 rpm en un rotor SW 55Ti (BeckmanMR) a 4°C durante aproximadamente 2 horas. La banda DLP se recolectó y se dializó durante la noche a 4°C contra solución amortiguadora lx TN (Tris 20 mM, pH 8.0, NaCl 100 mM) complementado con 0.02% de azida de sodio.

Las DLPs se tiñeron negativamente y se visualizaron usando microscopia electrónica (EM; Figura 3A). Ejemplo 6: Recubrimiento de las DLPs con el complejo HA-VP7

Las DLPs obtenidas en el Ejemplo 5 y la proteína VP7 de rotavirus modificada preparada en el Ejemplo 1 se mezclaron y se incubaron a 4°C durante al menos 1 hora en presencia de 5-10 mM de CaCl2. Las partículas resultantes se tiñeron negativamente y se visualizaron usando EM. Una capa de VP7 individual que cubre cada partícula se observó confirmando que la proteína VP7 modificada fue capaz de recubrir las DLPs (Figura 3B).

El recubrimiento de las DLPs con el complejo HA-VP7 obtenidas en el Ejemplo 2 se llevó a cabo a 4°C durante al menos 1 hora al mezclarlas en una relación molar de 1:1.5 a 1:2 en presencia de CaCl2 5~10 mM. Las partículas de rotavirus recubiertas se tiñeron negativamente y se visualizaron usando EM. Además de la capa de VP7 individual que cubre la DLP, se observó una capa adicional que circunda las partículas recubiertas sugiriendo que el complejo HA-VP7 se ensambló correctamente sobre la superficie del DLPs (Figura 3C).

Para confirmar que la capa adicional se formó por la proteína HA, las partículas recubiertas se cargaron sobre un gradiente CsCl preformado en lx TNC (densidad 1.25 g/mL a 1.45 g/mL) y se centrifugó en un rotor SW60 (BeckmanMR) a 58,000 rpm durante 2 horas. Las bandas resultantes se recolectaron, se dializaron contra 1x TNC, y se examinaron por SDS-PAGE. Como un control, DLPs, el complejo HA-VP7 y la mezcla de ambos como se usan en la reacción de recubrimiento también se cargaron en el gel en líneas separadas. Después de la separación, las bandas separadas que corresponden a las proteínas VP2 y VP6 de las DLPs, la proteína VP7 y la proteína HA se observaron en la estequiometria correcta en la muestra que correspondió a las partículas recubiertas (Figuras 4A y 4B). Esto confirmó que la capa adicional que circunda las partículas recubiertas se compuso de la proteína HA en ocupación completa.

Ejemplo 7: Reconstrucción de la imagen tridimensional del complejo HA-VP7-anticuerpo

La crio-EM de alta resolución tiene el potencial de reemplazar la cristalografía de rayos X como el método de elección para analizar grandes complejos moleculares, en particular en áreas donde la elucidación estructural de un gran número de complejos moleculares es necesaria. Una de tal área es diseño de vacuna de influenza, donde la deriva antigénica conduce a rápidos cambios en de la secuencia del antígeno de superficie inmunodominante, la proteína HA. Los anticuerpos monoclonales ampliamente protectores se han identificado previamente y muchos de estos anticuerpos reconocen epítopos conservados que no se someten a un cambio rápido. Para investigar su idoneidad como agentes protectores contra las cepas de influenza que surgen recientemente, los inventores necesitan clasificar estos anticuerpos anti-HA ampliamente neutralizantes contra diferentes variantes de la proteína HA.

Se probó la factibilidad de tal procedimiento usando el análisis crio-EM. Las DLPs se recubrieron con la proteína VP7 modificada sola o con un complejo HA-VP7 como se describe en el Ejemplo 6. Las partículas recubiertas con el anticuerpo HA-VP7 se obtuvieron al mezclar los complejos HA-VP7 purificados con las Fabs o scFvs del anticuerpo monoclonal CR6261 preparado en el Ejemplo 4 en una relación molar de 1:1.5~2.0. La mezcla se incubó a 4°C durante 30 minutos. Los complejos se purificaron al cargar la mezcla después del final del período de incubación en una columna Superose 6. Los complejos purificados después se usaron para recubrir las DLPs siguiendo los mismos procedimientos como se describe en el Ejemplo 6. Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos se agregaron directamente a las partículas recubiertas con los complejos HA-VP7 en una relación molar de 1:1.2~1.5 ya sea antes o después del paso de purificación en gradiente CsCl.

Las crio-rejillas se prepararon con un embolo Automatizado VitrobotMR (FEI). Rejillas de carbono Quantifoil Holey se les aplicó una descarga luminiscente y se dejaron a temperatura ambiente durante la noche antes del uso. Cada rejilla, 4 pL de muestra en una concentración equivalente a ~5 mg/mL de DLPs de rotavirus se aplicó a una superficie lateral de la rejilla. Durante la inmersión, la humedad de la cámara se mantuvo cercana 100% y la temperatura aproximadamente 22°C. La rejilla después se secó durante 4 segundos de ambos lados con papel de filtro, seguido inmediatamente por inmersión en etano líquido para vitrificación. Las rejillas después se almacenaron en nitrógeno líquido antes de ser usadas para recolección de datos.

Los datos se recolectaron en un microscopio electrónico TecnaiMR F30 (FEI) operado a 300 kV. El sistema optimo se alineó usando procedimientos estándares (cambios de haz, inclinación del haz, altura eucéntrica, puntos de pivote, centro rotacional, astigmatismo, etc.). Los procedimientos de adquisición de imagen implicaron el descubrimiento del área de imagen deseada, ajustar el desenfoque (entre 0.6 y 3.0 pm), probar la velocidad de deriva de la rejilla (menor que 2 A por segundo), y la exposición de imagen final. Estos procedimientos se lograron semiautomáticamente usando el programa SerialEM (Crio-electron Microscopy Facility, University of Colorado -Boulder). Los datos se registraron como películas en una cámara de detección directa K2 SummitMR (GatanMR) usando un modo de súper resolución (tamaño de pixel: 0.99 A). Se usó el protocolo “de película” de la referencia 24. La velocidad de dosis en la muestra fue ~3 electrones/A2 por segundo. Cada marco registró una exposición de 0.5 segundos y la película final consistió de 24 marcos con una dosis acumulada de ~36 electrones/A 2.

Los marcos de cada película se alinearon usando los caracteres IMOD (Crio-electron Microscopy Facility, University of Colorado - Boulder) basado en la correlación cruzada de imagen. Los marcos alineados se promediaron simplemente para procesamiento de imagen inicial. Ya que la resolución se mejoró posteriormente sin embargo, las imágenes promediadas de los primeros 13 marcos (o la mejor serie de marcos) de cada película, que correspondería a ~20 de dosis de electrones, fueron usados. Las imágenes de partículas se eligieron usando e2boxer.py de la suite de procesamiento de imagen EMAN2 [69]. Las imágenes con defectos obvios, aberraciones, enfoque normal, contaminación, solapamiento, o derivaciones de muestra grandes se excluyeron manualmente después de la inspección visual. Las coordenadas de las partículas se usaron para escindir las pilas de imágenes de las partículas individuales con dimensiones de 1600 x 1600 pixeles usando proc2d de la suite de procesamiento de imagen EMAN2 [69]. Los valores de desenfoque se determinaron usando el programa CTFFIND3 [23],

El refinamiento de la estructura y las reconstrucciones se llevaron a cabo usando el programa FREALIGN [40]. La búsqueda de orientación inicial se llevó a cabo usando datos combinados 4x y un mapa previamente calculado de las partículas recubiertas VP7 (7RP) (ver referencia 1) como una referencia tridimensional. Los parámetros de alineación iniciales de las partículas escindidas, determinadas por una investigación sistemática (modo 3) en un intervalo angular de 1o, se refinaron adicionalmente contra las últimas reconstrucciones (modo 1) hasta que no hubo mejora adicional en la resolución. Durante la alineación, una mascar de envoltura radial entre 220 y 400 A se aplicó para retener la densidad que corresponde a la porción de rotavirus y para excluir la densidad que corresponde a los picos de ARN y HA. Las imágenes también se filtraron en paso bajo (hasta 15 A) para evitar el sobre ajuste posible en el proceso de alineación. Los parámetros de alineación después se usaron para calcular las reconstrucciones de la partícula completa (dentro de la envoltura radial de 600 A o entre los radios de 220 y 600 A para los contenidos de las proteínas).

Subsecuentemente, imágenes combinadas y no combinadas posteriores 2x se usaron para refinar adicionalmente los parámetros de alineación siguiendo las estrategias similares a aquellas usadas para los datos combinados 4x, es decir una búsqueda sistemática inicial (modo 3) seguido por múltiples siclos de refinado angular y posicional (modo 1) hasta que no se observó una mejora adicional en la resolución. Durante cada paso de refinación, la máscara de envoltura entre 220 y 400 A se aplicó los datos de restringieron a la resolución más confiable (hasta 10 A para datos combinados 2x y hasta 8 A para datos no combinados). Se calcularon las reconstrucciones para la partícula completa dentro de la envoltura radial de 600 A.

La Figura 5A muestra una sección transversal a través de una reconstrucción tridimensional de la DLP de rotavirus recubierta con la proteína VP7 modificada solamente. La Figura 5B muestra una sección transversal a través de una reconstrucción tridimensional de la DLP de rotavirus recubierta con un complejo HA-VP7 como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 6 muestra una súper posición de una DLP en la reconstrucción tridimensional de la partícula recubierta mostrada en la Figura 5B. La Figura 5C muestra una sección transversal a través de una reconstrucción tridimensional de la DLP de rotavirus recubierta con la proteína VP7 modificada que muestra HA con fragmentos ScFv ligados del anticuerpo CR6261.

Para evaluar la confiabilidad del refinamiento, diferentes conjuntos de refinamiento se llevaron a cabo al enmascarar diferentes regiones de la partícula, y los parámetros de alineación se usaron para calcular las reconstrucciones para regiones omitidas que no se incluyeron durante el refinamiento. Por ejemplo, los parámetros de alineación obtenidos al refinar la porción HA (al aplicar una máscara de envoltura entre 425 y 600 A) se usaron para calcular la reconstrucción para la porción de rotavirus (al aplicar una máscara de envoltura entre 220 y 400 A). El mapa resultante contuvo densidades que representan claramente VP2, VP6, y VP7, sugiriendo un sesgo modelo mínimo. El arreglo casi equivalente T=13 de las capas VP6 y VP7 de rotavirus se extendieron claramente al adaptador y la porción HA de la partícula. El promedio de 13 veces local no se aplicó pero se puede llevar a cabo para mejorar adicionalmente la resolución. El ajuste corporal rígido de las VP2, VP6, y VP7 de rotavirus, el atado de seis hélices, la HA, y los Fabs en los mapas de densidad de electrones se llevó a cabo usando la quimera UCSF [47].

Un ejemplo del nivel de detalle que se puede lograr al refinar adicionalmente las reconstrucciones obtenidas de crio-EM como se describe en el párrafo anterior se muestra en la Figura 7. Un detalle de la reconstrucción tridimensional de una partícula de rotavirus que muestra el virus de influenza HA ligado a los fragmentos Fab del anticuerpo CR6261 se muestra. Algunas estructuras secundarias se pueden visualizar en el mapa calculado. Como es esperado, el dominio variable de CR6261 se observa que interactúa con tanto HA1 como HA2.

Ejemplo 8: Estudios de inmunización con los complejos de proteínas HA-VP7 montados en las DLPs de rotavirus

Ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad hembras se inmunizaron intramuscularmente (IM) tres veces en intervalos de tres semanas con una de las tres formulaciones diferentes, cada una formulada en 100 pl de una solución amortiguadora que contiene calcio. El grupo 1 recibe los complejos de proteínas HA-VP7 formuladas montadas en las DLPs de rotavirus, el grupo 2 recibe la HA purificada, y el grupo 3 recibe la HA purificada mezclada con las DLPs recubiertas con VP7. Un cuarto grupo de ratones se inyecta de manera simulada con 100 pl de solución amortiguadora. Los experimentos pueden incluir varias dosis para cada uno de los grupos. Cantidades equivalentes de antígenos se pueden usar para comparar la respuesta inmunitaria a las dosis equivalentes del antígeno en varios formatos. Alternativamente, las cantidades equivalentes de la proteína total se pueden usar para comparar las respuestas inmunes a varias cantidades de la proteína total.

Uno o más grupos pueden incluir un adyuvante. Los adyuvantes pueden ser particularmente útiles en estimular una respuesta inmunitaria en los ratones en el grupo 2 que reciben el antígeno HA purificado.

Cada grupo de vacuna contiene ocho ratones, y el grupo de control “solución amortiguadora sola” contiene cinco ratones. La sangre se extrae en los días -1, 20, 41, 56 y 84 de la administración de la primera inyección.

Los ratones se monitorean después de la inmunización para el cambio del peso corporal, las reacciones del sitio de la inyección, y otras observaciones clínicas. Las respuestas de anticuerpos a los antígenos administrados se analizan usando los métodos conocidos en la técnica para analizar la especificidad del anticuerpo (por ejemplo ensayo ELISA y ensayo ELISA de competición contra proteínas HA y de rotavirus incluyendo la proteína VP7) y la actividad de neutralización (por ejemplo ensayo de inhibición de hemaglutinación de influenza, ver por ejemplo referencias 70 y 71).

Los resultados muestran una respuesta inmunitaria sustancialmente más alta a los complejos de proteínas HA-VP7 montados en las DLPs de rotavirus como es comparada con la HA purificada, incluyendo la HA purificada formulada con el adyuvante. El ELISA de competición muestra que las respuestas de anticuerpos a los complejos de proteínas HA-VP7 son predominantemente a la porción HA del complejo antes de la VP7 o porción de rotavirus del complejo. Los resultados muestran títulos de anticuerpos de neutralización sustancialmente más altos como resultado de la inmunización con los complejos de proteínas HA-VP7 montados en las DLPs de rotavirus como es comparada con la HA purificada, incluyendo la HA purificada formulada con el adyuvante. Estos resultados muestran la inmunogenicidad incrementada de los antígenos de la gripe cuando se montan en la DLP recubierta con VP7 de rotavirus como es comparada con los antígenos de la gripe no montados en las DLPs recubiertas con VP7.

Todos los experimentos animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos del Comité del Cuidado y Uso Animal Institucional.

Ejemplo 9: Estudios de inmunización con complejos de proteínas HA-VP7 montados en las DLPs de rotavirus con y sin adyuvante

Ratones BALB/c hembras se inmunizaron mediante dos inyecciones intramusculares de 50 |jl bilaterales en los cuádriceps traseros en los días 0, 21, y 42 con 0.3-15 jg de los complejos de proteína de hemaglutinina (HA) H1N1 de antígeno purificado como se expone en la siguiente Tabla 4.

Los complejos se formularon con PBS o adyuvante 1-2 horas antes de la inmunización. Las vacunas de subunidad formuladas se mantienen sobre hielo hasta la administración.

Los ratones se monitorearon después de la inmunización para el cambio de peso corporal, las reacciones en el sitio de inyección, y otras observaciones clínicas. Se obtuvieron muestras de suero de los animales por sangrados de seno retro-orbital en el día 20 (3 semanas pos-primera inmunización) y el día 41 (3 semanas pos­ segunda inmunización) y de los sangrados de los animales sacrificados en el día 63 (3 semanas pos-tercera inmunización).

Las respuestas de anticuerpos a los antígenos administrados se analizan usando los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo ensayo ELISA, ensayo de neutralización). Los resultados muestran una respuesta inmunitaria sustancialmente más alta a los complejos de proteínas HA-VP7 montadas sobre las DLPs de rotavirus como es comparada con la HA purificada, incluyendo la HA purificada formulada con el adyuvante o HA purificada formulada con, pero no montada en las DLPs recubiertas con VP7.

Todos los experimentos animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos del Comité de Cuidado y Uso Animal Institucional.

Tabla 4

Monovolumen A/Sol es la HA recombinante, trimerizada oligomerizada con lípidos.

7RP es las partículas recubiertas con VP7 sin HA.

HA 7RP es partículas recubiertas con VP7 en las cuales la HA no se puede montar HA recombinante trimerizada HA-7RP es partículas recubiertas con VP7 montadas con HA recombinante, trimerizada.

A/Sol HA es HA recombinante trimerizada.

Se entenderá que la invención se ha descrito por medio de ejemplo solamente y se pueden hacer modificaciones mientras que permanezcan dentro del alcance y el espíritu de la invención.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un complejo proteico quimérico que comprende una proteína de superficie VP7 de rotavirus formadora de trímeros unida a una proteína heteróloga, en donde la proteína de superficie VP7 de rotavirus está unida a la proteína heteróloga de manera no covalente mediante un sistema adaptador de dos partes, donde una parte del sistema adaptador es formado por un primer polipéptido adaptador que se fusiona con la proteína de superficie VP7 del rotavirus, opcionalmente a través de una secuencia enlazadora, y la otra parte del adaptador está formado por un segundo polipéptido adaptador que se fusiona con la proteína heteróloga, opcionalmente a través de una secuencia enlazadora, por lo que ambas partes del sistema adaptador forman un complejo estable entre sí y el complejo proteico quimérico puede convertirse en parte de la capa externa de una partícula de rotavirus mediante la recubierta in vitro de partículas de rotavirus de doble capa.

2. El complejo proteico quimérico de la reivindicación 1, en el que el primer polipéptido adaptador y el segundo polipéptido adaptador comprenden una secuencia de repetición de heptada.

3. Una partícula de rotavirus que comprende el complejo proteico quimérico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. La partícula de rotavirus de la reivindicación 3 para uso como medicamento.

5. Una composición de ácido nucleico que comprende:

(a) un marco de lectura abierto que codifica una proteína de superficie de rotavirus modificada que comprende una proteína de superficie de rotavirus VP7, un primer polipéptido adaptador y, opcionalmente, una secuencia enlazadora; opcionalmente, en el que el marco de lectura abierto está vinculado operativamente a una secuencia promotora; y

(b) un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína heteróloga, un segundo polipéptido adaptador y, opcionalmente, una secuencia enlazadora; opcionalmente, en el que el marco de lectura abierto está vinculado operativamente a una secuencia promotora;

en donde los polipéptidos adaptadores primero y segundo son capaces de formar un complejo estable entre sí.

6. La composición de ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que el polipéptido adaptador comprende una secuencia de repetición de heptada

7. Un kit que comprende:

(a) (i) un primer ácido nucleico que codifica una proteína de superficie de rotavirus modificada que comprende una proteína de superficie VP7 de rotavirus y un primer polipéptido adaptador, y (ii) un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido adaptador y un sitio de clonación múltiple , y en la que la inserción de una región codificante para una proteína heteróloga en el sitio de clonación múltiple produce un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión que comprende la proteína heteróloga y el segundo polipéptido adaptador; o

(b) (i) un primer ácido nucleico que codifica una proteína de superficie de rotavirus modificada que comprende una proteína de superficie VP7 de rotavirus y un primer polipéptido adaptador y (ii) un segundo ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína heteróloga y un segundo polipéptido adaptador; en el que el primer polipéptido adaptador y el segundo polipéptido adaptador son capaces de formar un complejo estable

8. Un kit según la reivindicación 7, en el que el kit comprende además una partícula de rotavirus, en la que la partícula se deriva de la misma especie de rotavirus que la proteína de superficie del rotavirus o de una especie diferente de rotavirus

9. Un método para preparar la partícula de rotavirus de la reivindicación 3, en el que el método comprende propagar una partícula de rotavirus que comprende una capa externa en una célula que crece en un medio de cultivo, purificando la partícula de rotavirus del medio de cultivo, eliminando la capa externa del rotavirus partícula para obtener una partícula de doble capa de rotavirus (DLP), y recubrir la DLP del rotavirus con el complejo de proteínas quiméricas de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para producir la partícula de rotavirus de la reivindicación 3.

10. Un método para preparar la partícula de rotavirus de la reivindicación 3, en el que el método comprende propagar una partícula de rotavirus que comprende una capa externa en una célula que crece en un medio de cultivo, purificando la partícula de rotavirus del medio de cultivo, eliminando la capa externa del rotavirus partícula para obtener un DLP de rotavirus, y volver a recubrir el DLP de rotavirus con una primera proteína de fusión que comprende una proteína de superficie VP7 de rotavirus formadora de trímeros, un primer polipéptido adaptador que comprende una secuencia de repetición de heptada, y opcionalmente una secuencia enlazadora y mezclar el DLP de rotavirus recubierto con una la segunda proteína de fusión que comprende una proteína heteróloga formadora de trímeros, un segundo polipéptido adaptador que comprende una secuencia de repetición de heptada y, opcionalmente, una secuencia enlazadora para producir la partícula de rotavirus de la reivindicación 3.

11. Un método para preparar la partícula de rotavirus de la reivindicación 3, que comprende mezclar una partícula de rotavirus que comprende una primera proteína de fusión que comprende una proteína de superficie VP7 de rotavirus formadora de trímeros, un primer polipéptido adaptador que comprende una secuencia de repetición de heptada y, opcionalmente, una secuencia enlazadora con una segunda proteína de fusión que comprende una proteína heteróloga formadora de trímeros, un segundo polipéptido adaptador que comprende una secuencia de repetición de heptada y, opcionalmente, una secuencia enlazadora.

12. Un método para determinar la estructura de una proteína heteróloga, en donde el método comprende los pasos de (i) recubrir un DLP de rotavirus con un complejo proteico quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para producir una suspensión de partículas de rotavirus que muestran la proteína de superficie quimérica, (ii) congelación de la suspensión, (iii) imágenes del rotavirus

partículas que utilizan crio-EM para obtener una pluralidad de micrografías, y (iv) analizar la pluralidad de micrografías para obtener un modelo tridimensional del complejo proteico quimérico.

13. Un método para determinar la estructura de una proteína heteróloga en complejo con una molécula, en donde el método comprende las etapas de (i) recubrir una DLP de rotavirus con un complejo de proteína quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para producir una suspensión de partículas de rotavirus mostrando el complejo proteico quimérico, (ii) agregando a la suspensión una molécula que se une específicamente a la proteína heteróloga, en donde la molécula forma un complejo con el complejo proteico quimérico, (iii) congelando la suspensión, (iv) formando imágenes de las partículas del rotavirus usando crio -EM para obtener una pluralidad de micrografías, y (vi) analizar la pluralidad de micrografías para obtener un modelo tridimensional de la proteína quimérica complejada con la molécula.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la molécula es (a) un anticuerpo o fragmento del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento se une específicamente a la proteína heteróloga; o (b) un receptor de superficie celular, en el que la proteína heteróloga es una proteína de entrada celular viral y la molécula proteica está unida por la proteína de entrada celular viral.