KR20220132454A - 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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KR20220132454A
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Abstract

본 발명은 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 약독화된 레오바이러스는 캡시드의 시그마 1 단백질에서 251-455번째 아미노산이 절단된 것으로서, 상기 절단된 시그마 1 단백질 부위에 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원 단백질의 에피토프를 도입할 경우, 항원 단백질의 에피토프가 세포 내에 안정적으로 발현하여, 중화 항체를 생성하거나 세포성 면역을 유도하는 등 면역 반응을 나타내는 효과를 가진다. 이에, 본 발명에 따른 약독화된 레오바이러스의 절단된 시그마 1 단백질 부위에 항원 단백질의 에피토프를 도입함으로써 암 또는 감염성 질환에 대한 백신 조성물로 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물 및 이의 용도 {Vaccine composition based on attenuated reovirus and Use thereof}
본 발명은 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
바이러스는 유전 물질과 단백질로 이루어진 작은 비세포성 유기체로서, 상이한 유형의 바이러스들이 존재한다. 예를 들어 바이러스는 숙주의 핵 내에서 복제하는 DNA 바이러스, 또는 세포의 세포질 내에서 복제하는 RNA 바이러스일 수 있다. 바이러스는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 더욱이 단일 가닥 RNA 바이러스는 양성(+, 센스) 가닥 또는 음성(-) 가닥일 수 있다. 이와 같은 상이한 유형의 바이러스는 다양한 바이러스성 감염을 유발한다.
바이러스 감염은, 병원성 바이러스가 유기체의 체내에 침투하여 들어갈 때 발생한다. 일단 바이러스가 유기체의 체내에 들어가면, 바이러스는 자신을 세포에 부착시키고, 세포가 파열(cell burst) 또는 사멸할 때까지 세포가 새로운 바이러스를 복제하도록 세포를 재프로그래밍(reprogramming)하여, 인간과 동물에서 바이러스가 다양한 감염성 질환을 유발시키며 급속하게 퍼져나갈 수 있게 한다. 바이러스에 의해 유발되는 감염성 질환은 보통 감기, 독감 및 사마귀(warts)를 포함한다. 그러나, 바이러스는 또한 AIDS, 코로나 바이러스 감염증-19(COVID-19), C형 간염, 결핵, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 및 중동 호흡기 증후군(MERS), 중증 천연두(small pox), 포진(herpes), 출혈열(hemorrhagic fever), 소아마비(polio), 홍역(measles), 유행성이하선염(mumps), 풍진(rubella), 영유아장염(rotavirus), 비세균성 급성위장염(norovirus)과 같은 중증 질환을 일으키기도 한다.
오늘날 바이러스 감염에 대항하고 그 확산을 제한하기 위한 가장 중요한 보호 조치는 예방 접종이다. 현대의 백신은 원칙적으로 표면 바이러스 항원에 대한 항체 형성을 유도한다. 백신 효과는 백신에 함유된 바이러스의 항원 구조와 개체군에서 순환하는 균주 사이의 일치 정도에 직접적으로 의존적이다. 대다수 바이러스의 표면 단백질은 일정한 항원 변이(antigenic variation)(항원 소변이(drift))를 겪으며, 백신 균주 조성의 지속적인 갱신이 필요하다. 광범위한 작용의 면역 반응을 유도하는 고도의 면역원성 및 안전한 백신의 개발은 현재 효율적인 암 또는 감염성 질환 예방에서 부딪히는 주요한 문제 중 하나이다. 최근 확산한 SARS-CoV-2에 의한 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 등과 같은 전 세계적인 유행성 질병의 확산과 지속적인 감염을 막기 위해서는 백신의 개발이 필요한 실정이다. 이에, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 홍역 바이러스(MeV), 아데노바이러스(Ad), 배큘로바이러스 등과 같은 플랫폼을 사용하여 현재 전 세계적으로 많은 바이러스 기반 백신이 개발되고 있다.
레오바이러스(Respiratory Enteric Orphan Virus; Reovirus)는 전체 게놈이 10 개의 이중-가닥 RNA 단편으로 구성되는 비-외피 바이러스로, 일반적인 환경에 편재하며(ubiquitous), 정상적인 면역 기능을 가지는 숙주에서 증상을 보이지 않는 무증후성 바이러스이다. 사람에게 감염성이 약하여 감염 부위는 상부 호흡기 및 위장관에 국한되는 것으로 알려져 있다.
한편, 역유전학 기술은 바이러스의 전체 유전체 서열을 확인하여 재조합된 인공바이러스를 만들어내는 것으로, 최대 장점은 인공적으로 바이러스를 재조합 발현, 조작하여, 합성하기 때문에 바이러스 유전자에 의도하는 여러 조작을 가해줄 수 있다는 점이다. 키메라 바이러스(Chimeric virus), 코돈 최적화(codon pair deoptimization), 돌연변이(Mutagenesis) 등 여러 기전을 바이러스의 유전자에 탑재하여 조작된 새로운 바이러스를 만들어 낼 수 있다. 고전적인 유전학 접근법은 주로 주어진 생명체의 유전체에 대해 무작위적으로 변이를 유도한 후 관심대상 형질을 나타내는 돌연변이에서 유전자를 발굴하는 방법으로, 시간과 노력을 많이 소모하고 변이에 의한 형질변이 효과가 강하지 않은 유전자들의 변이는 분리하기가 쉽지 않은 단점을 가졌다. 최근 기능 유전체 발달로 효모를 비롯한 몇몇 모델 생물체에서 유전체 수준의 상기 돌연변이가 가용하게 되었다. 반면 역유전학 기술은 여러 기전 중 상기 돌연변이를 이용해 각 유전자의 변이가 일으킬 수 있는 가능한 형질변이를 직접적으로 도입하여 탐색함으로써 유전학적 탐색의 식별능을 증가시킬 수 있다. 상기 역유전학 기술은 인공적으로 원하는 대로 바이러스를 조작할 수 있고, 그 특성을 극대화할 수 있는 장점이 있어 백신 개발에 있어서 매우 유용한 기술이다.
이에, 본 발명자들은 역유전학 기술을 이용하여, 특정 아미노산 서열 위치가 절단되어 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질에 암 또는 감염성 질환에 대한 에피토프가 융합하여 발현되도록 에피토프 염기 서열을 삽입하는 “빠른 교환” 방법을 통해, 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 플랫폼을 개발하고자 하였다.
한국공개특허공보 제10-2019-0092468호
본 발명자들은 251-455번째 아미노산이 절단되어 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질에서, 절단된 아미노산 위치에 암 또는 감염성 질환에 대한 여러 가지 에피토프의 아미노산 서열을 치환 또는 삽입하는 방법으로 도입하여 이의 발현을 확인한 결과, 도입한 에피토프가 세포 내에 안정적으로 발현하여, 중화 항체를 생성하거나 세포성 면역을 유도하는 등 면역 반응을 나타내는 것을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 아미노산 서열; 및 암 또는 감염성 질환을 유발하는 에피토프(epitope)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 약독화된 레오바이러스 기반의 바이러스 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 바이러스 벡터를 유효성으로 포함하는, 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 아미노산 서열; 및 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프(epitope) 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 있어서,
N-말단에서 251번째 아미노산 위치가 절단되어 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 1 내지 250번째 아미노산 서열; 및
상기 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 아미노산 서열의 N-말단에서 251번째를 포함한 이후의 아미노산 위치에 삽입되어 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 약독화된 레오바이러스 기반의 바이러스 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 바이러스 벡터를 유효성으로 포함하는, 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다:
a) 서열번호 1로 표시되는 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질을 암호화하는 염기 서열을 포함하도록 역진화 바이러스 벡터를 제조하는 단계; 및
b) 상기 시그마 1 단백질을 암호화하는 염기 서열의 763 내지 1416번째 염기 서열 위치에 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프(epitope)를 암호화하는 염기 서열이 포함되도록 염기를 치환 또는 삽입하여, 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질과 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프가 융합하여 발현되도록 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 상기 벡터에 도입하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 에피토프는 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 카르복시 말단에서 융합 단백질을 형성하거나 구성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 에피토프의 아미노산 서열 전후로 링커(linker)(서열번호 11), Myc 단백질(서열번호 12), FLAG 단백질(서열번호 13), 및 2A 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 암은 간암, 신경교종, 육종, 대장암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 폐암, 두경부암, 난소암, 방광암, 위암, 식도암, 담관암, 췌장암, 자궁경부암, 피부암, 림프종, 갑상선암, 골수암, 자궁내막암, 신장암, 직장암, 및 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 감염성 질환은 코로나 바이러스 감염증-19(COVID-19), C형 간염, 인플루엔자, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 유도 에이즈(AIDS), 결핵, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 중동 호흡기 증후군(MERS), 로타바이러스(rotavirus)에 의한 영유아장염, 및 노로바이러스(norovirus)에 의한 비세균성 급성위장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 에피토프의 아미노산 서열은 서열번호 3 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 에피토프를 암호화하는 염기 서열은 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질을 암호화하는 염기 서열의 5' 말단에서 763 내지 1416번째 염기 서열 위치에 치환 또는 삽입되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 에피토프는 숙주에서 중화 항체를 생성하거나 세포성 면역을 유도하여 면역 반응을 일으키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 에피토프는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 B-세포 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 백신 조성물은 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 백신 조성물의 제조 방법에 있어서, c) 상기 b) 단계의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약독화된 레오바이러스 기반의 벡터를 BHK21, L929, HEK293, CHO, PER.C6, HeLa, 및 Vero 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포에서 생산 및 증식시키는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물의 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 바이러스 벡터의 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 약독화된 레오바이러스는 캡시드의 시그마 1 단백질에서 251-455번째 아미노산이 절단된 것으로서, 상기 절단된 시그마 1 단백질 부위에 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원 단백질의 에피토프를 도입할 경우, 항원 단백질의 에피토프가 세포 내에 안정적으로 발현하여, 중화 항체를 생성하거나 세포성 면역을 유도하는 등 면역 반응을 나타내는 효과를 가진다. 이에, 본 발명에 따른 약독화된 레오바이러스의 절단된 시그마 1 단백질 부위에 항원 단백질의 에피토프를 도입함으로써 암 또는 감염성 질환에 대한 백신 조성물로 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 야생형 레오바이러스 및 약독화된 레오바이러스 RP116의 구조를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명의 일 구현예에 따른 약독화된 레오바이러스 RP116의 시그마 1 단백질의 절단된 부위에 여러 가지 병원체 유래 항원의 에피토프를 추가하여 레오바이러스 백신 플랫폼을 생성할 수 있음을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 1c는 본 발명의 일 구현예에 따른 약독화된 레오바이러스를 이용하여 제조한 백신의 투여 경로 및 작용을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 빠른 교환(quick exchange) 레오바이러스 역유전학(reverse genetics) 시스템 및 레오바이러스 증식 과정을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따른 L929세포에 야생형 레오바이러스(WT ReoV), 절단된 σ1을 가진 약독화된 레오바이러스 RP116(ReoV+Q251*) 및 RBD를 도입한 레오바이러스(ReoV+RBD)를 각각 감염시킨 후 항-레오바이러스 항체에 의한 단백질 검출 결과를 확인한 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 L929세포에 ReoV+RBD를 감염시켜 추출한 유전 물질에서 RBD 유전자가 검출되는 것을 확인한 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일 구현예에 따른 L929세포에 ReoV+RBD를 감염시켜 얻은 세포 용해물에서 SARS-CoV-2 중화 항체(NeuAb)(상단) 및 항-레오바이러스 항체(하단)에 의한 레오바이러스 단백질과 RBD의 발현을 확인한 도면이다.
도 4a는 본 발명의 일 구현예에 따른 약독화된 레오바이러스의 재조합 σ1 단백질 구성 설계의 개략도를 나타낸 도면이다.
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 약독화된 레오바이러스에서 다양한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 에피토프를 σ1 단백질과 융합하여 발현하도록 조작하여, 재조합 레오바이러스에서 도입한 여러 가지 항원이 발현됨을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 도면이다.
도 4c는 도 4b에서 사용한 재조합 레오바이러스에서 도입한 항원이 발현됨을 RT-qPCR 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 4d는 본 발명의 일 구현예에 따른 약독화된 레오바이러스에서 다양한 B-세포 에피토프를 σ1 단백질과 융합하여 발현하도록 조작하여, 재조합 레오바이러스에서 도입한 여러 가지 항원이 발현됨을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 도면이다.
도 4e는 도 4d에서 사용한 재조합 레오바이러스에서 도입한 항원이 발현됨을 RT-qPCR 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 ReoV+OVA257-264에서 에피토프 발현을 면역세포화학 분석법으로 확인한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 ReoV-S21P2(2)에서 SARS-CoV-2의 선형 B 세포 에피토프 발현을 확인한 도면이다.
도 7a는 본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 레오바이러스 ReoV+S21P2(1) 및 ReoV+OVA257-264의 재조합 σ1 단백질 구성 설계의 개략도를 나타낸 도면이다.
도 7b는 본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 레오바이러스에서 레오바이러스 특이적 항체(상단)와 FLAG 태그에 대한 특이적 항체(하단)로 항원을 검출함으로써 도입한 에피토프의 안정성을 확인한 도면이다.
본 발명의 일 실시예에서는 뉴클레오티드 763CAA(아미노산 251Q-글루타민)에서 763TAA(STOP 코돈)로의 독특한 STOP 돌연변이가 있는 약독화된 레오바이러스 RP116를 사용하여, RP116의 절단된 시그마 1 단백질에 에피토프 아미노산 서열을 추가하고, 빠른 교환(quick exchange) 레오바이러스 역유전학(reverse genetics) 시스템을 통해 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 플랫폼을 구축하였다(실시예 1 및 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 레오바이러스 백신 플랫폼에 대한 개념 증명으로, 레오바이러스의 시그마 1 단백질과 융합 단백질 형태로 코돈 최적화된 SARS-CoV-2(중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2) 수용체 결합 도메인(RBD) 서열을 발현하는 ReoV-RBD를 제조하였으며, 이는 SARS-CoV-2 중화 항체에 의해 검출이 가능함을 확인하여, RBD를 발현하는 ReoV가 백신 후보에 이상적인 중화 항체를 생성함을 알 수 있었다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 빠른 교환 기술을 사용하여 다양한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 에피토프들이 약독화된 레오바이러스의 시그마 1 단백질과 융합하여 발현하도록 조작하였으며, 상기 에피토프들이 실제로 발현되는 것을 실험을 통해 확인하였고(실시예 4 내지 6 참조), 도입한 에피토프에 변이가 없이 안정적인 발현이 가능함을 확인하였다(실시예 7 참조).
이에, 본 발명은 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 아미노산 서열; 및 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프(epitope) 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 있어서,
N-말단에서 251번째 아미노산 위치가 절단되어 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 1 내지 250번째 아미노산 서열; 및
상기 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 아미노산 서열의 N-말단에서 251번째를 포함한 이후의 아미노산 위치에 삽입되어 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명에 있어서, “레오바이러스(respiratory enteric orphan virus, REO virus)”는 이중가닥의 RNA 단편을 게놈으로 갖는, 외피가 없는(non-enveloped) 20면체의 바이러스이다. 레오바이러스는 건강한 인간의 소화기 및 호흡기에서 흔하게 분리되며, 병원성이 없는 바이롬(virome)으로 여겨진다. 레오바이러스는 다양한 형질전환(transformed) 세포를 감염 및 사멸시킬 수 있는 종양용해성 바이러스 (oncolytic virus)로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, “약독화된 레오바이러스”는 야생형 레오바이러스의 캡시드에서 노출된 부착 단백질 시그마 1에서 251번째 아미노산인 글루타민(glutamine, Q)을 암호화하는 763CAA에서 763TAA(종결 코돈)으로 돌연변이가 일어나, 상기 시그마 1 단백질의 251번째 아미노산 이후가 절단되어, 구형 헤드 형태가 절단된 것을 특징으로 하는 레오바이러스 RP116일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “암”은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 당업계에 악성 종양으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 간암, 신경교종, 육종, 대장암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 폐암, 두경부암, 난소암, 방광암, 위암, 식도암, 담관암, 췌장암, 자궁경부암, 피부암, 림프종, 갑상선암, 골수암, 자궁내막암, 신장암, 직장암, 및 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, “감염”은 바이러스와 같은 병원성 미생물이 숙주가 되는 생물체의 체내에 침입하여 발육, 증식하는 것으로, 사람이나 동물, 식물의 조직, 체액, 표면에 정착하여 증식하는 것을 의미하며, 그 결과 숙주는 병리학적인 변화를 받아 질병이 발생할 수 있다.
본 발명에 있어서, “감염성 질환”이란 병원성 미생물이 사람이나 동물, 식물의 조직, 체액, 표면에 정착하여 증식함으로써 발생하는 질환을 의미하며, 감염 경로, 전염성 여부에 따라 여러 종류로 구분될 수 있다. 상기 감염은 바이러스성 감염, 진균 감염, 세균 감염, 원충 감염 및 기생충 감염을 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 감염성 질환은 C형 간염, 인플루엔자, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 유도 에이즈(AIDS), 결핵, 코로나 바이러스 감염증-19(COVID-19), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증, 로타바이러스(rotavirus)에 의한 영유아장염, 및 노로바이러스(norovirus)에 의한 비세균성 급성위장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 코로나 바이러스 감염증-19일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)”는 SARS-CoV-2가 일으키는 중증 호흡기 증후군이다. 2019년 12월에 중국에서 첫 사례가 보고되었고, 전 세계적으로 퍼져나가면서 유행병으로 자리잡았다. COVID-19의 증상은 다양하지만 발열, 기침, 두통, 피로, 호흡 곤란, 후각 및 미각 상실 등이 있다. 증상은 바이러스에 감염된지 1~14일 안에 나타난다. 특히 감염된 사람 중 3분의 1은 무증상 감염자로 눈에 띄는 증상이 나타나지 않는다. 환자로 분류될 만큼 눈에 띄는 81%의 사람들은 경증에서 중증의 증상이 발생하며, 14%의 사람들은 호흡 곤란, 저산소증 등 증상이 발생하며, 5%의 사람들은 호흡기 부전, 쇼크 등 심각한 증상이 발생한다. 고령자는 심각한 증상이 발생할 확률이 더 높으며, 일부 사람들은 회복 후 긴 시간동안 접한 COVID-19 때문에 장기 손상이 관찰되었다.
SARS-CoV-2는 30 kb의 뉴클레오티드를 가지며 4개의 중요한 구조 단백질을 가지고 있다; Nucleocapsid(N), Spike(S), Membrane(M), Envelope(E) 단백질. 그 중 S 단백질은 숙주 세포의 수용체(receptor)와 결합하는 것으로 중요한 부위이며, 세포 내로 viral nucleocaspid를 전달하며 복제(replication)가 이루어진다.
SARS-CoV-2를 combating하는 가장 간단하고 직접적인 방법은 인간 세포로 들어가는 바이러스를 중화시키는 것으로, SARS-CoV-2가 세포 내로 유입되어 복제가 일어나고 새로운 비리온(virion)이 분비되어 다른 세포를 감염시키는 메커니즘을 차단하는 것이다.
SARS-CoV-2는 인간 세포의 angiotensin converting enzyme 2(ACE2) 수용체와 결합하여 바이러스 복제가 가능한 것으로 알려졌다. 코로나 바이러스의 S 단백질 중 receptor-binding domain(RBD)는 숙주 세포의 ACE2 수용체와 결합하는 핵심 영역이며, SARS-CoV-2 감염에 대한 강력한 중화 항체를 유도하는 다중 형태 의존적 에피토프(multiple conformational-dependent epitopes)를 포함하고 있기 때문에 코로나바이러스 감염증-19의 치료 및 백신 개발에 핵심 표적이 될 수 있다(J. Immunol 2005;174:4908-4915).
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 약독화된 레오바이러스 기반의 바이러스 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 바이러스 벡터를 유효성으로 포함하는, 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “백신”이란 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 조성물을 의미한다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 살아있는 바이러스 또는 죽은 바이러스의 적절한 요소를 함유할 수 있고(서브유닛 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 바이러스 또는 이의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 제한되는 것은 아니지만 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 혼입에 의한 백신을 필요로 하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화) 제조된다.
백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 백신은 시그마 1 단백질이 절단되어 약독화된 레오바이러스를 기반으로 하여, 이의 절단된 부위에 여러 가지 암 또는 감염성 질환을 유발하는 에피토프가 융합된 형태로 발현되도록 제조될 수 있으며, 예컨대, 상기 약독화된 레오바이러스의 절단된 시그마 1 단백질 및 에피토프 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터의 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 백신은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피(transdermal) 패치에 함유시킬 수도 있다.
본 발명에 따른 백신은 필요에 따라, 약학적으로 허용되는 백신보호제, 면역강화제, 희석제, 흡수촉진제 등을 포함할 수 있다. 상기 백신보호제는, 예컨대, 락토오스 포스페이트 글루타메이트 젤라틴 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 백신이 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양(예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
상기 면역증강제(adjuvant)로 사용하는 물질에는 특별히 제한이 없으며, 예컨대 명반(Alum), MPL(monophosphoryl lipid A), 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도 후 신체에 의해 발생되는 보조 분자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 개체에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성인 것을 의미한다.
상기 백신은 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 예컨대, 경구 또는 근육 투여경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, “에피토프(epitope)”란 항원 결정기로서, 항체, B 세포, T 세포 등의 면역계가 항원을 식별하게 해주는 항원의 특정한 부분을 의미한다. B 세포(즉, 항체) 반응을 유도하기 위해서는, 항원이 “B 세포 에피토프”를 포함해야 하며, T 세포 반응을 유도하기 위해서는, 항원이 “T 세포 에피토프”를 포함해야 한다. 당 기술분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, B 세포 에피토프는 B 세포 수용체에 의해 인식되고 결합되는 항원의 일부이다. 지질, 다당류 및 단백질/펩티드는 B 세포 에피토프를 포함할 수 있으며, 이는 선택된 유기체에 도입될 때 도입된 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 B 세포가 생산하도록 한다.
본 발명에 있어서, 상기 에피토프는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 B-세포 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 RBD(서열번호 3), OVA257-264(서열번호 4), OVA323-339(서열번호 5), Adpgk(서열번호 6), Rpl18(서열번호 7), P15E(서열번호 8), S21P2(1)(서열번호 9), 및 S21P2(2)(서열번호 10)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 에피토프는 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 카르복시 말단에서 융합 단백질을 형성하거나 구성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 에피토프를 암호화하는 염기 서열은 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질을 암호화하는 염기 서열의 5' 말단에서 763 내지 1416번째 염기 서열 위치에 치환 또는 삽입되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 에피토프를 암호화하는 염기 서열은 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질을 암호화하는 서열번호 2의 염기 서열에서 5' 말단으로부터 763 내지 1416번째 염기 서열 위치 중에서 특정 위치의 염기 서열 대신 치환되는 것일 수 있고, 특정 위치의 염기 서열 사이에 삽입되는 것일 수도 있다. 이에 따라, 야생형 레오바이러스의 시그마 1 단백질의 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 251번째 아미노산 서열 이후가 절단되어, 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질에 있어서, 상기 251번째를 포함한 이후의 아미노산 위치에 삽입되어 융합되는 에피토프는 약 5개 내지 400개의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 약독화된 레오바이러스의 시그마 1 단백질에서 251번째를 포함한 이후의 아미노산 위치에 포함되는 에피토프의 아미노산 서열의 전후로 링커(linker)(서열번호 11), Myc 단백질(서열번호 12), FLAG 단백질(서열번호 13), 및 2A 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이들의 순서에는 제한이 없다. 상기 2A 펩타이드는 예컨대 P2A, T2A, E2A, 또는 F2A 등을 포함하는 2A 펩타이드 중 선택될 수 있으며, 이의 종류에 제한은 없다.
본 발명에 있어서, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 B-세포 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프는 T 세포 또는 B 세포가 항원을 식별하게 하여, 숙주에서 중화 항체를 생성하거나 세포성 면역을 유도함으로써 면역 반응을 일으키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “항체”란 항원에 특이적으로 결합하여 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편에서 유래하는 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 영역 유전자를 비롯하여, 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류되었다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 결과적으로 각각 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다. 전형적으로, 항체의 항원-결합 영역은 결합 특이성 및 친화성에서 가장 핵심적이게 된다. 항체는 체액성 면역의 주역이고, 감작 림프구와 함께 생체 방어 기구의 중요한 역할을 담당하고 있으며, 항원 단백질을 면역원으로서 동물에게 투여하여 체액성 면역 반응을 유도시킴으로써 제조된다. 항체 또는 항체의 단편은 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 낙타, 토끼 등을 포함한, 상이한 개체에서 유래될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “중화 항체(neutralizing antibody)”란 병원체에 결합하여 세포를 감염시키거나 질환을 야기하는 병원체의 능력을 방해하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 의미한다.
본 발명에 있어서, “세포성 면역”이란 한 림프계 세포가 어떤 항원에 직접적으로 면역반응을 일으키는 면역 활동을 말한다. 백혈구 세포가 한 항원에 작용하여 그 세포를 먹는 대식작용을 하거나, 독성 세포 반응을 일으켜 항원을 제거하는 면역 활동을 말한다. 체내에서 혈청 항체에 의해 행해지는 체액성 면역과 함께 면역계를 구성하고 있으며, 대표적으로 세포 독성을 가지는 T 세포의 작용을 들 수 있다. T 세포는 B 세포와 결합하여 항체를 구성한 후 직접적으로 항원과 접촉해 항원을 파괴시킨다.
본 발명에 있어서, “항원”이란 숙주에서 면역 반응을 생성하는 능력을 갖는 단백질을 나타낸다. 항원은 항체에 의해 인식되고 이에 결합될 수 있다. 항원은 체내에서 또는 외부 환경에서 유래될 수 있으며, 재조합된 형태의 단백질도 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 백신 조성물은 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프에 대한 항체의 생산을 유도할 수 있으며, 이 때 상기 에피토프는 항원으로 작용한다. 상기 백신 조성물을 1회 투여할 때에 비해 2회 또는 3회 반복 투여할 경우 항체 생산이 더 증가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다:
a) 서열번호 1로 표시되는 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질을 암호화하는 염기 서열을 포함하도록 역진화 바이러스 벡터를 제조하는 단계; 및
b) 상기 시그마 1 단백질을 암호화하는 염기 서열의 763 내지 1416번째 염기 서열 위치에 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프(epitope)를 암호화하는 염기 서열이 포함되도록 염기를 치환 또는 삽입하여, 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질과 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프가 융합하여 발현되도록 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 상기 벡터에 도입하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 역진화 바이러스 벡터는 숙주 세포에서 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질을 암호화하는 S1 세그먼트 RNA를 생산할 수 있도록 제조된 바이러스 벡터를 의미할 수 있고, 당업계에 공지된 방법을 통해 제조될 수 있다. T7 RNA 중합효소 프로모터로부터 바이러스 RNA 세그먼트(segment)가 전사될 수 있도록 벡터를 구성하며, 3’ 말단은 벡터에 있는 리보자임(ribozyme)에 의해 자연히 형성되어 벡터를 도입한 T7 중합효소 발현세포에서 바이러스 RNA가 생산되고 이를 이용하여 바이러스 단백질이 합성되게 되어 역진화 시스템(reverse genetics sytem)이라고 명명하고 있다. 이는 RNA 바이러스의 변이주를 디자인하여 만들어내는 유용한 방법이다.
본 발명의 백신 조성물의 제조 방법에 있어서, c) 상기 b) 단계의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약독화된 레오바이러스 기반의 벡터를 BHK21, L929, HEK293, CHO, PER.C6, HeLa, 및 Vero 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포에서 생산 및 증식시키는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물의 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 바이러스 벡터의 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 백신의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 백신 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “투여”는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 백신 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “개체”란 암 또는 감염성 질환의 예방을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에 있어서, “포함하는” 이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 약독화된 레오바이러스 기반 백신 플랫폼 구축
레오바이러스(Reovirus)는 이중 가닥의 RNA 비-외피 바이러스이다. REO는 Respiratory Enteric Orphan의 약자로, 인간의 호흡기 및 장을 위해 분리되었지만, 알려진 인간 질병과 관련이 없다. 야생형 레오바이러스 감염으로 인해 발생하는 대부분의 중화 항체 및 면역 반응은 바이러스의 시그마 1(sigma 1, σ1) 단백질, 보다 구체적으로 캡시드에서 튀어나온 단백질의 구형 헤드에 대한 것이다. 따라서, 레오바이러스에 대한 σ1의 이 영역은 항원성을 높이는 핵심 부분을 나타낸다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 야생형(WT) 레오바이러스는 접합부 접착 분자-A(JAM-A)를 인식하고 이에 결합하여 진입하는 외부 캡시드에 부착 단백질 σ1을 표시한다(도 1a의 좌측 도면).
야생형 레오바이러스 σ1 단백질의 아미노산 서열 및 염기 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
서열 서열번호
RP116 sigma-1 protein MDPRLREEVVRLIIALTSDNGVSLSKGLESRVSALEKTSQIHSDTILRITQGLDDANKRIIALEQSRDDLVASVSDAQLAISRLESSIGALQTVVNGLDSSVTQLGARVGQLETGLAELRVDHDNLVARVDTAERNIGSLTTELSTLTLRVTSIQADFESRISTLERTAVTSAGAPLSIRNNRMTMGLNDGLXLSGNNLAIRLPGNTGLNIQNGGLQFRFNTDQFQIVNNNLTLKTTVFDSINSRXGAXE 1
RP116 sigma-1 gene GCTATTGGTCGGATGGATCCTCGCCTACGTGAAGAAGTAGTACGGCTGATAATCGCATTAACGAGTGATAATGGAGTATCACTGTCAAAAGGGCTTGAATCAAGGGTCTCGGCGCTCGAGAAGACGTCTCAAATACACTCTGATACTATCCTCCGGATCACCCAGGGACTCGATGATGCAAACAAACGAATCATCGCTCTTGAGCAAAGTCGGGATGACTTGGTTGCATCAGTCAGTGATGCTCAACTTGCAATCTCCAGATTGGAAAGCTCTATCGGAGCCCTCCAAACAGTTGTCAATGGACTTGATTCGAGTGTTACCCAGTTGGGTGCTCGAGTGGGACAACTTGAGACAGGACTTGCAGAGCTACGCGTTGATCACGACAATCTCGTTGCGAGAGTGGATACTGCAGAACGTAACATTGGATCATTGACCACTGAGCTATCAACTCTGACGTTACGAGTAACATCCATACAAGCGGATTTCGAATCTAGGATATCCACATTAGAGCGCACGGCGGTCACTAGCGCGGGAGCTCCCCTCTCAATCCGTAATAACCGTATGACCATGGGATTAAATGATGGACTCAYGTTGTCAGGGAATAATCTCGCCATCCGATTGCCAGGAAATACGGGTCTGAATATTCAAAATGGTGGACTTCAGTTTCGATTTAATACTGATCAATTCCAGATAGTTAATAATAACTTGACTCTCAAGACGACTGTGTTTGATTCTATCAACTCAAGGABAGGCGCAAYTGAGTAAAGTKMCGTGGCGTCGGCAGTGACTCCCTTGAGATTAAACAGTAGCACGAAGGTGCTGGATATGCTAATAGACAGTTCAACACTTGAAATTAATTCTAGTGGACAGCTAACTGTTAGATCGACATCCCCGAATTTGAGGTATCCGATAGCTGATGTTAGCGGCGGTATCGGAATGAGTCCAAATTATAGGTTTAGGCAGAGCATGTGGATAGGAATTGTCTCCTATTCTGGTAGTGGGCTGAATTGGAGGGTACAGGTGAACTCCGACATTTTTATTGTAGATGATTACATACATATATGTCTTCCAGCTTTTGACGGTTTCTCTATAGCTGACGGTGGAGATCTATCGTTGAACTTTGTTACCGGATTGTTACCACCGTTACTTACAGGAGACACTGAGCCCGCTTTTCATAATGACGTGGTCACATATGGAGCACAGACTGTAGCTATAGGGTTGTCGTCGGGTGGTGCGCCTCAGTATATGAGTAAGAATCTGTGGGTGGAGCAGTGGCAGGATGGAGTACTTCGGTTACGTGTTGAGGGGGGTGGCTCAATTACGCACTCAAACAGTAAGTGGCCTGCCATGACCGTTTCGTACCCGCGTAGTTTCACGTGAGGATCAGACCACCCCGCGGCACTGGGGCATTTCATC 2
약독화된 레오바이러스 RP116은 뉴클레오티드 763CAA(아미노산 251Q-글루타민)에서 763TAA(STOP 코돈)로의 독특한 STOP 돌연변이가 있는 레오바이러스로서, WT 레오바이러스 σ1과 비교하여 "헤드가 절단된" σ1 단백질을 생성한다(도 1a의 우측 도면).
도 1b에 나타낸 바와 같이, RP116의 이러한 σ1 단백질은 구형 헤드가 레오바이러스 복제에 필수적이지 않으며 이 부위에서 다양한 병원체 유래의 다른 항원 단편과 교환될 수 있음을 보여준다. 혁신적이고 안전한 레오바이러스 백신 플랫폼의 생성을 위해 RP116 σ1 단백질의 이러한 부위에 에피토프 단편의 약 5개 내지 400개의 아미노산을 추가할 수 있다.
또한, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 외피가 없는 레오바이러스는 가혹한 환경 조건에 대한 회복력이 있어 다양한 용액 또는 식품 공급원과 함께 투여할 수 있다. 경구 진입 시, 레오바이러스는 소장의 M 세포를 우선적으로 감염시키고, σ1에 표시된 다양한 병원체 에피토프에 대한 면역 반응을 유도한다.
실시예 2. 빠른 교환(quick exchange) 레오바이러스 역유전학(reverse genetics) 시스템 구축
레오바이러스에 대한 역유전학 시스템은 10개의 바이러스 유전자 절편 및 T7 발현 세포주로 형질감염되어 복제 가능한 레오바이러스 입자를 생성하였으며(Kobayshi et al., 2007, Cell Host Microbe. 2007 Apr 19;1(2):147-57.), 이후 10개의 바이러스 유전자 절편을 포함하는 4개의 플라스미드만 T7 발현 세포주에 형질감염될 필요가 있는 역유전학 시스템의 개선된 버전이 보고되었다(Kobayashi et al., 2010, Virology. 2010 Mar 15; 398(2): 194-200.). 본 발명에서는 약독화된 레오바이러스 RP116 유전자를 사용하여 새로운 역유전학 시스템을 구축함으로써 백신의 설계 및 테스트를 위한 신속한 "빠른 교환(quick exchange)" 접근 방식을 구현하였다. 본 발명에서 상기 시스템을 도입하여 레오바이러스 RP116 기반의 백신을 설계하기 위해 사용한 벡터는 다음과 같다(도 2의 상단 도면 참조): pS1Att또는 pS1XX, pL1, pSet2, pSet3, pSet4.
T7 RNA 중합효소를 발현하도록 형질 전환한 BHK21 세포에 상기 벡터를 도입 시키면 바이러스 유전자가 전사되어 궁극적으로 24~72시간 내에 복제 가능한 바이러스 입자의 생성을 유도한다. pS1XX는pS1Att, 즉 RP116의 S1 유전자의 아미노산 위치 251에서 STOP 코돈 돌연변이로부터 C-말단으로의 서열을 재설계함으로써 비-레오바이러스 에피토프를 도입하여 제조하였다. STOP 코돈과 763번째 뉴클레오티드 이후 서열을 재설계하여 항원 또는 에피토프 단편을 RP116 σ1 단백질 서열에 "융합"할 수 있다. 특정 제한효소 인식부위는 아미노산 위치 251 및 C-말단 사이에도 설계되어 σ1 펩타이드의 이 부분을 쉽게 교환할 수 있었다.
생성된 복제 가능한 입자는 감염 전에 키모트립신(chymotrypsin) 50 μg/mL 처리를 통해 외부 캡시드를 분해함으로써 생산용 세포주 BHK21, L929, Vero 세포에 부착 및 진입을 더욱 용이하게 하였다.
이러한 빠른 교환(quick exchange) 레오바이러스 역유전학(reverse genetics) 시스템 및 레오바이러스 증식 과정을 도식화하여 도 2에 나타내었다.
또한, 본 발명에서 사용한 에피토프의 아미노산 서열, construct 아미노산 서열, 및 코돈 최적화된 construct DNA 서열을 하기 표 2에 나타내었다.
Epitope Name Amino Acid Sequence Construct Amino Acid Sequence Codon Optimized Construct DNA Sequence (5'-3')
RBD NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV
(서열번호 3)		 NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV
(서열번호 3)		 aatatcactaacttgtgtccgttcggcgaggtttttaatgcgaccaggtttgcttccgtgtacgcctggaacaggaaacggatctccaattgtgtcgccgattactccgtcttgtataattcagcatctttcagcacgtttaaatgttacggagtttcccccacaaaattgaatgacctttgctttacgaacgtctacgcggattcatttgtaatccggggggacgaagttaggcaaattgcgccagggcagactggcaagatagctgactataattataaattgccggatgactttacgggctgtgtgattgcttggaactcaaataatctggactcaaaggtagggggaaattataactacctttacaggctgttccggaagagtaatctgaagccattcgaaagagatataagtacagagatctaccaagctggaagcaccccctgcaatggtgttgaaggattcaattgttatttcccattgcaatcctatggttttcaaccgacgaatggggtgggataccaaccatatcgagttgtggttctcagtttcgagttgcttcatgctcctgcgacagtatgtggaccaaaaaaatctactaatctggtgaagaataaatgcgtcaatttttaa
(서열번호 21)
OVA 257-264 SIINFEKL
(서열번호 4)		 GGGGSGGGGSEQKLISEEDLSIINFEKLGGGGSSIINFEKLGGGGSSIINFEKLDYKDDDDK
(서열번호 14)		 ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgAGTATTATAAACTTCGAGAAGCTGGGTGGGGGAGGAAGTTCAATCATTAATTTTGAAAAACTTGGAGGAGGTGGATCTTCCATAATTAATTTTGAAAAGCTGgattataaggatgacgacgataagtga
(서열번호 22)
OVA 323-339 ISQAVHAAHAEINEAGR
(서열번호 5)		 GGGGSGGGGSEQKLISEEDLISQAVHAAHAEINEAGRDYKDDDDK
(서열번호 15)		 ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgatttcacaggctgtgcatgctgcacatgctgaaattaatgaggctggacgtgattataaggatgacgacgataagtga
(서열번호 23)
Adpgk ASMTNMELM
(서열번호 6)		 GGGGSGGGGSEQKLISEEDLASMTNMELMGGGGSASMTNMELMGGGGSASMTNMELMDYKDDDDK
(서열번호 16)		 ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctggctagcatgacgaacatggagctaatgggagggggcggaagtgcttctatgactaatatggaactgatgggaggtggaggttctgcttcaatgaccaacatggaacttatggattataaggatgacgacgataagtga
(서열번호 24)
Rpl18 KILTFDRL(서열번호 7) GGGGSGGGGSEQKLISEEDLKILTFDRLGGGGSKILTFDRLGGGGSKILTFDRLDYKDDDDK
(서열번호 17)		 ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgaagattctgacgtttgatcgtctggggggtggcggatctaagatattgacgttcgatcgactgggaggaggtggctctaagatcctaacattcgaccgtctagattataaggatgacgacgataagtga
(서열번호 25)
P15E KSPWFTTL(서열번호 8) GGGGSGGGGSEQKLISEEDLKSPWFTTLGGGGSKSPWFTTLGGGGSKSPWFTTLDYKDDDDK
(서열번호 18)		 ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgAAGTCACCTTGGTTTACTACTCTCGGTGGGGGAGGAAGTAAATCGCCATGGTTTACTACATTGGGAGGAGGTGGGTCTAAGTCACCATGGTTCACGACATTGgattataaggatgacgacgataagtga
(서열번호 26)
S21P2(1) PSKPSKRSFIEDLLFNKV
(서열번호 9)		 GGGGSGGGGSEQKLISEEDLPSKPSKRSFIEDLLFNKVDYKDDDDK
(서열번호 19)		 ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgCCTAGTAAGCCTTCTAAGCGCAGCTTCATAGAAGATTTGTTGTTCAATAAGGTAgattataaggatgacgacgataagtga
(서열번호 27)
S21P2(2) PSKPSKRSFIEDLLFNKV
(서열번호 10)		 GGGGSGGGGSEQKLISEEDLPSKPSKRSFIEDLLFNKVGGGGSPSKPSKRSFIEDLLFNKVDYKDDDDK
(서열번호 20)		 ggaggtggaggctcaggtggcggaggttctgagcagaagttgatttcagaggaagatctgCCTAGTAAGCCTTCTAAGCGCAGCTTCATAGAAGATTTGTTGTTCAATAAGGTAGGTGGGGGAGGAAGTCCATCGAAGCCAAGTAAGCGTAGTTTCATTGAGGACCTCCTCTTCAACAAGGTTgattataaggatgacgacgataagtga
(서열번호 28)
실시예 3. ReoV-RBD의 제조
레오바이러스 백신 플랫폼에 대한 개념 증명으로, 레오바이러스의 σ1 단백질과 융합단백질 형태로 코돈 최적화된 SARS-CoV-2(중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2) 수용체 결합 도메인(RBD) 서열을 발현하도록 약독화된 레오바이러스 S1 유전자의 위치 251 코돈 이후에 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD) 염기 서열을 도입하여 제조한 재조합 레오바이러스 ReoV+RBD(ReoV-RBD), WT σ1(WT ReoV) 및 절단된 σ1(ReoV+Q251*)을 가진 레오바이러스는 BHK21 세포에서 생성되어 L929에서 증식되었다. 이 과정에서 σ1에서 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD)을 발현하는 재조합 레오바이러스는 SARS-CoV-2 중화 항체에 의해 검출이 가능하다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, L929세포에 야생형 레오바이러스(WT ReoV), 절단된 σ1을 가진 레오바이러스(ReoV+Q251*) 및 RBD 항원기를 도입한 레오바이러스(ReoV+RBD)를 각각 감염시켜 96시간 후 세포 용해물에서 항-레오바이러스 항체에 의해 각각의 레오바이러스 단백질이 검출되는 것을 웨스턴 블롯 결과를 통해 확인하였다.
각각의 재조합 레오바이러스를 L929세포에 감염시켜 추출한 유전 물질에서 RBD 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 재조합된 레오바이러스의 4회 계대 후 RT-qPCR 분석을 실시한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, ReoV+RBD를 감염시킨 경우 RBD 유전자가 검출되는 것을 확인하였다. RT-qPCR 분석에 사용한 프라미어 서열은 하기 표 3에 나타내었다.
Gene Primer 5' - 3' 서열번호
S1
도3b, 4c, 4e		 S1 fwd CACCCAGGGACTCGATGATG 29
S1 rev GCACCCAACTGGGTAACACT 30
RBD
도 3b		 RBD fwd CAACTGAGCAAAGTTACGTGAGGGTACAACCTACGGAATC 31
RBD rev ATGAAATGCCCCAGTGCCGCGGGGTGGTCTGACCTCAAAAATTGACGCATTTATTCTTCAC 32
Epitope
도 4c, 4e		 S1-250-AvrII-F GATTCTATCAACTCAAGGATAGGCGCAATTGAGCCTAGG 33
pBacT7-SacII-R CAGTGCCGCGGGGTGGTCTGATCCTCACGTGAAACTACGCGGGTA 34
또한, L929세포에 감염시켜 얻은 세포 용해물에서 도트 블롯(dot blot)법을 실시한 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, SARS-CoV-2 중화 항체(NeuAb)(상단) 및 항-레오바이러스 항체(하단)에 의해 재조합된 RBD가 발현됨을 확인하였다. 양성 대조군 재조합 RBD는 Dr. John Bell 연구실에서 제조(Azad et al., Membranes (Basel). 2020 Aug 30;10(9):215)하였으며, SARS-CoV-2 NeuAb(40592-MM57)는 Sino Biological(Wayne, PA, 미국)에서 구매하여 사용하였다. 상기 결과는 RBD를 발현하는 ReoV가 백신 후보에 이상적인 중화 항체를 생성함을 나타낸다.
실시예 4. 레오바이러스 부착단백질 시그마 1(σ1)을 이용한 외래 항원 발현
특정 돌연변이 변화는 부위 지정 돌연변이 유발 또는 복제에 의해 도입되어 하나 또는 여러 레오바이러스 유전자 부분 내에서 정의된 돌연변이의 역할 또는 결과를 조사하여 레오바이러스가 변형되거나 돌연변이가 일어나도록 할 수 있다. 예로, 시그마 3 단백질을 인코딩하는 레오바이러스의 S4 유전자에 있는 특정 아미노산 돌연변이가 바이러스 벡터 내에 도입되어 바이러스 캡시드의 시그마 3 단백질에 특정 돌연변이를 가진 변형된 레오바이러스가 생성된다.
본 발명의 약독화된 레오바이러스 RP116의 주요 돌연변이는 σ1 단백질을 암호화하는 S1 유전자 내에서 763CAA(아미노산 251Q-글루타민)에서 763TAA(STOP 코돈)로의 STOP 돌연변이이며, 이 시스템 내에서 상기 돌연변이의 생성은 절단된 σ1 단백질을 가진 복제 가능한 RP116 레오바이러스를 생성한다.
유전자 단편의 특징에 따라 뉴클레오티드 763-1416 위치에 선택한 특정 에피토프 서열의 치환 또는 삽입이 가능하며, 본질적으로 σ1의 구형 헤드 구조를 대체하는 이 비-레오바이러스 서열의 치환 또는 삽입은 상기 비-레오바이러스 항원에 대한 면역 반응을 생성하는 신규 에피토프를 바이러스의 캡시드에 노출시킨다.
도 4a는 재조합 부착 단백질 구성 설계의 개략도를 나타낸 것으로서, σ1 단백질의 251번 위치 아미노산 ~ 455번 아미노산 사이의 잔기는 표지 목적의 Myc 및 FLAG 태그 등을 비롯하여 다양한 에피토프로 대체 가능하다.
레오바이러스는 "빠른 교환(Quick Exchange)" 기술을 사용하여 다양한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 에피토프를 σ1 단백질과 융합하여 발현하도록 조작하여, 도 4b에 나타낸 바와 같이 웨스턴 블롯으로 재조합 레오바이러스에서 도입한 여러 가지 항원이 발현됨을 확인하였으며, 도 4c에 나타낸 바와 같이 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 RT-qPCR 분석을 실시함으로써 상기 도 4b에서 사용한 재조합 레오바이러스에서 도입한 항원이 발현됨을 DNA 아가로스 겔로 분리하여 확인하였다.
또한, 레오바이러스는 빠른 교환 기술을 사용하여 다양한 B-세포 에피토프를 σ1 단백질과 융합하여 발현하도록 조작하여, 도 4d에 나타낸 바와 같이 웨스턴 블롯으로 재조합 레오바이러스에서 도입한 여러 가지 항원이 발현됨을 확인하였으며, 도 4e에 나타낸 바와 같이 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 RT-qPCR 분석을 실시함으로써 도 4d에서 사용한 재조합 레오바이러스에서 도입한 항원이 발현됨을 DNA 아가로스 겔로 분리하여 확인하였다.
이러한 실시예는 다양한 외래 항원의 에피토프를 발현하는 새로운 레오바이러스 백신 플랫폼의 다양한 유용성을 보여주며, 다양한 질병 에피토프를 도입하여 새로운 백신 개발에 있어 스크리닝 단계부터 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 5. ReoV-OVA를 감염시킨 세포에서 도입된 항원 발현 확인
도 4a에 나타낸 바와 같이 구성한 ReoV+오브알부민(OVA)257-264에서 OVA257-264 에피토프의 측면에 있는 Myc 및 FLAG 태그는 면역세포화학 분석법으로 검출할 수 있다.
이를 검출하기 위해, 커버슬립에서 자란 Vero 세포를 ReoV, ReoV+Q251*, 및 ReoV+OVA257-264로 48시간 동안 감염시켰다. 그런 다음, 세포를 3.7 % PFA에 고정하고 항-ReoV(1:1000, 토끼 혈청), 항-Myc(1:200), 및 항-FLAG(1:200)로 1시간 동안 반응시킨 후, 항-ReoV 항체에 대한 2차 항체인 토끼 Alexa Fluor 488 및 항-Myc 또는 항-FLAG 항체에 대한 2차 항체 Alexa Fluor 594와 함께 45분 동안 배양하였다. 염색한 커버슬립은 핵 카운터 염색용 DAPI가 있는 Fluoromount G로 마운팅하였으며, 이미지는 60X 오일 대물렌즈가 있는 올림푸스 공초점 현미경으로 촬영하였다(스케일 바 = 50 μm).
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 ReoV+OVA257-264로 감염된 경우 Myc 및 FLAG 태그에서 나타나는 형광(붉은색)은 레오바이러스 단백질에 대해 검출한 형광(녹색)과 겹치는 것을 확인하였다.
이는 재조합 레오바이러스가 감염된 세포에서 특이적으로 항원이 발현되는 것을 나타내며, 재조합 레오바이러스가 감염성이고, 포유동물 세포에서 조작된 네오에피토프(neoepitope)를 발현할 수 있음을 시사한다.
실시예 6. SARS-CoV-2 선형 B 세포 에피토프의 발현과 검출
BHK21 세포는 야생형(WT) 또는 조작된 ReoV(ReoV+p15E 및 SARS-CoV-2 선형 B 세포 에피토프를 발현하는 ReoV-S21P2(2))로 감염시켰다. 이전 연구에서 SARS-CoV-2 선형 B 세포 에피토프는 중화 항체를 생성하는 것으로 검증되었다(Poh et al., Nat Commun. 2020 Jun 1;11(1):2806).
SARS-CoV-2 선형 B 세포 에피토프의 발현을 확인하기 위해, 감염 48시간 후에 세포를 용해시켜 웨스턴 블롯에 사용하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 레오바이러스 단백질은 모든 감염된 샘플에서 검출될 수 있었으나, Myc 및 FLAG 태그는 모두 p15E 또는SARS-CoV-2 B 세포 에피토프로 조작된 ReoV에서만 검출되었다. 또한, SARS-CoV-2의 B 세포 에피토프 영역을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(Sino Biological 사)의 전체 S2 부분으로부터 생성된 항-S2 항체로 표지한 후에, ReoV+S21P2(2) 감염된 샘플에서만 명확하게 면역 반응성이 있는 단백질 밴드를 확인할 수 있었다(화살표로 표시).
이러한 결과는 SARS-CoV-2의 선형 B 세포 에피토프를 보유하는 재조합 레오바이러스가 에피토프에 대한 특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 시사한다.
실시예 7. 재조합 레오바이러스의 안정성 확인
도 7a에는 재조합 레오바이러스 ReoV+S21P2(1) 및 ReoV+OVA257-264의 재조합 σ1 단백질 구성 설계의 개략도를 나타내었다.
각각의 에피토프는 N-말단과 C-말단에서 각각 Myc와 FLAG 태그를 포함하도록 설계하여 도입한 에피토프가 안정적으로 발현하는지를 확인하는데 사용하였다.
BHK21 세포를 48시간 동안 재조합 레오바이러스로 감염시킨 후 웨스턴 블롯팅으로 분석하였으며, 재조합 레오바이러스에서 레오바이러스 특이적 항체(상단)와 FLAG 태그에 대한 특이적 항체(하단)로 모두 검출하였다. GAPDH 인식 항체(항-GAPDH)는 로딩 컨트롤로 사용되었다.
그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이 FLAG 태그로 고농도의 항원이 검출되는 것을 확인하였는 바, 검출되는 고농도 항원은 5번의 계대 후에도 도입한 에피토프에 변이가 없이 안정적인 발현이 가능함을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> Virocure Inc. <120> Vaccine composition based on attenuated reovirus and Use thereof <130> MP21-052P1 <150> KR 10-2021-0037160 <151> 2021-03-23 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RP116 sigma-1 protein <400> 1 Met Asp Pro Arg Leu Arg Glu Glu Val Val Arg Leu Ile Ile Ala Leu 1 5 10 15 Thr Ser Asp Asn Gly Val Ser Leu Ser Lys Gly Leu Glu Ser Arg Val 20 25 30 Ser Ala Leu Glu Lys Thr Ser Gln Ile His Ser Asp Thr Ile Leu Arg 35 40 45 Ile Thr Gln Gly Leu Asp Asp Ala Asn Lys Arg Ile Ile Ala Leu Glu 50 55 60 Gln Ser Arg Asp Asp Leu Val Ala Ser Val Ser Asp Ala Gln Leu Ala 65 70 75 80 Ile Ser Arg Leu Glu Ser Ser Ile Gly Ala Leu Gln Thr Val Val Asn 85 90 95 Gly Leu Asp Ser Ser Val Thr Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly Gln Leu 100 105 110 Glu Thr Gly Leu Ala Glu Leu Arg Val Asp His Asp Asn Leu Val Ala 115 120 125 Arg Val Asp Thr Ala Glu Arg Asn Ile Gly Ser Leu Thr Thr Glu Leu 130 135 140 Ser Thr Leu Thr Leu Arg Val Thr Ser Ile Gln Ala Asp Phe Glu Ser 145 150 155 160 Arg Ile Ser Thr Leu Glu Arg Thr Ala Val Thr Ser Ala Gly Ala Pro 165 170 175 Leu Ser Ile Arg Asn Asn Arg Met Thr Met Gly Leu Asn Asp Gly Leu 180 185 190 Xaa Leu Ser Gly Asn Asn Leu Ala Ile Arg Leu Pro Gly Asn Thr Gly 195 200 205 Leu Asn Ile Gln Asn Gly Gly Leu Gln Phe Arg Phe Asn Thr Asp Gln 210 215 220 Phe Gln Ile Val Asn Asn Asn Leu Thr Leu Lys Thr Thr Val Phe Asp 225 230 235 240 Ser Ile Asn Ser Arg Xaa Gly Ala Xaa Glu 245 250 <210> 2 <211> 1416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RP116 sigma-1 gene <400> 2 gctattggtc ggatggatcc tcgcctacgt gaagaagtag tacggctgat aatcgcatta 60 acgagtgata atggagtatc actgtcaaaa gggcttgaat caagggtctc ggcgctcgag 120 aagacgtctc aaatacactc tgatactatc ctccggatca cccagggact cgatgatgca 180 aacaaacgaa tcatcgctct tgagcaaagt cgggatgact tggttgcatc agtcagtgat 240 gctcaacttg caatctccag attggaaagc tctatcggag ccctccaaac agttgtcaat 300 ggacttgatt cgagtgttac ccagttgggt gctcgagtgg gacaacttga gacaggactt 360 gcagagctac gcgttgatca cgacaatctc gttgcgagag tggatactgc agaacgtaac 420 attggatcat tgaccactga gctatcaact ctgacgttac gagtaacatc catacaagcg 480 gatttcgaat ctaggatatc cacattagag cgcacggcgg tcactagcgc gggagctccc 540 ctctcaatcc gtaataaccg tatgaccatg ggattaaatg atggactcay gttgtcaggg 600 aataatctcg ccatccgatt gccaggaaat acgggtctga atattcaaaa tggtggactt 660 cagtttcgat ttaatactga tcaattccag atagttaata ataacttgac tctcaagacg 720 actgtgtttg attctatcaa ctcaaggaba ggcgcaaytg agtaaagtkm cgtggcgtcg 780 gcagtgactc ccttgagatt aaacagtagc acgaaggtgc tggatatgct aatagacagt 840 tcaacacttg aaattaattc tagtggacag ctaactgtta gatcgacatc cccgaatttg 900 aggtatccga tagctgatgt tagcggcggt atcggaatga gtccaaatta taggtttagg 960 cagagcatgt ggataggaat tgtctcctat tctggtagtg ggctgaattg gagggtacag 1020 gtgaactccg acatttttat tgtagatgat tacatacata tatgtcttcc agcttttgac 1080 ggtttctcta tagctgacgg tggagatcta tcgttgaact ttgttaccgg attgttacca 1140 ccgttactta caggagacac tgagcccgct tttcataatg acgtggtcac atatggagca 1200 cagactgtag ctatagggtt gtcgtcgggt ggtgcgcctc agtatatgag taagaatctg 1260 tgggtggagc agtggcagga tggagtactt cggttacgtg ttgagggggg tggctcaatt 1320 acgcactcaa acagtaagtg gcctgccatg accgtttcgt acccgcgtag tttcacgtga 1380 ggatcagacc accccgcggc actggggcat ttcatc 1416 <210> 3 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD Amino Acid Sequence <400> 3 Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA257-264 Amino Acid Sequence <400> 4 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA323-339 Amino Acid Sequence <400> 5 Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Adpgk Amino Acid Sequence <400> 6 Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rpl18 Amino Acid Sequence <400> 7 Lys Ile Leu Thr Phe Asp Arg Leu 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P15E Amino Acid Sequence <400> 8 Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu 1 5 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S21P2(1) Amino Acid Sequence <400> 9 Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn 1 5 10 15 Lys Val <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S21P2(2) Amino Acid Sequence <400> 10 Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn 1 5 10 15 Lys Val <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc tag <400> 12 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG tag <400> 13 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 14 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA257-264 Construct Amino Acid Sequence <400> 14 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Asp Leu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile 35 40 45 Ile Asn Phe Glu Lys Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 50 55 60 <210> 15 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA323-339 Construct Amino Acid Sequence <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Asp Leu Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile 20 25 30 Asn Glu Ala Gly Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 35 40 45 <210> 16 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Adpgk Construct Amino Acid Sequence <400> 16 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Asp Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 50 55 60 Lys 65 <210> 17 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rpl18 Construct Amino Acid Sequence <400> 17 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Asp Leu Lys Ile Leu Thr Phe Asp Arg Leu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Lys Ile Leu Thr Phe Asp Arg Leu Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ile 35 40 45 Leu Thr Phe Asp Arg Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 50 55 60 <210> 18 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P15E Construct Amino Acid Sequence <400> 18 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Asp Leu Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ser 35 40 45 Pro Trp Phe Thr Thr Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 50 55 60 <210> 19 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S21P2(1) Construct Amino Acid Sequence <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Asp Leu Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp 20 25 30 Leu Leu Phe Asn Lys Val Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 35 40 45 <210> 20 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S21P2(2) Construct Amino Acid Sequence <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Asp Leu Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp 20 25 30 Leu Leu Phe Asn Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Lys Pro Ser 35 40 45 Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Asp Tyr Lys 50 55 60 Asp Asp Asp Asp Lys 65 <210> 21 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD Codon Optimized Construct DNA Sequence <400> 21 aatatcacta acttgtgtcc gttcggcgag gtttttaatg cgaccaggtt tgcttccgtg 60 tacgcctgga acaggaaacg gatctccaat tgtgtcgccg attactccgt cttgtataat 120 tcagcatctt tcagcacgtt taaatgttac ggagtttccc ccacaaaatt gaatgacctt 180 tgctttacga acgtctacgc ggattcattt gtaatccggg gggacgaagt taggcaaatt 240 gcgccagggc agactggcaa gatagctgac tataattata aattgccgga tgactttacg 300 ggctgtgtga ttgcttggaa ctcaaataat ctggactcaa aggtaggggg aaattataac 360 tacctttaca ggctgttccg gaagagtaat ctgaagccat tcgaaagaga tataagtaca 420 gagatctacc aagctggaag caccccctgc aatggtgttg aaggattcaa ttgttatttc 480 ccattgcaat cctatggttt tcaaccgacg aatggggtgg gataccaacc atatcgagtt 540 gtggttctca gtttcgagtt gcttcatgct cctgcgacag tatgtggacc aaaaaaatct 600 actaatctgg tgaagaataa atgcgtcaat ttttaa 636 <210> 22 <211> 189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA257-264 Codon Optimized Construct DNA Sequence <400> 22 ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60 agtattataa acttcgagaa gctgggtggg ggaggaagtt caatcattaa ttttgaaaaa 120 cttggaggag gtggatcttc cataattaat tttgaaaagc tggattataa ggatgacgac 180 gataagtga 189 <210> 23 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA323-339 Codon Optimized Construct DNA Sequence <400> 23 ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60 atttcacagg ctgtgcatgc tgcacatgct gaaattaatg aggctggacg tgattataag 120 gatgacgacg ataagtga 138 <210> 24 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adpgk Codon Optimized Construct DNA Sequence <400> 24 ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60 gctagcatga cgaacatgga gctaatggga gggggcggaa gtgcttctat gactaatatg 120 gaactgatgg gaggtggagg ttctgcttca atgaccaaca tggaacttat ggattataag 180 gatgacgacg ataagtga 198 <210> 25 <211> 189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rpl18 Codon Optimized Construct DNA Sequence <400> 25 ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60 aagattctga cgtttgatcg tctggggggt ggcggatcta agatattgac gttcgatcga 120 ctgggaggag gtggctctaa gatcctaaca ttcgaccgtc tagattataa ggatgacgac 180 gataagtga 189 <210> 26 <211> 189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P15E Codon Optimized Construct DNA Sequence <400> 26 ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60 aagtcacctt ggtttactac tctcggtggg ggaggaagta aatcgccatg gtttactaca 120 ttgggaggag gtgggtctaa gtcaccatgg ttcacgacat tggattataa ggatgacgac 180 gataagtga 189 <210> 27 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S21P2(1) Codon Optimized Construct DNA Sequence <400> 27 ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60 cctagtaagc cttctaagcg cagcttcata gaagatttgt tgttcaataa ggtagattat 120 aaggatgacg acgataagtg a 141 <210> 28 <211> 210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S21P2(2) Codon Optimized Construct DNA Sequence <400> 28 ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60 cctagtaagc cttctaagcg cagcttcata gaagatttgt tgttcaataa ggtaggtggg 120 ggaggaagtc catcgaagcc aagtaagcgt agtttcattg aggacctcct cttcaacaag 180 gttgattata aggatgacga cgataagtga 210 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1 fwd <400> 29 cacccaggga ctcgatgatg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1 rev <400> 30 gcacccaact gggtaacact 20 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD fwd <400> 31 caactgagca aagttacgtg agggtacaac ctacggaatc 40 <210> 32 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD rev <400> 32 atgaaatgcc ccagtgccgc ggggtggtct gacctcaaaa attgacgcat ttattcttca 60 c 61 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1-250-AvrII-F <400> 33 gattctatca actcaaggat aggcgcaatt gagcctagg 39 <210> 34 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBacT7-SacII-R <400> 34 cagtgccgcg gggtggtctg atcctcacgt gaaactacgc gggta 45

Claims (16)

  1. 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 아미노산 서열; 및 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프(epitope) 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 있어서,
    N-말단에서 251번째 아미노산 위치가 절단되어 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 1 내지 250번째 아미노산 서열; 및
    상기 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 아미노산 서열의 N-말단에서 251번째를 포함한 이후의 아미노산 위치에 삽입되어 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 에피토프는 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질의 카르복시 말단에서 융합 단백질을 형성하거나 구성하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 에피토프의 아미노산 서열 전후로 링커(linker)(서열번호 11), Myc 단백질(서열번호 12), FLAG 단백질(서열번호 13), 및 2A 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 암은 간암, 신경교종, 육종, 대장암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 폐암, 두경부암, 난소암, 방광암, 위암, 식도암, 담관암, 췌장암, 자궁경부암, 피부암, 림프종, 갑상선암, 골수암, 자궁내막암, 신장암, 직장암, 및 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 감염성 질환은 코로나 바이러스 감염증-19(COVID-19), C형 간염, 인플루엔자, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 유도 에이즈(AIDS), 결핵, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 중동 호흡기 증후군(MERS), 로타바이러스(rotavirus)에 의한 영유아장염, 및 노로바이러스(norovirus)에 의한 비세균성 급성위장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 에피토프의 아미노산 서열은 서열번호 3 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 에피토프를 암호화하는 염기 서열은 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질을 암호화하는 염기 서열의 5' 말단에서 763 내지 1416번째 염기 서열 위치에 치환 또는 삽입되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 에피토프는 숙주에서 중화 항체를 생성하거나 세포성 면역을 유도하여 면역 반응을 일으키는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 에피토프는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 B-세포 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 약독화된 레오바이러스 기반의 바이러스 벡터.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 제12항의 바이러스 벡터를 유효성으로 포함하는, 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  15. 하기 단계를 포함하는, 약독화된 레오바이러스 기반의 백신 조성물의 제조 방법:
    a) 서열번호 1로 표시되는 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질을 암호화하는 염기 서열을 포함하도록 역진화 바이러스 벡터를 제조하는 단계; 및
    b) 상기 시그마 1 단백질을 암호화하는 염기 서열의 763 내지 1416번째 염기 서열 위치에 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프(epitope)를 암호화하는 염기 서열이 포함되도록 염기를 치환 또는 삽입하여, 약독화된 레오바이러스 시그마 1 단백질과 암 또는 감염성 질환을 유발하는 항원의 에피토프가 융합하여 발현되도록 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 상기 벡터에 도입하는 단계.
  16. 제15항에 있어서,
    c) 상기 b) 단계의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약독화된 레오바이러스 기반의 벡터를 BHK21, L929, HEK293, CHO, PER.C6, HeLa, 및 Vero 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포에서 생산 및 증식시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물의 제조 방법.
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KR20190092468A (ko) 2016-11-28 2019-08-07 메디젠, 인크. 양성 가닥 rna 바이러스에 의해 유발되는 감염성 질환에 대한 백신

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KR20190092468A (ko) 2016-11-28 2019-08-07 메디젠, 인크. 양성 가닥 rna 바이러스에 의해 유발되는 감염성 질환에 대한 백신

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