CN117321069A - 基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物及其用途，根据本发明的减毒呼肠孤病毒的衣壳σ‑1蛋白的第251至455位氨基酸被截短，使得当将诱导癌症或感染性疾病的抗原蛋白的表位引入到σ‑1蛋白的截短位点时，抗原蛋白的表位在细胞中稳定表达，从而获得了表现出免疫应答的效果，例如产生中和抗体或诱导细胞介导的免疫。因此，通过将抗原蛋白的表位引入到根据本发明的减毒呼肠孤病毒的σ‑1蛋白的截短位点，本发明预期可有效地用作用于癌症或感染性疾病的疫苗组合物。

Description

基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物及其用途
技术领域
本发明涉及基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物及其用途。
本申请要求基于2021年3月23日提交的韩国专利申请第10-2021-0037160号和2022年3月22日提交的韩国专利申请第10-2022-0035224号的优先权。这些申请的说明书和附图中公开的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
病毒是由遗传物质和蛋白质构成的小的非细胞生物体，并且存在不同类型的病毒。例如，病毒可以是在宿主细胞核内复制的DNA病毒或在细胞的细胞质内复制的RNA病毒。病毒可以是双链或单链的。此外，单链RNA病毒可以是正链(+，有义)或负(-)链。这些不同类型的病毒引起各种病毒感染。
当致病病毒进入生物体时，就会发生病毒感染。一旦病毒进入生物体，病毒就会将自身附着在细胞上，对细胞进行重新编程以复制新病毒，直到细胞破裂或死亡，从而使病毒在人类和动物中引起各种感染性疾病并迅速传播。由病毒引起的感染性疾病通常包括感冒、流感和疣。然而，病毒也可引起严重疾病，如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、冠状病毒病19(COVID-19)、丙型肝炎、结核病、严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)、天花、疱疹、出血热、脊髓灰质炎、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、轮状病毒引起的婴儿肠炎和诺如病毒引起的非细菌性急性胃肠炎。
如今，针对病毒感染和限制其传播的最重要的保护措施是疫苗接种。现代疫苗主要诱导针对表面病毒抗原的抗体的形成。疫苗的功效直接取决于疫苗中所含病毒的抗原结构与人群中传播的毒株之间的匹配性。大多数病毒的表面蛋白都会经历一致的抗原变异(抗原漂移)，因此需要不断更新疫苗株。开发具有诱导广泛免疫应答的高免疫原性的安全疫苗是有效预防癌症或感染性疾病面临的主要挑战之一。确实需要疫苗开发来预防全球流行性疾病(例如由SARS-CoV-2引起的COVID-19)的传播和持续感染。因此，全球正在利用诸如水疱性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、腺病毒(Ad)、杆状病毒等平台开发许多基于病毒的疫苗。
呼肠孤病毒(呼吸道肠道孤儿病毒)是一种无包膜病毒，包含在普通环境中普遍存在的10个双链RNA片段的完整基因组，并且是一种无症状病毒，在具有正常免疫功能的宿主中不会表现出症状。已知人类中的感染是轻微的，据信仅限于上呼吸道和胃肠道。
同时，反向遗传学技术涉及验证病毒的整个基因组序列以产生重组人工病毒。最大的优点是病毒可以被重组表达、操纵和人工合成，从而可以按预期对病毒基因进行各种操纵。通过将诸如嵌合病毒、密码子对去优化和诱变等各种机制加载到病毒基因上，可以产生修饰的新病毒。经典的遗传学方法主要涉及在给定生物体的基因组中随机诱导突变，然后从突变中发现表现出感兴趣性状的基因，这种方法费时费力，并且缺点是不容易分离出不具有强性状修饰作用的基因突变。随着功能基因组学的最新发展，基因组水平突变已在包括酵母在内的几种模式生物中可用。相比之下，反向遗传学技术可以通过直接引入和探索每个基因突变可能引起的潜在性状变异，来提高基因探索的识别能力。反向遗传学技术的优点是能够根据需要人为地操纵病毒并最大限度地发挥其特性，使其成为疫苗开发中非常有用的技术。
对此，本发明的发明人旨在开发一种基于呼肠孤病毒的疫苗平台，其使用反向遗传学技术通过“快速交换”方法将表位序列插入减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白中，其中特定的氨基酸序列位置被截短，以将癌症或感染性疾病的表位融合并表达到减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白中。
发明内容
[技术问题]
本发明的发明人发现，在第251至455位氨基酸被截短的减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白中，通过经由替换或插入在截短的氨基酸位点引入癌症或感染性疾病的各种表位的氨基酸序列，引入的表位在细胞中稳定表达。这种表达导致产生中和抗体或诱导细胞介导的免疫，从而表现出免疫应答。基于此，完成了本发明。
因此，本发明涉及提供一种多肽，其包含减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的氨基酸序列；和诱导癌症或感染性疾病的表位的氨基酸序列，以及编码所述多肽的多核苷酸。
本发明还涉及提供基于减毒呼肠孤病毒的病毒载体，其包含编码所述多肽的多核苷酸。
本发明还涉及提供基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物及其制备方法，所述疫苗组合物包含所述多肽、编码所述多肽的多核苷酸或病毒载体作为活性成分。
然而，本发明要解决的技术问题并不限于上述问题，本领域普通技术人员从以下描述中将充分理解本文中未描述的其它问题。
[技术方案]
为实现本发明的目的，本发明提供了一种多肽，其包含减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的氨基酸序列；和引起癌症或感染性疾病的抗原的表位的氨基酸序列，
其中所述多肽包含在从N末端起第251个氨基酸位置截短的所述减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的第1至第250位氨基酸序列；和
插入所述减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的氨基酸序列的N末端第251位及以后的氨基酸位置的引起癌症或感染性疾病的抗原的表位的氨基酸序列。
此外，本发明提供了基于减毒呼肠孤病毒的病毒载体，其包含编码所述多肽的多核苷酸。
另外，本发明提供了基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物，其包含所述多肽、编码所述多肽的多核苷酸或病毒载体作为活性成分。
进一步地，本发明提供了一种制备基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物的方法，其包括以下步骤：
a)制备包含编码由SEQ ID NO:1所示的减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的碱基序列的反向遗传学病毒载体；和
b)将多核苷酸引入所述载体中，其中所述多核苷酸编码减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白和引起癌症或感染性疾病的抗原的表位，其通过在编码所述σ-1蛋白的碱基序列的第763至1416位处替换或插入碱基从而包含编码所述引起癌症或感染性疾病的抗原的表位的碱基序列，而表达为融合蛋白。
在本发明的一个实施方案中，减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白可以由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白可以由SEQ ID NO:2所示的碱基序列编码，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，表位可以在减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的羧基末端形成或构成融合蛋白，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，在所述表位的氨基酸序列之前和之后，还可以包含选自由接头(SEQ ID NO:11)、Myc蛋白(SEQ ID NO:12)、FLAG蛋白(SEQ ID NO:13)和2A肽组成的组中的一个或多个氨基酸序列，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，癌症可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：肝癌、神经胶质瘤、肉瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、皮肤癌、淋巴瘤、甲状腺癌、骨髓癌、子宫内膜癌、肾癌、直肠癌和脑肿瘤，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，感染性疾病可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：冠状病毒病19(COVID-19)、丙型肝炎、流感、人类免疫缺陷病毒(HIV)诱导的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、结核病、严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)、轮状病毒引起的婴儿肠炎和诺如病毒引起的非细菌性急性胃肠炎，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，表位的氨基酸序列可以是选自由SEQ ID NO:3至10组成的组中的一种或多种，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，编码表位的碱基序列可以在从编码减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的碱基序列的5’端起的第763至1416位处替换或插入，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，表位可以通过在宿主中产生中和抗体或诱导细胞介导的免疫来诱导免疫应答，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，表位可以是选自由CD4+T细胞表位、CD8+T细胞表位和B细胞表位组成的组中的一种或多种，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，疫苗组合物可以用于预防或治疗癌症或感染性疾病，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，在制备疫苗组合物的方法中，可以包括步骤c)在选自由BHK21、L929、HEK293、CHO、PER.C6、HeLa和Vero细胞组成的组中的一种或多种细胞中产生并增殖来自步骤b)的包含多核苷酸的基于减毒呼肠孤病毒的载体，但不限于此。
另外，本发明提供了用于预防或治疗癌症或感染性疾病的方法，其包括将疫苗组合物施用于有此需要的受试者。
此外，本发明提供了疫苗组合物用于预防或治疗癌症或感染性疾病的用途。
此外，本发明提供了根据本发明的多肽、编码所述多肽的多核苷酸或病毒载体在制备用于预防或治疗癌症或感染性疾病的疫苗中的用途。
[有益效果]
根据本发明的减毒呼肠孤病毒是其中衣壳的σ-1蛋白的第251至455位氨基酸被截短的病毒，使得当将引起癌症或感染性疾病的抗原蛋白的表位引入σ-1蛋白的截短位点时，抗原蛋白的表位在细胞中稳定表达并且具有产生免疫应答的能力，例如产生中和抗体或诱导细胞介导的免疫。因此，通过将抗原蛋白的表位引入到根据本发明的减毒呼肠孤病毒σ1蛋白的截短位点中，预期其可有利地用作用于癌症或感染性疾病的疫苗组合物。
附图说明
图1a表示野生型呼肠孤病毒和根据本发明实施方案的减毒呼肠孤病毒RP116的结构的比较。
图1b表示显示可以将各种病原体来源的抗原的表位添加到根据本发明实施方案的减毒呼肠孤病毒RP116的σ-1蛋白的截短位点以产生呼肠孤病毒疫苗平台的图。
图1c表示描述使用根据本发明实施方案的减毒呼肠孤病毒制备的疫苗的施用途径和作用的图。
图2表示说明根据本发明实施方案的快速交换呼肠孤病毒反向遗传学系统和呼肠孤病毒复制过程的图。
图3a表示根据本发明实施方案的基于抗呼肠孤病毒抗体，验证用野生型呼肠孤病毒(WT ReoV)、具有截短σ1的减毒呼肠孤病毒RP116(ReoV+Q251*)和引入有RBD的呼肠孤病毒(ReoV+RBD)感染L929细胞之后的蛋白质检测结果的图。
图3b表示根据本发明的实施方案，验证从ReoV+RBD感染的L929细胞提取的遗传物质中检测到RBD基因的图。
图3c表示根据本发明的实施方案，在从ReoV+RBD感染的L929细胞获得的细胞裂解物中基于SARS-CoV-2中和抗体(NeuAb)(上)和抗呼肠孤病毒抗体(下)验证呼肠孤病毒蛋白和RBD的表达的图。
图4a表示描绘根据本发明实施方案的减毒呼肠孤病毒的重组σ1蛋白的构建体设计的图。
图4b表示通过蛋白质印迹分析验证根据本发明实施方案的减毒呼肠孤病毒中与σ1蛋白融合的各种CD4+和CD8+T细胞表位的表达的图。
图4c表示通过RT-qPCR分析验证图4B中使用的重组呼肠孤病毒中引入的抗原的表达的图。
图4d表示通过蛋白质印迹分析验证根据本发明实施方案的减毒呼肠孤病毒中与σ1蛋白融合的各种B细胞表位的表达的图。
图4e表示通过RT-qPCR分析验证图4D中使用的重组呼肠孤病毒中引入的抗原的表达的图。
图5表示通过免疫细胞化学分析验证根据本发明实施方案的ReoV+OVA257-264中的表位表达的图。
图6表示验证根据本发明实施方案的ReoV-S21P2(2)中SARS-CoV-2的线性B细胞表位的表达的图。
图7a表示描绘根据本发明实施方案的重组呼肠孤病毒ReoV+S21P2(1)和ReoV+OVA257-264的重组σ1蛋白的构建体设计的图。
图7b表示在根据本发明实施方案的重组呼肠孤病毒中通过用呼肠孤病毒特异性抗体(上)和针对FLAG标签的特异性抗体(下)检测抗原来验证引入的表位的稳定性的图。
具体实施方式
在本发明的一个实施方案中，使用具有从核苷酸763CAA(氨基酸251Q-谷氨酰胺)到763TAA(终止密码子)的独特终止突变的减毒呼肠孤病毒RP116来将表位氨基酸序列添加到RP116的截短的σ-1蛋白中，并通过快速交换呼肠孤病毒反向遗传学系统建立基于减毒呼肠孤病毒的疫苗平台(参见实施例1和实施例2)。
在本发明的另一个实施方案中，作为呼肠孤病毒疫苗平台的概念证明，制备了表达与呼肠孤病毒的σ-1蛋白融合的SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)的受体结合结构域(RBD)的密码子优化序列的ReoV-RBD，并且可以通过SARS-CoV-2中和抗体检测。因此，这表明表达RBD的ReoV产生了作为疫苗候选的理想中和抗体(参见实施例3)。
在本发明的另一个实施方案中，使用快速交换技术来操纵以表达与减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白融合的各种CD4+和CD8+T细胞表位。通过实验证实了表位确实得到表达(参见实施例4至6)，并且引入的表位可以稳定表达而不会发生突变(参见实施例7)。
因此，本发明提供了一种多肽，其包含减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的氨基酸序列；和引起癌症或感染性疾病的抗原的表位的氨基酸序列，
其中所述多肽包含在从N末端起第251个氨基酸位置截短的所述减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的第1至第250位氨基酸序列；和
插入所述减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的氨基酸序列的N末端第251位及以后的氨基酸位置的引起癌症或感染性疾病的抗原的表位的氨基酸序列。
本文所用的术语“呼肠孤病毒(呼吸道肠道孤儿病毒，REO病毒)”是指一种20面体、无包膜、以双链RNA片段作为其基因组的病毒。呼肠孤病毒通常从健康人的消化和呼吸系统中分离出来，被认为是非致病性病毒组。呼肠孤病毒被称为能够感染和破坏各种转化细胞的溶瘤病毒。
本文所用的术语“减毒呼肠孤病毒”可以是呼肠孤病毒RP116，其编码野生型呼肠孤病毒衣壳上暴露的附着σ-1蛋白中的第251位氨基酸谷氨酰胺(Q)的763CAA突变为763TAA(终止密码子)，导致σ-1蛋白第251个氨基酸后的截短，从而导致球形头形状的截短。
在本发明中，减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白可以由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示，但不限于此。
在本发明中，减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白可以由SEQ ID NO:2所示的碱基序列编码，但不限于此。
本文所用的术语“癌症”是指由忽略正常生长边界并表现出分裂和生长的侵袭性特征、穿透周围组织的扩散性特征和扩散至身体其它部分的转移性特征的细胞引起的疾病。
在本发明中，癌症没有特别限制，只要是本领域已知其为恶性肿瘤即可，并且可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：肝癌、神经胶质瘤、肉瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、皮肤癌、淋巴瘤、甲状腺癌、骨髓癌、子宫内膜癌、肾癌、直肠癌和脑肿瘤。
本文所用的术语“感染”是指病原微生物如病毒在宿主生物体内的侵入、发育和增殖，并且是指它们在人、动物或植物的组织、体液和表面上的定居和增殖。结果，宿主可能会发生病理变化并可能患上疾病。
本文所用的术语“感染性疾病”是指由病原微生物在人、动物或植物的组织、体液和表面上定居和增殖引起的疾病，并且根据感染途径和传染性可分为几种类型。感染包括病毒感染、真菌感染、细菌感染、原生动物感染和寄生虫感染。在本发明中，感染性疾病可以是选自由以下组成的组中的至少一种：丙型肝炎、流感、人类免疫缺陷病毒(HIV)诱导的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、结核病、冠状病毒病19(COVID-19)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染、轮状病毒引起的婴儿肠炎和诺如病毒引起的非细菌性急性胃肠炎，并且在本发明的一个实施方案中，其可以是COVID-19，但不限于此。
在本发明中，“冠状病毒病19(COVID-19)”是由SARS-CoV-2引起的严重呼吸综合征。COVID-19的症状各不相同，但包括发烧、咳嗽、头痛、疲劳、呼吸困难以及嗅觉和味觉丧失。症状在感染后1-14天内出现。值得注意的是，三分之一的受感染个体是无症状的，不表现出明显的症状。足够明显而被归类为患者的人中81％出现轻度至中度症状，14％出现诸如呼吸急促和缺氧等症状，并且5％出现诸如呼吸衰竭和休克等严重症状。老年人更有可能出现严重症状，并且康复后，由于长期接触COVID-19，一些人观察到了器官损伤。
SARS-CoV-2包含30kb核苷酸，并且具有四种重要的结构蛋白；核衣壳(N)、刺突(S)、膜(M)和包膜(E)蛋白。其中，S蛋白代表与宿主细胞受体结合的关键位点，并将病毒核衣壳递送到细胞中，在那里进行复制。
用于对抗SARS-CoV-2的最直截了当和直接的方法是中和进入人体细胞的病毒，从而阻断SARS-CoV-2浸润细胞、复制和分泌新病毒体以感染其它细胞的机制。
已知SARS-CoV-2能够通过与人细胞上的血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结合来进行复制。冠状病毒S蛋白的受体结合结构域(RBD)是与宿主细胞上的ACE2受体结合的关键区域。其包含诱导针对SARS-CoV-2感染的有效中和抗体的多个构象依赖性表位。因此，其可以成为针对COVID-19的治疗和疫苗开发的关键靶标(J.Immunol 2005；174:4908-4915)。
此外，本发明提供了基于减毒呼肠孤病毒的病毒载体，其包含编码所述多肽的多核苷酸。
另外，本发明提供了基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物，其包含所述多肽、编码所述多肽的多核苷酸或病毒载体作为活性成分。
在本发明中，疫苗组合物可以用于预防或治疗癌症或感染性疾病，但不限于此。
在本发明中，术语“疫苗”是指包含至少一种在动物中诱导免疫应答的免疫活性成分的组合物。疫苗的免疫活性成分可以包含活病毒或死病毒(亚单位疫苗)的适当元件，并且这些元件可以如下获得：破坏整个病毒或其生长培养物，然后进行纯化过程，或者但不限于，通过适当操纵合适的系统(例如细菌、昆虫、哺乳动物或其它物种)诱导的合成过程，然后进行分离和纯化过程，或通过使用合适的药物组合物将遗传物质直接掺入需要疫苗的动物中(多核苷酸疫苗接种)。
疫苗可以包含上述元件中的一种或多种并且可以通过本领域已知的方法制备。在本发明中，疫苗可以基于具有截短的σ-1蛋白的减毒呼肠孤病毒来制造，并且可以被设计为在其截短位点以融合形式表达引起癌症或感染性疾病的各种表位。例如，其可以以包含减毒呼肠孤病毒的截短的σ-1蛋白的氨基酸序列和表位的多肽、编码所述多肽的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的病毒载体的形式制造，但不限于此。本发明的疫苗可以是本领域已知的任何形式，例如液体或注射剂的形式，或适合混悬剂的固体形式，但不限于此。这样的制剂还可以被乳化或封装在脂质体或可溶性玻璃中，或者可以以气雾剂或喷雾剂的形式制造。它们也可以被包含在透皮贴剂中。
根据本发明，如果需要，疫苗可以包含药学上可接受的疫苗防腐剂、佐剂、稀释剂、吸收促进剂等。疫苗防腐剂可以包含例如乳糖磷酸谷氨酸明胶混合物，但不限于此。在疫苗是液体或注射剂的情况下，如果需要，其可以包含丙二醇和足量(例如约1％)的氯化钠以防止溶血。
用作佐剂的物质没有特别限制，并且可以例如是明矾、单磷酰脂质A(MPL)、氢氧化铝、矿物油或其它油或疫苗的添加剂，或者可以是由这样的附加成分诱导后由身体产生的辅助分子，但不限于此。
在本文中，“药学上可接受的”是指其是生理学上可接受的，并且当施用于受试者时，不会抑制活性成分的作用，并且通常不会引起过敏反应，例如胃肠道障碍或头晕，这意味着无毒性。
疫苗可以通过诸如经口、透皮、肌内、腹膜内、静脉内、皮下等施用途径施用，但不限于此，并且例如可以经口或肌内施用。
本文所用的术语“表位”是指允许免疫系统例如抗体、B细胞和T细胞识别抗原的抗原决定簇，指定了抗原的特定部分。为了诱导B细胞(即抗体)应答，抗原必须包含“B细胞表位”，并且为了诱导T细胞应答，抗原必须包含“T细胞表位”。如本领域通常理解的，B细胞表位是被B细胞受体识别和结合的抗原的一部分。脂质、多糖和蛋白质/肽可以包含B细胞表位，并且当引入选定的生物体时，它们会促使B细胞产生特异性结合引入的表位的抗体。
在本发明中，表位可以是选自由CD4+T细胞表位、CD8+T细胞表位和B细胞表位组成的组中的一种或多种，并且根据本发明的一个实施方案，可以包含选自由以下组成的组中的一种或多种氨基酸序列：RBD(SEQ ID NO:3)、OVA257-264(SEQ ID NO:4)、OVA323-339(SEQ IDNO:5)、Adpgk(SEQ ID NO:6)、Rpl18(SEQ ID NO:7)、P15E(SEQ ID NO:8)、S21P2(1)(SEQ IDNO:9)和S21P2(2)(SEQ ID NO:10)，但不限于此。
在本发明中，表位可以在减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的羧基末端形成或构成融合蛋白，但不限于此。
在本发明中，编码表位的碱基序列可以在从编码减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的碱基序列的5'端起的第763至1416位处进行替换或插入，但不限于此。例如，编码表位的碱基序列可以替换为从编码减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的SEQ ID NO:2的碱基序列的5'端起的第763至1416位之间的特定碱基序列，并且也可以插入在特定核苷酸序列之间。因此，在减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白中，在野生型呼肠孤病毒σ-1蛋白的N末端第251位氨基酸序列被截短之后，插入并融合到减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白中第251位及其之后的氨基酸位置的表位可以包含约5至400个氨基酸序列，但不限于此。
在本发明中，在第251位及其以后的氨基酸位置所包含的表位的氨基酸序列之前和之后，减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白可以还包含选自由接头(SEQ ID NO:11)、Myc蛋白(SEQ IDNO:12)、FLAG蛋白(SEQ ID NO:13)和2A肽组成的组的至少一个氨基酸序列，但不限于此，并且对这些的顺序没有限制。2A肽可以选自包括例如P2A、T2A、E2A或F2A的2A肽，并且对其类型没有限制。
在本发明中，选自由CD4+T细胞表位、CD8+T细胞表位和B细胞表位组成的组的一种或多种表位可以通过允许T细胞或B细胞识别抗原而引起免疫应答，从而导致宿主中中和抗体的产生或诱导细胞介导的免疫，但不限于此。
本文所用的术语“抗体”是指包含源自免疫球蛋白基因或其片段的框架区并且特异性识别并结合抗原的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，从而分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗原结合区对于结合特异性和亲和力至关重要。抗体是体液免疫的主要参与者，并且与T细胞一起在人体的防御机制中发挥着至关重要的作用，抗体是通过将抗原蛋白作为免疫原施用于动物以诱导体液免疫应答而制备的。抗体或抗体片段可源自各种受试者，包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、骆驼、兔等，但不限于此。
本文所用的术语“中和抗体”是指结合病原体并干扰病原体感染细胞或引起疾病的能力的任何抗体或其抗原结合片段。
本文所用的术语“细胞介导的免疫”是指其中淋巴系统的细胞直接诱导针对特定抗原的免疫应答的免疫活性。这种免疫活性是指其中白细胞作用于抗原以吞噬细胞的吞噬作用，或诱导细胞毒性细胞反应以消除抗原。这是免疫系统的一个组成部分，与血清抗体执行的体液免疫相结合，并且尤其包括具有细胞毒性的T细胞的作用。T细胞与B细胞结合形成抗体，然后直接接触并破坏抗原。
本文所用的术语“抗原”代表能够在宿主中诱导免疫应答的蛋白质。抗原可以被抗体识别并结合。抗原可以源自体内或源自外部环境，并且包括重组形式的蛋白质。在本发明中，疫苗组合物能够诱导产生针对引起癌症或感染性疾病的抗原的表位的抗体，其中所述表位充当抗原。与单次施用相比，当疫苗组合物施用两次或三次时，抗体的产生可以进一步增加，但不限于此。
此外，本发明提供了一种制备基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物的方法，其包括以下步骤：
a)制备包含编码由SEQ ID NO:1所示的减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的碱基序列的反向遗传学病毒载体；和
b)将多核苷酸引入所述载体中，其中所述多核苷酸编码减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白和引起癌症或感染性疾病的抗原的表位，其通过在编码所述σ-1蛋白的碱基序列的第763至1416位处替换或插入碱基从而包含编码所述引起癌症或感染性疾病的抗原的表位的碱基序列，而表达为融合蛋白。
在本发明中，反向遗传学病毒载体可以指被制备用于在宿主细胞中产生编码减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的S1片段RNA的病毒载体，并且可以通过本领域已知的方法来制备。载体的结构允许病毒RNA片段从T7RNA聚合酶启动子转录，并且3'末端由载体中存在的核酶自然形成。在其中引入了该载体的表达T7聚合酶的细胞中，会产生病毒RNA，并利用它合成病毒蛋白，因此被称为反向遗传学系统。这是设计和产生RNA病毒突变体的有用方法。
在用于制备本发明的疫苗组合物的方法中，步骤c)包括在选自由BHK21、L929、HEK293、CHO、PER.C6、HeLa和Vero细胞组成的组中的一种或多种细胞中产生并增殖来自步骤b)的包含多核苷酸的基于减毒呼肠孤病毒的载体，但不限于此。
另外，本发明提供了用于预防或治疗癌症或感染性疾病的方法，其包括将疫苗组合物施用于有此需要的受试者。
此外，本发明提供了疫苗组合物用于预防或治疗癌症或感染性疾病的用途。
此外，本发明提供了根据本发明的多肽、编码所述多肽的多核苷酸或病毒载体在制备用于预防或治疗癌症或感染性疾病的疫苗中的用途。
本文所用的术语“预防”是指抑制或延迟目标疾病发作的所有行动。本文使用的术语“治疗”是指通过施用根据本发明的药物组合物减轻或有益地改变目标疾病和由此引起的异常代谢症状的所有行动。
本文所用的术语“施用”是指通过使用任意适当的方法向受试者提供本发明的预定组合物。
本文所用的术语“受试者”是指需要预防癌症或感染性疾病的受试者，并且更具体地，是指哺乳动物，例如人或非人灵长类动物、小鼠、狗、猫、马和牛。
在本发明中，当使用术语“包含/包括”时，除非特别矛盾，否则并不意味着排除其它组分，而是可以包括其它组分。本发明通篇使用的程度术语“～的步骤”或“...的步骤”并不意味着“用于～的步骤”。
在下文中，提出优选实施例以帮助理解本发明。然而，提供这些实施例仅仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不限于这些实施例。
[实施例]
实施例1.基于减毒呼肠孤病毒的疫苗平台的构建
呼肠孤病毒是一种双链RNA无包膜病毒。REO是呼吸道肠道孤儿(RespiratoryEnteric Orphan)的缩写，是针对人类呼吸和肠道系统分离出来的，但与任何已知的人类疾病无关。野生型呼肠孤病毒感染引起的大多数中和抗体和免疫应答都针对病毒的σ-1(σ1)蛋白，更具体地说，针对从衣壳中突出的蛋白质的球形头。因此，呼肠孤病毒中的σ-1区域代表了增强其抗原性的关键部分。如图1a所示，野生型(WT)呼肠孤病毒代表外衣壳上的附着蛋白σ1，其识别并结合连接粘附分子-A(JAM-A)(图1a的左图)。
野生型呼肠孤病毒σ1蛋白的氨基酸序列和碱基序列如表1所示。
[表1]
减毒呼肠孤病毒RP116是具有从核苷酸763CAA(氨基酸251Q-谷氨酰胺)到763TAA(终止密码子)的独特终止突变的呼肠孤病毒，与WT呼肠孤病毒σ1(图1a右图)相比产生“头截短的”σ1蛋白。
如图1b所示，RP116的这种σ1蛋白表明球形头对于呼肠孤病毒复制不是必需的，并且来自各种病原体的片段可在该位点进行交换。为了产生创新且安全的呼肠孤病毒疫苗平台，可以将大约5至400个氨基酸的表位片段添加到RP116σ1蛋白的该位点。
另外，如图1c所示，无包膜呼肠孤病毒具有对恶劣环境条件的抵抗力，并且可以利用各种溶液或食物来源进行施用。经口施用后，呼肠孤病毒优先感染小肠的M细胞，并诱导针对σ1上代表的各种病原体表位的免疫应答。
实施例2.快速交换呼肠孤病毒反向遗传学系统的建立
用10个病毒基因片段和T7表达细胞系转染呼肠孤病毒的反向遗传学系统，以产生可复制的呼肠孤病毒颗粒(Kobayshi等人,2007,Cell Host Microbe.2007 Apr 19；1(2):147-57.)，然后报道了反向遗传学系统的改进版本，其中仅需要将包含10个病毒基因片段的4个质粒转染到T7表达细胞系中(Kobayashi等人,2010,Virology.2010 Mar 15；398(2):194-200.)。在本发明中，使用减毒呼肠孤病毒RP116基因构建了新型反向遗传学系统，从而能够实现用于疫苗设计和测试的快速“快速交换”方法。用于通过引入本发明的系统来设计基于呼肠孤病毒RP116的疫苗的载体如下(参见图2的上图)：pS1Att或pS1XX、pL1、pSet2、pSet3、pSet4。
当载体被引入经转化以表达T7RNA聚合酶的BHK21细胞时，病毒基因被转录，最终在24至72小时内诱导产生可复制的病毒颗粒。pS1XX是通过重新设计pS1Att的从终止密码子突变到氨基酸位置251的C末端的序列(即RP116的S1基因)而引入非呼肠孤病毒表位制备的。终止密码子和第763个核苷酸之后的序列可以重新设计，以将抗原或表位片段“融合”到RP116σ1蛋白序列。在氨基酸位置251和C末端之间还设计了特定的限制性酶识别位点，使得σ1肽的这一部分易于交换。
感染前通过50μg/mL胰凝乳蛋白酶处理分解外衣壳，从而使产生的可复制颗粒更容易附着和进入生产细胞系BHK21、L929、Vero细胞。
这种快速交换呼肠孤病毒反向遗传学系统和呼肠孤病毒增殖过程如图2所示。
此外，本发明中使用的表位的氨基酸序列、构建体氨基酸序列和密码子优化的构建体DNA序列示于表2中。
[表2]
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实施例3.ReoV-RBD的制备
作为呼肠孤病毒疫苗平台的概念验证，通过将SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)受体结合结构域(RBD)碱基序列引入到减毒呼肠孤病毒S1基因第251个密码子位置之后制备重组呼肠孤病毒ReoV+RBD(ReoV-RBD)，其以融合蛋白形式表达呼肠孤病毒的σ1蛋白和密码子优化的SARS-CoV-2RBD。重组呼肠孤病毒ReoV+RBD(ReoV-RBD)、WTσ1(WTReoV)和具有截短σ1的呼肠孤病毒(ReoV+Q251*)在BHK21细胞中产生并在L929细胞中增殖。在此过程中，表达来自σ1的SARS-CoV-2RBD的重组呼肠孤病毒可以通过SARS-CoV-2中和抗体检测。
如图3a所示，将野生型呼肠孤病毒(WT ReoV)、具有截短σ1的呼肠孤病毒(ReoV+Q251*)和引入有RBD抗原的呼肠孤病毒(ReoV+RBD)分别感染到L929细胞中，并且96小时后，如通过蛋白质印迹结果证实的，通过抗呼肠孤病毒抗体在细胞裂解物中检测到每种呼肠孤病毒蛋白。
当将每种重组呼肠孤病毒感染到L929细胞中并且在重组呼肠孤病毒传代四次之后使用RBD基因特异性引物对从其中提取的遗传物质进行RT-qPCR分析时，如图3b所示，在ReoV+RBD感染的情况下检测到RBD基因。用于RT-qPCR分析的引物序列如下表3所示。
[表3]
另外，作为对通过感染L929细胞而得到的细胞裂解物进行斑点印迹法的结果，如图3c所示，通过SARS-CoV-2中和抗体(NeuAb)(上)和抗呼肠孤病毒抗体(下)证实了重组RBD表达。阳性对照重组RBD由John Bell博士实验室制备(Azad等人,Membranes(Basel).2020Aug 30；10(9):215)，并且使用购自Sino Biological(Wayne,PA,USA)的SARS-CoV-2NeuAb(40592-MM57)。结果表明，表达RBD的ReoV为疫苗候选提供了理想的中和抗体。
实施例4.使用呼肠孤病毒附着蛋白σ-1(σ1)表达外源抗原
可以通过位点特异性诱变或复制来引入特定的突变变化，以研究呼肠孤病毒基因的一个或多个部分内的确定突变的作用或结果，从而允许呼肠孤病毒被修饰或发生突变。例如，将编码σ-3蛋白的呼肠孤病毒的S4基因中的特定氨基酸突变引入病毒载体中，产生有具有特定突变的病毒衣壳σ-3蛋白的修饰的呼肠孤病毒。
本发明的减毒呼肠孤病毒RP116在编码σ1蛋白的S1基因中具有其初级突变，从763CAA(氨基酸251Q-谷氨酰胺)到763TAA(终止密码子)的终止突变，并且该系统产生具有截短σ1蛋白的可复制RP116呼肠孤病毒。
根据基因片段的特征，可以在核苷酸位置763至1416处具有所选的特定表位序列的替换或插入。本质上，这种非呼肠孤病毒序列的替换或插入代替了σ1的球形头结构，将新的表位暴露于病毒的衣壳，从而产生针对非呼肠孤病毒抗原的免疫应答。
图4a代表重组附着蛋白组合物的构建体设计，其中σ1蛋白的第251位氨基酸和第455位氨基酸之间的残基可以被替换为各种表位，例如用于标记目的的Myc和FLAG标签。
使用“快速交换”技术，操纵呼肠孤病毒表达与σ1蛋白融合的各种CD4+和CD8+T细胞表位。如图4b所示，通过蛋白质印迹分析证实了引入重组呼肠孤病毒中的各种抗原的表达，并且如图4c所示，通过DNA琼脂糖凝胶分离了引入图4b中使用的重组呼肠孤病毒中的抗原的表达，并通过使用基因特异性引物进行RT-qPCR分析验证。
此外，使用快速交换技术操纵呼肠孤病毒表达与σ1蛋白融合的各种B细胞表位。如图4d所示，通过蛋白质印迹分析证实了引入重组呼肠孤病毒中的各种抗原的表达，并且如图4e所示，通过DNA琼脂糖凝胶分离了引入图4D中使用的重组呼肠孤病毒中的抗原的表达，并通过使用基因特异性引物进行RT-qPCR分析验证。
这些实施例证明了表达各种外源抗原表位的新型呼肠孤病毒疫苗平台的多种用途，表明其在通过引入各种疾病表位开发新疫苗的筛选阶段具有潜在用途。
实施例5.用ReoV-OVA感染的细胞中引入的抗原表达的确认
如图4a所示，可以通过免疫细胞化学分析检测所制备的与卵清蛋白(OVA)257-264组合的ReoV中位于OVA257-264表位处的Myc和FLAG标签。
为了检测这些，用ReoV、ReoV+Q251*和ReoV+OVA257-264感染盖玻片上生长的Vero细胞48小时。然后，将细胞固定在3.7％ PFA中，并与抗ReoV(1:1000，兔血清)、抗Myc(1:200)和抗FLAG(1:200)反应1小时，然后与抗ReoV(兔Alexa Fluor 488)的二抗和抗Myc或抗FLAG(Alexa Fluor 594)的二抗一起孵育45分钟。用包含DAPI的Fluoromount G封固染色的盖玻片用于核复染，并且用配备60倍油浸物镜的Olympus共焦显微镜捕获图像(比例尺＝50μm)。
结果，如图5所示，感染ReoV+OVA257-264的情况下来自Myc和FLAG标签的荧光(红色)与检测呼肠孤病毒蛋白的荧光(绿色)重叠。
这表明重组呼肠孤病毒在受感染的细胞中特异性表达抗原，表明重组呼肠孤病毒具有感染性并且可以在哺乳动物细胞中表达被操纵的新表位。
实施例6.SARS-CoV-2线性B细胞表位的表达和检测
用野生型(WT)或经操纵的ReoV(表达SARS-CoV-2线性B细胞表位的ReoV+p15E和ReoV-S21P2(2))感染BHK21细胞。先前的研究已证实了SARS-CoV-2线性B细胞表位能够产生中和抗体(Poh等人,Nat Commun.2020Jun 1；11(1):2806)。
为了确认SARS-CoV-2线性B细胞表位的表达，感染后48小时裂解细胞并用于蛋白质印迹。结果，如图6所示，在所有感染样品中均可检测到呼肠孤病毒蛋白。然而，仅在使用p15E或SARS-CoV-2B细胞表位操纵的ReoV中检测到Myc和FLAG标签。此外，用包含SARS-CoV-2的B细胞表位区域的SARS-CoV-2刺突蛋白的完整S2部分(由Sino Biological提供)产生的抗S2抗体标记后，仅在感染ReoV+S21P2(2)的样品中才确认了具有明显免疫反应性的蛋白质带(如箭头所示)。
这些结果表明携带SARS-CoV-2线性B细胞表位的重组呼肠孤病毒可以诱导针对该表位的特异性免疫应答。
实施例7.重组呼肠孤病毒稳定性的验证
图7a代表重组呼肠孤病毒ReoV+S21P2(1)和ReoV+OVA257-264的重组σ1蛋白构型的构建体设计。
每个表位被设计为分别在N末端和C末端包含Myc和FLAG标签，以验证引入表位的稳定表达。
将BHK21细胞用重组呼肠孤病毒感染48小时并通过蛋白质印迹分析进行分析，并且用呼肠孤病毒特异性抗体(上)和针对重组呼肠孤病毒中FLAG标签的特异性抗体(下)二者进行检测。使用识别GAPDH的抗体(抗GAPDH)作为上样对照。
结果，如图7b所示，证实了通过FLAG标签检测到高浓度的抗原，并且发现即使在传代五次之后，也可以稳定地表达高浓度的抗原，而引入的表位中没有突变。
上述对本发明的描述是为了说明的目的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，本发明可以容易地修改为其它具体形式而不改变其技术思想或本质特征。因此，上述实施例应当被理解为在所有方面都是说明性的而不是限制性的。
[工业实用性]
当抗原蛋白的表位被引入根据本发明的减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的截短位点时，预期其可用作用于癌症或感染性疾病的疫苗组合物。因此，本发明具有工业实用性。
序列表
<110> 百洛克株式会社（Virocure Inc.）
<120> 基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物及其用途
<130> MPO23-055CN
<150> KR 10-2021-0037160
<151> 2021-03-23
<150> KR 10-2022-0035224
<151> 2022-03-22
<160> 34
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RP116 σ-1蛋白
<400> 1
Met Asp Pro Arg Leu Arg Glu Glu Val Val Arg Leu Ile Ile Ala Leu
1 5 10 15
Thr Ser Asp Asn Gly Val Ser Leu Ser Lys Gly Leu Glu Ser Arg Val
20 25 30
Ser Ala Leu Glu Lys Thr Ser Gln Ile His Ser Asp Thr Ile Leu Arg
35 40 45
Ile Thr Gln Gly Leu Asp Asp Ala Asn Lys Arg Ile Ile Ala Leu Glu
50 55 60
Gln Ser Arg Asp Asp Leu Val Ala Ser Val Ser Asp Ala Gln Leu Ala
65 70 75 80
Ile Ser Arg Leu Glu Ser Ser Ile Gly Ala Leu Gln Thr Val Val Asn
85 90 95
Gly Leu Asp Ser Ser Val Thr Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly Gln Leu
100 105 110
Glu Thr Gly Leu Ala Glu Leu Arg Val Asp His Asp Asn Leu Val Ala
115 120 125
Arg Val Asp Thr Ala Glu Arg Asn Ile Gly Ser Leu Thr Thr Glu Leu
130 135 140
Ser Thr Leu Thr Leu Arg Val Thr Ser Ile Gln Ala Asp Phe Glu Ser
145 150 155 160
Arg Ile Ser Thr Leu Glu Arg Thr Ala Val Thr Ser Ala Gly Ala Pro
165 170 175
Leu Ser Ile Arg Asn Asn Arg Met Thr Met Gly Leu Asn Asp Gly Leu
180 185 190
Xaa Leu Ser Gly Asn Asn Leu Ala Ile Arg Leu Pro Gly Asn Thr Gly
195 200 205
Leu Asn Ile Gln Asn Gly Gly Leu Gln Phe Arg Phe Asn Thr Asp Gln
210 215 220
Phe Gln Ile Val Asn Asn Asn Leu Thr Leu Lys Thr Thr Val Phe Asp
225 230 235 240
Ser Ile Asn Ser Arg Xaa Gly Ala Xaa Glu
245 250
<210> 2
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RP116 σ-1基因
<400> 2
gctattggtc ggatggatcc tcgcctacgt gaagaagtag tacggctgat aatcgcatta 60
acgagtgata atggagtatc actgtcaaaa gggcttgaat caagggtctc ggcgctcgag 120
aagacgtctc aaatacactc tgatactatc ctccggatca cccagggact cgatgatgca 180
aacaaacgaa tcatcgctct tgagcaaagt cgggatgact tggttgcatc agtcagtgat 240
gctcaacttg caatctccag attggaaagc tctatcggag ccctccaaac agttgtcaat 300
ggacttgatt cgagtgttac ccagttgggt gctcgagtgg gacaacttga gacaggactt 360
gcagagctac gcgttgatca cgacaatctc gttgcgagag tggatactgc agaacgtaac 420
attggatcat tgaccactga gctatcaact ctgacgttac gagtaacatc catacaagcg 480
gatttcgaat ctaggatatc cacattagag cgcacggcgg tcactagcgc gggagctccc 540
ctctcaatcc gtaataaccg tatgaccatg ggattaaatg atggactcay gttgtcaggg 600
aataatctcg ccatccgatt gccaggaaat acgggtctga atattcaaaa tggtggactt 660
cagtttcgat ttaatactga tcaattccag atagttaata ataacttgac tctcaagacg 720
actgtgtttg attctatcaa ctcaaggaba ggcgcaaytg agtaaagtkm cgtggcgtcg 780
gcagtgactc ccttgagatt aaacagtagc acgaaggtgc tggatatgct aatagacagt 840
tcaacacttg aaattaattc tagtggacag ctaactgtta gatcgacatc cccgaatttg 900
aggtatccga tagctgatgt tagcggcggt atcggaatga gtccaaatta taggtttagg 960
cagagcatgt ggataggaat tgtctcctat tctggtagtg ggctgaattg gagggtacag 1020
gtgaactccg acatttttat tgtagatgat tacatacata tatgtcttcc agcttttgac 1080
ggtttctcta tagctgacgg tggagatcta tcgttgaact ttgttaccgg attgttacca 1140
ccgttactta caggagacac tgagcccgct tttcataatg acgtggtcac atatggagca 1200
cagactgtag ctatagggtt gtcgtcgggt ggtgcgcctc agtatatgag taagaatctg 1260
tgggtggagc agtggcagga tggagtactt cggttacgtg ttgagggggg tggctcaatt 1320
acgcactcaa acagtaagtg gcctgccatg accgtttcgt acccgcgtag tttcacgtga 1380
ggatcagacc accccgcggc actggggcat ttcatc 1416
<210> 3
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RBD氨基酸序列
<400> 3
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
1 5 10 15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
20 25 30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
35 40 45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
50 55 60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65 70 75 80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
85 90 95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
100 105 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
115 120 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
130 135 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
165 170 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
180 185 190
Thr Val
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OVA257-264氨基酸序列
<400> 4
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OVA323-339氨基酸序列
<400> 5
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Adpgk氨基酸序列
<400> 6
Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rpl18氨基酸序列
<400> 7
Lys Ile Leu Thr Phe Asp Arg Leu
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P15E氨基酸序列
<400> 8
Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu
1 5
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S21P2(1)氨基酸序列
<400> 9
Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn
1 5 10 15
Lys Val
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S21P2(2)氨基酸序列
<400> 10
Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn
1 5 10 15
Lys Val
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> c-Myc标签
<400> 12
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG标签
<400> 13
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 14
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OVA257-264构建体氨基酸序列
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Asp Leu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile
35 40 45
Ile Asn Phe Glu Lys Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
50 55 60
<210> 15
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OVA323-339构建体氨基酸序列
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Asp Leu Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile
20 25 30
Asn Glu Ala Gly Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
35 40 45
<210> 16
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Adpgk构建体氨基酸序列
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Asp Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
50 55 60
Lys
65
<210> 17
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rpl18构建体氨基酸序列
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Asp Leu Lys Ile Leu Thr Phe Asp Arg Leu Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Lys Ile Leu Thr Phe Asp Arg Leu Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ile
35 40 45
Leu Thr Phe Asp Arg Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
50 55 60
<210> 18
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P15E构建体氨基酸序列
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Asp Leu Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ser
35 40 45
Pro Trp Phe Thr Thr Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
50 55 60
<210> 19
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S21P2(1)构建体氨基酸序列
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Asp Leu Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp
20 25 30
Leu Leu Phe Asn Lys Val Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
35 40 45
<210> 20
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S21P2(2)构建体氨基酸序列
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Asp Leu Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp
20 25 30
Leu Leu Phe Asn Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Lys Pro Ser
35 40 45
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Asp Tyr Lys
50 55 60
Asp Asp Asp Asp Lys
65
<210> 21
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RBD密码子优化的构建体DNA序列
<400> 21
aatatcacta acttgtgtcc gttcggcgag gtttttaatg cgaccaggtt tgcttccgtg 60
tacgcctgga acaggaaacg gatctccaat tgtgtcgccg attactccgt cttgtataat 120
tcagcatctt tcagcacgtt taaatgttac ggagtttccc ccacaaaatt gaatgacctt 180
tgctttacga acgtctacgc ggattcattt gtaatccggg gggacgaagt taggcaaatt 240
gcgccagggc agactggcaa gatagctgac tataattata aattgccgga tgactttacg 300
ggctgtgtga ttgcttggaa ctcaaataat ctggactcaa aggtaggggg aaattataac 360
tacctttaca ggctgttccg gaagagtaat ctgaagccat tcgaaagaga tataagtaca 420
gagatctacc aagctggaag caccccctgc aatggtgttg aaggattcaa ttgttatttc 480
ccattgcaat cctatggttt tcaaccgacg aatggggtgg gataccaacc atatcgagtt 540
gtggttctca gtttcgagtt gcttcatgct cctgcgacag tatgtggacc aaaaaaatct 600
actaatctgg tgaagaataa atgcgtcaat ttttaa 636
<210> 22
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OVA257-264密码子优化的构建体DNA序列
<400> 22
ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60
agtattataa acttcgagaa gctgggtggg ggaggaagtt caatcattaa ttttgaaaaa 120
cttggaggag gtggatcttc cataattaat tttgaaaagc tggattataa ggatgacgac 180
gataagtga 189
<210> 23
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OVA323-339密码子优化的构建体DNA序列
<400> 23
ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60
atttcacagg ctgtgcatgc tgcacatgct gaaattaatg aggctggacg tgattataag 120
gatgacgacg ataagtga 138
<210> 24
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adpgk密码子优化的构建体DNA序列
<400> 24
ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60
gctagcatga cgaacatgga gctaatggga gggggcggaa gtgcttctat gactaatatg 120
gaactgatgg gaggtggagg ttctgcttca atgaccaaca tggaacttat ggattataag 180
gatgacgacg ataagtga 198
<210> 25
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rpl18密码子优化的构建体DNA序列
<400> 25
ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60
aagattctga cgtttgatcg tctggggggt ggcggatcta agatattgac gttcgatcga 120
ctgggaggag gtggctctaa gatcctaaca ttcgaccgtc tagattataa ggatgacgac 180
gataagtga 189
<210> 26
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P15E密码子优化的构建体DNA序列
<400> 26
ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60
aagtcacctt ggtttactac tctcggtggg ggaggaagta aatcgccatg gtttactaca 120
ttgggaggag gtgggtctaa gtcaccatgg ttcacgacat tggattataa ggatgacgac 180
gataagtga 189
<210> 27
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S21P2(1)密码子优化的构建体DNA序列
<400> 27
ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60
cctagtaagc cttctaagcg cagcttcata gaagatttgt tgttcaataa ggtagattat 120
aaggatgacg acgataagtg a 141
<210> 28
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S21P2(2)密码子优化的构建体DNA序列
<400> 28
ggaggtggag gctcaggtgg cggaggttct gagcagaagt tgatttcaga ggaagatctg 60
cctagtaagc cttctaagcg cagcttcata gaagatttgt tgttcaataa ggtaggtggg 120
ggaggaagtc catcgaagcc aagtaagcgt agtttcattg aggacctcct cttcaacaag 180
gttgattata aggatgacga cgataagtga 210
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S1正向
<400> 29
cacccaggga ctcgatgatg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S1反向
<400> 30
gcacccaact gggtaacact 20
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RBD正向
<400> 31
caactgagca aagttacgtg agggtacaac ctacggaatc 40
<210> 32
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RBD反向
<400> 32
atgaaatgcc ccagtgccgc ggggtggtct gacctcaaaa attgacgcat ttattcttca 60
c 61
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S1-250-AvrII-正
<400> 33
gattctatca actcaaggat aggcgcaatt gagcctagg 39
<210> 34
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pBacT7-SacII-反
<400> 34
cagtgccgcg gggtggtctg atcctcacgt gaaactacgc gggta 45

Claims (19)

1.一种多肽，包含减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的氨基酸序列；和引起癌症或感染性疾病的抗原的表位的氨基酸序列，
其中所述多肽包含在从N末端起第251个氨基酸位置截短的所述减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的第1至第250位氨基酸序列；和
插入所述减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的氨基酸序列的N末端第251位及以后的氨基酸位置的引起癌症或感染性疾病的抗原的表位的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白由SEQ ID NO:2所示的碱基序列编码。
4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述表位在所述减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的羧基末端形成或构成融合蛋白。
5.根据权利要求1所述的多肽，其在所述表位的氨基酸序列之前和之后还包含选自由接头(SEQ ID NO:11)、Myc蛋白(SEQ ID NO:12)、FLAG蛋白(SEQ ID NO:13)和2A肽组成的组中的一个或多个氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的多肽，其中所述癌症是选自由以下组成的组中的一种或多种：肝癌、神经胶质瘤、肉瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、胆管癌、胰腺癌、宫颈癌、皮肤癌、淋巴瘤、甲状腺癌、骨髓癌、子宫内膜癌、肾癌、直肠癌和脑肿瘤。
7.根据权利要求1所述的多肽，其中所述感染性疾病是选自由以下组成的组中的一种或多种：冠状病毒病19(COVID-19)、丙型肝炎、流感、人类免疫缺陷病毒(HIV)诱导的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、结核病、严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)、轮状病毒引起的婴儿肠炎和诺如病毒引起的非细菌性急性胃肠炎。
8.根据权利要求1所述的多肽，其中所述表位的氨基酸序列是选自由SEQ ID NO:3至10组成的组中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的多肽，其中编码所述表位的碱基序列在从编码所述减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的碱基序列的5’端起的第763至1416位处替换或插入。
10.根据权利要求1所述的多肽，其中所述表位通过在宿主中产生中和抗体或诱导细胞介导的免疫来诱导免疫应答。
11.根据权利要求1所述的多肽，其中所述表位选自由CD4+T细胞表位、CD8+T细胞表位和B细胞表位组成的组。
12.一种基于减毒呼肠孤病毒的病毒载体，包含编码权利要求1至11中任一项所述的多肽的多核苷酸。
13.一种基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物，包含权利要求1至11中任一项所述的多肽、编码所述多肽的多核苷酸、或权利要求12所述的病毒载体作为活性成分。
14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物用于预防或治疗癌症或感染性疾病。
15.一种制备基于减毒呼肠孤病毒的疫苗组合物的方法，包括以下步骤：
a)制备包含编码由SEQ ID NO:1所示的减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白的碱基序列的反向遗传学病毒载体；和
b)将多核苷酸引入所述载体中，其中所述多核苷酸编码减毒呼肠孤病毒σ-1蛋白和引起癌症或感染性疾病的抗原的表位，其通过在编码所述σ-1蛋白的碱基序列的第763至1416位处替换或插入碱基从而包含编码所述引起癌症或感染性疾病的抗原的表位的碱基序列，而表达为融合蛋白。
16.根据权利要求15所述的方法，还包括以下步骤：
c)在选自由BHK21、L929、HEK293、CHO、PER.C6、HeLa和Vero细胞组成的组中的一种或多种细胞中产生并增殖来自步骤b)的包含所述多核苷酸的所述基于减毒呼肠孤病毒的载体。
17.一种用于预防或治疗癌症或感染性疾病的方法，包括将权利要求13所述的疫苗组合物施用于有此需要的受试者的步骤。
18.根据权利要求13所述的疫苗组合物用于预防或治疗癌症或感染性疾病的用途。
19.根据权利要求1所述的多肽、编码所述多肽的多核苷酸、或包含所述多核苷酸的病毒载体在制备用于预防或治疗癌症或感染性疾病的疫苗中的用途。
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