RU2743594C1 - Пептидные иммуногены, используемые в качестве компонентов вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19 - Google Patents
Пептидные иммуногены, используемые в качестве компонентов вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2743594C1 RU2743594C1 RU2020140742A RU2020140742A RU2743594C1 RU 2743594 C1 RU2743594 C1 RU 2743594C1 RU 2020140742 A RU2020140742 A RU 2020140742A RU 2020140742 A RU2020140742 A RU 2020140742A RU 2743594 C1 RU2743594 C1 RU 2743594C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- coronavirus
- sars
- peptide
- cov
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 title claims abstract description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 42
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 claims description 23
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 claims description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 15
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 12
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims description 8
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 claims description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 23
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 19
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 14
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 14
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 5
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 4
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 206010003757 Atypical pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 241001461743 Deltacoronavirus Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 2
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 2
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 206010056342 Pulmonary mass Diseases 0.000 description 2
- 206010062106 Respiratory tract infection viral Diseases 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 108010028403 hemagglutinin esterase Proteins 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 2
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 2
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 2
- FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000004176 Alphacoronavirus Species 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010003598 Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 240000001284 Euphorbia milii Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 1
- 241001109669 Human coronavirus HKU1 Species 0.000 description 1
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 description 1
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- 101150028955 MBP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150001779 ORF1a gene Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 208000007123 Pulmonary Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 229940124680 SARS vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108091005774 SARS-CoV-2 proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 241000711517 Torovirus Species 0.000 description 1
- 241000711508 Turkey coronavirus Species 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002593 anti-atelectatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000002134 immunopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150011498 lad gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012768 mass vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описаны пептидные иммуногены: первый пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 2); второй пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 3). Техническим результатом изобретения является получение таких пептидных иммуногенов, которые несут минимально необходимые антигенные детерминанты для формирования специфического иммунного ответа и индуцируют протективный иммунитет против COVID-19. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 7 пр.
Description
Изобретение относится к разработке профилактических противовирусных препаратов, а именно к получению вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, и может быть использовано для профилактики этого заболевания.
Общая характеристика коронавирусной инфекции COVID-19
Коронавирус человека был впервые выделен D. Tyrrell и М. Bynoe в 1965 г. от больного острым респираторным заболеванием (ОРВЗ), им удалось культивировать человеческий коронавирус на клетках трахеи [1]. Однако первое упоминание о коронавирусе, выделенном у цыплят, больных бронхитом, относится к 1937 г.
Свое название коронавирусы получили в 1968 году благодаря сходству выростов (пепломеры) с corona spinarum - терновым венцом вокруг головы святого на средневековых религиозных картинах [2]. Поскольку многие коронавирусы плохо размножаются в культуре клеток, то долгое время молекулярно-биологические исследования их репликации отставали от аналогичных исследований других вирусов и в течение многих лет впервые обнаруживаемые вирусы относили к группе коронавирусов только по их характерной морфологии [3]. Лишь в 1983 году были установлены характерные биохимические особенности, идентифицированы классы мРНК, их нуклеотидные последовательности, а также структурные белки [4, 5].
После открытия в 1965 году коронавирусы почти не привлекали внимание исследователей, поскольку выделенные штаммы 229Е и ОС43 вызывали относительно легкие заболевания. Врачи лечили их как обычную простуду, пока в Китае в 2002 - 2003 годах не была зафиксирована вспышка атипичной пневмонии, или тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС, SARS). Заболевание зарегистрировано в 32 странах, наибольшее количество в Китае, Сингапуре, Канаде. Всего заболело 8273 человека, а 775 умерло (летальность 9,6%).
17 марта 2003 года ВОЗ была объявлена «глобальная тревога» в связи с распространением «атипичной пневмонии». Были привлечены 13 лабораторий из 9 стран для проведения объединенных исследований этого заболевания. В качестве приоритетных задач ставилось определение этиологического агента, и затем на основании этого - разработка диагностических тест систем. В результате тесного сотрудничества ученых из лабораторий разных стран первая часть поставленной задачи была выполнена поразительно быстро. 16 апреля 2003 года ВОЗ было объявлено, что этиологическим агентом "атипичной пневмонии" является новый патоген, вирус SARS, относящийся к семейству коронавирусов, но не родственный ни одному из известных штаммов этого вируса [6]. С тех пор обнаружилось еще два коронавируса, которые тоже вызывают простуду - NL63 и HKU1. В 2012 году - почти через 50 лет после его открытия - был окончательно секвенирован полный геном штамма 229Е.
В 2012 году были зарегистрированы первые случаи заболевания, вызванного коронавирусом. Заболевание в дальнейшем получило название ближневосточного респираторного синдрома (MERS), возбудителем которого являлся коронавирус MERS-CoV [7]. В 2015 году в Южной Корее произошла вспышка ближневосточного респираторного синдрома, в ходе которой заболело 183 человека, умерло 33.
В декабре 2019 года несколько медицинских учреждений в китайском городе Ухань (провинция Хубэй) сообщили о пациентах с пневмонией [8]; клинические проявления напоминали симптомы тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), заболевания, появившегося в 2002 году в соседнем районе - провинции Гуандун, вызванного коронавирусом SARS-CoV [9, 10]. 7 января 2020 г. был выделен новый штамм коронавируса, названный SARS-CoV-2, который вызывает коронавирусную болезнь 2019 года COVID-19. Полный геном SARS-CoV-2 уже достаточно изучен, его первая широкая публикация китайскими органами здравоохранения была сделана вскоре после обнаружения вируса, что облегчило процесс диагностики и идентификации возбудителя инфекции.
SARS-CoV-2 - одноцепочечный РНК-содержащий вирус, относится к семейству Coronaviridae, группе 2b бета-коронавирусов, который имеет по меньшей мере 70% сходство в генетической последовательности с SARS-CoV, его размер составляет около 100 нм [11].
Все известные коронавирусы (CoV) делятся на четыре рода, включая α-, β-, γ-, и δ-CoV. Представители первых двух родов способны инфицировать млекопитающих, тогда как γ- и δ-CoV инфицируют преимущественно птиц. Ранее было известно о шести коронавирусах, которые способны инфицировать человека. Это HCoV-229E и HCoV-NL63 (оба α-CoV), HCoV-HKU1 и HCoV-OC43 (оба β-CoV), - они вызывают легкие респираторные симптомы, сходные с простудой [12] Два других β-коронавируса, SARS-CoV и MERS-CoV, приводят к тяжелым и потенциально смертельным инфекциям дыхательных путей человека [13-16]. Несмотря на тщательное изучение коронавирусов после вспышки ТОРС, пока не совсем ясно, почему три из них - SARS-CoV-1, MERS-CoV и SARS-CoV-2 (источник пандемии COVID-19) - вызывают более тяжелые симптомы и приводят к более высокому уровню смертности, в то время как другие известные четыре коронавируса человека гораздо слабее.
Классификация инфекционного агента
В состав семейства Коронавирусов входят род Коронавирусы и род Торовирусы. Род Коронавирусы объединяет большие, оболочечные, позитивные одноцепочечные РНК-содержащие вирусы, которые вызывают широко распространенные заболевания человека и животных. Его представители могут быть выделены в три серологические подгруппы.
Серотипы и хозяева коронавирусов:
Как и другие респираторные вирусные инфекции, возбудитель COVID-19 в основном распространяется воздушно-капельным путем, через аэрозоли, а также через загрязненные предметы и прямой контакт [12, 16].
Коронавирусы обладают широким тропизмом и могут поражать помимо дыхательных путей печень, почки, кишечник, нервную систему, сердце и глаза [13-15, 17, 18]. Типичная коронавирусная инфекция клинически проявляется гриппоподобным синдромом и/или кишечными расстройствами. При коронавирусной инфекции поражается альвеолярный эпителий. Коронавирусы, обладая способностью к индукции апоптоза, вызывают некроз пораженных тканей, а у пациентов после выздоровления остаются фиброзные рубцы в легких. Коронавирусы, индуцируя слияние клеток, оказывают сильное воздействие на проницаемость клеток, что приводит к нарушению водно-солевого баланса и транспорта белков. Вероятно, в этих условиях развиваются недостаточность сурфактанта (антиателектатический фактор), что приводит к коллапсу альвеол, и легочному дистресс-синдрому. Наиболее опасным свойством коронавирусов является их способность поражать макрофаги. Вероятнее всего, заболевание в особо тяжелой форме развивается на фоне блокирования основных звеньев иммунного ответа [16, 17, 19, 20].
Коронавирусы домашних и лабораторных животных вызывают инфекционный бронхит птиц, гепатит мышей, пневмонии у крыс, гастроэнтериты и энцефаломиелиты у свиней, часто заканчивающихся у животных смертельным исходом, что приводит к большим экономическим потерям [14].
Постановлением Главного санитарного врача РФ вирус SARS-CoV-2, как и некоторые другие представители этого семейства (вирусы SARS-CoV, MERS-CoV), отнесен ко II группе патогенности (патогенные биологические агенты, в отношении которых известны случаи летальных исходов заболевания и/или имеются сведения о высоком эпидемическом потенциале). SARS-CoV-2 включен в перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих [18, 21].
Случаи заболевания COVID-19 зарегистрированы в большинстве стран мира на всех континентах. 30 января ВОЗ признала вспышку нового коронавируса глобальной чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение [12-14, 19, 20, 21]. 11 марта 2020 года Президент ВОЗ объявил COVID-19 глобальной пандемией, впервые назвав пандемией инфекционный процесс после пандемии гриппа H1N1 в 2009 году [12, 15, 19, 22].
Самый надежный способ остановить пандемию - массовая вакцинация. Разработка вакцины является критически важной задачей для системы здравоохранения. Именно поэтому работу по созданию вакцины для профилактики коронавирусной инфекции (COVID-19) ведут более 80 компаний по всему миру. По данным ВОЗ на 9 сентября 2020 года на стадии доклинических исследований находились 145 вакцин, 12 из них разрабатывались с использованием пептидов в качестве действующего начала вакцины. Клинические исследования проводились для 35 вакцин, среди них только одна из них была разработана на пептидной платформе [23].
Известен изолированный полипептид вируса SARS и вакцина для профилактики тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) на его основе, содержащая инактивированный вирус SARS, убитый вирус SARS, ослабленный вирус SARS, препарат расщепленного вируса SARS или по крайней мере один очищенный антиген вируса SARS (заявка США №20060257852, МПК С07К14/165, опубл. 16.11.2006 г. ) [24]. Полипептид представляет собой полипептид Spike (S), полипептид Env (Е), полипептид мембраны (М), полипептид гемагглютинин-эстеразы (НЕ), полипептид нуклеокапсида (N), полипептид ORF1a, полипептид ORF1ab, протеолитический фрагмент полипептида ORF1a или протеолитический фрагмент полипептида ORF1ab. Антиген представляет собой очищенный инактивированный антиген вируса SARS в форме вирусоподобной частицы (VLP) и содержит адъювант в виде соли алюминия или MF59. Антигены выбраны из S, Е, N и М. Инактивация антигена включает обработку вируса эффективным количеством одного или нескольких из следующих агентов, выбранных из группы, состоящей из детергентов, формальдегида, формалина, β-проприолактона и УФ-излучения.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является вакцинная композиция для стимулирования иммунного ответа в отношении MERS-CoV (международная заявка № WO 2015042373, МПК А61К 39/215, опубл. 26.03.2015 г. ). Вакцинная композиция содержит (i) эффективное количество наночастиц MERS-CoV, где наночастица содержит по меньшей мере один тример полипептида Spike, и (ii) адъювант на основе сапонина, где адъювант на основе сапонина состоит из Matrix M1. Наночастица содержит по меньшей мере от приблизительно пяти тримеров до приблизительно 30 тримеров полипептида Spike. Концентрация наночастицы составляет по меньшей мере от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 60 мкг/мл. Авторами была показана иммуногенность вакцинных композиций на основе белка S и наличие вируснейтрализующих антител в сыворотках вакцинированных животных. Полноразмерный белок S представляет широкий набор высокоиммуногенных эпитопов, индуцирующий формирование широкого спектра антител.
Однако, в исследованиях выше указанных кандидатных вакцин против коронавирусов (SARS и MERS) был отмечен риск развития антителозависимого усиления (ADE) инфекции [26, 27].
Следовательно, разработка вакцины на основе синтетических пептидов, нацеленных на белок S SARS-CoV-2, может дать более безопасную и эффективную вакцину. Также для аналогов и прототипа не показана способность индуцировать иммунный ответ, способный оказывать защитное действия против нового вируса SARS-CoV-2.
Техническим результатом изобретения является получение таких пептидных иммуногенов и вакцинных композиций, которые несут минимально необходимые антигенные детерминанты для формирования специфического иммунного ответа у кроликов, хорьков и хомяков и индуцируют протективный иммунитет против Covid-19.
Указанный технический результат достигается тем, что получен первый пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью CRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS (SEQ ID NO: 1), содержащей антигенные Т и В-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.
Указанный технический результат достигается тем, что получен второй пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью CKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQE (SEQ ID NO: 2), содержащей антигенные T и В-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.
Указанный технический результат достигается тем, что получен третий пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью CKNLNESLIDLQELGKYEQYIK (SEQ ID NO: 3), содержащей антигенные Т и В-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.
Указанный технический результат достигается тем, что получен химерный рекомбинантный белок MBP-6xHis-N_nCoV-2019, включающий N белок коронавируса SARS Cov-2, используемый в качестве белка-носителя в вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19 и характеризующийся аминокислотной последовательностью:
Указанный технический результат достигается также тем, что получена вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующаяся тем, что содержит пептидные иммуногены по п.п. 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 1), (SEQ ID NO: 2) и (SEQ ID NO: 3) соответственно и ковалентно связанные в виде конъюгатов с белком-носителем как в смеси, так и по отдельности, причем смесь вышеуказанных конъюгатов пептидных иммуногенов и белка-носителя сорбирована на фармацевтически приемлемый адъювант.
Конъюгаты пептидных иммуногенов с белком-носителем взяты в равных соотношениях между собой и белком - носителем. В качестве белка-носителя вакцинная композиция содержит химерный рекомбинантный белок-носитель, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 4). В качестве адъюванта вакцинная композиция содержит гидроокись алюминия в количестве 0,2-2,0 мг/мл.
Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлены аминокислотные последовательности трех пептидных иммуногенов. На фиг. 2 приведена аминокислотная последовательность химерного белка «MBP-6xHis-N_nCoV-2019» (SEQ ID NO: 4). На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность гена химерного белка «МВР-6xHis-N_nCoV-2019» (SEQ ID NO: 5). На фиг. 4 изображена генетическая и физическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК «pMBP-6xHis-N_nCoV-2019». На фиг. 5 представлена электрофореграмма рестрикционного анализа рекомбинантной плазмидной ДНК «pMBP-6xHis-N_nCoV-2019» в 1.5% агарозном геле.
Пример 1. Получение и структура пептидных иммуногенов.
При разработке вакцины, используя литературные данные о Т- и IB-клеточных эпитопах белка S нового коронавируса SARS Cov-2, были спроектированы структуры 3 пептидов - аналогов иммуногенных Т и В-клеточных эпитопов белка S нового коронавируса SARS Cov-2, которые затем были синтезированы (фиг. 1). Последовательность этих синтетических пептидов, моделирующих функционально значимые участки белка S нового коронавируса SARS Cov-2, были спроектированы таким образом, чтобы исключить присутствие элементов, ответственных за развитие иммунопатологического состояния, но сохранить способность индуцировать образование защитных антител и обеспечить защиту организма от развития COVID-19. Синтетические пептиды имеют размер от 22 до 25 аминокислотных остатков и аналогичны Т и В-клеточным эпитопам белка S нового коронавируса SARS Cov-2.
Синтез спроектированных аминокислотных последовательностей проводится с использованием стандартного оборудования и методик твердофазного пептидного синтеза и может быть проведен с использованием любых других методик синтеза аминокислотных последовательностей, например, таких как жидкофазный пептидный синтез, синтез с использованием генетически модифицированных микроорганизмов (технологии получения рекомбинантных белков), фрагментирование нативного белка с последующим выделением соответствующих фрагментов.
Ниже приведены структуры синтезированных пептидов.
Пример 2. Получение химерного рекомбинантного белка-носителя.
Белок-носитель является продуктом экспрессии гена химерного белка «MBP-6xHis-N_nCoV-2019», характеризующийся последовательностью (SEQ ID NO: 5) в прокариотической системе. Акцепторный плазмидный вектор pMBP-6xHis получен путем направленного клонирования в вектор рТ7 фрагмента гена MBP E.coli, амплифицированного из генома E.coli с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Клонирование проведено по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции Ndel-BamHI, где за счет обратного праймера в открытую рамку считывания МВР добавлена нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотный линкер, сайт протеолитического расщепления фактора Ха и 6xHis-метка, необходимая для проведения металл-хелатной аффинной хроматографии. Вектор рТ7 получен посредством направленного клонирования химически синтезированного фрагмента ДНК, кодирующего ген Lad, необходимого для контроля экспрессии за счет включения лактозного оператора LacO в транскрипционную кассету целевого гена, гена гор необходимого для контроля копийности плазмидной ДНК в бактериальной клетке, а также структурных элементов, обеспечивающих экспрессию целевого гена: модифицированного промотора бактериофага Т7 РТ7/O (Т. Giordano et al., 1989 г.), сайт связывания рибосом гена 10 бактериофага Т7 (Olins and Rangwala, 1989 г.) и терминатора транскрипции ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7. Плазмидный вектор кодирует ген устойчивости к β-лактамным антибиотикам (β-лактамаза), а также ориджин репликации бактериофага F1.
Экспрессирующий вектор pMBP-6xHis-N_nCoV-2019 получен посредством направленного клонирования ампликона гена N_nCoV-2019 по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail. Открытая рамка считывания гена химерного белка «MBP-6xHis-N_nCoV-2019» представлена лидирующей последовательностью мальтоза-связывающего белка МВР E.coli, аминокислотного линкера, сайта протеолитического расщепления фактора Ха, 6xHis-MeTKH для проведения металл-хелатной аффинной хроматографии, и последовательностью гена N коронавируса SARS-CoV-2 (nCoV-2019). Нуклеотидная последовательность гена химерного белка «MBP-6xHis-N_nCoV-2019» представлена на фиг. 3, а на фиг. 2 - ааминокислотная последовательность химерного белка «MBP-6xHis-N_nCoV-2019». Нуклеотидная вставка в вектор pMBP-6xHis осуществлена таким образом, что ген «MBP-6xHis-N_nCoV-2019» находится под контролем модифицированного промотора бактериофага Т7 РТ7/O, старт-кодон (ATG) расположен на оптимальном расстоянии от сайта связывания рибосом гена 10 бактериофага Т7. Дополнительный лактозный оператор (LacO) позволяет контролировать уровень экспрессии целевого гена при коэкспрессии Lad. Для идентификации клонируемой последовательности используется метод определения первичной последовательности ДНК на автоматическом секвенаторе. Клонируемый фрагмент ДНК фланкирован сайтами рестрикции - BamHI-SalI. Клонируемый фрагмент ДНК содержит открытую рамку считывания гена N коронавируса SARS-CoV-2 (nCoV-2019). Положение клонируемого гена внутри кассеты, а также положение регуляторных элементов отображено на фиг. 4 - физической и генетической карте рекомбинантной плазмидной ДНК «pMBP-6xHis-N_nCoV-2019». Способ введения конструкции в прокариотической системе - трансформация клеток Escherichia coli плазмидой. Селективный маркер - ген устойчивости к Р-лактамным антибиотикам (β-лактамаза).
Основные генетические элементы, содержащиеся в структуре плазмидной ДНК:
РТ7Ю promoter - модифицированный промотор бактериофага Т7 РТ7/O (21-64 п.н.)
Lac operator - лактозный оператор (40-64 п.н.)
RBS [bacteriophage Т7 gene 10] - сайта связывания рибосом гена 10 бактериофага Т7 (79-101 п.н.)
МВР - мальтоза-связывающий белок МВР Е. coli (109-1209 п.н.)
Factor Ха site - сайт протеолитического расщепления фактора Ха (1258-1269 п.н.)
6xHis - 6-гистидиновая аффинная метка (1282-1299 п.н.)
N - последовательность гена N коронавируса SARS-CoV-2 (nCoV-2019) (1309-2562 п.н.)
Т7 terminator - терминатор транскрипции ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7 (2653-2700 п.н.)
Ori - ориджин репликации pBR322/pUC (4355-4943 п.н.)
AmpR - ген β-лактамазы (устойчивость к ампициллину) (3324-4184 п.н.)
LacI - ген репрессора LacI (6376-7455 п.н.)
Карта (электрофореграмма) рестрикционного анализа рекомбинантной плазмидной ДНК «pMBP-6xHis-N_nCoV-2019» в 1.5% агарозном геле с использованием эндонуклеаз рестрикции XbaI, BglII, XhoI, HindIII, NcoI, AvaII представлена на фиг. 5.
Фрагменты ДНК, полученные после гидролиза рекомбинантной плазмиды «pMBP-6xHis-N_nCoV-2019» эндонуклеазами рестрикции XbaI, BglII, XhoI, HindIII, NcoI, AvaII (1-6 трек, соответственно).
Ниже представлены расчетные длины фрагментов ДНК, образующихся после гидролиза соответствующими эндонуклеазами рестрикции:
Далее рекомбинантный химерный белок-носитель MBP-6xHis-N_nCoV-2019, нарабатывают в прокариотической системе, биомассу осаждают центрифугированием, ресуспендируют в буфере 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0.5 мг/мл лизоцим, рН 8.0 и охлаждают до 2-5°С. Биомассу, полученную с 10 литров питательной среды ресуспендируют в 300 мл буфера. Затем клетки разрушают в ультразвуковом дезинтеграторе до полного осветления суспензии при температуре не выше 40°С. Полученный лизат охлаждают до 2-5°С, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 минут. К супернатанту добавляют насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 1:1 по объему и перемешивают взбалтыванием, после чего охлаждают при 4-8°С в течении 5-6 часов. Осадок отделяют центрифугированием при 12000 об/мин в течении 20 минут(температура 10°С), который затем растворяют в буфере: 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, рН 8.0 и охлаждают при 4-8°С в течение 1 часа. Объем буфера рассчитывается как половина объема лизата. Полученный раствор центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 минут при температуре 10°С. Супернатант хранят при температуре 4-8°С в течение 5 дней и используют для аффинной хроматографии.
Для аффинной хроматографии используют сорбент Ni-NTA-Superflow (QIAGEN) или его аналоги. Количество сорбента берется из расчета 100 мл на 1 грамм ожидаемого количества целевого белка. Используется колонка среднего давления с высотой столба не выше 30 см. Сорбент дегазируется, наносится в колонку и уравновешивается буфером: 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, рН 8.0. Осветленный центрифугированием супернатант лизата клеток пропускают через колонку со скоростью 2,5-4 мл/мин. Колонку промывают 5-кратным объемом буфера: 50 мМ NaH2PO4 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, рН 8.0, затем 40-кратным объемом буфера: 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 30 мМ имидазол, рН 8.0. Элюцию целевого белка проводят буфером: 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 300 мМ имидазол, рН 8.0. Элюцию контролируют по оптической плотности на длине волны 280 нм. Собирают одну фракцию первого пика, которую можно хранить до 5 дней при температуре 4-8°С.Полученная фракция содержит целевой продукт - химерный рекомбинантный белок-носитель MBP-6xHis-N_nCoV-2019. Расчетная молекулярная масса химерного рекомбинантного белка-носителя MBP-6xHis-N_nCoV-2019 составляет 89,2 кДа.
Поскольку химерный белок-носитель содержит Т-клеточные эпитопы SARS-CoV-2, то он не только повышает стабильность пептидных иммуногенов и участвует в формировании выраженного иммунного ответа, но и стимулирует специфический клеточный иммунный ответ.
Пример 3. Получение конъюгатов пептидных иммуногенов и белка-носителя, а также вакцинной композиции.
После синтеза пептидных иммуногенов осуществляют их конъюгирование с белком-носителем для повышения стабильности и формирования выраженного иммунного ответа.
В качестве белка-носителя в вариантах вакцины был использован рекомбинантный химерный белок, содержащий аминокислотную последовательность нуклеопротеина N нового коронавируса SARS-CoV-2, полученный по примеру 2. Кроме того, в качестве белков-носителей могут быть использованы такие белки как БСА (бычий сывороточный альбумин), KLH (keyhole limpet hemocyanin) - гемоцианин, овальбумин (альбумин яичного белка) или другие рекомбинантные белки.
Ковалентная связь между белком-носителем и пептидным иммуногеном может быть создана с использованием различных конъюгирующих агентов, например, таких как ГА (глутаровый альдегид), SMCC (Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), и многие другие.
Конъюгирование пептида с белком-носителем с помощью конъюгирующего агента Sulfo-SMCC проводят следующим образом: 20 мг белка-носителя растворяют в 2 мл дистиллированной воды. Непосредственно перед использованием готовят раствор Sulfo-SMCC с концентрацией 5 мг/мл. Добавляют 2 мл раствора Sulfo-SMCC. Инкубируют при комнатной температуре в течение 60 минут, или при температуре 37°С в течение 30 минут, периодически осторожно перемешивают. Для удаления избытка Sulfo-SMCC колонку 50 мл со смолой Sepharose CL4B уравновешивают 0,01 М фосфатно-солевым буферным раствором. Наносят на колонку активированный белок-носитель и собирают первый пик, при этом используют для детекции длину волны 280 нм.
Далее 20 мг пептида растворяют в 5 мл 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе. Немедленно смешивают пептид и активированный белок-носитель и инкубируют 2 часа при комнатной температуре. Для удаления избытка пептида колонку 50 мл с сорбентом Sepharose CL4B уравновешивают 0,01 М фосфатно-солевым буферным раствором. Наносят на колонку конъюгат пептида с белком-носителем и собирают первый пик, при этом используют для детекции длину волны 280 нм.
Для увеличения иммунного ответа используют адъювант.Существует множество известных адъювантов, включая адъювант Фрейнда (CFA or FCA), суспензии гидроксида алюминия, адъювант MF59 и др.
Полученные конъюгаты пептида и белка-носителя сорбируют на гидроксиде алюминия для получения готовой лекарственной формы в конечной концентрации (100-1000) мкг пептида в 1,0 мл препарата.
В качестве примера приведен следующий состав вакцинной композиции.
Вакцинная композиция: смесь пептидных иммуногенов, имеющих аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 1), (SEQ ID NO: 2) и (SEQ ID NO: 3) соответственно и ковалентно связанных в виде конъюгатов с химерным рекомбинантным белком-носителем MBP-6xHis-N_nCoV-2019, взятых в равных соотношениях и сорбированных на фармацевтически приемлемый адъювант гидроокись алюминия в количестве 1,0 мг/мл.
Пример 4. Исследование иммуногенности пептидных иммуногенов на кроликах.
Для получения иммунных сывороток используют лабораторных животных - кроликов породы Шиншилла с массой тела 2000-3000 г. Предварительно перед иммунизацией у кроликов берут пробу крови в объеме 1,0 мл из краевой вены уха и выделяют сыворотку для дальнейшего иммуноферментного анализа. Температура хранения сыворотки от минус 15°С до минус 25°С.
Каждый из 3 пептидов конъюгируют с белком-носителем гемоцианином и в смеси с неполным адьювантом Фрейнда двукратно с интервалом 7 дней подкожно вводят кроликам. Через 7 суток после второй иммунизации у кроликов берут пробу крови в объеме 1,0 мл из краевой вены уха. Из крови выделяют сыворотку для проведения иммуноферментного анализа. Сыворотки крови кроликов хранят при температуре от минус 15°С до минус 25°С.
Результаты определения титров специфических антител в сыворотках иммунных кроликов к соответсвующим пептидам и к рекомбинантному белку S представлены в Таблице 1.
Иммуноферментный анализ для определения титра антител к соответствующим антигенам проводят следующим образом:
В 96-ти луночный планшет вносят сорбционный буфер по 150 мкл в лунку. В качестве сорбционного буфера использовать 0,05 М карбонат-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,7) с добавлением соответствующего антигена с концентрацией 1 мкг/мл. Инкубируют 16 часов при комнатной температуре.
Перед нанесением испытуемых образцов сыворотки промывают иммуносорбент 0,01 М ФСБ-Т (рН 7,3-7,5). Вносят в планшет по 100 мкл разводящего буферного раствора для образца и в ряд «А» вносят образцы сывороток по 100 мкл и титруют с шагом 2. Инкубируют в термошейкере при температуре (37±2)°С, 700 об/мин в течение 45 минут.
По окончании инкубации содержимое лунок удаляют с помощью вошера и промывают 0,01 М ФСБ-Т. Вносят во все лунки по 100 мкл антивидового конъюгата и инкубируют в термошейкере при температуре (37±2)°С, 700 об/мин в течение 30 минут. По окончании инкубации содержимое лунок удаляют с помощью вошера и промывают 0,01 М ФСБ-Т. Вносят во все лунки по 100 мкл хромогенного субстрата (ТМБ) для окрашивания образовавшихся специфических АГ-АТ комплексов.
Инкубируют в темноте при комнатной температуре (24±5)°С в течение 20 минут. Вносят во все лунки по 50 мкл СТОП-реагента для прекращения реакции. Результаты ИФА регистрируют с помощью микропланшетного ридера, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм.
Титром антител считается максимальное разведение исследуемой сыворотки, при котором оптическая плотность раствора превышает ОПкрит.
Таким образом, двукратная иммунизация кроликов пептидными иммуногенами индуцирует у кроликов выработку антител к пептидным иммуногенам в диапазоне СГТ от 1:40637 до 1:129016 и к рекомбинантному белку S коронавируса SARS-CoV-2 (nCoV-2019) в диапазоне СГТ от 1:20319 до 1:40637.
Пример 5. Исследование иммуногенности пептидных иммуногенов и вакцинной композиции на мышах.
Для получения иммунных сывороток используют лабораторных животных - мышей ICR с массой тела 14-16 г. Предварительно перед иммунизацией у мышей берут пробу крови в объеме 100 мкл из ретроорбитального синуса и выделяют сыворотку для дальнейшего иммуноферментного анализа. Температура хранения сыворотки от минус 15°С до минус 25°С.
Каждый из 3 пептидов, конъюгируют с химерным рекомбинантным белком-носителем MBP-6xHis-N_nCoV-2019 по п. 4. Готовят вакцинную композицию, смешивая пептидные иммуногены в равных количествах в соответствии с п. 5 формулы изобретения. Пептидные иммуногены и вакцинную композицию сорбируют на адьювант гидроокись алюминия. Вакцинируют мышей подкожно двукратно с интервалом 14 дней. Через 14 дней после второй вакцинации из ретроорбитального синуса отбирают кровь в объеме 100 мкл. Из крови выделяют сыворотку для проведения иммуноферментного анализа. Сыворотки крови мышей хранят при температуре от минус 15°С до минус 25°С.
Результаты определения титров специфических антител в сыворотках иммунных мышей к соответствующим пептидным иммуногенам, вакцинной композиции и к рекомбинантному белку S коронавируса представлены в Таблице 2.
Иммуноферментный анализ для определения титра к соответсвующим антигенам проводят аналогично тому, как описано в примере 4.
Таким образом, двукратная иммунизация мышей пептидными иммуногенами и их вакцинными композициями индуцировало у мышей выработку антител к пептидным иммуногенам в диапазоне СГТ от 1:6400 до 1:11143 и к рекомбинантному белку S коронавируса SARS-CoV-2 (nCoV-2019) в диапазоне СГТ от 1:1600 до 1:2786.
Пример 6. Протективность вакцинной композиции на основе пептидных иммуногенов на хомяках.
Исследования протективности вакцинных композиций пептидных иммуногенов проводили после 2-кратной внутримышечной иммунизации хомяков с интервалом 14 суток дозой 200,0 мкг.На 28-е сутки после первой вакцинации хомяки были интраназально заражены новым коронавирусом SARS-CoV-2 штамм nCov/Victoria/1/2020 в дозе 102 ФОБ. На 2-е, 4-е, 6-е и 8-е сутки после заражения у животных брались носовые смывы, в ОТ-ПЦР определялась вирусная нагрузка. На 8-е сутки животных подвергали эвтаназии, извлекали легкие и вычисляли отношение (индекс) массы легких и массы тела. В таблице 3 приведены результаты измерения.
При гистологическом исследовании легких хомяков на 8-е сутки после заражения тяжелые патологические изменения наблюдались в плацебо группе животных, где обнаруживалась полная потеря эпителиальной выстилки мелких бронхов и бронхиол, очаги некротизации, плазматическое пропитывание стенок сосудов, значительные по площади зоны ателектаза. Гораздо меньшая степень проявления инфекции наблюдалась у вакцинированных животных, где явления отека и воспалительно-клеточной инфильтрации были локальными, дистрофические изменения эпителия мелких бронхов и кровеносных сосудов микроциркуляторного русла отмечались на относительно небольших участках легочной паренхимы
Таким образом, двукратное с интервалом 14 суток введение вакцинных композиций пептидных иммуногенов индуцировало у хомяков выработку антител к антигенам вакцины и цельновирионному антигену коронавируса, статистически значимо снижает индекс массы легкие/тело и обеспечивает защиту животных от развития пневмонии после интраназального заражения коронавирусом SARS-CoV-2.
Пример 7. Протективность вакцинной композиции на основе пептидных иммуногенов на хорьках.
Исследования протективности комбинаций пептидных иммуногенов проводили после 2-кратной внутримышечной иммунизации хорьков с интервалом 14 суток дозой 200,0 мкг. На 28-е сутки после первой вакцинации хорьки были интраназально заражены новым коронавирусом SARS-CoV-2 штамм nCov/Victoria/1/2020 в дозе 103 ФОБ. На 2-е, 4-е, 6-е и 8-е сутки после заражения у животных брались носовые смывы, в ОТ-ПЦР определялась вирусная нагрузка. На 8-е сутки животных подвергали эвтаназии, извлекали легкие и вычисляли отношение (индекс) массы легких и массы тела. В таблице 4 приведены результаты измерения
Таким образом, при изучении протективных свойств вакцинной композиции на основе пептидных иммуногенов на хорьках было установлено снижение более чем в 100 раз вирусной нагрузки в группах вакцинированных животных по сравнению с группой плацебо на 6-е сутки после заражения. Вирус элиминировался из верхних дыхательных путей на 4 сут раньше, чем в плацебо группе. Статистически значимо снижает индекс массы легкие/тело, что указывает на защиту легких от тяжелой воспалительной реакции.
Источники научно-технической и патентной информации
1. Tyrrell D.A.J., Bynoe М.А. Cultivation of novel type of commoncold virus in organ culture.Br. Med. J. - 1965. - №1. - P. 1467-1470.
2. Вирусология под редакцией Филдса Б. и Найпа Д. М: Мир, 1989, том 3.
3. Tyrrell D.A.J., Almeida I.D. Direct electron microscopy of organ cultures for the detection and characterization of viruses // Arch. Gesamte Virus forsch. - 1967. - №22. - P. AM-A25.
4. Siddell S.G., Wege H., ter Meulen V. The biology of coronaviruses // J Gen. Virol. - 1983. - №63. - P. 761-776.
5. Sturman L.S., Holmes K.V. The molecular biology of coronaviruses // Adv. Virus Res. №28. - P. 35-112.
6. Coronavirus never before seen in humans is the cause SARS. 2003. Сайт ВОЗ. http://www.who.int/mediacentre/releases/2003/pr31/en/print.html.
7. Enserink M. SARS: chronology of the epidemic, (англ.) // Science (New York, N.Y.). - 2013. - 15 March (vol. 339, no. 6125). - P. 1266-1271. - doi:10.1126/science.339.6125.1266.
8. Huang C, Wang Y., Li X. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China // Lancet. - 2020. - Feb 15;395(10223):497-506. doi: 10.1016/S0140-6736(20)30183-5.
9. Peiris J.S.M, Guan Y., Yuen K.Y. Severe acute respiratory syndrome // Nat Med. - 2004;10 (suppl 12):S88-S97. DOI: 10,1038 / nml 143.
10. CDC, 2019 Novel Coronavirus, Wuhan, China. CDC. Available at https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/abaut/index.html.; Accessed: January 27, 2020.
11. Hui D.S.I., Azhar E., Madani T.A., Ntoumi F., Kock R., Dar O., et al. The Continuing 2019-nCoV epidemic threat of novel coronaviruses to global health-The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China // Int. J. Infect. Dis. - 2020 Jan 14.91:264-266.
12. Larson H.E., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. Isolation of rhinovirases and coronaviruses from 38 coldsin adults // J. Med. Virol. - 1980. - №5. - P. 221-229.
13. Yin Y., Wunderink R.G. MERS, SARS and other coronaviruses as causes ofpneumonia // Respirology. - 2018 Feb; 23(2):130-137. doi: 10.1111/resp.l3196. Epub 2017 Oct 20.
14. Wege H., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top.Microbiol. Immunol. - 1982. - 99. - P, 165-200.
15. Risri H., Hovi T. Coronavirus infections of man associated with diseases other than the common cold // J. Med. Virol. - 1980. - №6. - P. 385-399.
16. Информационный Экспресс-Бюллетень. Коронавирус SARS-возбудитель атипичной пневмонии (временные методические рекомендации). - СПб-Москва, 2003.
17. Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия // Под редакцией О.И. Киселева, И.Г. Маринича, А.А. Сомининой). - СПб.: «Боргес», 2003.
18. Постановление Правительства РФ от 01.12.2004 №715.
19. World Health Organization. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19 - 11 March. Available from URL: https://www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19, 11 march 2020 (accessed April 2020).
20. Callegos A. WHO Declares Public Health Emergency for novel coronavirus // Medscape medical news. Available at https://www. Medscape, com/viewarticle/924596; Accessed: January 31, 2020.
21.. Ramzy A., McNeil D.G. W.H.O. Declares Global Emergency as Wuhan Coronavirus Spreads // The New York Times. Available at https://nyti.ms/2RER70M; Accessed: January 30, 2020.
22. The New York Times. Coronavirus Live Updates: W.H.O. Declares Pandemic as Number of Infected Countries Crows. The New York Times. Available at https:// www.nytimes.com/2020/03/1 l/world/coronavirus-news.html#link-282e5b06. Accessed: March 11, 2020.
23. Сайт ВОЗ https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/novel-coronavirus-landscape-ncov.pdf?sfvrsn=:b8e4a30_4&download=true.
24. Заявка США №20060257852, МПК С07К 14/165, опубл. 16.11.2006 г. (аналог).
25. WO 2015/042373, A1, Immunogenic middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) compositions and metods, 2015. (прототип).
26. Wang, Q. et al. Immunodominant SARS coronavirus epitopes in humans elicited both enhancing and neutralizing effects on infection in non-human primates. // ACS Infect. Dis. 2, 361-376 (2016).
27. Chen, W.H. et al. Optimization of the production process and characterization of the yeast-expressed SARS-CoV recombinant receptor-binding domain (RBD219-N1), a SARS vaccine candidate. // J. Pharm. Sci. 106, 1961-1970 (2017).
--->
ПРИЛОЖЕНИЕ
<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный
научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной
службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)
<120> Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против
коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных
иммуногенов и химерного рекомбинантного белка-носителя (варианты)
<160> Номер SEQ ID NO: 1
<210> 5
<211> 25
<212> peptide
<213> Искусственная последовательность
<223> Искусственно синтезированный пептид
<400> 1 Искусственная аминокислотная последовательность
CRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS
<160> Номер SEQ ID NO: 2
<210> 5
<211> 23
<212> peptide
<213> Искусственная последовательность
<223> Искусственно синтезированный пептид
<400> 2 Искусственная аминокислотная последовательность
CKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQE
<160> Номер SEQ ID NO: 3
<210> 5
<211> 22
<212> peptide
<213> Искусственная последовательность
<223> Искусственно синтезированный пептид
<400> 3 Искусственная аминокислотная последовательность
CKNLNESLIDLQELGKYEQYIK
<160> Номер SEQ ID NO: 4
<210> 5
<211> 817
<212> recombinant chimeric protein
<213> Искусственная последовательность
<223> Искусственно синтезированный рекомбинантный химерный белок
<400> 4 Искусственная аминокислотная последовательность
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLE 45
EKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKL 90
YPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPA 135
LDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIK 180
DVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAM 225
TINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAA 270
SPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKD 315
PRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDE 360
ALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRGGSGHHHHHHSGSDNGPQ 405
NQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASW 450
FTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGG 495
DGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTP 540
KDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSS 585
SRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLES 630
KMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRR 675
GPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGM 720
EVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTE 765
PKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDLSKQLQQSMS 810
SADSTQA 817
<160> Номер SEQ ID NO: 5
<210> 5
<211> 2454
<212> recombinant chimeric gen
<213> Искусственная последовательность
<223> Искусственно синтезированный рекомбинантный химерный ген
<400> 5 Искусственная нуклеотидная последовательность
ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGG 50
CTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAA 100
TTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAG 150
GTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCG 200
CTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACA 250
AAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTAC 300
AACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGAT 350
TTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCC 400
CGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTC 450
AACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGG 500
TTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCG 550
TGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATT 600
AAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGC 650
CTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGT 700
CCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACC 750
TTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTAT 800
TAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACT 850
ATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTG 900
GGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACG 950
TATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACA 1000
TCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAAC 1050
GCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGAC 1100
TAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGA 1150
TCGAGGGAAGGGGAGGATCTGGCCACCATCATCATCATCATTCTGGATCC 1200
GATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGG 1250
ACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGC 1300
GATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGG 1350
TTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGG 1400
ACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCT 1450
ACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAA 1500
GATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGC 1550
TGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTG 1600
AGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCT 1650
AACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAA 1700
AGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTT 1750
CCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGT 1800
AGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCT 1850
TGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTG 1900
GTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCT 1950
GAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAA 2000
TGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATT 2050
TTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCG 2100
CAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCG 2150
CATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTG 2200
CCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTG 2250
CTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAA 2300
AAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGAC 2350
AGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGAT 2400
TTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGC 2450
CTAA 2454
<---
Claims (2)
1. Пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, содержащей антигенные Т- и В-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.
2. Пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, содержащей антигенные Т- и В-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020140742A RU2743594C1 (ru) | 2020-12-09 | 2020-12-09 | Пептидные иммуногены, используемые в качестве компонентов вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020140742A RU2743594C1 (ru) | 2020-12-09 | 2020-12-09 | Пептидные иммуногены, используемые в качестве компонентов вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2743594C1 true RU2743594C1 (ru) | 2021-02-20 |
Family
ID=74666064
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020140742A RU2743594C1 (ru) | 2020-12-09 | 2020-12-09 | Пептидные иммуногены, используемые в качестве компонентов вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2743594C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115300608A (zh) * | 2021-05-06 | 2022-11-08 | 四川大学 | 一种利用甘露糖结合凝集素阻断新冠病毒感染的方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2378015C2 (ru) * | 2008-04-02 | 2010-01-10 | Равшан Иноятович Атауллаханов | Конъюгат для иммунизации и вакцинации и способ повышения иммуногенности |
RU2689671C2 (ru) * | 2012-07-10 | 2019-05-28 | Хипра Сьентифик, С.Л.У. | Мутантные штаммы mycoplasma hyopneumoniae |
CN111458504A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-07-28 | 中科欧蒙未一(北京)医学技术有限公司 | 用于检测样品中抗新型冠状病毒SARS-COV-2的IgG抗体的试剂盒 |
CN111533790A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-14 | 中山大学 | 基于马赛克策略的冠状病毒抗原的构建方法及其应用 |
CN111647053A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-09-11 | 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所 | 多肽及其在新型冠状病毒检测、抗体或疫苗筛选中的应用 |
CN111848753A (zh) * | 2020-07-20 | 2020-10-30 | 中国科学院过程工程研究所 | 新型冠状病毒抗原表位及其应用 |
RU2738081C1 (ru) * | 2020-10-14 | 2020-12-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов |
-
2020
- 2020-12-09 RU RU2020140742A patent/RU2743594C1/ru active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2378015C2 (ru) * | 2008-04-02 | 2010-01-10 | Равшан Иноятович Атауллаханов | Конъюгат для иммунизации и вакцинации и способ повышения иммуногенности |
RU2689671C2 (ru) * | 2012-07-10 | 2019-05-28 | Хипра Сьентифик, С.Л.У. | Мутантные штаммы mycoplasma hyopneumoniae |
CN111458504A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-07-28 | 中科欧蒙未一(北京)医学技术有限公司 | 用于检测样品中抗新型冠状病毒SARS-COV-2的IgG抗体的试剂盒 |
CN111647053A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-09-11 | 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所 | 多肽及其在新型冠状病毒检测、抗体或疫苗筛选中的应用 |
CN111533790A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-14 | 中山大学 | 基于马赛克策略的冠状病毒抗原的构建方法及其应用 |
CN111848753A (zh) * | 2020-07-20 | 2020-10-30 | 中国科学院过程工程研究所 | 新型冠状病毒抗原表位及其应用 |
RU2738081C1 (ru) * | 2020-10-14 | 2020-12-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115300608A (zh) * | 2021-05-06 | 2022-11-08 | 四川大学 | 一种利用甘露糖结合凝集素阻断新冠病毒感染的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2738081C1 (ru) | Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов | |
RU2743593C1 (ru) | Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов | |
US11590220B2 (en) | Antigens of β-coronaviruses, preparation methods and uses thereof | |
US11324836B2 (en) | Modified virus-like particles of CMV | |
Schwegmann-Weßels et al. | Sialic acids as receptor determinants for coronaviruses | |
RU2743595C1 (ru) | Вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 | |
JPH03502687A (ja) | レスピラトリイ・シンシチアル・ウイルス:ワクチンおよび診断法 | |
JP2008505050A (ja) | Sarsコロナウイルスsタンパク質およびその使用 | |
JP6692853B2 (ja) | 立体構造的に特異的なウイルス免疫原 | |
CN112043825A (zh) | 一种基于新型冠状病毒突刺蛋白s1区域预防新型冠状病毒感染的亚单位疫苗 | |
CN114437185A (zh) | 冠状病毒三聚体亚单位疫苗及其应用 | |
JP2024512575A (ja) | 弱毒化されたレオウイルスベースのワクチン組成物及びその用途 | |
TW201629090A (zh) | 類病毒顆粒疫苗 | |
RU2743594C1 (ru) | Пептидные иммуногены, используемые в качестве компонентов вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19 | |
Tripet et al. | Template-based coiled-coil antigens elicit neutralizing antibodies to the SARS-coronavirus | |
US7151163B2 (en) | Antiviral agents for the treatment, control and prevention of infections by coronaviruses | |
CN114057850B (zh) | 一种预防新型冠状病毒covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
EA040140B1 (ru) | Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции covid-19 с использованием пептидных иммуногенов | |
Katsura et al. | Novel bovine viral diarrhea virus (BVDV) virus-like particle vaccine candidates presenting the E2 protein using the SpyTag/SpyCatcher system induce a robust neutralizing antibody response in mice | |
EA040096B1 (ru) | Химерный рекомбинантный белок-носитель мвр-6xhis-n_ncov-2019 и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции covid-19 с использованием химерного рекомбинантного белка-носителя | |
KR101557191B1 (ko) | 넓은 범위의 방어능력을 갖는 인플루엔자 단독 또는 보강 백신 | |
CN114053400B (zh) | 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的疫苗及其制备方法 | |
CN114057846B (zh) | 一种预防新型冠状病毒感染covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
PT1780216E (pt) | Coronavírus canino pantrópico | |
CN114057847B (zh) | 一种预防新型冠状病毒covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210128 Effective date: 20210901 |
|
QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20211118 Effective date: 20211118 |