EA040140B1 - Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции covid-19 с использованием пептидных иммуногенов - Google Patents

Description

Изобретение относится к разработке профилактических противовирусных препаратов, а именно к получению вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19 и может быть использовано для профилактики этого заболевания.

Общая характеристика коронавирусной инфекции COVID-19

Коронавирус человека был впервые выделен D. Tyrrell и M. Bynoe в 1965 г. от больного острым респираторным заболеванием (ОРВЗ), им удалось культивировать человеческий коронавирус на клетках трахеи [1]. Однако первое упоминание о коронавирусе, выделенном у цыплят больных бронхитом, относится к 1937 г.

Свое название коронавирусы получили в 1968 году благодаря сходству выростов (пепломеры) с corona spinarum - терновым венцом вокруг головы святого на средневековых религиозных картинах [2]. Поскольку многие коронавирусы плохо размножаются в культуре клеток, то долгое время молекулярнобиологические исследования их репликации отставали от аналогичных исследований других вирусов и в течение многих лет впервые обнаруживаемые вирусы относили к группе коронавирусов только по их характерной морфологии [3]. Лишь в 1983 году были установлены характерные биохимические особенности, идентифицированы классы мРНК, их нуклеотидные последовательности, а также структурные белки [4, 5].

После открытия в 1965 году коронавирусы почти не привлекали внимание исследователей, поскольку выделенные штаммы 229E и OC43 вызывали относительно легкие заболевания. Врачи лечили их как обычную простуду, пока в Китае в 2002-2003 годах не была зафиксирована вспышка атипичной пневмонии, или тяжёлого острого респираторного синдрома (TOPC, SARS). Заболевание зарегистрировано в 32 странах, наибольшее количество в Китае, Сингапуре, Канаде. Всего заболело 8273 человека, а 775 умерло (летальность 9,6%).

марта 2003 года ВОЗ была объявлена глобальная тревога в связи с распространением атипичной пневмонии. Были привлечены 13 лабораторий из 9 стран для проведения объединённых исследований этого заболевания. В качестве приоритетных задач ставилось определение этиологического агента, и затем на основании этого - разработка диагностических тест систем. В результате тесного сотрудничества ученых из лабораторий разных стран первая часть поставленной задачи была выполнена поразительно быстро. 16 апреля 2003 года ВОЗ было объявлено, что этиологическим агентом атипичной пневмонии является новый патоген, вирус SARS, относящийся к семейству коронавирусов, но не родственный ни одному из известных штаммов этого вируса [6]. С тех пор обнаружилось еще два коронавируса, которые тоже вызывают простуду -NL63 и HKU1. В 2012 году - почти через 50 лет после его открытия - был окончательно секвенирован полный геном штамма 229E.

В 2012 году были зарегистрированы первые случаи заболевания, вызванного коронавирусом. Заболевание в дальнейшем получило название ближневосточного респираторного синдрома (MERS), возбудителем которого являлся коронавирус MERS-CoV [7]. В 2015 году в Южной Корее произошла вспышка ближневосточного респираторного синдрома, в ходе которой заболело 183 человека, умерло 33.

В декабре 2019 года несколько медицинских учреждений в китайском городе Ухань (провинция Хубэй) сообщили о пациентах с пневмонией [8]; клинические проявления напоминали симптомы тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), заболевания, появившегося в 2002 году в соседнем районе - провинции Гуандун, вызванного коронавирусом SARS-CoV [9, 10]. 7 января 2020 г. был выделен новый штамм коронавируса, названный SARS-CoV-2, который вызывает коронавирусную болезнь 2019 года COVID-19. Полный геном SARS-CoV-2 уже достаточно изучен, его первая широкая публикация китайскими органами здравоохранения была сделана вскоре после обнаружения вируса, что облегчило процесс диагностики и идентификации возбудителя инфекции.

SARS-CoV-2 - одноцепочечный РНК-содержащий вирус, относится к семейству Coronaviridae, группе 2b бета-коронавирусов, который имеет по меньшей мере 70% сходство в генетической последовательности с SARS-CoV, его размер составляет около 100 нм [11].

Все известные коронавирусы (CoV) делятся на четыре рода, включая α-, β-, γ-, и δ-CoV. Представители первых двух родов способны инфицировать млекопитающих, тогда как γ- и δ-CoV инфицируют преимущественно птиц. Ранее было известно о шести коронавирусах, которые способны инфицировать человека. Это HCoV-229E и HCoV-NL63 (оба α-CoV), HCoV-HKU1 и HCoV-OC43 (оба β-CoV), - они вызывают легкие респираторные симптомы, сходные с простудой [12] Два других β-коронавируса, SARS-CoV и MERS-CoV, приводят к тяжелым и потенциально смертельным инфекциям дыхательных путей человека [13-16]. Несмотря на тщательное изучение коронавирусов после вспышки TOPC, пока не совсем ясно, почему три из них - SARS-CoV-1, MERS-CoV и SARS-CoV-2 (источник пандемии COVID19) - вызывают более тяжелые симптомы и приводят к более высокому уровню смертности, в то время как другие известные четыре коронавируса человека гораздо слабее.

Классификация инфекционного агента

В состав семейства Коронавирусов входят род Коронавирусы и род Торовирусы. Род Коронавирусы объединяет большие, оболочечные, позитивные одноцепочечные РНК-содержащие вирусы, которые вызывают широко распространенные заболевания человека и животных. Его представители могут быть

- 1 040140 выделены в три серологические подгруппы.

Серотипы и хозяева коронавирусов:

Антигенная группа	Вирус	Хозяин
1	Human coronavirus 229Е (HcoV-229E) Porcine Transmissible gastroenteritis virus (TGEV) Porcine respiratory coronavirus (PRCoV) Canine Coronavirus (CcoV) Feline enteric coronavirus (FECoV) Feline infectious peritonitis virus (FIPV) Rabbit coronavirus (RbCoV)	Человек Свиньи Свиньи Собаки Кошки Кошки Кролики

Human coronavirus ОС43 (HcoV- ОС43) Murine hepatitis virus (MHV) Sialodacryoadenitis virus (SDAV) Porcine hemagglutinating encephalomyelitis (HEV)

Bovine coronavirus (BcoV)

Turkey coronavirus (TcoV)

Человек

Мыши

Крысы

Свиньи

Крупный рогатый скот

Индюки

Avian infectious bronchitis virus (IBV) Курицы

Turkey coronavirus (TcoV) Индюки

Как и другие респираторные вирусные инфекции, возбудитель COVID-19 в основном распростра няется воздушно-капельным путем, через аэрозоли, а также через загрязненные предметы и прямой контакт [12, 16].

Коронавирусы обладают широким тропизмом и могут поражать помимо дыхательных путей печень, почки, кишечник, нервную систему, сердце и глаза [13-15, 17, 18]. Типичная коронавирусная инфекция клинически проявляется гриппоподобным синдромом и/или кишечными расстройствами. При коронавирусной инфекции поражается альвеолярный эпителий. Коронавирусы, обладая способностью к индукции апоптоза, вызывают некроз пораженных тканей, а у пациентов после выздоровления остаются фиброзные рубцы в легких. Коронавирусы, индуцируя слияние клеток, оказывают сильное воздействие на проницаемость клеток, что приводит к нарушению водно-солевого баланса и транспорта белков. Вероятно в этих условиях развиваются недостаточность сурфактанта (антиателектатический фактор), что приводит к коллапсу альвеол и легочному дистресс-синдрому. Наиболее опасным свойством коронавирусов является их способность поражать макрофаги. Вероятнее всего заболевание в особо тяжелой форме развивается на фоне блокирования основных звеньев иммунного ответа [16, 17, 19, 20].

Коронавирусы домашних и лабораторных животных вызывают инфекционный бронхит птиц, гепатит мышей, пневмонии у крыс, гастроэнтериты и энцефаломиелиты у свиней, часто заканчивающихся у животных смертельным исходом, что приводит к большим экономическим потерям [14].

Постановлением Главного санитарного врача РФ вирус SARS-CoV-2, как и некоторые другие представители этого семейства (вирусы SARS-CoV, MERS-CoV), отнесен ко II группе патогенности (патогенные биологические агенты, в отношении которых известны случаи летальных исходов заболевания и/или имеются сведения о высоком эпидемическом потенциале). SARS-CoV-2 включен в перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих [18, 21].

Случаи заболевания COVID-19 зарегистрированы в большинстве стран мира на всех континентах. 30 января ВОЗ признала вспышку нового коронавируса глобальной чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение [12-14, 19, 20, 21]. 11 марта 2020 года Президент ВОЗ объявил COVID-19 глобальной пандемией, впервые назвав пандемией инфекционный процесс после пандемии гриппа H1N1 в 2009 году [12, 15, 19, 22].

Самый надежный способ остановить пандемию - массовая вакцинация. Разработка вакцины является критически важной задачей для системы здравоохранения. Именно поэтому работу по созданию вакцины для профилактики коронавирусной инфекции (COVID-19) ведут более 80 компаний по всему миру. По данным ВОЗ на 9 сентября 2020 года на стадии доклинических исследований находились 145 вакцин, 12 из них разрабатывались с использованием пептидов в качестве действующего начала вакцины. Клинические исследования проводились для 35 вакцин, среди них только одна из них была разработана на пептидной платформе [23].

Известен изолированный полипептид вируса SARS и вакцина для профилактики тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) на его основе, содержащая инактивированный вирус SARS, убитый вирус SARS, ослабленный вирус SARS, препарат расщепленного вируса SARS или по крайней мере один очищенный антиген вируса SARS (заявка США №20060257852, МПК C07K 14/165, опубл. 16.11.2006 г.) [24]. Полипептид представляет собой полипептид Spike (S), полипептид Env (E), полипептид мембраны (M), полипептид гемагглютинин-эстеразы (HE), полипептид нуклеокапсида (N), полипептид ORF1a, полипептид ORF1ab, протеолитический фрагмент полипептида ORF1a или протеолитический фрагмент полипептида ORF1ab. Антиген представляет собой очищенный инактивированный антиген вируса SARS в форме вирусоподобной частицы (VLP) и содержит адъювант в виде соли алюминия или MF59. Антигены выбраны из S, E, N и M. Инактивация антигена включает обработку вируса эффективным количест- 2 040140 вом одного или нескольких из следующих агентов, выбранных из группы, состоящей из детергентов, формальдегида, формалина, β-проприолактона и УФ-излучения.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является вакцинная композиция для стимулирования иммунного ответа в отношении MERS-CoV (международная заявка №WO2015042373, МПК A61K39/215, опубл. 26.03.2015 г.). Вакцинная композиция содержит (i) эффективное количество наночастиц MERSCoV, где наночастица содержит по меньшей мере один тример полипептида Spike, и (ii) адъювант на основе сапонина, где адъювант на основе сапонина состоит из Matrix M1. Наночастица содержит по меньшей мере от приблизительно пяти тримеров до приблизительно 30 тримеров полипептида Spike. Концентрация наночастицы составляет по меньшей мере от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 60 мкг/мл. Авторами была показана иммуногенность вакцинных композиций на основе белка S и наличие вируснейтрализующих антител в сыворотках вакцинированных животных. Полноразмерный белок S представляет широкий набор высокоиммуногенных эпитопов, индуцирующий формирование широкого спектра антител.

Однако в исследованиях выше указанных кандидатных вакцин против коронавирусов (SARS и MERS) был отмечен риск развития антителозависимого усиления (ADE) инфекции [26, 27].

Следовательно, разработка вакцины на основе синтетических пептидов, нацеленных на белок S SARS-CoV-2, может дать более безопасную и эффективную вакцину. Также для аналогов и прототипа не показана способность индуцировать иммунный ответ, способный оказывать защитное действия против нового вируса SARS-CoV-2.

Техническим результатом изобретения является получение таких пептидных иммуногенов и вакцинных композиций, которые несут минимально необходимые антигенные детерминанты для формирования специфического иммунного ответа у кроликов, хорьков и хомяков и индуцируют протективный иммунитет против Covid-19.

Указанный технический результат достигается тем, что получен первый пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью CRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS (SEQ ID NO: 1), содержащей антигенные T и B-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.

Указанный технический результат достигается тем, что получен второй пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью CKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQE (SEQ ID NO: 2), содержащей антигенные T и B-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.

Указанный технический результат достигается тем, что получен третий пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью CKNLNESLIDLQELGKYEQYIK (SEQ ID NO: 3), содержащей антигенные T и B-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.

Указанный технический результат достигается тем, что получен четвертый пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью CKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIK (SEQ ID NO: 4), содержащей антигенные T и B-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.

Указанный технический результат достигается тем, что получен химерный рекомбинантный белок MBP-6xHis-N_nCoV-2019, включающий N белок коронавируса SARS Cov-2, используемый в качестве белка-носителя в вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19 и характеризующийся аминокислотной последовательностью:

MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQ

VAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRY NGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFN LQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIK

- 3 040140

NKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPT FKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLG AVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINA ASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRGGSGHHHHHHSGS DNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASW FTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMK DLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPA NNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRG TSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAA EASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHW PQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVIL LNKMDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDD LSKQLQQSMSSADSTQA (SEQ ID NO: 5).

Указанный технический результат достигается также тем, что получена вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующаяся тем, что содержит пептидные иммуногены по пп.1, 2, 3, имеющие аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 1), (SEQ ID NO: 2) и (SEQ ID NO: 3) соответственно или по пп.1, 4, имеющие аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 1), (SEQ ID NO: 4) и ковалентно связанные в виде конъюгатов с белком-носителем, представляющим собой химерный рекомбинантный белок MBP-6xHis-N_nCoV-2019, включающий N белок коронавируса SARSCoV-2, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, причем смесь вышеуказанных конъюгатов пептидных иммуногенов и белка-носителя сорбирована на фармацевтически приемлемый адъювант.

Конъюгаты пептидных иммуногенов с белком-носителем взяты в равных соотношениях между собой и белком - носителем. В качестве белка-носителя вакцинная композиция содержит химерный рекомбинантный белок-носитель, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 5). В качестве адъюванта вакцинная композиция содержит гидроокись алюминия в количестве 0,2-2,0 мг/мл.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами.

На фиг. 1 представлены аминокислотные последовательности четырех пептидных иммуногенов. На фиг. 2 приведена аминокислотная последовательность химерного белка MBP-6xHis-N_nCoV-2019 (SEQ ID NO: 4). На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность гена химерного белка MBP6xHis-N_nCoV-2019 (SEQ ID NO: 5). На фиг. 4 изображена генетическая и физическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pMBP-6xHis-N_nCoV-2019. На фиг. 5 представлена электрофореграмма рестрикционного анализа рекомбинантной плазмидной ДНК pMBP-6xHis-N_nCoV-2019 в 1.5 % агарозном геле.

Пример 1. Получение и структура пептидных иммуногенов.

При разработке вакцины, используя литературные данные о T- и B-клеточных эпитопах белка S нового коронавируса SARS Cov-2, были спроектированы структуры 3 пептидов - аналогов иммуногенных T и B-клеточных эпитопов белка S нового коронавируса SARS Cov-2, которые затем были синтезированы (фиг. 1). Последовательность этих синтетических пептидов, моделирующих функционально значимые участки белка S нового коронавируса SARS Cov-2, были спроектированы таким образом, чтобы исключить присутствие элементов, ответственных за развитие иммунопатологического состояния, но сохранить способность индуцировать образование защитных антител и обеспечить защиту организма от развития COVID-19. Синтетические пептиды имеют размер от 22 до 32 аминокислотных остатков и аналогичны T и B-клеточным эпитопам белка S нового коронавируса SARS Cov-2.

Синтез спроектированных аминокислотных последовательностей проводится с использованием стандартного оборудования и методик твердофазного пептидного синтеза и может быть проведен с использованием любых других методик синтеза аминокислотных последовательностей, например, таких как жидкофазный пептидный синтез, синтез с использованием генетически модифицированных микроорганизмов (технологии получения рекомбинантных белков), фрагментирование нативного белка с последующим выделением соответствующих фрагментов. Ниже приведены структуры синтезированных пептидов.

- 4 040140

Первый пептид (п.1): CRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS (0454-0477), (SEQ

ID NO: 1);

Второй пептид (п.2): CKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQE (1179-1200), (SEQ ID

NO: 2);

Третий пептид (п.З): CKNLNESLIDLQELGKYEQYIK (1189-1209), (SEQ ID

NO: 3);

Четвертый пептид:

CKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIK (1179-1209), (SEQ ID NO: 4).

Пример 2. Получение химерного рекомбинантного белка-носителя.

Белок-носитель является продуктом экспрессии гена химерного белка MBP-6xHis-N_nCoV-2019, характеризующийся последовательностью (SEQ ID NO: 5) в прокариотической системе. Акцепторный плазмидный вектор pMBP-6xHis получен путем направленного клонирования в вектор pT7 фрагмента гена MBP E.coli, амплифицированного из генома E.coli с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Клонирование проведено по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции NdeI-BamHI, где за счет обратного праймера в открытую рамку считывания MBP добавлена нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотный линкер, сайт протеолитического расщепления фактора Xa и 6xHis-метка, необходимая для проведения металл-хелатной аффинной хроматографии. Вектор pT7 получен посредством направленного клонирования химически синтезированного фрагмента ДНК, кодирующего ген LacI, необходимого для контроля экспрессии за счет включения лактозного оператора LacO в транскрипционную кассету целевого гена, гена rop необходимого для контроля копийности плазмидной ДНК в бактериальной клетке, а также структурных элементов, обеспечивающих экспрессию целевого гена: модифицированного промотора бактериофага T7 PT7/O (T. Giordano et al., 1989 г.), сайт связывания рибосом гена 10 бактериофага T7 (Olins and Rangwala, 1989 г.) и терминатора транскрипции ДНКзависимой РНК-полимеразы бактериофага T7. Плазмидный вектор кодирует ген устойчивости к βлактамным антибиотикам (β-лактамаза), а также ориджин репликации бактериофага F1.

Экспрессирующий вектор pMBP-6xHis-N_nCoV-2019 получен посредством направленного клонирования ампликона гена N_nCoV-2019 по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и SalI. Открытая рамка считывания гена химерного белка MBP-6xHis-N_nCoV-2019 представлена лидирующей последовательностью мальтоза-связывающего белка MBP E.coli, аминокислотного линкера, сайта протеолитического расщепления фактора Xa, 6xHis-метки для проведения металл-хелатной аффинной хроматографии, и последовательностью гена N коронавируса SARS-CoV-2 (nCoV-2019). Нуклеотидная последовательность гена химерного белка MBP-6xHis-N_nCoV-2019 представлена на фиг. 3, а на фиг. 2 аминокислотная последовательность химерного белка MBP-6xHis-N_nCoV-2019. Нуклеотидная вставка в вектор pMBP-6xHis осуществлена таким образом, что ген MBP-6xHis-N_nCoV-2019 находится под контролем модифицированного промотора бактериофага T7 PT7/O, старт-кодон (ATG) расположен на оптимальном расстоянии от сайта связывания рибосом гена 10 бактериофага T7. Дополнительный лактозный оператор (LacO) позволяет контролировать уровень экспрессии целевого гена при коэкспрессии LacI. Для идентификации клонируемой последовательности используется метод определения первичной последовательности ДНК на автоматическом секвенаторе. Клонируемый фрагмент ДНК фланкирован сайтами рестрикции - BamHI-SalI. Клонируемый фрагмент ДНК содержит открытую рамку считывания гена N коронавируса SARS-CoV-2 (nCoV-2019). Положение клонируемого гена внутри кассеты, а также положение регуляторных элементов отображено на фиг. 4 - физической и генетической карте рекомбинантной плазмидной ДНК pMBP-6xHis-N_nCoV-2019. Способ введения конструкции в прокариотической системе - трансформация клеток Escherichia coli плазмидой. Селективный маркер - ген устойчивости к β-лактамным антибиотикам (β-лактамаза).

Основные генетические элементы, содержащиеся в структуре плазмидной ДНК:

PT7/O promoter - модифицированный промотор бактериофага T7 PT7/O (21-64 п.н.);

Lac operator - лактозный оператор (40-64 п.н.);

RBS [bacteriophage T7 gene 10] - сайта связывания рибосом гена 10 бактериофага T7 (79-101 п.н.);

MBP - мальтоза-связывающий белок MBP E. coli (109-1209 п.н.);

Factor Xa site - сайт протеолитического расщепления фактора Xa (1258-1269 п.н.);

6xHis - 6-гистидиновая аффинная метка (1282-1299 п.н.);

N-последовательность гена N коронавируса SARS-CoV-2 (nCoV-2019) (1309-2562 п.н.);

T7 terminator - терминатор транскрипции ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7 (26532700 п.н.);

Ori - ориджин репликации pBR322/pUC (4355-4943 п.н.);

AmpR - ген β-лактамазы (устойчивость к ампициллину) (3324-4184 п.н.);

LacI - ген репрессора LacI (6376-7455 п.н.).

Карта (электрофореграмма) рестрикционного анализа рекомбинантной плазмидной ДНК pMBP- 5 040140

6xHis-N_nCoV-2019 в 1.5% агарозном геле с использованием эндонуклеаз рестрикции XbaI, BglII, XhoI,

HindIII, NcoI, AvaII представлена на фиг. 5.

Фрагменты ДНК, полученные после гидролиза рекомбинантной плазмиды pMBP-6xHis-N_nCoV2019 эндонуклеазами рестрикции XbaI, BglII, XhoI, HindIII, NcoI, AvaII (1-6 трек, соответственно).

Ниже представлены расчетные длины фрагментов ДНК, образующихся после гидролиза соответствующими эндонуклеазами рестрикции:

1: pMBP-6xHis-N_nCoV-2019

XbaI

1. 7825 bp

2: pMBP-6xHis-N_nCoV-2019

BglII

1.6685 bp

2. 1140 bp

3: pMBP-6xHis-N_nCoV-2019

XhoI

1.7825 bp

4: pMBP-6xHis-N_nCoV-2019

HindIII

1.7825 bp

5: pMBP-6xHis-N_nCoV-2019

NcoI

1.7825 bp

6: pMBP-6xHis-N_nCoV-2019

Avail

1.2082 bp

2. 1746 bp

3. 1584 bp

4. 777 bp

5.509 bp

6. 376 bp

7. 279 bp

8. 222 bp

9. 91 bp

10. 88 bp

11. 42 bp 12. 29 bp

Далее рекомбинантный химерный белок-носитель MBP-6xHis-N_nCoV-2019, нарабатывают в прокариотической системе, биомассу осаждают центрифугированием, ресуспендируют в буфере 50 мМ NaH₂PO₄ 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0.5 мг/мл лизоцим, pH 8.0 и охлаждают до 2-5°C. Биомассу, полученную с 10 л питательной среды ресуспендируют в 300 мл буфера. Затем клетки разрушают в ультразвуковом дезинтеграторе до полного осветления суспензии при температуре не выше 40°C. Полученный лизат охлаждают до 2-5°C, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 мин. К супернатанту добавляют насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 1:1 по объему и перемешивают взбалтыванием, после чего охлаждают при 4-8°C в течении 5-6 ч. Осадок отделяют центрифугированием при 12000 об/мин в течении 20 мин(температура 10°C), который затем растворяют в буфере: 50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, pH 8.0 и охлаждают при 4-8°C в течение 1 ч. Объем буфера рассчитывается как половина объема лизата. Полученный раствор центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 мин при температуре 10°C. Супернатант хранят при температуре 4-8°C в течение 5 дней и

- 6 040140 используют для аффинной хроматографии.

Для аффинной хроматографии используют сорбент Ni-NTA-Superflow (QIAGEN) или его аналоги. Количество сорбента берется из расчета 100 мл на 1 г ожидаемого количества целевого белка. Используется колонка среднего давления с высотой столба не выше 30 см. Сорбент дегазируется, наносится в колонку и уравновешивается буфером: 50 мМ NaH2PO₄, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, pH 8.0. Осветленный центрифугированием супернатант лизата клеток пропускают через колонку со скоростью 2,5-4 мл/мин. Колонку промывают 5-кратным объемом буфера: 50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, pH 8.0, затем 40-кратным объемом буфера: 50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl, 30 мМ имидазол, pH 8.0. Элюцию целевого белка проводят буфером: 50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl, 300 мМ имидазол, pH 8.0. Элюцию контролируют по оптической плотности на длине волны 280 нм. Собирают одну фракцию первого пика, которую можно хранить до 5 дней при температуре 4-8°C. Полученная фракция содержит целевой продукт - химерный рекомбинантный белок-носитель MBP-6xHis-N_nCoV-2019. Расчетная молекулярная масса химерного рекомбинантного белка-носителя MBP-6xHis-N_nCoV-2019 составляет 89,2 кДа.

Поскольку химерный белок-носитель содержит T-клеточные эпитопы SARS-CoV-2, то он не только повышает стабильность пептидных иммуногенов и участвует в формировании выраженного иммунного ответа, но и стимулирует специфический клеточный иммунный ответ.

Пример 3. Получение конъюгатов пептидных иммуногенов и белка-носителя, а также вакцинной композиции.

После синтеза пептидных иммуногенов осуществляют их конъюгирование с белком-носителем для повышения стабильности и формирования выраженного иммунного ответа.

В качестве белка-носителя в вариантах вакцины был использован рекомбинантный химерный белок, содержащий аминокислотную последовательность нуклеопротеина N нового коронавируса SARSCoV-2, полученный по примеру 2. Кроме того, в качестве белков-носителей могут быть использованы такие белки как БСА (бычий сывороточный альбумин), KLH (keyhole limpet hemocyanin) - гемоцианин, овальбумин (альбумин яичного белка) или другие рекомбинантные белки.

Ковалентная связь между белком-носителем и пептидным иммуногеном может быть создана с использованием различных конъюгирующих агентов, например, таких как ГА (глутаровый альдегид), SMCC (Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl-4(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), и многие другие.

Конъюгирование пептида с белком-носителем с помощью конъюгирующего агента Sulfo-SMCC проводят следующим образом: 20 мг белка-носителя растворяют в 2 мл дистиллированной воды. Непосредственно перед использованием готовят раствор Sulfo-SMCC с концентрацией 5 мг/мл. Добавляют 2 мл раствора Sulfo-SMCC. Инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин, или при температуре 37°C в течение 30 мин, периодически осторожно перемешивают. Для удаления избытка Sulfo-SMCC колонку 50 мл со смолой Sepharose CL4B уравновешивают 0,01 М фосфатно-солевым буферным раствором. Наносят на колонку активированный белок-носитель и собирают первый пик, при этом используют для детекции длину волны 280нм.

Далее 20 мг пептида растворяют в 5 мл 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе. Немедленно смешивают пептид и активированный белок-носитель и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Для удаления избытка пептида колонку 50 мл с сорбентом Sepharose CL4B уравновешивают 0,01 М фосфатно-солевым буферным раствором. Наносят на колонку конъюгат пептида с белком-носителем и собирают первый пик, при этом используют для детекции длину волны 280 нм.

Для увеличения иммунного ответа используют адъювант. Существует множество известных адъювантов, включая адъювант Фрейнда (CFA or FCA), суспензии гидроксида алюминия, адъювант MF59 и др.

Полученные конъюгаты пептида и белка-носителя сорбируют на гидроксиде алюминия для получения готовой лекарственной формы в конечной концентрации (100-1000) мкг пептида в 1,0 мл препарата.

В качестве примера приведены следующие составы вакцинной композиции №1 и №2.

Вакцинная композиция №1: смесь пептидных иммуногенов, имеющих аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 1), (SEQ ID NO: 2) и (SEQ ID NO: 3) соответственно и ковалентно связанных в виде конъюгатов с химерным рекомбинантным белком-носителем MBP-6xHis-N_nCoV-2019, включающий N белок коронавируса SARS-CoV-2, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, взятых в равных соотношениях и сорбированных на фармацевтически приемлемый адъювант гидроокись алюминия в количестве 2,0 мг/мл.

Вакцинная композиция №2: смесь пептидных иммуногенов по п.п.1, 4, имеющие аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 1), (SEQ ID NO: 4) и ковалентно связанные в виде конъюгатов с белком-носителем, представляющим собой химерный рекомбинантный белок MBP-6xHis-N_nCoV-2019, включающий N белок коронавируса SARS-CoV-2, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, взятых в равных соотношениях. Смесь вышеуказанных конъюгатов пептидных иммуногенов и белка-носителя сорбирована на фармацевтически приемлемый адъювант гидроокись

- 7 040140 алюминия в количестве 1,0 мг/мл.

Пример 4. Исследование иммуногенности пептидных иммуногенов на кроликах.

Для получения иммунных сывороток используют лабораторных животных - кроликов породы Шиншилла с массой тела 2000-3000 г. Предварительно перед иммунизацией у кроликов берут пробу крови в объеме 1,0 мл из краевой вены уха и выделяют сыворотку для дальнейшего иммуноферментного анализа. Температура хранения сыворотки от минус 15°C до минус 25°C.

Каждый из 3 пептидов конъюгируют с белком-носителем гемоцианином и в смеси с неполным адьювантом Фрейнда двукратно с интервалом 7 дней подкожно вводят кроликам. Через 7 суток после второй иммунизации у кроликов берут пробу крови в объеме 1,0 мл из краевой вены уха. Из крови выделяют сыворотку для проведения иммуноферментного анализа. Сыворотки крови кроликов хранят при температуре от минус 15°C до минус 25°C.

Результаты определения титров специфических антител в сыворотках иммунных кроликов к соответсвующим пептидам и к рекомбинантному белку S представлены в табл. 1.

Таблица 1. Обратные титры антител в сыворотках кроликов, иммунизированных пептидными иммуногенами, к соответствующим пептидным иммуногенам и рекомбинантному белку S _________________коронавируса nCoV-2019_________________

Номер группы	Номер животно го	Обратный титр к соответствующему пептидному иммуногену до иммунизации	Обратный титр к соответствующему пептидному иммуногену на 7 день после 2-ой иммунизации	Обратный титр к рекомбинантному белку S nCoV-2019 на 7 день после 2ой иммунизации
Гр.1 пептидный иммуноген (п.1)	1	<100	25600	12800
2	<100	51200	51200
3	<100	51200	12800
СГТ			40637	20319
Гр.2 пептидный иммуноген (п.2)	4	<100	102400	25600
5	<100	25600	51200
6	<100	204800	51200
СГТ			81275	40637
Гр.З пептидный иммуноген (п.З)	7	<100	204800	51200
8	<100	102400	25600
9	<100	102400	51200
СГТ			129016	40637
Гр. 4 пептидный иммуноген (п. 4)	10	<100	102400	25600
И	<100	204800	25600
12	<100	204800	51200
СГТ			162550	32254

Примечание: СГТ - среднегеометрический титр по группе животных.

Иммуноферментный анализ для определения титра антител к соответствующим антигенам проводят следующим образом.

В 96-ти луночный планшет вносят сорбционный буфер по 150 мкл в лунку. В качестве сорбционного буфера использовать 0,05 М карбонат-бикарбонатный буфер (pH 9,5-9,7) с добавлением соответствующего антигена с концентрацией 1 мкг/мл. Инкубируют 16 ч при комнатной температуре.

Перед нанесением испытуемых образцов сыворотки промывают иммуносорбент 0,01 М ФСБ-Т (pH 7,3-7,5). Вносят в планшет по 100 мкл разводящего буферного раствора для образца и в ряд A вносят образцы сывороток по 100 мкл и титруют с шагом 2. Инкубируют в термошейкере при температуре (37±2)°C, 700 об/мин в течение 45 мин.

По окончании инкубации содержимое лунок удаляют с помощью вошера и промывают 0,01 М ФСБ-Т. Вносят во все лунки по 100 мкл антивидового конъюгата и инкубируют в термошейкере при температуре (37±2)°C, 700 об/мин в течение 30 минут. По окончании инкубации содержимое лунок удаляют с помощью вошера и промывают 0,01 М ФСБ-Т. Вносят во все лунки по 100 мкл хромогенного субстрата (ТМБ) для окрашивания образовавшихся специфических АГ-АТ комплексов.

Инкубируют в темноте при комнатной температуре (24±5)°C в течение 20 мин. Вносят во все лунки по 50 мкл СТОП-реагента для прекращения реакции. Результаты ИФА регистрируют с помощью микропланшетного ридера, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм.

Титром антител считается максимальное разведение исследуемой сыворотки, при котором оптическая плотность раствора превышает ОП_крит.

Таким образом, двукратная иммунизация кроликов пептидными иммуногенами индуцирует у кроликов выработку антител к пептидным иммуногенам в диапазоне СГТ от 1:40637 до 1:162550 и к рекомбинантному белку S коронавируса SARS-CoV-2 (nCoV-2019) в диапазоне СГТ от 1:20319 до 1:40637.

Пример 5. Исследование иммуногенности пептидных иммуногенов и вакцинной композиции на мышах.

Для получения иммунных сывороток используют лабораторных животных - мышей ICR с массой тела 14-16 г. Предварительно перед иммунизацией у мышей берут пробу крови в объеме 100 мкл из ретроорбитального синуса и выделяют сыворотку для дальнейшего иммуноферментного анализа. Темпера

- 8 040140 тура хранения сыворотки от минус 15°C до минус 25°C.

Каждый из 4 пептидов, конъюгируют с химерным рекомбинантным белком-носителем MBP-6xHisN_nCoV-2019. Готовят вакцинную композицию, смешивая пептидные иммуногены в равных количествах в соответствии с п.5 (вариант 1 и 2) формулы изобретения. Пептидные иммуногены и вакцинную композицию сорбируют на адьювант гидроокись алюминия. Вакцинируют мышей подкожно двукратно с интервалом 14 дней. Через 14 дней после второй вакцинации из ретроорбитального синуса отбирают кровь в объеме 100 мкл. Из крови выделяют сыворотку для проведения иммуноферментного анализа. Сыворотки крови мышей хранят при температуре от минус 15°C до минус 25°C.

Результаты определения титров специфических антител в сыворотках иммунных мышей к соответствующим пептидным иммуногенам, вакцинной композиции и к рекомбинантному белку S коронавируса представлены в табл. 2.

Иммуноферментный анализ для определения титра к соответсвующим антигенам проводят аналогично тому, как описано в примере 4.

Таким образом, двукратная иммунизация мышей пептидными иммуногенами и их вакцинными композициями индуцировало у мышей выработку антител к пептидным иммуногенам в диапазоне СГТ от 1:6400 до 1:11143 и к рекомбинантному белку S коронавируса SARS-CoV-2 (nCoV-2019) в диапазоне СГТ от 1:1600 до 1:3676.

Таблица 2. Обратные титры антител в сыворотках мышей, иммунизированных пептидными иммуногенами и вакцинными композициями, к соответствующим антигенам и рекомбинантному белку S ___________________коронавируса nCoV-2019 ______________

Номер группы	Номер животно го	Обратный титр к соответствующему иммуногену до иммунизации	Обратный титр к соответствующему иммуногену на 14 день после 2-ой иммунизации	Обратные титры к рекомбинантному белку S nCoV-2019 на 14 день после 2ой иммунизации
Гр.1 пептидный иммуноген содержащий пептид (п.1)	1	<100	6400	1600
2	<100	12800	6400
3	<100	3200	800
4	<100	12800	3200
5	<100	25600	6400
СГТ			9701	2786
Гр.2 пептидный иммуноген содержащий пептид (п.2)	6	<100	6400	1600
7	<100	6400	3200
8	<100	6400	800
9	<100	12800	3200
10	<100	3200	800
СГТ			6400	1600
Гр.З пептидный иммуноген содержащий пептид (п.З)	11	<100	12800	3200
12	<100	12800	6400
13	<100	25600	6400
14	<100	6400	1600
15	<100	6400	1600
СГТ			11143	3200
Гр.4 пептидный иммуноген содержащий пептид (п. 4)	16	<100	3200	800
17	<100	6400	1600
18	<100	6400	3200
19	<100	12800	6400
20	<100	12800	3200
СГТ			7352	2425
Гр.5 Вакцинная композиция по п. 5, вар. 1	21	<100	6400	1600
22	<100	12800	1600
23	<100	3200	800
24	<100	12800	3200
25	<100	25600	6400
СГТ			9701	2111
Гр.6 Вакцинная композиция по п. 5, вар. 2	26	<100	6400	3200
27	<100	12800	6400
28	<100	6400	6400
29	<100	6400	3200
30	<100	6400	1600
СГТ			7352	3676

Примечание: СГТ - среднегеометрический титр по группе животных.

Пример 6. Протективность вакцинной композиции на основе пептидных иммуногенов на хомяках.

Исследования протективности вакцинных композиций пептидных иммуногенов проводили после 2кратной внутримышечной иммунизации хомяков с интервалом 14 суток дозой 200,0 мкг. На 28-е сутки после первой вакцинации хомяки были интраназально заражены новым коронавирусом SARS-CoV-2 штамм nCov/Victoria/1/2020 в дозе 10² ФОЕ. На 2-е, 4-е, 6-е и 8-е сутки после заражения у животных брались носовые смывы, в ОТ-ПЦР определялась вирусная нагрузка. На 8-е сутки животных подвергали эвтаназии, извлекали легкие и вычисляли отношение (индекс) массы легких и массы тела. В табл. 3 приведены результаты измерения.

- 9 040140

При гистологическом исследовании легких хомяков на 8-е сутки после заражения тяжелые патологические изменения наблюдались в плацебо группе животных, где обнаруживалась полная потеря эпителиальной выстилки мелких бронхов и бронхиол, очаги некротизации, плазматическое пропитывание стенок сосудов, значительные по площади зоны ателектаза. Гораздо меньшая степень проявления инфекции наблюдалась у вакцинированных животных, где явления отека и воспалительно-клеточной инфильтрации были локальными, дистрофические изменения эпителия мелких бронхов и кровеносных сосудов микроциркуляторного русла отмечались на относительно небольших участках легочной паренхимы.

Таким образом, двукратное с интервалом 14 суток введение вакцинных композиций пептидных иммуногенов индуцировало у хомяков выработку антител к антигенам вакцины и цельновирионному антигену коронавируса, статистически значимо снижает индекс массы легкие/тело и обеспечивает защиту животных от развития пневмонии после интраназального заражения коронавирусом SARS-CoV-2.

Таблица 3. Протективность вакцинных композиций пептидных иммуногенов против коронавируса SARS-CoV-2 штамм nCov/Victoria/1/2020. Доза заражения 10² ФОЕ интраназально. Хомяки

Номер группы	Номер живот ного	Вирусная нагрузка в носовом смыве, Ct	Индекс массы легкие/тело
2 сут п.з.	4 сут п.з.	6 сут п.з.	8.сут п.з.
Гр.1 Композиция пептидных иммуногенов по п. 5, вар. 1	1	10,36	15,41	17,71	20,87	0,0070
2	7,15	18,77	16,87	21,3	0,0081
3	11,48	13,46	16,38	20,47	0,0079
4	10,11	12,76	20,88	22,14	0,0088
5	19,51	13,04	18,74	22,14	0,0086
СЗ		11,7	14,7	18,1	21,4	0,0081
ДИ95		3,64	1,96	1,40	0,59	0,0006
Гр.2 Композиция пептидных иммуногенов по п. 5, вар 2	6	8,26	12,01	12,84	22,74	0,0058
7	11,44	12,02	12,02	19,12	0,0089
8	9,08	13,16	19,18	25,01	0,0061
9	8,47	11,36	15,04	16,43	0,0109
10	10,94	10,22	18,80	20,92	0,0081
СЗ		9,6	11,8	15,6	20,8	0,0080
ДИ95		1,14	0,84	2,59	2,58	0,0016
Гр. 3 Плацебо	11	7,16	18,17	18,21	20,78	0,0114
12	9,52	21,34	19,8	24,51	0,0095
13	8,57	15,72	16,35	17,35	0,0103
14	8,18	16,62	16,51	16,74	0,0112
15	8,91	17,17	16,86	18,43	0,0105
СЗ		8,5	17,8	17,5	19,6	0,0106
ДИ95		0,69	1,70	1,14	2,48	0,0006

Примечания: СЗ - среднее значение по группе; ДИ95 - 95%-ный доверительный интервал; плацебо физиологический раствор 0,9% хлорида натрия.

Пример 7. Протективность вакцинной композиции на основе пептидных иммуногенов на хорьках.

Исследования протективности комбинаций пептидных иммуногенов проводили после 2-кратной внутримышечной иммунизации хорьков с интервалом 14 суток дозой 200,0 мкг. На 28-е сутки после первой вакцинации хорьки были интраназально заражены новым коронавирусом SARS-CoV-2 штамм nCov/Victoria/1/2020 в дозе 10³ ФОЕ. На 2-е, 4-е, 6-е и 8-е сутки после заражения у животных брались носовые смывы, в ОТ-ПЦР определялась вирусная нагрузка. На 8-е сутки животных подвергали эвтаназии, извлекали легкие и вычисляли отношение (индекс) массы легких и массы тела. В таблице 4 приведены результаты измерения

Таким образом, при изучении протективных свойств вакцинной композиции на основе пептидных иммуногенов на хорьках было установлено снижение более чем в 100 раз вирусной нагрузки в группах вакцинированных животных по сравнению с группой плацебо на 6-е сутки после заражения. Вирус элиминировался из верхних дыхательных путей на 4 суток раньше, чем в плацебо группе. Статистически значимо снижает индекс массы легкие/тело, что указывает на защиту легких от тяжелой воспалительной реакции.

- 10 040140

Таблица 4. Протективность вакцинной композиции пептидных иммуногенов против коронавируса

SARS-CoV-2 штамм nCov/Victoria/1/2020. Доза заражения 10³ ФОЕ интраназально. Хорьки

Номер группы	Номер животн ого	Вирусная нагрузка в носовом смыве, Ct	Индекс массы легкие/тело
2 сут п.з.	4 сут п.з.	6 сут п.з.	8.сут п.з.
Гр.1 Композиция 1 пептидных иммуногенов по п. 5, вар. 1	1	27,03	24,39	26,67	>40	0,0089
2	24,12	30,01	27,07	32,19	0,0091
3	22,13	26,23	32,7	>40	0,0071
4	21,06	34,07	>40	>40	0,0095
5	29,26	24,61	32,76	>40	0,0079
СЗ	24,7	27,9	32,0	39,2	0,0085
ДИ95	2,67	3,24	4,55	3,09	0,0008
Гр. 2 Композиция 2 пептидных иммуногено по п. 5, вар 2	6	18,37	21,23	23,7	>40	0,0069
7	20,97	22,16	28,68	>40	0,0091
8	22,01	27,24	31,58	>40	0,0073
9	22,06	30,94	>40	>40	0,0105
10	17,89	28,05	26,06	>40	0,0089
СЗ	22,8	20,3	25,9	30,2	>40
ДИ95	0,90	1,57	3,22	5,26
Гр.З Плацебо	11	22,3	21,79	22,24	23,4	0,012
12	22,48	26,84	17,99	23,63	0,0123
13	24,57	14,32	17,34	20,79	0,0101
14	21,53	17,98	18,78	17,03	0,011
15	25,71	24,07	28,26	23,79	0,0096
СЗ	23,3	21,0	20,9	21,7	0,0110
ДИ95	1,37	3,88	3,54	2,27	0,0009

Примечания: СЗ - среднее значение по группе. Для расчета СЗ при Ct>40 присваивали значение Ct=41; ДИ95 - 95%-ный доверительный интервал; плацебо - физиологический раствор 0,9% хлорида натрия.

Источники научно-технической и патентной информации

1. Tyrrell D.A.J., Bynoe М.А. Cultivation of novel type of commoncold virus in organ culture.Br. Med. J. - 1965. - № 1. - P. 1467-1470.

2. Вирусология под редакцией Филдса Б. и Найпа Д. М: Мир, 1989, том 3.

3. Tyrrell D.A.J., Almeida I.D. Direct electron microscopy of organ cultures for the detection and characterization of viruses // Arch. Gesamte Virus forsch. 1967.-№ 22.-P. 417-425.

4. Siddell S.G., Wege H., ter Meulen V. The biology of coronaviruses II J Gen. Virol. - 1983. - № 63. - P. 761-776.

5. Sturman L.S., Holmes K.V. The molecular biology of coronaviruses П Adv. Virus Res. № 28. - P.35-112.

6. Coronavirus never before seen in humans is the cause SARS. 2003. Сайт

ВОЗ. http://www.who.int/mediacentre/releases/2003/pr31/en/print.html.

7. Enserink M. SARS: chronology of the epidemic, (англ.) 11 Science (New York, N.Y.). - 2013. - 15 March (vol. 339, no. 6125). - P. 1266-1271. doi: 10.1126/science.339.6125.1266.

8. Huang C., Wang Y., Li X. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China П Lancet. - 2020. - Feb 15;395(10223):497506. doi: 10.1016/80140-6736(20)30183-5.

9. Peiris J.S.M, Guan Y., Yuen K.Y. Severe acute respiratory syndrome П Nat Med.-2004; 10 (suppl 12):S88-S97. DOI: 10,1038 / nml 143.

10. CDC, 2019 Novel Coronavirus, Wuhan, China. CDC. Available at https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/abaut/index.html.; Accessed: January 27, 2020.

11. Hui D.S.I., Azhar E., Madani T.A., Ntoumi F., Kock R., Dar 0., et al. The Continuing 2019-nCoV epidemic threat of novel coronaviruses to global healthThe latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China П Int. J. Infect. Dis. 2020 Jan 14.91:264-266.

- 11 040140

12. Larson H.E., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. Isolation of rhinoviruses and coronaviruses from 38 coldsin adults II J. Med. Virol. - 1980. - № 5. - P. 221229.

13. Yin Y., Wunderink R.G. MERS, SARS and other coronaviruses as causes of pneumonia//Respirology. -2018 Feb; 23(2):130-137. doi: 10.1111/resp.l3196. Epub 2017 Oct 20.

14. Wege H., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses П Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1982. - 99. - P, 165-200.

15. Risri H., Hovi T. Coronavirus infections of man associated with diseases other than the common cold // J. Med. Virol. - 1980. - № 6. - P. 385-399.

16. Информационный Экспресс-Бюллетень. Коронавирус SARSвозбудитель атипичной пневмонии (временные методические рекомендации). - СПб-Москва, 2003.

17. Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия // Под редакцией О. И. Киселева, И. Г. Маринича, А. А. Сомининой). - СПб.: «Боргес», 2003.

18. Постановление Правительства РФ от 01.12.2004 № 715.

19. World Health Organization. WHO Director-General’s opening remarks at the media briefing on COVID-19 - 11 March. Available from URL: https://www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarksat-the-media-briefing-on-covid-19, 11 march 2020 (accessed April 2020).

20. Callegos A. WHO Declares Public Health Emergency for novel coronavirus H Medscape medical news. Available at https://www. Medscape, com/viewarticle/924596; Accessed: January 31, 2020.

21. . Ramzy A., McNeil D.G. W.H.O. Declares Global Emergency as Wuhan Coronavirus Spreads // The New York Times. Available at https://nyti.ms/2RER7OM; Accessed: January 30, 2020.

22. The New York Times. Coronavirus Live Updates: W.H.O. Declares Pandemic as Number of Infected Countries Crows. The New York Times. Available at https:// www.nytimes.com/2020/03/ll/world/coronavirusnews.html#link-282e5b06. Accessed: March 11, 2020.

23. Сайт ВОЗ https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/novelcoronavirus-landscape-ncov.pdf?sfvrsn=b8e4a30_4&download=true.

24. Заявка США №20060257852, МПК С07К14/165, опубл. 16.11.2006 г. (аналог).

25. WO 2015/042373, Al, Immunogenic middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) compositions and metods, 2015. (прототип).

26. Wang, Q. et al. Immunodominant SARS coronavirus epitopes in humans elicited both enhancing and neutralizing effects on infection in non-human primates. H ACS Infect. Dis. 2, 361-376 (2016).

27. Chen, W. H. et al. Optimization of the production process and characterization of the yeast-expressed SARS-CoV recombinant receptor-binding domain (RBD219-N1), a SARS vaccine candidate. H J. Pharm. Sci. 106, 19611970 (2017).

Claims (7)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, содержащей антигенные T и B-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.
2. 2. Пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, содержащей антигенные T и B-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.
3. 3. Пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, содержащей антигенные T и B-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.
4. 4. Пептидный иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, содержащей антигенные T и B-клеточные эпитопы белка S коронавируса SARS Cov-2, которые способны индуцировать образование антител, обладающих антигенспецифической, вируснейтрализующей и протективной активностями.
5. 5. Вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19, характеризующаяся тем, что содержит пептидные иммуногены по пп.1, 2, 3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 или по пп.1, 4, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 соответственно и ковалентно связанные в виде конъюгатов с белкомносителем, представляющим собой химерный рекомбинантный белок MBP-6xHis-N_nCoV-2019, включающий N белок коронавируса SARS-CoV-2, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, причем смесь вышеуказанных конъюгатов пептидных иммуногенов и белка-носителя сорбирована на фармацевтически приемлемый адъювант.
6. 6. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что конъюгаты пептидных иммуногенов с белкомносителем взяты в равных соотношениях между собой и белком-носителем.
7. 7. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что в качестве адъюванта она содержит гидроокись алюминия в количестве 0,2-2 мг/мл.