CN111606980B - Sars-cov冠状病毒s2蛋白多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及SARS‑COV冠状病毒S2蛋白多肽及其应用。具体而言，发现了一段特定的SEQ ID No.1所示的S2蛋白抗原表位，通过这一表位制备抗血清，显示所获得的抗体具有较好的效价，对SARS‑CoV攻击具有免疫保护作用。

Description

SARS-COV冠状病毒S2蛋白多肽及其应用
技术领域
本申请涉及生物学领域。具体而言，涉及一种抗原表位，及其在作为疫苗中的用途。
背景技术
SARS-CoV为一种有包膜的单股正链RNA病毒，基因组长度约为29725核苷酸[1]。冠状病毒为最大的RNA病毒，病毒颗粒直径约为100nm。
按国际病毒分类委员会分类原则，冠状病毒科(Coronaviridae)归属于核糖病毒域(Riboviria)套式病毒目(Nidovirales)[2]。冠状病毒科下面又分为四个属(Genus)，分别称为：α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒。目前包括SARS-CoV-2在内共有7个已知人冠状病毒，它们来自α冠状病毒(HCoV-NL63，HCoV-229E)及β冠状病毒(HCoV-OC43，HCoV-HKU1，SARS-CoV，SARS-CoV-2和MERS-CoV)。其中SARS-CoV和SARS-CoV-2相关性最高且同属于萨克β冠状病毒(Sarbecovirus)亚属(subgenus)[2]。
SARS-CoV(GenBank:AY278488.2)基因组结构5'端有帽子结构，3'端有多聚腺苷酸poly(A)尾。从5'至3'依次为：ORF1a、ORF1b、S、PUP1、PUP2、E、M、PUP3、PUP4、PUP5及N等11个开放阅读框[3]。前2/3基因组内存在两个大的阅读框ORF1a和ORF1b，可编码两个复制酶相关的多蛋白前体pp1a和pp1ab。冠状病毒需要5'端错位一个核苷酸(-1)合成1b，最终翻译成完整的多蛋白前体pp1ab[4]。研究显示，冠状病毒感染细胞后会在胞质形成200-350nm大小的双层膜泡状细胞器样结构，是病毒重要的转录与复制场所。
刺突蛋白(即S蛋白)是病毒与靶细胞相互作用的重要胞膜蛋白，可介导病毒对宿主细胞的侵入过程。S蛋白可分为S1和S2两个部分。S1含有一个受体结合域(RBD)，可与细胞表面SARS-CoV受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合[5]；而S2部分有两个七肽重复序列HR1和HR2，参与病毒与细胞膜的融合[6]。
本领域仍需要开发一种SARS-CoV的疫苗，使其产生较好的抗体效价及对SARS-CoV攻击具有免疫保护作用。
发明内容
因此，根据本申请的一些实施方案，提供了多肽、肽片段、偶联物、免疫肽、免疫组合物、核酸片段、表达盒、核酸构建体、重组病毒、病毒性疫苗、肽疫苗、微生物疫苗、DNA疫苗、抗体、药用组合物、免疫动物的方法、治疗严重急性呼吸道综合征SARS的方法、诊断SARS的方法和试剂盒。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种抗原片段或多肽，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段。
根据本申请的一些实施方案，提供了SEQ ID NO:1所示的抗原片段在制备预防病毒感染的疫苗中的用途。
根据本申请的一些实施方案，提供了编码SEQ ID NO:1所示的抗原片段的核酸。
在一些实施方案中，所述病毒感染是指冠状病毒感染，例如SARS-CoV或其变种。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种制备疫苗的方法，包括将前述抗原片段作为免疫原的步骤。在一些实施方案中，制备疫苗的方法包括：将所述抗原片段与载体蛋白结合成偶联物，然后将偶联物进行纯化的步骤。
在一些实施方案中，所述抗原片段与载体蛋白的偶联可以通过采用偶联试剂进行结合，如采用碳化二亚胺、戊二醛和二异氰酸化合物等，也可以通过构建融合基因经生物体表达而获得(如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPub.1988；Taylor，Protein Immobilization，Marcel Dekker，Inc.，New York，1991)。
在具体的实施方案中，所述抗原片段与载体蛋白通过偶联试剂进行结合，且所述载体蛋白为血蓝蛋白(例如商品化的Blue carrier)。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1所示的抗原片段能够抑制SARS与动物细胞的融合、和/或在动物体内引发免疫反应。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1所示的抗原片段是来自SARS-CoV的刺突蛋白的可溶性多肽。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1所示的抗原片段对应于SARS-CoV的刺突蛋白的1123-1142位置(或不同氨基酸编号规则下的等同位置、或刺突蛋白的基因序列在不同数据库中等同位置)。
在一些实施方案中，本申请的核酸或多肽接种动物后引发细胞免疫反应。
在其他实施方案中，本申请的核酸或多肽接种动物后引发体液免疫反应。
在其他实施方案中，动物是哺乳动物，具体地，是人。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种偶联物，该偶联物包含SEQ ID NO:1所示的抗原片段和载体蛋白，二者共价结合。
在一些实施方案中，所述载体蛋白是可溶性的。在一些实施方案中，当用于接种动物后，该载体蛋白增强对本申请多肽的免疫反应。在其他实施方案中，当用于接种动物后，该载体蛋白诱导对本申请多肽的细胞免疫反应。在一些实施方案中，当用于接种动物后，该载体蛋白诱导对本申请多肽的体液免疫反应。
载体蛋白可以用于增强偶联物的可溶性。载体蛋白也可用于增强偶联物的免疫原性以增加抗体的产生。此外，载体蛋白还可用于分离和检测偶联物，因此，偶联物可以通过与偶联物的载体蛋白部分相结合的其他成分的相互作用而被检测或分离出来。例如，偶联物含有亲和素的载体蛋白，可通过已知的方法用生物素进行检测和分离。
多种载体蛋白可被用来制备本申请的偶联物。这些载体蛋白的例子包括血蓝蛋白、血清白蛋白、卵白蛋白、或其类似物、衍生物、变体、或其商品化形式。
根据本申请的一些实施方案，提供了含有佐剂(或药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂)和本申请的核酸、多肽的组合物。在一些实施方案中，所述组合物能抑制SARS-CoV与动物细胞的融合。在其他实施方案中，所述组合物引发免疫反应(细胞免疫反应和/或体液免疫反应)。
在一些实施方案中，所述佐剂选自以下的一种或组合：氢氧化铝、脂质A、灭活的细菌、多糖、矿物油、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、磷酸铝、铁盐、锌盐、钙盐、乙酰化酪氨酸、乙酰化糖、阳离子衍生化的多糖、阴离子衍生化的多糖、聚磷腈、生物降解微球、单磷酰脂A、quil A。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体选自以下的一种或组合：脂质体、脂类复合物、囊泡样物质、阳离子多聚物、壳聚糖多聚物、无机纳米离子载体。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种表达盒，其中启动子可操作性地连接到本申请的核酸。在一些实施方案中，启动子是可诱导的。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种构建体，其包含编码SEQID NO:1所示的抗原片段的核酸片段。
根据本申请的一些实施方案，提供了含有病毒载体和本申请的核酸片段的重组病毒。在一些实施方案中，病毒载体是疱疹病毒。在其他实施方案中，病毒载体选自：腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒。
根据本申请的一些实施方案，提供了抗SARS疫苗，其包含本申请的核酸片段或包含SEQ ID NO:1所示的抗原片段。在一些实施方案中，所述疫苗是用于注射的。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种抗体或其抗原结合片段(scFv、Fv、Fab′、Fab、单链抗体、双链抗体、F(ab′)2)，其能够与本申请的抗原片段结合。在一些实施方案中，抗体为单克隆或多克隆抗体。在进一步实施方案中，抗体是单链抗体。在其他实施方案中，抗体为嵌合抗体或人源化抗体。抗体可以与可检测标记物结合，例如，同位素标记物、亲和标记物、酶、荧光标记物、毒素(A链毒素、α-帚曲霉素、白树毒蛋白、曲霉菌素、核糖核酸酶、表鬼臼毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒素、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、放线菌素D、PE40、糖皮质激素等)。
在本申请中，“分离”的核酸或“分离”的多肽指存在于非天然环境中的核酸或多肽。分离的核酸或多肽可以以纯化的形式存在、或存在于一个非天然的环境中(例如，表达载体或宿主细胞中)。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种组合物，所述组合物包含药用载体和编码SEQ ID NO：1多肽的核酸片段；或前述的表达盒，所述组合物可制成预防或治疗SARS-CoV的制剂。
在一些实施方案中，所述疫苗被制成单位剂量形式。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种DNA疫苗，所述DNA疫苗包含药用载体和插入有编码SEQ ID NO：1多肽的核酸片段的载体。在一些实施方案中，所述载体选自质粒、黏粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体、F因子、病毒和噬粒。在一些实施方案中，所述DNA疫苗被制成单位剂量的形式。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种免疫哺乳动物的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的与SEQ ID NO：1所示的多肽、或本申请的偶联物。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种治疗哺乳动物的严重急性呼吸系统综合征的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的特异于SEQ ID NO：1片段的抗体。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种在哺乳动物体内诱导抗SARS病毒S蛋白的免疫反应的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的与SEQ ID NO：1所示的多肽、本申请的偶联物。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种诊断动物严重急性呼吸系统综合征的方法，所述方法包括：使生物样品与特异于SEQ ID NO：1片段的抗体接触；确定所述抗体是否与所述生物样品结合。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种制备抗体的方法，所述方法包括：提供SEQ ID NO：1所示的多肽(或包含SEQ ID NO：1所示多肽的偶联物或组合物)；使其与动物接触；分离抗体。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有SEQ ID NO：1所示的多肽、本申请的偶联物、或特异于SEQ ID NO：1片段的抗体。
根据本申请的一些实施方案，提供了选自以下的任一项在制备疫苗中的用途：根据本申请的多肽、根据本申请的偶联物、根据本申请的多核苷酸、根据本申请的表达载体、根据本申请的药物组合物、根据本申请的重组病毒、根据本申请的核酸疫苗、根据本申请的抗体。
根据本申请的一些实施方案，提供了选自以下的任一项在制备诊断试剂中的用途：根据本申请的多肽、根据本申请的偶联物、根据本申请的多核苷酸、根据本申请的表达载体、根据本申请的药物组合物、根据本申请的重组病毒、根据本申请的核酸疫苗、根据本申请的抗体。
在本申请的一些实施方案中，在前述的预防、免疫、治疗或诊断用途中，SEQ IDNo.1所示的多肽(或本申请的偶联物)或编码SEQ ID No.1所示多肽的核酸可作为唯一的活性成分。
根据本申请的一些实施方案，还提供了一种S2蛋白的抗原表位，其氨基酸序列和SEQ ID No.1具有至少90％的同一性，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
附图说明
图1.SARS-CoV的抗原性S2表位。
图2.SARS-CoV-BJ01的S蛋白序列。
具体实施方式
实施例1.S2表位的预测和筛选
1.从SARS-CoV BJ01(GenBank序列号：AY278488.2)全基因组信息中获得S蛋白全序列(全长共1255aa，图2)。
将S蛋白全长序列用蛋白预测软件(https://www.predictprotein.org)进行分析。依据蛋白亲水区域强弱及PROFval和Ucon软件分析蛋白先天无序状态分布等(图1)，选取多个片段作为潜在的抗原表位。最终确认SARS-CoV BJ01的1123至1142的20个氨基酸区域为S2最佳表位(即LQPELDSFKEELDKYFKNHT，SEQ ID No.1)。
2.对照表位：
现有报道中预测，可以被B细胞识别的表位可能在436-456以及1136至1146附近。因此，在本申请中，将1136至1146作为阳性对照表位(11个氨基酸)。
实施例2.制备兔源抗S2多肽表位的抗体
将0.5mgsolfo-SMCC溶于10μL DMSO，加入230μL缓冲液(0.1MNa3PO4含0.1M NaCl，pH7.2)，混合后加入10μL(2mg)载体蛋白Blue Carrier(Pierce公司产品)，混合后室温放置60分钟。将反应物加入Sephadex G25，用交联缓冲液洗脱，用BCA方法检测蛋白流出峰，接收第6-9管活化的载体蛋白。即刻将2mg S2的多肽表位(本申请、或对照表位)溶于10μL交联缓冲液，与活化的载体蛋白充分混合，室温放置2小时。
在PBS中透析交联产物Blue-S2。取0.5mL Blue-S2交联产物(200μg)与0.5mL弗氏完全佐剂充分混合，将1mL混合物分散接种到2kg重的新西兰大白兔的背部。
免疫前留取兔少量兔血清作为免疫前血清。3周以后，取0.5mLBlue-S2交联产物(200μg)与0.5mL弗氏不完全佐剂充分混合进行第二次免疫。6周后，取0.5mL Blue-S2交联产物(200μg)与0.5mL弗氏不完全佐剂充分混合进行第三次免疫。3次免疫后8周，收获兔全部血清。
实施例3.兔源抗S2多肽表位的IgG抗体效价
将每孔100μL(5μg/mL)S2多肽(溶于15mM Na2CO3/35mM NaHCO3/0.1％NaN3，pH9.6)加入96孔板(Dynex Technologies)，4℃过夜孵育。然后，用PBS-T清洗，加入200μL溶于PBS-T的2％BSA封闭，室温1小时。将抗S2抗体血清进行1:100，1:500，1:5000，1:5万及1:50万稀释，每孔加入100μL各稀释度抗S2抗体，室温孵育1小时。用PBS-T清洗后，每孔加入100μL过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体，室温孵育1小时。清洗后，加入底物显色，然后用伯乐微孔板酶标仪在450nm波长进行检测。结果如表1，所获得的兔源抗S2抗体效价为：1:50万>兔抗S2抗体>1:5万。通过本申请的S2多肽表位制备的抗体，其效价优于对照表位(低于1：5万，p<0.05)。
表1.兔抗S2多肽表位的IgG抗体效价检测
Figure BDA0002510665810000081
实施例4.TCID50测定SARS-CoV病毒滴度
用SARS-CoV病毒株(HKU-39849)在生物安全P3实验室接种到Vero E6细胞中进行大量扩增，充分感染形成CPE后收集细胞，反复冻融，高速离心收取上清作为病毒原液进行滴度测定。将Vero E6细胞铺于96孔板，长至90％覆盖孔底的单层。将病毒原液在100μL体系中进行1:10倍比稀释，从10-1稀释到10-10。每个稀释度接种四个孔，每孔100μL，三天后镜下观察每一个孔细胞病变情况，结果如表2。病毒滴度最终计算为109TCID50/mL，约为2x108PFU/mL。
表2.SARS-CoV病毒的滴度检测
病毒稀释度 病变情况 病变比例
10<sup>-10</sup> 0 0
10<sup>-9</sup> 1/4 0.25
10<sup>-8</sup> 2/4 0.5
10<sup>-7</sup> 3/4 0.75
10<sup>-6</sup> 4/4 1.00
10<sup>-5</sup> 4/4 1.00
10<sup>-4</sup> 4/4 1.00
10<sup>-3</sup> 4/4 1.00
10<sup>-2</sup> 4/4 1.00
10<sup>-1</sup> 4/4 1.00
实施例5.抗S2抗体的中和试验
将Vero E6细胞铺于96孔板，长至90％覆盖孔底的单层。将兔抗S2血清进行1:10稀释后，余后进行1:2倍比稀释，即1:20，1:40，1:80，1:160，1:320。将2μL SARS-CoV病毒原液(2x108PUF/mL)加入10mL无血清MEM，将60μL(含2400PFU病毒)与60μL病毒稀释液混合后，以每孔120μL总量加入96孔板，每个抗体稀释度有4个重复。37℃孵育3小时后，置换120μL全细胞培养液(MEM加10％FBS)。37℃及5％CO2培养48小时后，统计实验结果(表3)。兔源抗S2抗体的对SARS-CoV的中和效价至少为1:80(表3)。通过本申请的S2多肽表位制备的抗体，其中和效价优于对照表位所得抗体(劣于1:80，p<0.05)。
表3.病毒的中和实验，检测兔抗S2多抗的保护性
Figure BDA0002510665810000091
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<120> SARS-COV冠状病毒S2蛋白多肽及其应用
<130> 300049CG
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> SARS-CoV冠状病毒(Coronaviridae)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(20)
<223> 源自SARS-CoV病毒S蛋白的抗原
<400> 1
Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe
1 5 10 15
Lys Asn His Thr
20
<210> 2
<211> 1255
<212> PRT
<213> SARS-CoV冠状病毒(Coronaviridae)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(1255)
<223> SARS-CoV病毒S蛋白
<400> 2
Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu
1 5 10 15
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln
20 25 30
His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
35 40 45
Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
50 55 60
Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val
65 70 75 80
Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn
85 90 95
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
100 105 110
Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
115 120 125
Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met
130 135 140
Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
145 150 155 160
Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
165 170 175
Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly
180 185 190
Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp
195 200 205
Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
210 215 220
Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
225 230 235 240
Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr
245 250 255
Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile
260 265 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys
275 280 285
Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
290 295 300
Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305 310 315 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser
325 330 335
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
340 345 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
355 360 365
Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400
Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser
420 425 430
Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu
435 440 445
Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly
450 455 460
Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp
465 470 475 480
Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
485 490 495
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
500 505 510
Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn
515 520 525
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg
530 535 540
Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp
545 550 555 560
Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys
565 570 575
Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser
580 585 590
Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr
595 600 605
Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr
610 615 620
Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu
625 630 635 640
His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile
645 650 655
Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys
660 665 670
Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala
675 680 685
Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile
690 695 700
Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys
705 710 715 720
Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu
725 730 735
Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile
740 745 750
Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys
755 760 765
Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe
770 775 780
Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile
785 790 795 800
Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met
805 810 815
Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile
820 825 830
Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr
835 840 845
Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala
850 855 860
Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe
865 870 875 880
Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
885 890 895
Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala
900 905 910
Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly
915 920 925
Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu
930 935 940
Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
945 950 955 960
Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp
965 970 975
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln
980 985 990
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
995 1000 1005
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe
1010 1015 1020
Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His
1025 1030 1035 1040
Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn
1045 1050 1055
Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro
1060 1065 1070
Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln
1075 1080 1085
Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val
1090 1095 1100
Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr
1105 1110 1115 1120
Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys
1125 1130 1135
Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser
1140 1145 1150
Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu
1155 1160 1165
Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu
1170 1175 1180
Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu
1185 1190 1195 1200
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu
1205 1210 1215
Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys
1220 1225 1230
Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys
1235 1240 1245
Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1250 1255

Claims (8)

1.SEQ ID No.1所示的多肽在制备SARS-CoV疫苗中的用途：
所述疫苗制备成选自以下的剂型：注射剂、喷雾剂、气雾剂、滴鼻剂、栓剂、膏剂、口服剂型。
2.偶联物在制备SARS-CoV疫苗中的用途，所述偶联物包含以下：
SEQ ID No.1所示的多肽、以及
载体蛋白；
所述多肽和所述载体蛋白共价连接；
所述载体蛋白选自：卵清蛋白、血蓝蛋白、破伤风类毒素、血清白蛋白；
所述疫苗制备成选自以下的剂型：注射剂、喷雾剂、气雾剂、滴鼻剂、栓剂、膏剂、口服剂型。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中：
所述SARS-CoV疫苗用于预防SARS-CoV病毒感染。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中：
所述SARS-CoV疫苗用于治疗SARS-CoV病毒感染。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中：
所述SARS-CoV疫苗用于治疗SARS-CoV病毒感染所致的病症。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述疫苗还包含药物上可接受的载体。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述疫苗还包含佐剂；
所述佐剂选自以下的一种：氢氧化铝、脂质A、灭活的细菌、多糖、矿物油、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、磷酸铝、铁盐、锌盐、钙盐、乙酰化酪氨酸、乙酰化糖、阳离子衍生化的多糖、阴离子衍生化的多糖、聚磷腈、生物降解微球、单磷酰脂A、QuilA。
8.根据权利要求6所述的用途，其中：
所述药物上可接受的载体选自以下的一种：脂质体、脂类复合物、囊泡样物质、阳离子多聚物、壳聚糖多聚物、无机纳米离子载体。
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