CN113717945B - 分泌抗非洲猪瘟病毒e165r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗体、抗原表位肽及应用 - Google Patents

分泌抗非洲猪瘟病毒e165r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗体、抗原表位肽及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株分泌抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为：ASFV‑E165R‑8F9，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C2021181，保藏日期：2021年7月15日。本发明还公开了该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体、该单克隆抗体在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂、试剂盒、生物芯片中的应用、在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒的药物中的应用。本发明还提供了该单克隆抗体识别的抗原表位在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒的药物中的应用。本发明的单克隆抗体，能够显著抑制E165R的酶活性，具备开发为ASFV治疗性抗体药物的应用潜力。

Description

分泌抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、 抗体、抗原表位肽及应用
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫技术领域，尤其涉及一种分泌抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗体、抗原表位肽及应用。
背景技术
非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，能够感染家猪、野猪，引起急性、出血性的烈性传染病病原，感染致死率高达100％，是我国动物疫病防控中重点监控的Ⅰ类动物疫病，目前尚无安全有效的疫苗用于ASFV的防控。
ASFV是双链DNA病毒，基因组长170-193Kb，病毒颗粒直径为260-300nm，编码超过150种蛋白。ASFV结构复杂，具有外膜、外衣壳、内膜、内衣壳、核壳五层囊膜结构。复制过程中会编码多种核酸复制相关酶类，用于保证复制的保真性。
E165R蛋白是ASFV编码的一种dUTPase酶(脱氧尿苷焦磷酸酶)，用于控制DNA复制过程中dUT/dTT的比例，降低DNA复制过程中的错误碱基的引入。前期的研究表明，缺失E165R基因会导致ASFV在细胞上的复制水平下降；晶体结构解析显示E165R是一种三聚体结构，属于Ⅰ型dUTPase酶。E165R蛋白是ASFV药物、疫苗研究的重要靶点之一，制备针对E165R的单克隆抗体药物是ASFV相关药物研发的重要的方向之一。
发明内容
本发明提供了一种分泌抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗体及应用,并鉴定了该抗体识别的表位肽信息，提供了抗原表位肽及应用，解决了现有技术中存在的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
一种分泌抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为：ASFV-E165R-8F9，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C2021181，保藏日期：2021年7月15日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
上述抗非洲猪瘟病毒E165R单抗的杂交瘤细胞株的制备方法如下：
利用大肠杆菌表达系统制备具有6个组氨酸(His)标签的重组E165R蛋白，经过亲和层析和分子筛纯化后免疫小鼠，制备杂交瘤单克隆细胞株。
一种抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的单克隆抗体，通过培养上述杂交瘤细胞株获得，命名为ASFV-E165R-8F9。通过蛋白重叠表达和合成重叠的多肽，利用蛋白免疫印迹(Western blotting)和酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测抗体识别的具体表位肽信息为 149-RGEGRFGSTG-158，对抗体进行亚型分类显示该抗体为IgG2A。
进一步地，培养上述杂交瘤单克隆细胞株获得单克隆抗体，经过重组E165R 蛋白的Western blotting和真核瞬时转染后间接免疫荧光(Indirect immunofluorescentassay，IFA)鉴定后，获得能够识别E165R重组蛋白的单克隆抗体，命名为ASFV-E165R-8F9单克隆抗体。
进一步地，利用ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)和未感染的PAM细胞裂解产物进行Western blotting分析，发现ASFV-E165R-8F9单克隆抗体能够特异性的识别ASFV病毒，而对PAM细胞中的dUTPase没有交叉反应。
另外一种抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的单克隆抗体，是在上述抗E165R的单克隆抗体基础上进一步修饰或进行抗体改造得到；所述修饰包括磷酸乙酰化、糖基化、酰胺化和/或封闭基团衍生化；所述抗体改造选自蛋白酶水解或生产重组抗体。
所述的抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的单克隆抗体在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂、试剂盒和/或生物芯片中的应用。具体应用时，检测方法可以是血清学检测、抗体偶联的核酸检测等。
所述抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的单克隆抗体在预防或治疗非洲猪瘟病毒中的应用，在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒的药物中的应用。
一种用于预防或治疗非洲猪瘟病毒的药物，其有效成分为：上述抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的单克隆抗体，或该抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的单克隆抗体经修饰或改造后的产物；所述修饰的形式选自磷酸化，乙酰化，糖基化，酰胺化和/或利用已知的保护、封闭基团衍生化；所述改造选自蛋白酶水解和/或生产重组抗体。
一种非洲猪瘟病毒E165R蛋白抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列为：149-RGEGRFGSTG-158(如SEQ ID NO:1所示)，位于E165R蛋白的motif Ⅴ区域。
一种非洲猪瘟病毒E165R蛋白抗原，由上述抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的抗原表位肽与载体蛋白偶联而成。
上述的抗原表位肽、抗原作为免疫原在制备抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白抗体中的应用。
一种抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的抗体，由上述的抗原表位肽、抗原为免疫原制备获得的单克隆抗体或多克隆抗体。
进一步地，所述的抗非洲猪瘟病毒E165R的单克隆抗体或其抗体Fab片段在制备预防或治疗非洲猪瘟药物中的应用。所述药物包括但不限于化学化合物、蛋白类抑制剂。
抗原表位在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒的药物中的应用。所述药物可以是化学化合物，蛋白类抑制剂等。所述抗原表位的氨基酸序列为 149-RGEGRFGSTG-158，位于E165R蛋白的motif Ⅴ区域。
本发明的有益效果：
本发明通过制备鼠源化的单克隆抗体，利用E165R酶活抑制试验、Westernblotting、IFA、ELISA，获得了一株分泌抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该单克隆抗体特异性识别ASFV E165R蛋白，识别的具体表位肽信息为149-RGEGRFGSTG-158。本发明的单克隆抗体，能够显著抑制E165R 的酶活性，具备开发为ASFV治疗性抗体药物的应用潜力。同时，本发明还对不同基因型的ASFV毒株中8F9抗体识别表位肽信息进行了同源分析，发现该表位肽信息在不同毒株中高度保守，具有作为广谱性抑制ASFVE165R蛋白的应用潜力，可以以此为靶点用于ASFV治疗药物的开发。
附图说明
本发明所涉及的杂交瘤细胞株，分类命名为：ASFV-E165R-8F9，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C2021181，保藏日期：2021 年7月15日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
图1为ASFV E165R蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳鉴定及凝胶过滤层析结果示意图；
图2为使用Anti-His-mAb通过Western bloting鉴定重组E165R的结果示意图；
图3为使用ASFV阳性血清鉴定重组E165R蛋白的结果示意图；
图4为重组E165R蛋白催化特异性检测的结果示意图；
图5为8F9单克隆抗体IFA鉴定HA标签的重组E165R蛋白结果示意图；
图6为E165蛋白截短重叠表达示意图；
图7为使用Anti-His-mAb通过Western blotting鉴定截短重叠表达的重组E165R蛋白结果示意图；
图8为E165R蛋白氨基酸在不同ASFV毒株中保守性分析(Amino Acidsubstitutions)(×100)结果示意图；
图9为8F9单克隆抗体识别表位在不同ASFV毒株间的保守性分析结果示意图；
图10为ASFV的dUTPase与猪类的dUTPase结构比较示意图；
图11为利用8F9单克隆抗体通过Western blotting鉴定PAM细胞及感染 ASFV的PAM细胞结果示意图。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1杂交瘤细胞株及单克隆抗体的研究
一、试验材料
pET28a质粒为实验室保存，DH5α感受态细胞与BL21表达感受态细胞购自北京庄盟生物，ASFV阳性血清购自中国兽医药品监察所，SP2/0细胞为实验室保存。
二、溶液配制
(1)酶活反应及抗体中和缓冲液：2mM bicine，100mM KCl，5mM MgCl2， 40mM甲酚红(pH 8.0)；
(2)PBS缓冲液：称取8.0gNaCl，0.2g KCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4，溶于800mL的去离子水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L， 121℃高压灭菌20min，4℃保存备用；
(3)PBST缓冲液：向1L高压后的PBS中加入500μL的Tween-20，混匀，4℃保存；
(4)封闭液：称取50g的脱脂牛奶，加入到100mL PBST缓冲液中，溶解后置于4℃保存；
(5)包被缓冲液：称取8.58gNa2CO3·10H2O和5.8g NaHCO3加入去离子水中，定容至1L，调节PH至9.5，4℃保存；
(6)IPTG：将2g IPTG溶解至8mL超纯水中，定容至10mL，用0.22μm 滤器过滤除菌。分装至1.5mL EP管中，-20℃保存；
(7)卡那霉素：将100mg卡那霉素溶解于足量的超纯水中，定容至10mL，分装至1.5mL EP管中，-20℃保存；
(8)LB培养基：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl溶于800 mL去离子水中，用NaOH调PH至7.4，定容至1L，121℃高压灭菌20min，室温保存备用；
(9)裂解缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.5；
(10)10％血清浓度的DMEM：在450mL DMEM中加入50mL的FBS，配制成10％FBS的DMEM细胞培养液。
三、试验方法
3.1重组质粒的构建及蛋白表达纯化
根据ASFV HLJ株(Pig/HLJ/2018)基因组序列，合成E165R基因(SEQ IDNO:2 所示，NCBI参考号为MK333180.1，生工生物技术有限公司)。以此为模板PCR 扩增截断的E165R基因被使用特定引物(表1)，获得的PCR产物，使用Nde Ⅰ和HindⅢ酶切后与pET-28a载体(N端具有6*His标签，方便下一步纯化鉴定)连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素的LB平板，鉴定获得阳性克隆，提取质粒转化BL21表达感受态细胞，将转化后的阳性菌落，在 30μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养，当OD600达到0.5-0.6时。在16℃条件下，加入IPTG(异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃苷)溶液使其终浓度为0.5mM。
表1引物序列表
诱导16h后，离心收集菌液沉淀，在裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,150 mM NaCl,pH8.5)中重悬，使用低温高压匀质机4℃条件下破碎15min，将裂解液在4℃20,000xg条件下离心60min，去除细胞碎片，使用HisTrap FF 进行His亲和纯化，使用300mM咪唑洗脱重组E165R蛋白，使用HiLoad16/600 Superdex 200pg进行层析纯化。使用His-Tag单克隆抗体和非洲猪瘟阳性血清鉴定重组E165R蛋白。
3.2重组E165R蛋白酶促动力学测定
根据以前报道，E165R蛋白编码的dUTPase，水解dUTP时，伴随着PPi和 H+的产生。甲酚红在573nm波长有显著的吸收峰，可以作为质子化和去质子化指示剂，是检测dUTPase酶活性的常用指示剂。本研究中使用甲酚红作为指示剂。反应体系由2mM bicine、100mMKCl、5mM MgCl2和40μM甲酚红组成，pH 值为8.0。重组E165R蛋白浓度为10nM，dUTP浓度为50μM。在25℃条件下，用分光光度计和波长为10mm的恒温比色皿，记录573nm紫外光吸光度变化。使用GraphPad Prism 9.3.0对稳态曲线拟合Michaelis-Menten方程，所有的测量至少进行三次平行重复。
3.3单克隆抗体制备
纯化的E165R蛋白与弗氏免疫佐剂(体积比1:1)完全乳化。免疫BALB/c 小鼠，免疫程序：每2周背部皮下免疫0.1mg重组E165R蛋白1次，共免疫5 次。第4、5次免疫后，ELISA方法检测血清中抗体滴度(重组E165R蛋白包被浓度1μg/ml，体积100μL/孔)。将4免到5免血清效价OD450变化最显著的小鼠中分离脾细胞并与SP2/0细胞融合，使用HAT筛选培养基筛选细胞，经过两轮单细胞亚克隆，获得单克隆细胞株。
通过Western blotting实验筛选，得到稳定分泌单克隆抗体的19株杂交瘤细胞株，其中有10株单克隆抗体可以用于IFA检测，酶活抑制试验显示4 株单克隆抗体能够显著抑制E165R的酶活，其中ASFV-E165R-8F9单克隆抗体抑制效率最高达到62.50％，将ASFV-E165R-8F9的细胞株进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C2021181，保藏日期：2021 年7月15日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
3.4 ELISA
96孔ELISA板包被100μL 1μg/ml的重组蛋白使用碳酸盐缓冲液(pH 9.6) 稀释，室温下孵育3h，使用5％脱脂牛奶4℃封闭过夜。封闭后的板子使用PBST 洗3次后，加入100μL待检血清，37℃孵育30min。PBST清洗3次，用100μLHRP 标记羊抗鼠二抗(Abcam，Rockford，IL)(1:5000)，37℃孵育30min，用 PBST洗涤5次。加入100μL TMB单组分底物溶液底物/孔(索莱宝生物，北京) 室温孵育15min，然后加入等体积1M的盐酸终止反应。使用酶标仪测量450nm 波长下吸光度，结果用光密度(OD450)表示。
3.5 Western blotting实验
重组E165R蛋白的组氨酸标签鉴定：重组蛋白在12.5％SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，将蛋白转印到PVDF膜，使用5％脱脂牛奶封闭1h后，随后用小鼠抗His单克隆抗体(1:3000)作为一抗，在室温下孵育1h，然后用PBST 洗涤3次，每次10min，用稀释度为1:5000的HRP标记山羊抗小鼠抗体作为二抗孵育。室温下孵育1h后，PBST洗3次，然后加入SuperSignal West Pico化学发光膜底物(Thermo Fisher Scientific，USA)使用AmershamImager 680 发光5-10min，鉴定目的蛋白。
猪ASFV多抗血清鉴定重组E165R蛋白:操作步骤同上，其中猪ASFV多抗血清(1:1000)作为一抗，在室温下孵育1h；稀释程度为1:5000的HRP标记山羊抗猪作为二抗，室温下孵育1h。
3.6 IFA
以合成的基因为模板(表1)，通过PCR扩增E165R基因全长，N端HA标记。PCR产物通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点克隆到pCAGGS-HA载体中。将500ng 重组质粒每孔转染PK15细胞，转染24孔板。6h后用10％胎牛血清DMEM替换培养液，培养72h后，使用3％多聚甲醛固定，PBS洗涤3次。用PBS(1:500) 稀释单克隆抗体，以抗HA标签的单克隆抗体作为阳性对照。37℃培养箱孵育 1h后用PBS洗3次。将Alexa-Fluor-488偶联的山羊抗鼠二抗用PBS 1:500 稀释，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察。
3.7 E165R抗原表位定位
通过Western blotting和间接ELISA法对表位区进行鉴定。根据检测结果，设计并合成了6-7aa重叠表位肽(金斯瑞生物)，用于特异性检测表位。用100μL(100μg/ml)的重叠表位肽在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中进行包覆，使用ELISA鉴定抗体的表位，使用未包被表位肽的孔作为阴性对照，将阴性对照结果加上4倍方差作为判定结果的阳性阈值。
3.8抗体中和作用检测
970μL的缓冲溶液(2mM bicine、100mM KCl、5mM MgCl2和40μM甲酚红,pH 值8.0),10μLdUTPase(10μM)和10μL anti-E165R-mAb(1mg/mL) 混匀后室温下孵育3min后。加入10μLdUTP(50mM)，连续动力学检测120 s，每2s采集一次573nm的紫外吸光度变化，共采集61次数据，采用GraphPad Prism 9.0对采集数据进行线性回归拟合分析，通过拟合曲线的斜率大小反应 ASFV dUTPase的酶活性，确定制备的单克隆抗体对E165R酶活性的抑制作用。
3.9单克隆抗体亚型分析
使用小鼠单克隆抗体同型试剂(义翘神州，北京)通过检测单克隆细胞培养上清对抗体进行分类。按照试剂盒说明书(目录编号：SEK003)，每孔加入培养上清100μL进行检测。用TMB单组分底物溶液底物(索莱宝，北京)进行显色，并在450nm处测定吸光度，在阳性对照成立的条件下，将阴性对照结果加上4倍方差作为判定结果的阳性阈值。
3.10经典dUTPases序列比对
采用DNAstar MegAlign软件7.0(DNAstarInc，Wisconsin，USA)对来自不同国家或地区的ASFV毒株和其他病毒的表位对应的氨基酸序列进行比对，分析鉴定出的表位的保守性情况。
3.11抑制性抗体识别表位的结构分析及特异性验证
利用PyMol软件模拟ASFV dUTPase(PDB登录号:6LJ3)、猪类(PDB登录号：6LJJ)的催化结构，显示并比较抗体识别区域的细节，发现抗体识别区域的结构差异。用8F6抗体检测PAM细胞、PAM细胞感染ASFV(Pig/HLJ/2018)，并验证抗体结合表位的种特异性。以抗GAPDH单抗作为内参抗体，一抗稀释浓度为1:1000，二抗稀释浓度为1:5000。
3.12数据分析
氨基酸序列多重比对采用DNAstar MegAlign软件7.0(DNAstarlnc, WisconsinUSA)进行分析。所有统计分析均采用GraphPad Prism 9.3.0软件 (GraphPad softwareInc，San Diego，CA，USA)进行。P<0.05为差异有统计学意义。
四、结果
4.1重组E165R蛋白的纯化与鉴定
E165R蛋白经亲和层析和凝胶过滤层析表达纯化，在凝胶过滤层析纯化过程中，有一个明显的紫外吸收峰(图1)。在His单克隆抗体(图2)、ASFV 阳性血清(图3)的Westernblotting分析表明，纯化的重组蛋白约为18.5KDa， dUTP底物水解反应表明表达获得的重组E165R蛋白能够特异性降解dUTP，对其他核糖核酸的降解无影响，如图4所示。这些结果表明：重组ASFV E165R 蛋白具有良好的酶促反应性。
4.2抗E165R蛋白的单克隆抗体制备
为了制备针对E165R的单克隆抗体，用纯化的重组E165R蛋白对小鼠进行初免和加强免疫。与杂交瘤细胞融合后，通过两轮ELISA筛选共获得19株阳性单克隆融合细胞系，并通过Western blotting检测得到证实，如下表2。
使用pCAGGS-HA载体构建HA-E165R重组质粒并转染PK15细胞。IFA结果显示，转染72h后，10株单克隆抗体可用于检测重组融合蛋白，如图5所示。
表2 8F9单克隆抗体鉴定及表位分析
4.3单克隆抗体抑制E165R的酶活性
为了研究8F9单克隆抗体对E165R酶活性的抑制作用，在体外将抗体-抗原孵育后，测试了上述制备的单克隆抗体对E165R的酶活性抑制作用。
抗体抑制酶活试验中结果表明：10株单克隆抗体中有4株单克隆抗体对 E165R的酶活性有显著抑制作用，如下表3，其中8F9单克隆抗体的酶活性抑制率最高，达到62.50％，显著优于其它细胞株。
表3单克隆抗体中和E165R酶活试验
4.4 8F9单克隆抗体的亚型鉴定
使用抗体亚型分类试剂盒对单克隆抗体亚型进行鉴定，结果显示，8F9单克隆抗体亚型属于IgG2A。
4.5 8F9单克隆抗体识别表位鉴定
为了确定8F9单克隆抗体识别的表位，我们对ASFV的E165R基因按照氨基酸位置截断为1-86aa、1-100aa、1-120aa、1-140aa和37-165aa(如图6所示)，连接在pET28a载体在大肠杆菌(E.coil)BL21中表达，使用His 单克隆抗体进行Westernblotting鉴定，结果如图7所示。被单克隆抗体识别的表位通过蛋白质印迹法表明，8F9单克隆抗体表位区140-165aa，根据表位识别结果合成5-7个aa重叠的肽段(如下表4)，通过ELISA检测单克隆抗体的特异性识别表位。
结果表明，8F9单克隆抗体识别的表位是149-RGEGRFGSTG-158，位于E165R 蛋白的motif V区域(表5)。
表4用于表位鉴定的合成肽段
表5 8F9单克隆抗体亚型分类及识别表位鉴定
4.6 dUTPase抑制表位保守分析
为了分析8F9单克隆抗体抑制表位在不同非洲猪瘟毒株中的保守性，我们将Pig/HLJ/2018毒株与其他ASFV毒株的E165R氨基酸序列信息进行多重同源比对。结果显示，不同ASFV毒株间E165R氨基酸同源性达到94％(图8)，且不同毒株间8F9单克隆抗体抑制表位(E165R的motif V区域)高度保守，同源性达到100％(图9)。
4.7 8F9单克隆抗体识别E165R蛋白的表位肽特异性分析
ASFV E165R蛋白(dUTPase)的motif V是位于蛋白的C端的磷酸结合环区，由于其晶体结构电子密度低，在ASFV的dUTPase的蛋白晶体结构中难以被展示。我们将前期文献报道的dUMP与E165R蛋白的结构复合体与猪类的 dUTPase的结构进行了比较，基于均方根偏差(RMSD)值，ASFV的dUTPase(PDB 登录号：6LJ3)与猪类的(PDB登录号：6LJJ)(RMSD＝3.035)的结构形式之间的motif V区域有显着差异。虽然ASFV的dUTPase的基序V区结构与猪类的dUTPase的基序V区结构高度相似(RMSD＝0.423)，但在F151、R153、F154 的氨基酸位置有显着差异(图10)。
Western blotting检测猪肺泡巨噬细胞蛋白样品、感染的猪肺泡巨噬细胞的蛋白样品，结果显示8F6单克隆抗体能够特异性识别ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞的蛋白样品，不与猪肺泡巨噬细胞蛋白样品发生反应(图11)。这些结果表明，8F6单克隆抗体能够特异性识别ASFV的dUTPase而不与猪的dUTPase 发生交叉反应。
五、讨论
目前尚无有效的预防和控制ASF的药物和疫苗。以往的研究证实，E165R 作为dUTPase能够促进ASFV在宿主靶细胞中正确有效的复制，E165R蛋白是 ASFV相关治疗药物开发的重要靶蛋白。dUTPase是多种病毒复制的关键酶，在宿主细胞病毒感染过程中发挥多种作用，例如伪狂犬病毒(PRV)的dUTPase (UL50)通过抑制I型IFN信号转导和促进病毒免疫逃逸，是PRV复制必需基因。在EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)诱导的神经炎症介质研究中，也观察到同样的抑制IFN信号转导作用；由单纯疱疹病毒1(HSV-1)或喉气管炎病毒(ILTV,Gallid herpesvirus 1)编码的dUTPase是一个重要的毒力因子。
已有的研究表明，dUTPase可被多种化学分子药物靶向，通过与底物竞争与酶催化活性中心结合来抑制酶的反应效率。例如，分子抑制剂化合物((1- (4-(三丁胺)丁基)嘧啶-2,4(1H,3H)-dionel))对恶性疟原虫的dUTPase 活性具有抑制作用；也有研究发现dUTPase的抑制抗体可减轻EBV感染。本研究中，8F9抗ASFV dUTPase的单抗能显著抑制E165R的活性(表3)；并在E165R 的149-158aa中鉴定出该抗体的抑制性表位，同源性分析证实，这些氨基酸在不同基因型ASFV中相对保守(图9)。在本研究中，发现motif V区域的单克隆抗体显著抑制dUTPase活性，提示motif V区域可能在dUTPase催化中发挥重要作用。
dUTPase基序V区作为dUTP的脱磷基团，也是影响PRV定位的重要病毒因子。基序V位于多肽链的C端，包含一个p-环样(磷酸结合环样)基序。在催化过程中，motif V绕过第二亚基，到达第二亚基和第三亚基形成的酶催化活性中心。在水解过程中，C末端(motif V)恢复到开放状态，有利于PPi的释放。motifV将催化过程由无序状态转变为有序催化状态。我们发现8F9单克隆抗体识别的抑制表位位于E165R的motif V区域。8F9抑制抗体降低了dUTPase 的催化效率，但并没有完全抑制酶的活性。这些结果表明，结合motif V的抗体抑制了PPi的释放，导致dUTPase催化过程处于无序状态，从而降低dUTPase 催化效率。
综上所述，本发明制备了一种直接抑制E165R催化活性的抑制抗体。该研究为ASFVdUTPase相关单克隆抗体相关药物的进一步开发提供了基础。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。
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序列表
<110> 河南农业大学
<120> 分泌抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗体、抗原表位肽及应用
<141> 2021-08-02
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Asfarviridae, genus Asfivirus
<400> 1
Arg Gly Glu Gly Arg Phe Gly Ser Thr Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 498
<212> DNA
<213> Asfarviridae, genus Asfivirus
<400> 2
atggcaacaa atttttttat tcaacctatc accgaagaag ctgaagcata ctacccacct 60
tccgtgataa cgaataaacg gaaggacctg ggggtagacg tatactgttg ctccgaccta 120
gtgcttcaac ctggactaaa tattgttcgc ctgcatatta aagtagcatg cgaacacatg 180
ggcaaaaaat gcggttttaa aatcatggcg agaagcagta tgtgcaccca tgaacggctg 240
ctcatccttg caaacggaat tggtttaata gacccgggtt atgtgggcga gctcatgctc 300
aagatcatta atcttggcga caccccggtc caaatatggg ccaaagaatg tttggtgcag 360
ttggtggccc aaggtgacca tgtgcctgac catatcaaca tcctaaaaag aaaccaaata 420
tttccgctgt ttgcgcctac cccaagaggc gagggtagat ttgggagcac gggcgaggcc 480
gggattatga gaacttaa 498

Claims (7)

1.分泌抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的分类命名为：ASFV-E165R-8F9，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C2021181，保藏日期：2021年7月15日，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学。
2.一种抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.一种抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是在权利要求2所述的抗E165R的单克隆抗体基础上修饰或进行抗体改造得到的；所述修饰选自磷酸乙酰化、糖基化、酰胺化和/或封闭基团衍生化；所述抗体改造选自蛋白酶水解和/或生产重组抗体。
4.权利要求2或3所述的抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的单克隆抗体在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂、试剂盒和/或生物芯片中的应用。
5.权利要求2或3所述的抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的单克隆抗体在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒的药物中的应用。
6.一种用于预防或治疗非洲猪瘟病毒的药物，其特征在于，其有效成分为：如权利要求2或3所述的抗非洲猪瘟病毒E165R蛋白的单克隆抗体。
7.一种非洲猪瘟病毒E165R蛋白抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列为：149-RGEGRFGSTG-158，位于E165R蛋白的motifⅤ区域。
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