TW201938578A - 腸病毒疫苗 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題在於提供一種針對腸病毒之疫苗。解決手段如下:
著眼於腸病毒結構、特別是VP0會分裂成VP2與VP4,即發現該分裂會影響免疫原性。亦即,可認為設計出含有許多VP2與VP4作為顯示免疫原性之多肽的疫苗,會關係到提供一種顯示高免疫原性之疫苗。已確認製造含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,該多肽作為針對腸病毒之免疫原具有高效果。
著眼於腸病毒結構、特別是VP0會分裂成VP2與VP4,即發現該分裂會影響免疫原性。亦即,可認為設計出含有許多VP2與VP4作為顯示免疫原性之多肽的疫苗,會關係到提供一種顯示高免疫原性之疫苗。已確認製造含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,該多肽作為針對腸病毒之免疫原具有高效果。
Description
本發明有關於針對腸病毒之疫苗。
腸病毒是屬於微小核糖核酸病毒科(picornaviridae)之單股RNA病毒,會感染人的可舉腸病毒A~D型。腸病毒中包含脊髓灰質炎病毒(Poliovirus)、克沙奇病毒A型、克沙奇病毒B型、伊科病毒及其他腸病毒。
A型腸病毒中包含克沙奇病毒A2~8、10、12、14、16及腸病毒71(以下,EV71)。腸病毒B型中包含克沙奇病毒A9、克沙奇病毒B1~6、伊科病毒1~33及腸病毒69。腸病毒C型中包含脊髓灰質炎病毒、克沙奇病毒A1、11、13、15、17~22及24。腸病毒D型中包含腸病毒68及70。
普遍已知,腸病毒會引起各式各樣的疾病,作為代表性之該疾病可舉手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎等。已知,腸病毒之中,尤其是EV71及克沙奇病毒A型是作為手足口病之主要成因病毒。又已知,腸病毒之中,尤其是克沙奇病毒A型、EV71、克沙奇病毒B型及伊科病毒是作為皰疹性咽峽炎之主要成因病毒。無菌性腦膜炎除了伊科病毒、克沙奇病毒A型、B型及EV71等腸病毒之外,還會因寄生蟲等範圍廣泛的病原體而被引起。
A型腸病毒中包含克沙奇病毒A2~8、10、12、14、16及腸病毒71(以下,EV71)。腸病毒B型中包含克沙奇病毒A9、克沙奇病毒B1~6、伊科病毒1~33及腸病毒69。腸病毒C型中包含脊髓灰質炎病毒、克沙奇病毒A1、11、13、15、17~22及24。腸病毒D型中包含腸病毒68及70。
普遍已知,腸病毒會引起各式各樣的疾病,作為代表性之該疾病可舉手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎等。已知,腸病毒之中,尤其是EV71及克沙奇病毒A型是作為手足口病之主要成因病毒。又已知,腸病毒之中,尤其是克沙奇病毒A型、EV71、克沙奇病毒B型及伊科病毒是作為皰疹性咽峽炎之主要成因病毒。無菌性腦膜炎除了伊科病毒、克沙奇病毒A型、B型及EV71等腸病毒之外,還會因寄生蟲等範圍廣泛的病原體而被引起。
克沙奇病毒A型中包含例如A1~22型及24型,且各自會引起不同的疾病及症狀。克沙奇病毒B型中包含例如1~6型。伊科病毒中包含伊科1~7型、9型、11~27型、29~31型。其他腸病毒中包含腸病毒68~71型。各個基因型中進一步包含基因亞型(sub genotype),例如,EV71中已知原型株(prototype strain)之僅由BrCr構成之A型、B1~B5型及C1~C5型。
已知手足口病,一般是會在手、足、口等出現水疱性發疹的輕症疾病,且兒童常在夏天發病。手足口病的主要感染途徑是飛沫感染及糞口感染。有報告指出,手足口病之大規模流行是以東亞為中心,例如,有報導指出,2016年在中國有約200萬人、2015年在日本有約50萬人的患者。大部分手足口病患者之預後為良好,然而,也可見到少有的病發中樞神經併發症,例如無菌性腦膜炎、急性腦炎或肺水腫等,並且重症化或死亡的例子。像這樣產生併發症的,許多是因EV71所引起之手足口病的情況。又,不僅是兒童,成人之手足口病亦有報告,且在成人的情況下,許多會重症化。然而,針對手足口病之治療方法尚未確立,利用疫苗之預防以東亞各國為中心有在探討或實施。在日本,手足口病之流行也被認為是公衆衛生上的問題,在厚生科學審議會上,對其預防及傳播之制止有效的疫苗是被指定作為一開發優先度高的疫苗。
已知皰疹性咽峽炎,一般是以發燒與在口腔黏膜出現水疱性發疹為特徵的急性病毒性咽頭炎,且常是以嬰幼兒為中心在夏季流行。皰疹性咽峽炎的主要感染途徑是飛沫感染及糞口感染。針對皰疹性咽峽炎的治療方法亦尚未確立,而期待利用疫苗等的預防。
無菌性腦膜炎有發燒、頭痛、嘔吐的所謂3大特徴,且是可透過如下來診斷之症候群:存在頸部僵硬、Kernig徵象等腦膜刺激徵象;利用腦脊髓液常規檢查獲得標準診斷結果;利用腦脊髓液之塗抹、細菌培養而未檢測出細菌。儘管已知腸病毒以外之各式各樣病毒等也會引起無菌性腦膜炎,但主要的原因仍是腸病毒,特別是伊科病毒及克沙奇病毒。雖然感染途徑、流行病學上的性質會仰賴病原體,然在起因於腸病毒之無菌性腦膜炎的情況,與手足口病等同樣是在夏天以兒童為中心,經由飛沫感染及糞口感染而流行。針對無菌性腦膜炎之有效治療方法尚未確立,期待可利用疫苗等來預防。
作為針對病毒性疾病預防法之疫苗的有效性,從針對脊髓灰質炎病毒之疫苗等前例來看,是廣泛被認可的。疫苗抗原之候補,一般已知弱毒化株、以全粒子為首之不活化病毒、類病毒粒子(Virus Like Particle,以下「VLP」)、重組蛋白質、重組載體(vector)及胜肽等。針對腸病毒之疫苗,亦已有各式各樣的研究及報告。例如,非專利文獻1及非專利文獻2報告了將腸病毒以福馬林進行不活化之疫苗。專利文獻1報告了含有腸病毒之VP0~4的VLP。專利文獻2報告了腸病毒粒子及其製造法。專利文獻3報告了包含腸病毒之多樣病毒之VLP的製造法。非專利文獻3報告了EV71之F粒子的免疫原性。非專利文獻4報告了EV71不活化疫苗投予後之EV71基因型間及基因亞型的交差性。非專利文獻5報告了含有EV71之VP1~3的VLP作為針對EV71之疫苗。又,作為已經實用化之針對EV71之疫苗,可舉例如Sinovac公司的Inlive。
EV71,具有在直徑20~30nm之病毒殼體(capsid)內部封入了約7.4kb之單股RNA的結構,該殼體是由4種不同結構蛋白質(VP1~4)的60個拷貝構成。4個結構蛋白質組合(assemble)並形成單元體(protomer),5個單元體組合並形成五聚物(pentamer),12個五聚物與病毒基因組構成成熟的病毒體(virion)。EV71之基因亞型主要是根據VP1上之突變等來規定(非專利文獻6)。
先行技術文獻
專利文獻
專利文獻1:日本特表2014-532691號公報
專利文獻2:日本特表2017-517571號公報
專利文獻3:日本特表2015-528285號公報
專利文獻
專利文獻1:日本特表2014-532691號公報
專利文獻2:日本特表2017-517571號公報
專利文獻3:日本特表2015-528285號公報
非專利文獻
非專利文獻1:Lee MS, et al., Expert Rev Vaccines 9: 149-156, 2010
非專利文獻2:Xu J, et al., Vaccine 28: 3516-3521, 2010
非專利文獻3:Chia-Chyi Liu, et al., PLOS one, Vol6, Issue 5, May 2011
非專利文獻4:Longding Liu, et al., BMC Medicine, 2015, 13:226
非專利文獻5:Xiaoli Wang, et al., J. Virol. doi:10.1128/JVI.01330-17, 2017
非專利文獻6:Eun-Je Yi, et al., Clin Exp Vaccine Res 2017;6:4-14
非專利文獻1:Lee MS, et al., Expert Rev Vaccines 9: 149-156, 2010
非專利文獻2:Xu J, et al., Vaccine 28: 3516-3521, 2010
非專利文獻3:Chia-Chyi Liu, et al., PLOS one, Vol6, Issue 5, May 2011
非專利文獻4:Longding Liu, et al., BMC Medicine, 2015, 13:226
非專利文獻5:Xiaoli Wang, et al., J. Virol. doi:10.1128/JVI.01330-17, 2017
非專利文獻6:Eun-Je Yi, et al., Clin Exp Vaccine Res 2017;6:4-14
發明概要
本發明有關於針對腸病毒之疫苗。具體而言,本發明提供一種針對腸病毒顯示免疫原性之多肽、該多肽之製造方法、含有該多肽之針對腸病毒之疫苗及使用有該多肽之腸病毒關聯疾病之預防方法。更具體而言,本發明之多肽是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽。
本發明有關於針對腸病毒之疫苗。具體而言,本發明提供一種針對腸病毒顯示免疫原性之多肽、該多肽之製造方法、含有該多肽之針對腸病毒之疫苗及使用有該多肽之腸病毒關聯疾病之預防方法。更具體而言,本發明之多肽是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽。
發明欲解決之課題
疫苗之有效性一般而言是透過免疫原性來評價。有鑒於以手足口病為首之因腸病毒所引起之疾病的流行狀況,需要有針對腸病毒顯示出更高免疫原性之疫苗。並且,作為實用性疫苗,更是期望在使用有模式小鼠等的動物實驗上能顯示出高感染預防效果。
疫苗之有效性一般而言是透過免疫原性來評價。有鑒於以手足口病為首之因腸病毒所引起之疾病的流行狀況,需要有針對腸病毒顯示出更高免疫原性之疫苗。並且,作為實用性疫苗,更是期望在使用有模式小鼠等的動物實驗上能顯示出高感染預防效果。
用以解決課題之手段
本案發明人等有鑑於上述課題,製造了對腸病毒具有高免疫原性之疫苗。具體而言,著眼於腸病毒之結構、特別是VP0會分裂(cleavage)成VP2與VP4,即發現該分裂會影響免疫原性。亦即,可認為設計出含有許多VP2與VP4作為顯示免疫原性之多肽的疫苗,會關係到提供一種顯示高免疫原性之疫苗。已確認製造含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,該多肽作為針對腸病毒之免疫原具有高效果,而完成本發明。
本案發明人等有鑑於上述課題,製造了對腸病毒具有高免疫原性之疫苗。具體而言,著眼於腸病毒之結構、特別是VP0會分裂(cleavage)成VP2與VP4,即發現該分裂會影響免疫原性。亦即,可認為設計出含有許多VP2與VP4作為顯示免疫原性之多肽的疫苗,會關係到提供一種顯示高免疫原性之疫苗。已確認製造含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,該多肽作為針對腸病毒之免疫原具有高效果,而完成本發明。
以下進行本發明之詳細說明,本說明書中所使用之用語可依照微生物學、生化學、分子生物學、醫學及藥學領域中一般的定義來理解。但是,針對本說明書中特別說明或定義之用語,是以本說明書中之說明或定義為優先。又,本說明書中所引用之文獻是透過參照而作為本說明書之一部分。
第一態樣中,本發明提供一種多肽,是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,特徵在於在該VP2與VP4之結合部位含有蛋白酶會辨識之胺基酸序列。
腸病毒包含脊髓灰質炎病毒、克沙奇病毒A型、克沙奇病毒B型、伊科病毒及其他腸病毒,尤其在本發明中,是以腸病毒之A~D型腸病毒,特別是A型腸病毒為主題。本發明特別是以手足口病、皰疹性咽峽炎及無菌性腦膜炎等腸病毒關聯疾病之原因的病毒,例如,克沙奇病毒A型、克沙奇病毒B型、伊科病毒及A型腸病毒為主題。更具體而言,本發明有關於手足口病之原因的腸病毒,例如A型腸病毒,特別是EV71,尤其是克沙奇病毒A6、10及16。進一步,本發明有關於皰疹性咽峽炎之原因的腸病毒,例如克沙奇病毒A型、EV71、克沙奇病毒B型及伊科病毒,特別是克沙奇病毒A型,例如克沙奇病毒A2、3、4、5、6及10。
腸病毒之基因組RNA中,如圖1所示,存在稱作P1之編碼病毒結構蛋白質之區域與稱作P2及P3之編碼病毒非結構蛋白質之區域。P1相當於病毒殼體,該區域受到利用非結構蛋白質之病毒蛋白酶之加工(processing),會分裂成VP0~4之病毒結構蛋白質。腸病毒之殼體有由稱作原殼體(procapsid)之VP0、1及3之結構蛋白質形成之情況,或VP0分裂成VP2與4,而由VP1~4之結構蛋白質形成之情況。本說明書中,將前者稱為不完全粒子形狀之病毒、將後者稱為完全粒子形狀之病毒。
腸病毒之VP0、VP1、VP2、VP3及VP4的胺基酸序列及編碼該等之鹼基序列是已知,且可容易從DNA Data Bank of Japan (DDBJ)、EMBL-Bank/EBI、GenBank/National Center for Biotechnology Information (以下,NCBI)等資料庫獲得。例如EV71之BrCr序列資訊可自NCBI登錄編號U22521獲得。
本發明中,所謂「源自」用語,意指對象物與原本的病毒具有免疫學上的相同性,或與原本病毒之胺基酸序列具有一定的相同性,並應理解成不受制於製造方法。所謂免疫學上的相同性,意指針對原本病毒之免疫反應對對象物亦同樣會被引發。確認免疫學上的相同性之方法可為習於此藝者能利用之任何手段,而無限定到特定方法。一般而言,可透過對象物所誘導表現出之抗體是否可中和原本的病毒來確認,亦即,測定對象物所誘導表現出之中和抗體來確認。例如,「源自」腸病毒之記載,意指針對腸病毒之免疫反應針對對象物亦同樣會被引發,或者,具有與腸病毒之胺基酸序列一定的相同性,例如,具有可在微生物學上理解為腸病毒之程度的相同性。與胺基酸序列一定的相同性,意指在典型上為具有80%以上,且宜為90%以上,例如95%以上、宜為96%以上、較佳為97%以上、更佳為98%以上、最佳為99%以上之相同性。相同性的鑑定可利用習於此藝者通常可利用的任何鑑定方法,例如,以初期設定之參數使用BLAST。
舉個例子,由於可以說是源自腸病毒之VP1,首先,意指成為問題之多肽的胺基酸序列與從NCBI取得之任一腸病毒之VP1之胺基酸序列,在使用有初期設定參數之BLAST上具有一定的相同性,例如具有可在微生物學上理解為腸病毒之程度的相同性,且意指在典型上為具有80%以上,宜為90%以上,例如,95%以上、宜為96%以上、較佳為97%以上、更佳為98%以上、最佳為99%以上之相同性。
該領域皆知,將某胺基酸以具有同樣疏水性指數之其他胺基酸取代,然後,可產生仍然具有同樣生物學上機能之蛋白質(例如,在酵素活性上為等價之蛋白質。以下,「生物學等價體」)。在如此胺基酸取代中,宜為疏水性指數在±2以內,且以±1以內為佳、以±0.5以內更佳。該領域中可理解為基於疏水性之如此胺基酸的取代是有效率的。又,親水性指標亦是在製作生物學等價體時會考慮的。如美國專例第4、554、101號所記載,以下的親水性指數可分配到胺基酸殘基上:精胺酸(+3.0);離胺酸(+3.0);天冬胺酸(+3.0±1);穀胺酸(+3.0±1);絲胺酸(+0.3);天門冬醯胺(+0.2);麩胺醯胺(+0.2);甘胺酸(0);蘇胺酸(-0.4);脯胺酸(-0.5±1);丙胺酸(-0.5);組胺酸(-0.5);半胱胺酸(-1.0);甲硫胺酸(-1.3);纈胺酸(-1.5);白胺酸(-1.8);異白胺酸(-1.8);酪胺酸(-2.3);苯丙胺酸(-2.5);色胺酸(-3.4)。在如此胺基酸取代中,宜為親水性指數在±2以內,且以±1以內為佳、以±0.5以內更佳。
因此,本發明中,多肽可被保留性取代。所謂保留性取代,是說原本胺基酸與取代胺基酸之親水性指數及/或疏水性指數類似於上述的取代。保留性取代之例為習於此藝者所周知,可舉例如在以下各組內之取代:精胺酸與離胺酸;穀胺酸與天冬胺酸;絲胺酸與蘇胺酸;麩胺醯胺與天門冬醯胺;纈胺酸、白胺酸、及異白胺酸、等,然並未受限於該等。又,該保留性取代在本發明中亦是包含在「源自」之用語範圍。
本發明中,蛋白酶意指會分解胺基酸間之肽鍵之任何酵素,且不問其對象為蛋白質、高分子胜肽或低分子胜肽的哪一個。從可專一辨識VP2與VP4之結合部位,且希望不影響其他肽鍵來看,本發明中適宜之蛋白酶為受質專一性高者,可舉例如,半胱胺酸蛋白酶、3C蛋白酶、3CD蛋白酶等。
本發明中,蛋白酶並非任意分解肽鍵,而是各自辨識特定之胺基酸序列並專一的切斷肽鍵。因此,若選擇1種蛋白酶,便可直接決定該蛋白酶可辨識之胺基酸序列。某蛋白酶會辨識何種胺基酸序列,是記載於各種文獻,例如,記載於販賣蛋白酶之業者之說明書等之中。在3C蛋白酶或3CD蛋白酶之情況,辨識之胺基酸序列為X-X-Gln-Gly-X,且在Gln-Gly間發生切斷。例如,在HRV3C蛋白酶之情況,從Funakoshi公司提供之說明書可理解到,辨識之胺基酸序列為Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro,且在Gln-Gly間產生切斷。再者,X表示任意之胺基酸。
本發明中,發明人等發現,因VP0分裂成VP2與VP4會提升免疫原性。進一步發現,在利用細胞表現系統製做VLP等時,透過已知的鹼基序列製造本發明之多肽時,上述分裂是難以發生的。引起分裂之手法並無特別限定,例如,宜使用含有蛋白酶會辨識之胺基酸序列之多肽的手法。
本發明中,蛋白酶會辨識之胺基酸序列是依賴蛋白酶來決定的。由於腸病毒之基因組RNA中含有編碼3C蛋白酶或3CD蛋白酶之鹼基序列,因此本發明之多肽中,作為該蛋白酶會辨識之胺基酸序列,宜為X-X-Gln-Gly-X如此麩胺醯胺及甘胺酸呈連續之序列。進一步,本發明人等發現,宜為VP2與VP4之結合部位是該蛋白酶會辨識之胺基酸序列。例如,在本發明之多肽上,以3C蛋白酶或3CD蛋白酶受質專一的切斷VP2與VP4之結合部位,結果是,VP2之N末端會是甘胺酸,VP4之C末端會是麩胺醯胺。該蛋白酶會辨識之胺基酸序列在與野生型之胺基酸序列比較時,亦可具有取代、插入、刪除、或附加之任一突變。
因此,在較佳之態樣中,本發明提供一種多肽,為含有源自腸病毒,例如,A~D型腸病毒,且宜為A型腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,其特徵在於在該VP2與VP4之結合部位含有蛋白酶會辨識之胺基酸序列。
在更佳之態樣中,本發明提供一種多肽,為含有源自腸病毒,例如,A~D型腸病毒,且宜為A型腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,其特徵在於在該VP2與VP4之結合部位含有3C蛋白酶或3CD蛋白酶會辨識之胺基酸序列。
在更佳之態樣中,本發明提供一種多肽,為含有源自腸病毒,例如,A~D型腸病毒,且宜為A型腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,其特徵在於該VP2與VP4是藉由麩胺醯胺及甘胺酸呈連續之序列來連結。
在另一較佳之態樣中,本發明提供一種多肽,為含有源自腸病毒,例如,A~D型腸病毒,且宜為A型腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,其特徵在於該VP4之C末端含有麩胺醯胺、該VP2之N末端含有甘胺酸。
進一步,本發明人等發現,有鑑於在天然腸病毒中完全粒子形狀與不完全粒子形狀之病毒是混著存在的,透過從腸病毒中萃取出完全粒子形狀之病毒,可調整出具有比不完全粒子形狀之病毒還要高免疫原性的抗原。因此,在進一步的態樣中,本發明提供一種多肽,為含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,其特徵在於實質上不含腸病毒VP0。VP0是約36kDa之多肽,且含有約28kDa之VP2與約8kDa之VP4。
本發明中所謂「實質上不含」用語,意指在定量測定的情況,該含量與主成分相比,為30%以下、20%以下、10%以下,且宜為5%以下、以3%以下為佳、以1%以下更佳。此處之「主成分」單純是指在量上為主要之成分,而非意味性質上為主要。在定量測定上可利用之手段可為習於此藝者通常可選擇之任一方法,含量可使用該測定方法提供之通常的定量單位來掌握。例如,使用SDS-PAGE法檢測出之VP0之條帶(band)強度,與VP2之條帶強度相比,為30%以下、20%以下、10%以下、宜為5%以下、較佳為3%以下、更佳為1%以下時,可理解為「實質上不含」VP0。SDS-PAGE法是將添加在膠中之蛋白質混合物透過電泳並依照分子量來分離,並在染及脫色後分析條帶強度,使用之膠、試劑、薄膜(membrane)、標準(standard)及裝置等,若為習於此藝者則可適宜選擇。
在較佳之態樣中,本發明提供一種多肽,為含有源自腸病毒,例如,A~D型腸病毒,且宜為A型腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,其特徵在於實質上不含腸病毒VP0。
本發明之多肽可使用習於此藝者通常可利用之胜肽、多肽及蛋白質製造方法之任一來製造。該方法並不限定於其等,包含化學合成、病毒不活化及細胞表現系統。具體之製造方法或於其使用之試劑、條件及裝置等,若為習於此藝者則可容易選擇。例如,可將市售質之蛋白質表現套組,依照附在該套組之說明書來利用。
適宜之本發明多肽之製造方法為使用有病毒不活化或細胞表現系統的方法。可增殖腸病毒之細胞可舉Vero細胞、RD細胞(Rhabdomysarcoma細胞)、RD-A細胞、RD-18S細胞等。病毒不活化可藉由在疫苗上通常使用之福馬林處理等任何方法來進行。另一方面,A型腸病毒在使用了細胞之病毒培養時,有增殖上的問題,因此從量及成本的觀點來看,較佳為利用細胞表現系統來製作VLP。
使用有細胞表現系統之方法,若為可利用之表現載體及細胞,則無特別限制,例如,可將市售之載體及細胞依照附在該製品之說明書來利用。該載體並不限於該等,包含例如,HaloTag載體、pHEK293載體、BacPAK載體、pRI101DNA載體、桿狀病毒載體、pcDNA載體等,且可因應使用之細胞適宜選擇。可利用之細胞並不限定於該等,包含CHO細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、Vero細胞、MDCK細胞、大腸桿菌細胞、蠶細胞、菸葉細胞等。利用該細胞表現系統製做之多肽可舉例如如VLP。
使用有細胞表現系統之方法,若為可利用之表現載體及細胞,則無特別限制,例如,可將市售之載體及細胞依照附在該製品之說明書來利用。該載體並不限於該等,包含例如,HaloTag載體、pHEK293載體、BacPAK載體、pRI101DNA載體、桿狀病毒載體、pcDNA載體等,且可因應使用之細胞適宜選擇。可利用之細胞並不限定於該等,包含CHO細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、Vero細胞、MDCK細胞、大腸桿菌細胞、蠶細胞、菸葉細胞等。利用該細胞表現系統製做之多肽可舉例如如VLP。
從意圖投予到人類來看,本發明之多肽宜藉由使用有哺乳類細胞之表現系統來製造。使用有其他細胞,例如,大腸桿菌、植物及昆蟲細胞的表現系統亦可製造本發明之多肽,然從轉譯後修飾的觀點來看,宜使用哺乳類細胞。製造本發明多肽所適合之哺乳類細胞可舉例如CHO細胞。使用有該細胞之表現系統若為習於此藝者可利用之任何手段即可,雖不限定於該等,可舉例如利用質體之轉染(transfection)的暫時性表現系統。
舉個例子,為了製造本發明多肽而使用病毒不活化方法之情況,可依照以下步驟來製:
提供含有以下步驟的方法
・以細胞培養使腸病毒增殖之步驟
・將病毒液過濾處理之步驟
・將處理後病毒液以蔗糖密度梯度離心法取得相當於完全粒子形狀之病毒部分的步驟
・藉由將該病毒部分不活化,取得目的多肽之步驟。
提供含有以下步驟的方法
・以細胞培養使腸病毒增殖之步驟
・將病毒液過濾處理之步驟
・將處理後病毒液以蔗糖密度梯度離心法取得相當於完全粒子形狀之病毒部分的步驟
・藉由將該病毒部分不活化,取得目的多肽之步驟。
舉個例子,為了製造本發明之多肽使用細胞表現系統之情況,可依照以下步驟來製造:
・從腸病毒萃取RNA,或利用人工合成來設計DNA之步驟
・藉由萃取好之RNA且以RT-PCR來合成及放大DNA片斷,並黏合(ligation)到表現用質體之步驟;或將以前步驟人工合成之DNA片斷,直接或放大後黏合到表現用質體的步驟
・將獲得之質體轉染到細胞之步驟
・使經轉染之細胞增殖的步驟
・從已增殖之細胞回收本發明多肽之步驟。
・從腸病毒萃取RNA,或利用人工合成來設計DNA之步驟
・藉由萃取好之RNA且以RT-PCR來合成及放大DNA片斷,並黏合(ligation)到表現用質體之步驟;或將以前步驟人工合成之DNA片斷,直接或放大後黏合到表現用質體的步驟
・將獲得之質體轉染到細胞之步驟
・使經轉染之細胞增殖的步驟
・從已增殖之細胞回收本發明多肽之步驟。
在上述製造方法之任一步驟中,若為習於此藝者,皆可容易就試劑、條件、裝置等做選擇。又,在各步驟中,可適當插入為了確認是否獲得意圖結果的步驟。該確認步驟包含,例如,將萃取好之RNA序列以適當之定序法,例如,循環定序法或焦磷酸定序法等來確認,或將獲得之多肽以西方墨點法(WB)等來確認。
將VP0分裂成VP2與VP4之手段並無特別限定,可以導入突變以形成編碼成蛋白酶會辨識之胺基酸序列的鹼基序列。為了導入突變,可將原本的鹼基序列進行取代、插入、刪除、或附加,然並不侷限於該等。從腸病毒萃取RNA後,藉由RT-PCR並利用RNA來合成及放大DNA片斷,並將該DNA片斷黏合到表現用質體的步驟中,突變導入可在黏合時進行,亦可在黏合之前或後進行。被插入或取代之編碼蛋白酶會辨識之胺基酸序列的鹼基序列可使用密碼子表來容易決定。例如,使用3C蛋白酶或3CD蛋白酶時,編碼該蛋白酶會辨識之Gln-Gly的鹼基序列可使用例如CAAGGU。突變導入之具體方法可為習於此藝者可利用之任何手段,且不限定於該等,包含,例如,反向PCR法、互補引子法等。例如,可將市售之突變導入套組依照附在該套組之說明書來使用。
因此,在一態樣中,本發明提供一種方法,是將本發明多肽使用細胞表現系統來製造之方法,包含以下步驟:
・從腸病毒萃取RNA之步驟
・藉由萃取好之RNA且以RT-PCR來合成及放大DNA片斷,並黏合到表現用質體之步驟
・在經黏合之表現用質體上的該部分,導入編碼蛋白酶會辨識之胺基酸序列之鹼基序列的突變的步驟
・將獲得之質體轉染到細胞之步驟
・使被轉染之細胞增殖的步驟、從已增殖之細胞回收本發明多肽之步驟。
・從腸病毒萃取RNA之步驟
・藉由萃取好之RNA且以RT-PCR來合成及放大DNA片斷,並黏合到表現用質體之步驟
・在經黏合之表現用質體上的該部分,導入編碼蛋白酶會辨識之胺基酸序列之鹼基序列的突變的步驟
・將獲得之質體轉染到細胞之步驟
・使被轉染之細胞增殖的步驟、從已增殖之細胞回收本發明多肽之步驟。
又,在別的態樣中,本發明提供一種方法,是將本發明多肽使用細胞表現系統來製造之方法,包含以下步驟:
・透過人工合成,設計DNA的步驟,該DNA導入有編碼蛋白酶會辨識之胺基酸序列之鹼基序列
・將以前步驟人工合成之DNA,直接或放大後黏合到表現用質體的步驟
・將獲得之質體轉染到細胞之步驟
・使被轉染之細胞增殖的步驟、從已增殖之細胞回收本發明多肽之步驟。
・透過人工合成,設計DNA的步驟,該DNA導入有編碼蛋白酶會辨識之胺基酸序列之鹼基序列
・將以前步驟人工合成之DNA,直接或放大後黏合到表現用質體的步驟
・將獲得之質體轉染到細胞之步驟
・使被轉染之細胞增殖的步驟、從已增殖之細胞回收本發明多肽之步驟。
進一步在別的態樣中,本發明提供一種方法,是將本發明多肽使用細胞表現系統來製造之方法,含有以下步驟:
・從腸病毒萃取RNA之步驟
・透過萃取好之RNA,以RT-PCR合成及放大含有編碼VP1~4之鹼基序列的DNA片斷,並黏合到表現用質體的步驟
・將存在於黏合好之表現用質體上之編碼VP4與VP2之鹼基序列之間,導入編碼蛋白酶會辨識之胺基酸序列之鹼基序列的突變的步驟
・將獲得之質體轉染到細胞之步驟
・使被轉染之細胞增殖的步驟
・從已增殖之表現細胞回收本發明多肽之步驟。
・從腸病毒萃取RNA之步驟
・透過萃取好之RNA,以RT-PCR合成及放大含有編碼VP1~4之鹼基序列的DNA片斷,並黏合到表現用質體的步驟
・將存在於黏合好之表現用質體上之編碼VP4與VP2之鹼基序列之間,導入編碼蛋白酶會辨識之胺基酸序列之鹼基序列的突變的步驟
・將獲得之質體轉染到細胞之步驟
・使被轉染之細胞增殖的步驟
・從已增殖之表現細胞回收本發明多肽之步驟。
進一步,在別的態樣中,本發明提供一 種方法,是將本發明之多肽使用細胞表現系統來製造之方法,含有以下步驟:
・人工合成含有編碼源自腸病毒之VP1~4之鹼基序列的DNA的步驟,且該DNA在編碼VP4與VP2之鹼基序列之間,含有編碼蛋白酶會辨識之胺基酸序列的鹼基序列
・將以前步驟人工合成之DNA片斷,直接或放大後黏合到表現用質體的步驟
・將獲得之質體轉染到細胞之步驟
・使被轉染之細胞增殖的步驟
・從已增殖之表現細胞回收本發明多肽之步驟。
・人工合成含有編碼源自腸病毒之VP1~4之鹼基序列的DNA的步驟,且該DNA在編碼VP4與VP2之鹼基序列之間,含有編碼蛋白酶會辨識之胺基酸序列的鹼基序列
・將以前步驟人工合成之DNA片斷,直接或放大後黏合到表現用質體的步驟
・將獲得之質體轉染到細胞之步驟
・使被轉染之細胞增殖的步驟
・從已增殖之表現細胞回收本發明多肽之步驟。
如此製造出之本發明多肽可接受磷酸化或醣基化等修飾。接受該修飾之多肽亦是包含在本發明之多肽中。修飾包含,例如,表現細胞之轉譯後修飾。
又,本發明之多肽可透過各式各樣的相互作用而獲取任一的三級或四級結構。例如,透過本發明多肽內之離子鍵、氫鍵、雙硫鍵等,產生VP1~4之各次單元的折疊,並形成三級結構,接著,VP1~4之各次單元會組合,而可形成四級結構。一般而言,該高級結構在結構上越近似天然之病毒粒子,顯示越高的免疫原性。在本發明進一步發現,在結構上越近似完全粒子形狀,顯示越高的免疫原性。因此,在較佳之態樣中,本發明多肽為類完全粒子形狀的VLP或完全粒子形狀的不活化病毒。
進一步,本發明提供一種用以製造本發明多肽之表現卡匣(expression cassette)。表現卡匣是目的基因與啟動子的組合並導入至載體使用,前述啟動子是可操作來起始該目的基因之轉錄而結合。本發明亦謀求一種表現卡匣,含有核酸及起始該核酸轉錄之啟動子,且該核酸會編碼源自腸病毒(例如A~D型腸病毒,且宜為A型腸病毒)之VP1~4、蛋白酶及該蛋白酶會辨識之胺基酸序列。
本發明人等發現,本發明多肽具有對腸病毒之高免疫原性。進一步,本發明之多肽亦可期待基因型間及基因亞型間之免疫反應的交差性。因此,本發明提供一種疫苗,是針對腸病毒,例如A~D型腸病毒,且宜為A型腸病毒、較佳為EV71、克沙奇病毒A6、克沙奇病毒A10或克沙奇病毒A16、更佳為EV71、克沙奇病毒A6、克沙奇病毒A10及克沙奇病毒A16的疫苗,特徵在於含有本發明之多肽作為抗原。進一步,亦可為針對EV71之基因型為B型、進一步基因亞型為B5型的疫苗。
本發明中,「疫苗」用語意指含有可提高對特定病原體,例如病毒、細菌等之免疫力之抗原的醫藥製劑。不問為預防疫苗與治療疫苗之何者,本發明尤其是謀求預防疫苗。預防疫苗是對仍未罹患之對象投予疫苗,使其在體內誘發對特定病原體之免疫應答,提高對病原體之免疫力,藉此用以預防對該病原體之感染或重症化的醫藥製劑。疫苗之投予路徑並不限定於該等,可為例如皮下投予、皮內投予、肌肉內投予、經鼻投予、經皮投予、口服投予等。
本發明中,疾病是指腸病毒關聯疾病,例如腸病毒A~D型關聯疾病、典型是指A型腸病毒關聯疾病,具體而言,例如手足口病、皰疹性咽峽炎及無菌性腦膜炎,尤其是手足口病及皰疹性咽峽炎。
本發明之疫苗除了抗原之外,亦可含有其他在疫苗通常可使用之添加物。該添加物包含有載劑、防腐劑及佐劑等。例如,載劑包含水或生理食鹽水。例如,防腐劑包含酚、氯化苯索寧(Benzethonium Chloride)、2-苯氧乙醇、硫柳汞等。例如,佐劑包含鋁鹽、磷酸鋁、氯化鋁、氫氧化鋁、硫酸鋁、磷酸鈣、類鐸受體(TLR)配體分子、dsRNA、IL-12等。該等添加物,若為習於此藝者,可考慮到投予路徑等各式各樣的要因而適宜選擇。
本發明疫苗之對象為會感染腸病毒之動物,例如哺乳類,包含例如人類、猴子、牛、馬、豬、綿羊等。典型的對象為人類,尤其是容易感染腸病毒之未滿5歲的人類,然並未受限於其。
就此,本發明提供以下之態樣:
(態樣1)一種多肽,是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,特徵在於該VP2與VP4是經由VP0之分裂所獲得;
(態樣2)如態樣1之多肽,是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,且在該VP2與VP4之結合部位含有蛋白酶會辨識之胺基酸序列;
(態樣3)如態樣2之多肽,其中前述蛋白酶為3C或3CD蛋白酶;
(態樣4)如態樣3之多肽,其中前述蛋白酶會辨識之胺基酸序列是麩胺醯胺及甘胺酸呈連續的序列;
(態樣5)如態樣1至4中任一者之多肽,是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,其在VP2之N末端含有甘胺酸及在VP4之C末端含有麩胺醯胺;
(態樣6)如態樣1至5中任一者之多肽,其為類病毒粒子;
(態樣7)一種多肽,含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4,且實質上不含腸病毒VP0;
(態樣8)如態樣7之多肽,其為不活化全粒子;
(態樣9)如態樣1至8中任一者之多肽,其中腸病毒為A~D型任一型之腸病毒;
(態樣10)如態樣9之多肽,其中腸病毒為A型腸病毒;
(態樣11)如態樣10之多肽,其中A型腸病毒為腸病毒71(EV71)或克沙奇病毒A6或克沙奇病毒A10或克沙奇病毒A16;
(態樣12)如態樣10之多肽,其中A型腸病毒為腸病毒71(EV71)及克沙奇病毒A6及克沙奇病毒A10及克沙奇病毒A16;
(態樣13)如態樣12之多肽,其中EV71之基因型為B型;
(態樣14)如態樣12之多肽,其中EV71之基因亞型為B5型;
(態樣15)一種疫苗,是針對腸病毒之疫苗,且含有如態樣1至14中任一者之多肽作為抗原;
(態樣16)如態樣15之疫苗,其為針對A型腸病毒之疫苗;
(態樣17)如態樣15之疫苗,其中A型腸病毒為腸病毒71(EV71)或克沙奇病毒A6或克沙奇病毒A10或克沙奇病毒A16。
(態樣1)一種多肽,是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,特徵在於該VP2與VP4是經由VP0之分裂所獲得;
(態樣2)如態樣1之多肽,是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,且在該VP2與VP4之結合部位含有蛋白酶會辨識之胺基酸序列;
(態樣3)如態樣2之多肽,其中前述蛋白酶為3C或3CD蛋白酶;
(態樣4)如態樣3之多肽,其中前述蛋白酶會辨識之胺基酸序列是麩胺醯胺及甘胺酸呈連續的序列;
(態樣5)如態樣1至4中任一者之多肽,是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,其在VP2之N末端含有甘胺酸及在VP4之C末端含有麩胺醯胺;
(態樣6)如態樣1至5中任一者之多肽,其為類病毒粒子;
(態樣7)一種多肽,含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4,且實質上不含腸病毒VP0;
(態樣8)如態樣7之多肽,其為不活化全粒子;
(態樣9)如態樣1至8中任一者之多肽,其中腸病毒為A~D型任一型之腸病毒;
(態樣10)如態樣9之多肽,其中腸病毒為A型腸病毒;
(態樣11)如態樣10之多肽,其中A型腸病毒為腸病毒71(EV71)或克沙奇病毒A6或克沙奇病毒A10或克沙奇病毒A16;
(態樣12)如態樣10之多肽,其中A型腸病毒為腸病毒71(EV71)及克沙奇病毒A6及克沙奇病毒A10及克沙奇病毒A16;
(態樣13)如態樣12之多肽,其中EV71之基因型為B型;
(態樣14)如態樣12之多肽,其中EV71之基因亞型為B5型;
(態樣15)一種疫苗,是針對腸病毒之疫苗,且含有如態樣1至14中任一者之多肽作為抗原;
(態樣16)如態樣15之疫苗,其為針對A型腸病毒之疫苗;
(態樣17)如態樣15之疫苗,其中A型腸病毒為腸病毒71(EV71)或克沙奇病毒A6或克沙奇病毒A10或克沙奇病毒A16。
發明的效果
本發明之多肽不僅具有對腸病毒之高免疫原性,在動物試驗上亦顯示出高感染預防效果。為了確認本發明多肽之免疫原性,本發明人等製造含有VP1~4之多肽作為抗原蛋白質,進行對動物之免疫,測定中和抗體力價。又,在比較對象方面,製造含有VP0、1及3之多肽作為抗原蛋白質,並同樣的測定中和抗體力價。進一步,進行小鼠挑戰試驗,確認對腸病毒之感染預防效果。進一步,本發明之多肽亦可期待基因型間及基因亞型間之免疫反應的交差性。
本發明之多肽不僅具有對腸病毒之高免疫原性,在動物試驗上亦顯示出高感染預防效果。為了確認本發明多肽之免疫原性,本發明人等製造含有VP1~4之多肽作為抗原蛋白質,進行對動物之免疫,測定中和抗體力價。又,在比較對象方面,製造含有VP0、1及3之多肽作為抗原蛋白質,並同樣的測定中和抗體力價。進一步,進行小鼠挑戰試驗,確認對腸病毒之感染預防效果。進一步,本發明之多肽亦可期待基因型間及基因亞型間之免疫反應的交差性。
詳細的手法及結果留待實施例說明,然本發明之多肽,亦即含有VP1~4之多肽,與含有VP0、1及3之多肽相比,具有高中和抗體誘導能力。因此,本發明之多肽具有對腸病毒之高免疫原性,作為針對腸病毒之疫苗的抗原是有用的。再者,在臨床症狀或病原性類似之病毒上,可期待同樣的效果。
實施例
(實施例1)製作及評價EV71之不活化病毒
1.製作EV71之完全粒子形狀及不完全粒子形狀之不活化病毒
使用RD-A細胞培養EV71B5型(臨床分離株)( CellSTACK、10室 (chamer)、Corning公司)。將培養液中之細胞打碎,取得病毒液。將病毒液離心、過濾(0.45μm→0.22μm),並除去細胞殘渣。使用GE Healthcare公司之AKTA flux s(分子量截留值500kDa)將濾液進行超濾濃縮。使用Hitachi公司之超離心機CP80wx製作病毒粒子的沉澱物(pellet)。使沉澱物懸浮在PBS中一晩,並使其再浮游。接著,將懸浮液使用透過超離心機CP80wx之蔗糖密度梯度離心法(10~40%)而獲得區份(fraction)。透過SDS-PAGE及WB,可確認到完全粒子區份及不完全粒子區份。結果顯示在圖2。完全粒子區份是集中在35%前後(約1.15g/mL)、不完全粒子區份是集中在25%前後(約1.11g/mL)的蔗糖密度梯度。將完全粒子區份及不完全粒子區份使用Merck Millipore公司的Amicon Ultra進行濃縮。使用福馬林進行病毒的不活化,並使經不活化的病毒液感染RD-A細胞,並透過測定CPE之有無進行不活化的確認。
(實施例1)製作及評價EV71之不活化病毒
1.製作EV71之完全粒子形狀及不完全粒子形狀之不活化病毒
使用RD-A細胞培養EV71B5型(臨床分離株)( CellSTACK、10室 (chamer)、Corning公司)。將培養液中之細胞打碎,取得病毒液。將病毒液離心、過濾(0.45μm→0.22μm),並除去細胞殘渣。使用GE Healthcare公司之AKTA flux s(分子量截留值500kDa)將濾液進行超濾濃縮。使用Hitachi公司之超離心機CP80wx製作病毒粒子的沉澱物(pellet)。使沉澱物懸浮在PBS中一晩,並使其再浮游。接著,將懸浮液使用透過超離心機CP80wx之蔗糖密度梯度離心法(10~40%)而獲得區份(fraction)。透過SDS-PAGE及WB,可確認到完全粒子區份及不完全粒子區份。結果顯示在圖2。完全粒子區份是集中在35%前後(約1.15g/mL)、不完全粒子區份是集中在25%前後(約1.11g/mL)的蔗糖密度梯度。將完全粒子區份及不完全粒子區份使用Merck Millipore公司的Amicon Ultra進行濃縮。使用福馬林進行病毒的不活化,並使經不活化的病毒液感染RD-A細胞,並透過測定CPE之有無進行不活化的確認。
2.評價EV71之完全粒子形狀及不完全粒子形狀的不活化病毒
2-1. 評價免疫原性
以EV71之完全粒子形狀之不活化病毒或不完全粒子形狀之不活化病毒將BALB/c小鼠進行免疫,採取血清並測定中和抗體力價。具體而言,對4週齡之BALB/c小鼠分別注射完全粒子形狀之不活化病毒或不完全粒子形狀之不活化病毒0.1μg,並在6週齡及8週齡時分別同量追加進行免疫。在10週齡進行全採血,獲得約0.8mL的血清。將小鼠血清進行2倍階段稀釋,製作1/2~1/4096的稀釋系列,並在於各稀釋系列中添加調製成5×103 PFU/mL的EV71病毒液後,在37℃、5%CO2 下反應4小時來中和病毒。設不含小鼠血清者為負控制。於前日預先播種好之RD-A細胞(6孔盤)添加中和反應液,並在37℃下,在1小時內每隔15分將盤子進行振盪,使病毒感染細胞。將病毒液抽吸去除後,添加並重疊甲基纖維素。在37℃、5%CO2 下培養5天,在抽吸去除甲基纖維素後,利用經10倍稀釋之甲醛液固定細胞。以結晶紫將細胞染色,計數斑點數。令負控制之斑點數為100%,算出添加有中和反應液之孔的斑點數成為20%以下之最大稀釋率以作為抗體力價。結果顯示在圖3。由圖3可知,藉由使用完全粒子形狀之不活化病毒作為抗原,顯示出比不完全粒子形狀之不活化病毒還要高的中和抗體誘導能力。
2-1. 評價免疫原性
以EV71之完全粒子形狀之不活化病毒或不完全粒子形狀之不活化病毒將BALB/c小鼠進行免疫,採取血清並測定中和抗體力價。具體而言,對4週齡之BALB/c小鼠分別注射完全粒子形狀之不活化病毒或不完全粒子形狀之不活化病毒0.1μg,並在6週齡及8週齡時分別同量追加進行免疫。在10週齡進行全採血,獲得約0.8mL的血清。將小鼠血清進行2倍階段稀釋,製作1/2~1/4096的稀釋系列,並在於各稀釋系列中添加調製成5×103 PFU/mL的EV71病毒液後,在37℃、5%CO2 下反應4小時來中和病毒。設不含小鼠血清者為負控制。於前日預先播種好之RD-A細胞(6孔盤)添加中和反應液,並在37℃下,在1小時內每隔15分將盤子進行振盪,使病毒感染細胞。將病毒液抽吸去除後,添加並重疊甲基纖維素。在37℃、5%CO2 下培養5天,在抽吸去除甲基纖維素後,利用經10倍稀釋之甲醛液固定細胞。以結晶紫將細胞染色,計數斑點數。令負控制之斑點數為100%,算出添加有中和反應液之孔的斑點數成為20%以下之最大稀釋率以作為抗體力價。結果顯示在圖3。由圖3可知,藉由使用完全粒子形狀之不活化病毒作為抗原,顯示出比不完全粒子形狀之不活化病毒還要高的中和抗體誘導能力。
2-2. 挑戰試驗小鼠生存率之評價
以EV71之完全粒子形狀的不活化病毒及不完全粒子形狀的不活化病毒將hSCARB2表現Tg-小鼠進行免疫後,接種EV71B5型(臨床分離株),並測定小鼠的生存率。上述hSCARB2表現Tg-小鼠是以記載於Ken Fujii, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2013 Sep 3;110(36):14753-8的手法取得。對4週齡之hSCARB2表現Tg-小鼠分別注射完全粒子形狀之不活化病毒及不完全粒子形狀之不活化病毒0.1μg進行免疫,並在6週齡及8週齡時分別同量追加進行免疫。在10週齡將106 CCID50 之病毒接種在小鼠腹腔內。從腹腔內接種2週間後之小鼠的生存率顯示在圖4。從圖4可知,藉由使用完全粒子形狀之不活化病毒作為抗原,顯示出比不完全粒子形狀之不活化病毒還要高的生存率。
以EV71之完全粒子形狀的不活化病毒及不完全粒子形狀的不活化病毒將hSCARB2表現Tg-小鼠進行免疫後,接種EV71B5型(臨床分離株),並測定小鼠的生存率。上述hSCARB2表現Tg-小鼠是以記載於Ken Fujii, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2013 Sep 3;110(36):14753-8的手法取得。對4週齡之hSCARB2表現Tg-小鼠分別注射完全粒子形狀之不活化病毒及不完全粒子形狀之不活化病毒0.1μg進行免疫,並在6週齡及8週齡時分別同量追加進行免疫。在10週齡將106 CCID50 之病毒接種在小鼠腹腔內。從腹腔內接種2週間後之小鼠的生存率顯示在圖4。從圖4可知,藉由使用完全粒子形狀之不活化病毒作為抗原,顯示出比不完全粒子形狀之不活化病毒還要高的生存率。
(比較例1)製作及評價EV71之VLP (無突變)
1.透過細胞表現系統之EV71之VLP的製作與確認
依照附在Roche公司之High Pure Viral RNA Kit的說明書,從EV71B5型(臨床分離株)萃取RNA。將獲得之RNA之P1區域及蛋白酶區域,依照附在TaKaRa公司之PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit的說明書,利用RT-PCR進行放大。將獲得之放大DNA片斷黏合到表現用質體pcDNA3.4。在TaKaRa公司之E. coli JM109 Competent Cells,依照所附之說明書,將製作好之質體進行轉形後,將細胞播種到培養基並使其增殖。從獲得之大腸桿菌細胞,依照附在Invitrogen公司之Plasmid DNA Midiprep kit的說明書,萃取VLP表現用質體。獲得之質體中的EV71之VLP表現卡匣顯示在圖5。VLP表現卡匣中包含EV71之P1、2A自己分裂序列、3CD蛋白酶及CMV啟動子。
1.透過細胞表現系統之EV71之VLP的製作與確認
依照附在Roche公司之High Pure Viral RNA Kit的說明書,從EV71B5型(臨床分離株)萃取RNA。將獲得之RNA之P1區域及蛋白酶區域,依照附在TaKaRa公司之PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit的說明書,利用RT-PCR進行放大。將獲得之放大DNA片斷黏合到表現用質體pcDNA3.4。在TaKaRa公司之E. coli JM109 Competent Cells,依照所附之說明書,將製作好之質體進行轉形後,將細胞播種到培養基並使其增殖。從獲得之大腸桿菌細胞,依照附在Invitrogen公司之Plasmid DNA Midiprep kit的說明書,萃取VLP表現用質體。獲得之質體中的EV71之VLP表現卡匣顯示在圖5。VLP表現卡匣中包含EV71之P1、2A自己分裂序列、3CD蛋白酶及CMV啟動子。
使用Thermo公司之ExpiCHO Expression System,以暫時性表現製作VLP。具體而言,將ExpiCHO-S細胞以ExpiCHO Expression Medium培養到達到預定之細胞密度。於培養好之ExpiCHO-S細胞添加經OptiPRO SFM Complexation Medium稀釋之ExpiFectamine CHO Reagent及VLP表現用質體,進行轉染。將轉染好之細胞以ExpiCHO Expression Medium進行培養,添加ExpiCHO Feed及ExpiFectamine CHO Enhancer,再繼續培養。培養期間中,確認細胞生存率,在自轉染8日後,停止培養,並回收。將獲得之培養液進行離心、分離細胞與上清液,回收上清液,並以過濾器過濾(0.22μm)。將獲得之上液清,以分子量截留值500kDa來使用GE Healthcare公司的AKTA flux s,進行超濾濃縮。使用Hitachi公司之超離心機CP80wx製作VLP之沉澱物。
使VLP之沉澱物懸浮在PBS中一晩,並使其再浮游。進一步,將懸浮液施實施利用超離心機CP80wx之蔗糖密度梯度離心(10~40%),進行分區(fractionation),並將各區份實施SDS-PAGE及WB,確認VLP區份。結果顯示在圖6之Lane2與4。由此可知,該VLP區份含有許多分裂前的VP0。
2. 評價透過細胞表現系統之EV71之VLP的免疫原性
使用製作好之VLP,並以與實施例1之2-1.同樣的手法測定中和抗體力價。結果顯示在圖8之類不完全粒子形狀VLP。與圖3比較可知,製作好之VLP顯示出與不完全粒子形狀之不活化病毒同等程度的中和抗體力價,且顯示出比完全粒子形狀之不活化病毒還要低的中和抗體力價。
使用製作好之VLP,並以與實施例1之2-1.同樣的手法測定中和抗體力價。結果顯示在圖8之類不完全粒子形狀VLP。與圖3比較可知,製作好之VLP顯示出與不完全粒子形狀之不活化病毒同等程度的中和抗體力價,且顯示出比完全粒子形狀之不活化病毒還要低的中和抗體力價。
(實施例2)製作及評價EV71之VLP (有突變)
1.製作與確認透過細胞表現系統之EV71的VLP
利用反向PCR法,在質體中之P1(病毒殼體)區域內之VP4-VP2間插入Gln-Gly突變。具體而言,以EV71之基因序列資訊為基礎,設計出用以在該處插入突變之引子。使用TaKaRa BIO公司之PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit,依照所附之說明書,進行反轉錄反應及PCR反應。PCR反應是將98℃(10sec)→60℃(15sec)→68℃(7.5min)反覆進行30循環。使用DpnI分解突變未導入之質體後,使用TaKaRa BIO Clontech公司之In-Fusion HD Cloning Kit,依照所附之說明書,處理PCR產物(50℃、15min)。之後,對大腸桿菌進行轉形。除上述,其餘是以與比較例1之1.同樣的手法製作VLP。
1.製作與確認透過細胞表現系統之EV71的VLP
利用反向PCR法,在質體中之P1(病毒殼體)區域內之VP4-VP2間插入Gln-Gly突變。具體而言,以EV71之基因序列資訊為基礎,設計出用以在該處插入突變之引子。使用TaKaRa BIO公司之PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit,依照所附之說明書,進行反轉錄反應及PCR反應。PCR反應是將98℃(10sec)→60℃(15sec)→68℃(7.5min)反覆進行30循環。使用DpnI分解突變未導入之質體後,使用TaKaRa BIO Clontech公司之In-Fusion HD Cloning Kit,依照所附之說明書,處理PCR產物(50℃、15min)。之後,對大腸桿菌進行轉形。除上述,其餘是以與比較例1之1.同樣的手法製作VLP。
將製作好之VLP區份使用Merck Millipore公司之Amicon Ultra進行濃縮。以穿透式電子顯微鏡確認VLP之粒子結構(圖7)。又,以與比較例1之1.同樣的手法,進行藉由SDS-PAGE及WB之確認。結果顯示在圖6之Lane1與3。從圖6發現,藉由插入Gln-Gly突變,可促進從VP0朝向分裂為VP2與VP4。
2.評價藉由細胞表現系統之EV71之VLP的免疫原性
使用製作好之VLP,並以與實施例1之2-1.同樣的手法測定中和抗體力價。結果顯示在圖8之類完全粒子形狀VLP。由此發現,藉由導入突變且讓VP0朝向分裂成VP2與VP4,可誘導出高的中和抗體力價。
使用製作好之VLP,並以與實施例1之2-1.同樣的手法測定中和抗體力價。結果顯示在圖8之類完全粒子形狀VLP。由此發現,藉由導入突變且讓VP0朝向分裂成VP2與VP4,可誘導出高的中和抗體力價。
圖1顯示腸病毒之基因結構。
圖2顯示不活化疫苗之蔗糖密度梯度離心(10~40%)部分之SDS-PAGE及WB結果。
圖3顯示不活化疫苗之中和抗體力價。
圖4顯示不活化疫苗之挑戰試驗小鼠生存率。
圖5顯示含有EV71之VP1~4、2A自己分裂序列、3CD蛋白酶及CMV啟動子的EV71之VLP表現卡匣。
圖6顯示已純化之VLP之SDS-PAGE及WB的結果。
圖7顯示使用CHO細胞表現系統製造之含有EV71之VP1~4之VLP的TEM圖像。
圖8顯示含有EV71之VP1~4之類完全粒子形狀VLP,及含有EV71之VP0、1及3之類不完全粒子形狀VLP的中和抗體力價。
Claims (17)
- 一種多肽,是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,特徵在於該VP2與VP4是經由VP0之分裂所獲得。
- 如請求項1之多肽,是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,且在該VP2與VP4之結合部位含有蛋白酶會辨識之胺基酸序列。
- 如請求項2之多肽,其中前述蛋白酶為3C或3CD蛋白酶。
- 如請求項3之多肽,其中前述蛋白酶會辨識之胺基酸序列是麩胺醯胺及甘胺酸呈連續的序列。
- 如請求項1至4中任一項之多肽,是含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4之多肽,其在VP2之N末端含有甘胺酸及在VP4之C末端含有麩胺醯胺。
- 如請求項1至5中任一項之多肽,其為類病毒粒子。
- 一種多肽,含有源自腸病毒之VP1、VP2、VP3及VP4,且實質上不含腸病毒VP0。
- 如請求項7之多肽,其為不活化全粒子。
- 如請求項1至8中任一項之多肽,其中腸病毒為A~D型任一型之腸病毒。
- 如請求項9之多肽,其中腸病毒為A型腸病毒。
- 如請求項10之多肽,其中A型腸病毒為腸病毒71(EV71)或克沙奇病毒A6或克沙奇病毒A10或克沙奇病毒A16。
- 如請求項10之多肽,其中A型腸病毒為腸病毒71(EV71)及克沙奇病毒A6及克沙奇病毒A10及克沙奇病毒A16。
- 如請求項12之多肽,其中EV71之基因型為B型。
- 如請求項12之多肽,其中EV71之基因亞型為B5型。
- 一種疫苗,是針對腸病毒之疫苗,且含有如請求項1至14中任一項之多肽作為抗原。
- 如請求項15之疫苗,其為針對A型腸病毒之疫苗。
- 如請求項15之疫苗,其中A型腸病毒為腸病毒71(EV71)或克沙奇病毒A6或克沙奇病毒A10或克沙奇病毒A16。
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