JP6942309B2 - フラビウイルスウイルス様粒子 - Google Patents
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Description
第一の局面において、本願は、天然起源の構造からエンベロープ領域の少なくとも1つのアミノ酸が改変された、1つ以上のフラビウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子を提供する。
第二の局面において、本願は、本発明の第一の局面で提供するウイルス様粒子をコードするヌクレオチド配列を含むか、または、それからなる核酸分子を提供する。
第三の局面において、本願は、本願の第一の局面で提供するウイルス様粒子および/または本発明の第二の局面で提供する核酸分子を含む、組成物またはワクチンを提供する。
第四の局面において、本願は、本願の第一の局面で提供するウイルス様粒子および/または本発明の第二の局面で提供する核酸分子を哺乳動物に接触させることを含む、フラビウイルスに対する抗体およびフラビウイルスに対する中和抗体を含有する抗血清の産生方法を提供する。
第五の局面において、第一の局面で提供するウイルス様粒子、第二の局面で提供するヌクレオチド分子、または第三の局面で提供する組成物が投与される対象において、デング熱などのフラビウイルス感染により引き起こされる疾患または症状を処置する方法が提供される。先に挙げたVLP、ヌクレオチド分子、または組成物を対象に投与することにより、フラビウイルスに対する免疫応答が増強され得、従って、フラビウイルス感染により引き起こされる疾患または症状は効果的に処置され得る。本局面において、該VLP、ヌクレオチド分子、または組成物は、患者に対し、罹患臓器に局所的に、あるいは、全身的に投与されてよい。
第六の局面において、本願は、本発明の第一の局面で提供するウイルス様粒子を作製する方法であって:ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞を培養すること;および細胞培養液からウイルス様粒子を回収することを含む方法を提供する。
第七の局面において、本願は、哺乳動物におけるフラビウイルス感染を診断する方法またはキットで用いるための、ウイルス様粒子を提供する。該ウイルス様粒子を用いることにより、フラビウイルスに特異的な抗体を検出可能な酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)診断キットが作製され得る。
1〜2型デングウイルスのタンパク質または断片を含む、ウイルス様粒子の作製
1型および2型デングウイルス構造タンパク質を、野生型ウイルス構造タンパク質として用いた。ウイルス構造タンパク質のエンベロープ領域に、少なくとも1つの改変を導入した。つまり、1型デングウイルスエンベロープタンパク質(配列番号20)の位置108のアミノ酸PheをAlaに改変し(F108A)、1型デングウイルスエンベロープタンパク質の位置203のアミノ酸LysをAsnに改変し(K203N)(エンベロープ領域:配列番号4の172-676aa)、位置246のアミノ酸AsnをMetに改変した(K246M)。本実施例において、エンベロープ領域は配列番号2の172-676aaに相当し、配列番号20の位置108は配列番号2の位置289に相当し、配列番号20の位置203は配列番号2の位置384に相当し、配列番号20の位置246は配列番号2の位置427に相当する。本実施例において、エンベロープ領域の変異は、エンベロープ領域から始まる数字を用いて表現される。
デングウイルス構造タンパク質prMおよびエンベロープを含むウイルス様粒子の調製。
実施例1で用いた、prMおよび修飾エンベロープタンパク質F108A、K203N、またはK203N+F108A(それぞれ配列番号1、3、15)を含有するデングウイルス構造タンパク質の発現ベクターを用いた。実施例1と同じ方法で、20μgのベクターを293F細胞に遺伝子導入して培養した。遺伝子導入細胞の上清を、遺伝子導入の4日後に回収した。ウエスタンブロットを行い、一次抗体としてモノクローナル抗体(9.F. 10, Santa Cruz Biotech)を用い、二次抗体としてウサギ抗マウスIgG-HRP結合抗体を用いて、DENV VLPを検出した。結果は図4に示す。図4が示すように、DENV1-prMおよび少なくとも1つの改変を有するエンベロープタンパク質により遺伝子導入した細胞は、より高いエンベロープタンパク質量を産生した。
デングウイルスに対する抗体
実施例2で得られた精製VLP(K203N+F108A)をDEN1 VLPと名付け、本実施例で用いた。精製ウイルス様粒子を、さらに、スピンカラム(分子量カットオフ:100kDa)を用いて濃縮し、免疫化のためのウイルス様粒子を作製した。その後、4匹のマウスを、0週目および4週目に、アルミニウムアジュバント(アルハイドロゲル2%, Sergeant Aduvants)を含有するPBS中の30μgのDEN1 VLPを用いて、筋肉内注射により2回免疫化した。
以下のデング血清型1〜4を用いた:
DENV-1、Philippine-99St12A株
DENV-2、Philippine-00St22A株
DENV-3、Philippine-SLMC50株
DENV-4、Philippine-SLMC318株
JEV-JaOAr S-982株
デングウイルス様粒子を含む医薬組成物の作製
実施例1に従い、デングウイルス様粒子を作製した。ワクチン組成物である医薬組成物を調製するために、作製した80μgの各粒子を、1mlのリン酸スクロース溶液、pH7.2、エンドトキシン不含有(Teknova, SP buffer)と混合した。
デングウイルス2〜4型由来ウイルス様粒子の作製
エンベロープ領域のアミノ酸位置108(配列番号22−24の289aaに相当)がFからAに置換され、エンベロープタンパク質のC末端領域(478-676aaまたは476-674aa)が1型デングウイルスエンベロープタンパク質に相当する配列(配列番号22の478-676aa)で置換されている、2〜4型デングウイルスのprMおよびエンベロープタンパク質の発現ベクターを作製する。該ベクターにより発現されたタンパク質は、配列番号22−24で表されるタンパク質である。ウイルス様粒子は、実施例1と同じ方法で得られる。
Claims (18)
- 配列番号2、4、8、10、14、16、23および24のいずれかで表されるアミノ酸配列の、アミノ酸位置16からC末端までのアミノ酸配列を含むタンパク質であるフラビウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子。
- 該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号2、4、8、10、14または16のアミノ酸配列の、アミノ酸位置16からC末端までのアミノ酸配列を含む、請求項1記載のウイルス様粒子。
- 該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号2、10、14、16、23または24のアミノ酸配列の、アミノ酸位置16からC末端までのアミノ酸配列を含む、請求項1記載のウイルス様粒子。
- 該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号2、10、14、または16のアミノ酸配列の、アミノ酸位置16からC末端までのアミノ酸配列を含む、請求項3記載のウイルス様粒子。
- 該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号2、4、8、10、14、16、23および24のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項1記載のウイルス様粒子。
- 該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号2、4、8、10、14および16のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項5記載のウイルス様粒子。
- 該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号2、4、8、10、14、16、23および24のいずれかで表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項1記載のウイルス様粒子。
- 該フラビウイルス構造タンパク質が、配列番号2、4、8、10、14、および16のいずれかで表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項7記載のウイルス様粒子。
- 請求項1−8のいずれか記載のウイルス様粒子に含有されるフラビウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 配列番号1、3、7、9、13および15のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなる、単離された核酸分子。
- 請求項9または10に記載の核酸分子を含むベクターであって、該核酸分子に操作可能に結合している発現制御配列を含んでよい、ベクター。
- (a)請求項1−8のいずれか記載のウイルス様粒子、および/または請求項9−11のいずれか記載の核酸分子;および
(b)薬学的に許容される担体
を含む、医薬組成物。 - 請求項1−8のいずれか記載のウイルス様粒子を含む、ワクチン組成物。
- 請求項9−11のいずれか記載の核酸分子を含む、DNAワクチン組成物。
- 請求項1−8のいずれか記載のウイルス様粒子および/または請求項9−11のいずれか記載の核酸分子を、非ヒト哺乳動物に接触させることを含む、抗体の産生方法。
- フラビウイルス感染により引き起こされる疾患または症状を処置または予防するための、請求項12−14のいずれかに記載の組成物。
- 請求項1−8のいずれか記載のウイルス様粒子に含有される少なくとも1つのフラビウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を用いて遺伝子導入した細胞を培養すること;および細胞培養液からウイルス様粒子を回収することを含む、請求項1−8のいずれか記載のウイルス様粒子を作製する方法。
- 請求項1−8のいずれか記載のウイルス様粒子を含む、哺乳動物におけるフラビウイルス感染の診断のためのキット。
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