KR20170055513A - 플라비바이러스 바이러스 유사 입자 - Google Patents

Abstract

본 출원은 하나 이상의 플라비바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자, 및 이를 포함하는 조성물 또는 백신, 플라비바이러스 감염의 예방 또는 치료에서의 이의 용도를 제공한다. 플라비바이러스 구조 단백질은 외피 영역 중에 적어도 하나의 아미노산 변형을 함유한다. 플라비바이러스의 예는 뎅기 바이러스를 함유한다.

Description

플라비바이러스 바이러스 유사 입자 {FLAVIVIRUS VIRUS LIKE PARTICLE}

본 발명은 하나 이상의 플라비바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자, 및 이를 포함하는 조성물 또는 백신, 의약에서의, 특히 플라비바이러스 감염의 예방 또는 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.

플라비바이러스는 70 가지가 넘는 상이한 바이러스를 포함하며, 이들 중 다수는 절지동물-유래이고, 모기 또는 진드기에 의해 전염된다.

플라비바이러스는 플라비비리다에 (Flaviviridae) 과의 바이러스 속이다. 상기 속은 웨스트 나일 바이러스 (West Nile virus: WNV), 뎅기 바이러스 (DENV), 진드기-유래 뇌염 바이러스 (TBEV), 황열병 바이러스 (YFV), 일본 뇌염 (JEV), C 형 간염 바이러스 (HCV) 및 뇌염 또는 출혈성 질환을 일으킬 수 있는 여러 다른 바이러스를 포함한다.

뎅기열은 플라비바이러스에 의해 야기되는 모기-유래 질환이고, 대부분의 열대 및 많은 아열대 지역에 퍼져있다. 상기 질환은 다음과 같은 4 개의 가깝게 관련된 바이러스: 뎅기 바이러스 1 - 서브유형 I 내지 IV 포함, 뎅기 바이러스 2 - 서브유형 아시아 I 형 (Asian I), 아시아 II 형 (Asian II), 세계형 (Cosmopolitan), 미국형 (American) 및 미국/아시아형 (American/Asian) 포함, 뎅기 바이러스 3 - 서브유형 I 내지 IV 포함, 및 뎅기 바이러스 4 - 서브유형 I 내지 III 포함: 에 의해 야기된다. 뎅기가 전세계적인 질환 발병과 관련하여 가장 중요한 플라비바이러스임에도 불구하고, 상기 바이러스에 대항하는 백신의 개발 및 사용은 지금까지 백신-관련 부작용, 예컨대 감염의 면역 상승이라는 이론적인 위험 및 동시에 모든 4 개의 뎅기 혈청형에 대항하여 오래 지속되는 보호 면역 반응을 유도하는 필요조건에 의해 제한받았다.

효과적인 뎅기 치료법은 없고, 뎅기열에 대항하는 예방은 현재 벡터 통제 측정에만 제한된다. 그러므로 뎅기 백신이 질환의 통제에서 주요한 향상을 나타낼 것이다.

허가받은 뎅기 백신이 이용가능하지 않은 반면, 여러 개의 백신 후보가 현재 임상 연구에서 평가중이다. WHO 는 뎅기의 증가하는 전세계적인 유행에 대한 우려가 증가하며, 안전하고 효과적인 백신이 시급히 요구된다고 발표했다.

(http://www.who.int/immunization/research/development/dengue_vaccines/en/) and Vaccine 30 (2012) 4301-4306)

바이러스-유사 입자 (Virus-like particle: VLP) 는 진정한 고유의 바이러스의 조직 및 형태를 모방하나 임의의 바이러스 게놈을 함유하고 있지 않기 때문에 비-감염성인 다중단백질 구조이고, 잠재적으로 더욱 안전한 백신 후보를 산출한다. 몇몇의 예방적 VLP-기반 백신이 현재 세계적으로 시판된다: GlaxoSmithKline's Engerix^R (B 형 간염 바이러스) 및 Cervarix^R (인간 파필로마바이러스), 및 Merck and Co., Inc.'s Recombivax HB^R (B 형 간염 바이러스) 및 Gardasil^R (인간 파필로마바이러스) 가 몇몇 예이다. 기타 VLP-기반 백신 후보자는 임상 실험중이거나 전임상 평가 중이다 (예컨대 인플루엔자 바이러스, 파보바이러스, 노워크 (Norwalk) 및 다양한 키메라성 VLP). 많은 다른 것들이 전임상 실험에서의 성공에도 불구하고, 여전히 소규모 기본 연구에 제한된다. 대규모 VLP 제조의 영향은 공정 통제, 모니터링 및 최적화의 문맥에서 논의된다. 주요한 업-스트림 및 다운-스트림 기술적 도전이 확인되고 따라서 논의된다. 성공적인 VLP-기반 백신 블록버스터는 부수적으로 임상 실험으로부터의 최신 결과 및 치료적 또는 예방적 백신화를 위한 키메라성 VLP-기반 기술에서의 최근의 발달과 함께 간략하게 제시된다.

지금까지, VLP-기반 백신은 인간 및 다른 동물을 감염시키는 30 가지가 넘는 상이한 바이러스에 대해 제조되었다. 그 예에는 AAV (Adeno-associated virus: 아데노-연관 바이러스), H5N3 (Avian influenza: 조류 인플루엔자), BFDV (Budgerigar fledgling disease virus: 어린 잉꼬병 바이러스), BTV (Bluetongue virus: 청설병 바이러스), 에볼라 (Ebola), 엔테로바이러스 71 (Enterovirus 71), GHPV (Goose hemorrhagic polyoma virus: 거위 출혈 폴리오마 바이러스), HBV (B 형 간염 바이러스), HCV (C 형 간염 바이러스), HDV (δ 형 간염 바이러스), HEV (E 형 간염 바이러스), HIV, HPV (인간 파필로마바이러스), IBDV (Infectious bursal disease virus: 감염성 윤활낭병 바이러스), 인플루엔자 A (Influenza A), 인플루엔자 A H1N1, 인플루엔자 A H3N2, JC 폴리마바이러스, 마르구르그 (Margurg), MS2, IPCV (Indian peanut clump virus: 인도 땅콩 덤불 바이러스), NDV (Newcastle disease virus: 뉴캐슬 질환 바이러스), No (Norovirus: 노로바이러스) Nv (Norwalk virus: 노워크 바이러스), PhMV (Physalis mottle virus: 꽈리 반점 바이러스), 폴리마바이러스, PPV (Porcine parvovirus: 돼지 파보바이러스), RHDV (Rabbit hemorrhagic disease virus: 토끼 출혈병 바이러스), 로타바이러스 (Rotavirus), SARS, SIV (Simian immunodeficiency virus: 유인원 면역결핍 바이러스), SV40 (Simian virus 40: 유인원 바이러스 40), SVDV (Swine vesicular disease virus: 돼지 수포병 바이러스) 등이 포함된다. (Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010).

[비특허문헌]

[NPTL1]Vaccine 30 (2012) 4301-4306

[NPTL2] Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010

제 1 양상에서, 본 출원은 플라비바이러스 구조 단백질의 외피 영역이 아미노산 서열 중에 적어도 하나의 변형을 함유하는, 하나 이상의 플라비바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 제공한다.

제 2 양상에서, 본 출원은 본 출원의 제 1 양상에서 제공되는 바이러스 유사 입자 내에 함유되는 플라비바이러스 구조 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또는 이것으로 이루어지는 핵산 분자를 제공한다.

제 3 양상에서, 본 출원은 제 1 양상에서 제공되는 바이러스 유사 입자 및/또는 제 2 양상에서 제공되는 핵산 분자를 포함하는 조성물 또는 백신을 제공한다.

제 4 양상에서, 본 출원은 본 출원의 제 1 양상에서 제공되는 바이러스 유사 입자 및/또는 본 출원의 제 2 양상에서 제공되는 핵산 분자를 포유류와 접촉시키는 것을 포함하는, 항체 또는 중화 항체를 포함하는 항-혈청의 제조 방법을 제공한다.

제 5 양상에서, 본 출원은 본 출원의 제 3 양상에서 제공되는 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 플라비바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법 또는 포유류에서 플라비바이러스에 대항하는 면역 반응을 유도 및/또는 향상시키는 방법을 제공한다.

제 6 양상에서, 본 출원은 바이러스 유사 입자 내에 함유된 적어도 하나의 플라비바이러스 구조 단백질을 엔코딩하는 유전자로 트랜스펙션된 세포를 배양하는 단계; 및 세포 배양물로부터 바이러스 유사 입자를 회수하는 단계를 포함하는, 본 출원의 제 1 양상에서 제공되는 바이러스 유사 입자의 제조 방법을 제공한다. 본 양상은 추가로 바이러스 유사 입자 내에 함유된 적어도 하나의 플라비바이러스 구조 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 제조 단계를 포함할 수 있다.

제 7 양상에서, 본 출원은 포유류에서 플라비바이러스 감염을 진단하는 방법 또는 키트에서 사용하기 위한 바이러스 유사 입자를 제공한다.

[도 1] 도 1 은 뎅기 바이러스 게놈의 구축 및 뎅기 VLP 구축물의 하나의 예를 보여준다.
[도 2] 도 2 는 웨스턴 블롯팅에 의해 측정되는 상청액 중의 외피 단백질을 보여준다. 뎅기 유형 2 바이러스 prM 및 외피 단백질을 포함하는 바이러스 구조 단백질, 또는 뎅기 유형 2 바이러스 prM 및 뎅기 유형 2 및 뎅기 유형 1 의 키메라를 포함하는 바이러스 구조 단백질 (이때 뎅기 바이러스 유형 2 외피 단백질의 C-말단 영역을 상응하는 뎅기 바이러스 유형 1 C-말단 영역 (SEQ ID NO: 8 의 199aa-676aa) 에 대해 대체하였음), 또는 키메라성 외피 영역을 함유하는 바이러스 구조 단백질 (이때 키메라성 외피 영역 중에 하나의 아미노산 변형 (F108K, SEQ ID NO: 10 의 289aa 에서) 을 도입하였음) 에 대한 발현 벡터, 및 뎅기 바이러스 유형 1 캡시드 단백질에 대한 발현 벡터를 293F 세포에 트랜스펙션하였다. 뎅기 외피 단백질에 대항하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅을 배양 상청액에 대항하여 수행하였다.
[도 3] 도 3 은 웨스턴 블롯팅의 결과를 보여준다. 뎅기 유형 1 캡시드 단백질에 대한 발현 벡터와 함께, 뎅기 유형 1 바이러스 prM 및 변형이 있는 또는 없는 외피 (야생형, F108A, K203M, K246M F108A +K246M 또는 F108+K203N) 를 포함하는 바이러스 구조 단백질에 대한 발현 벡터를 293F 세포에 트랜스펙션하였다. 뎅기 외피 단백질에 대항하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅을 배양 상청액에 대항하여 수행하였다.
[도 4] 도 4 는 웨스턴 블롯팅의 결과를 보여준다. 뎅기 유형 1 바이러스 prM 및 변형이 있는 또는 없는 외피 (야생형, F108A, K203M 또는 F108+K203N) 를 포함하는 바이러스 구조 단백질에 대한 발현 벡터를 293F 세포에 트랜스펙션하였다. 뎅기 외피 단백질에 대항하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅을 배양 상청액에 대항하여 수행하였다.
[도 5] 도 5 는 음성으로 염색된 VLP (F108+K203N) 의 전자 현미경 (EM) 시각화를 보여준다.

(1) 하나 이상의 플라비바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자

제 1 양상에서, 본 출원은 외피 영역 중의 적어도 하나의 아미노산이 이의 자연 발생된 구조로부터 변형된, 하나 이상의 플라비바이러스 구조 단백질를 포함하는 바이러스 유사 입자를 제공한다.

플라비바이러스는 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기-유래 뇌염 바이러스, 황열병 바이러스, 일본 뇌염, 및 C 형 간염 바이러스 (HCV) 일 수 있다. 바람직한 플라비바이러스는 뎅기 바이러스이다. 뎅기 바이러스는: 뎅기 바이러스 1 - 서브유형 I 내지 IV 포함, 뎅기 바이러스 2 - 서브유형 아시아 I 형 (Asian I), 아시아 II 형 (Asian II), 세계형 (Cosmopolitan), 미국형 (American) 및 미국/아시아형 (American/Asian) 포함, 뎅기 바이러스 3 - 서브유형 I 내지 IV 포함, 및 뎅기 바이러스 4 - 서브유형 I 내지 III 포함: 일 수 있다. 명세서 및 청구항에서, 용어 "플라비바이러스 구조 단백질 또는 이의 절편" 은, 대상에서 면역계에 의해 인지될 수 있는, 및/또는 대상에서 세포-매개 면역 반응을 촉진하는 및/또는 대상에서 항체의 생성을 촉진하는, 플라비바이러스 유래의 임의의 펩티드-기반 서열을 말한다.

도 1 에서 제시되는 바와 같이, 뎅기 바이러스 구조 단백질은 캡시드 단백질, 전구체 막 단백질 및 외피 단백질로 이루어진다. 본 구현예에서, VLP 는 이들 구조 단백질 중 적어도 하나, 및 바람직하게는, 전구체 막 단백질 (prM) 및 외피 단백질을 포함한다. 뎅기 바이러스 구조 단백질은 개시 코돈 및 prM 서열의 아미노 말단에 대한 신호 서열에 상응하는 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.

적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 영역은 바람직하게는 SEQ ID NO: 17 의 개시 코돈 M 및 신호 펩티드에 이어 뎅기 바이러스 1 의 prM 및 외피 영역을 포함하는 SEQ ID NO: 21 의 단백질 (WestPac 균주, GenBank Accsession No: U88535) 의 아미노산 위치 182 와 아미노산 위치 676 사이, 더욱 바람직하게는 아미노산 위치 271 과 아미노산 위치 302 사이, 특히 아미노산 위치 280 과 아미노산 위치 291 사이, 특히 289, 또는 개시 코돈 M, 신호 펩티드에 이어 플라비바이러스의 prM 및 외피 영역 또는 이의 절편을 포함하는 단백질의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 21 에 의해 나타내지는 아미노산 서열과 정렬된 경우 상기-확인된 위치로서 결정된 위치 사이에 있을 수 있다.

뎅기 바이러스 유형 1 아미노산 서열의 외피 영역은 SEQ ID NO: 20 에 의해 나타내진다. 따라서, 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 영역은 상기 서열 내에, 바람직하게는 SEQ ID NO: 20 의 단백질의 아미노산 위치 90 과 아미노산 위치 121 사이, 특히 아미노산 위치 99 와 아미노산 위치 110 사이, 특히 108, 또는 플라비바이러스의 외피 또는 이의 절편의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 20 과 정렬된 경우 상기-확인된 위치로서 결정된 위치 사이에 있을 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "~ 에 상응하는 위치" 또는 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치가 기재된 서열에서, 예컨대 서열목록에 언급된, 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치 "에 상응한다" 라는 언급은, 표준 정렬 알고리즘을 사용하여 일치성을 최대화하기 위해 기재된 서열과 정렬시 확인된 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치를 말한다. 서열을 정렬함으로써, 당업자는 상응하는 잔기를 확인할 수 있다.

뎅기 바이러스 유형 1-4 와 같은 다양한 플라비바이러스의 바이러스 구조 단백질은 GenBank 데이터베이스와 같은 다양한 공개 데이터베이스에서 확인 및 이용가능하다. 예를 들어, 뎅기 바이러스 유형 1 (WestPac 균주): Accession No. U88535, 뎅기 바이러스 유형 2 (S1 백신 균주): Accession No. M19197, 뎅기 바이러스 유형 3 (균주 Singapore 8120/95): Accession No. AY766104 및 뎅기 바이러스 유형 4 (균주 ThD4_0476_97): Accession No. Y618988. 본 출원에 따르면, 뎅기 바이러스와 같은 플라비바이러스의 외피 단백질은 데이터베이스로부터 입수하여, SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 90 및 아미노산 위치 121 에 상응하는 위치, 예컨대 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 108 에 상응하는 위치 사이의 위치를 확인하기 위해 SEQ ID NO: 20 과 함께 정렬될 수 있다.

외피 영역 중에 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 것은 제외하고, 바이러스 유사 입자 내에 함유된 플라비바이러스 구조 단백질은 자연 발생 바이러스 구조 단백질 또는 이의 개질된 단백질일 수 있다. 하나의 구현예에서, 개질된 단백질은 prM 및 외피 단백질을 포함하는 자연 발생 바이러스 구조 단백질에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 아미노산 서열 일치성을 갖는다. 하나의 구현예에서, 개질된 단백질은 아미노산의 최대 10% 가 prM 및 외피 영역을 포함하는 자연 발생 바이러스 구조 단백질에 대해 결실, 치환, 및/또는 부가된 돌연변이체이다. 서열 일치성은 통상의 방법에 의해 결정될 수 있다.

본 출원에 따르면, 상기 논의된 하나 이상의 플라비바이러스 구조 단백질 또는 이의 절편은 이들이 입자 구조로 자발적으로 조립되는 한, 사용될 수 있다. 예를 들어, 뎅기 바이러스의 prM 및 외피 단백질을 엔코딩하는 유전자를 발현하는 진핵 세포를 배양할 때, 단백질이 세포에 의해 생성되고 조립되어 VLP 를 산출하고, VLP 가 세포 배양 상청액으로부터 수집될 수 있다.

본 출원은 VLP, VLP 를 엔코딩하는 벡터, 및 항원에 특이적으로 결합하는 항체 (및 앱타머 및 펩티드를 포함하는 항체-유사 분자) 를 제공함으로써, 플라비바이러스 감염의 예방 또는 치료에서의 이의 사용 (단독 또는 조합으로) 과 함께, 상기 필요성 중 하나 이상을 해결한다.

명세서 및 청구항에서 사용되는 바와 같은, 용어 "항체" 는 에피토프 또는 항원 결정소에 결합할 수 있는 분자를 말한다. 상기 용어는 전체 항체 및 이의 항원-결합 절편 (단일-사슬 항체를 포함) 을 포괄한다. 이러한 항체는 인간 항원 결합 항체 절편을 포함할 수 있고, 제한 없이, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-사슬 Fvs (scFv), 단일-사슬 항체, 디술피드-연결 Fvs (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 절편을 포함한다. 항체는 새 및 포유류를 포함하는 임의의 동물 기원일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 포유류 예를 들어, 인간, 쥣과, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말 등, 또는 다른 적합한 동물 예를 들어 닭이다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 유전자도입되고 예를 들어, 그 설명이 본원에 전체가 참고로서 인용된 미국 특허 제 5,939,598 호에 기재된 바와 같은 내생 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 단리된 항체를 포함한다.

플라비바이러스 구조 단백질은 자연 발생 단백질 또는 자연 발생 단백질의 개질된 단백질 또는 자연 발생 단백질 또는 개질된 펩티드의 절편일 수 있다. 개질된 단백질은 자연 발생 바이러스 구조 단백질의 절편일 수 있다.

하나의 구현예에서, 플라비바이러스 구조 단백질로부터 유래되는 개질된 단백질은 자연 발생 단백질에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 아미노산 서열 일치성을 갖는다. 하나의 구현예에서, 플라비바이러스로부터 유래되는 개질된 단백질은 아미노산의 최대 10% 가 플라비바이러스로부터 유래되는 자연 발생 바이러스 구조 단백질에 대해 결실, 치환, 및/또는 부가되는 돌연변이체이다.

하나의 구현예에서, 본 출원은 SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 및 16 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 아미노산 서열을 갖는 플라비바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 제공한다.

이들 서열 각각은 하기 영역을 함유하는 단백질을 나타낸다: 개시 코돈: M (1aa), 신호 서열 (2-15aa), pr 서열 (16-106aa), M 서열 (107-181aa), 및 외피 영역 (182-676aa). 하나의 구현예에서, SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 및 16 의 prM 및 외피 영역의 영역을 갖는 바이러스 구조 단백질을 포함하는, 즉, 상기 단백질의 위치 16 에서 위치 676 까지의 아미노산 서열을 포함하는 바이러스 유사 입자가 제공될 수 있다.

개질된 플라비바이러스 구조 단백질은 SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 및 16 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 아미노산 서열, 또는 상기 서열 중 하나의 위치 16 에서 위치 676 까지의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 아미노산 서열 일치성을 가질 수 있다. 또한, 개질된 플라비바이러스 구조 단백질은 아미노산의 최대 10% 가 SEQ ID Nos. SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 및 16 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 아미노산 서열, 또는 상기 서열 중 임의의 하나의 위치 16 에서 위치 676 까지의 아미노산 서열을 갖는 플라비바이러스 구조 단백질에 대해 결실, 치환, 및/또는 부가되는 돌연변이체일 수 있다.

(2) 뉴클레오티드 및 벡터

제 2 양상에서, 본 출원은 본 발명의 제 1 양상에서 제공되는 바이러스 유사 입자를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 또는 이것으로 이루어지는 핵산 분자를 제공한다.

하나의 구현예에서, 본 출원은 상기 기재된 바이러스 유사 입자를 제공하는 플라비바이러스 구조 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

하나의 구현예에서, 본 출원은 상기 기재된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 임의로 포함한다.

발현 조절 서열의 예는 제한 없이, 프로모터 예컨대 CMV 프로모터, 파지 람다 PL 프로모터, E. coli lac, phoA 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 및 레트로바이러스 LTR 의 프로모터를 포함한다.

하나의 구현예에서, 본 출원은 SEQ ID Nos.1, 3, 7, 9, 13 및 15 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 플라비바이러스 구조 단백질에 대한 발현 벡터를 제공한다.

하나의 구현예에서, 본 출원은 SEQ ID Nos.1, 3, 7, 9, 13 및 15 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자로부터 개질된 핵산 분자를 제공한다. 개질된 핵산 분자는 SEQ ID Nos.1, 3, 7, 9, 13 및 15 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 뉴클레오티드 서열 일치성을 가질 수 있다. 또한, 개질된 핵산 분자는 아미노산의 최대 10% 가 SEQ ID Nos.1, 3, 7, 9, 13 및 15 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 대해 결실, 치환, 및/또는 부가되는 돌연변이체일 수 있다.

(3) 조성물 또는 백신

제 3 양상에서, 본 출원은 본 출원의 제 1 양상에서 제공되는 바이러스 유사 입자 및/또는 본 발명의 제 2 양상에서 제공되는 핵산 분자를 포함하는 조성물 또는 백신을 제공한다.

하나의 구현예에서, 본 출원은 상기 기재된 플라비바이러스 바이러스 유사 입자 또는 상기 기재된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.

조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 아쥬반트를 추가로 포함할 수 있다. 아쥬반트의 예는 제한 없이, Ribi 용액 (Sigma Adjuvant system, Sigma-Aldrich) 을 포함한다.

본 출원의 약학 조성물은 단일 활성 성분 또는 2 개 이상의 활성 성분의 조합을, 이들이 본 발명의 목적과 반대되지 않는 한, 함유할 수 있다. 예를 들어, 케모카인을 포함하는 사이토카인, 사이토카인에 대항하는 항체, 예컨대 항-TNF 항체 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무밥), 항-VEGF 항체 (예를 들어, 베바시주맙 및 라니비주맙), 사이토카인 수용체 길항제 예컨대 항 HER2 항체 (예를 들어, 트라스투주맙), 항 EGF 수용체 항체 (예를 들어, 세툭시맙), 항 VEGF 앱타머 (예를 들어, 페갑타닙) 및 면역조절제 예컨대 시클로스포린, 타크롤리무스 및 우베니멕스가 조합 요법을 위해 사용될 수 있다.

다수의 활성 성분과 조합에서, 각 성분의 함량은 이들의 치료 효과 및 안전성을 고려하여 적합하게 증가 또는 감소될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "조합" 은 2 가지 이상의 활성 성분이 환자에게 단일한 독립체 또는 투여량의 형태로 동시에 투여되는 것, 또는 이들 활성 성분이 환자에게 특정한 시간 제한 없이 동시에 또는 순차적으로 분리된 독립체로서 투여되는 것을 의미하며, 이러한 투여가 체내에서 2 개 성분의 치료학적으로 효과적인 수준을, 바람직하게는 동시에 제공한다.

하나의 구현예에서, 조성물은 DNA 백신을 포함하는 백신 조성물이다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 DNA 백신은 CpG 함유 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

(4) 항체의 제조 방법

제 4 양상에서, 본 출원은 본 출원의 제 1 양상에서 제공되는 바이러스 유사 입자 및/또는 본 발명의 제 2 양상에서 제공되는 핵산 분자를 포유류에게 접촉시키는 것을 포함하는, 플라비바이러스에 대항하는 항체 또는 플라비바이러스에 대항하는 중화 항체를 포함하는 항혈청의 제조 방법을 제공한다.

본 양상에서 제조되는 항체는 포유류에 플라비바이러스-야기 병원체를 투여함으로써 포유류에서 플라비바이러스-야기 병원체에 대항하는 수동 면역화를 위해 사용될 수 있고, 따라서 플라비바이러스 감염으로부터 포유류를 예방하거나 또는 포유류에서 플라비바이러스 감염에 의해 야기되는 질환 또는 상태를 치료한다.

본 출원의 제 4 양상에서 제조되는 항체는 통상의 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명의 제 4 양상에서 제공되는 방법은 비-인간 포유류 제조된 항체의 인간화 단계를 추가로 포함한다. 본 양상에 의해 제공되는 항체 또는 인간화된 항체는 플라비바이러스 감염으로부터 인간 대상을 예방하기 위해 또는 대상에서 플라비바이러스 감염에 의해 야기되는 질환 또는 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 양상에 따라 제조되는 항체는 환자로부터 유래된 면역 세포, 예컨대 B-세포 및 T-세포로부터의 하위집단을 선택하기 위해 시험관 내에서 사용될 수 있으며, 이후 이들은 환자에게 재투여된다.

항혈청은 통상의 방식에 의해 수득될 수 있다. 면역화된 비-인간 동물로부터 혈액 샘플을 취하고, 혈액을 가공하여 항혈청, 즉, 혈액의 항체-함유 액체 성분을 수득한다. 비-인간 포유류는 바람직하게는 래트, 마우스, 햄스터, 돼지, 토끼, 말, 당나귀, 염소, 양, 기니아 피그, 라마, 및 비-인간 영장류 (예를 들어, 침팬치) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

(5) 대상에서 플라비바이러스 감염에 의해 야기되는 질환을 치료하는 또는 플라비바이러스 감염으로부터 대상을 예방하는 방법

제 5 양상에서, 제 1 양상에서 제공되는 바이러스 유사 입자, 제 2 양상에서 제공되는 뉴클레오티드 분자, 또는 제 3 양상에서 제공되는 조성물이 대상에게 투여되는, 대상에서 플라비바이러스 감염에 의해 야기되는 질환 또는 상태 예컨대 뎅기열을 치료하는 방법. 상기 나열된 VLP, 뉴클레오티드 분자 또는 조성물을 대상에게 투여함으로써, 플라비바이러스에 대항하는 면역 반응이 향상될 수 있고, 따라서, 플라비바이러스 감염에 의해 야기되는 질환 또는 상태가 효과적으로 치료될 수 있다. 본 양상에서, VLP, 뉴클레오티드 분자 또는 조성물은 환자에게 영향을 받는 기관에 국부적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다.

제 1 양상의 바이러스 유사 입자, 제 2 양상에서 제공되는 뉴클레오티드 분자 또는 제 3 양상의 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 플라비바이러스 감염으로부터 또는 플라비바이러스 감염에 의해 야기되는 질환으로부터 대상을 예방하는 방법. 플라비바이러스에 의해 야기되는 질환은 뎅기열일 수 있다.

본 출원에 따르면, 바이러스 유사 입자는 또한 면역 요법에 적용될 수 있다. VLP 는 환자에게 후속적으로 투여되는 인간 세포주 또는 환자로부터 유래되는 세포에 생체 외에서 적용될 수 있다.

(6) 바이러스 유사 입자의 제조 방법

제 6 양상에서, 본 출원은 바이러스 구조 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포를 배양하는 단계; 및 세포 배양물로부터 바이러스 유사 입자를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 제 1 양상에서 제공되는 바이러스 유사 입자의 제조 방법을 제공한다.

다양한 숙주-벡터 시스템이 바이러스 유사 입자의 발현을 위해 사용될 수 있다. 진핵 세포는 본 출원의 제 4 양상에 의해 제공되는 방법을 위해 사용될 수 있다. 진핵 세포의 예는 제한 없이, 곤충 세포 (예를 들어, sf9 세포, H5 세포), 효모 세포 (예를 들어, S. cerevisiae) 및 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 293F 세포) 를 포함한다. 본 출원의 제 2 양상에 의해 제공되는 방법에 사용되는 벡터는 발현하고자 하는 바이러스 유사 입자를 엔코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 세포는 통상의 방법 (예를 들어, 리포펙션, 전기천공법) 을 사용하여 벡터와 함께 트랜스펙션될 수 있다. 당업자는 사용되는 세포에 따라, 배양 배지 또는 DNA 메틸 트랜스페라아제 억제제 및 히스톤 디아세틸라아제 억제제, 예컨대 나트륨 부티레이트의 여부를 선택할 수 있다. 트랜스펙션 후, 바이러스 유사 입자는 세포 및/또는 배양 상청액에서 제조될 수 있다. 바이러스 유사 입자는 배양 상청액으로부터 회수되고 초원심분리를 사용하여 정제될 수 있다.

본 출원의 바이러스 유사 입자는 복제되지 않고, 따라서 고도로 안정한 프로파일을 갖는다.

(7) 플라비바이러스 감염을 진단하는 키트 또는 방법

제 7 양상에서, 본 출원은 포유류에서 플라비바이러스 감염을 진단하는 방법 또는 키트에서 사용하기 위한 바이러스 유사 입자를 제공한다. 바이러스 유사 입자를 사용함으로써, 플라비바이러스에 특이적인 항체를 검출할 수 있는 효소-연결 면역-흡착 어세이 (ELISA) 진단 키트가 제조될 것이다.

본 출원은 하기 실시예를 참고로 더욱 상세히 기술될 것이며, 그러나 하기 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

[실시예 1]

뎅기 바이러스 유형 1-2 의 단백질 또는 절편을 포함하는 바이러스 유사 입자의 제조

뎅기 바이러스 유형 1 및 2 바이러스 구조 단백질을 야생형 바이러스 구조 단백질로서 사용하였다. 바이러스 구조 단백질의 외피 영역에, 적어도 하나의 변형을 도입하였다. 즉, 뎅기 바이러스 유형 1 외피 단백질 (SEQ ID NO: 20) 의 위치 108 에서의 아미노산 Phe 를 Ala (F108A) 로 변경하였고, 뎅기 바이러스 유형 1 외피 단백질의 위치 203 에서의 아미노산 Lys 를 Asn (K203N) (외피 영역: SEQ ID NO: 4 의 172-676aa) 로 변경하였고, 위치 246 에서의 아미노산 Asn 을 Met (K246M) 로 변경하였다. 본 실시예에서, 외피 영역은 SEQ ID NO: 2 의 172-676aa 에 상응하고, SEQ ID NO: 20 의 위치 108 은 SEQ ID NO: 2 의 위치 289 에 상응하고, SEQ ID NO: 20 의 위치 203 은 SEQ ID NO: 2 의 위치 384 에 상응하고, SEQ ID NO: 20 의 위치 246 은 SEQ ID NO: 2 의 위치 427 에 상응한다. 본 실시예에서, 외피 영역 중의 돌연변이는 외피 영역으로부터 시작하는 숫자를 사용하여 표현된다.

포유류 세포에서 바이러스 구조 단백질을 발현하기 위해, DENV2 prM E 발현 벡터 및 DENV2 캡시드 발현 벡터 20ug 각각을 혼합하고, 293F 세포로 트랜스펙션하였다. 캡시드 벡터는 더 나은 수율을 발현하기 위해 R85A 및 K86A 돌연변이시켰다 (SEQ ID NO: 11 및 12). DENV2 prM E 를 더 잘 발현하기 위해, C 말단 DENV2 Env 영역 (199aa-676aa) 을 상응하는 DENV1 Env 영역에 대체하여, 키메라 단백질 (SEQ ID NOs. 7 및 8) 을 산출하였다. VLP 를 안정화하기 위해, Env 융합 펩티드 영역 (F108A) 을 돌연변이시켰다 (SEQ ID NOs. 9 및 10).

트랜스펙션 4 일 후, 트랜스펙션된 세포 배양물로부터의 상청액을 수확하고, Env 발현을 1st 항체로서 외피 단백질에 특이적으로 결합하는 뎅기 바이러스 (9.F.10) 모노클로날 항체 (sc-70959, Santa Cruz Biotechnology) 및 2nd 항체로서 토끼 항-마우스 IgG-HRP (sc-358920, Santa Cruz Biotechnology) 를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 시험하였다. 결과는 도 2 에 제시한다.

도 2 로부터 제시되는 바와 같이, DENV2 prM 및 하나의 변형 (F108A) 을 가진 뎅기 바이러스 유형 2 및 유형 1 외피 단백질의 키메라로 트랜스펙션된 세포는 더 많은 양의 단백질을 산출하였다. 상청액 중의 상기 단백질은 자발적으로 조립되어 입자를 제공한다.

VLP 를 발현하기 위해, DENV1 prM E 발현 벡터 및 DENV1 캡시드 발현 벡터 20ug 각각을 혼합하고, 293F 세포로 트랜스펙션하였다. 캡시드 벡터는 더 나은 수율을 발현하기 위해 K85A 및 K86A 돌연변이시켰다 (SEQ ID NOs. 5 및 6). VLP 를 안정화하기 위해, Env 융합 펩티드 영역 (F108A) (SEQ ID NOs. 1 및 2) 또는 염기성 아미노산 (K203N) (SEQ ID NOs. 3 및 4) 또는 (K246M) 을 돌연변이시켰다. 추가로, 2 개의 아미노산 (F108A+K246M, SEQ ID NOs: 13 및 14) 및 (F108A+K203N, SEQ ID NOs. 15 및 16) 을 또한 돌연변이시켰다. 트랜스펙션 4 일 후, 트랜스펙션된 세포로부터의 상청액을 수확하고, Env 발현을 1st 항체로서 뎅기 바이러스 (9.F.10) 모노클로날 항체 (sc-70959, Santa Cruz Biotechnology) 및 2nd 항체로서 토끼 항-마우스 IgG-HRP (sc-358920, Santa Cruz Biotechnology) 를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 시험하였다. 결과는 도 3 에 제시한다.

도 3 으로부터 제시되는 바와 같이, DENV prM 및 적어도 하나의 변형을 가진 외피 단백질로 트랜스펙션된 세포는 더 많은 양의 외피 단백질을 산출하였다. 상청액 중의 상기 단백질은 자발적으로 조립되어 입자를 제공한다.

[실시예 2]

뎅기 바이러스 구조 단백질 prM 및 외피를 포함하는 바이러스 유사 입자의 제조.

실시예 1 에서 사용된 prM 및 개질된 외피 단백질 F108A, K203N, 또는 K203N+F108A (각각, SEQ ID NOs 1, 3, 15) 을 함유하는 뎅기 바이러스 구조 단백질에 대한 발현 벡터를 사용하였다. 실시예 1 과 동일한 방식으로, 20ug 의 벡터를 293F 세포에 트랜스펙션하고 배양하였다. 트랜스펙션 4 일 후에 트랜스펙션된 세포로부터의 상청액을 수확하였다. 1 차 항체로서 모노클로날 항체 (9.F. 10, Santa Cruz Biotech) 및 2 차 항체로서 토끼 항-마우스 IgG-HRP 콘쥬게이션된 항체를 사용하여 DENV VLP 를 검출하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 결과는 도 4 에 제시한다. 도 4 로부터 제시되는 바와 같이, DENV1-prM 및 적어도 하나의 변형을 가진 외피 단백질로 트랜스펙션된 세포는 더 많은 양의 외피 단백질을 산출하였다.

바이러스 유사 입자를 수득하기 위해 상청액을 0.45μm 필터를 사용하여 여과하였다. 바이러스 유사 입자를 TFF 컬럼을 사용하여 농축하고 QXL 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 정제하여 정제된 바이러스 유사 입자를 수득하였다. 정제된 VLP 를 PBS 중의 4% 포름알데히드로 채웠다. 음성으로 염색된 VLP 의 전자 현미경 (EM) 시각화를 수행하였다. 간략히, 1.0μl 의 샘플을 탄소 코팅된 Formvar-필름 구리 격자 상에 두고, VLP 가 부착되도록 하였다. 이후, 2μl 1% PTA 용액을 격자에 첨가하고, 격자를 전자 현미경에 의해 시험하였다. 결과는 도 5 에 제시한다. 상청액에서, 바이러스 유사 입자가 관찰되었다.

[실시예 3]

뎅기 바이러스에 대항하는 항체

실시예 2 에서 수득된 정제된 VLP (K203N+F108A) 를 DEN1 VLP 로서 명명하였고, 본 실시예에서 사용하였다. 정제된 바이러스 유사 입자를 스핀 컬럼 (분자량 절삭: 100kDa) 을 사용하여 추가 농축하였고, 면역화를 위한 바이러스 유사 입자를 제조하였다. 이후, 4 마리의 마우스를 0 주 및 4 주에, 2 회 근육내 주사에 의해 알루미늄 아쥬반트 (alhydrogel 2%, Sergeant Aduvants) 를 함유하는 PBS 중의 DEN1 VLP 30 μg 으로 면역화하였다.

면역화된 마우스로부터 유래하는 혈청의 뎅기 바이러스 특이적 IgG 역가를 ELISA 시스템에 의해 측정하였다. 혈청을 각각의 DENV-1, DENV-2, DENV-3, 및 DENV-4 바이러스에 대한 중화 항체에 대해 어세이하였다. 하기 뎅기 혈청형 1-4 를 사용하였다:

DENV-1, Philippine-99St12A 균주

DENV-2, Philippine-00St22A 균주

DENV-3, Philipine-SLMC50 균주

DENV-4, Philippine-SLMC318 균주

JEV- JaOAr S-982 균주

면역화된 마우스 혈청 중의 항-DENV 중화 항체를 1.25 x 10⁸ FFU 의 Vero-적응된 DV 유형 1-4 를 사용하여 Vero 세포에 대해 이전에 기재된 초점 감소 중화 시험 (FRNT) 에 의해 검출하였다. 종료점 역가를 FFU 의 수가 적어도 50% 감소된 (FRNT₅₀) 것을 시험된 최고 혈청 희석으로서 계산하였다. 96 웰 플레이트에서 100% 컨플루언스 (confluence) 로의 Vero 세포를 사용하였다.

인 하우스 (In house) 항-뎅기 토끼 IgG 를 1 차 항체로서 사용하였고, 항-토끼 IgG-HRPO 콘쥬게이트 (102-PD) 를 2 차 항체로서 사용하였다. 결과는 하기 표에 요약한다.

[표 1]

표 1 에서 제시되듯이, DENV1 VLP 는 뎅기 바이러스 유형 1, 2, 3 및 4 에 대해 우수한 중화 효과를 나타냈다. 뎅기 약화 생 백신으로 수득되는 중화 항체의 FRNT 50 값이 대략 1000 이라는 사실의 관점에서 (Tsai et al., Journal of Virology, 2015 89: 7348-7362.), DENV1 VLP 의 면역원성은 매우 강하였고, 약화 생 백신보다 뎅기 바이러스에 대항하여 약 10 배 더 높은 중화 항체를 제공하였다.

[실시예 4]

뎅기 바이러스 유사 입자를 포함하는 약학 조성물의 제조

뎅기 바이러스 유사 입자를 실시예 1 에 따라 제조하였다. 백신 조성물인 약학 조성물을 제조하기 위해, 80μg 의 각각의 제조된 입자를 1ml 의 수크로오스 포스페이트 용액, pH 7.2, 내독소 없음 (Teknova, SP 완충액) 과 혼합하였다.

[실시예 5]

뎅기 바이러스 유형 2-4 유래된 바이러스 유사 입자의 제조

외피 영역의 아미노산 위치 108 (SEQ ID NOs. 22-24 의 289aa 에 상응함) 이 F 에서 A 로 대체되고, 외피 단백질의 C-말단 영역 (478-676aa 또는 476-674aa) 이 뎅기 바이러스 유형 1 외피 단백질 (SEQ ID NO. 22 의 478-676aa) 에 상응하는 것으로 대체되는 뎅기 바이러스 유형 2-4 의 prM 및 외피 단백질에 대한 발현 벡터를 제조한다. 벡터에 의해 발현하고자 하는 단백질은 SEQ ID NOs. 22-24 에 의해 나타내지는 것들이다. 바이러스 유사 입자는 실시예 1 과 동일한 방식으로 수득된다.

SEQUENCE LISTING <110> VLP THERAPEUTICS, LLP <120> FLAVIVIRUS VIRUS LIKE PARTICLE <130> 6725231 <150> 62/048,897 <151> 2014-09-11 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5498 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> misc_feature <223> DENV1 prM E (Env F108A) <220> <221> CDS <222> (1046)..(3073) <400> 1 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtttg acattgatta 420 ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 480 ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 540 ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 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gac ttc ggt tct ata gga ggg gtg ttc acg tct gtg gga aaa ctg ata 2896 Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Leu Ile 605 610 615 cac cag att ttt ggg act gcg tat gga gtt ttg ttc agc ggt gtt tct 2944 His Gln Ile Phe Gly Thr Ala Tyr Gly Val Leu Phe Ser Gly Val Ser 620 625 630 tgg acc atg aag ata gga ata ggg att ctg ctg aca tgg cta gga tta 2992 Trp Thr Met Lys Ile Gly Ile Gly Ile Leu Leu Thr Trp Leu Gly Leu 635 640 645 aac tca agg agc acg tcc ctt tca atg acg tgt atc gca gtt ggc atg 3040 Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Met Thr Cys Ile Ala Val Gly Met 650 655 660 665 gtc acg ctg tac cta gga gtc atg gtt cag gcg taataaagat ctgctgtgcc 3093 Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala 670 675 ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 3153 tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag 3213 gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga 3273 caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct cgagcatggt catagctgtt 3333 tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 3393 gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 3453 gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 3513 ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 3573 ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 3633 cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 3693 gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 3753 tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 3813 ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 3873 atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 3933 gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 3993 tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 4053 cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 4113 cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 4173 tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 4233 cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 4293 cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 4353 gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 4413 gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 4473 gtctgacagt tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 4533 attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 4593 gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 4653 aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg 4713 agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc agacttgttc 4773 aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 4833 tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 4893 aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 4953 atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttccca gggatcgcag tggtgagtaa 5013 ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 5073 cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 5133 tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga 5193 ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 5253 taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcatactct tcctttttca 5313 atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 5373 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 5433 ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 5493 tcgtc 5498 <210> 2 <211> 676 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 2 Met Ser Val Thr Met Leu Leu Met Leu Leu Pro Thr Ala Leu Ala Phe 1 5 10 15 His Leu Thr Thr Arg Gly Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Lys Gln 20 25 30 Glu Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Ser Ala Gly Val Asn Met 35 40 45 Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr Met 50 55 60 Thr Tyr Lys Cys Pro Arg Ile Thr Glu Thr Glu Pro Asp Asp Val Asp 65 70 75 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Leu Leu Lys Thr Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys 230 235 240 att gaa gct aaa ata tca aac acc acc acc gat tcg aga tgt cca aca 1907 Ile Glu Ala Lys Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr 245 250 255 caa gga gaa gcc acg ctg gtg gaa gaa cag gac acg aac ttt gtg tgt 1955 Gln Gly Glu Ala Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Thr Asn Phe Val Cys 260 265 270 cga cga acg ttc gtg gac aga ggc tgg ggc aat ggt tgt ggg cta gcc 2003 Arg Arg Thr Phe Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Ala 275 280 285 gga aaa ggt agc tta ata acg tgt gct aag ttt aag tgt gtg aca aaa 2051 Gly Lys Gly Ser Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val Thr Lys 290 295 300 305 ctg gaa gga aag ata gtc caa tat gaa aac tta aaa tat tca gtg ata 2099 Leu Glu Gly Lys Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser Val Ile 310 315 320 gtc acc gta cac act gga gac cag cac caa gtt gga aat gag acc aca 2147 Val Thr Val His Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Thr 325 330 335 gaa cat gga aca act gca acc ata aca cct caa gct ccc acg tcg gaa 2195 Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr Ser Glu 340 345 350 ata cag ctg aca gac tac gga gct cta aca ttg gat tgt tca cct aga 2243 Ile Gln Leu Thr Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Arg 355 360 365 aca ggg cta gac ttt aat gag atg gtg ttg ttg aca atg gaa aat aaa 2291 Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Glu Asn Lys 370 375 380 385 tca tgg ctc gtc cac aaa caa tgg ttt cta gac tta cca ctg cct tgg 2339 Ser Trp Leu Val His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp 390 395 400 acc tcg ggg gct tca aca tcc caa gag act tgg aat aga caa gac ttg 2387 Thr Ser Gly Ala Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln Asp Leu 405 410 415 ctg gtc aca ttt aag aca gct cat gca aaa aag cag gaa gta gtc gta 2435 Leu Val Thr Phe Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val 420 425 430 cta gga tca caa gaa gga gca atg cac act gcg ttg act gga gcg aca 2483 Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr 435 440 445 gaa atc caa acg tct gga acg aca aca att ttt gca gga cac ctg aaa 2531 Glu Ile Gln Thr Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His Leu Lys 450 455 460 465 tgc aga cta aaa atg gat aaa ctg act tta aaa ggg atg tca tat gta 2579 Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val 470 475 480 atg tgc aca ggg tca ttc aag tta gag aag gaa gtg gct gag acc cag 2627 Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln 485 490 495 cat gga act gtt cta gtg cag gtt aaa tac gaa gga aca gat gca cca 2675 His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro 500 505 510 tgc aag atc ccc ttc tcg tcc caa gat gag aag gga gta acc cag aat 2723 Cys Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn 515 520 525 ggg aga ttg ata aca gcc aac ccc ata gtc act gac aaa gaa aaa cca 2771 Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro 530 535 540 545 gtc aac att gaa gcg gag cca cct ttt ggt gag agc tac att gtg gta 2819 Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val 550 555 560 gga gca ggt gaa aaa gct ttg aaa cta agc tgg ttc aag aag gga agc 2867 Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser 565 570 575 agt ata ggg aaa atg ttt gaa gca act gcc cgt gga gca cga agg atg 2915 Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met 580 585 590 gcc atc ctg gga gac act gca tgg gac ttc ggt tct ata gga ggg gtg 2963 Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val 595 600 605 ttc acg tct gtg gga aaa ctg ata cac cag att ttt ggg act gcg tat 3011 Phe Thr Ser Val Gly Lys Leu Ile His Gln Ile Phe Gly Thr Ala Tyr 610 615 620 625 gga gtt ttg ttc agc ggt gtt tct tgg acc atg aag ata gga ata ggg 3059 Gly Val Leu Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Gly Ile Gly 630 635 640 att ctg ctg aca tgg cta gga tta aac tca agg agc acg tcc ctt tca 3107 Ile Leu Leu Thr Trp Leu Gly Leu Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser 645 650 655 atg acg tgt atc gca gtt ggc atg gtc acg ctg tac cta gga gtc atg 3155 Met Thr Cys Ile Ala Val Gly Met Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val 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tcggccaacg 3984 cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 4044 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 4104 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 4164 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 4224 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 4284 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 4344 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 4404 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 4464 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 4524 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 4584 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 4644 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 4704 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4764 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 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2723 Cys Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn 515 520 525 ggg aga ttg ata aca gcc aac ccc ata gtc act gac aaa gaa aaa cca 2771 Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro 530 535 540 545 gtc aac att gaa gcg gag cca cct ttt ggt gag agc tac att gtg gta 2819 Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val 550 555 560 gga gca ggt gaa aaa gct ttg aaa cta agc tgg ttc aag aag gga agc 2867 Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser 565 570 575 agt ata ggg aaa atg ttt gaa gca act gcc cgt gga gca cga agg atg 2915 Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met 580 585 590 gcc atc ctg gga gac act gca tgg gac ttc ggt tct ata gga ggg gtg 2963 Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val 595 600 605 ttc acg tct gtg gga aaa ctg ata cac cag att ttt ggg act gcg tat 3011 Phe Thr Ser Val Gly Lys Leu Ile His Gln Ile Phe Gly Thr Ala Tyr 610 615 620 625 gga gtt ttg ttc agc ggt gtt tct tgg acc atg aag ata gga ata ggg 3059 Gly Val Leu Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Gly Ile Gly 630 635 640 att ctg ctg aca tgg cta gga tta aac tca agg agc acg tcc ctt tca 3107 Ile Leu Leu Thr Trp Leu Gly Leu Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser 645 650 655 atg acg tgt atc gca gtt ggc atg gtc acg ctg tac cta gga gtc atg 3155 Met Thr Cys Ile Ala Val Gly Met Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met 660 665 670 gtt cag gcg taataaagat ctgctgtgcc ttctagttgc cagccatctg 3204 Val Gln Ala 675 ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 3264 cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 3324 gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 3384 atgcggtggg ctctatgggt acccaggtgc tgaagaattg acccggttcc tcctgggcca 3444 gaaagaagca ggcacatccc cttctctgtg acacaccctg tccacgcccc tggttcttag 3504 ttccagcccc actcatagga cactcatagc tcaggagggc tccgccttca atcccacccg 3564 ctaaagtact tggagcggtc tctccctccc tcatcagccc accaaaccaa acctagcctc 3624 caagagtggg aagaaattaa agcaagatag gctattaagt gcagagggag agaaaatgcc 3684 tccaacatgt gaggaagtaa tgagagaaat catagaattt taaggccatg atttaaggcc 3744 atcatggcct aagcttgaaa ggagatagga tcaaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 3804 gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 3864 aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 3924 actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 3984 cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 4044 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 4104 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 4164 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 4224 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 4284 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 4344 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 4404 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 4464 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 4524 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 4584 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 4644 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 4704 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4764 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 4824 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 4884 ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4944 ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 5004 tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 5064 accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaacca cgctcaccgg ctccagattt 5124 atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 5184 cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 5244 tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 5304 tatggcttca ttcagctccg 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Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg 580 585 590 Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly 595 600 605 Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Leu Ile His Gln Ile Phe Gly Thr Ala 610 615 620 Tyr Gly Val Leu Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Gly Ile 625 630 635 640 Gly Ile Leu Leu Thr Trp Leu Gly Leu Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu 645 650 655 Ser Met Thr Cys Ile Ala Val Gly Met Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val 660 665 670 Met Val Gln Ala 675 <210> 22 <211> 676 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> MISC_FEATURE <223> DEN2 prM E (F108A)_3' DEN1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (182)..(477) <223> DEN2 prM E (F108A) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (182)..(477) <223> DEV2 prM E (F108A) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (478)..(676) <223> 3' DEV1 <400> 22 Met Thr Ala Gly Met Ile Ile Met Leu Ile Pro Thr Val Met Ala Phe 1 5 10 15 His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg Gln 20 25 30 Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Lys Asp Gly Thr Asn Met 35 40 45 Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr Ile 50 55 60 Thr Tyr Lys Cys Pro Phe Leu Lys Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile Asp 65 70 75 80 Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr 85 90 95 Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val Pro 100 105 110 His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg 130 135 140 His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly 145 150 155 160 Thr Thr His Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Ile 165 170 175 Ala Pro Ser Met Thr Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp Phe 180 185 190 Val Glu Gly Val Ser Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His 195 200 205 Gly Ser Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe 210 215 220 Glu Leu Ile Lys Thr Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr 225 230 235 240 Cys Ile Glu Ala Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro 245 250 255 Thr Gln Gly Glu Pro Thr Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val 260 265 270 Cys Lys His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu 275 280 285 Ala Gly Lys Gly Gly Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys Lys 290 295 300 Asn Met Glu Gly Lys Ile Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val 305 310 315 320 Val Ile Thr Pro His Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr 325 330 335 Gly Lys His Gly Lys Glu Val Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr 340 345 350 Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro 355 360 365 Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Lys Asp 370 375 380 Lys Ala Trp Leu Val His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro 385 390 395 400 Trp Leu Pro Gly Ala Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu 405 410 415 Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val 420 425 430 Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala 435 440 445 Thr Glu Ile Gln Met Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu 450 455 460 Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr 465 470 475 480 Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr 485 490 495 Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala 500 505 510 Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln 515 520 525 Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys 530 535 540 Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val 545 550 555 560 Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly 565 570 575 Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg 580 585 590 Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly 595 600 605 Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Leu Ile His Gln Ile Phe Gly Thr Ala 610 615 620 Tyr Gly Val Leu Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Gly Ile 625 630 635 640 Gly Ile Leu Leu Thr Trp Leu Gly Leu Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu 645 650 655 Ser Met Thr Cys Ile Ala Val Gly Met Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val 660 665 670 Met Val Gln Ala 675 <210> 23 <211> 674 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> misc_feature <223> DEV3 prM E (F108A)_3'DEV1 <220> <221> misc_feature <222> (182)..(475) <223> DEV3 prM E (F108A) <220> <221> misc_feature <222> (476)..(676) <223> 3' DEV1 <400> 23 Met Thr Ser Leu Cys Leu Met Met Ile Leu Pro Ala Thr Leu Ala Phe 1 5 10 15 His Leu Thr Ser Arg Asp Gly Glu Pro Arg Met Ile Val Gly Lys Asn 20 25 30 Glu Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Ala Ser Gly Ile Asn Met 35 40 45 Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Met Cys Asp Asp Thr Val 50 55 60 Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Ile Ala Glu Val Glu Pro Glu Asp Ile Asp 65 70 75 80 Cys Trp Cys Asn Leu Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Asn 85 90 95 Gln Ala Gly Glu His Arg Arg Asp Lys Arg Ser Val Ala Leu Ala Pro 100 105 110 His Val Gly Met Gly Leu Asp Thr Arg Thr Gln Thr Trp Met Ser Ala 115 120 125 Glu Gly Ala Trp Arg Gln Val Glu Lys Val Glu Thr Trp Ala Leu Arg 130 135 140 His Pro Gly Phe Thr Ile Leu Ala Leu Phe Leu Ala His Tyr Ile Gly 145 150 155 160 Thr Ser Leu Thr Gln Lys Val Val Ile Phe Ile Leu Leu Met Leu Val 165 170 175 Thr Pro Ser Met Thr Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe 180 185 190 Val Glu Gly Leu Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His 195 200 205 Gly Gly Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Ile 210 215 220 Glu Leu Gln Lys Thr Glu Ala Thr Gln Leu Ala Thr Leu Arg Lys Leu 225 230 235 240 Cys Ile Glu Gly Lys Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro 245 250 255 Thr Gln Gly Glu Ala Ile Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Val 260 265 270 Cys Lys His Thr Tyr Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu 275 280 285 Ala Gly Lys Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln Cys Leu Glu 290 295 300 Pro Ile Glu Gly Lys Val Val Gln His Glu Asn Leu Lys Tyr Thr Val 305 310 315 320 Ile Ile Thr Val His Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Asp Thr 325 330 335 Gln Gly Val Thr Val Glu Ile Thr Pro Gln Ala Ser Thr Val Glu Ala 340 345 350 Ile Leu Pro Glu Tyr Gly Thr Leu Gly Leu Glu Cys Ser Pro Arg Thr 355 360 365 Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Ile Leu Leu Thr Met Lys Asn Lys Ala 370 375 380 Trp Met Val His Arg Gln Trp Phe Phe Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr 385 390 395 400 Ser Gly Ala Thr Thr Glu Ala Pro Thr Trp Asn Arg Lys Glu Leu Leu 405 410 415 Val Thr Phe Lys Asn Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu 420 425 430 Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu 435 440 445 Ile Gln Asn Ser Gly Gly Thr Ser Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys 450 455 460 Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met 465 470 475 480 Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His 485 490 495 Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys 500 505 510 Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly 515 520 525 Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val 530 535 540 Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly 545 550 555 560 Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser 565 570 575 Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala 580 585 590 Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe 595 600 605 Thr Ser Val Gly Lys Leu Ile His Gln Ile Phe Gly Thr Ala Tyr Gly 610 615 620 Val Leu Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Gly Ile Gly Ile 625 630 635 640 Leu Leu Thr Trp Leu Gly Leu Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Met 645 650 655 Thr Cys Ile Ala Val Gly Met Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val 660 665 670 Gln Ala <210> 24 <211> 676 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> MISC_FEATURE <223> DEV4 prM E (F108A)_3'DEV1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(477) <223> DEV4 prM E (F108A) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (478)..(676) <223> 3' DEV1 <400> 24 Met Ser Thr Val Thr Leu Leu Cys Leu Ile Pro Thr Val Met Ala Phe 1 5 10 15 His Leu Ser Thr Arg Asp Gly Glu Pro Leu Met Ile Val Ala Lys His 20 25 30 Glu Arg Gly Arg Pro Leu Leu Phe Lys Thr Thr Glu Gly Ile Asn Lys 35 40 45 Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Met Cys Glu Asp Thr Val 50 55 60 Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu Val Asn Thr Glu Pro Glu Asp Ile Asp 65 70 75 80 Cys Trp Cys Asn Leu Thr Ser Thr Trp Val Met Tyr Gly Thr Cys Thr 85 90 95 Gln Asn Gly Glu Arg Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Thr Pro 100 105 110 His Ser Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Ala Glu Thr Trp Met Ser Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Val Glu Ser Trp Ile Leu Arg 130 135 140 Asn Pro Gly Phe Ala Leu Leu Ala Gly Phe Met Ala Tyr Met Ile Gly 145 150 155 160 Gln Thr Gly Ile Gln Arg Thr Val Phe Phe Val Leu Met Met Leu Val 165 170 175 Ala Pro Ser Tyr Gly Met Arg Cys Ile Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe 180 185 190 Val Glu Gly Val Ser Gly Gly Ala Trp Val Asp Leu Val Leu Glu His 195 200 205 Gly Gly Cys Val Thr Thr Met Ala Gln Gly Lys Pro Thr Leu Asp Phe 210 215 220 Glu Leu Ile Lys Thr Thr Ala Lys Glu Val Ala Leu Leu Arg Thr Tyr 225 230 235 240 Cys Ile Glu Ala Ser Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys Pro 245 250 255 Thr Gln Gly Glu Pro Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr Ile 260 265 270 Cys Arg Arg Asp Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu 275 280 285 Ala Gly Lys Gly Gly Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Ser Gly 290 295 300 Lys Ile Thr Gly Asn Leu Val Gln Ile Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val 305 310 315 320 Val Val Thr Val His Asn Gly Asp Thr His Ala Val Gly Asn Asp Thr 325 330 335 Ser Asn His Gly Val Thr Ala Thr Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser Val 340 345 350 Glu Val Glu Leu Pro Asp Tyr Gly Glu Leu Ser Leu Asp Cys Glu Pro 355 360 365 Arg Ser Gly Ile Asp Phe Asn Glu Met Ile Leu Met Lys Met Glu Lys 370 375 380 Lys Thr Trp Leu Val His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro 385 390 395 400 Trp Thr Ala Gly Ala Asp Thr Ser Glu Val His Trp Asn His Lys Glu 405 410 415 Arg Met Val Thr Phe Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val Thr 420 425 430 Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Ser Ala Leu Thr Gly Ala 435 440 445 Thr Glu Val Asp Ser Gly Asp Gly Asn His Met Phe Ala Gly His Leu 450 455 460 Lys Cys Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr 465 470 475 480 Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr 485 490 495 Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala 500 505 510 Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln 515 520 525 Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys 530 535 540 Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val 545 550 555 560 Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly 565 570 575 Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg 580 585 590 Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly 595 600 605 Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Leu Ile His Gln Ile Phe Gly Thr Ala 610 615 620 Tyr Gly Val Leu Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Gly Ile 625 630 635 640 Gly Ile Leu Leu Thr Trp Leu Gly Leu Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu 645 650 655 Ser Met Thr Cys Ile Ala Val Gly Met Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val 660 665 670 Met Val Gln Ala 675

Claims (22)

1. 플라비바이러스 구조 단백질의 외피 영역이 아미노산 서열 중에 적어도 하나의 변형을 함유하는, 하나 이상의 플라비바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형이 SEQ ID NO: 21 의 아미노산 위치 182 와 아미노산 위치 676 사이, 또는 정렬에 의해 SEQ ID NO: 21 의 위치 182 및 676 에 상응하는 위치로서 결정된 위치에 있는 바이러스 유사 입자.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형이 SEQ ID NO: 20 에 의해 나타내지는 뎅기 바이러스 유형 1 의 외피 영역의 아미노산 위치 90 과 아미노산 위치 121 사이, 또는 정렬에 의해 SEQ ID NO: 20 의 위치 90 및 121 에 상응하는 위치로서 결정된 위치 사이에 있는 바이러스 유사 입자.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형이 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 108 에, 또는 정렬에 의해 SEQ ID NO: 20 의 위치 108 에 상응하는 위치로서 결정된 위치에 있는 바이러스 유사 입자.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 플라비바이러스가 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기-유래 뇌염 바이러스, 황열병 바이러스, 일본 뇌염 바이러스 또는 C 형 간염 바이러스인 바이러스 유사 입자.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 플라비바이러스가 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스인 바이러스 유사 입자.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 플라비바이러스가 뎅기 바이러스인 바이러스 유사 입자.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 구조 단백질이 prM 및 외피 영역을 포함하는 바이러스 유사 입자.
9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라비바이러스 구조 단백질이 SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 및 16 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 아미노산 서열의 아미노산 위치 16 에서 아미노산 위치 676 사이의 아미노산 서열을 포함하는 단백질인 바이러스 유사 입자.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 플라비바이러스 구조 단백질이 SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 및 16 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질인 바이러스 유사 입자.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라비바이러스 구조 단백질이 SEQ ID Nos.2, 4, 8, 10, 14 및 16 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로부터 유래되는 바이러스 유사 입자.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 유사 입자 내에 함유되는 플라비바이러스 구조 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
13. SEQ ID Nos.1, 3, 7, 9, 13 및 15 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 서열 일치성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 단리된 핵산 분자.
14. 제 12 항에 있어서, SEQ ID Nos.1, 3, 7, 9, 13 및 15 중 임의의 하나에 의해 나타내지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 단리된 핵산 분자.
15. 제 12 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 핵산 분자에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 임의로 포함하는 벡터.
16. 하기를 포함하는 약학 조성물:
    (a) 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 유사 입자 및/또는 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자; 및
    (b) 약학적으로 허용가능한 담체.
17. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 유사 입자를 포함하는 백신 조성물.
18. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 DNA 백신 조성물.
19. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 유사 입자 및/또는 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포유류와 접촉시키는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법.
20. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 플라비바이러스 감염에 의해 야기되는 질환 또는 상태의 치료 또는 예방 방법.
21. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 유사 입자 내에 함유된 적어도 하나의 플라비바이러스 구조 단백질을 엔코딩하는 유전자로 트랜스펙션된 세포를 배양하는 단계; 및 세포 배양물로부터 바이러스 유사 입자를 회수하는 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 유사 입자의 제조 방법.
22. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류에서 플라비바이러스 감염을 진단하는 방법 또는 키트에서 사용하기 위한 바이러스 유사 입자.

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