CN114836444B - 重组肠道病毒a71病毒样颗粒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途，所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒包括P1结构蛋白和蛋白酶3CD，所述P1结构蛋白和蛋白酶3CD来源于不同的重组肠道病毒A71病毒株。本发明还提供所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。所述预防手足口病产品为药物组合物，例如为疫苗组合物。本发明的A71病毒样颗粒的表达量高，且纯化获得VLP可诱导较好的免疫原性，可作为肠道病毒A71的候选疫苗进行产业化生产。

Description

重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途。

背景技术

手足口病是一种5岁以下儿童常见的婴幼儿传染病，主要临床表现为手、足和口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎、心肌炎等一系列并发症甚至导致死亡。手足口病是由人肠道病毒属的柯萨奇病毒A组16、4、5、7、9、10和B组2、5型以及肠道病毒71型和埃可病毒30感染引起的，其中肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16是导致手足口病暴发的主要病原体。目前尚无针对肠道病毒A71的特异性治疗药物，因此预防就成为应对肠道病毒A71导致的手足口病的一种有效方法。疫苗是预防肠道病毒A71感染的最有效的方法，目前在中国已经有三个上市的肠道病毒A71灭活疫苗，可以有效保护儿童免受肠道病毒A71的感染。但是，灭活疫苗仍存在一些缺点，例如表位破坏，不完全灭活和成本高等。

肠道病毒71属于小RNA病毒科肠道病毒属，是无包膜的二十面立体颗粒，直径约30nm，其基因组是单股正链RNA，两端为保守的非编码区，中间为含有1个开放阅读框的编码区，此编码区又分为P1、P2、P3区。P1的翻译产物可以被病毒蛋白酶3CD加工产生衣壳蛋白亚基VP1、VP0和VP3，并进一步组装成病毒的衣壳。病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)与病毒在形态与组成上相似，可诱导较好的免疫反应，同时具有安全性好和成本低的优点，因此VLP为肠道病毒A71疫苗的开发提供了一种方案。研究表明，共表达肠道病毒A71结构蛋白P1和非结构蛋白3CD后可切割为VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，并进一步组装成肠道病毒A71VLP，且该VLP可以保护小鼠免受肠道病毒A71致死性攻击。但通过共表达P1和3CD获取的VLP产量较低，较低的产量不利于产业化生产，因此亟需提高VLP的产量。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码肠道病毒A71的P1结构蛋白和蛋白酶3CD的核苷酸，所述多核苷酸编码的P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白酶3CD的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所示。

本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括所述的多核苷酸。

本发明还提供一种细胞系，所述细胞系中包括所述核酸构建体，或基因组中整合有所述多核苷酸。

本发明还提供一种重组肠道病毒A71病毒样颗粒，所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒包括P1结构蛋白和蛋白酶3CD。

本发明还提供所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

本发明还提供一种用于预防手足口病的药物组合物，所述药物组合物包括所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

如上所述，本发明的重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途，具有以下有益效果：将VLP的表达量提高了约6倍，且纯化获得VLP的形态和免疫原性良好，为肠道病毒VLP的产量优化提供了新思路。

附图说明

图1显示为本发明的表达载体示意图，P_AOX1为AOX1启动子，CYC1 TT为CYC1终止子，3CD^-O和3CD^-N为肠道病毒A71的蛋白酶，P1是肠道病毒A71的结构蛋白，其中3CD^-O和3CD^-N来源于不同株病毒。

图2显示为本发明的不同VLP的表达量比较图，即将筛选得到的A71 VLP^-O高表达株和A71 VLP^-N高表达株进行诱导表达，于诱导后24h和48h收集样品测定目的蛋白含量(VLP)和可溶性蛋白含量(TSP)，纵坐标为目的蛋白比可溶性蛋白，即VLP/TSP。

图3显示为本发明的VLP的电镜分析结果，其中(A)为A71 VLP^-O，(B)为A71 VLP^-N，Bar＝100nm。

图4显示为本发明的VLP的免疫原性，为了方便统计，将OD450nm吸光值大于0.15的最高稀释倍数的倒数定位该样品的特异抗体滴度，横线显示为几何平均值。

具体实施方式

本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码肠道病毒A71的P1结构蛋白和蛋白酶3CD的核苷酸，所述多核苷酸编码的P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白酶3CD的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

如图1所示，所述多核苷酸中编码肠道病毒A71 P1蛋白和蛋白酶3CD的核苷酸的排列顺序为：3CD-P1。

所述多核苷酸中表达各蛋白的表达框在所述多核苷酸中串联。

在如图1所示的实施例中，具体的串联方式为启动子-3CD-终止子-启动子-P1-终止子。当然，在其他实施方式中，两个表达框的串联方式也可以是：启动子-P1-终止子-启动子-3CD-终止子。由于各蛋白均为独立的开放阅读框，因此不同的串联方式均能达到与实施例相同的效果。

在一种实施方式中，编码肠道病毒A71的P1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。编码肠道病毒A71 3CD的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。

在一种实施方式中，与SEQ ID NO.5～6所示序列的同源性在95％以上的序列，或与SEQ ID NO.5～6所示序列互补的序列也能达到与本发明实施例相同的效果。

所述多核苷酸的序列为经过密码子优化后得到的序列。

在一种实施方式中，所述肠道病毒A71的P1结构蛋白的氨基酸序列选自以下任一项：1)如SEQ ID NO:1所示的序列；2)与SEQ ID NO:1所示序列的同源性在95％、96％、97％、98％或99％以上的序列；3)与前两项任一所述的序列互补的序列。

在一种实施方式中，所述肠道病毒A71 3CD的氨基酸序列选自以下任一项：1)如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列；2)与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示序列的同源性在95％、96％、97％、98％或99％以上的序列；3)与前两项任一所述的序列互补的序列。

本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括所述多核苷酸。

术语“核酸构建体”是指可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段，所述核酸构建体包括载体骨架即表达载体与表达框，所述核酸构建体可以为质粒。

在一种实施方式中，所述核酸构建体还包括表达载体。所述表达载体可以是现有技术中任意适于表达肠道病毒的表达载体，例如为酵母表达载体。较佳的为毕赤酵母表达载体pPink-HC(厂家：Invitrogen)。

在一种实施方式中，所述核酸构建体核苷酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。

本发明还提供一种细胞系，所述细胞系中包括所述核酸构建体，或基因组中整合有所述多核苷酸。

所述细胞系为真核细胞。在一种实施方式中，所述细胞系为将所述核酸构建体转导入毕赤酵母细胞得到。

本发明还提供一种重组肠道病毒A71病毒样颗粒，所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒包括P1结构蛋白和蛋白酶3CD。

在一较佳的实施方式中，所述P1结构蛋白和蛋白酶3CD来源于不同的肠道病毒A71病毒株。

所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒中P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白酶3CD的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒由所述细胞系产生。

重组肠道病毒A71病毒样颗粒电镜下为直径约为30nm规则的球形结构。所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒的大小均一。

本发明还提供所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)培养所述细胞系，使其表达重组肠道病毒A71病毒样颗粒；

2)分离出所述细胞系表达的重组肠道病毒A71病毒样颗粒。

在一种实施方式中，培养所述细胞系的条件为28℃-30℃，250-300rpm。

在一种实施方式中，所述细胞系通过将所述核酸构建体转导入宿主细胞得到。在一种实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。

在一种实施方式中，所述核酸构建体的制备方法包括如下步骤：

1)将表达蛋白酶3CD的核苷酸和密码子优化后的表达肠道病毒A71 P1结构蛋白的核苷酸分别克隆入不同的表达载体中，获得中间构建体；

2)将步骤1)获得的中间构建体重组后获得所述核酸构建体。

本发明还提供所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

在一种实施方式中，所述手足口病为肠道病毒A71感染的手足口病。

所述预防手足口病产品为药物组合物。所述药物组合物例如为疫苗组合物。

本发明还提供一种用于预防手足口病的药物组合物，所述药物组合物包括所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

所述药物组合物可以是单价的(仅含有一种病毒样颗粒)，也可以是多价的(含有多种病毒样颗粒)。

所述药物组合物可制备成各种常规剂型，例如：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

所述药物组合物包括预防或治疗有效量的本发明病毒样颗粒或多核苷酸。

术语“预防或治疗有效量”指药物组合物治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

在一种实施方式中，为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的病毒样颗粒。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于药物组合物(例如本发明的重组病毒样颗粒)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

所述药物组合物例如为疫苗组合物。疫苗组合物可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物的途径包括：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1肠道病毒A71表达质粒构建

为了使表达达到最优，将肠道病毒A71结构蛋白P1氨基酸序列根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化合成，并连入pPinK-HC质粒中，得到质粒pPink/HC-A71 P1。肠道病毒A71结构蛋白P1氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

将肠道病毒A71 P1同源的3CD(命名为3CD^-O或A71 3CD^-O，氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示)和P1非同源的3CD(命名为3CD^-N或A71 3CD^-N，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)核苷酸序列进行合成并连入表达载体pPink-HC载体中(由第三方公司完成)，获得质粒pPink/HC-A71 3CD^-O和pPink/HC-A71 3CD^-N。3CD^-O(A71 3CD^-O)和3CD^-N(A71 3CD^-N)核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

表达质粒的制备：将A71 3CD^-O和A71 3CD^-N合成后连入表达载体pPink-HC获得中间质粒pPink/HC-A71 3CD^-O和pPink/HC-A71 3CD^-N；利用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ以酶切连接的方法将中间质粒中A71 3CD^-O表达框或A71 3CD^-N连入pPink/HC-A71 P1中，分别得到终质粒pPink/HC-A71 3CD^-O-P1(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)和pPink/HC-A71 3CD^-N-P1(核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)，示意图如图1所示。

实施例2肠道病毒A71高表达菌株的筛选、表达与纯化

高表达菌株的筛选

将实施例1制备的终质粒pPink/HC-A71 3CD^-O-P1或pPink/HC-A71 3CD^-N-P1分别使用内切酶AflⅡ进行线性化，并用乙醇沉淀法进行纯化回收；利用电转的方法将线性化质粒分别导入不同的毕赤酵母中进行基因重组，涂布PAD平板与30℃进行培养；3天后，挑取大的白色菌落于24孔深孔板中使用BMMY培养基进行甲醇诱导表达(28℃，250rpm)，诱导表达48h后收取诱导菌体使用夹心ELISA的方法进行表达检测，得到表达A71 VLP^-O的两个高表达株，以及表达A71 VLP^-N的两个高表达株，各高表达菌株目的基因序列经测序分析与理论核苷酸序列一致。

夹心ELISA方法所用的兔抗肠道病毒A71多抗血清和肠道病毒A71特异的鼠单抗均为申请人自制，制备步骤如下：(1)兔抗肠道病毒A71多抗血清：将纯化后的肠道病毒A71VLP(500μg/只)与弗氏佐剂1:1混合乳化后皮下多点注射成年的新西兰大白兔(1ml/只)，两次免疫间隔4周共免疫4次，第4次免疫2周后采取兔血清备用；(2)肠道病毒A71特异的鼠单抗：将纯化后的肠道病毒A71 VLP(5μg/只)与铝佐剂(500μg/只)充分混合后，腹腔注射小鼠，两次免疫间隔2周共免疫4次，第4次免疫后2周取脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后筛选得到肠道病毒A71特异的鼠单抗细胞株，将该细胞株腹腔注射小鼠后获得腹水，经protein G填料纯化后获得A71特异的鼠单抗备用。

夹心ELISA方法操作步骤如下：将兔抗肠道病毒A71多抗血清按1:2000进行稀释包被于96孔酶标板中，50μl/孔，4℃包被过夜后用5％脱脂奶粉进行封闭；将菌体用PBS重悬，加入等体积玻璃珠后70HZ破碎120s，离心后取上清备用；破菌上清和肠道病毒A71 VLP自制标品用2％脱脂奶粉进行适当的稀释后加到封闭后的酶标板中，于37℃进行孵育；2h后，加入肠道病毒A71特异的鼠单抗，于37℃进行孵育；2h后，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃孵育1h后进行显色并读取450nm吸光值，并根据标曲计算VLP含量。同时，将上述破菌上清使用Coomassie Plus Protein Assay Regent试剂盒(Thermo)按操作说明进行可溶性总蛋白含量测定。目标蛋白VLP值/总蛋白值即为该菌株的产量(单位为μg/mg)，当换算为百分比时即为目标蛋白VLP占可溶性蛋白的百分比(单位为％)。

表达与纯化

将筛选得到的高表达株分别接种于BMGY培养基，培养24h(30℃，250rpm)后更换为BMMY培养基进行诱导表达(28℃，250rpm)，诱导24h和48h分别离心收获菌体。将菌体用PBS重悬后使用高压匀浆机1200bar进行破菌，离心后收集上清进行PEG沉降，复溶后的上清使用DEAE填料进行纯化，最终获得目的VLPs，分别命名为A71 VLP^-3CD和A71VLP^-N3CD。

如图2所示，纯化后A71 VLP^-O高表达株1和高表达株2产量都在25μg/mg以下，即占总可溶蛋白的2.5％，而A71 VLP^-N高表达株1和高表达株2的产量均在150μg/mg左右，即占总可溶蛋白的15％。A71 VLP^-N的产量为A71 VLP^-O的6倍。

实施例3肠道病毒A71 VLP的形态研究

负染：将纯化后的各柯萨奇病毒A71 VLP用PBS稀释至50-200ng/μl，进行电子显微镜分析，具体步骤如下：上样到铜网后使用醋酸铀进行染色，然后使用120kV冷冻电镜进行观察其形态，如图3所示，由高表达株A71 VLP^-O发酵产物纯化获得的VLP在形态和大小上与从高表达株A71 VLP^-N发酵产物纯化得到的VLP相似，均呈直径约为30nm规则的球形结构。

实施例4肠道病毒A71 VLP的免疫原性

为了比较A71 VLP^-O和A71 VLP^-N两种高表达株纯化获得VLP的免疫原性，将纯化后的A71 VLP^-O和A71 VLP^-N分别免疫小鼠，具体步骤如下：6-8周龄雌性ICR小鼠，共分为3组，包括两组实验组和一组PBS对照组，实验组每组10只小鼠，对照组每组5只小鼠。将5μg/只A71 VLP^-O和A71 VLP^-N与铝佐剂(80μg/只)室温振荡吸附1-2h，然后进行肌肉注射(100μL/只)，共免疫2次，两次免疫之间间隔4周。于第二次免疫后两周采取小鼠血清测定特异抗体滴度。

肠道病毒A71 VLP特异抗体滴度测定

将兔抗肠道病毒A71 VLP包被于96孔酶标板中，20ng/孔，4℃包被过夜后用5％脱脂奶粉进行封闭；将血清样品用2％脱脂奶粉进行倍比稀释后加到封闭后的酶标板中，于37℃进行孵育；2h后，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃孵育1h后进行显色并读取450nm吸光值。如图4所示，A71 VLP^-O和A71 VLP^-N均可诱导较好的免疫原性，且无明显差异。

使用GraphPad Prism 8.3.0进行数据处理，使用t检验进行差异分析，P＜0.05，*，P＜0.01，**，P＜0.001，***。

本发明中利用毕赤酵母表达系统共表达肠道病毒A71的结构蛋白P1和3CD成功制备了VLP，VLP的表达量从2.1％提高至15％，将VLP的表达量提高了约6倍，且纯化获得VLP的形态和免疫原性无明显差异，为肠道病毒VLP的产量化生产提供了新思路。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 华淞（上海）生物医药科技有限公司

<120> 重组肠道病毒A71病毒样颗粒及其用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

1 5 10 15

Asn Ser Ala Thr Glu Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Thr Ala Gly Lys Gln Ser Leu Lys Gln

35 40 45

Asp Pro Asp Lys Phe Ala Asn Pro Val Lys Asp Ile Phe Thr Glu Met

50 55 60

Ala Ala Pro Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Ile Val Gly Tyr Gly Glu Trp Pro Ser Tyr Cys Ser

100 105 110

Asp Ser Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Thr Lys Leu Trp Glu Lys Ser Ser

130 135 140

Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Leu Pro Glu Tyr Val Ile Gly Thr Val Ala Gly Gly Thr

195 200 205

Gly Thr Glu Asp Ser His Pro Pro Tyr Lys Gln Thr Gln Pro Gly Ala

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Leu Gln His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro

225 230 235 240

Ile Ser Gln Leu Thr Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr

245 250 255

Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Leu Pro Phe

260 265 270

Asp Ser Ala Leu Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Val Pro Ile

275 280 285

Ser Pro Leu Asp Tyr Asp Gln Gly Ala Thr Pro Val Ile Pro Ile Thr

290 295 300

Ile Thr Leu Ala Pro Met Cys Ser Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala

305 310 315 320

Val Thr Gln Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe

325 330 335

Leu Thr Thr Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro Ile Leu Pro Asn Phe His

340 345 350

Pro Thr Pro Cys Ile His Ile Pro Gly Glu Val Arg Asn Leu Leu Glu

355 360 365

Leu Cys Gln Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Val Pro Thr Asn

370 375 380

Ala Thr Ser Leu Met Glu Arg Leu Arg Phe Pro Val Ser Ala Gln Ala

385 390 395 400

Gly Lys Gly Glu Leu Cys Ala Val Phe Arg Ala Asp Pro Gly Arg Asn

405 410 415

Gly Pro Trp Gln Ser Thr Leu Leu Gly Gln Leu Cys Gly Tyr Tyr Thr

420 425 430

Gln Trp Ser Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe

435 440 445

Met Ala Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro

450 455 460

Leu Pro Lys Asp Arg Ala Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp

465 470 475 480

Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser

485 490 495

Asn Thr His Tyr Arg Ala His Ala Arg Asp Gly Val Phe Asp Tyr Tyr

500 505 510

Thr Thr Gly Leu Val Ser Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro

515 520 525

Ile Gly Ala Pro Asn Thr Ala Tyr Ile Ile Ala Leu Ala Ala Ala Gln

530 535 540

Lys Asn Phe Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Ala Ser Asp Ile Leu Gln

545 550 555 560

Thr Gly Thr Ile Gln Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser

565 570 575

Ile Gly Asp Ser Val Ser Arg Ala Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ala Pro

580 585 590

Thr Gly Gln Asn Thr Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys

595 600 605

Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser

610 615 620

Asp Glu Ser Met Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr

625 630 635 640

Ala Glu Thr Thr Leu Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly

645 650 655

Glu Ile Asp Leu Pro Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala

660 665 670

Asn Trp Asp Ile Asp Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val

675 680 685

Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala

690 695 700

Cys Thr Pro Thr Gly Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe

705 710 715 720

Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp

725 730 735

Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro

740 745 750

Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp

755 760 765

Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp

770 775 780

Leu Glu Tyr Gly Ala Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val

785 790 795 800

Arg Thr Val Gly Thr Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile

805 810 815

Tyr Met Arg Met Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg

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Asn Gln Asn Tyr Leu Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser

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Ile Lys Pro Thr Gly Thr Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu

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<210> 2

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<212> PRT

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ctgcttagag ctagcaaaaa caggcaaaga gtatggtctg accatgactc ctgcggacaa 2580

gtctccttgc tttaatgaag ttaattggga gaacgcaacc ttcttgaaga gaggtttctt 2640

gcccgatgaa cagttcccgt tcttgattca cccaatcatg ccaatgaagg agatccatga 2700

atctatccgg tggaccaagg acgcacgcaa cacacaagat cacgtgcgat ctttgtgctt 2760

gttggcgtgg cacaacggta agcaagaata tgaaaaattt gtaagcacaa ttcgctctgt 2820

tccagtagga aaggcattgg caattccaaa ctatgaaaat ctgagacgca attggctcga 2880

attgttttaa tgaggtaccg gccggccatt taaatacagg ccccttttcc tttgtcgata 2940

tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc tcccacatcc gctctaaccg 3000

aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt taatagttat 3060

gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt ttttttctgt acaaacgcgt 3120

gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag gttttgggac gctcgaaggc 3180

tttaatttgc aagctggatc taacatccaa agacgaaagg ttgaatgaaa cctttttgcc 3240

atccgacatc cacaggtcca ttctcacaca taagtgccaa acgcaacagg aggggataca 3300

ctagcagcag accgttgcaa acgcaggacc tccactcctc ttctcctcaa cacccacttt 3360

tgccatcgaa aaaccagccc agttattggg cttgattgga gctcgctcat tccaattcct 3420

tctattaggc tactaacacc atgactttat tagcctgtct atcctggccc ccctggcgag 3480

gttcatgttt gtttatttcc gaatgcaaca agctccgcat tacacccgaa catcactcca 3540

gatgagggct ttctgagtgt ggggtcaaat agtttcatgt tccccaaatg gcccaaaact 3600

gacagtttaa acgctgtctt ggaacctaat atgacaaaag cgtgatctca tccaagatga 3660

actaagtttg gttcgttgaa atgctaacgg ccagttggtc aaaaagaaac ttccaaaagt 3720

cggcataccg tttgtcttgt ttggtattga ttgacgaatg ctcaaaaata atctcattaa 3780

tgcttagcgc agtctctcta tcgcttctga accccggtgc acctgtgccg aaacgcaaat 3840

ggggaaacac ccgctttttg gatgattatg cattgtctcc acattgtatg cttccaagat 3900

tctggtggga atactgctga tagcctaacg ttcatgatca aaatttaact gttctaaccc 3960

ctacttgaca gcaatatata aacagaagga agctgccctg tcttaaacct ttttttttat 4020

catcattatt agcttacttt cataattgcg actggttcca attgacaagc ttttgatttt 4080

aacgactttt aacgacaact tgagaagatc aaaaaacaac taattattcg aaacggaatt 4140

caccatgggt tctcaagttt ctactcaaag atccggttct catgagaact ctaattctgc 4200

tactgaaggt tctactatta actacactac tattaattac tacaaggatt cttatgctgc 4260

tactgctggt aaacaatctt tgaaacaaga tccagacaag ttcgctaacc ctgttaagga 4320

tattttcact gagatggctg ctccattgaa atctccttct gctgaagctt gtggttactc 4380

tgatagagtt gctcaattga ctatcggtaa ctctactatc actactcaag aggctgctaa 4440

tattatcgtt ggttacggtg aatggccttc ttattgttct gattctgatg ctactgctgt 4500

tgataagcca actagacctg atgtttctgt taacagattc tacactttgg atactaagtt 4560

gtgggagaag tcttctaaag gttggtattg gaaatttcca gatgttttga ctgaaactgg 4620

tgtttttggt caaaacgctc aattccacta cttgtataga tccggtttct gtatccatgt 4680

tcaatgtaac gcttctaagt tccaccaagg tgctttgttg gttgctgttt tgcctgagta 4740

tgttattggt actgttgctg gtggtactgg tactgaagat tctcatccac cttacaaaca 4800

aactcaacca ggtgctgatg gttttgaatt gcaacaccca tatgttttgg atgctggtat 4860

tcctatttct caattgactg tttgtccaca tcaatggatc aacttgagaa ctaacaactg 4920

tgctactatc atcgttccat acatcaacgc tttgcctttt gattctgctt tgaaccactg 4980

taatttcggt ttgttggttg ttccaatttc tcctttggat tatgatcaag gtgctactcc 5040

agttattcct atcactatca ctttggctcc tatgtgttct gagtttgctg gtttgagaca 5100

agctgttact caaggtttcc caactgaatt gaagcctggt actaaccaat ttttgactac 5160

tgatgatggt gtttctgctc caattttgcc taacttccat ccaactcctt gtattcacat 5220

tccaggagag gttagaaatt tgttggaatt gtgtcaagtt gaaactattt tggaggttaa 5280

caatgttcct actaacgcta cttctttgat ggagagattg agattcccag tttctgctca 5340

agctggtaaa ggagaattgt gtgctgtttt tagagctgat ccaggtagaa atggtccttg 5400

gcaatctact ttgttgggtc aattgtgtgg ttactatact caatggtctg gttctttgga 5460

agttactttt atgttcactg gttcttttat ggctactggt aaaatgttga ttgcttacac 5520

tccacctggt ggtccattgc ctaaagatag agctactgct atgttgggta ctcatgttat 5580

ttgggatttc ggtttgcaat cttctgttac tttggttatt ccatggattt ctaacactca 5640

ttacagagct cacgctagag atggtgtttt cgattactac actactggtt tggtttctat 5700

ctggtatcaa actaactacg ttgttccaat tggtgctcct aatactgctt atattattgc 5760

tttggctgct gctcaaaaga atttcactat gaagttgtgt aaagatgctt ctgatatttt 5820

gcaaactggt actattcaag gagatagagt tgctgatgtt atcgaatctt ctatcggaga 5880

ttctgtttct agagctttga ctcaagcttt gccagctcct actggtcaaa acactcaagt 5940

ttcttctcat agattggata ctggtaaagt tccagctttg caagctgctg agattggtgc 6000

ttcttctaac gcttctgatg aatctatgat tgagactaga tgtgttttga actctcactc 6060

tactgctgaa actactttgg attctttctt ttctagagct ggtttggttg gagagattga 6120

tttgccattg gaaggtacta ctaaccctaa tggttacgct aactgggata tcgatatcac 6180

tggttacgct caaatgagaa gaaaggttga gttgtttact tacatgagat tcgatgctga 6240

gtttactttc gttgcttgta ctccaactgg agaggttgtt cctcaattgt tgcaatatat 6300

gtttgttcca cctggtgctc caaagcctga ttctagagaa tctttggctt ggcaaactgc 6360

tactaatcca tctgttttcg ttaaattgtc tgatccacct gctcaagttt ctgttccatt 6420

catgtctcct gcttctgctt accaatggtt ttacgatggt tatcctactt tcggtgaaca 6480

taagcaagag aaagatttgg aatatggtgc ttgtccaaac aatatgatgg gtactttctc 6540

tgttagaact gttggtactt ctaagtctaa atacccattg gttgttagaa tctacatgag 6600

aatgaaacac gttagagctt ggattccaag acctatgaga aaccaaaact acttgtttaa 6660

ggctaaccct aactacgctg gtaattctat taaaccaact ggtacttcta gaactgctat 6720

tactactttg taatgaggta ccggccggcc atttaaatac aggccccttt tcctttgtcg 6780

atatcatgta attagttatg tcacgcttac attcacgccc tcctcccaca tccgctctaa 6840

ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag tctaggtccc tatttatttt ttttaatagt 6900

tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc tgtacaaacg 6960

cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa 7020

ggctttaatt tgcaagctgg atccgcggcc gccttccaaa ctctcatgga ttctcaggta 7080

ataggtattc taggaggagg ccagctaggc cgaatgattg ttgaggccgc tagcaggctc 7140

aatatcaaga ccgtgattct tgatgatggt ttttcacctg ctaagcacat taatgctgcg 7200

caagaccaca tcgacggatc attcaaagat gaggaggcta tcgccaagtt agctgccaaa 7260

tgtgatgttc tcactgtaga gattgagcat gtcaacacag atgctctaaa gagagttcaa 7320

gacagaactg gaatcaagat atatccttta ccagagacaa tcgaactaat caaggataag 7380

tacttgcaaa aggaacattt gatcaagcac aacatttcgg tgacaaagtc tcagggtata 7440

gaatctaatg aaaaggcgct gcttttgttt ggagaagaga atggatttcc atatctgttg 7500

aagtcccgga ctatggctta tgatggaaga ggcaattttg tagtggagtc taaagaggac 7560

atcagtaagg cattagagtt cttgaaagat cgtccattgt atgccgagaa gtttgctcct 7620

tttgttaaag aattagcggt aatggttgtg agatcactgg aaggcgaagt attctcctac 7680

ccaaccgtag aaactgtgca caaggacaat atctgtcata ttgtgtatgc tccggccaga 7740

gttaatgaca ccatccaaaa gaaagctcaa atattagctg aaaacactgt gaagactttc 7800

ccaggcgctg gaatcttcgg agttgagatg ttcctattgt ctgatggaga acttcttgta 7860

aatgagattg ctccaaggcc ccacaattct ggtcactata caatcgatgc atgtgtaaca 7920

tctcagttcg aagcacatgt aagagccata actggtctgc caatgccact agatttcacc 7980

aaactatcta cttccaacac caacgctatt atgctcaatg ttttgggtgc tgaaaaatct 8040

cacggggaat tagagttttg tagaagagcc ttagaaacac ccggtgcttc tgtatatctg 8100

tacggaaaga ccacccgatt ggctcgtaag atgggtcata tcaacataat aggatcttcc 8160

atgttggaag cagaacaaaa gttagagtac attctagaag aatcaaccca cttaccatcc 8220

agtactgtat cagctgacac taaaccgttg gttggagtta tcatgggttc agactctgat 8280

ctacctgtga tttcgaaagg ttgcgatatt ttaaaacagt ttggtgttcc attcgaagtt 8340

actattgtct ctgctcatag aacaccacag agaatgacca gatatgcctt tgaagccgct 8400

agtagaggta tcaaggctat cattgcaggt gctggtggtg ctgctcatct tccaggaatg 8460

gttgctgcca tgactccgtt gccagtcatt ggtgttcctg tcaagggctc tacgttggat 8520

ggtgtagact cgctacactc gattgtccaa atgcctagag gtgttcctgt ggctacggtt 8580

gctatcaaca acgccaccaa tgccgctctg ttggccatca ggattttagg tacaattgac 8640

cacaaatggc aaaaggaaat gtccaagtat atgaatgcaa tggagaccga agtgttgggg 8700

aaggcatcca acttggaatc tgaagggtat gaatcctatt tgaagaatcg tctttgaatt 8760

tagtattgtt ttttaataga tgtatatata atagtacacg taacttatct attccattca 8820

taattttatt ttaaaggttc ggtagaaatt tgtcctccaa aaagttggtt agagcctggc 8880

agttttgata ggcattatta tagattgggt aatatttacc ctgcacctgg aggaactttg 8940

caaagagcct catgtgcggc gcgccaggcc ataatggcca aacggtttct caattactat 9000

atactactaa ccatttacct gtagcgtatt tcttttccct cttcgcgaaa gctcaagggc 9060

atcttcttga ctcatgaaaa atatctggat ttcttctgac agatcatcac ccttgagccc 9120

aactctctag cctatgagtg taagtgatag tcatcttgca acagattatt ttggaacgca 9180

actaacaaag cagatacacc cttcagcaga atcctttctg gatattgtga agaatgatcg 9240

ccaaagtcac agtcctgaga cagttcctaa tctttacccc atttacaagt tcatccaatc 9300

agacttctta acgcctcatc tggcttatat caagcttacc aacagttcag aaactcccag 9360

tccaagtttc ttgcttgaaa gtgcgaagaa tggtgacacc gttgacaggt acacctttat 9420

gggacattcc cccagaaaaa taatcaagac tgggccttta gagggtgctg aagttgaccc 9480

cttggtgctt ctggaaaaag aactgaaggg caccagacaa gcgcaacttc ctggtattcc 9540

tcgtctaagt ggtggtgcca taggatacat ctcgtacgat tgtattaagt actttgaacc 9600

aaaaactgaa agaaaactga aagatgtttt gcaacttccg gaagcagctt tgatgttgtt 9660

cgacacgatc gtggcttttg acaatgttta tcaaagattc caggtaattg gaaacgtttc 9720

tctatccgtt gatgactcgg acgaagctat tcttgagaaa tattataaga caagagaaga 9780

agtggaaaag atcagtaaag tggtatttga caataaaact gttccctact atgaacagaa 9840

agatattatt caaggccaaa cgttcacctc taatattggt caggaagggt atgaaaacca 9900

tgttcgcaag ctgaaagaac atattctgaa aggagacatc ttccaagctg ttccctctca 9960

aagggtagcc aggccgacct cattgcaccc tttcaacatc tatcgtcatt tgagaactgt 10020

caatccttct ccatacatgt tctatattga ctatctagac ttccaagttg ttggtgcttc 10080

acctgaatta ctagttaaat ccgacaacaa caacaaaatc atcacacatc ctattgctgg 10140

aactcttccc agaggtaaaa ctatcgaaga ggacgacaat tatgctaagc aattgaagtc 10200

gtctttgaaa gacagggccg agcacgtcat gctggtagat ttggccagaa atgatattaa 10260

ccgtgtgtgt gagcccacca gtaccacggt tgatcgttta ttgactgtgg agagattttc 10320

tcatgtgatg catcttgtgt cagaagtcag tggaacattg agaccaaaca agactcgctt 10380

cgatgctttc agatccattt tcccagcagg aaccgtctcc ggtgctccga aggtaagagc 10440

aatgcaactc ataggagaat tggaaggaga aaagagaggt gtttatgcgg gggccgtagg 10500

acactggtcg tacgatggaa aatcgatgga cacatgtatt gccttaagaa caatggtcgt 10560

caaggacggt gtcgcttacc ttcaagccgg aggtggaatt gtctacgatt ctgaccccta 10620

tgacgagtac atcgaaacca tgaacaaaat gagatccaac aataacacca tcttggaggc 10680

tgagaaaatc tggaccgata ggttggccag agacgagaat caaagtgaat ccgaagaaaa 10740

cgatcaatga acggaggacg taagtaggaa tttatggttt ggccataatg gcctagcttg 10800

gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 10860

aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 10920

acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 10980

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 11040

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 11100

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 11160

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 11220

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 11280

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 11340

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 11400

ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 11460

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 11520

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 11580

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 11640

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 11700

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 11760

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 11820

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 11880

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 11940

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 12000

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 12060

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 12120

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 12180

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 12240

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 12300

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 12360

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 12420

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 12480

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 12540

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 12600

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 12660

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 12720

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 12780

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 12840

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 12900

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 12960

cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 13020

aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc 13080

ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc 13140

gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt 13200

gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 13260

cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg 13320

gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg 13380

gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attg 13434

<210> 8

<211> 13431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tgggcccgag 960

ccttgatttt gctctctccc tactgaggag gaacgtcagg caagtccaaa cagaccaggg 1020

gcatttcacc atgttgggtg ttagggatcg cttagcagtc ctcccacgcc actcacaacc 1080

tggtaaaact atttggattg aacataaact cgtgaacgtc cttgatgcag ttgaattggt 1140

ggacgagcaa ggagtcaacc tggaattaac cctcatcact cttgacacta acgaaaagtt 1200

tagggatatc accaaattta tcccagaaaa tattagcact gctagtgatg ccaccctagt 1260

gattaacacg gagcacatgc cctcaatgtt tgtcccggtg ggtgacgctg tgcagtatgg 1320

cttcttgaat ctcagtggca agcctaccca tcgcaccatg atgtacaact ttcctactaa 1380

agcaggacag tgtggaggag tagtgacatc tgttgggaag gttatcggta ttcacattgg 1440

tggcaatggc agacaaggtt tctgcgcagg cctcaaaagg agttactttg ctagtgaaca 1500

aggagagatc cagtgggtta agcccaataa agaaactgga agactcaaca tcaatggacc 1560

aacccgtacc aagttagaac ctagtgtatt ccatgatatc ttcgagggaa ataaggaacc 1620

agctgtcttg catagtaaag acccccgact tgaggtagat tttgaacagg ccctgttctc 1680

taagtatgtg ggaaatacac tatatgagcc tgacgagtac atcaaagagg cagctcttca 1740

ttatgcaaac caattaaagc aactagagat taatacctct caaatgagca tggaggaggc 1800

ctgctacggt actgagaatc ttgaggccat tgatcttcat actagtgcag gttaccccta 1860

cagtgccctg ggaataaaga aaagagacat cttagacccc accaccaggg acgtgagtaa 1920

aatgaagttc tacatggaca aatatggtct tgatctccct tactccactt atgtcaagga 1980

cgagctgcgc tcaattgata aaattaagaa agggaagtcc cgtctgattg aggccagtag 2040

tttaaatgat tcagtgtacc tcagaatgac tttcggtcat ttgtatgagg ctttccacgc 2100

aaatcctggg acgataactg gatcagccgt ggggtgtaat cctgacacat tctggagcaa 2160

gctgccaatt ttgctccctg gttcactctt tgcctttgac tactcaggtt atgatgctag 2220

ccttagccct gtctggttca gagcattaga attggtcctt agggagatag ggtatagtga 2280

aagggcggtc tcactcattg agggaatcaa ccacacacac catgtgtatc gtaataagac 2340

ctattgtgtg cttggtggga tgccctcagg ctgttcggga acatccattt tcaactcaat 2400

gatcaacaac attattatca gagcactgct cataaaaaca tttaagggca ttgacttgga 2460

tgaactcaac atggtcgctt atggagacga tgtgctcgct agctatccct tcccaattga 2520

ttgcctggag ttagcaaaga ctggcaagga gtatggtctg accatgactc ctgcagataa 2580

gtctccttgc tttaatgagg ttaactgggg taatgcgacc ttcctcaaga ggggcttctt 2640

acccgatgaa cagtttccat ttttgattca ccctactatg ccaatgaggg agatccatga 2700

gtccattcga tggaccaagg acgcacgaaa cactcaagat catgtgcggt ccttgtgcct 2760

tctagcatgg cataatggta agcaagaata tgagaaattt gtgagcacaa ttaggtctgt 2820

cccagtagga agagcgttgg ctatcccaaa ttatgaaaat tttagacgga aggggctcga 2880

gttattttag ggtaccggcc ggccatttaa atacaggccc cttttccttt gtcgatatca 2940

tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac gccctcctcc cacatccgct ctaaccgaaa 3000

aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg tccctattta ttttttttaa tagttatgtt 3060

agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca aacgcgtgta 3120

cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt 3180

aatttgcaag ctggatctaa catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct ttttgccatc 3240

cgacatccac aggtccattc tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg ggatacacta 3300

gcagcagacc gttgcaaacg caggacctcc actcctcttc tcctcaacac ccacttttgc 3360

catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc aattccttct 3420

attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc tggcgaggtt 3480

catgtttgtt tatttccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat cactccagat 3540

gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc caaaactgac 3600

agtttaaacg ctgtcttgga acctaatatg acaaaagcgt gatctcatcc aagatgaact 3660

aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca gttggtcaaa aagaaacttc caaaagtcgg 3720

cataccgttt gtcttgtttg gtattgattg acgaatgctc aaaaataatc tcattaatgc 3780

ttagcgcagt ctctctatcg cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa cgcaaatggg 3840

gaaacacccg ctttttggat gattatgcat tgtctccaca ttgtatgctt ccaagattct 3900

ggtgggaata ctgctgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt ctaaccccta 3960

cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt tttttatcat 4020

cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt tgattttaac 4080

gacttttaac gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaaa cggaattcac 4140

catgggttct caagtttcta ctcaaagatc cggttctcat gagaactcta attctgctac 4200

tgaaggttct actattaact acactactat taattactac aaggattctt atgctgctac 4260

tgctggtaaa caatctttga aacaagatcc agacaagttc gctaaccctg ttaaggatat 4320

tttcactgag atggctgctc cattgaaatc tccttctgct gaagcttgtg gttactctga 4380

tagagttgct caattgacta tcggtaactc tactatcact actcaagagg ctgctaatat 4440

tatcgttggt tacggtgaat ggccttctta ttgttctgat tctgatgcta ctgctgttga 4500

taagccaact agacctgatg tttctgttaa cagattctac actttggata ctaagttgtg 4560

ggagaagtct tctaaaggtt ggtattggaa atttccagat gttttgactg aaactggtgt 4620

ttttggtcaa aacgctcaat tccactactt gtatagatcc ggtttctgta tccatgttca 4680

atgtaacgct tctaagttcc accaaggtgc tttgttggtt gctgttttgc ctgagtatgt 4740

tattggtact gttgctggtg gtactggtac tgaagattct catccacctt acaaacaaac 4800

tcaaccaggt gctgatggtt ttgaattgca acacccatat gttttggatg ctggtattcc 4860

tatttctcaa ttgactgttt gtccacatca atggatcaac ttgagaacta acaactgtgc 4920

tactatcatc gttccataca tcaacgcttt gccttttgat tctgctttga accactgtaa 4980

tttcggtttg ttggttgttc caatttctcc tttggattat gatcaaggtg ctactccagt 5040

tattcctatc actatcactt tggctcctat gtgttctgag tttgctggtt tgagacaagc 5100

tgttactcaa ggtttcccaa ctgaattgaa gcctggtact aaccaatttt tgactactga 5160

tgatggtgtt tctgctccaa ttttgcctaa cttccatcca actccttgta ttcacattcc 5220

aggagaggtt agaaatttgt tggaattgtg tcaagttgaa actattttgg aggttaacaa 5280

tgttcctact aacgctactt ctttgatgga gagattgaga ttcccagttt ctgctcaagc 5340

tggtaaagga gaattgtgtg ctgtttttag agctgatcca ggtagaaatg gtccttggca 5400

atctactttg ttgggtcaat tgtgtggtta ctatactcaa tggtctggtt ctttggaagt 5460

tacttttatg ttcactggtt cttttatggc tactggtaaa atgttgattg cttacactcc 5520

acctggtggt ccattgccta aagatagagc tactgctatg ttgggtactc atgttatttg 5580

ggatttcggt ttgcaatctt ctgttacttt ggttattcca tggatttcta acactcatta 5640

cagagctcac gctagagatg gtgttttcga ttactacact actggtttgg tttctatctg 5700

gtatcaaact aactacgttg ttccaattgg tgctcctaat actgcttata ttattgcttt 5760

ggctgctgct caaaagaatt tcactatgaa gttgtgtaaa gatgcttctg atattttgca 5820

aactggtact attcaaggag atagagttgc tgatgttatc gaatcttcta tcggagattc 5880

tgtttctaga gctttgactc aagctttgcc agctcctact ggtcaaaaca ctcaagtttc 5940

ttctcataga ttggatactg gtaaagttcc agctttgcaa gctgctgaga ttggtgcttc 6000

ttctaacgct tctgatgaat ctatgattga gactagatgt gttttgaact ctcactctac 6060

tgctgaaact actttggatt ctttcttttc tagagctggt ttggttggag agattgattt 6120

gccattggaa ggtactacta accctaatgg ttacgctaac tgggatatcg atatcactgg 6180

ttacgctcaa atgagaagaa aggttgagtt gtttacttac atgagattcg atgctgagtt 6240

tactttcgtt gcttgtactc caactggaga ggttgttcct caattgttgc aatatatgtt 6300

tgttccacct ggtgctccaa agcctgattc tagagaatct ttggcttggc aaactgctac 6360

taatccatct gttttcgtta aattgtctga tccacctgct caagtttctg ttccattcat 6420

gtctcctgct tctgcttacc aatggtttta cgatggttat cctactttcg gtgaacataa 6480

gcaagagaaa gatttggaat atggtgcttg tccaaacaat atgatgggta ctttctctgt 6540

tagaactgtt ggtacttcta agtctaaata cccattggtt gttagaatct acatgagaat 6600

gaaacacgtt agagcttgga ttccaagacc tatgagaaac caaaactact tgtttaaggc 6660

taaccctaac tacgctggta attctattaa accaactggt acttctagaa ctgctattac 6720

tactttgtaa tgaggtaccg gccggccatt taaatacagg ccccttttcc tttgtcgata 6780

tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc tcccacatcc gctctaaccg 6840

aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt taatagttat 6900

gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt ttttttctgt acaaacgcgt 6960

gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag gttttgggac gctcgaaggc 7020

tttaatttgc aagctggatc cgcggccgcc ttccaaactc tcatggattc tcaggtaata 7080

ggtattctag gaggaggcca gctaggccga atgattgttg aggccgctag caggctcaat 7140

atcaagaccg tgattcttga tgatggtttt tcacctgcta agcacattaa tgctgcgcaa 7200

gaccacatcg acggatcatt caaagatgag gaggctatcg ccaagttagc tgccaaatgt 7260

gatgttctca ctgtagagat tgagcatgtc aacacagatg ctctaaagag agttcaagac 7320

agaactggaa tcaagatata tcctttacca gagacaatcg aactaatcaa ggataagtac 7380

ttgcaaaagg aacatttgat caagcacaac atttcggtga caaagtctca gggtatagaa 7440

tctaatgaaa aggcgctgct tttgtttgga gaagagaatg gatttccata tctgttgaag 7500

tcccggacta tggcttatga tggaagaggc aattttgtag tggagtctaa agaggacatc 7560

agtaaggcat tagagttctt gaaagatcgt ccattgtatg ccgagaagtt tgctcctttt 7620

gttaaagaat tagcggtaat ggttgtgaga tcactggaag gcgaagtatt ctcctaccca 7680

accgtagaaa ctgtgcacaa ggacaatatc tgtcatattg tgtatgctcc ggccagagtt 7740

aatgacacca tccaaaagaa agctcaaata ttagctgaaa acactgtgaa gactttccca 7800

ggcgctggaa tcttcggagt tgagatgttc ctattgtctg atggagaact tcttgtaaat 7860

gagattgctc caaggcccca caattctggt cactatacaa tcgatgcatg tgtaacatct 7920

cagttcgaag cacatgtaag agccataact ggtctgccaa tgccactaga tttcaccaaa 7980

ctatctactt ccaacaccaa cgctattatg ctcaatgttt tgggtgctga aaaatctcac 8040

ggggaattag agttttgtag aagagcctta gaaacacccg gtgcttctgt atatctgtac 8100

ggaaagacca cccgattggc tcgtaagatg ggtcatatca acataatagg atcttccatg 8160

ttggaagcag aacaaaagtt agagtacatt ctagaagaat caacccactt accatccagt 8220

actgtatcag ctgacactaa accgttggtt ggagttatca tgggttcaga ctctgatcta 8280

cctgtgattt cgaaaggttg cgatatttta aaacagtttg gtgttccatt cgaagttact 8340

attgtctctg ctcatagaac accacagaga atgaccagat atgcctttga agccgctagt 8400

agaggtatca aggctatcat tgcaggtgct ggtggtgctg ctcatcttcc aggaatggtt 8460

gctgccatga ctccgttgcc agtcattggt gttcctgtca agggctctac gttggatggt 8520

gtagactcgc tacactcgat tgtccaaatg cctagaggtg ttcctgtggc tacggttgct 8580

atcaacaacg ccaccaatgc cgctctgttg gccatcagga ttttaggtac aattgaccac 8640

aaatggcaaa aggaaatgtc caagtatatg aatgcaatgg agaccgaagt gttggggaag 8700

gcatccaact tggaatctga agggtatgaa tcctatttga agaatcgtct ttgaatttag 8760

tattgttttt taatagatgt atatataata gtacacgtaa cttatctatt ccattcataa 8820

ttttatttta aaggttcggt agaaatttgt cctccaaaaa gttggttaga gcctggcagt 8880

tttgataggc attattatag attgggtaat atttaccctg cacctggagg aactttgcaa 8940

agagcctcat gtgcggcgcg ccaggccata atggccaaac ggtttctcaa ttactatata 9000

ctactaacca tttacctgta gcgtatttct tttccctctt cgcgaaagct caagggcatc 9060

ttcttgactc atgaaaaata tctggatttc ttctgacaga tcatcaccct tgagcccaac 9120

tctctagcct atgagtgtaa gtgatagtca tcttgcaaca gattattttg gaacgcaact 9180

aacaaagcag atacaccctt cagcagaatc ctttctggat attgtgaaga atgatcgcca 9240

aagtcacagt cctgagacag ttcctaatct ttaccccatt tacaagttca tccaatcaga 9300

cttcttaacg cctcatctgg cttatatcaa gcttaccaac agttcagaaa ctcccagtcc 9360

aagtttcttg cttgaaagtg cgaagaatgg tgacaccgtt gacaggtaca cctttatggg 9420

acattccccc agaaaaataa tcaagactgg gcctttagag ggtgctgaag ttgacccctt 9480

ggtgcttctg gaaaaagaac tgaagggcac cagacaagcg caacttcctg gtattcctcg 9540

tctaagtggt ggtgccatag gatacatctc gtacgattgt attaagtact ttgaaccaaa 9600

aactgaaaga aaactgaaag atgttttgca acttccggaa gcagctttga tgttgttcga 9660

cacgatcgtg gcttttgaca atgtttatca aagattccag gtaattggaa acgtttctct 9720

atccgttgat gactcggacg aagctattct tgagaaatat tataagacaa gagaagaagt 9780

ggaaaagatc agtaaagtgg tatttgacaa taaaactgtt ccctactatg aacagaaaga 9840

tattattcaa ggccaaacgt tcacctctaa tattggtcag gaagggtatg aaaaccatgt 9900

tcgcaagctg aaagaacata ttctgaaagg agacatcttc caagctgttc cctctcaaag 9960

ggtagccagg ccgacctcat tgcacccttt caacatctat cgtcatttga gaactgtcaa 10020

tccttctcca tacatgttct atattgacta tctagacttc caagttgttg gtgcttcacc 10080

tgaattacta gttaaatccg acaacaacaa caaaatcatc acacatccta ttgctggaac 10140

tcttcccaga ggtaaaacta tcgaagagga cgacaattat gctaagcaat tgaagtcgtc 10200

tttgaaagac agggccgagc acgtcatgct ggtagatttg gccagaaatg atattaaccg 10260

tgtgtgtgag cccaccagta ccacggttga tcgtttattg actgtggaga gattttctca 10320

tgtgatgcat cttgtgtcag aagtcagtgg aacattgaga ccaaacaaga ctcgcttcga 10380

tgctttcaga tccattttcc cagcaggaac cgtctccggt gctccgaagg taagagcaat 10440

gcaactcata ggagaattgg aaggagaaaa gagaggtgtt tatgcggggg ccgtaggaca 10500

ctggtcgtac gatggaaaat cgatggacac atgtattgcc ttaagaacaa tggtcgtcaa 10560

ggacggtgtc gcttaccttc aagccggagg tggaattgtc tacgattctg acccctatga 10620

cgagtacatc gaaaccatga acaaaatgag atccaacaat aacaccatct tggaggctga 10680

gaaaatctgg accgataggt tggccagaga cgagaatcaa agtgaatccg aagaaaacga 10740

tcaatgaacg gaggacgtaa gtaggaattt atggtttggc cataatggcc tagcttggcg 10800

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 10860

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 10920

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 10980

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 11040

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 11100

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 11160

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 11220

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 11280

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 11340

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 11400

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 11460

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 11520

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 11580

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 11640

tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 11700

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 11760

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 11820

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 11880

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 11940

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 12000

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 12060

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 12120

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 12180

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 12240

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 12300

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 12360

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 12420

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 12480

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 12540

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 12600

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 12660

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 12720

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 12780

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 12840

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 12900

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 12960

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 13020

ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 13080

gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 13140

tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta 13200

ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc 13260

atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc 13320

tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 13380

acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt g 13431

Claims (14)

1.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码肠道病毒A71的P1结构蛋白和蛋白酶3CD的核苷酸，所述多核苷酸编码的P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白酶3CD的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中各核苷酸的排列方式为启动子-3CD-终止子-启动子-P1-终止子。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，编码肠道病毒A71的P1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，编码肠道病毒A71 3CD的核苷酸序列如SEQID NO:6所示。

5.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括权利要求1-4任一所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体还包括表达载体。

7.如权利要求6所述的核酸构建体，其特征在于，所述表达载体为酵母表达载体。

8.如权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的核苷酸序列如SEQID NO:8所示。

9.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系中包括权利要求5-8任一所述的核酸构建体，或基因组中整合有权利要求1-4任一所述的多核苷酸。

10.如权利要求9所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为将权利要求5-8任一所述的核酸构建体转导入毕赤酵母细胞得到。

11.一种重组肠道病毒A71病毒样颗粒，其特征在于，所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒包括P1结构蛋白和蛋白酶3CD，所述重组肠道病毒A71病毒样颗粒中P1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述蛋白酶3CD的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

12.权利要求11所述的重组肠道病毒A71病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

13.一种用于预防手足口病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求11所述的重组肠道病毒A71病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，所述药物组合物为疫苗组合物。