TWI695842B - 類黃熱病毒粒子 - Google Patents

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Abstract

本案提供一種類病毒粒子，包括一或多個黃熱病毒結構蛋白，以及一種包括該類病毒粒子之組成物或疫苗、其於預防或治療黃熱病毒感染之用途。該黃熱病毒結構蛋白包括至少一個於被膜區域中的胺基酸變異。黃熱病毒的實例包括登革病毒。

Description

類黃熱病毒粒子
本發明有關包括一或多個黃熱病毒結構蛋白之類病毒粒子，以及一種包括其之組成物或疫苗、其在醫藥方面，尤其是黃熱病毒感染之預防或治療方面之用途。
黃熱病毒屬(Flavivirus)包括超過70種不同的病毒，其中許多為節肢動物媒介且由蚊子或蜱傳播。
黃熱病毒屬係黃熱病毒科(Flaviviridae)病毒中的一個屬。這個屬中包括西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)、登革病毒(dengue virus,DENV)、蜱媒腦炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)、黃熱病病毒(yellow fever virus,YFV)、日本腦炎(JEV)、C型肝炎病毒(HCV)以及多種其他可能造成腦炎或出血性(haemorrhagic)疾病的病毒。
登革熱係一種由該黃熱病毒所造成之蚊媒疾病且已傳播至大多數熱帶和許多亞熱帶地區。該疾病由四種密切相關的病毒所造成，包括亞型I至IV之登革病毒1，包括亞型亞洲I、亞洲II、全球、美洲以及美洲/亞洲之登革病毒2，包括亞型I至IV之登革病毒3，以及包括亞 型I至III之登革病毒4。雖然在全球疾病發生率方面，登革是最重要之黃熱病毒，但對抗該病毒之疫苗的發展和使用迄今仍被疫苗相關的不良事件之理論性風險所限制，諸如感染的免疫增強和對於誘導長效型保護免疫反應以同時對抗全部四種登革血清型之需求。
沒有有效的登革治療，且對抗登革熱之預防目前受限於病媒控制措施。因此登革疫苗將代表對該疾病控制的一大進步。
儘管沒有可取得的經許可之登革疫苗，多種疫苗候選者目前在臨床研究中被評估。世界衛生組織(WHO)指出，登革之成長中的全球流行性受到越來越多的關注，而急需一種安全且有效的疫苗。
(http：//www.who.int/immunization/research/development/dengue_vaccines/en/)和Vaccine 30(2012)4301-4306)
類病毒粒子(Virus-like particles,VLPs)為多蛋白結構，其模擬真正的原生病毒之組織和構型但不具感染性，因為它們不含任何病毒基因體，其有潛力生產較安全的疫苗候選者。目前少數預防性VLP型疫苗正全球性商業化：葛蘭素史克藥廠(GlaxoSmithKline)的EngerixR(B型肝炎病毒)和CervarixR(人類乳突病毒)，以及默克藥廠(Merck and Co.,Inc.)的Recombivax HBR(B型肝炎病毒)和GardasilR(人類乳突病毒)為一些實例。其他VLP型疫苗候選者係在臨床試驗或在接受臨床前評估，諸如，流行性感冒病毒、微小病毒、諾瓦克(Norwalk)以及各種嵌合型VLP。許多其 他疫苗仍受限於小規模的基礎研究，儘管他們在臨床前試驗上係成功的。大規模製造VLP的含意在過程控制(process control)、監測和優化的背景下討論。上下游的技術挑戰因此被鑑定和討論。針對治療型或預防型的疫苗，伴隨著來自臨床試驗的最新結果和VLP型疫苗技術的近來發展，成功的VLP型疫苗暢銷品(blockbusters)短暫地出現
迄今，已製造了針對超過30種感染人類或其他動物之不同病毒之VLP型疫苗。該實例包括AAV(腺相關病毒)、H5N3(禽流感)、BFDV(虎皮鸚鵡掉羽症病毒(Budgerigar fledgling disease virus))、BTV(藍舌病(Bluetongue)病毒)、伊波拉、腸病毒71型、GHPV(鵝出血型多瘤病毒(Goose hemorrhagic polyoma virus))、HBV(B型肝炎病毒)、HCV(C型肝炎病毒)、HDV(δ型肝炎病毒)、HEV(E型肝炎病毒)、HIV、HPV(人類乳突病毒)、IBDV(傳染性華氏囊病(Infectious bursal disease)病毒)、A型流感、H1N1 A型流感、H3N2 A型流感、JC多瘤性病毒、馬堡病毒(Margurg)、MS2、IPCV(印地安花生叢簇病毒)、NDV(新城病病毒)、No(諾羅病毒)Nv(諾瓦克病毒)、PhMV(酸漿斑駁病毒(Physalis mottle virus))、多瘤病毒、PPV(豬小病毒)、RHDV(兔出血病病毒)、輪狀病毒、SARS、SIV(猿猴免疫缺乏病毒)、SV40(猿猴病毒40)、SVDV(豬水疱病病毒)等等(Expert Rev.Vaccines 9(10),1149-1176,2010)。
[引用列表] [非專利文獻]
[NPTL1]Vaccine 30 (2012) 4301-4306
[NPTL2] Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010
在第一態樣中，本案提供一種包括一或多個黃熱病毒結構蛋白之類病毒粒子，其中該黃熱病毒結構蛋白之被膜區域(envelope region)包括至少一個變異於該胺基酸序列中。
在第二態樣中，本案提供一種核酸分子，包括編碼本案第一態樣提供之類病毒粒子中所包括之黃熱病毒結構蛋白之核苷酸序列或由其所組成。
在第三態樣中，本案提供一種包括第一態樣所提供之類病毒粒子和/或第二態樣所提供之核酸分子之組成物或疫苗。
在第四態樣中，本案提供一種製造抗體或包括中和抗體之抗血清之方法，包括將本案第一態樣所提供之類病毒粒子和/或本案第二態樣所提供之核酸分子與哺乳動物接觸。
在第五態樣中，本案提供一種治療或預防黃熱病毒感染之方法或一種在哺乳動物中誘導和/或增強對抗黃熱病毒之免疫反應之方法，包括施用本案第三態樣中所提供之該組成物至哺乳動物。
在第六態樣中，本案提供一種製造本案第一態樣所提供之類病毒粒子之方法，包括：培養經編碼包 含於該類病毒粒子中之至少一個黃熱病毒結構蛋白之基因轉染的細胞；以及自該細胞培養中回收類病毒粒子。此態樣可能進一步包括製備包括編碼包含於該類病毒粒子中之至少一個黃熱病毒結構蛋白之核苷酸序列之基因的步驟。
在第七態樣中，本案提供一種用於診斷哺乳動物之黃熱病毒感染的方法或套組中的類病毒粒子。
C‧‧‧殼蛋白
E‧‧‧被膜
prM‧‧‧前驅膜蛋白
[第1圖]
第1圖顯示登革病毒基因體之構造以及登革VLP建構之一實例。
[第2圖]
第2圖顯示以西方墨點法測量上清液中之被膜蛋白。用於表現包括登革第2型病毒prM以及被膜蛋白之病毒結構蛋白，或用於表現包括登革第2型病毒prM以及登革第2型和登革第1型的嵌合體(其中該登革病毒第2型被膜蛋白之C端區域被取代為對應的登革病毒第1型之C端區域(SEQ ID NO：8之199aa至676aa))之病毒結構蛋白，或包括該嵌合被膜區域之病毒結構蛋白(其中該嵌合被膜區域中被導入一個胺基酸變異(SEQ ID NO：10之第289個胺基酸，F108K))的表現載體，以及用於表現登革病毒第1型殼蛋白之表現載體係轉染至293F細胞。進行使用對抗登革被膜蛋白之抗體的西方墨點法來對付培養上清液。
[第3圖]
第3圖顯示西方墨點法之結果。用於表現包括登革第1型病毒prM及具有變異或不具變異之被膜(野生型、F108A、K203M、K246M、F108A+K246M或F108+K203N)之病毒結構蛋白的表現載體和用於表現登革第1型殼蛋白之表現載體一起被轉染至293F細胞。進行使用對抗登革被膜蛋白之抗體的西方墨點法來對付培養上清液。
[第4圖]
第4圖顯示西方墨點法之結果。用於表現包括登革第1型病毒prM及具有變異或不具變異之被膜(野生型、F108A、K203M或F108+K203N)之病毒結構蛋白的表現載體被轉染至293F細胞。進行使用對抗登革被膜蛋白之抗體的西方墨點法來對付培養上清液。
[第5圖]
第5圖顯示經負染之VLP(F108+K203N)之電子顯微(EM)顯影。
(1)包括一或多個黃熱病毒結構蛋白之類病毒粒子
在第一態樣中，本案提供一種包括一或多個黃熱病毒結構蛋白之類病毒粒子，其中在被膜區中之至少一個胺基酸係變異自其天然存在之結構。
病毒可能為西尼羅病毒、登革病毒、蜱媒腦炎病毒、黃熱病病毒、日本腦炎、以及C型肝炎(HCV)。較佳的黃熱病毒為登革病毒。登革病毒可能為包括亞型I 至IV的登革病毒第1型，包括亞型亞洲I、亞洲II、全球、美洲以及美洲/亞洲之登革病毒第2型，包括亞型I至IV之登革病毒第3型，以及包括亞型I至III之登革病毒第4型。在說明書和申請專利範圍中，術語“黃熱病毒結構蛋白或其片段”指的是衍生自黃熱病毒之任何以肽為主的序列，其可被個體之免疫系統鑑別，和/或其刺激個體中之細胞媒介之免疫反應和/或刺激個體中抗體之生成。
如第1圖所示，登革病毒結構蛋白係由殼蛋白(capsid)、前驅膜蛋白(prM)及被膜蛋白(envolop)所組成。此具體實施例中，VLP包括該些結構蛋白中的至少一個，以及較佳包括prM和被膜蛋白。該登革病毒結構蛋白可進一步包括對應至該prM序列之起始密碼子和訊息序列至胺基末端的胺基酸。
該包括至少一個胺基酸變異之區域可較佳在SEQ ID NO：21蛋白質的胺基酸位置182和胺基酸位置676之間，更佳在胺基酸位置271和胺基酸位置302之間，尤其是在胺基酸位置280和胺基酸位置291之間，特別是位置289，SEQ ID NO：21包括起始密碼子M和SEQ ID NO：17之訊息肽，其後為prM和登革病毒第1型之被膜區域(WestPac株，GenBank登錄號：U88535)，或當包括起始密碼子M、訊息肽其後是prM和黃熱病毒之被膜區域蛋白或其片段的蛋白質之胺基酸序列和由SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列比對時，在確定為上述經識別位置之位置之間。
該登革病毒第1型之被膜區域的胺基酸序 列係由SEQ ID NO：20所示。因此，該包括至少一個胺基酸變異之區域可於此序列中，較佳在SEQ ID NO：20之蛋白質之胺基酸位置90和胺基酸位置121之間，尤其是在胺基酸位置99和胺基酸位置110之間，特別是的位置108，或當黃熱病毒之被膜或其片段之胺基酸序列和SEQ ID NO：20比對時，在確定為上述經識別位置之位置之間。
如本文所用“對應至…之位置”或記載核苷酸或胺基酸位置“對應至”揭露序列(諸如序列表中所載者)中之核苷酸或胺基酸位置，指的是當使用標準比對算法與該揭露之序列比對時被識別為最大相似度之核苷酸或胺基酸位置。藉由比對該序列，熟悉本領域知識者可識別對應之殘基。
各種黃熱病毒諸如登革病毒第1至4型之病毒結構蛋白已經識別，且可在各種公開資料庫諸如GenBank資料庫取得。例如，登革病毒第1型(WestPac株)：登錄號U88535、登革病毒第2型(S1疫苗株)：登錄號M19197、登革病毒第3型(Singapore 8120/95病毒株)：登錄號AY766104以及登革病毒第4型(ThD4_0476_97病毒株)：登錄號Y618988。根據本說明書，黃熱病毒諸如登革病毒之被膜蛋白可自資料庫獲得，且與SEQ ID NO：20比對以識別該對應至在SEQ ID NO：20之胺基酸位置90和胺基酸位置121之間之位置，諸如對應至SEQ ID NO：20之胺基酸位置80之位置。
除了在該被膜區域包括至少一個胺基酸變 異之外，包含於該類病毒粒子之黃熱病毒結構蛋白可為天然存在之病毒結構蛋白或其經修飾之蛋白。在一具體實施例中，和包括prM和被膜蛋白之天然存在之病毒結構蛋白相比，該經修飾之蛋白具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之胺基酸序列相似度。在一具體實施例中，該經修飾之蛋白為突變體，其中至多10%的胺基酸被刪除、取代和/或加入至包括prM和被膜區域之天然存在之病毒結構蛋白。該序列之相似度可藉由習知方法確定。
根據本案，可使用如上所討論之一或多個黃熱病毒結構蛋白或其片段，只要他們自動組裝為粒子結構。例如，當培養表現編碼登革病毒之prM和被膜蛋白之基因之真核細胞時，該蛋白質係由該細胞生成及組裝以提供VLP，以及該VLP可以自該細胞培養上清液中收集。
本案設法處理一或多個以上所述之需求，藉由提供VLP、編碼該VLP之載體、以及抗體(和類抗體分子，包括適體和肽)，其特異地結合至該抗原，連同其(單獨或結合使用)在黃熱病毒感染之預防或治療之用途。
如於該說明書和申請專利範圍所用，術語“抗體”指的是能夠結合至表位或抗原決定位的分子。該術語涵蓋全部抗體和其抗原結合片段，包括單鏈抗體。這些抗體可包括人類抗原結合抗體片段以及包括，但不限於，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、雙硫鍵結Fvs(sdFv)以及包括VL或VH區域之片段。該抗體可來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。較佳地， 該抗體為哺乳動物的，如人類、鼠科動物、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬等，或其他適合之動物，如雞。如本文所用“人類”抗體包括具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列之抗體，以及包括分離自人類免疫球蛋白基因庫或分離自轉殖有一或多個人類免疫球蛋白且其不表現內源性免疫球蛋白之動物之抗體，例如於美國專利第5,939,598號中所述者，其揭露內容係全部合併於本文中以做為參考。
黃熱病毒結構蛋白可為天然存在之蛋白質或該天然存在之蛋白質之經修飾之蛋白質或該天然存在之蛋白質之片段或經修飾之肽。該經修飾之蛋白可為該天然存在之病毒結構蛋白之片段。
於一具體實施例中，該衍生自黃熱病毒結構蛋白之經修飾之蛋白質和該天然存在之蛋白質相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之胺基酸序列相似度。於一具體實施例中，該衍生自黃熱病毒結構蛋白之經修飾之蛋白為突變體，其中基於該衍生自黃熱病毒之天然存在之病毒結構蛋白，至多10%的胺基酸被刪除、取代和/或加入。
一具體實施例中，本案提供一種類病毒粒子，包括具有以SEQ ID No.2、4、8、10、14和16中任一者所示之胺基酸序列之黃熱病毒結構蛋白。
那些序列各自表示包含以下區域之蛋白：啟示密碼子：M(第1個胺基酸)、訊息序列(第2至15個胺基酸)、pr序列(第16至106個胺基酸)、M序列(第107至 181個胺基酸)、以及被膜區域(第182至676個胺基酸)。一具體實施例中，可提供類病毒粒子，其包括具有prM區域和SEQ ID No.2、4、8、10、14和16之被膜區域之病毒結構蛋白，即包括該些蛋白之位置16至位置676之胺基酸序列。
該經修飾之黃熱病毒結構蛋白相比於以SEQ ID No.2、4、8、10、14和16中任一者所示之胺基酸序列，或該些序列中之一者自位置16至位置676之胺基酸序列，可具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%胺基酸序列相似度。此外，該經修飾之黃熱病毒結構蛋白可為突變體，其中基於該具有以SEQ ID No.2、4、8、10、14和16中任一者所示之胺基酸序列或該些序列中之一者自位置16至位置676之胺基酸序列之黃熱病毒病毒結構蛋白，至多10%的該胺基酸被刪除、取代和/或加入。
(2)核苷酸和載體
在第二態樣中，本案提供一種核酸分子，包括編碼如本案第一態樣提供之類病毒粒子之核苷酸序列或由其所組成。
一具體實施例中，本案提供一種核酸分子，包括核苷酸序列，其編碼提供如上述之該類病毒粒子之黃熱病毒結構蛋白。
一具體實施例中，本案提供一種包括如上述核酸分子之表現載體，其中該載體視需求包括可操作地 連接至該核酸分子之表現控制序列。
表現控制序列之實例包括，但不限於，啟動子諸如CMV啟動子、噬菌體lambda PL啟動子、大腸桿菌之lac、phoA和tac啟動子、SV40之早期和晚期啟動子、以及反轉錄病毒長終端重複之啟動子。
一具體實施例中，本案提供一種用於黃熱病毒結構蛋白之表現載體，其由SEQ ID No.1、3、7、9、13和15中之任一者所示之核苷酸序列所組成。
一具體實施例中，本案提供核酸分子，其係自具有由SEQ ID No.1、3、7、9、13和15中之任一者所示之核苷酸序列之核酸分子經修飾而來。該經修飾之核酸序列相比於該具有由SEQ ID No.1、3、7、9、13和15中之任一者所示之核苷酸序列之核酸分子，可具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%核苷酸序列相似度。此外，該經修飾之核酸分子可為突變體，其中基於具有由SEQ ID No.1、3、7、9、13和15中之任一者所示之核苷酸序列之核酸分子，至多10%之該氨基酸被刪除、取代和/或增加。
(3)組成物或疫苗
在第三態樣中，本案提供一種包括本案第一態樣所提供之類病毒粒子和/或本發明第二態樣所提供之核酸分子之組成物或疫苗。
一具體實施例中，本案提供包括如上述之 類黃熱病毒粒子或如上述之核酸分子之組成物。
該組成物可進一步包括醫藥上可接受之載劑和/或佐劑。佐劑之實例包括，但不限於Ribi溶液(Sigma佐劑系統，Sigma-Aldrich)。
本案之醫藥組成物可含單一活性成分或二種或更多活性成分的組合，只要他們不和本案之目標矛盾。例如，細胞激素包括趨化素、對抗細胞激素之抗體，諸如抗-TNF抗體(如英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab))、抗-VEGF抗體(如貝伐珠單抗(bevacizumab)和蘭尼單抗(ranibizumab))、細胞激素受體拮抗劑，諸如抗HER2抗體(如曲妥珠單抗(Trastuzumab))、抗EGF受體抗體(如西妥昔單抗(Cetuximab))、抗VEGF適配體(如哌加他尼(Pegaptanib))以及免疫調節劑諸如環孢素、他克莫斯(tacrolimus)以及烏苯美斯(ubenimex)可用於組合治療。
複數種活性成分之組合中，有鑑於其療效和安全性，各成分的含量可適當地增加或減少。
本文所使用之術語“組合”意指二或多種活性成分以單一實體或劑量之形式同時施用至患者，或是該些活性成分作為個別的實體同時或沒有時間限制地依序施用至患者，其中這種施用，較佳在相同時間，在體內提供此二種成分的治療有效水平。
一具體實施例中，該組成物是疫苗組成物，包括DNA疫苗。一具體實施例中，本案所提供之DNA疫苗包括含有寡核苷酸之CpG。
(4)製造抗體的方法
在第四態樣中，本案提供一種方法製造對抗黃熱病毒之抗體或包括對抗黃熱病毒之中和抗體之抗血清，包括將本案第一態樣所提供之類病毒粒子和/或本案第二態樣所提供之核酸分子與哺乳動物接觸。
於此態樣中所製造之抗體可用於哺乳動物中對抗黃熱病毒導致之病原體的被動免疫，藉由施用該抗體至該哺乳動物中，因此預防該哺乳動物感染黃熱病毒或治療該哺乳動物之由黃熱病毒感染所致之疾病或症狀。
本案第四態樣所製造之抗體可使用習知技術而人化。因此，一具體實施例中，本案第四態樣所提供之方法進一步包括人化非人類哺乳動物製造之抗體的步驟。此態樣提供之抗體或人化抗體可被用於預防人類個體感染黃熱病毒或治療該個體中由黃熱病毒感染所致之疾病或症狀。
根據本態樣製造之抗體可被用於體外以自免疫細胞，諸如衍生自該患者之B細胞和T細胞中選擇亞群，其接著再施用至該患者。
抗血清可藉由習知方式取得。血液樣品係取自經免疫之非人類之動物，以及該血液係經處理以便取得該抗血清，即含該血液之液態成分之抗體。該非人類之哺乳動物較佳係選自由大鼠、小鼠、倉鼠、豬、兔、馬、驢、山羊、綿羊、天竺鼠、駱馬以及非人類靈長類動物(如 黑猩猩)所組成群組中。
(5)治療個體中由黃熱病毒感染所致疾病或預防個體感染黃熱病毒之方法
在第五態樣中，治療個體中由黃熱病毒感染，諸如登革熱，所致之疾病或症狀方法，其中第一態樣所提供之類病毒粒子、第二態樣所提供之核酸分子或第三態樣所提供之組成物係施用至該個體。藉由施用上列之VLP、核酸分子或組成物至該個體，對抗黃熱病毒之免疫反應可被增強並因此，由黃熱病毒感染所致之疾病或症狀可被有效地治療。在此態樣中，該類病毒粒子、核酸分子或組成物可被局部地施用至該患者之受影響之器官或全身性地施用至該患者。
預防個體感染黃熱病毒或預防由黃熱病毒感染所致疾病的方法，包括施用第一態樣之類病毒粒子、第二態樣提供之核酸分子或第三態樣之組成物至該個體。該由黃熱病毒感染所致之疾病可為登革熱。
根據本案，該類病毒粒子亦可應用於免疫療法。該VLP可於活體外應用至衍生自患者之細胞或人類細胞株，其隨後施用至該患者。
(6)製造類病毒粒子之方法
在第六態樣中，本案提供一種製造本案第一態樣所提供類病毒粒子之方法，包括：培養細胞，該細胞表現編碼 該病毒結構蛋白之基因；以及自該細胞培養中回收該類病毒粒子。
各種宿主-載體系統可被用於該類病毒粒子之表現。真核細胞可被用於本案第四態樣所提供之方法。真核細胞之實例包括，但不限於，昆蟲細胞(如sf9細胞、H5細胞)、酵母菌細胞(如釀酒酵母(S.cerevisiae))以及哺乳動物細胞(如CHO細胞、人類胚胎腎臟(HEK)293F細胞)。被用於本案第二態樣所提供之方法之載體包括編碼將被表現之類病毒粒子之核酸分子。可使用習知方法(如脂質轉染、電穿孔)使細胞被該載體轉染。熟悉此技藝者可依據使用之細胞選擇培養基或添加DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白去乙醯酶抑制劑諸如丁酸鈉。經轉染後，類病毒粒子可被該製造於該細胞和/或培養上清液中。類病毒粒子可被回收自該培養上清液並以超高速離心方法純化。
本案之類病毒粒子不複製，且因此具有高安全性。
(7)診斷黃熱病毒感染之套組或方法
在第七態樣中，本案提供一種用於診斷哺乳動物之黃熱病毒感染的方法或套組中的類病毒粒子。藉由使用該類病毒粒子，能夠偵測黃熱病毒特異性之抗體之酵素連結免疫吸附法(ELISA)診斷套組能夠被製造。
本案將參考以下實施例以詳細描述，然而該實施例並不意圖限制本案之範疇。
[實施例1] 包括登革病毒第1-2型蛋白或片段之類病毒粒子之製備
登革病毒第1和2型之病毒結構蛋白被使用作為野生型病毒結構蛋白。該病毒結構蛋白之被膜區域中被導入至少一個變異。意即，位於登革病毒第1型被膜蛋白(SEQ ID NO：20)之位置108的胺基酸Phe變成Ala(F108A)，位於登革病毒第1型被膜蛋白之位置203的胺基酸Lys變成Asn(K203N)(被膜區域：SEQ ID NO：4之第172至676個胺基酸)，位於位置246的胺基酸Asn變成Met(K246M)。在此實施例中，被膜區域對應至SEQ ID NO：2的第172至676個胺基酸、SEQ ID NO：20的位置108對應至SEQ ID NO：2的位置289、SEQ ID NO：20的位置203對應至SEQ ID NO：2的位置384、以及SEQ ID NO：20的位置246對應至SEQ ID NO：2的位置427。於此實施例中，該被膜區域中的突變是使用起始自該被膜區域的數字表述。
為了在哺乳動物細胞中表現該病毒結構蛋白，混合DENV2 prM E表現載體和DENV2殼蛋白表現載體各20ug並轉染至293F細胞。殼蛋白載體具有R85A和K86A突變以表現更好的產量(SEQ ID NO：11和12)。為了更好地表現該DENV2 prM E，DENV2被膜區域的C端(胺基酸199至胺基酸676)置換為該對應的DENV1被膜區域以提供嵌合體蛋白(SEQ ID NO.7和8)。為了穩定該類病毒粒子，被膜融合肽區域(F108A)係經突變(SEQ ID NO.9和10)。
轉染4天後，自該經轉染之細胞培養中收穫上清液，並且使用特異結合至該被膜蛋白之登革病毒(9.F.10)之單株抗體(sc-70959，Santa Cruz Biotechnology)作為一級抗體以及兔抗鼠IgG-HRP(sc-358920，Santa Cruz Biotechnology)作為二級抗體，以西方墨點法檢驗被膜表現。結果顯示於第2圖。
如自第2圖所顯示，經DENV2 prM和帶有一個變異(F108A)的登革病毒第2型和第1型被膜蛋白嵌合體轉染之細胞產生較大量之蛋白。上清液中的該些蛋白係自動組裝以提供粒子。
為了表現該VLP，混合DENV1 prM E表現載體和DENV1殼蛋白表現載體各20ug並轉染至293F細胞。殼蛋白載體具有K85A和K86A突變以表現更好的產量(SEQ ID NO.5和6)。為了穩定該VLP，被膜融合肽區域(F108A)(SEQ ID NO.1和2)或鹼性胺基酸(K203N)(SEQ ID NO.3和4)或(K246M)係經突變。再者，兩個胺基酸(F108A+K246M，SEQ ID NO：13和14)和(F108A+K203N，SEQ ID NO.15和16)也係經突變。轉染4天後，自該經轉染之細胞培養中收穫上清液，並且使用登革病毒(9.F.10)之單株抗體(sc-70959，Santa Cruz Biotechnology)作為一級抗體以及兔抗鼠IgG-HRP(sc-358920，Santa Cruz Biotechnology)作為二級抗體，以西方墨點法檢驗被膜表現。結果顯示於第3圖。
如自第3圖所顯示，經DENV prM和帶有至少一個變異的被膜蛋白轉染之細胞產生較大量之被膜蛋 白。上清液中的該些蛋白係自動組裝以提供粒子。
[實施例2] 包括登革病毒結構蛋白prM和被膜之類病毒粒子之製備
使用實施例1中所用之包含prM和經修飾之被膜蛋白F108A、K203N或K203N+F108A(分別為SEQ ID NO1、3、15)的登革病毒結構蛋白之表現載體。如實施例1中相同之方法，將20ug之載體轉染至293F細胞並培養。在轉染後4天，自該經轉染之細胞培養中收穫上清液。使用單株抗體(9.F.10,Santa Cruz Biotech)作為一級抗體以及兔抗鼠IgG-HRP接合抗體作為二級抗體，進行西方墨點法以偵測DENV VLP。結果顯示於第4圖。如第4圖所顯示，經DENV1-prM和該帶有至少一個變異之被膜蛋白轉染之細胞產生較大量之被膜蛋白。
使用0.45μm的濾膜過濾該上清液以獲得類病毒粒子。該類病毒粒子使用TFF管柱濃縮並使用QXL管柱(GE Healthcare)純化以獲得經純化之類病毒粒子。該經純化之類病毒粒子係保存於4%甲醛磷酸緩衝液中。進行經負染之類病毒粒子之電子顯微(EM)顯影。簡言之，將1.0μL之樣品置於碳塗佈之聚乙烯醇縮甲醛樹脂成膜銅網上並使該VLP貼附。接著，將2μL 1% PTA溶液加至該網，並以電子顯微鏡檢驗該網。結果顯示於第5圖。在上清液中觀察到類病毒粒子。
[實施例3] 對抗登革病毒之抗體
實施例2所得之經純化的類病毒粒子(K203N+F108A)命名為DEN1 VLP並用於此實施例中。該經純化之類病毒粒子進一步使用離心層析管柱(spin column)(分子量篩截：100kDa)濃縮以製造用於免疫之類病毒粒子。接著，藉由第0和4週肌內注射兩次於含鋁佐劑之磷酸緩衝液中(alhydrogel 2%,Sergeant Aduvants)之DEN1 VLP 30μg使4隻小鼠免疫。
衍生自該經免疫之小鼠的血清之登革病毒特異IgG力價係以ELISA系統檢測。檢驗該血清中各DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4病毒之中和抗體。使用以下登革血清型1至4：
DENV-1，菲律賓-99St12A株
DENV-2，菲律賓-00St22A株
DENV-3，菲律賓-SLMC50株
DENV-4，菲律賓-SLMC318株
JEV-JaOAr S-982株
該經免疫之小鼠之血清中抗-DENV中和抗體係以前述灶點減少中和測試(focus reduction neutralization test,FRNT)偵測，使用1.25x108灶點形成單位(FFU)的Vero-馴化DV第1-4型於非洲綠猴腎細胞(Vero cell)。在測試最高血清稀釋其減少FFU之數字至少50%(FRNT50)時，計算終點力價。使用在96孔盤中100%聚滿狀態(confluence)之 Vero細胞。
使用內部抗-登革兔IgG作為一級抗體，以及使用抗-兔IgG-HRPO接合體(102-PD)作為二級抗體。結果係整合於下表中。
Figure 104130067-A0305-02-0023-1
如表1所示，該DENV1 VLP顯示對登革病毒第1、2、3和4型的優異中和效果。考慮到自登革減毒活疫苗中所得之中和抗體之FRNT50值為約1000(Tsai等人，Journal of Virology,2015 89：7348-7362)，DENV1 VLP的免疫原性是非常強的並且比起登革減毒活疫苗提供了約10倍高的登革病毒中和抗體。
[實施例4] 包括類登革病毒粒子之醫藥組成物之製備
依據實施例1製備類登革病毒粒子。為了製備為疫苗組成物的醫藥組成物，將各經製備之粒子80μg與1mL之蔗糖磷酸鹽溶液混合，pH 7.2，無內毒素(Teknova,SP buffer)。
[實施例5] 類登革病毒第2-4型衍生病毒粒子之製備
製備登革病毒第2-4型之prM和被膜蛋白之表現載體，其中該被膜區域之胺基酸位置108(對應至SEQ ID NO.22至24的第289個胺基酸)之F置換為A，以及該被膜蛋白之C端(第478-676個胺基酸或第476-674個胺基酸)置換為對應至登革病毒第1型之被膜蛋白者(SEQ ID NO.22之胺基酸478-676)。由該些載體表現之蛋白為以SEQ ID NO.22至24所表示者。類病毒粒子係以如實施例1相同之方法取得。
<110> VLP醫療股份有限公司
<120> 類黃熱病毒粒子
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<223> 登革第1型病毒前驅膜蛋白被膜(F108A K246M)
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<223> 登革第1型病毒前驅膜蛋白被膜(F108A K203N)類病毒粒子D01
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<223> pr序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(91)
<223> 登革第1型病毒pr序列
<400> 18
Figure 104130067-A0202-12-0087-81
<210> 19
<211> 75
<212> PRT
<213> 登革病毒
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(75)
<223> M序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(75)
<223> 登革第1型病毒M序列
<400> 19
Figure 104130067-A0202-12-0087-82
Figure 104130067-A0202-12-0088-83
<210> 20
<211> 495
<212> PRT
<213> 登革病毒
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(495)
<223> 登革第1型病毒被膜序列
<400> 20
Figure 104130067-A0202-12-0088-84
Figure 104130067-A0202-12-0089-85
Figure 104130067-A0202-12-0090-86
<210> 21
<211> 676
<212> PRT
<213> 登革病毒
<220>
<221> INIT_MET
<222> (1)..(1)
<220>
<221> SIGNAL
<222> (2)..(15)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(106)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (107)..(181)
<223> 登革第1型病毒M序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (182)..(676)
<223> 登革第1型病毒被膜序列
<400> 21
Figure 104130067-A0202-12-0091-87
Figure 104130067-A0202-12-0092-88
Figure 104130067-A0202-12-0093-89
Figure 104130067-A0202-12-0094-90
<210> 22
<211> 676
<212> PRT
<213> 登革病毒
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 登革病毒第2型前驅膜蛋白被膜(F108A)_3'登革病毒第1型
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (182)..(477)
<223> 登革病毒第2型前驅膜蛋白被膜(F108A)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (182)..(477)
<223> 登革病毒第2型前驅膜蛋白被膜(F108A)
<220>
<221> MISC_FEATURRE
<222> (478)..(676)
<223> 3'登革病毒第1型
<400> 22
Figure 104130067-A0202-12-0094-91
Figure 104130067-A0202-12-0095-92
Figure 104130067-A0202-12-0096-93
Figure 104130067-A0202-12-0097-94
Figure 104130067-A0202-12-0098-95
<210> 23
<211> 674
<212> PRT
<213> 登革病毒
<220>
<221> misc_feature
<223> 登革病毒第3型前驅膜蛋白被膜(F108A)_3'登革病毒第1型
<220>
<221> misc_feature
<222> (182)..(475)
<223> 登革病毒第3型前驅膜蛋白被膜(F108A)
<220>
<221> misc_feature
<222> (476)..(676)
<223> 3'登革病毒第1型
<400> 23
Figure 104130067-A0202-12-0098-96
Figure 104130067-A0202-12-0099-97
Figure 104130067-A0202-12-0100-98
Figure 104130067-A0202-12-0101-99
<210> 24
<211> 676
<212> PRT
<213> 登革病毒
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 登革病毒第4型前驅膜蛋白被膜(F108A)_3'登革病毒第1型
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(477)
<223> 登革病毒第4型前驅膜蛋白被膜(F108A)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (478)..(676)
<223> 3'登革病毒第1型
<400> 24
Figure 104130067-A0202-12-0102-100
Figure 104130067-A0202-12-0103-101
Figure 104130067-A0202-12-0104-102
Figure 104130067-A0202-12-0105-103
C‧‧‧殼蛋白
E‧‧‧被膜
prM‧‧‧前驅膜蛋白

Claims (18)

  1. 一種類病毒粒子，包括一或多個黃熱病毒結構蛋白，其中該黃熱病毒結構蛋白包括前驅膜蛋白(prM)和被膜區域，該黃熱病毒結構蛋白的被膜區域包括於胺基酸序列中包括至少一個變異，該至少一個變異係位於SEQ ID NO：20的胺基酸位置108、203或246，或位於經比對為對應至SEQ ID NO：20之胺基酸位置108、203或246之胺基酸位置。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子，其中該至少一個變異係位於SEQ ID NO：20之胺基酸位置108，或位於經比對識別為對應至SEQ ID NO：20之位置108之位置。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子，其中該黃熱病毒為西尼羅病毒、登革病毒、蜱媒腦炎病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒或C型肝炎病毒。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之類病毒粒子，其中該黃熱病毒為登革病毒、西尼羅病毒、日本腦炎病毒。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之類病毒粒子，其中該黃熱病毒為登革病毒。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之類病毒粒子，其中該黃熱病毒結構蛋白係包括以SEQ ID Nos.2、4、8、10、14和16中任一者表示之胺基酸序列的胺基酸位置16至胺基酸位置676之胺基酸序列之蛋白質。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之類病毒粒子，其中該黃熱 病毒結構蛋白係由以SEQ ID Nos.2、4、8、10、14和16中任一者表示之胺基酸序列所組成之蛋白質。
  8. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之類病毒粒子，其中該黃熱病毒結構蛋白係衍生自由與SEQ ID Nos.2、4、8、10、14和16中任一者表示之胺基酸序列有90%或更高序列相似度之胺基酸序列所組成之蛋白質。
  9. 一種分離之核酸分子，包括核苷酸序列，該核苷酸序列編碼包含於申請專利範圍第1至8項中任一項所述之類病毒粒子中之黃熱病毒結構蛋白。
  10. 一種分離之核酸分子，係由與SEQ ID No.1、3、7、9、13和15中任一者表示之核苷酸序列具有90%或更高序列相似度之核苷酸序列所組成。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之分離之核酸分子，其係由SEQ ID No.1、3、7、9、13和15中任一者表示之核苷酸序列所組成。
  12. 一種載體，包括申請專利範圍第9項所述之核酸分子，其中該載體視需求包括可操作地連接至該核酸分子之表現控制序列。
  13. 一種醫藥組成物，包括：(a)申請專利範圍第1至8項中任一項所述之類病毒粒子和/或如申請專利範圍第9至11項中任一項所述之核酸分子和/或如申請專利範圍第12項所述之載體；以及(b)醫藥上可接受之載劑。
  14. 一種疫苗組成物，包括申請專利範圍第1至8項中任一項所述之類病毒粒子。
  15. 一種DNA疫苗組成物，包括申請專利範圍第9至11項中任一項所述之核酸分子和/或如申請專利範圍第12項所述之載體。
  16. 一種申請專利範圍第13至15項中任一項所述之組成物之用途，其係用於製造用以治療或預防由黃熱病毒感染引起之疾病或症狀之藥劑。
  17. 一種製造申請專利範圍第1至8項中任一項所述之類病毒粒子之方法，包括培養經下述基因轉染的細胞，該基因係編碼包含於申請專利範圍第1至8項中任一項所述之類病毒粒子中之至少一個黃熱病毒結構蛋白者；以及自該細胞培養中回收類病毒粒子。
  18. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之類病毒粒子，其用於診斷黃熱病毒感染之方法或套組。
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