CN101151272A - 在假单胞菌中生产重组二十面体病毒样颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了生产重组肽的改进方法，通过将重组肽与二十面体病毒衣壳融合并在假单胞菌来源的细菌细胞中表达。假单胞菌细胞支持体内从二十面体病毒衣壳形成病毒样颗粒，并使得较大的重组肽作为单体和多联体的包涵体存在于病毒样颗粒中。本发明特别地提供了表达病毒衣壳融合体的细胞，编码毒性蛋白和二十面体病毒衣壳的融合体的核酸，以及制造重组蛋白的方法。

Description

在假单胞菌中生产重组二十面体病毒样颗粒

相关申请的交叉参考

本申请要求2003年12月1日提交的，发明名称为“假单胞菌中高效肽生产”的U.S.临时专利申请No.60/525,982的优先权。

技术领域

本发明提供了生产重组肽的改良方法。尤其是，本发明提供了在利用二十面体病毒的病毒样颗粒的细菌细胞中生产或表达(presentation)重组肽的改良方法。

发明背景

已经扩展基因工程革命来研发用作人和动物治疗剂的重组肽。目前，存在超过100种U.S.FDA批准用于医疗用途的源自生物技术的治疗剂和疫苗，和超过1000种的其他药物和疫苗正处于临床实验的各个阶段。(参见，M.Rai&H.Padh，(2001)用于生产异种蛋白质的表达系统“Expression systems for production ofheterologous proteins”，Cur.Science 80(9)：1121-1128)。

目前将细菌、酵母、盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)、昆虫和哺乳动物细胞表达系统用于生产重组肽，具有不同程度的成功。创建用于生产异种肽的表达系统的一个目标是提供可用于商业、治疗和疫苗应用中的广泛、灵活、有效、经济而实用的平台和方法。例如，对于特定肽的生产，为了消除或降低下游重新装配的成本，理想的是具有能够以有效而廉价的方式在体内产生大量所需终产品的表达系统。

目前，由于产生大量重组肽的潜力，细菌是生产重组肽最广泛使用的表达系统。然而，细菌产生特定类型肽的能力经常是有限的，需要使用可替换的和更昂贵的表达系统。例如，细菌系统产生单体抗微生物肽的能力受到限制，由于这种肽对细菌的毒性，通常在肽表达时导致细胞死亡。由于就非细菌表达系统的成本和产量而言的固有缺陷，已经花费了相当多的时间和资源来努力提高细菌系统生产多种商业和治疗用途肽的能力。尽管在该领域取得了进展，在细菌表达系统中生产异种肽的其他方法和平台是有益的。

病毒

提高宿主细胞表达系统中肽生产的一种方法是使用复制病毒产生目标肽的特性。然而，使用复制全长病毒在用于重组肽生产策略中具有多种缺陷。例如，难以在发酵调控过程中控制重组肽生产，其需要表达的严格调控，为了最大化发酵运行的效率。此外，使用复制病毒来生产重组肽可能导致调控需要的负担，其可能导致下游纯化步骤增加。

为了克服生产问题，尤其是在发酵过程中的生产问题，研究的一方面聚焦于不是特定病毒天然宿主的细胞(非向性宿主细胞)中病毒的表达和装配。非向性细胞是病毒不能成功进入的细胞，由于病毒衣壳和宿主受体分子之间的不相容性，或病毒生化和细胞生化之间的不相容性，阻止病毒完成其生命周期。例如，Price等的US专利No.5,869,287描述了在酵母细胞中合成和装配含RNA的可复制或感染性病毒的方法，其中病毒衣壳或衣壳中所含的RNA来自非酵母病毒种野田村病毒(Nodaviridae)或雀麦花叶病毒(Bromoviridae)。然而，该方法没有克服可能的调节与复制性病毒中蛋白生产相关的。

病毒样颗粒

提高重组肽生产的另一种方法是使用病毒样颗粒(VLP)。通常，包膜病毒包括装配的蛋白质外壳或“衣壳”来包含病毒核酸。许多病毒具有可以从单独表达的衣壳“自我装配”的衣壳，都在细胞内衣壳得到表达(“体内装配”)形成VLP，细胞外分离和纯化后(“体外装配”)。理想地，改变衣壳来包含目标重组肽，产生重组病毒衣壳-肽融合。然后将该融合肽在细胞中表达，且理想地在体内装配成重组病毒或病毒样颗粒。

该方法已经获得了不同程度的成功。参见，例如，C Marusic等，J Virol.75(18)：8434-39(2001年9月)(在植物中表达重组的、末端与抗原HIV肽融合的螺旋马铃薯病毒X，体内形成重组病毒颗粒)；FR Brennan等，Vaccine17(15-16)：1846-57(1999年4月9日)(在植物中表达重组的，末端与抗原金黄色葡萄球菌肽融合的二十面体豇豆病毒或螺旋马铃薯病毒X抗，体内形成重组病毒颗粒)。

Lomonossoff&Johnson的US专利No.5,874,087描述了在植物细胞中重组植物病毒的生产，其中病毒衣壳包括工程化包含生物活性肽如激素、生长因子或抗原肽的衣壳。将选自豇豆花叶病毒(Comovirus)，番茄丛矮病毒(Tombusvirus)，南方菜豆花叶病毒(Sobemovirus)和线虫传多面体病毒(Nepovirus)的病毒工程化来包含外源肽编码序列，且表达病毒完整的工程化基因组来产生重组病毒。将外源肽编码序列插入一个或多个衣壳表面环基序编码序列内。

已经尝试利用非向性细胞来产生特定的病毒样颗粒。参见，例如，JW Lamb等，J Gen.Virol.77(第7部分)：1349-58(1996年7月)，描述了在昆虫细胞中表达重组的、末端与十七肽融合的二十面体马铃薯叶卷叶病毒，体内形成病毒样颗粒。特定情况中，优选非向性VLP。例如，非向性病毒衣壳比天然病毒衣壳更适应外源肽插入而没有破坏装配病毒样颗粒的能力。或者，非向性病毒衣壳可以比天然、向性病毒得到更好地表征和理解。此外，特定应用，如疫苗生产，在特定宿主细胞表达系统中不可以使用向性病毒。Chapman等的U.S.专利No.6,232,099描述了使用杆状病毒在植物中生产连接病毒衣壳亚基的外源蛋白。杆状病毒，也归类为螺旋病毒，如马铃薯病毒X(PVX)，具有插入病毒基因组的目标重组肽来形成重组病毒衣壳-肽融合。然后将重组病毒用于感染宿主细胞，且病毒在宿主细胞中活跃地复制并进一步感染其他细胞。最终，从植物宿主细胞中纯化重组病毒衣壳-肽融合体。

在细菌表达系统中使用病毒样颗粒

由于重组肽快速、有效、廉价和产量大的潜力，已经研究了细菌作为表达系统中的宿主细胞用于生产重组病毒衣壳-肽融合病毒样颗粒。

研究者已经表明没有重组肽插入的特定野生型病毒可以在非向性肠细菌中转基因表达。研究者还表明了这些衣壳可以在体内和体外装配成病毒样颗粒。参见，例如，SJ Shire等，Biochemistry29(21)：5119-26(1990年5月29日)(从大肠杆菌中表达的螺旋烟草花叶病毒衣衣壳外装配病毒样颗粒)；X Zhao等，Virology207(2)：486-94(1995年3月10日)(丛大肠杆菌中表达的二十面体豇豆褪绿斑驳病毒衣衣壳外装配病毒样颗粒)；Y Stram等，Virus Res.28(1)：29-35(1993年4月)(在大肠杆菌中表达丝状马铃薯病毒Y衣壳，体内形成病毒样颗粒)；J Joseph & HSSavithri，Arch.Virol.144(9)：1679-87(1999)(在大肠杆菌中表达丝状红辣椒脉结病毒衣壳，体内形成病毒样颗粒)；DJ Hwang等，Proc Nat’l Acad.Sci.USA91(19)：9067-71(1994年9月13日)(在大肠杆菌中表达螺旋烟草花叶病毒衣壳，体内形成病毒样颗粒)；M Sastri等，J Mol.Biol.272(4)：541-52(1997年10月3日)(在大肠杆菌中表达二十面体酸浆斑纹病毒衣壳，体内形成病毒样颗粒)。

迄今为止，在非向性细菌细胞中表达和体内装配重组病毒衣壳-肽融合颗粒获得了不同的成功。通常，这些颗粒的成功体内装配只是限于非二十面体病毒衣壳-目标肽融合颗粒。参见，例如，MN Jagadish等，Intervirology 39(1-2)：85-92(1996)(在非植物细胞中表达重组的、丝状、末端与抗原肽融合的非二十面体约翰逊草花叶病毒衣壳，体内形成病毒样颗粒)。

连接二十面体衣壳的肽的表达还未成功或只是有限的使用。例如，V Yusibov等，J Gen.Virol.77(第4部分)：567-73(1996年4月)描述了从大肠杆菌表达的重组的末端与六组氨酸肽融合的二十面体苜蓿花叶病毒体外装配病毒样颗粒。

Brumfield等没有成功获得表达为体外装配的插入二十面体衣壳的病毒样颗粒重组肽。参见Brumfield等，(2004)豇豆褪绿斑驳雀麦花叶病毒修饰衣壳的体外表达导致具有改变的结构和功能的蛋白质笼的装配(“Heterologous expression ofthe modified capsid of Cowpea chlorotic mottle bromovirus results in the assembly ofprotein cages with altered architectures and functions”)，J.Gen.Vir.85：1049-1053。观察到的二十面体病毒衣壳-肽融合颗粒无法在大肠杆菌体内中装配成病毒样颗粒的原因还没有得到充分地了解。Brumfield等将装配失败与大肠杆菌产生了不溶衣壳的事实联系起来。

Chapman在U.S.专利No.6,232,099中，指出二十面体病毒耐受有限的插入片段大小。Chapman引用了WO92/18618，其将用于植物宿主细胞中表达的二十面体病毒中重组肽的大小限制为26个氨基酸长度，来支持他的论断。Chapman推论二十面体病毒衣壳中内在插入位点存在较大的肽可能会导致蛋白质几何结构的破坏和/或与其他衣壳成功相互作用的能力，导致嵌合病毒装配的失败。该参考文献还描述了在包括大肠杆菌的细胞中使用非复制性杆状病毒来生产衣壳-重组肽融合肽。

因此，本发明的目的是提供改良的细菌表达系统用于产生病毒样颗粒，其中病毒样颗粒源自二十面体病毒。

本发明的另一目的是提供细菌生物体用作改良表达系统中的宿主细胞用于生产病毒样颗粒。

本发明的再一目的是提供在细菌中生产病毒样颗粒的改良方法。

本发明的再一目的是提供新的构建体和核酸用于改良细菌表达系统中用于生产病毒样颗粒。

发明内容

当在假单胞菌生物体中得到表达时，二十面体衣壳-重组肽融合颗粒体内装配成病毒样颗粒或可溶的笼形结构。此外，大的重组肽或肽多联体(concatamers)，大于50个氨基酸，可以插入二十面体衣壳中并在假单胞菌生物体中体内装配。

本发明的一方面中，提供包括编码二十面体衣壳和重组肽的融合肽的核酸构建体的假单胞菌生物体。本发明的一个特定实施方案中，假单胞菌细胞是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。一个实施方案中，细胞产生病毒样颗粒或可溶的笼形结构。

细胞中产生的病毒样颗粒通常不能够感染细胞。病毒衣壳序列可以源自对细胞非向性(tropic)的病毒。一个实施方案中，除了所需的二十面体衣壳以外细胞不包括病毒蛋白质。一个实施方案中，病毒衣壳源自对细胞以外的不同科生物体具有向性的病毒。另一个实施方案中，病毒衣壳源自对细胞以外的不同属生物体具有向性的病毒。另一个实施方案中，病毒衣壳源自对细胞以外的不同种生物体具有向性的病毒。本发明的一个实施方案中，二十面体衣壳源自植物二十面体病毒。特定实施方案中，二十面体衣壳源自选自豇豆花叶病毒病毒，豇豆退绿斑驳病毒(cowpea chlorotic mosaic virus)或苜蓿花叶病毒的病毒。

本发明的一个实施方案中，融合二十面体衣壳的重组肽是用于人或动物治疗的治疗肽。一特定实施方案中，重组肽是抗原。一个实施方案中，衣壳-重组肽病毒样颗粒可以作为人或动物应用中的疫苗给药。另一特定实施方案中，当重组肽是游离单体形式时，是对宿主细胞有毒的肽。更特定的实施方案中，毒性肽是抗微生物肽。

一个实施方案中，融合二十面体衣壳的重组肽为至少7，至少8，至少9，至少10，至少12，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，至少40，至少45，至少50，至少55，至少60，至少65，至少75，至少85，至少95，至少99或至少100个氨基酸。

本发明的一个实施方案中，融合二十面体衣壳的重组肽包含所需目标肽的至少一个单体。可替换的实施方案中，重组肽含有所需目标肽的多于一个单体。特定实施方案中，肽包括至少2、至少5，至少10，至少15或至少20个分开的单体，可作为连环肽可操作地连接衣壳。另一个实施方案中，连环肽中的单个单体通过可分裂连接物片段连接。再一个实施方案中，将重组肽插入二十面体病毒衣壳的至少一个表面环中。一个实施方案中，将至少一个单体插入二十面体病毒衣壳的多于一个表面环中。

可以修饰病毒样颗粒多于一个的环。一特定实施方案中，在二十面体病毒样颗粒的至少两个表面环上表达重组肽。另一个实施方案中，将至少两个不同的肽插入病毒衣壳、笼形或病毒样颗粒的至少两个表面环中。另一个实施方案中，将至少三个重组肽插入病毒样颗粒的至少三个表面环中。表面环中的重组肽可以具有相同的氨基酸序列。分开的实施方案中，表面环中重组肽的氨基酸序列是不同的。

再一个实施方案中，细胞包括至少一个另外的核酸，其编码第二个野生型衣壳或衣壳-重组肽融合肽，其中体内装配多个衣壳来产生嵌合病毒样颗粒。

本发明的一方面中，提供包括二十面体衣壳和重组肽的融合肽的假单胞菌生物体。本发明一特定实施方案中，假单胞菌细胞是荧光假单胞菌。一个实施方案中，衣壳-重组肽融合肽体内装配成病毒样颗粒。

本发明另一方面中，提供了核酸构建体，编码二十面体衣壳和重组肽的融合肽。本发明的一个实施方案中，二十面体衣壳源自植物二十面体病毒。特定实施方案中，二十面体衣壳源自选自豇豆花叶病毒病毒，豇豆退绿斑驳病毒或苜蓿花叶病毒的病毒。

一个实施方案中，当重组肽是游离单体形式时，是对宿主细胞有毒的肽。更特别的实施方案中，毒性肽是抗微生物肽。

本发明的一个实施方案中，重组肽含有所需目标肽的至少一个单体。可替换的实施方案中，重组肽含有所需目标肽的多于一个单体。再一个实施方案中，将重组肽插入二十面体病毒衣壳的至少一个表面环中。

另一个实施方案中，核酸构建体包括另外的核酸序列，包括至少一个启动子、至少一个选择标记、至少一个操纵子序列、至少一个复制起点和至少一个核糖体结合位点。

一方面，本发明提供了生产重组肽的方法，包括：

a)提供假单胞菌细胞；

b)提供编码融合肽的核酸，其中融合体是重组肽和二十面体衣壳的融合；

c)在假单胞菌细胞中表达核酸，其中细胞中的表达提供了将融合肽体内装配成病毒样颗粒；和

d)分离病毒样颗粒。

一个实施方案中，该方法进一步包括：e)分裂融合产物从衣壳分离出重组肽。本发明的一个实施方案中，假单胞菌细胞是荧光假单胞菌。

一个实施方案中，该方法包括共表达另一种编码野生型衣壳或衣壳-重组肽融合肽的核酸，其中体内装配衣壳来产生嵌合病毒样颗粒。

本发明另一方面中，提供了用于生产重组肽的表达系统，包括：

a)假单胞菌细胞；

b)编码融合肽的核酸；其中融合肽包括至少一个重组肽和至少一个二十面体病毒衣壳；和

c)生长培养基。

当表达时，融合肽可以在细胞内装配成病毒样颗粒。

附图说明

图1呈现了用于在假单胞菌宿主细胞中表达重组VLP的CCMV127-CP表达质粒的质粒图谱。

图2说明了在宿主细胞例如假单胞菌宿主细胞中的病毒样颗粒(VLP)中生产肽单体的示意图。所需目标肽插入片段编码序列(“I”)的正确读码框，插入病毒衣壳编码序列中(“CP”)以构建重组病毒衣壳基因(“rCP”)，其作为载体的一部分，转化进宿主细胞中并表达形成重组衣壳(“rCP”)。在CCMV的情况中，然后将这些装配成每个含有达180rCPs的VLP。用衣壳外部环中表达的目标肽插入片段(“T”)来说明VLP。装配的VLP各自在每个颗粒中含有多个肽插入片段，例如，达180个或多个。然后从细胞裂解物中容易地沉淀出VLP用于收集，例如通过PEG沉淀。以高纯度的形式从沉淀的VLP中分离在衣壳表面环和/或末端表达的重组肽插入片段。

图3说明了在宿主细胞例如假单胞菌宿主细胞中的VLP中生产肽多聚体的示意图。肽插入片段是所需目标肽的多聚体(显示了三聚体)，将其编码序列(“i”)插入病毒衣壳编码序列(“CP”)中以构建重组病毒衣壳基因(“rCP”)。每个目标肽编码序列通过编码分裂位点(“*”)的序列连接并将完整的核酸插入片段标记为“I”。图示中，每个CCMV衣壳只形成一个三聚体插入片段，且每个所得到的VLP含有达180个肽插入片段(“I”)，用于总共达540个的目标肽(“i”)。然后在VLP沉淀后，用分裂剂例如酸或酶处理VLP，以高度纯化的形式容易地分离出目标肽。

图4是用于重组VLPs表达的CCMV63-CP表达质粒的质粒图谱。将限制位点AscI和NotI工程化至CCMV-CP(SEQ ID NO：1)上来用作肽的插入位点。

图5是用于重组VLPs表达的R26C-CCMV63/129-CP表达质粒的质粒图谱。两个插入位点(AscI-NotI和BamHI)工程化至CP中用于插入两个相同或不同的肽。

图6是SDS-PAGE凝胶的图象，显示了诱导后24小时荧光假单胞菌中嵌合CCMV CP的表达。已经将嵌合CP工程化来表达20个氨基酸的抗原肽PD1。与非工程化的野生型(wt)CCMV CP相比，嵌合CP减缓了迁移率。泳道1是大小标记(ladder)，泳道2是诱导后0小时的野生型CP，泳道3是诱导后24小时的野生型CP，泳道4是诱导后0小时的CCMV129-PD1，和泳道5是诱导后24小时的CCMV129-PD1。

图7是蛋白质印迹的图象，显示了荧光假单胞菌中嵌合CCMV CP的表达。已经将嵌合CP工程化来表达20个氨基酸的抗原肽PD1。与非工程化的野生型(wt)CCMV CP相比，嵌合CP减缓了迁移率。泳道1是大小标记(ladder)，泳道2是诱导后0小时的野生型CP，泳道3是诱导后24小时的野生型CP，泳道4是诱导后0小时的CCMV129-PD1，和泳道5是诱导后24小时的CCMV129-PD1。

图8是CCMV129-PD1 VLP蔗糖梯度级分的蛋白质印迹图象。工程化来表达20个氨基酸的抗原肽PD1的嵌合CCMV CPs在荧光假单胞菌中表达。诱导后24小时通过PEG沉淀来分离嵌合VLP并在蔗糖密度梯度上分级。VLP级分对嵌合CP是阳性的。泳道1是CCMV129-PD1 VLP蔗糖梯度级分，泳道2是CCMV129-PD1 VLP蔗糖梯度级分，泳道3是CCMV129-PD1 VLP蔗糖梯度级分，泳道4是大小标记(ladder)。

图9是呈现了20个氨基酸的抗原肽PD1的嵌合CCMV VLP的电子显微镜(EM)图象。使用PEG沉淀和蔗糖密度分级从荧光假单胞菌中分离VLPs。

图10是SDS-PAGE凝胶图象，显示了诱导后12、24和48小时嵌合CCMV CP在荧光假单胞菌中的表达。已经将嵌合CP工程化来表达通过酸水解位点分离的抗微生物肽D2A21三聚体。与非工程化的野生型(wt)CCMV CP相比，嵌合CP具有较慢的迁移率。泳道1是大小标记(ladder)，泳道2是诱导后0小时的野生型CP，泳道3是诱导后12小时的野生型CP，泳道4是诱导后24小时的野生型CP，泳道5是诱导后48小时的野生型CP，泳道6是诱导后0小时的CCMV129-(D2A21)₃，泳道7是诱导后12小时的CCMV129-(D2A21)₃，泳道8是诱导后24小时的CCMV129-(D2A21)₃，和泳道9是诱导后48小时的CCMV129-(D2A21)₃。

图11是CCMV129-(D2A21)₃VLP蔗糖梯度级分的蛋白质印迹图象。工程化来表达通过酸水解位点分离的96个氨基酸的抗微生物肽D2A21三聚体的嵌合CCMV CP在荧光假单胞菌中表达。诱导后24小时通过PEG沉淀分离嵌合VLPs并在蔗糖密度梯度上分级。VLP级分对嵌合CP是阳性的。泳道1是大小标记(ladder)，泳道2-4是CCMV129-(D2A21)₃VLP蔗糖梯度级分。

图12是呈现通过酸水解位点分离的抗微生物肽D2A21三聚体的嵌合CCMVVLPs的电子显微镜(EM)图象。使用PEG沉淀和蔗糖密度分级从荧光假单胞菌中分离VLPs。

图13是HPLC色谱，显示了AMP D2A21肽单体从工程化来呈现通过酸处理通过酸分裂位点分离的抗微生物肽D2A21三聚体的嵌合VLPs的释放。在非工程化(空)VLPs中没有检测到AMP肽峰。

图14是MALDI-MS图，显示了从工程化来呈现通过酸处理通过酸分裂位点分离的抗微生物肽D2A21三聚体的嵌合VLPs释放的AMP D2A21肽单体的同一性。D2A21肽单体分子量和预测的一样。

图15是SDS-PAGE凝胶图象，显示了诱导后12和24小时嵌合CCMV CP在荧光假单胞菌中的表达。已经将嵌合CP工程化来表达四个不同的25个氨基酸的抗原肽PA1、PA2、PA3和PA4。与非工程化的野生型(wt)CCMV CP相比，嵌合CP具有较慢的迁移率。泳道1是大小标记(1adder)，泳道2是诱导后0小时的CCMV129-PA1，泳道3是诱导后12小时的CCMV129-PA1，泳道4是诱导后24小时的CCMV129-PA1，泳道5是诱导后0小时的CCMV129-PA2，泳道6是诱导后12小时的CCMV129-PA2，泳道7是诱导后24小时的CCMV129-PA2，泳道8是诱导后0小时的CCMV129-PA3，泳道9是诱导后12小时的CCMV129-PA3，泳道10是诱导后24小时的CCMV129-PA3，泳道11是诱导后0小时的CCMV129-PA4，泳道12是诱导后12小时的CCMV129-PA4，泳道13是诱导后24小时的CCMV129-PA4。

图16是CCMV129-PA1、CCMV129-PA2、CCMV129-PA3、CCMV129-PA4 VLP蔗糖梯度级分的蛋白质印迹图象。工程化来表达25个氨基酸的抗原PA肽的嵌合CCMV CP在荧光假单胞菌中表达。诱导后24小时通过PEG沉淀分离嵌合VLPs并在蔗糖密度梯度上分级。VLP级分对嵌合CP是阳性的。泳道1是大小标记(ladder)，泳道2-4是CCMV129-PA1 VLP蔗糖梯度级分，泳道5-7是CCMV129-PA2 VLP蔗糖梯度级分，泳道8-10是CCMV129-PA3 VLP蔗糖梯度级分和泳道11-13是CCMV129-PA4 VLP蔗糖梯度级分。

图17是SDS-PAGE图象，显示了嵌合CCMV CP在荧光假单胞菌中的表达。已经将嵌合CCMV63-CP工程化来表达通过酸水解位点分离的20个氨基酸抗微生物肽PBF20。与非工程化的野生型(wt)CCMV CP相比。嵌合CP具有较慢的迁移率。泳道1是大小标记(ladder)，泳道2是诱导后0小时的野生型CP，泳道3是诱导后24小时的野生型CP，泳道4是诱导后0小时的CCMV63-PBF20，泳道5是诱导后24小时的CCMV63-PBF20。

图18是源自CCMV63-CP并呈现了通过酸水解位点分离的20个氨基酸的抗微生物肽PBF20的嵌合CCMV VLPs的电子显微镜(EM)图象。使用PEG沉淀和蔗糖密度分级从荧光假单胞菌中分离嵌合VLPs。

图19是SDS-PAGE图象，显示了嵌合CCMV CP在荧光假单胞菌中的表达。已经将嵌合CCMV129-CP工程化来表达通过酸水解位点分离的20个氨基酸的抗微生物肽PBF20。泳道1是大小标记(ladder)，泳道2是诱导后0小时的CCMV129-PBF20和泳道3是诱导24小时后的CCMV129-PBF20。

图20是源自CCMV129-CP并呈现了通过酸水解位点分离的20个氨基酸的抗微生物肽PBF20的嵌合CCMV VLPs的电子显微镜(EM)图象。使用PEG沉淀和蔗糖密度分级从荧光假单胞菌中分离嵌合VLPs。

图21是SDS-PAGE的图象，显示了嵌合CCMV CP在荧光假单胞菌中的表达。已经将CCMV63/129-CP工程化来表达通过CP中两个不同插入位点(63和129)的酸水解位点分离的20个氨基酸抗微生物肽PBF20。与工程化来表达相同肽单个插入片段(CP+1×20AA)的衣壳相比，含有双插入片段(CP+2×20AA)的嵌合CP在SDS-PAGE凝胶上具有较慢的迁移率。泳道1是大小标记(ladder)，泳道2是诱导后0小时的CCMV63-PBF20，泳道3是诱导24小时后的CCMV63-PBF20，泳道4是诱导后0小时的CCMV63/129-2×(PBF20)，泳道5是诱导24小时后的CCMV63/129-2×(PBF20)，泳道6是诱导后0小时的CCMV63/129-2×(PBF20)，泳道7是诱导后24小时的CCMV63/129-2×(PBF20)，泳道8是诱导后0小时的CCMV63/129-2×(PBF20)，泳道9是诱导后24小时的CCMV63/129-2×(PBF20)。

图22是源自CCMV63/129-CP的呈现了通过每个衣壳两个插入位点(63和129)的酸水解位点分离的20个氨基酸的抗微生物肽PBF20的嵌合CCMV VLPs的电子显微镜(EM)图象。使用PEG沉淀和蔗糖密度分级从荧光假单胞菌中分离嵌合VLPs。

具体实施方式

本发明提供了在细菌中表达包括二十面体病毒衣壳和目标重组肽的融合肽的方法。如在此所用的术语“肽”不受限于任何特定分子量，并还可以包括蛋白质或多肽。本发明进一步提供了用于该方法中的细菌细胞和核酸构建体。具体地，本发明提供了具有核酸构建体的假单胞菌生物体，该构建体编码二十面体衣壳和重组肽的融合肽。本发明的一特定实施方案中，假单胞菌细胞是荧光假单胞菌。一个实施方案中，细胞产生病毒样颗粒或可溶笼形结构。本发明还提供了编码二十面体衣壳和重组肽的融合肽的核酸构建体，一个实施方案中，其可以是用于人和动物治疗的治疗肽。

本发明还提供了在假单胞菌细胞中生产重组肽的方法，提供了：编码重组肽和二十面体衣壳的融合肽的核酸；在假单胞菌细胞中表达核酸，其中细胞中的表达提供了将融合肽体内装配成病毒样颗粒；和分离病毒样颗粒。

I.重组假单胞菌细胞

本发明提供了包括核酸构建体的假单胞菌细胞，该构建体编码二十面体衣壳和重组肽的融合肽。细胞可用于生产重组肽的方法中。

病毒衣壳

一个实施方案中，本发明提供了用于肽生产方法中的假单胞菌细胞，通过表达融合二十面体病毒衣壳的肽。表达通常在细胞中形成至少一个病毒样颗粒(VLP)。

可以将病毒归类于具有螺旋状对称或二十面体对称的那些。通常已知的衣壳形态包括：二十面体(包括正常的、等角的，准等角的和成对的或“孪生的”二十面体)，多面体(包括球形，卵形和柠檬形)，杆状(包括棒状或子弹形，和纺锤形或雪茄形)和螺旋(包括杆状、柱状和丝状)；其中任何一种可以具尾和/或含有表面凸出，如穗或鼓起。

形态学

本发明的一个实施方案中，衣壳的氨基酸序列选自归类为具有任何二十面体形态的病毒衣壳。一个实施方案中，衣壳氨基酸序列选自正常的二十面体病毒的衣壳。另一个实施方案中，衣壳氨基酸序列选自二十面体病毒的衣壳。一特定实施方案中，衣壳氨基酸序列选自二十面体植物病毒的衣壳。然而，另一个实施方案中，病毒衣壳源自不感染植物的二十面体病毒。例如，一个实施方案中，病毒是感染哺乳动物的病毒。

通常，二十面体病毒的病毒衣壳由排列成二十面体(立方体)对称的多个蛋白质亚基构成。例如，天然二十面体衣壳可以由形成衣壳每个三角面的3个亚基建成，获得形成完整衣壳的60个亚基。这种小病毒结构的代表是例如噬菌体X174。许多二十面体病毒衣壳含有多于60个亚基。许多二十面体病毒衣壳含有反平行，八链β桶形折叠基序。基序具有楔形嵌段，一侧四个β链(称为BIDG)，和另一侧四个(称为CHEF)。还存在两个保守的α螺旋(称为A和B)，一个在βC和βD之间，另一个在βE和βF之间。

包膜病毒可以从感染的细胞中出来而颗粒通过膜的挤压(出芽)没有将其完全破坏，在该过程中颗粒变成包覆于源自细胞膜的脂质膜中(参见，例如AJ Cann(编辑)(2001)Principles of Molecular Virology(Academic Press)；A Granoff和RG Webster(编辑)(1999)Encyclopedia of Virology(Academic Press)；DLD Caspar(1980)Biophys.J.32：103；DLD Caspar和A Klug(1962)Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.27：1；J Grimes等(1988)Nature 395：470；JE Johnson(1996)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 93：27；和J Johnson和J Speir(1997)J.Mol.Biol.269：665)。

病毒

病毒分类学公认以下的衣壳化颗粒实体分类群：

·I类病毒，即dsDNA病毒；

·II类病毒，即ssDNA病毒；

·III类病毒，即dsRNA病毒；

·IV类病毒，即ssRNA(+)-链病毒，没有DNA阶段；

·V类病毒，即ssRNA(-)-链病毒；

·VI类病毒，即RNA类逆转录病毒，是ssRNA逆转录病毒；

·VII类病毒，即DNA类逆转录病毒，是dsDNA逆转录病毒；

·δ病毒；

·类病毒；和

·卫星噬菌体和卫星病毒，卫星核酸和朊病毒除外

这些分类群的成员是本领域技术人员公知的，并综述于H.V.Van Regenmortel等(编辑)，病毒分类学：病毒分类学国际会议的第七次报告(Virus Taxonomy：Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of viruses)(2000)(Academic Press/Elsevier，Burlington Mass.，USA)；University of Leicester(UK)Microbiology &Immunology Department的病毒分类学网页http://wwwmicro.msb.le.ac.uk/3035/Virusgroups.html；和美国健康和公共事业部门(Washington，D.C.，USA)的国家医药实验室的国家生物技术信息中心(NCBI)的分类学浏览器的在线“病毒”和“类病毒”部分http://www.ncbi.nlm.nlh.gov/Taxonomy/tax.html。

衣壳的氨基酸序列可以选自这些分类群中任一种中任何成员的衣壳。这些分类群成员的衣壳氨基酸序列可以从以下来源获得，包括，但不限于，例如：通过NCBI在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi提供的PubMed研究机构的在线“核苷酸”(Genbank)，“蛋白质”和“结构”部分。

一个实施方案中，衣壳氨基酸序列选自对以下至少一个宿主特异性的分类群成员：包括酵母的真菌，植物，藻类包括的原生生物，无脊椎动物，脊椎动物和人。一个实施方案中，衣壳氨基酸序列选自以下分类群任一种的成员：I类、II类、III类、IV类、V类、VI类、VII类、类病毒和卫星病毒。一个实施方案中，衣壳氨基酸序列选自这七种分类群中对上述六种宿主中至少一种特异性的任一种成员。更特别的实施方案中，衣壳氨基酸序列选自II类、III类、IV类、VII类和卫星病毒中任一种的成员；或II类、IV类、VII类和卫星病毒中的任一种。另一个实施方案中，病毒衣壳选自IV类或VII类。

病毒衣壳序列可以源自对细胞非向性的病毒。一个实施方案中，除所需二十面体衣壳以外，细胞不包括来自特定选择病毒的病毒蛋白质。一个实施方案中，病毒衣壳源自对细胞以外的不同科生物体具有向性的病毒。另一个实施方案中，病毒衣壳源自对细胞以外的不同属生物体具有向性的病毒。另一个实施方案中，病毒衣壳源自对细胞以外的不同种生物体具有向性的病毒。

特定实施方案中，病毒衣壳选自IV类病毒。

一个实施方案中，病毒衣壳选自二十面体病毒。二十面体病毒选自乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)，全病毒科(Totiviridae)，二順反子病毒科(Dicistroviridae)，嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，披膜病毒科(Togaviridiae)，多瘤病毒科(Polyomaviridiae)，野田村病毒科(Nodaviridae)，复层噬菌体科(Tectiviridae)，光滑病毒科科(Leviviridae)，微小病毒科(Microviridae)，Sipoviridae，野田村病毒科，细小核糖核酸病毒科(Picornoviridae)，细小病毒科(Parvoviridae)，Calciviridae，四病毒科(Tetraviridae)和卫星病毒中任一种的成员。

特定实施方案中，序列选自对至少一种植物宿主特异性的分类群中任一种的成员。一个实施方案中，二十面体植物病毒种是植物感染病毒种，是或是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，呼肠孤病毒科(Reoviridae)，棒状病毒(Rhabdoviridae)，黄矮病毒(Luteoviridae)，矮化病毒科(Nanoviridae)，分病毒科(Partitiviridae)，随伴病毒科(伴生病毒科)Sequiviridae，芜菁黄花叶病毒(Tymoviridae)，欧尔密病毒(科)属(Ourmiavirus)，烟草坏死病毒卫星，Caulimoviridae，花椰菜花叶病毒科(Geminiviridae)，豇豆花叶病毒科(Comoviridae)，南方菜豆花叶病毒科(Sobemovirus)，番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)或雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)分类群中任一种的成员。一个实施方案中，二十面体植物病毒种是植物感染病毒种，是或是黄矮病毒科(Luteoviridae)，矮化病毒科(Nanoviridae)，分病毒科(Partitiviridae)，随伴病毒科(伴生病毒科)Sequiviridae，芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)，欧尔密病毒(科)属(Ourmiavirus)，烟草坏死病毒卫星，Caulimoviridae，花椰菜花叶病毒科(Geminiviridae)，豇豆花叶病毒科(Comoviridae)，南方菜豆花叶病毒科(Sobemovirus)，番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)或雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)分类群中任一种的成员。特定实施方案中，二十面体植物病毒种是植物感染病毒，是或是Caulimoviridae，花椰菜花叶病毒科(Geminiviridae)，豇豆花叶病毒科(Comoviridae)，南方菜豆花叶病毒科(Sobemovirus)，番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)或雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)任一种的成员。更特别的实施方案中，二十面体植物病毒是植物感染病毒种，是或是豇豆花叶病毒科(Comoviridae)，南方菜豆花叶病毒科(Sobemovirus)，番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)或雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)任一种的成员。更特别的实施方案中，二十面体植物病毒种是植物感染病毒种，是或是豇豆花叶病毒科(Comoviridae)或雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)科的成员。特定实施方案中，病毒衣壳源自豇豆花叶病毒或豇豆退绿斑驳病毒。另一个实施方案中，病毒衣壳源自雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)分类群的种。特定实施方案中，衣壳源自等轴不稳定环斑病毒属(Ilarvirus)或Alafamovirus。更特别的实施方案中，衣壳源自烟草条纹病毒或苜蓿花叶病毒(AMV)(包括AMV1或AMV2)。

VLP

本发明的二十面体病毒衣壳在所述宿主细胞中是非感染性的。一个实施方案中，在病毒衣壳表达过程之中或之后在宿主细胞中形成病毒样颗粒(VLP)或笼形结构。一个实施方案中，VLP或笼形结构还包括目标肽，特定实施方案中，在VLP表面上表达目标肽。表达系统通常不包含另外的使病毒具有传染性的病毒蛋白质。典型的实施方案中，表达系统包括宿主细胞和编码一个或多个病毒衣壳的载体和可操作连接的目标肽。载体通常不包括另外的病毒装配蛋白质。本发明源自发现：病毒衣壳在特定宿主细胞中形成更大程度并可以更有效地收集重组肽。

一个实施方案中，VLP或笼形结构是多嵌合(multimeric)装配的衣壳，包括3至约200个衣壳。一个实施方案中，VLP或笼形结构包括至少30，至少50，至少60，至少90或至少120个衣壳。另一个实施方案中，每个VLP或笼形结构包括至少150个衣壳，至少160，至少170或至少180个衣壳。

一个实施方案中，VLP表达为二十面体结构。另一个实施方案中，VLP表达为与产生衣壳序列的天然病毒相同的几何结构。然而，分开的实施方案中，VLP不具有天然病毒的相同几何结构。特定实施方案中，例如，结构以多个衣壳形成的颗粒产生但不形成天然型VLP。例如，可以形成少如3个病毒衣壳的笼形结构。分开的实施方案中，形成约6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57或60个衣壳的笼形结构。

一个实施方案中，至少一个衣壳包括至少一个目标肽。一个实施方案中，肽在VLP的至少一个内部环中表达，或在至少一个外表面环中表达。

可以修饰病毒衣壳的多于一个环。一特定实施方案中，在二十面体病毒样颗粒的至少两个表面环上表达重组肽。另一个实施方案中，将至少两个不同肽插入病毒衣壳、笼形或病毒样颗粒的至少两个表面环中。另一个实施方案中，将至少三个重组肽插入病毒样颗粒的至少三个表面环中。表面环中的重组肽可以具有相同的氨基酸序列。分开的实施方案中，表面环中重组肽的氨基酸序列是不同的。

特定实施方案中，可以修饰宿主细胞来提高VLP的装配。例如，可以修饰宿主细胞来包括伴侣蛋白质，来促进VLP从表达的病毒衣壳的形成。另一个实施方案中，将宿主细胞修饰来包括阻遏蛋白来更有效地调控衣壳的表达来促进VLPs的调控形成。

编码病毒衣壳或蛋白质的核酸序列还可以另外修饰来改变VLPs的形成(参见，例如，Brumfield等，(2004)J.Gen.Virol.85：1089-1053)。例如，最常见产生三个大类的修饰来改变VLP表达和装配。设计这些修饰来改变装配的蛋白质笼中的内部、外部或连接亚基之间的接触面。为此，诱变引物可以用来：(i)改变病毒核酸结合片段的内表面电荷，通过酸性谷氨酸替代N端的碱基(例如，K，R)(Douglas等，2002b)；(ii)从N端删除内部残基(CCMV中，通常为残基4-37)；(iii)将编码11个氨基酸肽的细胞靶向序列的cDNA(Graf等，1987)插入表面暴露的环中；和(iv)通过改变金属结合位点来改变病毒亚基之间的相互作用(CCMV中，残基81/148突变)。

重组肽

大小

一个实施方案中，可操作地连接病毒衣壳序列的肽包含至少两个氨基酸的。另一个实施方案中，肽是至少三个，至少四个，至少五个或至少六个氨基酸长。分开的实施方案中，肽是至少七个氨基酸长。肽还可以是至少八个，至少九个，至少十个，至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、45、50、60、65、75、85、95、96、99或更多氨基酸长。一个实施方案中，编码的肽至少为25kD。

一个实施方案中，肽通常含有2至约300个氨基酸，或约5至约250个氨基酸，或约5至约200个氨基酸，或约5至约150个氨基酸，或约5至约100个氨基酸。另一个实施方案中，肽含有约10至约140个氨基酸，或约10至约120个氨基酸，或约10至约100个氨基酸。

一个实施方案中，可操作地连接病毒衣壳序列的肽或蛋白质含有约500个氨基酸。一个实施方案中，肽含有少于500个氨基酸。另一个实施方案中，肽含有达约300个氨基酸，或达约250，或达约200，或达约180，或达约160，或达约150，或达约140，或达约120，或达约110，或达约100，或达约90，或达约80，或达约70，或达约60，或达约50，或达约40或达约30个氨基酸。

一个实施方案中，融合二十面体衣壳的重组肽为至少7，至少8，至少9，至少10，至少12，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，至少40，至少45，至少50，至少55，至少60，至少65，至少75，至少85，至少95，至少99，或至少100个氨基酸。

本发明的一个实施方案中，重组肽含有所需目标肽的至少一个单体。可替换的实施方案中，重组肽含有所需目标肽的多于一个单体。特定实施方案中，肽由至少2，至少5，至少10，至少15或至少20个分开的单体构成，作为连环肽可操作地连接衣壳。另一个实施方案中，连环肽中的单个单体通过可分裂连接物片段连接。再一个实施方案中，将重组肽插入二十面体病毒样颗粒的至少一个表面环中。一个实施方案中，将至少一个单体插入病毒样颗粒的表面环中。

分类

融合病毒衣壳的目标肽可以是不是源自病毒的异种蛋白质，并任意地不是源自和细胞相同的物种。

融合病毒衣壳的目标肽可以是功能肽；结构肽；抗原肽，毒性肽，抗微生物肽，其片段；其前体；前述任意的组合；和/或前述任一种的多联体。本发明的一个实施方案中，重组肽是用于人和动物治疗的治疗肽。

功能肽包括，但不限于，例如：生物活性肽(即，发挥、引发或另外导致生物实体例如生物体、细胞、培养物、组织、器官或细胞器之中或其生物功能或活性的启动、提高、延长、衰减、终止或防止的肽，)；催化肽；微结构-和纳结构-活性肽(即，形成工程化微-或纳-结构一部分的肽，其中或与其结合进行活动，例如，移动，能量转化)；和刺激肽(例如，肽调味品、色素、加臭剂、信息素、引诱剂、制止物和防护剂)。

生物活性肽包括，但不限于，例如：免疫活性肽(例如，抗原肽，过敏原肽，肽免疫调控剂，肽免疫调节剂)；信号和信号转化肽(例如，肽激素，细胞因子，和神经递质；受体；激动剂和拮抗剂肽；靶向肽和分泌信号肽)；和生物抑制肽(例如，毒性、杀菌或生物静止的肽，如肽毒素和抗微生物肽)。

结构肽包括，但不限于，例如：肽适配子(aptamers)；折叠肽(例如，促进或诱导另一分子中物理构象形成或保持的肽)；粘着-促进肽(例如，粘着肽，细胞-粘着-促进肽)；界面肽(例如，肽表面活性剂和乳化剂)；微结构和纳结构-结构肽(例如，形成工程化微-或纳-结构一部分的结构肽)；和激活前肽(例如，前、原的前导肽和前-、原-蛋白质和肽；内切肽(inteins))。

催化肽包括，例如，apo B RNA-编辑胞嘧啶脱氨基酶肽；谷氨酰胺酰基tRNA合成酶的催化肽；天冬氨酸转氨甲酰酶的催化肽；植物1型核糖体-灭活肽；病毒催化肽如，例如，口蹄疫病毒[FMDV-2A]催化肽；基质金属蛋白酶肽；和催化的金属寡肽。

肽还可以是肽抗原决定部位，半抗原，或相关的肽(例如，抗原病毒肽；病毒相关的肽，例如，HIV相关的肽，肝炎相关的肽；抗体独特型结构域；细胞表面肽；抗原性的人、动物、原生生物、植物、真菌、细菌和/或古(archaeal)肽；过敏原肽和过敏原脱敏肽)。

肽还可以是肽免疫调控剂或免疫调节剂(例如，干扰素，白细胞间介素，肽免疫抑制剂和免疫增效剂)；抗体肽(例如，单链抗体；单链抗体片段和构建体，例如，单链Fv分子；抗体轻链分子，抗体重链分子，结构域缺失的抗体轻链或重链分子；单链抗体结构域和分子，例如CH1、CH1-3、CH3、CH1-4、CH4、VHCH1、CL、CDR1或FRI-CDR1-FR2结构域；抗原互补肽(paratopic peptide)；微抗体)；另一种结合肽(例如，肽适配子，胞内和细胞表面受体蛋白，受体片段；抗肿瘤坏死因子肽)。

肽还可以是酶底物肽或酶抑制剂肽(例如，caspase底物和抑制剂，蛋白激酶底物和抑制剂，荧光-共振-能量转移-肽酶底物)。

肽还可以是细胞表面受体肽配体，激动剂和拮抗剂(例如，蛙皮素(caeruleins)，强啡肽(dynorphins)，orexin，垂体腺苷酸环化酶激活肽，肿瘤坏死因子肽；合成的肽配体，激动剂和结抗剂)；肽激素(例如，内分泌、副分泌和自分泌激素，包括，例如：糊精(amylins)，血管紧张素，舒缓激肽，降钙素，兴奋心脏的神经肽，类吗啡因子(casomorphin)，肠促胰酶肽，促肾上腺皮质激素和促肾上腺皮质激素相关的肽，分化因子，内啡肽，内皮缩血管肽，脑啡肽，促红细胞生成素，促胰岛素分泌肽(exendin)，卵泡刺激激素，促生长激素神经肽(galanins)，胃泌素，胰高血糖素和胰高血糖素样肽，促性腺激素，生长激素和生长因子，胰岛素，胰激肽，激肽，瘦素(leptin)，防治脂肪肝的激素，促黄体素激素，黑素细胞刺激激素，褪黑激素，促尿钠排泄的肽，神经激肽，神经调节肽，nociceptin，骨钙素，缩宫素(即，催产素(ocytocins))，甲状旁腺激素，pleiotrophin，促乳素，松弛素，分泌素，血清素，诱导睡眠的肽，生长调节素，促胸腺生成素，甲状腺刺激激素，促甲状腺激素，尿压素(urotensins)，血管活性的肠肽，血管加压素)；肽细胞因子，趋化因子，病毒因子和病毒编码受体(viroceptor)激素释放和释放抑制肽(例如，促肾上腺皮质激素释放激素，cortistatin，卵泡刺激激素释放因子，胃抑制肽，胃泌素释放肽，促性腺激素释放激素，生长激素释放激素，促黄体素激素释放激素，促黑细胞激素释放激素，促黑激素释放抑制因子；nocistatin，胰抑制素，促乳素释放肽，促乳素释放抑制因子；生长抑制素；促甲状腺激素释放激素)；肽神经递质或通道阻断剂(例如，韩蛙皮素(bombesins)，神经肽Y，神经降压素(neurotensins)，物质P)，肽毒素，毒素前体肽，或毒素肽部分。特定实施方案中，肽毒素不含有D-氨基酸。毒素前体肽可以是不含有D-氨基酸和/和没有通过翻译后修饰转化成天然毒素结构的那些，如，例如，通过能够将D-构象引入氨基酸中的的D构象诱导剂的作用，(例如，肽异构酶，或表异构酶或消旋酶或转氨酶)，和/或通过能够形成环状肽结构的环化剂(例如，肽硫代酯酶，或肽连接酶如反-剪接蛋白质或内切肽)的作用。

毒素肽部分可以是含肽毒素的线性的或前环化的寡和多肽部分。肽毒素的实例包括，例如agatoxin，鹅膏毒素，卡律蝎毒素(charybdotoxins)，氯毒素，芋螺毒素(conotoxins)，树眼镜蛇毒素(dendrotoxins)，insectotoxin，玛格毒素(margatoxins)，肥大细胞去粒肽，皂草素，角蝰毒素(sarafotoxins)，和细胞外毒素，如，例如，炭疽毒素，肉毒杆菌毒素，白喉毒素和破伤风毒素。

肽还可以是代谢和消化相关的肽(例如，胆囊收缩素-肠促胰酶素肽，肽yy，胰腺肽，胃肠动素(motilins))；细胞粘着调节或介导肽，细胞基质肽(例如，附着因子，选择蛋白，层粘连蛋白(laminins))；神经保护剂或髓鞘生成-促进肽；聚集抑制肽(例如，细胞或血小板凝集抑制肽，淀粉状蛋白形成或沉积抑制肽)；连接肽(例如，心血管连接神经肽，免疫球蛋白A连接肽)；或其他的肽(例如，刺豚鼠相关的肽，淀粉状蛋白质肽，骨相关的肽，细胞渗透性肽，conantokin，contryphan，contulakin，髓磷脂碱性蛋白和其他的)。

特定实施方案中，目标肽对选定的病毒衣壳是外源的。肽可以是天然或合成序列的(及其编码序列可以是天然的或合成的核苷酸序列)。因此，例如，包括天然，修饰的天然的和全部人造的氨基酸序列。编码这些氨基酸序列的核酸分子序列同样可以是天然的、修饰的天然的或全部人造的核酸序列，并可以是例如一个或多个用来获得核酸分子合理或随机突变和/或重组和/或合成和/或选择方法(即，通过人作用的)的结果。

编码序列可以是目标肽的天然编码序列，如果可获得，但更常见的是已经选择、改进或最佳化的编码序列用于选定的表达宿主细胞中：例如，通过合成基因来反映宿主物种的密码子使用偏好。本发明的一个实施方案中，宿主物种是荧光假单胞菌，当设计信号序列和肽序列时考虑荧光假单胞菌的密码子偏好。

抗原肽(肽抗原决定部位)

一个实施方案中，通过病毒衣壳的表达来产生抗原肽。抗原肽可以选自人或动物病原体的抗原肽的那些，病原体包括传染剂，寄生物，癌细胞和其他病原体。这样的病原体还包括那些物质的毒力因子和病原因子，例如，外毒素，内毒素等。病原体可以呈现任何水平的毒力，即，它们可以是例如，剧毒，无毒，假剧毒，半剧毒等。一个实施方案中，抗原肽将含有病原体的抗原决定部位氨基酸序列。一个实施方案中，抗原决定部位序列包括至少一种这样物质的至少部分的表面肽。一个实施方案中，衣壳-重组肽病毒样颗粒可以用作人或动物应用中的疫苗。

可以选择多于一种的抗原肽，该情况中所得到的病毒样颗粒可以具有多个不同的抗原肽。多抗原肽形式的特定实施方案中，各种抗原肽全部选自相同病原体的多个抗原决定部位。多抗原肽形式的特定实施方案中，选定的各种抗原决定部位选自多个密切相关的病原体，例如，相同属的相同种或不同种的不同菌株，亚种，生物变种，致病变种(pathovars)，血清变种(serovars)或基因变种(genovars)。

一个实施方案中，病原体属于至少以下的一类：细菌和支原体病原体，包括，但不限于：芽孢杆菌属(Bacillus spp.)，例如，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；巴尔通氏体属(Bartonella spp.)，例如，五日热巴尔通氏体(B.quintana)；布鲁氏菌属(Brucella spp.)；伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia spp.)，例如，类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei)；弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)；梭菌属(Clostridium spp.)，例如破伤风梭菌(C.tetani)，肉毒梭菌(C.botulinum)；考克斯氏体属(Coxiella spp.)，例如，伯氏考克斯氏体(C.burnetii)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)，例如迟钝爱德华氏菌(E.tarda spp.)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如，阴沟肠杆菌(E.cloacae)；肠球菌属(Enterococcus spp.)，例如，粪肠球菌(E.faecalis)，屎肠球菌(E.faecium)；埃希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠埃希氏菌(E.coli spp.)；弗朗西丝氏菌属(Francisella spp.)，例如，土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)；嗜血菌属(Haemophilus spp.)，例如，流感嗜血菌(H.influenzae)；克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)，例如，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；军团菌属(Legionella)；利斯特氏菌属(Listeris spp.)，例如，单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；脑膜炎双球菌和淋球菌，例如，奈瑟氏球菌属(Neisseria spp.)；莫拉氏菌属(Moraxella spp.)；分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)，例如，麻风分枝杆菌(M.leprae)，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)；肺炎球菌，例如，肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae spp.)；假单胞菌属(Pseudomonas spp.)，例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；立克次氏体属(Rickettsia spp.)，例如，普氏立克次氏体(R.prowazekii)，立氏立克次氏体(R.Rickettsii)，斑疹伤寒立克次氏体(R.Typhi)；沙门氏菌属(Salmonella spp.)，例如，伤寒沙门氏菌(S.typhi)；葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)，例如，金黄色葡萄球菌(S.Aureus)；链球菌属(Streptococcusspp.)，包括A类链球菌和溶血链球菌，例如，肺炎链球菌(S.pneumoniae)，酿脓链球菌(S.Pyogenes)；链霉菌属(Streptomyces spp.)；志贺氏菌属(Shigella spp.)；弧菌属(Vibrio spp.)，例如，霍乱弧菌(V.Cholerae)和耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)，例如，鼠疫耶尔森氏菌(Y.Pestis)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.Enterocolitica)。真菌和酵母病原体，包括，但不限于，链格孢属(Alternaria spp.)；曲霉属(Aspergillusspp.)；芽生菌属(Blastomyces spp.)，例如，B.dermatiditis；假丝酵母属(Candidaspp.)，例如，白色假丝酵母(C.albicans)；枝孢菌属(Cladosporium spp.)；球孢子菌属(Coccidiodes spp.)，例如，C.immitis；隐球酵母菌属(Cryptococcus spp.)，例如，C.neoformans；组织胞浆菌属(Histoplasma spp.)，例如，H.Capsulatum和孢子丝菌属(Sporotlirix spp.)，例如S.Schenckii。

一个实施方案中，病原体来自原生生物病原体，包括，但不限于，变形虫，包括，Acanthamoeba属，变形虫属(Amoeba spp.)，Naegleria属，肠阿米巴属(Entamoeba spp.)，例如E.Histoltica；Cryptosporidium spp.属，例如，C.parvum；Cyclospora属，脑胞内原虫属(Encephalitozoon spp.)，例如E.intestinalis；Enterocytozoon属；贾第鞭毛虫属(Giardia spp.)，例如，G.Lamblia；等孢球虫属(Isospora spp.)；Microsporidium属；疟原虫属(Plasmodium spp.)，例如P.falciparum，P.malariae，P.ovale，P.vivax；弓型属(Toxoplasma spp.)例如，T.Gondii；和锥体虫属(Trypanosoma spp.)，例如T.brucei。

一个实施方案中，病原体来自寄生的病原体(例如，蠕虫寄生物)，包括，但不限于，蛔虫属(Ascaris spp.)，例如，A.lumbricoides；龙线属(Dracunculus spp.)，例如，D.medinensis；盘尾属(Onchocerca spp.)，例如，肠扭转盘尾丝虫(O.Volvulus)；血吸虫属(Schistosomaspp.)；旋毛虫属(Trichinella spp.)，例如，腋索旋毛虫(T.Spiralis spp.)和Trichuris属，例如，T.trichiura。

另一个实施方案中，病原体来自病毒病原体，包括，但不限于，腺病毒；嵌沙样病毒，例如，拉沙热病毒，星状病毒(Astroviruses)；本杨病毒(Bunyaviruses)，例如，汉坦病毒(Hantaviruses)，立夫特山谷热病毒(Rift Valley Fever viruses)；冠状病毒，三角病毒(Deltaviruses)；细胞肥大病毒(Cytomegaloviruses)，EB病毒，疱疹病毒，水痘病毒；线状病毒(Filoviruses)，例如，埃博拉病毒，马尔堡病毒；黄病毒(Flaviruses)，例如，登革热病毒，西尼罗热病毒，黄热病毒；肝炎病毒；流感病毒；慢病毒(Lentiviruses)，T-细胞淋巴病毒，其他白血病病毒；诺沃克病毒；乳头状瘤病毒(Papillomaviruses)，其他肿瘤病毒；副粘病毒，例如，麻疹病毒，腮腺炎病毒(Mumps viruses)，副流感病毒，肺病毒(Pneumoviruses)，仙台病毒；细小病毒；细小核糖核酸病毒，例如，心病毒(Cardioviruses)，柯萨奇病毒，艾柯病毒，脊髓灰质炎病毒，伤风病毒(Rhinoviruses)，其他肠病毒；痘病毒，例如，天花病毒，牛痘病毒，副痘病毒(Parapoxviruses)；呼肠孤病毒，例如，coltivirus，环状病毒，轮状病毒，棒状病毒，例如，狂犬病病毒(Lyssaviruses)，水疱性口炎病毒；和外衣病毒，例如，风疹病毒，SIN病毒(Sindbis viruses)，东方马脑炎病毒。

一特定实施方案中，抗原肽选自犬细小病毒肽、炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)抗原肽和东方马脑炎病毒抗原肽。特定实施方案中，抗原肽是具有SEQ ID NO：7氨基酸序列的犬细小病毒衍生的肽。另一特定实施方案中，抗原肽是具有SEQ.ID.NO：9、11、13或15任一氨基酸序列的炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)抗原肽。再一特定实施方案中，抗原肽是具有SEQ.ID.NO：25或27之一的氨基酸序列的东方马脑炎病毒抗原肽。

宿主细胞毒性肽

另一特定实施方案中，重组肽是游离形式时对宿主细胞毒性的肽。更特别的实施方案中，毒性肽是抗微生物肽。

特定实施方案中，结合病毒衣壳表达的目标肽是宿主细胞毒性肽。特定实施方案中，这种蛋白质是抗微生物肽。宿主细胞毒性肽表示对表达其的宿主，或对细胞培养物中的其他细胞或宿主细胞为成员的生物体的，或对提供宿主细胞生物体或物种的细胞，是生物静止的，杀生物的，毒性的生物抑制肽。一个实施方案中，宿主细胞毒性肽是对表达其的宿主细胞生物静止的，杀生物的，毒性的生物抑制肽。宿主毒性肽的一些实例包括，但不限于：肽毒素，抗微生物肽和其他抗菌肽。

抗微生物肽包括，例如，抗菌肽如，例如，爪蟾抗菌肽(magainins)，β防卫素(betadefensins)，一些α防卫素(defensins)；cathelicidin；histatin；抗真菌肽；抗原生动物肽；合成AMP；肽抗生素及其线性和预环化的寡和多肽部分；其他抗菌肽(例如，抗蠕虫肽，溶血肽，破坏瘤的肽(tumoricidal peptides))；和抗病毒肽(例如，一些α防卫素，杀病毒肽；抑制病毒感染的肽)。一特定实施方案中，抗微生物肽是具有SEQ ID NO：20氨基酸序列的D2A21肽。另一个实施方案中，抗微生物肽是具有基本上对应于SEQ ID NO：24氨基酸序列的抗微生物肽PBF20。

用于表达VLPs的细胞

本发明用作病毒衣壳或病毒衣壳融合肽表达宿主的细胞(也称为“宿主细胞”)是其中病毒衣壳不允许复制或感染细胞的细胞。一个实施方案中，病毒衣壳源自病毒不感染源自宿主细胞的细胞种的病毒。例如，一个实施方案中，病毒衣壳源自二十面体植物病毒并在细菌种的宿主细胞中表达。另一个实施方案中，病毒种感染哺乳动物且表达系统包括细菌宿主细胞。

一个实施方案中，宿主细胞是原核生物如细菌细胞，包括，但不限于，假单胞菌种。典型的细菌细胞，例如，描述于“生物多样性：细菌和古细菌”(“BiologicalDiversity：Bacterial and Archaeans”)，在线生物学书(On-Line Biology Book)中的一部分，由Estrella Mountain Community College，Arizona，USA的Dr MJ Farabee提供URL：

http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDiversity_2.html。特定实施方案中，宿主细胞是假单胞菌细胞，并通常是荧光假单胞菌细胞。

一个实施方案中，宿主细胞是任何真细菌种的成员。宿主可以是以下分类群中任一种的成员：酸杆菌(Acidobacteria)，放线菌(Actinobacteira)，Aquificae，拟杆菌(Bacteroidetes)，氯新生霉菌(Chlorobi)，衣原体(Chlamydiae)，Choroflexi，Chrysiogenetes，蓝藻菌(Cyanobacteria)，Deferribacteres，异常球菌属(Deinococcus)，网球菌属(Dictyoglomi)，成纤维菌(Fibrobacteres)，硬壁菌(Firmicutes)，融合菌(Fusobacteria)，Gemmatimonadetes，Lentisphaerae，硝孢菌(Nitrospirae)，浮游霉菌(Planctomycetes)，变形菌(Proteobacteria)，螺旋体(Spirochaetes)，耐热硫细菌(Thermodesulfobacteria)，耐热微生物(Thermodesulfobacteria)，耐热菌(Thermotogae)，栖热菌(Thermus(Thermales)，和疣状微生物(Verrucomicrobia)。真细菌宿主细胞的实施方案中，细胞是任何真细菌种的成员，蓝藻菌(Cyanobacteria)除外。

细菌宿主还可以是任何变形菌种(Proteobacterial)的成员。变形菌宿主细胞可以是以下分类群中任一种的成员：α变形菌(Alphaproteobacteria)，β变形菌(Betaproteobacteria)，γ变形菌(Gammaproteobacteria)，δ变形菌(Deltaproteobacteria)，ε变形菌(Epsilonproteobacteria)。此外，宿主是以下分类群中任一种的成员，α变形菌，β变形菌或γ变形菌，和任何γ变形菌种的成员。

γ变形菌宿主的一个实施方案中，宿主是以下分类群中任一种成员：气单胞菌(Aeromonadales)，Alteromofaadales，肠细菌(Enterobacteriales)，假单胞菌(Pseudomonadales)或黄单胞菌(Xanthomonadales)，或者肠细菌(Enterobacterium)或假单胞菌(Pseudomonadales)中任何种的一成员。一个实施方案中，宿主细胞是肠细菌目，宿主细胞是肠细菌科(family Enterobacteriaceae)的成员，或欧文氏菌属(Erwinia)，埃希氏菌属(Escherichia)或沙雷氏菌属(Serratia)中任一属的成员；或是埃希氏菌属的成员。假单胞菌目宿主细胞的一个实施方案中，宿主细胞是假单胞菌科的成员，甚至是假单胞菌属。γ变形菌宿主包括大肠杆菌种的成员和荧光假单胞菌种的成员。

还可以使用其他假单胞菌生物体。假单胞菌和密切相关的种包括革兰氏(-)变形菌亚群1，其包括属于描述为“革兰氏阴性需氧杆菌和球菌”的科和/或属的变形菌组，R.E.Buchanan和N.E.Gibbons(编辑)，Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology，pp.217-289(第8版，1974)(The Williams & Wilkins Co.，Baltimore，MD，USA)(下文中“Bergey(1974)”)。表1列出了这些生物体的科和属。

表1.部分示例的科和属，“革兰氏阴性需氧杆菌和球菌”(BERGEY(1974)

科I.假单胞菌科	葡萄糖酸菌(Gluconobacter)假单胞菌属黄单胞菌属菌胶团(Zoogloea)
		科II.固氮菌科	氮单胞菌属(Azomonas)固氮菌属(Azotobacter)拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)德克斯氏菌属(Derxia)
科III.根瘤菌科	土壤杆菌属(Agrobacterium)根瘤菌(Rhizobium)
		科IV.甲基单胞菌科	甲基球菌属(Methylococcus)甲基单胞菌属(Methylomonas)
科V.盐杆菌科	盐杆菌属(Halobacterium)盐球菌属(Halococcus)
		其他属	醋杆菌属(Acetobacter)产碱菌属(Alcaligenes)博德特氏菌属(Bordetella)布鲁氏菌属(Brucella)弗朗西丝氏菌属(Francisella)栖热菌属(Thermus)

“革兰氏(-)变形菌亚群1”还包括根据分类学中所用的标准归类于该标题下的变形菌。标题还包括之前归类于该部分但现在不再是的群，如食酸菌属(Acidovorax)，短波单胞菌属(Brevundimonas)，伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)，氢杆菌属(Hydrogenophaga)，海洋单胞菌属(Oceanimonas)，Ralstonia，和Stenotrophomonas，醇单胞菌属(Sphingomonas)和(芽生单胞菌属(Blastomonas)，源自其)，其通过将属于黄单胞菌属，酸单胞菌属(之前称为科)的生物体再分组形成，其通过将属于Bergey(1974)中所定义的醋杆菌(Acetobacter)属的生物体再分组形成。此外，宿主可以包括假单胞菌属的细胞，海洋假单胞菌(Pseudomonasenalia)(ATCC 14393)，生黑假单胞菌(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC19375)和腐败假单胞菌(Pseudomonas putrefaciens)(ATCC 8071)，其已经各自再次分类为河豚毒素交替单胞菌(Alteromonas haloplanktis)，产黑交替单胞菌(Alteromonas nigrifaciens)，和腐败交替单胞菌(Alteromonas putrefaciens)。相似地，例如，食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovotans)(ATCC 15668)和睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)(ATCC 11996)各自已经再次分类为食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovotans)和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)，和生黑假单胞菌(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375)和杀鱼假单胞菌(Pseudomonas piscicida)(ATCC 15057)各自已经再次分类为Psedoalteromonasnigrifaciens和Psedoalteromonas piscicida。“革兰氏(-)变形菌亚群1”还包括归类为属于以下任一科的变形菌：假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，固氮菌科(Azotobacteraceae)(现在经常称为同物异名假单胞菌科的“固氮菌群”(Azotobactergroup))，根瘤菌科(Rhizobiaceae)和甲基单胞菌科(Methylomonadaceae)(现在经常称为同物异名“甲基球菌科”(Methylococcaceae))。因此，除了另外在此所述的那些属，更多的变形菌属于“革兰氏(-)变形菌亚群1”包括：1)嗜氮根瘤菌(Azorhizophilus)属的固氮菌；2)假单胞菌科的纤维弧菌属(Cellvibrio)，Oligella和Teredinibacter属的细菌；3)根瘤菌科的Chelatobacter属，剑菌属(Ensifer)，Liberibacter属(也称为″Candidatus Liberibacter″)，和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的细菌；和4)甲基球菌科的甲基杆菌属(Methylobacter)，甲基暖菌属(Methylocaldum)，甲基微菌属(Methylomicrobium)，甲基八叠球菌属(Methylosarcina)和甲基球形菌属(Methylosphaera)属的细菌。

另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形菌亚群2”。“革兰氏(-)变形菌亚群2”定义为以下属的变形菌(括号中表示所列目录中公众可获得的保藏菌株的总数，所有保藏在ATCC，除非另外表示)：酸单胞菌(Acidomonas)(2)；醋菌(Acetobacter)(93)；葡糖杆菌(Gluconobacter)(37)；短波单胞菌(Brevundimonas)(23)；拜叶林克氏菌(Beijerinckia)(13)；德克斯氏菌(Derxia)(2)；布鲁氏菌(Brucella)(4)；土壤杆菌(Agrobacterium)(79)；Chelatobacter(2)；剑菌属(Ensifer)(3)；根瘤菌(Rhizobium)(144)；中华根瘤菌(Sinorhizobium)(24)；芽生单胞菌(Blastomonas)(1)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)(27)；产碱菌(Alcaligenes)(88)；博德特氏菌(Bordetella)(43)；伯克氏菌(Burkholderia)(73)；劳尔氏菌(Ralstonia)(33)；噬酸菌(Acidovorax)(20)；噬氢菌(Hydrogenophaga)(9)；动胶菌(Zoogloea)(9)；甲基杆菌属(Methylobacter)(2)；甲基暖菌属(Methylocaldum)(1在NCIMB)；甲基球菌属(Methylococcus)(2)；甲基微菌属(Methylomicrobium)(2)；甲基单胞菌属(Methylomonas)(9)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)(1)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌(Azomonas)(9)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)(5)；固氮菌(Azotobacter)(64)；纤维弧菌(Cellvibrio)(3)；Oligella(5)；假单胞杆菌(Pseudomonas)(1139)；弗兰西氏菌属(Francisella)(4)；黄单胞菌(Xanthomonas)(229)；寡养单胞菌(Stenotrophomonas)(50)；和海洋假单胞菌(Oceanimonas)(4)。

“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群2”中的典型的宿主细胞种类包括，但是不限于下面的细菌(在括号中显示的ATCC或者其它机构的典型菌株的保藏号)：甲醇酸单胞菌(Acidomonas methanolica)(ATCC 43581)；纹膜醋酸杆菌(Acetobacter aceti)(ATCC 15973)；Gluconobacter oxydans(ATCC 19357)；短波单胞菌(Brevundimonasdiminua)(ATCC 11568)；印度贝氏固氮菌(Beijerinckia indica)(ATCC 9039和ATCC 19361)；Derxia gummosa(ATCC 15994)；Brucella melitensis(ATCC 23456)，牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)(ATCC 23448)；根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(ATCC 23308)，放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)(ATCC19358)，发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)(ATCC 11325)；Chelatobacterheintzii(ATCC 29600)；Ensifer adhaerens(ATCC 33212)；根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)(ATCC 10004)；Sinorhizobium fredii(ATCC 35423)；Blastomonasnatatoria(ATCC 35951)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)(ATCC 29837)；粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)(ATCC 8750)；百日咳杆菌(Bordetella pertussis)(ATCC 9797)；洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)(ATCC 25416)；Ralstoniapickettii(ATCC 27511)；敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)(ATCC 11228)；氢噬胞菌(Hydrogenophaga flava)(ATCC 33667)；生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)(ATCC19544)；甲基细菌(Methylobacter luteus)(ATCC 49878)；Methylocaldumgracile(NCIMB 1912)；甲基球菌(Methylococcus capsulatus)(ATCC 19069)；Methylomicrobium agile(ATCC 35068)；甲烷甲基单胞菌(Methylononas methanica)(ATCC 35067)；Metthylosarcina fibrata(ATCC 700909)；Methylosphaerahansonii(ACAM 549)；氮单胞菌(Azomonas agilis)(ATCC 7494)；Azorhizophiluspaspali(ATCC 23833)；圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)(ATCC 9043)；对褐纤维弧菌(Cellvibrio mixtus)(UQM 2601)；尿道寡源杆菌(Oligella urethralis)(ATCC17960)；绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 10145)；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(ATCC 35858)；土拉热弗朗西丝菌(Francisellatularensis)(ATCC 6223)；嗜麦寡养食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC13637)；Xanthomonas campestris(ATCC 33913)；和Oceanimonas doudoroffii(ATCC27123)。另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群3”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群3”被定义为下面属中的变形杆菌的群：短波单胞菌属(Brevundimonas)；土壤杆菌属(Agrobacterium)；根瘤菌(Rhizobium)；中华根瘤菌(Sinorhizobium)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；产碱杆菌属(Alcaligenes)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstona)；酸单胞菌(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；甲基杆菌属(Methylobacter)；甲基暖菌属(Methylocaldum)；甲基球菌属(Methylococcus)；甲基微菌属(Methylomicrobium)；甲基单胞菌属(Methylomonas)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗兰西氏菌属(Francisella)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌属(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。

另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群4”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群4”被定义为下面属中的变形杆菌的组：短波单胞菌属(Brevundimonas)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；甲基杆菌属(Methylobacter)；甲基暖菌属(Methylocaldum)；甲基球菌属(Methylococcus)；甲基微菌属(Methylomicrobium)；甲基单胞菌属(Methylomonas)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗兰西氏菌属(Francisella)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。

一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群5”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群5”被定义为下面属中的变形杆菌的组：甲基杆菌属(Methylobacter)；甲基暖菌属(Methylocaldum)；甲基球菌属(Methylococcus)；甲基微菌属(Methylomicrobium)；甲基单胞菌属(Methylomonas)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗兰西氏菌属(Francisella)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。

宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群6”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群6”被定义为下面属中的变形杆菌的组：短波单胞菌属(Brevundimonas)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。

宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群7”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群7”被定义为下面属中的变形杆菌的组：氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。

宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群8”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群8”被定义为下面属中的变形杆菌的组：短波单胞菌属(Brevundimonas)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。

宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群9”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群9”被定义为下面属中的变形杆菌的组：短波单胞菌属(Brevundimonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。

宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群10”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群10”被定义为下面属中的变形杆菌的组：伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；和黄单胞菌(Xanthomonas)。

宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群11”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群11”被定义为下面属中的变形杆菌的组：假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；和黄单胞菌(Xanthomonas)。宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群12”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群12”被定义为下面属中的变形杆菌的组：伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；假单胞杆菌(Pseudomonas)宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群13”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群13”被定义为下面属中的变形杆菌的组：伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；假单胞杆菌(Pseudomonas)和黄单胞菌(Xanthomonas)。宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群14”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群14”被定义为下面属中的变形杆菌的组：假单胞杆菌(Pseudomonas)和黄单胞菌(Xanthomonas)。宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群15”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群15”被定义为假单胞杆菌(Pseudomonas)属中的变形杆菌的组。

宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群16”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群16”被定义为下面假单胞杆菌(Pseudomonas)种的变形杆菌的组(括号中显示的ATCC或其它机构中的典型菌株的保藏号)：Pseudomonas abietaniphila(ATCC700689)；绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 10145)；产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)(ATCC 14909)；Pseudomonas anguilliseptica(ATCC33660)；Pseudomonas citronellolis(ATCC 13674)；Pseudomonas flavescens(ATCC51555)；门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(ATCC 25411)；Pseudomonasnitroreducens(ATCC 33634)；解油极毛杆菌(Pseudomonas oleovorans)(ATCC8062)；假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(ATCC17440)；Pseudomonas resinovorans(ATCC 14235)；Pseudomonas straminea(ATCC33636)；蘑菇假单胞菌(Pseudomonas agarici)(ATCC 25941)；Pseudomonasalcalphila；Pseudomonas alginovora；Pseudomonas andersonii；Pseudomonasasplenii(ATCC 23835)；壬二酸假单胞菌(Pseudomonas azelaica)(ATCC 27162)；拜氏假单胞菌(Pseudomofaas beijerinckii)(ATCC 19372)；Pseudomonas borealis；北城假单胞菌(Pseudomonas boreopolis)(ATCC 33662)；Pseudomonas brassicacearum；食丁酸假单胞菌(Pseudomonas butanovora)(ATCC 43655)；Pseudomonas cellulosa(ATCC 55703)；枯黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)(ATCC 33663)；绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)(ATCC 9446，ATCC 13985，ATCC 17418，ATCC17461)；草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)(ATCC 4973)；隆德假单胞菌(Pseudomonas lundensis)(ATCC 49968)；腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)(ATCC 4683)；青紫葛假单胞菌(Pseudomonas cissicola)(ATCC 33616)；晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronfaciens)；Pseudomonas diterpeniphila；伸长假单胞菌(Pseudomonas elongate)(ATCC 10144)；弯曲假单胞菌(Pseudomonas flectens)(ATCC 12775)；氮芽孢杆菌(Pseudomonas azotoformans)；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；皱纹假单胞菌Pseudomonas corrugata(ATCC 29736)；Pseudomonas extremorientalis；Pseudomonas fluorescens(ATCC35858)；Pseudomonas gessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii(ATCC 700871)；边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)(ATCC 10844)；Pseudomonas migulae；霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)(ATCC 4685)；Pseudomonas orientais；Pseudomonas rhodesiae；类黄假单胞菌(Pseudomonassynxantha)(ATCC 9890)；托拉斯假单胞杆(Pseudomonas tolaasii)(ATCC 33618)；威隆气单胞菌(Pseudomonas veronii)(ATCC 700474)；Pseudomonasfrederiksbergensis；弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)(ATCC 19374)；Pseudomonas gingers；Pseudomonas graminis；Pseudomonas grimontii；Pseudomonashalodenitrificans；嗜盐假单胞菌；栖木槿假单胞菌(Pseudomonashalophila；Pseudornonas hibiscicola)(ATCC 19867)；哈特假单胞菌(Pseudomonashuttiensis)(ATCC 14670)；噬氢假单胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)；Pseudomonas jessenii(ATCC 700870)；Pseudomonas kilonensis；柳叶刀形假单胞菌Pseudomonas lanceolata(ATCC 14669)；Pseudomonas lini；划界假单胞菌Pseudomonas marginata(ATCC 25417)；臭味假单胞菌Pseudomonas mephitica(ATCC 33665)；脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)(ATCC 19244)；Pseudomonas pertucinogena(ATCC 190)；皮克特假单胞菌(Pseudomonaspictorum)(ATCC 23328)；Pseudomonas psychrophila；黄褐假单胞菌Pseudomonasfulva(ATCC 31418)；Pseudomonas monteilii(ATCC 700476)；Pseudomonas mosselii；栖稻假单胞菌Pseudomonas oryzihabitans(ATCC 43272)；Pseudomonasplecoglossicida(ATCC 700383)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(ATCC12633)；多刺假单胞菌Pseudomonas reactants；Pseudomonas spinosa(ATCC 14606)；巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)；浅黄假单胞菌Pseudomonas luteola(ATCC 43273)；斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)(ATCC 17588)；扁桃假单胞菌(Pseudomonas amygdali(ATCC 33614)；Pseudomonas avellanae(ATCC 700331)；番木瓜假单胞菌Pseudomonas caricapapayae(ATCC 33615)；菊苣假单孢菌(Pseudomonas cichorii)(ATCC 10857)；天仙果假单胞菌Pseudomonas ficuserectae(ATCC 35104)；褐鞘假单胞菌；苦楝假单胞菌Pseudomonasfuscovaginae；Pseudomonas meliae(ATCC 33050)；丁香假单胞菌(Pseudomonassyringe)(ATCC 19310)；绿黄假单胞菌Pseudoinoizas viridiflava(ATCC 13223)；热食碳酸假单胞菌Pseudomonas thermocarboxydovorans(ATCC 35961)；Pseudomonasthermotolerans；Pseudomonas thivervalensis；Pseudomonas vancouverensis(ATCC700688)；Pseudomonas wisconsinensis；和Pseudomonas xiamenensis。

宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形菌亚群17”。“革兰氏(-)变形菌亚群17”定义为本领域已知的“荧光假单胞菌”的单胞菌，例如包括属于以下假单胞菌种的那些：产碱假单胞菌；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；皱纹假单胞菌；Pseudomonas extremorienralis；荧光假单胞菌；Pseudomonas gessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii；边缘假单胞菌；Pseudomonasmigulae；霉味假单胞菌；Pseudomonas orientalis；Pseudomonas rhodesiae；类黄假单胞菌；托拉氏假单胞菌；Pseudomonas veronii。

该实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形菌亚群18”。“革兰氏(-)变形菌亚群18”定义为荧光假单胞菌种的所有亚种、变体、菌株和其他亚种单位，例如包括属于以下的那些(括号内所示的为实例菌株的ATCC或其他保藏编号)：荧光假单胞菌生物型A，也称为生物变种1或生物变种I(ATCC13525)；荧光假单胞菌生物型B，也称为生物变种2或生物变种II(ATCC17816)；荧光假单胞菌生物型C，也称为生物变种3或生物变种III(ATCC 17400)；荧光假单胞菌生物型F，也称为生物变种4或生物变种IV(ATCC 12983)；荧光假单胞菌生物型G，也称为生物变种5或生物变种V(ATCC 17518)；荧光假单胞菌生物变种VI；荧光假单胞菌Pf0-1；荧光假单胞菌Pf-5(ATCC BAA-477)；荧光假单胞菌SBW25；和荧光假单胞菌纤维素亚种(NCIMB 10462)。

宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形菌亚群19”。“革兰氏(-)单胞菌亚群19”定义为荧光假单胞菌生物型A的所有菌株。该生物型的特定菌株是荧光假单胞菌菌株MB101(参见，Wilcox的U.S.专利No.5,169,760)，及其衍生物。其衍生物的实例是荧光假单胞菌菌株MB214，通过将染色体asd(天冬氨酸脱氢酶基因)座插入MB101来构建的，天然大肠杆菌PlacI-lacI-lacZYA构建体(即，其中PlacZ是删除的)。

本发明中可使用的其他荧光假单胞菌菌株包括荧光假单胞菌Migula和荧光假单胞菌Loitokittok，具有以下的ATCC编号：[NCIB8286]；NRRL B-1244；NCIB8865菌株CO1；NCIB 8866菌株CO2；1291[ATCC 17458；IFO 15837；NCIB8917；LA；NRRL B-1864；吡咯烷；PW2[ICMP 3966；NCPPB 967；NRRLB-899]；13475；NCTC 10038；NRRL B-1603[6；IFO 15840]；52-1C；CCEB 488-A[BU140]；CCEB 553[IEM15/47]；IAM1008[AHH-27]；IAM 1055[AHH-23]；1[IFO15842]；12[ATCC 25323；NIH 11；den Dooren de Jong 216]；18[IFO15833；WRRL P-7]；93[TR-10]；108[52-22；IFO 15832]；143[IFO 15836；PL]；149[2-40-40；IFO15838]；182[IFO 3081；PJ 73]；184[IFO 15830]；185[W2L-1]；186[IFO 15829；PJ 79]；187[NCPPB263]；188[NCPPB 316]；189[PJ227；1208]；191[IFO 15834；PJ236；22/1]；194[Klinge R-60；PJ 253]；196[PJ 288]；197[PJ 290]；198[PJ 302]；201[PJ368]；202[PJ 372]；203[PJ 376]；204[IFO 15835；PJ682]；205[PJ 686]；206[PJ692]；207[PJ 693]；208[PJ722]；212[PJ 832]；215[PJ 849]；216[PJ 885]；267[B-9]；271[B-1612]；401[C71A；IFO 15831；PJ187]；NRRLB-3178[4；IFO15841]；KY8521；3081；30-21；[IFO 3081]；N；PYR；PW；D946-B83[BU 2183；FERM-P 3328]；P-2563[FERM-P 2894；IFO 13658]；IAM-1126[43F]；M-1；A506[A5-06]；A505[A5-05-1]；A526[A5-26]；B69；72；NRRL B-4290；PMW6[NCIB 11615]；SC12936；A1[1F0 15839]；F 1847[CDC-EB]；F1848[CDC 93]；NCIB 10586；P17；F-12；AmMS 257；PRA25；6133D02；6519E01；N1；SC15208；BNL-WVC；NCTC2583[NCIB8194]；H13；1013[ATCC 11251；CCEB 295]；IFO 3903；1062；或Pf-5。

II.核酸构建体

本发明进一步提供核酸构建体，该构建体编码二十面体衣壳和重组肽的融合肽。一个实施方案中，提供了用于转化假单胞菌宿主细胞的核酸构建体，包括a)编码重组肽的核酸，和b)编码二十面体衣壳的核酸序列，其中在细胞中表达时，a)的核酸和b)的核酸可操作地连接成融合蛋白。

特定实施方案中，载体包括多个衣壳的序列，或多个目标肽的序列。一个实施方案中，载体包括至少两个不同的衣壳-肽编码序列。一个实施方案中，将编码序列连接相同的启动子。特定实施方案中，通过内部核糖体结合位点来分隔编码序列。其他实施方案中，通过连接物序列来连接编码序列使得在细胞中形成病毒样颗粒。另一个实施方案中，将编码序列连接不同的启动子。可以通过相同的诱导条件来启动这些启动子。另一个实施方案中，提供了编码不同衣壳-肽组合物的多个载体。多个载体包括通过相同诱导条件或通过不同诱导条件启动的启动子。一个实施方案中，启动子是lac启动子，或lac启动子的衍生物如tac启动子。

可以将目标肽的编码序列插入病毒衣壳或衣壳编码序列的预定位点中。还可以将肽插入非预定位点并筛选用于VLPs生产的细胞。一个实施方案中，将肽插入衣壳编码序列中以致在VLP形成过程中表达为环。一个实施方案中，载体中包括一个肽编码序列，然而其他实施方案中，包括多个序列。多个序列可以是多联体的形式，例如通过可分裂连接物序列连接的多联体。

可以在衣壳的多于一个插入位点中插入肽。因此，可以将肽插入衣壳多于一个的表面环基序中；肽还可以插入给定环基序中的多个位点。插入片段的单个功能和/或结构肽，和/或完整的肽插入片段，可以通过分裂位点来分隔，即，分裂或水解蛋白的试剂作用来从衣壳结构或集合物残余物分离肽的位点。

肽可以插入外表面环中和/或内表面环中，即各自远离或朝向衣壳中心的面的衣壳环中。结合衣壳表面环的任何氨基酸或肽可以作为肽的插入片段。通常，在约环的中心选择插入位点，即约位于折叠衣壳肽三级结构中心最远端的位置。肽编码序列可以可操作地插入衣壳编码序列的位置中，对应于该选定环的大约中心。这包括为从肽插入位点肽下游合成的衣壳肽序列一部分的阅读框的保留，。

另一个实施方案中，可以将肽插入衣壳的氨基末端。可以通过一个或多个连接物序列将肽连接衣壳，包括上述的可分裂连接物。再一个实施方案中，可以将肽插入衣壳的羧基端。还可以通过一个或多个连接物将肽连接羧基端，可以通过化学或酶水解来分裂该连接物。一个实施方案中，肽序列连接氨基和羧基两端，或在一端和至少一个内部位置，如以其三维构象在衣壳表面上表达的位置。

一个实施方案中，肽可以插入来自豇豆褪绿斑驳病毒的衣壳中。一特定实施方案中，可以在CCMV病毒的氨基酸129插入肽。另一个实施方案中，可以在CCMV病毒的氨基酸60、61、61或63插入肽序列。再一个实施方案中，可以在CCMV病毒的氨基酸129和氨基酸60-63插入肽。

特定实施方案中，本发明提供了核酸构建体，包括a)编码抗微生物肽的核酸；和b)编码二十面体衣壳的核酸，其中在细胞中表达时，a)的核酸和b)的核酸可操作地连接成融合蛋白。以上公开了用于构建核酸构建体中的其他衣壳和重组肽。

启动子

一个实施方案中，核酸构建体包括启动子序列，该启动子序列可操作连接编码衣壳-重组肽融合肽的核酸序列。可操作衔接或连接指的是其中转录和任何翻译调控序列共价连接所述序列的任何构型，使得通过宿主细胞的作用，调控序列可以指导目标序列的表达。

发酵过程中，一旦诱导了目标重组肽的表达，为了最大化表达系统的效率，理想的是具有高水平的生产。启动子启动了转录并通常在核糖体结合位点的上游10-100个核苷酸。理想地，启动子足够强大使得累积宿主细胞总细胞蛋白约50％的重组肽，接受严格的调控并容易地(和廉价地)诱导。

根据本发明所用的启动子可以是组成型启动子或调控启动子。常用的可诱导启动子及其诱导剂的实例包括lac(IPTG)，lacUV5(IPTG)，tac(IPTG)，trc(IPTG)，P_syn(IPTG)，trp(色氨酸饥饿)，araBAD(1-阿拉伯糖)，lppa(IPTG)，lpp-lac(IPTG)，phoA(磷酸盐饥饿)，recA(萘啶酸)，proU(渗透压浓度)，cst-1(葡萄糖饥饿)，tetA(四环素)，cadA(pH)，nar(厌氧条件)，PL(热转换至42℃)，cspA(热转换至20℃)，T7(热诱导)，T7-lac启动子(IPTG)，T3-lac启动子(IPTG)，T5-lac启动子(IPTG)，T4基因32(T4转染)，nprM-lac启动子(IPTG)，Pm(烷基-或卤素-苯甲酸盐)，Pu(烷基-或卤素-甲苯)，Psal(水杨酸盐)和VHb(氧)。参见，例如，Makrides，S.C.(1996)Microbiol.Rev.60，512-538；Hannig G.& Makrides，S.C.(1998)TIBTECH 16，54-60；Stevens，R.C.(2000)Structures 8，R177-R185。参见，例如：J.Sanchez-Romero & V.De Lorenzo，Genetic Engineering of NonpathogenicPseudomonas strains as Biocatalysts for Industrial and Environmental Processes(用作工业和环境工程中生物催化剂的非致病假单胞菌的遗传工程)，Manual of IndustrialMicrobiology and Biotechnology(工业微生物和生物技术手册)(A.Demain & J.Davies编辑)pp.460-74(1999)(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer，Vectorsto express foreign genes and techniques to monitor gene expression for Pseudomonads(表达外源基因的载体和监控假单胞菌基因表达的技术)，Current Opinion inBiotechnology，12：439-445(2001)；和R.Slater & R.Williams，The Expression ofForeign DNA in Bacteria(细菌中外源DNA的表达)，Molecular Biology andBiotechnology(分子生物学和生物技术)(J.Walker & R.Rapley编辑)pp.125-54(2000)(The Royal Society of Chemistry，Cambridge，UK)。

具有对选定细菌宿主细胞天然的启动子核苷酸序列的启动子也可以用于控制编码目标肽的转基因的表达，例如假单胞菌氨基苯甲酸盐或苯甲酸盐操纵子启动子(Pant，Pben)。还可以使用串连的启动子，其中多于一个启动子共价地连接另一个，不管序列是相同或不同，例如，Pant-Pben串连启动子(启动子间杂交)或Plac-Plac串连启动子。

调控启动子使用启动子调控蛋白质，以便控制启动子作为一部分基因的转录。当在此使用的调控启动子时，相应的启动子调控蛋白也是根据本发明的表达系统的一部分。启动子调控蛋白的实例包括：激活剂蛋白，例如，大肠杆菌分解产物激活剂蛋白，MalT蛋白；AraC家族的转录激活剂；阻遏物蛋白，例如，大肠杆菌LacI蛋白；和双重-部分调控蛋白，例如大肠杆菌NagC蛋白。许多调控启动子/启动子调控蛋白对是本领域已知的。

启动子调节蛋白与效应物化合物相互作用，即，与调控蛋白可逆或不可逆相连的化合物，使得蛋白质能够释放或结合至少一个基在启动子控制下因的DNA转录调控片段，因此在启动基因的转录中允许或阻断转录酶的作用。效应物化合物分类为诱导剂或辅阻遏物。这些化合物包括天然效应物化合物和安慰的诱导剂化合物。许多调控启动子/启动子调控蛋白/效应物化合物三重体是本领域已知的。尽管在细胞培养或发酵的整个过程中可以使用效应物化合物，使用调控启动子的特定实施方案中，所需量或密度的宿主细胞生物量生长后，将合适的效应物化合物加入培养物中，以便直接或间接地获得所需目标基因的表达。

例如，使用lac家族的启动子时，lacI基因或其衍生物如lacI^Q或lacI^Q1基因，也可以存在于系统中。LacI基因，(通常)是组成型表达的基因，编码Lac阻遏物蛋白质(LacI蛋白)，其结合这些启动子的lac操纵子。因此，当使用lac家族的启动子时，还可以包括在表达系统中lacI基因诱导表达。在lac启动子家族成员例如tac启动子的情况中，效应物化合物是诱导剂，优选安慰的诱导剂如IPTG(异丙基-β-D-1-硫代乳糖吡哺糖苷，也称为“异丙基硫代半乳糖苷”)。

特定实施方案中，本发明使用lac或tac家族的启动子，包括Plac，Ptac，Ptrc，PtacII，PlacUV5，lpp-PlacUV5，lpp-lac，nprM-lac，T7lac，T5lac，T3lac和Pmac。

其他序列

表达构建体中包括其他的调控序列，包括lacO序列。这样的序列包括，但不限于，例如，转录增强子序列，翻译增强子序列，其他启动子，激活剂，翻译起始和停止信号，转录终止子，顺反子调控序列，多顺反子调控序列，标记序列，如核苷酸序列“标记”和“标记”肽编码序列，其有助于所表达肽的鉴定、分离、纯化或分离，包括His-标记，Flag-标记，T7-标记，S-标记，HSV-标记，B-标记，Strep-标记，聚精氨酸，聚半胱氨酸，聚苯丙氨酸，聚天冬氨酸，(Ala-Trp-Trp-Pro)n，硫氧还蛋白，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，环糊精葡萄糖酸转移酶(cyclomaltodextrin gluconotransferase)，CTP：CMP-3-脱氧-D-甘露-辛酮-胞嘧啶转移酶？(CTP：CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonatecytidyltransferase)，trpE或trpLE，抗生物素蛋白，链霉亲和素，T7基因10，T4gp55，葡萄球菌蛋白A，链霉球菌蛋白G，GST，DHFR，CBP，MBP，半乳糖结合结构域，调钙蛋白结合结构域，GFP，KSI，c-myc，ompT，ompA，pelB，NusA，泛激素和hemosylin A。

一个实施方案中，核酸构建体进一步包括连接目标重组肽编码序列，或连接病毒衣壳编码序列的标记序列。一个实施方案中，该标记序列使得可以纯化蛋白质。标记序列可以是亲和性标记，如六-组氨酸亲和性标记。另一个实施方案中，亲和性标记是谷胱甘肽S-转移酶分子。标记还可以是荧光分子，如YFP或GFP，或这样荧光蛋白的类似物。标记还可以是抗体分子的一部分，或用于纯化的已知结合配偶体已知的抗原或配体。

除了衣壳-重组肽编码序列，本发明还包括与其可操纵连接的调控序列：启动子，核糖体结合位点(RBS)，转录终止子，翻译起始和停止信号。有用的RBS可以从任何用作根据本发明的表达系统中的宿主细胞物种获得，优选来自选定的宿主细胞。许多特异性的和各种一致RBSs是已知的，例如，D.Frishman等描述和参考的那些，Starts of bacterial genes：estimating the reliability of computer predictions(细菌基因的开始：估算计算机预测的可靠性)，Gene 234(2)：257-65(8 Jul 1999)和B.E.Suzek等，A probabilistic method for identifying start codons in bacterialgenomes(鉴定细菌基因组中起始密码子的概率性方法)，Bioinformatics 17(12)：1123-30(2001年12月)。此外，可以使用天然或合成的RBS，例如，描述于：EP0207459(合成RBS)；O.Ikehata等，Primary structure of nitrile hydratase deducedfrom the nucleotide sequence of a Rhodococcus species and its expression inEscherichia coli，Eur.J.Biochem.181(3)：563-70(1989)(天然RBS序列AAGGAAG)中的那些。本发明中有用的方法、载体以及翻译和转录序列，和其他序列的更多实例描述于，例如：Gilroy的US专利No.5,055,294和Gilroy等的US专利No.5,128,130；Rammler等的US专利No.5,281,532；Barnes等的US专利No.4,695,455和4,861,595；Gray等的US专利No..4,755,465；和Wilcox的US专利No.5,169,760。

载体

可以通过将增强子序列插入载体或质粒中来进一步提高假单胞菌对编码本发明酶的DNA的转录。典型的增强子是DNA的顺作用序列，通常约10至300bp的大小，作用于启动子来增强其转录。

通常，重组表达载体将包括复制起点和使假单胞菌宿主细胞转化选择标记，例如，本发明的衣壳-重组肽融合肽，和源自高度表达基因的启动子来指导下游结构序列的转录。以上已经描述了这样的启动子。在合适的阶段装配带有翻译启动和终止序列的异种结构序列。任意地，并根据本发明，异种序列可以编码融合肽，该融合肽包括给予所需特征的N-端识别序列，所需特征为例如稳定或简化所表达重组产物的纯化。

通过在可操作阅读阶段插入编码与衣壳肽融合的所需目标肽的结构DNA序列与合适的翻译启动和终止信号以及功能启动子来构建表达衣壳-重组肽融合肽中荧光假单胞菌使用的有用表达载体。载体将包括一个或多个表型选择标记和复制起点来确保载体的维持，和如果需要，提供宿主内的扩增。根据本公开内容中用于转化的合适宿主包括假单胞菌属内的各种种，特别是，荧光假单胞菌的宿主细胞菌株。

用于在宿主细胞中表达重组蛋白的载体是本领域已知的，且可以改进这些中的任一种并用于表达根据本发明的融合产物。这样的载体包括，例如，质粒，粘粒和噬菌体表达载体。可以改进来用于本发明的有用质粒载体的实例包括，但不限于，表达质粒pBBR1MCS，pDSK519，pKT240，pML122，pPS1O，RK2，RK6，pRO1600和RSF1010。更多的实例包括pALTER-Ex1，pALTER-Ex2，pBAD/His，pBAD/Myc-His，pBAD/gIII，pCal-n，pCal-n-EK，pCal-c，pCal-Kc，pcDNA2.1，pDUAL，pET-3a-c，pET 9a-d，pET-1 1a-d，pET-12a-c，pET-14b，pET15b，pET-16b，pET-17b，pET-19b，pET-20b(+)，pET-21a-d(+)，pET-22b(+)，pET-23a-d(+)，pET24a-d(+)，pET-25b(+)，pET-26b(+)，pET-27b(+)，pET28a-c(+)，pET-29a-c(+)，pET-30a-c(+)，pET31b(+)，pET-32a-c(+)，pET-33b(+)，pET-34b(+)，pET35b(+)，pET-36b(+)，pET-37b(+)，pET-38b(+)，pET-39b(+)，pET-40b(+)，pET-41a-c(+)，pET-42a-c(+)，pET-43a-c(+)，pETBlue-1，pETBlue-2，pETBlue-3，pGEMEX-1，pGEMEX-2，pGEX1λT，pGEX-2T，pGEX-2TK，pGEX-3X，pGEX-4T，pGEX-5X，pGEX-6P，pHAT1O/11/12，pHAT20，pHAT-GFPuv，pKK223-3，pLEX，pMAL-c2X，pMAL-c2E，pMAL-c2g，pMAL-p2X，pMAL-p2E，pMAL-p2G，pProEX HT，pPROLar.A，pPROTet.E，pQE-9，pQE-16，pQE-30/31/32，pQE-40，pQE-50，pQE-70，pQE-/80/81/82L，pQE-100，pRSET，和pSE280，pSE380，pSE420，pThioHis，pTrc99A，pTrcHis，pTrcHis2，pTriEx-1，pTriEx-2，pTrxFus.。这样有用载体的其他实例包括以下描述的那些：N.Hayase，Appl.Envir.Microbiol.60(9)：3336-42(Sep 1994)；A.A.Lushnikov等，Basic Life Sci.30：657-62(1985)；S.Graupner & W.Wackernagel，Biomolec.Eng.17(1)：11-16(2000年10月)；H.P.Schweizer，Curr.Opin.Biotech.12(5)：439-45(2001年10月)；M.Bagdasarian & K.N.Timmis，Curr.Topics Microbiol.Immunol.96：47-67(1982)；T.Ishii等，FEMS Microbiol.Lett.116(3)：307-13(1994年3月1目)；I.N.Olekhnovich & Y.K.Fomichev，Gene 140(1)：63-65(1994年3月14日)；M.Tsuda & T.Nakazawa，Gene 136(1-2)：257-62(Dec22，1993)，C.Nieto等，Gene 87(1)：145-49(1990年3月1日)；J.D.Jones & N.Gutterson，Gene 61(3)：299-306(1987)，M.Bagdasarian等，Gene 16(1-3)：237-47(1981年12月)；H.P.Schweizer等，Genet.Eng.(NY)23：69-81(2001)；P.Mukhopadhyay等，J.Bact.172(1)：477-80(1990年1月)；D.O.Wood等，J.Bact.145(3)：1448-51(1998年3月)；和R.Holtwick等Microbiology 147(第2部分)：337-44(2001年2月)。

可以用于假单胞菌宿主细胞的表达载体的更多实例包括表2中所列的源自所示复制子的那些。

表2.有用表达载体的一些实例

复制子	载体
		pPS10	pCN39，pCN51
RSF1010	pKT261-3
		pMMB66EH
	pEB8
		pPLGN1
	pMYC1050
		PK2/RP1	pRK415
pJB653
	pRO1600		pUCP
pBSP

F.Heffron等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA72(9)：3623-27(1975年9月)，和K.Nagahari & K.Sakaguchi，J.Bact.133(3)：1527-29(1978年5月)，描述了表达质粒，RSF1010，。质粒RSF1010及其衍生物是本发明中特别有用的载体。本领域已知的RSF1010的有用衍生物实例包括，例如，pKT212，pKT214，pKT231和相关的质粒，和pMYC1050和相关质粒(例如，参见，Thompson等的US专利No.5,527,883和5,840,554)，如，例如，pMYC1803。质粒pMYC1803源自基于RSF1010的质粒pTJS260(参见，Wilcox等的US专利No.5,169,760)，其携带调控四环素抗性标记以及来自RSF1010质粒的复制和固定基因座。其他实例有用的载体包括Puhler等的US专利No.4,680,264中描述的那些。

一个实施方案中，表达质粒用作表达载体。另一个实施方案中，RSF1010或其衍生物用作表达载体。再一个实施方案中，pMYC1050或其衍生物，或pMYC1803或其衍生物，用作表达载体。

Champion^TM pET表达系统提供了高水平的蛋白生产。从强T7lac启动子诱导表达。该系统具有高水平转录目标基因的噬菌体T7 RNA聚合酶的高活性和特异性的优势。位于启动子片段的Lac操纵子提供了比传统的基于T7的载体更严格的调控，提高了质粒稳定性和细胞生活力(Studier，F W.和B.A.Moffatt(1986)JMolecular Biology 189(10)：113-30；Rosenberg等，(1987)Gene 56(1)：125-35)。T7表达系统使用T7启动子和用于目标基因高水平转录的T7RNA聚合酶(T7RNAP)。在T7表达系统中获得高水平的表达，因为T7RNAP比天然大肠杆菌RNAP更前进，并致力于目标基因的转录。通过提供宿主细胞中T7RNAP的来源来诱导基因的表达。通过使用含有T7RNAP基因染色体拷贝的BL 21大肠杆菌宿主来完成这。T7RNAP基因处于IPTG诱导的lacUV5的控制。诱导时表达T7RNAP并转录目标基因。

pBAD表达系统可以通过特定碳源如葡萄糖、甘油和阿拉伯糖的存在来严格控制可滴定的表达重组蛋白(Guzman等，(1995)J Bacteriology 177(14)：4121-30)。独特地设计pBAD载体以给予对表达水平的精确控制。在araBAD启动子启动pBAD载体的异种基因表达。通过araC基因的产物来正向或负向调控启动子。AraC是与L-阿拉伯糖形成复合体的转录调控子。L-阿拉伯糖不存在时，AraC二聚体阻断转录。对于最大转录激活，需要两个事件：(i)L-阿拉伯糖结合AraC，使转录开始。(ii)cAMP激活剂蛋白(CAP)-cAMP复合体结合DNA并刺激AraC与启动子片段的正确位置结合。

Trc表达系统使大肠杆菌中trc启动子的高水平调控表达。已经最佳化Trc表达载体来用于大肠杆菌中真核基因的表达。Trc启动子是源自色氨酸(trp)和乳糖(lac)启动子的强杂交启动子。其受到lacO操纵子和lacIQ基因产物的调控(Brosius，J.(1984)Gene 27(2)：161-72)。

III.假单胞菌中病毒样颗粒的表达

本发明还提供了生产重组肽的方法。该方法包括：

a)提供假单胞菌细胞；

b)提供编码融合肽的核酸；其中是重组肽和二十面体衣壳的融合；

c)在假单胞菌细胞中表达核酸，其中细胞中的表达提供了融合肽体内装配成病毒样颗粒；和

d)分离病毒样颗粒。

肽可以表达为衣壳肽中的单拷贝肽插入片段(即，从单顺反子肽的重组衣壳肽编码序列表达为单个插入片段)或可以表达为二-、三-或多-拷贝肽插入片段(即，从多顺反子肽的重组衣壳肽编码序列表达为多联插入片段；多联插入片段可以包含相同外源目标肽的多个拷贝或可以包含不同目标外源目标肽的拷贝)。多联体可以是同型-或杂-多联体。

一个实施方案中，可以在疫苗策略中将分离的病毒样颗粒给药于人或动物。

另一个实施方案中，核酸构建体可以和另一个编码野生型衣壳的核酸共表达。特定实施方案中，共表达的衣壳/衣壳-重组肽融合颗粒体内装配成嵌合病毒样颗粒。嵌合VLPs是包括至少两个不同核酸构建体编码的衣壳或衣壳-肽融合体的病毒样颗粒。

再一个实施方案中，核酸构建体可以和另一个编码不同衣壳-重组肽融合颗粒的核酸共表达。特定实施方案中，共表达的衣壳融合颗粒体内装配成嵌合病毒样颗粒。

再一个实施方案中，设计来表达不同肽如伴侣蛋白的第二个核酸，可以伴随编码融合肽的核酸来表达。

以上讨论了用于本发明中的假单胞菌细胞、质粒和重组肽。

一个实施方案中，该方法产生至少0.1g/L VLPs形式的蛋白质。另一个实施方案中，该方法产生0.1至10g/L VLPs形式的蛋白质。次实施方案中，该方法产生至少约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0g/L VLPs形式的蛋白质或笼形结构。一个实施方案中，产生的总重组蛋白质为至少1.0g/L。一些实施方案中，产生的VLPs蛋白量为所产生的总重组蛋白质的至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。

一个实施方案中，该方法产生至少0.1g/L预先形成的VLPs或笼形结构。另一个实施方案中，该方法在细胞中产生0.1至10g/L预先形成的VLPs。另一个实施方案中，该方法在细胞中产生0.1至10g/L预先形成的笼形结构。次实施方案中，方法产生至少约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0g/L预先形成的VLPs。一个实施方案中，所产生的总预先形成的VLP蛋白质为至少1.0g/L。次实施方案中，所产生的总VLPs蛋白质为至少约2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0、20.0或50.0g/L。一些实施方案中，产生的VLPs蛋白量为所产生的总重组蛋白质的至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％或更多。

另一个实施方案中，可以以复性形式在宿主细胞中产生所产生的高于50％的表达的转基因肽、肽、蛋白质或其片段。另一个实施方案中，可以以活化形式或复性成活化形式获得约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的表达蛋白质。

本发明的方法还导致重组蛋白质提高的产量。一个实施方案中，该方法产生总细胞蛋白质(tcp)5、10、15、20、25、30、40或50、55、60、65、70或75％的重组蛋白质。“总细胞蛋白质百分比”是宿主细胞中作为聚合细胞蛋白质百分比的肽含量。总细胞蛋白质百分比的测定是本领域公知的。

特定实施方案中，当在矿物盐培养基中生长时(即，在约4至55℃的温度范围内，包括两端)，宿主细胞可以含有表达水平为至少1％tcp的重组肽，肽，蛋白质或其片段和至少为40g/L的细胞密度。特定实施方案中，当以至少10L的发酵规模生长于矿物盐培养基中时即，在约4至55℃的温度范围内，包括两端)，表达系统将具有肽表达水平至少为5％tcp的重组蛋白质和至少为40g/L的细胞密度。

分开的实施方案中，所表达的可操作地连接目标肽的病毒衣壳的一部分在细胞中形成不溶聚合物。一个实施方案中，可以从不溶聚合物中复性目标肽。

目标肽的分裂

一个实施方案中，该方法进一步提供：e)从衣壳分裂融合产物来分离重组肽。

可以在病毒蛋白质和重组肽之间包括可分裂的连接序列。可以分裂这样序列的试剂实例包括，但不限于，化学试剂如酸(HCl，甲酸)，CNBr，羟胺(对于天冬酰胺-甘氨酸)，2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸盐，O-亚碘酰苯(lodosobenzoate)，和酶试剂，如肽链内切酶，蛋白内切酶，胰岛素，梭菌蛋白酶，和葡萄球菌蛋白酶。

可分裂连接序列是本领域公知的。本发明中，可以使用通过分裂试剂识别的任何可分裂连接序列，包括二肽可分裂序列如Asp-Pro。

表达

本发明的方法最佳地导致宿主细胞中重组肽的提高生产。提高的生产可替换地是每克所产生蛋白质或每克宿主蛋白质的活性肽的提高水平。提高的生产还可以是每克重组或每克宿主细胞蛋白质产生的可收集肽如可溶性蛋白质的提高水平。提高的生产还可以是提高的总水平和蛋白质提高的活性或可溶水平的结合。

重组蛋白质的提高表达可以通过插入VLPs中的蛋白质的表达。特定实施方案中，每个VLPs中表达目标蛋白至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170或至少180个的拷贝。可以从宿主细胞的细胞质、周质和胞外培养基中产生并收集VLPs。

另一个实施方案中，肽在细胞中是不溶的。特定实施方案中，以多衣壳形成的颗粒但不形成天然型VLP来产生不溶性肽。例如，形成少至3个病毒衣壳的笼形结构。特定实施方案中，结构包括多于一个目标肽的拷贝，特定实施方案中，包括至少10、至少20或至少30个拷贝。

肽或病毒衣壳序列还可以包括一个或多个靶向序列或帮助纯化的序列。这些可以是亲和性标记。这些还可以是指导衣壳装配成VLPs的靶向序列。

细胞生长

可以使用本领域已知的任何转化技术来进行载体对假单胞菌宿主细胞的转化，且细菌宿主细胞可以以完整的细胞或原生质体(即，包括胞质体)来转化。实例转化方法包括穿孔方法，例如，电穿孔，原生质体融合，细菌缀合和二价阳离子处理，例如，氯化钙处理或CaCl/Mg2+处理，或本领域的其他公知方法。参见，例如，Morrison，J.Bact.，132：349-351(1977)；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods inEnzymology(酶学方法)101：347-362(Wu等，编辑，1983)，Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)(第2版，1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(基因转移和表达：实验室手册)(1990)和Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学中通用的实验方案)(Ausubel等，编辑，1994))。

如在此所用的，术语“发酵”包括其中使用原意发酵的实施方案，和其中使用其他非发酵性培养模式的实施方案。以任何规模进行发酵。一个实施方案中，发酵培养基选自富化培养基、基本培养基和矿物盐培养基中选择；可以使用富化培养基，但优选避免。另一个实施方案中，选择基本培养基或矿物盐培养基。

再一个实施方案中，选择基本培养基。再一个实施方案中，选择矿物盐培养基。特别优选矿物盐培养基。

矿物盐培养基包括矿物盐和碳源如，例如，葡萄糖，蔗糖或甘油。矿物盐培养基的实例包括，例如，M9培养基，假单胞菌培养基(ATCC 179)，Davis和Mingioli培养基(参见，BD Davis & ES Mingioli(1950)J.Bact.60：17-28)。用于制备矿物盐培养基的矿物盐包括选自例如磷酸钾、硫酸铵或氯化铵，硫酸镁或氯化镁中的那些，和微量矿物质如氯化钙，硼酸盐，和铁、铜、锰和锌的硫酸盐。矿物盐培养基中没有包括有机氮源，如蛋白胨，胰蛋白胨，氨基酸或酵母提取物。替代的，使用无机氮源，并可以选自例如，铵盐，氨水和气态氨。优选的矿物盐培养基含有葡萄糖作为碳源。与矿物盐培养基相比较，基本培养基也含有矿物盐和碳源，但可以补充，例如，低含量的氨基酸、维生素、蛋白胨或其他成分，尽管以非常小的含量加入这些。

高细胞密度的培养物可以作为分批生产的开始，接着两个阶段的补料分批培养。分批部分无限生长后，可以在3倍增时间的阶段中将生长控制于降低的特定生长率，其中生物量浓度可以提高几倍。这样培养方法的更多详细内容描述于Riesenberg，D.；Schulz，V.；Knorre，W.A.；Pohl，H.D.；Korz，D.；Sanders，E.A.；Ross，A.；Deckwer，W.D.(1991)″High cell density cultivation of Escherichia coli atcontrolled specific growth rate″(大肠杆菌在控制的特定生长速率的高细胞密度培养)J Biotechnol：20(1)17-27。

根据本发明的表达系统可以以任何发酵形式培养。例如，在此可以使用分批、补料分批、半连续和连续发酵模式。

根据本发明的表达系统可用于任何发酵规模(即，体积)的转基因表达。因此，例如，可以使用微升规模，厘升规模，和分升规模发酵体积；和可以使用1升规模和较大的发酵体积。一个实施方案中，发酵体积是或高于1升。另一个实施方案中，发酵体积是或高于5升，10升，15升，20升，25升，50升，75升，100升，200升，500升，1,000升，2,000升，5,000升，10,000升或50,000升。

本发明中，在允许宿主细胞存活的温度范围内进行转化宿主细胞的生长、培养和/或发酵，优选约4至约55℃的温度范围，包括两端。因此，例如，术语“生长(growth)”(和“生长(grow)”，“生长(growing)”)，“培养(culturing)”(和“培养(culture)”)和“发酵(fermentation)”(和“发酵(ferment)”，“发酵(fermenting)”)，如在此关于本发明宿主细胞使用时，意思是在约4至约55℃包括两端温度范围内的“生长”，“培养”和“发酵”。此外，使用“生长”来表示活细胞分裂和/或增大的生物状态，以及其中非分裂和/或非增大细胞是代谢上得到维持的生物状态，术语“生长”的后一用途是术语“维持”的同义词。

细胞密度

在表达重组肽中使用嵌入VLPs的荧光假单胞菌的其他优势包括与大肠杆菌或其他细菌表达系统相比，荧光假单胞菌以高细胞浓度生长的能力。为此，根据本发明的荧光假单胞菌表达系统可以提供约20g/L或更高的细胞密度。根据本发明的荧光假单胞菌表达系统同样可以提供至少约70g/L的细胞密度，就规定的术语每体积的生物量而言，以干细胞重来测量生物量。

一个实施方案中，细胞密度为至少20g/L。另一个实施方案中，细胞密度为至少25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L或至少150g/L。

另一个实施方案中，诱导时细胞密度为介于20g/L至150g/L之间；20g/L至120g/L之间，20g/L至80g/L之间，25g/L至80g/L之间，30g/至80g/L之间，35g/L至80g/L之间，40g/L至80g/L之间，45g/L至80g/L之间；50g/L至80g/L之间；50g/L至75g/L之间；50g/L至70g/L之间；40g/L至80g/L之间。

VLPs或目标肽的分离

特定实施方案中，本发明提供了通过在表达过程中与病毒衣壳连接和共表达来保护肽从而提高了目标肽收集的方法。特定实施方案中，病毒衣壳融合形成VLPs，其可以从细胞裂解物中容易地分离出来。

通过本领域公知的标准技术可以将本发明的蛋白质分离纯化至实质性(substantial)的纯度，这些方法包括，但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，磷酸纤维素色谱，疏水相互作用色谱，亲和色谱，镍色谱，羟磷灰石色谱，反相色谱，凝集素色谱，制备性电泳，去污剂溶解，选择性沉淀，使用这样的材料如柱色谱，免疫纯化色谱等等。例如，具有建立的分子粘附特性的蛋白质可以可逆地与配体融合。使用合适的配体，蛋白质可以选择性地吸附至纯化柱然后以相对纯的形式从柱子游离出来。然后通过酶活性除去融合蛋白。此外，可以使用免疫亲和柱或Ni-NTA柱来纯化蛋白质。常用的技术进一步地描述于，例如，R.Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(蛋白质纯化：原理和实践)Springer-Verlag：N.Y.(1982)；Deutscher，Guide to ProteinPurification(蛋白纯化的指导)，Academic Press(1990)；U.S.专利No.4,511,503；S.Roe，Protein Purification Techniques：A Practical Approach(蛋白纯化技术：实践方法)(Practical Approach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag等，Protein Methods(蛋白方法)，Wiley-Lisa，Inc.(1996)；AK Patra等，Protein Expr Purif，18(2)：p/182-92(2000)；和R.Mukhija等，Gene 165(2)：p.303-6(1995)。还参见，例如，Ausubel等(1987和增刊)；Deutscher(1990)Guide to Protein Purification(蛋白纯化的指导)，Methods in Enzymology(酶学方法)，vol.182和该系列中的其他卷，Coligan等，(1996和增刊)Current Protocols in Protein Science(蛋白质科学中的通用实验方案)Wiley/Greene，NY；和使用蛋白纯化产物时制造商的文献，例如，Pharmacia，Piscataway，N.J.或Bio-Rad，Richmond，Calif.结合重组技术使得可以融合合适的片段，例如，FLAG序列或其等价物，其可以通过蛋白酶可去除序列来融合。还参见，例如，Hochuli(1989)Chemische Industrie 12：69-70；Hochuli(1990)″Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent″(用金属螯合吸附剂纯化重组蛋白)Setlow(编辑)Genetic Engineering，Principle and Methods 12：87-98，Plenum Press，NY；以及Crowe等(1992)QIAexpress：The High LevelExpression & Protein Purification System QUIAGEN(QIAexpress：高水平表达和蛋白纯化系统QUIAGEN)，Inc.，Chatsworth，Calif。

相似地，通过本领域公知的标准技术可以将病毒样颗粒或笼形结构分离和/或纯化成实质性的纯度。分离VLPs的技术包括，除了上述的那些，沉淀技术如聚乙二醇或盐沉淀。分离技术包括阴离子或阳离子交换色谱，大小排阻色谱，磷酸纤维素色谱，疏水性相互作用色谱，亲和色谱，镍色谱，羟磷灰石色谱，反相色谱，凝集素色谱，制备性电泳，免疫纯化方法，离心，超离心，密度梯度离心(例如，蔗糖或氯化铯(CsCl)梯度)，通过大小排除滤器的超滤，和本领域已知的任何其他蛋白质分离方法。

本发明还提高了活性重组肽的收集。例如，通过任何适宜的体外或体内测试来测量鉴定的和母体肽、肽变体，片段取代-肽和/或残基取代肽之间的相互作用来测量活性肽的水平。因此，体外测试可用于测定鉴定的蛋白质和目标肽之间的任何可检测的相互作用，例如酶和底物之间，激素和激素受体之间，抗体和抗原之间，等。这样的检测包括比色改变、放射性改变、溶解度改变、分子量改变的测量，如通过凝胶电泳和/或凝胶排除方法等来测量。体内测试包括，但不限于，检测生理效应的测试，例如，体重获得，电解质平衡的改变，凝血时间的改变，凝块溶解的改变和抗原响应的诱导。通常，可以使用任何体内测试，只要可变参数存在使得检测鉴定的和目标肽之间相互作用的改变。参见，例如，U.S.专利No.5,834,250。

为了从周质释放重组肽，已经使用包括化学物质的处理，如氯仿(Ames等，(1984)J.Bacteriol，160：1181-1183)，胍-HCl和曲通X-100(Naglak和Wang(1990)Enzyme Microb.Technol.，12：603-611)。然而，这些化学品不是惰性的并对许多重组蛋白质产物或随后的纯化方法具有不利的影响。大肠杆菌的甘氨酸处理，导致外膜渗透，还报道了释放周质内含物(Ariga等，(1989)J.Ferm.Bioeng，68：243-246)。最广泛使用的重组蛋白周质释放的方法是渗透压休克(Nosal和Heppel(1966)J.Biol.Chem.，241：3055-3062；Neu和Heppel(1965)J.Biol.Chem.，240：3685-3692)，鸡蛋白(HEW)溶菌酶/乙二胺四乙酸(EDTA)处理(Neu和Heppel(1964)J.Biol.Chem.，239：3893-3900；Witholt等，(1976)Biochim.Biophys.Acta，443：534-544；Pierce等，(1995)ICheme Research.Event，2：995-997)，和组合的HEW-溶菌酶/渗透休克处理(French等，(1996)Enzyme and Microb.Tech.，19：332-338)。French方法包括将细胞重悬浮于分级缓冲液中，接着收集周质部分，其中溶菌酶处理后立即渗透休克。还讨论了重组蛋白的超表达效果，热紫链霉菌S.thermoviolaceus直链淀粉酶，和宿主生物体收集时的生长阶段。

通常，这些方法包括渗透稳定培养基中的初始破坏接着在非稳定培养基中的选择性释放。报道了特定方法中不同地使用这些培养基的组成(pH，保护剂)和破坏方法(氯仿，HEW-溶菌酶，EDTA，超声)。Stabel等，(1994)Veterinary Microbiol.38：307-314中讨论了使用两极离子去污剂替代EDTA的HEW-溶菌酶/EDTA处理的改变。对于使用破坏大肠杆菌的胞内分解酶系统的综述，参见Dabora和Cooney(1990)，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology(生化工程/生物技术的进展)，Vol.43，A.Fiechter编辑(Springer-Verlag：Berlin)，pp.11-30。

从细胞质作为可溶蛋白质或折射颗粒收集重组蛋白质的常规方法，包括通过机械破裂来分解细菌细胞。机械破坏通常涉及液体悬浮液中局部空化的产生，用坚硬珠快速搅拌，超声或研磨细胞悬浮液(Bacterial Cell Surface Techniques(细菌细胞表面技术)，Hancock和Poxton(John Wiley & Sons Ltd，1988)，第3章，p.55)。

HEW-溶菌酶用来生物上水解细胞壁的肽聚糖主链。首先由Zinder和Amdt(1956)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，42：586-590产生了该方法，他们用蛋清蛋白(其含有HEW-溶菌酶)处理大肠杆菌来产生细胞球，之后称为原生质球。这些结构保留一些细胞壁成分但具有大的表面积，其中暴露了细胞质膜。U.S.专利No.5,169,772公开了从细菌中纯化肝素酶的方法，包括在渗透稳定培养基例如20％蔗糖溶液中将细菌的膜破坏，使用例如EDTA，溶菌酶，或有机化合物，通过将细菌暴露于低离子强度的缓冲液中从破坏细菌的周质空间释放出非肝素酶样蛋白质，并通过将低离子强度洗涤的细菌暴露于缓冲盐溶液中来释放肝素酶样蛋白质。

这些方法的许多不同改变已经用于多种表达系统中，获得了不同程度的成功(Joseph-Liazun等，(1990)Gene，86：291-295；Carter等，(1992)Biol Technology，10：163-167)。已经报道了诱导重组细胞培养物来产生溶菌酶的尝试。EP 0 155 189中公开了诱导重组细胞培养物来产生溶菌酶的方法，通常期望溶菌酶通过破坏或裂解细胞壁结构来杀灭这样的宿主细胞。

U.S.专利No.4,595,658公开了帮助转运至大肠杆菌周质空间的蛋白质外化的方法。该方法使得位于周质中的蛋白质的选择性分离而不需要细胞的溶菌酶处理，机械研磨或渗透休克处理。U.S.专利No.4,637,980公开了产生细菌产物的方法，通过用直接或间接编码产物的DNA分子转化温度敏感性溶原性细菌，在许可的条件下培养转化子来胞内表达基因产物，并通过将温度提高至诱导噬菌体编码的功能来外化产物。Asami等，(1997)，J.Ferment.and Bioeng，83：511-516公开了通过T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞的同步破坏，和Tanji等(1998)，J.Ferment.andBioeng，84：74-78公开了T4噬菌体中编码的裂解基因的受控表达，用于大肠杆菌细胞的温和破坏。

一旦细胞裂解，基因组DNA从细胞质中漏出进入培养基中并导致流体粘度的显著提高，可以阻止离心力场中固体的沉淀。在那些机械破坏过程中运用的来裂解DNA聚合物的剪切力不存在下，通过粘性流体减缓了固体的沉淀速率导致离心过程中固体和液体差的分离。除了机械剪切力以外，存在降解DNA聚合物的核酸酶。大肠杆菌中，内源基因endA编码核酸内切酶(约24.5kD分子量的成熟蛋白质)，通常分泌至周质并以核酸内切的方式将DNA分裂成寡脱氧核糖核苷酸。已经表明大肠杆菌相对弱地表达endA(Wackemagel等，(1995)Gene 154：55-59)。

通过本领域已知的方法获得表达蛋白质的检测，这些方法包括，例如，放射性免疫测试，蛋白质印迹技术或免疫沉淀。

本发明中表达的特定蛋白质可以形成不溶性的聚合物(“包涵体”)。几种方法适于从包涵体纯化蛋白质。例如，包涵体的纯化包括通过破坏宿主细胞提取、分离和/或纯化包涵体，例如，通过在50mM TRIS/HCL，pH7.5，50mM NaCl，5mMMgCl₂，lmM DTT，0.1mMATP和1mM PMSF的缓冲液中孵育。通常使用2-3次通过French Press来裂解细胞悬浮液。还可以使用Polytron(Brinkman Instruments)或在冰上进行超声处理来均质细胞悬浮液。裂解细菌的可替换方法是本领域技术人员清楚的(参见，例如，Sambrook等，上文；Ausubel等，上文)。

如果需要，可以将包涵体溶解，且通常将裂解的细胞悬浮液离心来除去不需要的不溶物质。通过用相容的缓冲液稀释或渗析来使形成包涵体的蛋白质复性。合适的溶剂包括，但不限于，脲(约4M至约8M)，甲酰胺(至少约80％，体积/体积比(volume/volume basis))和盐酸胍(约4M至约8M)。尽管盐酸胍和相似的试剂是去污剂，但这种变性不是不可逆方，并在除去(例如通过渗析)或稀释去污剂时发生复性，使得免疫上和/或生物上活性的蛋白质的再形成。其他合适的缓冲剂是本领域技术人员已知的。

或者，可以从宿主周质中纯化重组肽。宿主细胞裂解后，当重组蛋白质出来进入宿主细胞周质中时，除了本领域技术人员已知的其他方法外，通过冷渗透休克分离细菌的周质部分。为了从周质分离出重组蛋白质，例如，可以将细菌细胞离心来形成沉淀。将沉淀重悬浮于含有20％蔗糖的缓冲液中。为了裂解细胞，将细菌离心并将沉淀重悬浮于冰冷的5mM MgSO₄中并保持于冰浴中约10分钟。将细胞悬浮液离心并将上清液倾析和保存。通过本领域技术人员公知的标准分离技术将上清液中存在的重组蛋白质从宿主蛋白质中分离出来。

最初的盐分级可以从目标重组蛋白质分离出许多不需要的宿主细胞蛋白质(或源自细胞培养基的蛋白质)。硫酸铵通过有效地减少蛋白质混合物中的水量来沉淀蛋白质。然后在溶解度的基础上来沉淀蛋白质。疏水性越大的蛋白质，越容易在较低的硫酸铵浓度沉淀。典型的实验方案包括将饱和的硫酸铵加入蛋白质溶液中，使得所得到的硫酸铵浓度是20-30％。该浓度将沉淀最疏水的蛋白质。然后丢弃沉淀(除非目标蛋白是疏水性的)并将硫酸铵加入上清液中至沉淀目标蛋白的已知浓度。然后将沉淀溶解于缓冲液中，并如果需要通过渗析或渗滤除去过量的盐。依靠蛋白质溶解度的其他方法，如冷乙醇沉淀，是本领域技术人员公知的并可以用于分级复杂的蛋白质混合物。

使用超滤通过不同孔径的膜(例如，Amicon或Millipore膜)可以将重组蛋白质的分子量用于从大小更大或更小的蛋白质中分离出来。作为第一步，将蛋白质混合物通过分子量截留低于目标蛋白分子量的膜来超滤。然后将超滤的滞留物通过截留分子大于目标蛋白分子量的的膜来超滤。重组蛋白质将穿过膜进入滤出液中。然后将滤出液如下所述的进行色谱。

还可以基于大小、净表面电荷、亲水性和配体亲和性从其他蛋白质中分离出重组蛋白质。此外，对抗蛋白质的抗体可以与柱基质缀合并将蛋白质免疫纯化。所有这些方法是本领域公知的。本领域技术人员将清楚可以以任何规模和使用许多不同制造商的设备(例如，Pharmacia Biotech)来进行色谱技术。

复性和重折叠

可以将不溶性蛋白质复性或重折叠来产生二级和三级蛋白质结构构象。如果需要，在完成重组产物的构象重，可以使用蛋白质重折叠步骤。使用本领域已知的来促进蛋白质解吸/吸附的试剂来完成重折叠和复性。例如，用二硫苏糖醇孵育，接着用氧化的谷胱甘肽二钠盐孵育，接着用含有重折叠试剂如脲的缓冲液孵育蛋白质。

例如还可以通过对磷酸盐缓冲的盐水(PBS)或50mM Na-醋酸，pH6缓冲液加200mMNaCl渗析来使重组蛋白质复性。或者，当固定于柱子如NiNTA柱子上时将蛋白质重折叠，使用500mM NaCl中线性6M-1M脲梯度，20％甘油，20mMTris/HCl，pH7.4，含有蛋白酶抑制剂。在1.5小时或更长的时间内进行复性。复性后，通过加入250mM咪唑来洗脱蛋白质。通过对PBS或50mM醋酸钠，pH6缓冲液加200mM NaCl的最后透析步骤来除去咪唑。将纯化的蛋白质可以保存于4℃或冷冻于-80℃。

其他方法包括，例如，描述于MH Lee等，Protein Expr.Purif.，25(1)：p.166-73(2002)，W.K.Cho等，J.Biotechnology，77(2-3)：p.169-78(2000)，Ausubel等，(1987和增刊)，Deutscher(1990)″Guide to Protein Purification，″(蛋白纯化的指导)Methods in Enzymology(酶学方法)vol.182和该系列中的其他卷，Coligan等(1996和增刊)，Current Protocols in Protein Science(蛋白科学中的通用实验方安)，Wiley/Greene，NY，S.Roe，Protein Purification Techniques：A Practical Approach(蛋白纯化技术：实践方法)(实践方法系列)，Oxford Press(2001)；D.Bollag等，ProteinMethods(蛋白方法)，Wiley-Lisa，Inc.(1996)。

活性肽分析

活性蛋白质具有衍生其序列的天然肽至少20％，30％或40％，和优选至少50％，60％或70％，最优选至少80％，90％或95％的特异性活性。此外，底物特异性(k_cat/K_m)任意地与天然肽基本上相似。通常，k_cat/K_m为天然肽的至少30％，40％或50％；和更优选至少为60％，70％，80％或90％。测试和定量蛋白质和肽活性和底物特异性(k_cat/K_m)测量值的方法，是本领域技术人员公知的。

通过本领域已知的任何蛋白质特定的常规或标准体外或体内测试来测量根据本发明产生的重组肽的活性。假单胞菌产生的重组肽的活性可以与相应天然蛋白质的活性相比较来测定是否重组蛋白质呈现了与相同或相似生理条件下通常在天然肽中观察到的活性基本上相似或等价的活性。

重组蛋白质的活性可以与之前建立的天然肽标准活性相比较。或者，以同时或基本上同时的天然肽比较测试来测定重组肽的活性。例如，体外测试可以用来测定重组肽和目标之间的任何可检测的相互作用，例如，表达的酶和底物之间，表达的激素和激素受体之间，表达的抗体和抗原之间等。这样的检测可以包括比色改变、增殖改变、细胞死亡、细胞排斥、放射性改变、溶解度改变、如通过凝胶电泳和/或凝胶排除方法测量的分子量改变，磷酸化能力，抗体特异性测试如ELASA测试等。此外，体内测试包括，但不限于，检测假单胞菌所产生肽的生理效果的测试，与天然肽的生理效果相比较，例如，体重获得，电解质平衡的改变，凝血时间的改变，凝块溶解的改变和抗原响应的诱导。通常，任何体外或体内测试可以用来测定假单胞菌所产生重组肽的活性性质，使得可以进行与天然肽的比较分析，只要这样的活性是可测试的。或者，可以测试本发明所产生的肽刺激或抑制肽和分子之间相互作用的能力，该分子通常与肽相互作用，例如，天然蛋白质通常相互作用的底物或信号途径的组成部分。这样的测试通常包括在使得肽与目标分子相互作用的条件下将蛋白质和底物分子合并的步骤，并检测蛋白质和目标分子相互作用的生化结果。描述了可以用来测定肽活性的测试，例如，Ralph，P.J等，(1984)J.Immunol.132：1858或Saiki等，(1981)J.Immunol.127：1044，Steward，W.E.II(1980)The Interferon Systems(干扰素系统)，Springer-Verlag，Vienna和NewYork，Broxmeyer，H.E.等，(1982)Blood 60：595，″Molecular Cloning：A LaboratoryManual″(分子克隆：实验室手册)(第2版)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis编辑，1989，和″Methods in Enzymology：Guide to Molecular Cloning Techniques″(酶学方法：分子克隆技术指导)，AcademicPress，Berger，S.L.和A.R.Kimmel编辑，1987，AKPatra等，Protein Expr Purif，18(2)：p/182-92(2000)，Kodama等，J.Biochem.99：1465-1472(1986)；Stewart等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 90：5209-5213(1993)；(Lombillo等，J.Cell Biol.128：107-115(1995)；(Vale等，Cell 42：39-50(1985)。

实施例

这些实施例中，豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV)用作肽载体，荧光假单胞菌用作表达宿主。CCMV是雀麦花叶病毒科雀麦花叶病毒群的成员。雀麦花叶病毒是25-28nm直径的二十面体病毒，具有四个组成部分，正义，单链RNA基因组。RNA1和RNA2编码复制酶。RNA3编码涉及植物宿主内病毒移动的蛋白质。RNA4(源自RNA3的亚基因组RNA)，即sgRNA4，编码20kDa衣壳(CP)，SEQ ID NO：1。

由sgRNA编码的野生型CCMV衣壳(SEQ ID NO：1)

Met Ser Thr Val Gly Thr Gly Lys Leu Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala

Arg Lys Asn Lys Arg Asn Thr Arg Val Val Gln Pro Val Ile Val Glu Pro Ile Ala

Ser Gly Gln Gly Lys Ala Ile Lys Ala Trp Thr Gly Tyr Ser Val Ser Lys Trp Thr

Ala Ser Cys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Val Thr Ser Ala Ile Thr Ile Ser Leu Pro

Asn Glu Leu Ser Ser Glu Arg Asn Lys Gln Leu Lys Val Gly Arg Val Leu Leu

Trp Leu Gly Leu Leu Pro Ser Val Ser Gly Thr Val Lys Ser Cys Val Thr Glu Thr

Gln Thr Thr Ala Ala Ala Ser Phe Gln Val Ala Leu Ala Val Ala Asp Asn Ser Lys

Asp Val Val Ala Ala Met Tyr Pro Glu Ala Phe Lys Gly Ile Thr Leu Glu Gln Leu

Thr Ala Asp Leu Thr Ile Tyr Leu Tyr Ser Ser Ala Ala Leu Thr Glu Gly Asp Val

Ile Val His Leu Glu Val Glu His Val Arg Pro Thr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Pro

Val Tyr

每个CCMV颗粒含有达约CCMV CP的180个拷贝。SEQ ID NO：21显示了编码CCMV CP的实例DNA序列。

编码CCMV CP的实例DNA序列(SEQ ID NO：21)

atg tct aca gtc gga aca ggg aag tta act cgt gca caa cga agg get gcg gcc cgt aag aac

aag egg aac act cgt gtg gtc caa cct gtt att gta gaaccc atc get tca ggc caa ggc aag get att

aaa gca tgg ace ggt tac age gta tog aag tgg acc gcc tct tgc gcg gcc gcc gaa get aaa gta

acc tog get ata act atctct ctccct aat gag cta tcg tcc gaa agg aac aag cag ctc aag gta ggt

aga gtt tta tta tgg ctt ggg ttg ctt ccc agt gtt agt ggc aca gtg aaa tcc tgt gtt aca gag acg cag

act act get get gcc tcc ttt cag gtg gca tta get gtg gcc gac aac tcg aaa gat gtt gtc get get atg

tac ccc gag gcg ttt aag ggt ata ace ctt gaa caa ctc acc gcg gat tta acg atc tac ttg tac age

agt gcg get ctc act gag ggc gac gtc atc gtg cat ttg gag gtt gag cat gtc aga cct acg ttt gac

gac tct ttc act ccg gtg tat tag

已经解开了CCMV的晶体结构。该结构提供了对颗粒溶解度和动力学关键的衣壳相互作用的更清楚图象，并帮助指导插入位点的合理设计。之前的研究已经证明可以遗传上改变CCMV衣壳来携带异种肽而没有影响它们形成颗粒的能力。已经鉴定了多个合适的插入位点。

图2中用图表表示了用于荧光假单胞菌中衣壳-肽融合VLPs生产的一般策略。总的达约异种肽单位(不管是单个肽或多联体)的180个拷贝可以插入CCMV颗粒中，如果使用CCMV CP中的单个插入位点。所鉴定的CCMV CP中的插入位点迄今为止适应各种长度的肽。此外，可以将多嵌合形式的肽插入插入位点中。此外，同时可以使用多个插入位点以在相同颗粒之内/之上表达相同或不同的肽。肽插入物可以为约200个氨基酸残基或更少的长度，更优选达或约180，更优选达或约150，再更优选达或约120，再更优选达或约100个氨基酸残基长度。优选实施方案中，肽插入物为约5个或更多氨基酸残基的长度。优选实施方案中，肽插入物为约5至约120，更优选约5至约100个氨基酸残基长度。

材料和方法

除非另外指出，将分子生物学领域中已知的标准技术、载体、控制序列组成部分和其他表达系统组成部分用于核酸操纵、转化和表达。这样的标准技术、载体和序列可以发现于，例如：Ausubel等，(编辑)，Current Protocols in MolecularBiology(分子生物学的通用实验方案)(1995)(John Wiley & Sons)；Sambrook，Fritsch，& Maniatis(编辑)，Molecular Cloning(分子克隆)(1989)(Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY)；Berger & Kimmel，Methods in Enzymology 152：Guideto Molecular Cloning Techniques(酶学方法152：分子克隆技术指导)(1987)(Academic Press)和Bukhari等，(编辑)，DNA Insertion Elements，Plasmids andEpisomes(DNA插入序列，质粒和游离基因)(1977)(Cold Spring HarborLaboratory Press，NY)。

质粒图谱构建

使用VECTORNTI(InforMax Inc.，Frederick，MD，USA)构建所有的质粒图谱。

DNA提取

使用Qiagen(Germany)最小、中等和最大试剂盒根据制造商说明来进行大肠杆菌的所有质粒DNA提取。

实验策略

按照以下的程序，用编码嵌合病毒衣壳-目标肽插入融合体的表达质粒转化荧光假单胞菌宿主细胞。将转化的细胞生长至所需密度并诱导来表达嵌合病毒衣壳-肽融合体。然后将细胞裂解并分析它们的内容物。

改进的CCMV-CP DNA的构建来添加工程化的插入位点

通过在阅读框中插入BamHI限制酶识别和分裂位点(gggatcctn)来改进含有CCMV CP编码序列的DNA分子，该位点在Asn129和Ser130之间将三肽(Gly-Ile-Leu)引入了天然CCMV-CP氨基酸序列中。因此，天然CCMV-CP氨基酸序列(SEQ ID NO：1)得到改进形成CCMV129-CP(SEQ ID NO：2)。

存密码子129添加BamHI位点的CCMV-CP(CCMV129-CP)(SEQ ID NO：2)：

Met Ser Thr Val Gly Thr Gly Lys Leu Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala

Arg Lys Asn Lys Arg Asn Thr Arg Val Val Gln Pro Val Ile Val Glu Pro Ile Ala

Ser Gly Gln Gly Lys Ala Ile Lys Ala Trp Thr Gly Tyr Ser Val Ser Lys Trp Thr

Ala Ser Cys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Val Thr Ser Ala Ile Thr Ile Ser Leu Pro

Asn Glu Leu Ser Ser Glu Arg Asn Lys Gln Leu Lys Val Gly Arg Val Leu Leu

Trp Leu Gly Leu Leu Pro Ser Val Ser Gly Thr Val Lys Ser Cys Val Thr Glu Thr

Gln Thr Thr Ala Ala Ala Ser Phe Gln Val Ala Leu Ala Val Ala Asp Asn Gly Ile

Leu Ser Lys Asp Val Val Ala Ala Met Tyr Pro Glu Ala Phe Lys Gly Ile Thr Leu

Glu Gln Leu Thr Ala Asp Leu Thr Ile Tyr Leu Tyr Ser Ser Ala Ala Leu Thr Glu

Gly Asp Val Ile Val His Leu Glu Val Glu His Val Arg Pro Thr Phe Asp Asp Ser

Phe Thr Pro Val Tyr

设计引物CCMV-For(核酸序列：5’-gactagtagg aggaaagaga tgtctacagt cgg-3’(SEQID NO：3))来添加ACTAGT SpeI限制位点并添加保守Shine-Dalgarno序列至CCMV CP编码序列。设计引物CCMV-Rev(核酸序列：5’-ccgctcgat cattactaatacaccgg-3’(SEQ ID NO：4))来添加CTCCAG XhoI限制位点并引入两个终止密码子至CCMV-CP编码序列。在使用CCMV-CP的DNA编码序列的第一个PCR反应中使用这两个引物。

CCMV63-CP DNA的构建来添加工程化的插入位点

将限制位点AscI和NotI工程化至CCMV-CP上(SEQ ID NO：1)来作为插入位点。将AscI(ggcgcgcc)，NotI(gcggccgc)的识别和分裂位点和另外的核苷酸的七肽(Glu-Ala-Trp-Arg-Ala-Ala-Ala)引入CCMV-CP残基Ala 60和Ala 61之间上。因此，将CCMV-CP改进来形成CCMV63-CP。此外，将残基Arg26突变成Cys 26来增加装配的VLPs的稳定性。

pCCMV63-CP的质粒图谱显示于图4中。

CCMV63-CP ORF的序列(SEQ ID NO：22)

atgtctacagtcggaacagggaagttaactcgtgcacaacgaagggctgcggcccgtaagaacaagcggaacacttgtgtg

gtccaacctgttattgtagaacccatcgcttcaggccaaggcaaggctattaaagcatggaccggttacagcgtatcgaagtgg

accgcctcttgtgcggctgccgaagcttggcgcgccgcggccgctaaagtaacctcggctataactatctctctccctaatgag

ctatcgtccgaaaggaacaagcagctcaaggtaggtagagttttattatggcttgggttgcttcccagtgttagtggcacagtga

aatcctgtgttacagagacgcagactactgctgctgcctcctttcaggtggcattagctgtggccgacaactcgaaagatgttgt

cgctgctatgtaccccgaggcgtttaagggtataacccttgaacaactcaccgcggatttaacgatctacttgtacagcagtgcg

gctctcactgagggcgacgtcatcgtgcatttggaggttgagcatgtcagacctacgtttgacgactctttcactccggtgtatta

gtaatga

双插入R26C-CCMV63/129-CP的构建：

将限制位点AscI和NotI工程化至CCMV129-CP上(SEQ ID NO：3)来作为第二个插入位点。将AscI(ggcgcgcc)，NotI(gcggccgc)的识别和分裂位点和引入CCMV 129-CP残基Ala 60和Ala 61之间的七肽(Glu-Ala-Trp-Arg-Ala-Ala-Ala)另外的核苷酸。因此，将CCMV129-CP改进来形成CCMV63/129-CP。此外，将残基Arg 26突变成Cys 26来增加装配VLPs的稳定性来形成R26C-CCMV63/129-CP。pR26C-CCMV63/129-CP的质粒图谱显示于图5中。

R26C-CCMV63/129-CP的序列(SEQ ID NO：23)：

atgtctacagtcggaacagggaagttaactcgtgcacaacgaagggctgcggcccgtaagaacaagcggaacactt

gtgtggtccaacctgttattgtagaacccatcgcttcaggccaaggcaaggctattaaagcatggaccggttacagcgt

atcgaagtggaccgcctcttgtgcggctgccgaagcttggcgcgccgcggccgctaaagtaacctcggctataacta

tctctctccctaatgagctatcgtccgaaaggaacaagcagctcaaggtaggtagagttttattatggcttgggttgcttc

ccagtgttagtggcacagtgaaatcctgtgttacagagacgcagactactgctgctgcctcctttcaggtggcattagct

gtggccgacaacgggatcctgtcgaaagatgttgtcgctgctatgtaccccgaggcgtttaagggtataacccttgaac

aactcaccgcggatttaacgatctacttgtacagcagtgcggctctcactgagggcgacgtcatcgtgcatttggaggt

tgagcatgtcagacctacgtttgacgactctttcactccggtgtattagtaatga

实施例1：假单胞菌中生产CCMV VLPs中的肽PD1

1.A.嵌合CCMV-PD1基因的构建

选择20个氨基酸抗原肽作为CCMV病衣壳毒中的插入片段来表达。抗原肽与CCMV和荧光假单胞菌不相关。从质粒pCP7Pavol DNA扩增编码肽的寡核苷酸，使用引物Parvo-BamHI-F(核酸序列：5’-cgggatcctg gacccggatg-3’(SEQ ID NO：16))和Parvo-BamHI-R(核酸序列：5’-cgggatcccc gggtctcttt c-3’(SEQ ID NO：17))。(这些引物从Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA，USA获得，下文中称为“IdtDNA”)。这些引物从犬细小病毒肽编码序列扩增，同时在两端添加BamHI限制位点，用于在其BamHI限制位点插入CCMV 129编码序列中。

使用PTC225热循环仪(MJ Research，South San Francisco，CA，USA)根据以下实验方案进行PCR反应：

表4.PCR实验方案

反应混合物(100μL总体积)                           热循环步骤

10μL	10X PT HIFI缓冲液*	步骤1	1个循环	2分钟	94℃
						4μL	50mM MgSO4 *			30秒钟	94℃
2μL	10mM dNTP*	步骤2	35个循环	30秒钟	55℃
						0.25ng	每个引物			1分钟	68℃
1-5ng	模板DNA	步骤3	1个循环	10分钟	70℃
						1μL	PT HIFI Taq DNA聚合酶*	步骤4	1个循环	维持	4℃
剩余物	蒸馏去离子H2O(ddH2O)

^*(来自Invitrogen Corp，Carlsbad，CA，USA，下文中称为“Invitrogen”)

将DNA序列插入CCMV129穿梭质粒中，从质粒pESC(从StratageneCorp.，LaJolla，CA，USA获得)构建的质粒，通过将含有CCMV129CP DNA序列的核酸插入其中，使用SpeI和XhoI限制酶。将PD1肽编码核酸在CCMV129 CDS中BamHI限制位点插入，产生CCMV129-PD1穿梭质粒。

还将PD1CDS插入CCMV129CDS中。结果，插入的PD1编码序列是：5’-tgggcc tgc cgc ggc acg gcc ggc tgg ccg ccg tcc ggc tgc acg gcg ccg tcc ggg tcg-3’(SEQ IDNO：18)，编码的PD1肽的氨基酸序列是：Trp Ala Cys Arg Gly Thr Ala Gly Trp ProPro Ser Gly Cys Thr Ala Pro Ser Gly Ser(SEQ ID NO：7)。PD1-编码核苷酸序列与犬细小病毒无关。

1.B.CCMV-PD1表达质粒的构建

用SpeI和XhoI限制酶来消化CCMV129-PD1质粒。通过凝胶纯化来分离含有嵌合CCMV129-PD1 DNA序列的片段。然后在表达质粒的SpeI和XhoI限制位点插入pMYC1803表达质粒中，替代buibui毒素基因，可操作连接tac启动子。参见图1。用SpeI和XhoI限制酶消化来筛选所得到的表达质粒来鉴定插入片段的存在。

1.C.将质粒转化至假单胞菌宿主细胞中

根据以下的实验方案将CCMV129-PD1表达质粒转化至荧光假单胞菌MB214宿主细胞中。将宿主细胞在维持于冰上的小瓶中逐渐解冻。对于每次转化，将1μL纯化的表达质粒DNA加入宿主细胞中并用移液管将所得到的混合物温和涡旋来混合，然后在冰上孵育30分钟。将混合物转移至电穿孔可任意处理的比色皿中(BioRad Gene Pulser Cuvette，0.2cm电极间隙，目录编号165-2086)。将比色皿预放入设定在20Ohms，25μ法拉，2.25kV的Biorad基因脉冲发生器中。将细胞简短地脉冲(约1-2秒钟)。然后立即加入冷LB培养基并将所得到的悬浮液在30℃孵育2小时。然后将细胞放置于LB tet15琼脂培养基(补充四环素的LB培养基)上并在30℃生长过夜。

1.D.CCMMV-PD1构建体的摇瓶表达

从每个平板挑选一个菌落并将挑选的样品接种于带隔板摇瓶中的50mL LB种子培养物中。将液体悬浮液培养物在30℃250rpm振荡生长过夜。然后将10mL每个所得到的种子培养物用于接种带隔板1升摇瓶中的200mL摇瓶培养基(即，酵母提取物和微量元素的盐，柠檬酸钠，和甘油，pH6.8)。加入四环素用于选择。将接种的培养物在30℃250rpm振荡培养过夜并用IPTG诱导CCMV129-PD1嵌合衣壳的表达。

1.E.将细胞培养物裂解物分离成可溶和不可溶部分

然后将每个摇瓶培养物的1mL等份试样离心来沉淀细胞。将细胞沉淀重悬浮于0.75mL的冷50mM Tris-HCl，pH8.2中，含有2mM EDTA。然后加入0.1％体积的10％曲通X-100去污剂，接着加入溶菌酶至0.2mg/mL的终浓度。然后将细胞在冰上孵育2小时，在该时间澄清和粘性的细胞裂解物应当是明显的。

向裂解物中加入1/200体积的1M MgCl2，接着加入1/200体积的2mg/mLDNAseI，然后在冰上孵育1小时，通过这个时间裂解物已经变成粘度更低的液体。然后将处理过的裂解物在台式离心机的最大速度4℃离心30分钟，并将上清液倾析至干净的管子中。倾析的上清液是“可溶”蛋白质部分。然后将剩余的沉淀重悬浮于0.75mL TE缓冲液中(10mM Tris-Cl，pH7.5，1mM EDTA)。重悬浮的沉淀是“不溶”部分。

1.F.可溶和不溶蛋白质部分的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析

然后根据制造商的说明将这些“可溶”和“不溶”部分在NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶(来自Invitrogen，目录NP0323)上电泳，具有1.0mm×15个孔。用Simply BlueSafe Stain(来自Invitrogen，目录LC6060)染色，并用水脱色过夜。使用CCMV IgG(DSMZ登陆号No.AS0011，德国)和WESTERN BREEZE试剂盒(来自Invitrogen，目录WB7105)按照制造商的实验方案来进行蛋白质印迹检测。对于CCMV的产生和尤其是对于嵌合CCMV CP的产生，结果是阳性的(参见图6和7)。

1.G.嵌合VLPs的PEG沉淀

通过裂解分离的摇瓶培养样品，接着PEG(聚乙二醇)处理所得到的细胞裂解物来沉淀嵌合，即重组，VLPs，根据以下的实验方案。将5mL每个摇瓶培养物的等份试样离心来沉淀细胞。将沉淀的细胞重悬浮于0.1M磷酸盐缓冲液中(优选单碱价和二碱价磷酸钾的混合物)，pH7.0，以2体积缓冲液对1体积沉淀的比例。然后将细胞超声处理10秒钟，4次，之间在冰上停留2分钟。在该超声处理的过程中，细胞裂解物有一些澄清。超声处理后，加入溶菌酶至0.5mg/ml的终浓度。使溶菌酶消化在室温进行30分钟。

然后将所得到的处理过的裂解物在4℃15000×G离心5分钟。除去所得到的上清液并测量它们的体积。向每份上清液中，加入PEG 6000至4％的终浓度；接着加入NaCl至0.2M的终浓度，并在冰上孵育1小时或在4℃过夜。然后，将这些在4℃20000×G离心15分钟。然后将沉淀的沉淀重悬浮于1/10初始上清液体积的磷酸盐缓冲液并存储于4℃。

1.H.蔗糖梯度离心

使用磷酸盐缓冲液中的蔗糖(Sigma，目录S-5390)制得蔗糖溶液。从顶部至底部手工倾倒蔗糖梯度10％、20％、30％和40％。然后将重悬浮的沉淀的沉淀在Beckman-Coulter XL 100K Ultracentrifuge中的Beckman-Coulter SW41-Ti转子中离心1小时，没有间断。分开洗脱蔗糖梯度的每1mL级分并进一步离心来获得VLP沉淀。然后将VLP沉淀重悬浮于磷酸盐缓冲液中，在SDS-PAGE凝胶上电泳，并使用CCMV IgG进行蛋白质印迹，按照上述的实验方案。对于VLP形成，蛋白质印迹是阳性的(图8)。每份所得到的VLP制剂的一部分用于电子显微镜检查。

1.I.电子显微镜分析

将VLP样品点在胶棉/碳-或聚醋酸甲基乙烯酯/碳-涂覆的格网上。用2％磷钨酸(PTA)将样品染色并在Philips CM-12TEM透射电子显微镜上(#D769系列)成像，在120kV的加速电压下运行。用MultiScan CCD相机(来自Gatan，Inc.，Pleasanton，CA，USA；模型749，系列#971119010)数码记录图象。VLPs的形成得到了检验(图9)。

实施例2：在假单胞菌中的CCMV VLPs中生产D2A21 AMP三聚物并从其收集AMP

2.A.D2A21插入片段的合成

从质粒pET-(D2A21)3扩增编码抗微生物肽(“AMP”)三聚物(“D2A21三聚物”，即三个D2A21单嵌合的AMPs)的核酸序列，使用引物D2A21-BamHI-F(核酸序列：5’-cgggatcctg ggacagcaaa tgggtcgcga tccg-3’(SEQ ID NO：5))和D2A21-BamHI-R(核酸序列：5’-cgggatcccg tcgacggagc tcgaattcgg atcacc-3’(SEQ IDNO：6))。根据以上实施例1.A.中所述的相同实验方案来进行PCR反应。

将所得到的扩增的插入片段在每一端含有添加的BamHI限制位点，用于在工程化的BamHI位点将D2A21三聚物CDS插入CCMV129 CDS中。D2A21三聚物的核酸编码序列和氨基酸序列各自显示于SEQ ID NO：19和20中。

编码D2A21三聚物的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)：

5′-ttc gcg aag aag ttt gcg aaa aag ttc aag aaa ttt gcc aag aag ttt gcc aag ttc gca ttc gcg

ttc ggc gat ccg ttc gcg aag aag ttt gcg aaa aag ttc aag aaa ttt gcc aag aag ttt gcc aag ttc

gca ttc gcg ttc ggc gat ccg ttc gcg aag aag ttt gcg aaa aag ttc aag aaa ttt gcc aag aag ttt

gcc aag ttcgca ttc gcg ttc ggt-3′

D2A21三聚物的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)：

Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys

Phe Ala Phe Ala Phe Gly Asp Pro Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Lys

Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Phe Ala Phe Ala Phe Gly Asp Pro Phe Ala

Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Phe Ala

Phe Ala Phe Gly

通过二肽Asp-Pro酸不稳定切割位点CDS来分离含有三个AMP单体CDSs的三聚物CDSs，如图3中所示的。完整三聚物CDS也在每端通过二肽Asp-Pro酸不稳定位点CDS接壤。用BamHI限制酶来消化扩增的插入片段来形成粘性末端，用于在CCMV129CDS内的BamHI位点克隆至pESC-CCMV129BamHI穿梭质粒中。用SpeI和XhoI限制酶来消化所得到的穿梭质粒。通过凝胶纯化来分离所需的嵌合RBS/CDS片段。

2.B.表达质粒构建体

然后将所得到的嵌合CCMV129-(D2A21)3多核苷酸插入pMYC1803表达质粒中来替代buibui编码序列，可操作地连接tac启动子。用SpeI和XhoI限制消化来筛选所得到表达质粒的插入片段的存在。使用以上实施例1B中所述的相同实验方案。

2.C.转化和表达

将所得到的表达质粒转化进荧光假单胞菌MB214中，使用以上实施例1C中所述的实验方案。挑选平板克隆的转化子并转移至摇瓶用于表达，按照以上实施

例1.D.中所述的相同实验方案。

2.D.蛋白质和VLP的收集和分析

将摇瓶培养的细胞裂解并分级，按照实施例1.E.的程序。通过实施例1.F.中所述的SDS-PAE和蛋白质印迹来分析所得到的级分。通过PEG沉淀和蔗糖梯度离心来收集嵌合VLPs，并通过电子显微镜来分析，如以上实施例1.G.中所述的，通过1.I.验证了嵌合CCMV VLP的装配。对于CCMV的产生，结果是阳性的。嵌合CP表达的SDS-PAGE显示了96个氨基酸的插入片段(图10)，通过蔗糖梯度分级后蛋白质印迹来证实，表明了VLP形成(图11)，和通过电子显微镜照片来证实VLP形成(图12)。

2.E.D2A21抗微生物肽产生的分析

如下将可溶和不溶蛋白质部分进一步处理来表征嵌合VLPs中产生的D2A21肽。

2.E.1.D2A21的酸分裂

将不溶部分溶解于15％v/v含水乙腈和约40-50％v/v甲酸中；将可溶部分重悬浮于约45-50％甲酸中。然后将样品在60℃孵育24小时来进行酸分裂。通过冷冻至-20℃来停止反应，在该温度将处理的样品保存直至HPLV分析。

2.E.2.通过HPLC分析D2A21

将可溶部分通过0.22μm的膜过滤；将不溶部分离心来沉淀细胞碎片，然后通过0.22μm的膜过滤。将50μL每个样品加入950μL 25％含水乙腈中。将250μL体积的每个样品，含有D2A21内在对照肽(总的10μg对照肽)，注射至安置于Beckman高性能液相色谱(HPLC)系统中的6.4mm内径的VYDAC 250mm反相C18柱上(从Grace Vydac，Hesperia，CA，USA获得)。使用25％乙腈/0.1％三氟乙酸(TFA)至75％乙腈/0.01％TFA的含水梯度在30分钟内进行洗脱。将洗出物逐滴收集成色谱级分。只在源自含有工程化肽的VLPs样品中而不是在源自非工程化VLPs的样品中观察到合适的肽峰(图13)。

2.E.3D2A21肽的质谱分析

使用Micromass M@LDI线性基质辅助激光吸收离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱系统(来自Micromass UK Ltd，Manchester，UK)来进行肽对照和色谱级分的质谱分析。在MS分析之前，通过离心蒸发将HPLC级分浓缩，使用Speed Vac系统(从Thermo Savant获得，Milford，MA，USA；型号250DDA)。结果证明D2A21 AMPs精确的产生，且释放的肽是D2A21肽(图14)。这些结果证明使用VLPs融合体用于假单胞菌中的肽表达有效避免了其他通常的宿主细胞毒性。在VLP形式(总的达96个氨基酸)中已经证明(A)嵌合VLPs的产生和已经证明(B)肽多体的产生。因此，该实施例具有：

(1)测试荧光假单胞菌支持CCMV CP表达和颗粒装配的能力，

(2)通过简单方法(PEG沉淀)来纯化嵌合的VLPs，

(3)通过之前测试过的方法(酸水解)来分裂目标肽和

(4)验证了肽的同一性和完整性。

实施例3：在假单胞菌中CCMV VLPs中生产炭疽热抗原

3.A.PA 肽插入片段的合成

在CCMV VLPs中独立地表达四个不同的炭疽芽孢杆菌保护性抗原(“PA”)肽(PA1-PA4)。通过合成寡核苷酸的SOE(剪接重叠延伸)来合成编码PA1-PA4的核酸。所得到的核酸含有BamHI识别位点端。这些PA肽的核酸编码序列和氨基酸序列各自如下：1)对于PA1，SEQ ID NO：8和9；2)对于PA2，SEQ ID NO：10和11；3)对于PA3，SEQ ID NO：12和13；和4)对于PA4，SEQ ID NO：14和15。用BamHI消化所得到的核酸来形成粘性末端，用于克隆至穿梭载体中。将每个所得到的PA插入片段在CCMV129 CDS的BamHI位点克隆至pSEC-CCMV129BamHI穿梭质粒中。用SpeI和XhoI限制酶来消化每个所得到的穿梭质粒。通过凝胶纯化来分离每个所需的嵌合CCMV129-PA编码片段。

PA1

核酸序列(SEQ ID NO：8)	5’-agt aat tct cgt aag aaa cgt tct acc tct gct ggc cct accgtg cct gat cgt gat aat gat ggc att cct gat-3’
		氨基酸序列(SEQ ID NO：9)	Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly ProThr Val Pro Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp

PA2

核酸序列(SEQ ID NO：10)	5’-agt cct gaa gct cgt cat cct ctc gtg gct gcg tat cct attgtg cat gtt gat atg gaa aat att atc ctc tct-3’
		氨基酸序列	Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro

(SEQ ID NO：11)

Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser

PA3

核酸序列(SEQ ID NO：12)	5’-cgt att att ttc aat ggc aaa gat ctc aat ctc gtg gaa cgtcgt att gct gct gtg aat cct tct gat cct ctc-3’
		氨基酸序列(SEQ ID NO：13)	Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val GluArg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu

PA4

核酸序列(SEQ ID NO：14)	5’-cgt caa gat ggc aaa acc ttc att gat ttc aaa aag tat aatgat aaa ctc cct ctc tat att tct aat cct aat-3’
		氨基酸序列(SEQ ID NO：15)	Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys TyrAsn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn

3.B.表达质粒构建体

然后将每个所得到的嵌合CCMV129-PA寡核苷酸插入pMYC1803表达质粒中替代buibui编码序列，可操作地连接tac启动子。用SpeI和XhoI限制消化来筛选所得到表达质粒的插入片段的存在。使用以上实施例1B中所述的相同实验方案。

3.C.转化和表达

将所得到的表达质粒转化至荧光假单胞菌MB214中，使用以上实施例1C中所述的实验方案。挑选平板菌落的转化子并转移至摇瓶用于表达，按照以上实施

例1.D.所述的相同实验方案。

3.D.蛋白质和VLPs的的集和分析

按照实施例1.E.的程序将摇瓶培养的细胞裂解并分级。如实施例1.F.中所述的通过SDS-PAE和蛋白质印迹来分析所得到的级分。对于CCMV的产生，结果是阳性的。

对于嵌合CCMV CP产生，结果是阳性的(参见图15)。如实施例1.G.和1.H.中所述的通过PEG沉淀和蔗糖梯度分级来收集VLPs。如1.H.所述的进行蔗糖梯度级分的蛋白质印迹。对于VLPs生产，结果是阳性的(图16)。

实施例4：通过假单胞菌中CCMV VLPs中的单和双插入片段来生产PBF20 AMP单体的

按照实施例1、2和3中所列的程序。将编码PBF20单体肽的核酸(编码AMP，包括氨基酸序列Asp Pro Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys PheAla Lys Lys Phe Ala Lys Asp Pro(SEQ ID NO：24)的氨基酸序列3-22)和含有SEQID NO：24的氨基酸序列1-2和23-24的酸分裂位点各自在AscI/NotI位点插入CCMV63-CP中，在BamHI位点插入CCMV129-CP中。同时还将肽在AscI/NotI位点和BamHI位点插入R26C-CCMV63/129-CP中。

将每个所得到的嵌合寡核苷酸插入pMYC 1803表达质粒中替代buibui编码序列，可操作地连接tac启动子。用SpeI和XhoI限制消化来筛选所得到表达质粒的插入体的存在，并转化至荧光假单胞菌MB214中，使用以上实施例1C中所述的实验方案。挑选平板菌落的转化子并转移至摇瓶用于表达，按照以上实施例1.D.所述的相同实验方案。

将摇瓶培养的细胞裂解并分级，按照实施例1.E.的程序。如实施例1.F.中所述的通过SDS-PAE和蛋白质印迹来分析所得到的级分。对于VLPs的生产，结果是阳性的。

图17中显示了SDS-PAGE，表明在荧光假单胞菌中工程化嵌合CCMV63-CP的表达来表达酸水解位点来分离20个氨基酸的抗微生物肽PBF20。与非工程化的野生型(wt)CCMV CP相比，嵌合CCMV63-CP-PBF20具有较低的迁移率。图18中显示了源自CCMV63-CP的嵌合CCMV VLPs的电子显微镜(EM)图象和呈现了通过酸水解位点分离的20个氨基酸的抗微生物肽PBF20。

图19中显示了SDS-PAGE，表明在荧光假单胞菌中工程化嵌合CCMV129-CP的表达来表达酸水解位点来分离20个氨基酸的抗微生物肽PBF20，。与非工程化的野生型(wt)CCMV CP相比，嵌合CCMV129-CP-PBF20具有较低的迁移率。图20中显示了源自CCMV129-CP的嵌合CCMV VLPs的电子显微镜(EM)图象和呈现了通过酸水解位点分离的20个氨基酸的抗微生物肽PBF20。

图21中显示了SDS-PAGE，表明在荧光假单胞菌中工程化嵌合CCMV63/129-CP的表达来表达在CP中两个不同的插入位点的酸水解位点来分离的20个氨基酸的抗微生物肽PBF2。与工程化来表达相同肽单个插入片段(CP+1×20AA)的衣壳相比，含有双插入片段(CP+2×20AA)的嵌合CP具有在SDS-PAGE凝胶上的较低的迁移率。图22显示了源自CCMV63/129-CP的呈现了通过每个衣壳两个插入位点的酸水解位点分离的20个氨基酸的抗微生物肽PBF20的嵌合CCMV VLPs的电子显微镜(EM)图象。发现每个VLPs含有达每个颗粒360个PBF20单体。

实施例5：在假单胞菌中的CCMV VLPs中生产东方马脑炎病毒(EEE)抗原

5.A.EEE肽插入片段的合成

在CCMVVLPs中独立地表达两个不同的EEE肽(EEE-1和EEE-2)。

EEE-1肽序列：

DLDTHFTQYKLARPYIADCPNCGHS(SEQ ID NO：25)

EEE-1核酶序列：

5′gacctggacacccacttcacccagtacaagctggcccgcccgcccgtacatcgccgactgcccgaactgcggccacagc-3′(SEQ ID NO：26)

EEE-2肽序列：

GRLPRGEGDTFKGKLHVPFVPVKAK(SEQ ID NO：27)

EEE-2核酸序列：

5′ggccgcctgccgcgcggcgaaggcgacaccttcaagggcaagctgcacgtgccgttcgtgccggtgaaggccaag-3′(SEQ ID NO：28)

通过合成寡核苷酸的SOE合成编码EEE-1和EEE-2的核酸。所得到的核酸含有BamHI识别位点端。用于插入片段合成的正义和反义寡核苷酸引物包括BamHI限制位点，且如下：

EEE1.S：

5′-cgg ggatcc tgg acc tgg aca ccc act tca ccc agt aca agc tggccc gcc cgtac-3′(SEQID NO：29)

EEE1.AS：

5′-cgc agg atc ccg ctg tgg ccg cag ttc ggg cag tcg gcg atg tac ggg cgg gccagc-3′(SEQID NO：30)

EEE2.S：

5′-cgg ggatcc tgg gcc gcc tgc cgc gcg gcg aag gcg aca cct tca agg gcaagc-3′(SEQIDNO：31)

EEE2.AS：

5′-cgc agg atc ccc ttg gcc ttc acc ggc acg aac ggc acg tgc agc ttg ccc ttg-3′(SEQIDNO：32)

用BamHI消化所得到的核酸来形成粘性末端，用于克隆至pESC-CCMV129BamHI穿梭质粒中。

将每个所得到的EEE插入片段在CCMV129 CDS的BamHI位点克隆至pESC-CCMV129BamHI穿梭质粒中。用SpeI和XhoI限制酶消化每个所得到的穿梭质粒。通过凝胶纯化来分离每个所需的嵌合CCMV-129-EEE-编码片段。

5.B.表达质粒构建体

然后将每个所得到的嵌合CCMV129-EEE多核苷酸片段插入用SpeI和XhoI的限制位点pMYC1803表达质粒中替代buibui编码序列，可操作地连接tac启动子。用SpeI和XhoI限制消化来筛选所得到表达质粒的插入体的存在。使用以上实施例1B中所述的相同实验方案。

5.C.转化和表达

使用以上实施例1C中所述的实验方案将所得到的表达质粒转化至荧光假单胞菌MB214中。以上实施例1.D.所述的相同实验方案用于表达呈现EEE抗原的嵌合VLPs。

5.D.蛋白质和VLP的收集和分析

按照实施例1.E.的程序将摇瓶培养的细胞裂解并分级。如实施例1.F.中所述的通过SDS-PAE和蛋白质印迹来分析所得到的级分。

Claims (85)

1.含有第一个核酸构建体的假单胞菌细胞，该构建体包括：

a)至少一个编码二十面体病毒衣壳的核酸序列；和

b)至少一个编码重组肽的核酸序列。

2.权利要求1的细胞，其中假单胞菌是荧光假单胞菌。

3.权利要求1的细胞，其中该二十面体病毒衣壳来自没有呈现对假单胞菌细胞天然向性的病毒。

4.权利要求3的细胞，其中该二十面体病毒衣壳来自植物二十面体病毒。

5.权利要求4的细胞，其中该植物二十面体病毒选自豇豆退绿斑驳病毒，豇豆花叶病毒病毒或苜蓿花叶病毒。

6.权利要求1的细胞，其中该核酸编码至少两个不同的二十面体病毒衣壳。

7.权利要求6的细胞，其中至少一个二十面体病毒来自植物二十面体病毒。

8.权利要求1的细胞，其中编码重组肽的该核酸含有多于一个单体。

9.权利要求8的细胞，其中编码重组肽的该核酸含有至少三个单体。

10.权利要求8的细胞，其中该单体可操作地连接成多联体。

11.权利要求1的细胞，其中该融合二十面体病毒衣壳的该重组肽是治疗肽。

12.权利要求1的细胞，其中该重组肽是抗原。

13.权利要求12的细胞，其中该抗原选自犬细小病毒抗原，炭疽芽孢杆菌抗原或东方马脑炎病毒抗原。

14.权利要求1的细胞，其中该重组肽是抗微生物肽。

15.权利要求14的细胞，其中该抗微生物肽选自D2A21和PBF20。

16.权利要求1的细胞，其中该重组肽是至少7个氨基酸长。

17.权利要求16的细胞，其中该重组肽是至少15个氨基酸长。

18.权利要求1的细胞，其中该细胞进一步包括编码野生型二十面体病毒蛋白的第二个核酸。

19.权利要求1的细胞，其中该细胞进一步包括第二个核酸，该核酸包括：

c)至少一个编码第二个二十面体病毒衣壳的核酸序列；和

d)至少一个编码第二个重组肽的核酸序列。

20.权利要求19的细胞，其中第一个和第二个二十面体病毒衣壳是不同的。

21.包括融合肽的假单胞菌细胞，其中该融合肽包括：

a)至少一个二十面体病毒衣壳；和

b)至少一个重组肽。

22.权利要求21的细胞，其中该融合肽在细胞内装配成病毒样颗粒。

23.权利要求21的细胞，其中该融合肽在细胞内装配成可溶性笼形结构。

24.权利要求22的细胞，其中该病毒样颗粒不能够复制。

25.权利要求22的细胞，其中该病毒样颗粒不能够感染细胞。

26.权利要求21的细胞，其中将该重组肽插入该二十面体衣壳的至少一个表面环中。

27.权利要求21的细胞，其中将该重组肽插入该二十面体衣壳的多于一个表面环中。

28.权利要求21的细胞，其中该融合肽包括多于一个融合二十面体病毒衣壳的重组肽。

29.权利要求28的细胞，其中该重组肽是不同的。

30.权利要求21的细胞，其中该重组肽是治疗肽。

31.权利要求21的细胞，其中该重组肽是抗原。

32.权利要求31的细胞，其中该抗原选自犬细小病毒抗原，炭疽芽孢杆菌抗原或东方马脑炎病毒抗原。

33.权利要求22的细胞，其中该病毒样颗粒能够用作疫苗。

34.权利要求21的细胞，其中该重组肽是抗微生物肽。

35.权利要求34的细胞，其中该抗微生物肽选自D2A21或PBF20。

36.权利要求21的细胞，其中该重组肽是至少7个氨基酸长。

37.权利要求21的细胞，其中该重组肽是至少15个氨基酸长。

38.权利要求21的细胞，其中该细胞进一步包括野生型二十面体病毒衣壳。

39.权利要求21的细胞，其中该细胞进一步包括第二个融合肽，该融合肽包括：

a)至少第二个二十面体病毒衣壳；和

b)至少第二个重组肽。

40.权利要求39的细胞，其中第二个融合肽在细胞内装配成病毒样颗粒或可溶性笼形结构。

41.权利要求39的细胞，其中该第二个融合肽包括与第一个融合肽不同的氨基酸序列。

42.权利要求21的细胞，其中通过含有连接物的氨基酸序列连接病毒衣壳和重组肽。

43.权利要求42的细胞，其中该连接物氨基酸序列包括可分裂序列。

44.权利要求21的细胞，其中该假单胞菌是荧光假单胞菌。

45.核酸构建体，包括编码二十面体病毒衣壳的第一个核酸序列，该核酸序列可操作地连接编码对微生物细胞毒性的肽的第二个核酸序列。

46.权利要求45的构建体，其中该二十面体病毒衣壳来自植物二十面体病毒。

47.权利要求46的构建体，其中该植物二十面体病毒选自豇豆退绿斑驳病毒，豇豆花叶病毒病毒或苜蓿花叶病毒。

48.权利要求46的构建体，其中该毒性肽包括多于一个肽单体序列。

49.权利要求46的构建体，其中该毒性肽包括至少三个肽单体序列。

50.权利要求48的构建体，其中该单体可操作地连接成多联体。

51.权利要求45的构建体，其中该可操作连接是在第一个编码衣壳的核酸序列的内部。

52.权利要求45的构建体，其中编码毒性肽的该第二个核酸序列在编码至少一个衣壳表面环的位置可操作地连接衣壳序列。

53.权利要求45的构建体，其中编码多于一个毒性肽序列的构建体在编码多于一个衣壳表面环的位置可操作地连接衣壳序列。

54.权利要求45的构建体，其中该重组肽是抗微生物肽。

55.权利要求54的构建体，其中该抗微生物肽选自D2A21或PBF20。

56.生产重组肽的方法，包括：

a)提供假单胞菌细胞；

b)提供编码融合肽的核酸，其中该融合肽包括至少一个重组肽和至少一个二十面体衣壳；

c)在假单胞菌细胞中表达核酸，其中该融合肽装配成病毒样颗粒；和

d)分离该病毒样颗粒。

57.权利要求56的方法，进一步包括：

e)分裂融合肽来从二十面体病毒衣壳分离重组肽。

58.权利要求56的方法，其中假单胞菌是荧光假单胞菌。

59.权利要求56的方法，其中该病毒样颗粒不能够复制。

60.权利要求56的方法，其中该病毒样颗粒不能够感染细胞。

61.权利要求56的方法，其中该二十面体病毒衣壳来自没有呈现对假单胞菌细胞天然向性的病毒。

62.权利要求56的方法，其中该二十面体病毒衣壳来自植物二十面体病毒。

63.权利要求62的方法，其中该植物二十面体病毒选自豇豆退绿斑驳病毒，豇豆花叶病毒病毒或苜蓿花叶病毒。

64.权利要求56的方法，其中该核酸包括编码至少两个不同二十面体病毒衣壳的核酸序列。

65.权利要求64的方法，其中至少一个二十面体病毒衣壳来自植物二十面体病毒。

66.权利要求56的方法，其中该重组肽包括至少一个肽单体。

67.权利要求56的方法，其中该重组肽包括至少三个单体。

68.权利要求66的方法，其中该单体可操作地连接成多联体。

69.权利要求56的方法，其中该重组肽可操作地连接至少一个该二十面体衣壳的表面环。

70.权利要求69的方法，其中重组肽可操作地连接多于一个该二十面体衣壳的表面环。

71.权利要求56的方法，其中该融合肽包括多于一个重组肽，重组肽是不同的。

72.权利要求56的方法，其中该重组肽是治疗肽。

73.权利要求56的方法，其中该重组肽是抗原。

74.权利要求73的方法，其中该抗原选自犬细小病毒抗原，炭疽芽孢杆菌抗原或东方马脑炎病毒抗原。

75.权利要求56的方法，其中该病毒样颗粒能够用作疫苗。

76.权利要求56的方法，其中该重组肽是抗微生物肽。

77.权利要求76的方法，其中该抗微生物肽选自D2A21或PBF20。

78.权利要求56的方法，其中该重组肽是至少7个氨基酸长。

79.权利要求56的方法，其中该重组肽是至少15个氨基酸长。

80.权利要求56的方法，其中该细胞进一步包括第二个编码野生型二十面体病毒衣壳的核酸。

81.权利要求56的方法，其中该细胞进一步包括编码第二个融合肽的第二个核酸，该第二个融合肽包括：

a)至少第二个二十面体病毒衣壳；和

b)至少第二个重组肽。

82.权利要求81的方法，包括在细胞中表达第二个核酸。

83.权利要求81的方法，其中该第二个融合肽在细胞内装配成病毒样颗粒和可溶性笼形结构。

84.权利要求81的方法，其中该第一个二十面体病毒衣壳包括第一个氨基酸序列，和第二个二十面体病毒衣壳包括第二个氨基酸序列，且第一个和第二个衣壳序列不同。

85.权利要求81的方法，其中该第一个重组肽包括第一个氨基酸序列，和第二个重组肽包括第二个氨基酸序列，且第一个和第二个重组肽序列不同。

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