KR101038266B1

KR101038266B1 - 개 렙토스피라 예방을 위한 재조합 항원 단백질 및 그제조방법

Info

Publication number: KR101038266B1
Application number: KR1020080073124A
Authority: KR
Inventors: 이홍원; 안정오; 정준기; 김천석; 이은교; 홍지연; 이혁원; 윤인중; 유성식
Original assignee: 주식회사 중앙백신연구소; 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2011-06-01
Also published as: KR20100011770A

Abstract

본 발명은 개 렙토스피라 예방을 위한 재조합 항원 단백질 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 렙토스피라 유래의 외막단백질에 MBP가 결합된 융합단백질을 대장균에서 발현시켜 개 렙토스피라증을 검출하기 위한 진단시약 및 예방용 백신, 또는 개 사료첨가제 등에 적용하는 개 렙토스피라 예방을 위한 재조합 항원 단백질 및 그 제조방법에 관한 것이다.

개 렙토스피라, 서브유닛 백신, OmpL1, LipL41, MBP

Description

개 렙토스피라 예방을 위한 재조합 항원 단백질 및 그 제조방법{Recombinant antigen against the pathogenicity of canine Leptospira and method for preparing the same}

시판중인 개 렙토스피라증 예방용 백신 제품은 불활성의 렙토스피라 캐니콜라(L. canicola)와 렙토스피라 익테로헤모지에(Leptospira icterohaemorrhagiae)의 전세포(whole cell) 세균백신(bacterin)으로 구성된다. 이러한 전세포 세균백신은 세포단백질-관련 백신접종 후 반응(post-vaccination reaction)을 유발시킬 수 있다. 따라서, 중요한 항원을 이용하는 차세대 서브유닛 백신(subunit vaccine) 개발 이 이루어지고 있다. 이러한 연구로 개 렙토스피라증 예방을 위한 항원으로 그 중요성이 인식되고 있는 렙토스피라 유래의 외막 단백질들(outermembrane proteins)을 이용한 백신개발이 있다. 렙토스피라 유래의 외막단백질 중 포린(porin)기능을 하는 OmpL1(Haake, D.A et al., 1993. Journal of Bacteriology 175, 4225-4234.)과 지질단백질(lipoprotein)로서 LipL41(Shang, E.S. et al., 1996. Infection and Immunity 64, 2322-2330)이 가장 중요한 항원으로서 인식되고 있다(Haake, D.A. et al., 1999, Infection and immunity, 67(12):6572-6582). 그러나, 이들 단백질은 렙토스피라 균주로부터 분리가 어려워 유전자 재조합을 통해 다른 생물체로부터 생산 및 분리하는 연구가 진행되어 왔다(Dey, S. et al., 2004. Veterinary Microbiology 103, 99-106; Flannery, B. et al., , 2001. Journal Clinical Microbiology 39, 3303-3310; Haake, D.A et al .., 1993. Journal of Bacteriology 175, 4225-4234; Shang, E.S. et al., 1996. Infection and Immunity 64, 2322-2330.).

하지만, 이러한 노력에도 OmpL1과 LipL41은 다른 생물체로부터 아주 적은 양으로 발현되거나, 활성화를 위한 복잡한 공정을 요하는 불용성형태로 발현되고 있다(Shang, E. S. et al., 1995. Infect . Immun. 63:317-3181; Shang, E. S. et al., 1996. Infect . Immun. 64:2322-2330; Haake, D.A. et al ., 1999, Infection and immunity, 67(12):6572-6582).

본 발명의 목적은 렙토스피라증 예방을 위한 서브유닛 백신 개발을 위한 항원으로, 외막독소단백질인 OmpL1과 LipL41 단백질을, 숙주세포로 대장균을 사용하여 활성형 형태로 대량생산할 수 있는 재조합 항원 단백질 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 항원 단백질을 이용한 개의 렙토스피라증을 검출할 수 있는 진단키트 또는 예방용 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 항원 단백질, 이들을 발현하는 숙주세포 또는 이의 파쇄물을 포함하여 면역적 효과를 높일 수 있는 개 사료첨가제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

렙토스피라(Leptospira)의 외막단백질; 및

MBP(Maltose-binding Protein)를 포함하는 재조합 항원 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한

렙토스피라(Leptospira)의 외막단백질 코딩 서열; 및

MBP(Maltose-binding Protein) 코딩 서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 제 공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 숙주세포를 배지에서 배양하고, 상기 배양물로부터 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 OmpL1 또는 LipL41 항원 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 렙토스피라의 재조합 항원 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 항원 단백질을 포함하는 개의 렙토스피라증을 검출할 수 있는 진단키트를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 개 렙토스피라증 예방용 백신조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 항원 단백질, 상기 재조합 항원 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포 및 이의 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 개 사료첨가제를 제공한다.

본 발명은 개 렙토스피라증 예방을 위한 서브유닛 백신을 위한 항원으로서 렙토스피라 유래의 OmpL1과 LipL41의 활성형 형태를 효과적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하고, 병원성 균주인 렙토스피라에 의해 유발되는 치명적인 개의 렙토스피라증을 진단 및 예방할 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은

렙토스피라(Leptospira)의 외막단백질; 및

MBP(Maltose-binding Protein)를 포함하는 재조합 항원 단백질에 관한 것이다.

상기 렙토스피라의 외막단백질로는 특별히 제한하지는 않으나, 포린(porin) 기능을 하는 OmpL1 또는 지질단백질인 LipL41을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 OmpL1 또는 LipL41 단백질은 렙토스피라 유래의 공지의 아미노산 서열이라면 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 Genbank No. AY622661, 또는 AY622673로 등록된 서열을 사용하는 것이 좋다. 상기 서열은 외막단백질의 숙주세포에서의 발현을 위한 분비서열을 자체적으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 MBP(Maltose-binding Protein)는 말토덱스트린(Maltodextrin)을 이동시 키고 분해하는데 관여하는 단백질로 활성형 재조합 항원 단백질의 발현을 위해 결합될 수 있으며, 상기 재조합 항원 단백질의 세포파쇄물에서 뿐만 아니라 수용성 단백질 형태로의 발현을 가능하게 할 수 있다. 바람직하게는 상기 외막단백질의 N-말단에 연결되는 것이 좋다.

상기 MBP는 공지의 MBP 서열이라면 특별히 제한하지는 않으며, 예를 들어, Genbank No. EF431917 에 등록된 서열을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한

렙토스피라(Leptospira)의 외막단백질 코딩 서열; 및

MBP(Maltose-binding Protein) 코딩 서열을 포함하는 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

상기 렙토스피라의 외막단백질 코딩 서열로는 특별히 제한하지는 않으나, 포린(porin) 기능을 하는 OmpL1 또는 지질단백질인 LipL41을 코딩하는 서열을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 OmpL1 또는 LipL41 단백질의 코딩 서열은 렙토스피라 유래의 공지의 핵산 서열이라면 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 Genbank No. AY622661, 또는 AY622673로 등록된 서열을 사용하는 것이 좋다. 상기 서열은 외막단백질의 숙주세포에서의 발현을 위한 분비서열을 자체적으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 MBP(Maltose-binding Protein)를 코딩하는 서열은 상기 외막단백질 코 딩 서열의 N-말단에 연결될 수 있으며, 상기 MBP 코딩 서열은 공지의 MBP 핵산 서열이라면 특별히 제한하지는 않으며, 예를 들어, Genbank No. EF431917 에 등록된 서열을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 발현벡터는 재조합 항원 단백질을 발현시킬 수 있도록 통상의 프로모터 서열, 번역개시서열 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 재조합 항원 단백질의 정제가 용이하도록 단백질의 C-말단에 히스티딘이 융합되는 벡터를 설계할 수 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 재조합 발현벡터는 렙토스피라의 외막단백질 및 MBP 코딩 서열을 포함하는 도 1b(OmpL1 코딩 서열 포함) 또는 도 2b(LipL41 코딩 서열 포함)에 기재된 개열지도를 갖는 pKPM-MBP-OmpL1-H6, 또는 pKPM-MBP-LipL41-H6인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 렙토스피라의 재조합 항원 단백질 코딩 서열을 발현벡터에 도입하는 방법은 당업자 수준에서 이해될 수 있는 범위 내에서 사용가능한 기술이라면 특별히 제한하지는 않으나, 다음의 방법에 따라 제조하는 것이 바람직하다.

렙토스피라 캐니콜라(Leptospira canicola)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, OmpL1 유전자를 코딩하고 그 자체의 분비서열을 함유한 핵산 서열(GenBank No. AY622661)의 말단에 상보적인 염기서열을 포함하도록 프라이머(서열번호 1 및 2)를 제작하여 PCR을 통해 그 자체의 분비서열을 함유한 OmpL1을 코딩하는 유전자를 증 폭한다.

상기 증폭된 PCR 산물을 유전자 클로닝벡터, 바람직하게는 pGEM-T에 삽입하여 재조합 벡터, pGEM-OmpL1를 제조한다.

숙주세포, 바람직하게는 대장균에서 OmpL1 단백질의 발현을 위해, 대장균 발현벡터 pET-28(b)+ 벡터와 상기 pGEM-OmpL1 벡터를 재조합시켜 OmpL1의 C-말단에는 6개의 히스티딘이 첨가되고, N-말단에는 자체 분비서열이 결합되어 있는 pKPM-OmpL1 재조합 발현벡터(도 1a)를 제조한다.

MBP를 결합하기 위해, 공지의 MBP 유전자의 말단에 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머(서열번호 7 및 8)를 제작하고, PCR을 통해 MBP 코딩 유전자를 증폭한다.

상기 pKPM-OmpL1 재조합 발현벡터를 주형으로 하고, 프라이머(서열번호 5 및 2)를 이용하여 OmpL1의 N-말단에 엔테로키나아제(enterokinase)가 작동하는 유전자를 포함한 OmpL1 유전자를 증폭한다.

상기 MBP 및 OmpL1 유전자들을 대장균 발현벡터 pET-28(b)+에 삽입하여 MBP가 OmpL1의 N-말단에 결합되고, 엔테로키나아제 사이트가 상기 MBP와 OmpL1 사이에 첨가되고, OmpL1의 C-말단에 6개의 히스티딘이 첨가되어 있는, 재조합 발현벡터 pKPM-MBP-OmpL1-H6(도 1b)를 제조한다.

또한, 렙토스피라 캐니콜라(Leptospira canicola)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, LipL41 유전자를 코딩하고 그 자체의 분비서열을 함유한 핵산 서열(GenBank No. AY622673)의 말단에 상보적인 염기서열을 포함하도록 프라이머(서열번호 3 및 4)를 제작하여 PCR을 통해 그 자체의 분비서열을 함유한 LipL41을 코딩하는 유전자를 증폭한다.

상기 증폭된 PCR 산물을 유전자 클로닝벡터, 바람직하게는 pGEM-T에 삽입하여 재조합 벡터, pGEM-LipL41를 제조한다.

숙주세포, 바람직하게는 대장균에서 LipL41 단백질의 발현을 위해, 대장균 발현벡터 pET-28(b)+ 벡터와 상기 LipL41 벡터를 재조합시켜 LipL41의 C-말단에는 6개의 히스티딘이 첨가되고, N-말단에는 자체 분비서열이 결합되어 있는 pKPM-LipL41 재조합 발현벡터(도 2a)를 제조한다.

상기 pKPM-LipL41 재조합 발현벡터를 주형으로 하고, 프라이머(서열번호 6 및 4)를 이용하여 LipL41의 N-말단에 엔테로키나아제(enterokinase)가 작동하는 유전자를 포함한 LipL41 유전자를 증폭한다.

상기 MBP 및 LipL41 유전자들을 대장균 발현벡터 pET-28(b)+에 삽입하여 MBP가 LipL41의 N-말단에 결합되고, 엔테로키나아제 사이트가 상기 MBP와 LipL41 사이에 첨가되고, LipL41의 C-말단에 6개의 히스티딘이 첨가되어 있는, 재조합 발현벡터 pKPM-MBP-LipL41-H6(도 2b)를 제조한다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

상기 재조합 발현벡터는 렙토스피라의 외막단백질 OmpL1 또는 LipL41를 발현하는 벡터라면 특별히 제한하지는 않으나, pKPM-MBP-OmpL1-H6, 또는 pKPM-MBP-LipL41-H6 인 것이 바람직하다.

본 발명의 숙주세포로는 박테리아와 같은 원핵세포, 효모와 같은 진핵세포 또는 다세포 유기체 세포와 같은 포유동물세포가 사용될 수 있어 특별히 제한하지는 않으나, 발현을 통한 대량생산을 위해서는 대장균이 바람직하다.

본 발명의 재조합 발현벡터 pKPM-MBP-OmpL1-H6로 형질전환된 대장균을 "Escherichia coli BL21(DE3)/pKPM-MBP-OmpL1-H6"라 명명하고, 이를 한국생명공학연구원 내 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2008년 7월 11일자로 수탁하고, 수탁번호 KCTC 11363BP를 부여받았다.

또한, 본 발명의 재조합 발현벡터 pKPM-MBP-LipL41-H6로 형질전환된 대장균을 "Escherichia coli BL21(DE3)/pKPM-MBP-LipL41-H6"라 명명하고, 이를 한국생명공학연구원 내 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2006년 11월 7일자로 수탁하고, 수탁번호 KCTC 11019BP를 부여받았다.

형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자 수준에서 이해될 수 있는 범위 내에서 숙주세포에 따라 적합한 사용가능한 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 본 발명의 형질전환된 숙주세포를 배지에서 배양하고, 상기 배양물로부터 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 OmpL1 또는 LipL41 항원 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 렙토스피라의 재조합 항원 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

형질전환된 숙주세포, 바람직하게는 대장균으로부터 재조합 항원 단백질의 발현을 유도하는 방법은 특별히 제한하지는 않으나, 형질전환 대장균, 바람직하게는 수탁번호 KCTC 11363BP, 또는 KCTC 11019BP로 기탁된 대장균을 렙토스피라의 재조합 항원 단백질의 생산에 적합한 영양 배지, 예를 들어, LB 또는 2×YT 배지에서 배양하고 IPTG (Isoprophyl-β-thiogalactosidase)를 첨가하여 세포파쇄물로부터 재조합 항원 단백질을 수득하거나, 수용성 형태로 수득하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 본 발명의 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 항원 단백질을 포함하는 개의 렙토스피라증을 검출할 수 있는 진단키트에 관한 것이다.

본 발명의 렙토스피라의 재조합 항원 단백질을 포함하는 백신을 동물에 접종하고, 생산된 항체와 렙토스피라 캐니콜라 균주의 면역학적 반응을 유도하면 높은 항체가를 확인할 수 있어 개의 렙토스피라증을 검출할 수 있는 진단키트로 사용할 수 있다.

상기 재조합 항원 단백질로는 특별히 제한하지는 않으나 재조합 OmpL1 및 LipL41 항원 단백질이 바람직하다.

또한, 본 발명의 진단키트에 사용되는 검출방법은 ELISA법 또는 Disp-stick assay법을 사용할 수 있으나 이에 제한하지는 않는다.

본 발명은 또한 본 발명의 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 개 렙토스피라증 예방용 백신조성물에 관한 것이다.

본 발명의 백신조성물은 공지의 렙토스피라 균주 자체를 불활화한 백신과 비교하여 활성형의 렙토스피라의 재조합 외막단백질을 항원 단백질로 이용한 것으로 생체 적합하고 안전하게 사용할 수 있다.

또한, 상기 백신 조성물은 아쥬반트 또는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 면역원의 보관 및 환자에 대한 면역원의 투여를 용이하게 한다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 주사용 멸균수, 일반 식염수 또는 인산염 완충 식염수, 슈크로스, 히스티딘, 염 및 폴리솔베이트 등과 같은 여러 성분을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 주사 형태로 투여할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 상기 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물의 바람직한 유효량(투여량)은 개의 연령, 체중 및 질환의 정도에 따라 차이가 있으나, 통상 비경구로 1회 1∼2 mL 투여하고, 2~3주 간격으로 반복 투여하는 것이 바람직하며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 경험에 의하여 적절히 결정될 수도 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 항원 단백질, 상기 재조합 항원 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포 및 이의 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 개 사료첨가제에 관한 것이다.

본 발명의 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 항원 단백질, 상기 재조합 항원 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포, 또는 이의 파쇄물은 개 사료에 첨가되어 개에게 섭취시킴으로써, 이를 섭취한 개에서 렙토스피라증에 대한 항체 형성을 유 도하여 면역효과를 유발시킬 수 있다.

상기 재조합 항원 단백질, 상기 재조합 항원 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포, 또는 이의 파쇄물은 분말형태 또는 액상형태로 사료에 첨가될 수 있다. 이와 같이 본 발명에 따른 재조합 항원 단백질, 상기 재조합 항원 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포, 또는 이의 파쇄물을 사료첨가제로서 사료와 혼합하여 개에게 급여하는 경우, 개에게 지속적으로 백신을 투여하는 효과를 나타낼 수 있다.

상기 재조합 항원 단백질은 렙토스피라의 외막단백질이라면 특별히 제한하지는 않으나, 렙토스피라의 재조합 OmpL1 항원 단백질 및 재조합 LipL41 항원 단백질을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 형질전환된 숙주세포는 특별히 제한하지는 않으나, 수탁번호 KCTC 11363BP 및 KCTC 11019BP로 기탁된 대장균을 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 렙토스피라(Leptospira) 유래의 OmpL1 독소 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝

렙토스피라 캐니콜라(Leptospira canicola)의 게놈 DNA를 분리한 후 이렇게 분리된 게놈 DNA를 주형으로, OmpL1 유전자를 코딩하고 그 자체의 분비서열을 함유한 DNA 서열(GenBank No. AY622661)의 말단에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(서열번호 1(LOP1) 및 서열번호 2(LOP2); 각각 제한효소 EcoRV와 XhoI 인식부위를 포함하고 있음)를 프라이머로 이용하는 PCR을 수행하여 그 자체의 분비서열을 함유한 OmpL1을 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 이때, PCR은 최종부피가 50㎕가 되도록 20pmol 프라이머, 2.5mM의 dNTP 혼합물, 100ng의 플라스미드 DNA, 5㎕의 10×PCR 완충용액(Solgent Co.), 2.5 unit의 Taq DNA 폴리머라제를 혼합한 다음 상기 혼합액을 94℃에서 10분간 변성, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 45초간 재결합, 72℃에서 45초간 신장 과정을 34회 반복하였다. 이어서 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다.

증폭된 PCR 산물은 0.8% 아가로스 젤[agarose gel (BMA, USA)]에 전기 영동한 후, 큐어엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex Ⅱ gel extraction kit (Qiagen, USA)]를 이용하여 분리하였다.

이를 유전자 클로닝벡터인 pGEM-T(Promega, USA)에 삽입하였다. 결과적인 벡터를 pGEM-OmpL1이라 명명하였다.

<실시예 2> pKPM-OmpL1-H6와 pKPM-MBP-OmpL1-H6의 제조

상기 실시예 1에서 분리된 OmpL1을 코딩하는 유전자를 대장균의 재조합 발현벡터인 pET-28(b)+(Novagen, USA)중 T7 프로모터에 작동가능하게 결합시키기 위하여 먼저 pET-28(b)+를 NcoI으로 절단하고, Klenow fragment(Takara, Japan)를 이용하여, Sticky end 부분을 fill-out 시켜 blunt end로 만들고 나서 XhoI으로 절단하고 큐어엑스 투 젤 추출 키트를 이용하여 분리하였다.

상기 처리한 pET-28(b)+와 실시예 1에서 제작된 pGEM-OmpL1을 EcoRV과 XhoI으로 처리하여 분리된 OmpL1 유전자를 리가아제(ligase)로 결합시켰다. 이때 생성된 재조합 발현벡터를 pKPM-OmpL1-H6라 명명하였고(도 1a), 이 발현벡터에서는 OmpL1 그 자체 분비서열이 OmpL1의 N-말단에 결합되었으며, OmpL1의 C-말단에는 6개의 히스티딘이 첨가되었다.

OmpL1에 Maltose-binding domain (MBP)을 결합시킨 벡터를 제조하기 위하여, MBP를 pMAL-c2X (New England BioLabs, Beverly, MA)를 주형으로 하여, MBP 유전자의 말단에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(서열번호 7(LO7) 및 서열번호 8(LO8); 각각 제한효소 NdeI과 EcoRI 인식부위를 포함하고 있음)를 프라이머로 이용하는 PCR을 수행하여 MBP를 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 또한, 서열번호 5(LO5) 및 서열번호 2(LO2)(각각 제한효소 EcoRI과 XhoI 인식부위를 포함하고 있음)를 프라이머로 이용하는 PCR을 수행하여 OmpL1의 N-말단에 엔테로키나아제(enterokinase)가 작동하는 유전자를 포함한 OmpL1유전자를 증폭하였다.

상기에 증폭된 MBP와 OmpL1을 각각 NdeI과 EcoRI, EcoRI과 XhoI으로 처리하였다. 이렇게 얻어진 MBP와 OmpL1 유전자들을 NcoI과 XhoI으로 절단된 pET-28(b)+에 삽입하였다. 이렇게 얻어진 발현벡터를 pKPM-MBP-OmpL1-H6(도 1b)로 명명하였으며, 이 발현벡터에서는 MBP는 OmpL1의 N-말단에 결합되었으며, EK site가 MBP를 제거하기 위해 MBP와 OmpL1의 사이에 첨가되었다. 또한, OmpL1의 C-말단에는 6개의 히스티딘이 첨가되었다.

<실시예 3> 렙토스피라(Leptospira) 유래의 LipL41 독소 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝

렙토스피라 캐니콜라의 게놈 DNA를 분리한 후 이렇게 분리된 게놈 DNA를 주형으로, LipL41 유전자를 코딩하고 그 자체의 분비서열을 함유한 DNA 서열(Genbank No. AY622673)의 말단에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(서열번호 3(LO3) 및 서열번호 4(LO4); 각각 제한효소 NcoI과 SalI 인식부위를 포함하고 있음)를 프라이머로 이용하는 PCR을 수행하여 그 자체의 분비서열을 함유한 LipL41을 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 이때, PCR은 최종부피가 50㎕가 되도록 20pmol 프라이머, 2.5mM의 dNTP 혼합물, 100ng의 플라스미드 DNA, 5㎕의 10×PCR 완충용액(Solgent Co.), 2.5 unit의 Taq DNA 폴리머라제를 혼합한 다음 상기 혼합액을 94℃에서 10분간 변성, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 45초간 재결합, 72℃에서 45초간 신장 과정을 34회 반복하였다. 이어서 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다.

증폭된 PCR 산물은 0.8% 아가로스 젤[agarose gel (BMA, USA)]에 전기 영동한 후, 큐어엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex Ⅱ gel extraction kit (Qiagen, USA)]를 이용하여 분리하였다. 이를 유전자 클로닝벡터인 pGEM-T(Promega, USA)에 삽입하였다. 결과적인 벡터를 pGEM-LipL41이라 명명하였다.

<실시예 4> pKPM-LpL41-H6와 pKPM-MBP-LipL41-H6의 제조

상기 실시예 3에서 분리한 LipL41을 코딩하는 유전자를 대장균의 재조합 발현벡터인 pET-28(b)+(Novagen, USA)중 T7 프로모터에 작동가능하게 결합시키기 위하여, 먼저 pET-28(b)+를 NcoI과 XhoI으로 절단하고 큐어엑스 투 젤 추출 키트를 이용하여 분리하였다. 상기 NcoII과 XhoI으로 처리한 pET-28(b)+와 실시예 3에서 제작된 pGEM-LipL41을 NcoI과 XhoI으로 처리하여 분리된 LipL41 유전자를 리가아제(ligase)로 결합시켰다. 이때 생성된 재조합 발현벡터를 pKPM-LipL41-H6라 명명하였고(도 2a), 이 발현벡터에서는 LipL41 그 자체 분비서열이 LipL41의 N-말단에 결합되었으며, LipL41의 C-말단에는 6개의 히스티딘이 첨가되었다.

LipL41에 Maltose-binding Protein(MBP)을 결합시킨 벡터를 제조하기 위하여, MBP를 pMAL-c2X (New England BioLabs, Beverly, MA)를 주형으로 하여, MBP 유전자의 말단에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(서열번호 7(LO7) 및 서열번호 8(LO8); 각각 제한효소 NdeI과 EcoRI 인식부위를 포함하고 있음)를 프라이머로 이용하는 PCR을 수행하여 MBP를 코딩하는 유전자를 증폭하였다.

또한, 서열번호 6(LO6) 및 서열번호 4(LO4)(각각 제한효소 EcoRI과 XhoI 인식부위를 포함하고 있음)를 프라이머로 이용하는 PCR을 수행하여 LipL41의 N-말단에 엔테로키나아제가 작동하는 유전자를 포함한 LipL41 유전자를 증폭하였다.

상기에 증폭된 MBP와 LipL41을 각각 NdeI과 EcoRI, EcoRI과 XhoI으로 처리하였다. 이렇게 얻어진 MBP와 LipL41 유전자들을 NcoI과 XhoI으로 절단된 pET-28(b)+에 삽입하였다. 이렇게 얻어진 발현벡터를 pKPM-MBP-LipL41-H6(도 2b)로 명명하였으며, 이 발현벡터에서는 MBP는 LipL41의 N-말단에 결합되었으며, EK site가 MBP를 제거하기 위해 MBP와 LipL41의 사이에 첨가되었다. 또한, LipL41의 C-말단에는 6개의 히스티딘이 첨가되었다.

<실시예 5> 형질전환체의 제조

숙주세포로 대장균(E. coli BL21(DE3), Novagen)를 이용하였다. 실시예 2 및 4에서 제조된 발현벡터를 각각 전기충격유전자전달법(electroporation) 방법을 사용하여 대장균(E. coli) BL21(DE3)을 형질전환시켰고, 카나마이신(kanamysin)이 함유된 LB평판배지(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 5g/L)에 도말하여 형질전환된 균주들을 각각 선별하였다. 이로부터 얻은 pKPM-OmpL1-H6, pKPM-MBP-OmpL1-H6, pKPM-LipL41-H6와 pKPM-MBP-LipL41-H6으로 형질전환된 E. coli BL21(DE3)을 각각, E. coli BL21(DE3)/pKPM-OmpL1-H6, E. coli BL21(DE3)/pKPM-MBP-OmpL1-H6(KCTC 11363BP), E. coli BL21(DE3)/pKPM-LipL41-H6와 E. coli BL21(DE3)/pKPM-MBP-LipL41-H6(KCTC 11019BP)으로 명명하였다.

<실시예 6> 형질전환 대장균에서 OmpL1과 LipL41 단백질의 발현

실시예 5에서 제조된 각각의 형질전환체를 이용하여 OmpL1과 LipL41의 발현을 확인하였다. 50mL의 LB배지를 함유한 250mL 플라스크에 각각의 형질전환체를 접종하였고, 균체량은 배양액을 적당히 희석한 후 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도 600nm에서 측정하였다. 균체농도가 1.OD일 때 최종농도 0.4mM가 되도록 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 3시간이 지나고 나서 배양 플라스크로부터 형질전환체를 각각 수확하여 균체들을 초음파처리하여 파쇄하고 SDS-PAGE 분석을 실시하였다.

도 3 및 도 4는 발현이 유도된 형질전환체의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다. 각 레인에서, T: IPTG 첨가 후 세포파쇄물, S: IPTG 첨가 후 세포파쇄물중 수용성부분, I: IPTG 첨가 후 세포파쇄물중 불용성부분, B: IPTG 첨가 전 세포파쇄물, M: 단백질 표준 시약을 나타낸다.

도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, MBP가 결합된 형태인 OmpL1과 LipL41 모두 수용성형태에서도 발현됨을 확인할 수가 있었다.

또한, MBP가 결합되지 않은 형태인 OmpL1과 LipL41은 확인할 수 없을 정도로 거의 발현되지 않았으나, MBP가 결합된 OmpL1과 LipL41은 세포파쇄물의 전체 단백질에서 34.7%와 37.4%, 그리고, 수용성 단백질에서는 47.0%와 50.2%정도로 발현됨을 확인할 수가 있었다(표 2).

*ND는 확인되지 않을 만큼 발현이 이루어지지 않음

<실시예 7> 재조합 OmpL1및 LipL41 독소 단백질을 이용한 개 렙토스피라증 예방을 위한 시제품의 효능 시험

실시예 6에서 얻은 수용성의 MBP가 결합된 OmpL1(전체 단백질 기준500 ㎍/mL)과 LipL41(전체 단백질 기준 250 ㎍/mL) 독소 단백질을 함유하는 시험 백신을 생산하여 기니픽에 2주 간격으로 2회 접종하고 기니픽에서 채혈하여 개 렙토스피라증을 유발하는 병원성 균주인 렙토스피라 캐니콜라의 균체가 코팅되어있는 플레이트를 이용하여 ELISA 항체가를 측정하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, MBP가 결합된 OmpL1과 LipL41을 함유한 세포파쇄물에 의한 ELISA 항체가가 음성 대조군(negative control, 아무것도 투입되지 않은 대조군), 벡터 대조군[OmpL1 및 LipL41을 함유하지 않은 pET-28(b)+에 의해서 형질전환된 대장균의 세포파쇄물에 의한 대조군], pET-MBP 대조군[OmpL1 및 LipL41을 함유하지 않고 MBP만 함유한 벡터인 pET-MBP에 의해 형질전환된 대장균의 세포파쇄물에 의한 대조군]들에 비해 월등히 높았으며, 양성대조군[개 렙토스피라증을 유발하는 병원성 균주인 렙토스피라 캐니콜라가 접종된 마우스] 및 현재 중앙백신에서 렙토스피라 병원성 균주 자체를 불활화한 백신인 렙토스피라 불활화백신(중앙백신, 대한민국)이 투여된 대조군보다도 높거나 유사한 항체가를 보였다.

이 결과는 실시예 6에서 얻어진 MBP가 결합된 재조합 OmpL1과 LipL41항원 단백질이 효과적인 면역학적인 반응을 보인다는 것을 나타내는 것이다.

도 1은 본 발명의 OmpL1을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pKPM-OmpL1-H6(a) 및 pKPM-MBP-OmpL1-H6(b)를 도식화한 것이다.

도 2는 본 발명의 LipL41를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pKPM-LipL41-H6(a) 및 pKPM-MBP-LipL41-H6(b)를 도식화한 것이다.

도 3은 본 발명의 재조합 발현벡터 pKPM-MBP-OmpL1-H6으로 형질전환된 대장균의 플라스크배양 후 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 재조합 발현벡터 pKPM-MBP-LipL41-H6으로 각각 형질전환된 대장균의 플라스크배양 후 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 항원 단백질을 포함하는 시험 白身과 대조군들을 기니픽에 접종 후 채혈을 통해 ELISA를 이용하여 렙토스피라에 대한 항체가를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Choong Ang Vaccine Lab. <120> Recombinant antigen against the pathogenicity of canine Leptospira and method for preparing the same <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: LOP1 <400> 1 tgttagatat ccgtaacata agtaag 26 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: LOP2 <400> 2 aaaggactcg aggagttcgt gtttataacc 30 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: LOP3 <400> 3 tggtaaccat ggggagaaaa ttatcttctc ta 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: LOP4 <400> 4 aaaggactcg agctttgcgt tgctttcgtc 30 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: LOP5 <400> 5 tctgaattcg acgacgacga caagaaaaca tatgcaattg tagg 44 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: LOP6 <400> 6 tctgaattcg acgacgacga caagtgcgca gctacagtcg atg 43 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: LOP7 <400> 7 agcatacata tgaaaatcga agaaggtaaa ctggta 36 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: LOP8 <400> 8 ataagtgaat tcagtctgcg cgtctttcag ggctt 35

Claims

렙토스피라(Leptospira)의 외막단백질인 OmpL1 또는 LipL41;

MBP(Maltose-binding Protein); 및

(His)₆를 포함하는 재조합 항원 단백질.
삭제
렙토스피라(Leptospira)의 외막단백질인 OmpL1 또는 LipL41의 코딩 서열;

MBP(Maltose-binding Protein)의 코딩 서열; 및

(His)₆의 코딩 서열을 포함하는 재조합 발현벡터.
삭제
제3항에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
제5항에 있어서,

수탁번호 KCTC 11363BP, 또는 KCTC 11019BP로 기탁된 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제5항에 따른 숙주세포를 배지에서 배양하고, 상기 배양물로부터 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 OmpL1 또는 LipL41 항원 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 렙토스피라의 재조합 항원 단백질의 제조방법.
제1항에 따른 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 항원 단백질을 포함하는 개의 렙토스피라증을 검출할 수 있는 진단키트.
제1항에 따른 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 개 렙토스피라증 예방용 백신조성물.
제1항에 따른 렙토스피라(Leptospira)의 재조합 항원 단백질, 상기 재조합 항원 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포 및 이의 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 개 사료첨가제.