WO2005083072A1 - 大腸菌における豚丹毒菌表層防御抗原変異体の製造方法 - Google Patents

大腸菌における豚丹毒菌表層防御抗原変異体の製造方法 Download PDF

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Toshihiro Ushijima
Masashi Sakaguchi
Eiji Tokunaga
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Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a mutant of a surface protective antigen (hereinafter sometimes referred to as “SpaA”) protein of Escherichia coli swine using Escherichia coli as a host. More specifically, it is a mutant in which an amino acid substitution has been introduced into a shortened form of SpaA from which the SpaA protein or a portion thereof has been removed (hereinafter, the shortened form of SpaA may be referred to as “ ⁇ SpaAj”).
  • the present invention relates to a method for producing a product that is expressed as an insoluble inclusion body when expressed in E. coli, and a mutant of the recombinant SpaA protein or ⁇ SpaA protein obtained by the production method.
  • Knee erysipelas is a knee disease caused by infection with Erysipelothrix rhusiopathiae. Infected pigs have symptoms such as sepsis in the acute case, subacute Jungle measles, and chronic cases of endocarditis and arthritis. Present. Around 3,000 outbreaks are reported annually, causing serious damage to livestock farmers. Swine erysipelas is also pathogenic to edible animals such as wild boars, whales, chickens, and turkeys in addition to pigs, and is designated as one of the monitored infectious diseases in the Livestock Infectious Diseases Control Law.
  • Swine erysipelas is also a zoonotic disease that causes erysipelas in humans and is an important disease from the viewpoint of meat hygiene.
  • serotypes of swine erysipelas There are many serotypes of swine erysipelas, but most of swine erysipelas in pigs are mainly caused by type 1 or type 2 bacteria.
  • a live attenuated vaccine produced using attenuated Koganei strain of swine erysipelas produced by long-term subculturing of a virulent strain in a medium containing acriflavine
  • Freeze-dried live vaccine Inactivated Dani Vaccine (Sterile culture of a virulent strain of swine erysipelas is sterilized with formalin, and all cells and extracellular products are adsorbed to Hydroxidani aluminum gel.
  • Bacterial vaccines produced by such methods and component vaccines are widely used.
  • a live attenuated vaccine can be effective only with a single inoculation of a small dose and is considered to be economical.However, the problem with using this vaccine is that it has the pathogenicity of arthritis in mice. It has been pointed out that severe side effects occur in pigs with low antibodies and SPF pigs, and that pathogenic vaccine strains are isolated from pigs with chronic erysipelas.
  • the concentration step by ultrafiltration under neutral and weak alkali (pH 7-9.5) conditions; 2) ultrafiltration under strong alkali ( ⁇ . ⁇ -12.0) conditions At least three steps are essential: 3) a step of recovering the filtered fraction by filtration, and 3) a step of purifying the ultrafiltered fraction by anion exchange chromatography.
  • the SpaA gene When the SpaA gene is expressed in Escherichia coli, most of it is expressed as a soluble protein, so that the above-described purification method for insolubles cannot be applied.
  • the culture contains a variety of contaminants, including Escherichia coli cells, components derived from the culture medium, and metabolites produced during culture. It is not easy to efficiently recover and purify the target soluble SpaA protein from such contaminants.
  • animal vaccines unlike human vaccines, are unacceptable to livestock farmers unless they are of high purity, high quality, and low in price. Therefore, manufacturers of animal vaccines are always required to improve production methods and recovery / purification methods that can process large quantities and reduce production costs.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-279179
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-34568
  • Non-patent document l Garan, JE et al. (1990) Infect. Immun., 58, p. 3116-3121
  • Non-patent document 2 Makino, S. et al. (1998) Microb.Pathog. 25, p. 101 -109
  • Non-Patent Document 3 Imada, Y. et al. (1999) Proc. Jpn. Pig. Vet. Soc. 34, p. 12-
  • Non-Patent Document 4 Imada, Y. et al. (1999) Infect. Immun. 67 (9), p.4376-4382
  • the present invention has been made in view of such technical and industrial needs, and has been made in view of the amino acid sequence of the SpaA protein or a truncated form of the SpaA ( ⁇ SpaA) protein from which a part thereof has been removed.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a SpaA protein or a ⁇ SpaA protein, which comprises expressing a soluble SpaA protein or a ⁇ SpaA protein in an Escherichia coli body as an insert by partially substituting the protein and recovering and purifying it.
  • Another object of the present invention is to provide a highly purified recombinant SpaA protein or ⁇ SpaA protein obtained by the above method.
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, clones forming insoluble inclusion bodies were mixed in Escherichia coli expressing SpaA protein or ⁇ SpaA protein.
  • the 69th amino acid of the SpaA protein or ⁇ SpaA protein derived from SE-9 strain was replaced with glycine
  • the 214th amino acid was replaced with glutamine
  • the 278th amino acid was replaced with glycine
  • the 531st amino acid was replaced with glycine.
  • Substitution of amino acids with glycine substitution of amino acids at positions 154 and 203 with glycine and threonine, substitution of amino acids at positions 214 and 253 with glutamine and threonine, respectively, and substitutions at positions 69, 154 and 154
  • substitutions at positions 69, 154 and 154 By substituting the amino acid at position 203 with glycine, glycine and threonine, an inclusion body is formed.
  • the present invention generally provides a mutant of the Escherichia coli porphyrin surface protective antigen SpaA protein or a truncated ⁇ SpaA protein from which a part thereof has been removed, which is immunogenic and expressed as inclusion bodies in Escherichia coli.
  • the SpaA protein or A SpaA protein when expressed in Escherichia coli, a mutant of the SpaA protein or ⁇ SpaA protein that is expressed as an insoluble inclusion body is created by amino acid substitution.
  • the SpaA protein or ⁇ SpaA protein which was originally difficult to purify due to its solubility, was expressed in Escherichia coli as an insoluble inclusion body, thereby facilitating the protein recovery and purification. Is what you do.
  • the method of the present invention comprises the following (A) to (D):
  • the method of the present invention is characterized in that recovery and purification thereof are facilitated by converting originally soluble SpaA protein or ⁇ SpaA protein into a mutant that is expressed as an insoluble inclusion body. Is what you do.
  • the gene encoding SpaA protein or ⁇ SpaA protein is mutated to introduce SpaA protein or ⁇ SpaA protein. Amino acid substitution in the amino acid sequence of SpaA protein or ⁇ SpaA protein having such amino acid substitution Since some of these mutants are expressed by forming inclusion bodies, those that finally form such inclusion bodies are selected.
  • Such a mutation or amino acid substitution may be used as long as the body is expressed by forming an inclusion body.
  • the 154th and 203rd amino acids from the N-terminus including the signal peptide are respectively substituted with glycine and threonine; the 214th amino acid from the N-terminus including the signal peptide is substituted. And the 253rd amino acid are substituted with glutamine and threonine, respectively; and the 69th, 154th and 203rd amino acids from the N-terminal containing the signal peptide are substituted with glycine, glycine and threonine, respectively.
  • the amino acid sequence of SpaA protein or ⁇ SpaA protein is the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a sequence from which the C-terminal has been removed, and the desired amino acid substitution in the amino acid sequence, specifically, The above amino acid substitutions can be introduced.
  • the present invention provides a mutant of the swine erysipelas surface protective antigen SpaA protein or ⁇ SpaA protein, which is immunogenic and is expressed as an inclusion body in Escherichia coli.
  • the SpaA protein or the mutant of the ⁇ SpaA protein of the present invention is preferably produced by the above production method of the present invention.
  • the term “porcine erysipelas surface protective antigen SpaA protein or ⁇ SpaA mutant” refers to a soluble porcine erysipelas surface protective antigen SpaA protein or ⁇ SpaA protein.
  • SpaA means a protein that is mutated to an insoluble protein by substituting a specific amino acid.
  • “having immunogenicity” means having the ability to induce a protective antibody and the ability to inhibit infection with swine erysipelas.
  • the present invention provides a composition comprising, as a main component, a mutant of the surface protective antigen SpaA protein or ⁇ SpaA protein of the erysipelas swine of the present invention.
  • the SpaA protein or ⁇ SpaA protein mutant of the present invention contained in the composition is preferably produced by the above production method.
  • the present invention relates to a gene encoding a mutant of the swine erysipelas surface protective antigen SpaA protein or ⁇ SpaA protein, which is immunogenic and is expressed as an inclusion body in Escherichia coli.
  • the gene encoding the SpaA protein or the mutant of the ⁇ SpaA protein of the present invention is preferably produced by the above production method.
  • the gene encoding the SpaA protein or the mutant of the ⁇ SpaA protein of the present invention contains at least one base substitution compared to the gene encoding the SpaA protein or the ⁇ SpaA protein, but the base substitution is a silent mutation. It must cause at least one amino acid substitution (point mutation) in the SpaA or ⁇ SpaA protein.
  • nucleotide at position 206 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is G;
  • the 758th base is C
  • SEQ ID NO: 1 Other specific examples of the gene encoding the SpaA protein or ⁇ SpaA protein mutant of the present invention include, for example, the following (a) to (h) in SEQ ID NO: 1: (a) the nucleotide at position 206 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is G;
  • the 206th, 461st and 608th bases are G, G and C, respectively.
  • the present invention provides a method of using a mutant of the porcine erysipelas surface protective antigen SpaA protein or ⁇ SpaA protein of the present invention as a porcine erysipelas vaccine.
  • the SpaA protein or ⁇ SpaA protein mutant of the present invention used in this method is preferably produced by the above-mentioned production method.
  • the erysipelas swine used for producing the SpaA protein or ⁇ SpaA protein mutant of the present invention includes, for example, Fujisawa strain and Koganei strain as type 1 bacteria, Tama 96 strain as type 2 bacteria, and SE-9. Strain and Shizuoka 63 strain can be exemplified, and SpaA gene derived from any strain can be used in the present invention.
  • a method for expressing soluble SpaA protein or ⁇ SpaA protein in Escherichia coli as an insoluble inclusion body By expressing it as an inclusion body in Escherichia coli, SpaA protein or ⁇ SpaA protein can be easily purified to high purity only by performing centrifugation and washing operations.
  • the SpaA protein or ⁇ SpaA protein inclusion body thus obtained has purity and immunogenicity that can be used as a vaccine only by dilution after solubilization. That is, a simple and effective method for producing a SpaA protein or ⁇ SpaA protein vaccine is provided.
  • SpaA protein or ⁇ SpaA protein obtained by this method makes it possible to infect humans with swine erysipelas compared to the methods for producing inactivated vaccines and component vaccines using swine erysipelas as a starting material. Opportunities can be reduced. In addition, problems such as the reversion of virulence seen in attenuated swine erysipelas and severe side effects on low antibody and SPF pigs are avoided.
  • FIG. 1 shows SpaA protein and A SpaA protein expression vectors.
  • a plasmid (pETlld / SpaA) into which the gene encoding SpaA protein derived from E. coli swine strain SE-9
  • b plasmid (pETl Id / ⁇ SpaA) into which the gene encoding ⁇ SpaA protein was inserted .
  • FIG. 2A shows the results of SDS-PAGE of SpaA protein and ⁇ SpaA protein derived from E. coli swine strain SE-9.
  • M Marker
  • Lane 1 Escherichia coli culture expressing no foreign protein
  • Lane 2 Escherichia coli culture expressing SpaA protein
  • Lane 3 Escherichia coli culture expressing ⁇ SpaA protein.
  • FIG. 2B shows the results of SDS-PAGE of ⁇ SpaA protein derived from swine erysipelas.
  • M Marker
  • lane 1 Escherichia coli culture expressing no foreign protein
  • lane 2 Fujisawa strain-expressing ⁇ SpaA protein-expressing Escherichia coli culture
  • lane 3 Tama 96 strain-expressing Escherichia coli culture
  • lane 4 Escherichia coli culture expressing ⁇ SpaA protein from Koganei strain
  • lane 5 Escherichia coli culture expressing ⁇ SpaA protein from SE-9 strain.
  • FIG. 3 Soluble and insoluble (inclusion body) ⁇ SpaA protein derived from erysipelas swine strain SE-9
  • FIG. 4A Comparison with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, the SpaA gene of a plasmid extracted from an Escherichia coli transformant (3 clones: Nol, No2 and No3) expressing an insoluble (inclusion body)
  • a SpaA protein Shows the mutation site and restriction enzyme cleavage site observed in the above.
  • FIG. 4B Mutation observed in SpaA gene of plasmid extracted from Escherichia coli transformant (1 clone: No4) expressing insoluble (inclusion body) SpaA protein by comparison with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 The site and restriction enzyme cleavage site are shown.
  • FIG. 5 shows the results of SDS-PAGE of soluble and insoluble (inclusion body) SpaA proteins derived from porcine erysipelas SE-9 strain.
  • FIG. 6 shows the results of SDS-PAGE of purified insoluble (inclusion body) SpaA protein and ⁇ SpaA protein derived from swine erysipelas SE-9 strain.
  • M marker
  • lane 1 SpaA protein
  • lane 2 ⁇ SpaA protein.
  • the method of the present invention comprises a method of substituting an amino acid at a specific position in the amino acid sequence of SpaA protein or ⁇ SpaA protein with a specific amino acid to express the protein as an inclusion body in Escherichia coli. It is characterized by the method for producing the incorporated SpaA protein or ⁇ SpaA protein.
  • Type 1 bacteria include Fujisawa strain and Koganei strain
  • type 2 bacteria include Tama 96 strain, SE-9 strain, and Shizuoka 63 strain.
  • SpaA gene derived from any strain can be used in the present invention.
  • the growth of these cells is carried out using a commercially available medium according to the attached method. For example, a method in which a certain amount of cells is suspended in 0.1% Tween 80-added kakeru brain heart infusion medium and cultured at 37 ° C for 16 to 48 hours is used.
  • SEQ ID NO: 1 shows the entire nucleotide sequence of the SpaA gene derived from Fujisawa strain
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the full-length SpaA protein including the signal peptide derived from Fujisawa strain
  • SEQ ID NO: 7 shows a part of the entire base sequence of the SpaA gene derived from SE-9 strain. This sequence corresponds to the 107th to 1854th sequence of the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • PCR primers can be easily obtained by requesting a DNA synthesis contract organization (eg, QIAGEN). At this time, it is desirable to add an appropriate restriction enzyme cleavage site sequence to the 5 ′ side. More specifically, a synthetic DNA having an Ncol site added to SEQ ID NO: 3 and a BamHI site added to SEQ ID NOs: 4 and 5 is used.
  • the primers described in SEQ ID NOs: 3 and 5 are used to amplify the DNA fragment encoding SpaA protein
  • the primers described in SEQ ID NOs: 3 and 4 are used to amplify the DNA fragment encoding ⁇ SpaA protein.
  • the resulting DNA fragments encoding the SpaA and ⁇ SpaA proteins consist of Met derived from the restriction enzyme Ncol and 12 bases encoding the three C-terminal amino acids (Ala-Phe-Ala) of the signal sequence. It has been done.
  • the NDA fragment encoding the ⁇ SpaA protein is a fragment having up to the 1260th base of the SpaA gene, and encodes a truncated SpaA protein in which 207 amino acids at the C-terminal have been removed.
  • the site and size of the ⁇ SpaA protein from which a part of the SpaA protein has been removed can be arbitrarily set according to the purpose by changing the position of the primer sequence.
  • the PCR reaction may be performed using a commercially available LA-Taq kit (Takara Shuzo), Advantage HF-2 PCR Kit (BC Bioscience), etc., according to the attached protocol.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained by PCR is determined by using a DNA sequencer, for example, ABI PRISM310 Genetic Analyzer (PE Biosystems) after cloning using a TA Cloning Kit (Invitrogen) or the like. Cloning of the gene encoding the SpaA protein or ⁇ SpaA protein thus obtained is performed. More specifically, the PCR product is digested with Ncol and BamHI restriction enzymes, inserted into an appropriate plasmid previously digested with the same restriction enzymes, for example, pETlld (Novagen), and introduced into E. coli. A clone having DNA encoding the desired protein is selected from E. coli colonies.
  • a DNA sequencer for example, ABI PRISM310 Genetic Analyzer (PE Biosystems) after cloning using a TA Cloning Kit (Invitrogen) or the like. Cloning of the gene encoding the SpaA protein or ⁇ SpaA protein thus obtained is performed
  • HB101, JM109, LE392, TBI and BL21 can be used as host Escherichia coli.
  • JM109 is used.
  • Examples of a method for introducing a gene include an electoporation method, a protoplast method, and a PEG method, and any method may be used.
  • Identification of the target gene is performed by purifying the plasmid and determining the nucleotide sequence. Such a series of recombination procedures can be performed according to the general cloning procedure described in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). it can. Actually, a commercially available kit may be used according to the attached method.
  • the originally soluble SpaA or ⁇ SpaA protein becomes insoluble. Can be expressed as inclusion bodies.
  • Point mutation is performed by the site-directed mutagenesis method.
  • this is ii, Takara Chido's; te—Directed Mutagenesis System (Mutan—Super Express Km, Mutan-Express Km, Mutan- Express Km, Mutan- K), QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit from Stratagene, QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit from Invitrogen, and GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System from Invitrogen, and the attached protocol may be used.
  • te Directed Mutagenesis System
  • te Directed Mutagenesis System
  • te Directed Mutagenesis System
  • te Directed Mutagenesis System
  • te Directed Mutagenesis System
  • te Directed Mutagenesis System
  • QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit from Stratagene
  • QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit from Invitrogen
  • an unspecified number of base substitutions occur at unspecified positions at a fixed rate in an amplified gene. Can be. If the substituted base affects the amino acid codon, it will cause an amino acid mutation, which may result in the appearance of clones forming inclusion bodies. By selecting these clones, a sealed human body can be obtained.
  • the soluble SpaA protein or ⁇ SpaA protein is, for example, the ninth amino acid at the N-terminus containing the signal peptide of the protein is substituted with glycine, the 154th amino acid is substituted with glycine, the 203rd amino acid is substituted.
  • threonine amino acid 214 to glutamine, amino acid 253 to threonine, amino acid 278 to glycine, and amino acid Z or 531 to glycine. Is expressed as an insoluble inclusion body in Escherichia coli. Therefore, point mutation of the SpaA gene is performed so that these amino acids are substituted.
  • Inclusion bodies are formed by introducing amino acid mutations in at least one of the above-mentioned positions, but all of these may be mutated as long as immunogenicity is not lost.
  • the amino acid at position 69 of the SpaA protein or ⁇ SpaA protein is substituted with glycine
  • the amino acid at position 214 is substituted with glutamine
  • the amino acid at position 278 is substituted with glycine
  • the amino acid at position 531 is substituted with glycine.
  • Substitution, the 154th and 203rd amino acids were substituted with glycine and threonine, respectively, the 214th and 253rd amino acids
  • the point mutation of the SpaA gene is carried out such that the amino acids No. are replaced with glutamine and threonine, respectively, and the amino acids at positions 69, 154 and 203 are respectively replaced with glycine, glycine and threonine.
  • the region and size of the ⁇ SpaA protein obtained by removing a part of the SpaA protein are particularly limited as long as they retain immunogenicity and form inclusion bodies when amino acid substitution is performed. Absent. ⁇ SpaA from which at least about 1/3 of the C-terminal side has been removed can be used in the present invention. Preferably, it is a ⁇ SpaA protein consisting of 420 amino acids from the N-terminal, including the signal peptide, with the C-terminal 207 amino acids removed.
  • Expression of the gene encoding the SpaA protein or the ⁇ SpaA protein to which the point mutation has been applied is carried out according to the method used for the above-mentioned closing.
  • Expression vectors are commercially available, and appropriate Escherichia coli is selected as a host.
  • BL21 (DE3) and DH5a (DE3) are used for a vector having a T7 promoter
  • HB101, DH5a, and JM109 are used for a vector having a tryptophan promoter.
  • it is a combination of a pETl Id (Novagen) vector and Escherichia coli BL21 strain, which can simultaneously perform clawing and expression of a target protein.
  • a surfactant for example, Triton X100
  • a chelating agent for example, EDTA
  • lysozyme or the like
  • distilled water After suspending again in an appropriate amount of distilled water, a certain amount was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, stained with Coomassie brilliant blue, and the expression of SpaA protein or ⁇ SpaA protein was confirmed from the molecular size and stained image. I do.
  • the amount of inclusion bodies formed is determined by comparing the amount of SpaA protein or A SpaA protein in the supernatant after centrifugation with the precipitate. In the present invention, about 90% or more is detected in the sediment.
  • a method based on antigen-antibody reaction such as ELISA, Western blot, or dot blot may be used in addition to the method based on the molecular size described above. . Both are general methods for detecting a foreign protein expressed in Escherichia coli, and may be appropriately selected according to the purpose.
  • the power of Escherichia coli producing such SpaA protein or ⁇ SpaA protein can also be determined by the method described in JP-A-2002-34568, or in general, when purifying the SpaA protein or ⁇ SpaA protein. Purification methods used in, for example, centrifugation, salting out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchange chromatography method, gel filtration chromatography method, affinity chromatography method, hydrophobic chromatography method A method in which a method such as a hydroxyapatite chromatography method is combined is used.
  • a culture of Escherichia coli producing SpaA protein or ⁇ SpaA protein is subjected to an enzyme treatment (for example, lysozyme), an ultrasonic treatment (for example, a sonication type cell disrupter) or both treatments.
  • an enzyme treatment for example, lysozyme
  • an ultrasonic treatment for example, a sonication type cell disrupter
  • a washing buffer for example, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA, l% TritonX-100
  • the immunogenicity of the SpaA protein or ⁇ SpaA protein thus obtained can be examined by immunizing mice or other infected animals with these proteins and conducting an attack test with a virulent strain of erysipelas swine.
  • the immunization method for example, administration site such as subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, etc., immunization period, etc.
  • administration site such as subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, etc., immunization period, etc.
  • a dilution series was prepared by serially diluting the antigen protein with 25% (vol / vol) hydroxylated aluminum gelka-zuke physiological saline, and a dilution series was prepared, and 5-10 mice per dilution series ( ddy, 5 weeks old, female) Immunize subcutaneously.
  • live mice of Fujisawa strain which is a virulent strain of swine erysipelas, are injected intradermally into mice, and the mice are observed for survival for 10 days.
  • the immunizing effect of an antigen protein is determined based on the half-protective dose (PD50) of the protein.
  • the SpaA protein or ⁇ SpaA protein of the present invention is purified in an insoluble state, and then solubilized with a solubilizing agent such as urea, guanidine hydrochloride, arginine hydrochloride, and the like. It is aseptically filtered and used as a vaccine material to protect against infection with swine erysipelas and other susceptible animals such as boars, whales, chickens, turkeys and humans.
  • a solubilizing agent such as urea, guanidine hydrochloride, arginine hydrochloride, and the like. It is aseptically filtered and used as a vaccine material to protect against infection with swine erysipelas and other susceptible animals such as boars, whales, chickens, turkeys and humans.
  • immunostimulants such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, mineral oil and non-mineral oil, stabilizers such as polysorbate 80, amino acids and sugars such as ratatose sucrose, and formalin, thimerosal, 2-phenoxyethanol
  • a preservative such as benzyl alcohol, benzethonium chloride and benzalcodium salt.
  • Swine erysipelas serotype 1 serotype 1 Fujisawa strain and Koganei strain, and serotype 2 Tama 96 strain and SE-9 strain were cultured at 37 ° C, 16–48 in 0.1% Tween80-supplemented kabu brain heart infusion medium (Difco). It was cultured for a time. From the precipitate (about 0.03 g or more) obtained by centrifuging the culture bacterial solution (about 1.5 to 3.0 mL), whole genomic DNA was extracted using a DNA extraction kit (Isoplant, Inc.-Tubongene).
  • a synthetic primer prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (a pair of SEQ ID NOs: 3 and 4, and a pair of SEQ ID NOs: 3 and 5) and a LAPCR kit (Takara) were used. PCR was performed. After maintaining the reaction solution at 94 ° C for 3 minutes, a cycle of 94 ° C for 60 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 60 seconds was repeated 30 times.
  • the primer of SEQ ID NO: 3 was designed to amplify a region downstream from the 79th base of the SpaA gene, and has an Ncol site added to its 5 'end.
  • the primers of SEQ ID NOs: 4 and 5 were designed to amplify the nucleotides at positions 1260 and 1881 of the SpaA gene (the stop codon of the SpaA gene), respectively. A site has been added.
  • PCR a SpaA gene having the nucleotide sequence at positions 79 to 1188 and a ⁇ SpaA gene having the nucleotide sequence at positions 79 to 1260 are obtained.
  • the DNA fragment amplified by PCR is double-digested with Ncol and BamHI, and the obtained digest and the plasmid pETl Id (Novagen) previously double-digested with Ncol and BamHI are mixed using T4 DNA ligase. Connected. This reaction solution and E.
  • coli JM109 were mixed and left on ice for several tens of seconds, and then LB agar medium containing ampicillin g / ml (1.0% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, 1.0% NaCl, 1.5% agar, pH 7.0) ) And allowed to stand at 37 ° C. Inoculate a single colony into 1 to 5 mL of LB medium containing g / ml of ampicillin, shake at 30-37 ° C, extract the plasmid containing the genes encoding SpaA protein and ⁇ SpaA protein according to the standard method. ( Figure 1a, Figure 1b).
  • Example 1 In accordance with the same method as in (1), plasmids derived from each strain were introduced into large intestine BL2KDE3) to obtain a single transformed colony. Inoculate a single colony into 5 mL of LB medium containing 50 g / ml of ampicillin and shake the culture at 30-37 ° C.
  • the culture was continued until the OD600nm reached 0.6-1.0.
  • a 1/100 volume of IPTG (100 mM) solution was added to the bacterial solution, and the cells were shake-cultured at 37 ° C for 2-3 hours.
  • the mixture is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and Coomassie brilliant blue (Nacalai Tester) Manufactured by the company). Bands around 70 and 45 kD were detected in all strains, and the expression of SpaA protein and ⁇ SpaA protein was confirmed from these stained images.
  • Figure 2A shows the results of SDS-PAGE of SpaA protein and A SpaA protein derived from SE-9 strain
  • Figure 2B shows the SDS-PAGE of SpaA protein and ⁇ SpaA protein derived from Fujisawa strain, Tama 96 strain, Koganei strain and SE-9 strain. Are shown.
  • Example 1 One (2) of the culture solution was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes, and the obtained sediment was washed with 1/5 to 1/10 volume of a washing buffer (20 mM Tris-HC1 pH7 .5, 10mM EDTA,
  • lysozyme solution (lOmgZml) was added with 1/100 volume, sensitized at 30 ° C for 15 minutes, and then ice-cooled, handy-soaker (manufacturer; UR-20P, output; 5, time; 15 seconds, 2-4 times) and centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes. Collect centrifugation supernatant After that, the precipitate was washed with an equal amount of washing buffer as the sonicated solution before centrifugation and suspended again until it became uniform.
  • plasmids were extracted from 4 clones (Nol, No2, No3 and No4) of the SE-9 strain that formed the inclusion bodies shown in Table 1, and the nucleotide sequence of the gene encoding ⁇ SpaA protein was analyzed (Takara Bio Custom). Request to service center). As a result of comparison with the sequence of SEQ ID NO: 7, amino acid substitution due to the mutation of the base shown in Table 2 was observed.
  • the DNA fragment containing the base substitution shown in Table 2 obtained by cleaving the plasmid derived from the inclusion body-forming bacterium of Example 1 (4) with an appropriate restriction enzyme was used to transform the soluble ⁇ SpaA protein-expressing bacterial cell (SE- (9 strains) extracted from the corresponding region of the gene encoding the ⁇ SpaA protein of the plasmid.
  • SE- (9 strains) soluble ⁇ SpaA protein-expressing bacterial cell
  • Plasmid base substitution at position 833 containing EcoRI-Clal fragment (Fig. 4A-b) containing positions 587 to 1152 of the gene encoding ⁇ SpaA protein from clone No3, c) from clone No2 Plasmid (base substitutions at positions 461 and 608) into which a Kpnl-C fragment (Fig. 4A-c) containing positions 266 to 1152 of the gene encoding the ⁇ SpaA protein of
  • a plasmid (base substitution at position 608) was constructed in which an EcoRI-Clal fragment (Fig. 4A-d) containing positions 587 to 1152 of the gene encoding ⁇ SpaA protein derived from clone No2 was inserted.
  • the plasmid in which the 206th base of the gene encoding ⁇ SpaA protein has been substituted contains the 266th to 1152th genes of the soluble ⁇ SpaA protein encoding gene (derived from strain SE-9). It was constructed by inserting the Kpnl-Clal fragment (Fig. 4A-e) into a plasmid derived from Kpnl and Clal treated clone No2.
  • Plasmid in which the 642nd base of the gene encoding ⁇ SpaA protein was substituted was constructed by the site-directed mutagenesis method (Takara, Mutan-Super Express Km). More specifically, a plasmid (FIG. 1b) derived from a cell (strain SE-9) expressing a soluble ⁇ SpaA protein was double-digested with EcoRI and Hindlll to obtain a gene encoding the ⁇ SpaA protein. An EcoR Hindlll fragment (967 bp) containing positions 587 to 1260 and part of the plasmid (pETlld) was cloned into the vector plasmid pKF18k (Takara).
  • the synthetic oligonucleotide for mutation introduction of SEQ ID NO: 6 (encoding the ⁇ SpaA protein) (The sequence has a sequence from 632 to 657 in which the T at position 642 of the gene to be replaced with G), 5 pmol of the selection primer attached to the Mutan-Super Express Km kit of Takara, 10 X LAPCR buffer (+ Mg 2+ ) 51, dNTP mixed solution 8 ⁇ l, LA-Taq polymerase solution 0.51 and sterilized distilled water were used as Kamono 501, and PCR was carried out in the same manner as in Example 1- (1).
  • This PCR reaction solution was subjected to ethanol precipitation Z washing, and then cloned into Escherichia coli MV1184 strain (Takara).
  • the resulting mutagenized plasmid was double-digested with EcoRI and BamHI, and an EcoRI-BamHI fragment containing the 587th to 1260th positions of the gene encoding ⁇ SpaA protein was separated and purified.
  • This fragment was substituted and inserted into a homologous portion of a plasmid derived from a bacterial cell (strain SE-9) expressing a soluble A SpaA protein as a starting material to obtain a desired plasmid.
  • a plasmid in which the 642th base T was replaced with G was constructed in the same manner as described above.
  • Escherichia coli BL2KDE3 was transformed with the plasmid thus obtained, and the shape of the ⁇ SpaA protein was examined according to Example (3). Formed inclusions!
  • the DNA fragment containing the base substitution in Table 2 obtained by cleaving the plasmid derived from the inclusion body-forming bacterium of Example 1 (4) with an appropriate restriction enzyme was used to transform the soluble SpaA protein-expressing cells (SE-9 A plasmid was constructed by substituting and inserting into the region corresponding to the gene encoding the SpaA protein of the plasmid extracted from the strain.
  • the Clal-BamHI fragment containing the sequence (FIG. 4B-a) was isolated and purified. This was inserted into a plasmid derived from a bacterial strain (SE-9 strain) expressing a soluble full-length SpaA protein that had been treated with Clal and BamHI in advance to construct a plasmid in which the 1591th base of the gene encoding SpaA protein had been substituted. did.
  • Example 2- (1) The plasmid of Example 2- (1) a) was double-digested with Pstl and Clal, subjected to agarose electrophoresis, and contained the 611st to 1152nd sequence of the gene encoding ⁇ SpaA protein.
  • the Pstl-C fragment ( Figure 4A-f) was isolated and purified. This was inserted into a plasmid derived from a microorganism (SE-9 strain) expressing a soluble full-length SpaA protein that had been treated with Pstl and Clal in advance, and the 642th and 758th bases of the gene encoding SpaA protein were inserted.
  • a plasmid was constructed in which was replaced.
  • Escherichia coli BL2KDE3 was transformed with the plasmid thus obtained, and the shape of the expressed protein was examined according to Example 1 (3). As a result, SpaA protein was expressed as inclusion bodies (Fig. 5).
  • Example 2 Escherichia coli expressing the ⁇ SpaA protein obtained in (1) as an inclusion body and Escherichia coli expressing the full-length SpaA protein obtained in Example 2 (2) as an inclusion body were cultured, respectively, and each culture solution was cultured. 100 ml was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes, and the resulting sediment was added to 1/5 to 1/10 volume of washing buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA, 1 % TritonX-100) was added, and the mixture was suspended until the mixture became homogeneous. A 1/100 volume of a lysozyme solution (10 mg Zml) was added to this suspension, and the mixture was allowed to stand at 30 ° C.
  • washing buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA, 1 % TritonX-100
  • the measurement effect rate (survival number Z attack number).
  • the method of the present invention provides a method for producing a soluble SpaA protein or ⁇ SpaA protein as an insoluble inclusion body in Escherichia coli. It is possible to establish a method for producing a SpaA protein or a ⁇ SpaA protein in a plant, and by establishing the production method, a stable supply of the SpaA protein or the ⁇ SpaA protein to the factory can be secured. Recombinant SpaA obtained by the method of the present invention
  • O-protein or ⁇ SpaA protein retains the same immunogenicity as the original soluble protein, and can be used alone or in combination with various additives such as stabilizers, protective agents and preservatives. It can be used as a material for pork erysipelas vaccine. Further, it can be used as an antigen when preparing a monoclonal Z polyclonal antibody, or as a research material on the binding between an anti-SpaA protein or ⁇ SpaA protein antibody and erysipelas swine. As described above, the SpaA protein or ⁇ SpaA protein obtained by the method of the present invention greatly contributes to medical and research fields.

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Abstract

　豚丹毒菌の感染を阻止するための豚丹毒菌表層防御抗原SpaA蛋白又はその一部を除去した短縮形のSpaA（ΔSpaA）蛋白の変異体及びその製造方法を提供する。SpaA蛋白又はΔSpaA蛋白のアミノ酸配列の特定の位置にアミノ酸置換を導入することにより、免疫原性を有し且つ大腸菌において封入体として発現されるSpaA蛋白又はΔSpaA蛋白の変異体を得ることができる。本発明のSpaA蛋白又はΔSpaA蛋白の変異体は大腸菌において不溶性の封入体として発現されるため、容易に回収・精製することが可能である。

Description

明 細 書
大腸菌における豚丹毒菌表層防御抗原変異体の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、大腸菌（Escherichia coli)を宿主とする豚丹毒菌の表層防御抗原 ( surface protective antigen；以下、「SpaA」と称することもある）蛋白の変異体の製造方 法に関する。更に詳細には、 SpaA蛋白又はその一部を除去した短縮形の SpaA (以 下、短縮形の SpaAを「 Δ SpaAjと称することもある）にアミノ酸置換を導入した変異体 であって、大腸菌体内で発現させたときに不溶性の封入体として発現されるものの製 造方法、及び当該製造方法により得られる組換え SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異 体に関する。
背景技術
[0002] 膝丹毒は、膝丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)の感染によって起こる膝の病気 で、感染豚は、急性では敗血症、亜急性では蓴麻疹、慢性では心内膜炎及び関節 炎などの症状を呈する。年間 3,000頭前後の発生報告があり、畜産農家に大きな被 害を与えている。豚丹毒菌は、豚以外にイノシシ、鯨類、鶏、七面鳥などの食用動物 に対しても病原性を持ち、家畜伝染病予防法において監視伝染病の一つに指定さ れている。また、豚丹毒は、ヒトに類丹毒を引き起こす人獣共通伝染病でもあり、食肉 衛生上からも重要視される疾病である。豚丹毒菌には多くの血清型が存在するが、 豚の豚丹毒の発生のほとんどは 1型菌又は 2型菌によるものが主体である。
[0003] これまで、豚丹毒感染症を予防する方法として、弱毒生ワクチン (強毒株をァクリフ ラビン添加培地中で長期継代培養して作製した豚丹毒菌弱毒株 Koganei株を用いて 製造した凍結乾燥生ワクチン）、不活ィ匕ワクチン (豚丹毒菌強毒株の培養菌液をホル マリンで殺菌処理し、その全菌体及び菌体外生産物を水酸ィ匕アルミニウムゲルに吸 着させて製造したバクテリアワクチン)及び成分ワクチン (全菌体からアルカリ水溶液 で抽出した菌体表層非精製蛋白質画分力 成る成分ワクチン)が広く使用されてい る。弱毒生ワクチンは、少量を 1回接種するだけでその効果が現れ、経済的と考えら れるが、これを使用した場合、問題点として、マウスに関節炎発症の病原性をもつこと 、抗体の低い豚や SPF豚において重篤な副作用を示すこと、また慢性豚丹毒症例豚 の病変力 ワクチン株が分離されることが指摘されている。
[0004] 新 、タイプのワクチンとして、遺伝子組換え技術による組換えワクチンの研究 ·開 発も進められている。 Galanと Timonyは、豚丹毒菌ゲノムの一部の遺伝子を発現する 組換えファージを感染させた大腸菌の溶解物を用いてマウスを免疫した後、豚丹毒 菌で攻撃試験を行ったところ、その 14一 17%が感染死力も免れることを観察した。更 に、同溶解物に対する免疫血清との反応性から当該遺伝子にコードされる蛋白が、 分子量 66、 64、 43 kDaの蛋白質であることを明らかにし、これらが豚丹毒菌の感染に 対する感染防御抗原となり得ることを示した (例えば、非特許文献 1参照)。
[0005] Makinoらは、 2型菌豚丹毒菌多摩 96株の分子量 64 kDaの表面蛋白質（SpaAと命名 )をコードする遺伝子を大腸菌で発現させ、得られた組換え大腸菌の生菌をマウスに 免疫した後豚丹毒菌による攻撃試験を行い、 SpaA蛋白が感染防御能を有することを 示した。また、彼等は、当該 SpaA蛋白は、 606個のアミノ酸配列からなる蛋白で、その N末側に 29個のアミノ酸からなるシグナルペプチド、 C末側に 20個のアミノ酸からなる 8個の相似な繰り返し配列（8番目の繰り返し配列は、 19個のアミノ酸力もなる）を有す ることを明らかにした (例えば、非特許文献 2参照)。
[0006] Imadaらは、前記 SpaA蛋白に相当する 1型菌藤沢株の SpaA蛋白及びこれをコード する遺伝子を調べ、これが分子量 69 kDa, 626個のアミノ酸力 なること、そのアミノ酸 配列は、 2型菌の SpaA蛋白に比べ、 C末側の操り返し配列が 1個多い 9個の相似な 繰り返し配列（9番目の繰り返し配列は、 19個のアミノ酸力もなる）を有することを明ら かにし、全長 SpaA、 C末側の繰り返し領域を除いた SpaA、又は N末側の一部及び C 末側の繰り返し部分を除いた SpaAとヒスチジンへキサマーとの融合蛋白質が感染防 御効果を有することを示した (例えば、非特許文献 3、 4参照)。
[0007] 渡辺らも、同様に、豚丹毒菌の SpaA蛋白から C末側の繰り返し配列及び N末側の 分泌シグナルを除去した 46.5 kDaのポリペプチドが感染防御抗原（46.5kDa protective antigen ;46.5 KPAと命名）となり得ることを報告している（例えば、特許文 献 1参照)。
[0008] 一方で、ワクチン候補蛋白の生産性を上げる試みも行われて 、る。例えば、ブレビ バチルス ·チョウシネンシス（Brevibacillus choshinensis)を宿主菌として 46.5 KPAを菌 体外に分泌発現させることに成功したとの報告がある（例えば、特許文献 2参照)。こ の発現システムでは、発現量の約 50%が培養液中で凝集して不溶性となる。本報告 では、この不溶ィ匕した 46.5 KPAの精製は、培養液を限外濾過膜でろ過し、膜上に回 収された不溶物をアルカリ溶液に懸濁し、可溶ィ匕してくる 46.5 KPAを回収する方法に より行われている。すなわち、本法によれば、 1)中性力も弱アルカリ（pH7— 9.5)条件 下での限外濾過による濃縮工程、 2)強アルカリ（ρΗΙΟ.Ο— 12.0)条件下での限外濾 過による濾過画分への回収工程、 3)限外濾過画分の陰イオン交換クロマトグラフィ 一による精製工程、の少なくとも 3工程が必須である。
[0009] SpaA遺伝子を大腸菌で発現させた場合、そのほとんどが可溶性の蛋白として発現 されるので上記のような不溶物に対する精製方法を適用することができない。培養物 には、目的の SpaA蛋白以外に大腸菌菌体、培地由来の成分や培養時に生産される 代謝産物を始めとする多種多様の夾雑物質が混在する。このような混在物から目的 とする可溶性の SpaA蛋白を効率的に回収精製することは容易ではない。一般に、動 物用ワクチンは、ヒト用ワクチンとは異なり、高純度、高品質に加えて、低価格でなけ れば畜産農家にとって受け入れ難い。したがって、動物用ワクチン製造メーカには、 常に、大量処理でき且つ製造コストを抑えた生産方法、回収精製方法の改善'改良 が求められる。
[0010] 特許文献 1：特開 2000-279179号公報
特許文献 2：特開 2002— 34568号公報
非特許文献 l : Garan, J. E. et al. (1990) Infect. Immun., 58, p.3116- 3121 非特許文献 2 : Makino, S. et al. (1998) Microb. Pathog. 25, p.101- 109
非特許文献 3 : Imada,Y.et al.(1999) Proc. Jpn. Pig. Vet. Soc. 34, p.12- 非特許文献 4 : Imada,Y.et al.(1999) Infect. Immun. 67 (9), p.4376-4382
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 上述したように、大腸菌ゃブレビバチルス ·チョウシネンシスを宿主として豚丹毒菌 の SpaA遺伝子を発現させた場合、可溶性の SpaA蛋白あるいは可溶性蛋白と不溶性 蛋白の混在する形で生産されるので製造方法が煩雑となり、高収率が期待できない 。これは製造コストに反映する。
[0012] 本発明は、このような技術上ないし工業上の必要性に鑑みてなされたものであって 、 SpaA蛋白又はその一部を除去した短縮形の SpaA ( Δ SpaA)蛋白のアミノ酸配列の 一部を置換することにより、可溶性の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白を大腸菌体内に封 入体として発現させ、これを回収精製することからなる SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の 製造方法を提供することを目的とする。
[0013] また、本発明の他の目的は、上記方法により得られる高純度の組換え SpaA蛋白又 は Δ SpaA蛋白を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明者らは、上記の目的を達成する為に鋭意研究を重ねた結果、 SpaA蛋白又 は Δ SpaA蛋白を発現させた大腸菌の中に不溶性の封入体を形成するクローンが混 在すること、これら封入体を形成した SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列の特 定位置に置換が起こっていること、人為的にこのアミノ酸置換を行うことにより可溶性 の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白は菌体内に封入体として蓄積されることを見出した。更 に、これらの SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白は、封入体形成後も免疫原性を有することを 見出し、本発明を完成するに至った。例えば、 SE-9株由来の SpaA蛋白又は Δ SpaA 蛋白の第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換、第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置 換、第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換、第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換、 第 154番目及び第 203番目のアミノ酸を各々グリシン及びトレォニンに置換、第 214番 目及び第 253番目のアミノ酸を各々グルタミン及びトレォニンに置換、第 69番目、第 154番目及び第 203番目のアミノ酸を各々グリシン、グリシン及びトレォニンに置換す ることにより、封入体が形成される。
[0015] 本発明は一般に、免疫原性を有し且つ大腸菌において封入体として発現される、 豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白又はその一部を除去した短縮型の Δ SpaA蛋白の 変異体を製造する方法であって、当該 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝 子に当該 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列にアミノ酸置換を導入するような 変異を起こさせ、当該変異を有する遺伝子を大腸菌中で発現させ、ついで発現され た変異体のうちカゝら封入体を形成したものを選択することを特徴とする方法を提供す る。すなわち、本発明の方法は、 SpaA蛋白又は A SpaA蛋白を大腸菌で発現させるに 際して、不溶性の封入体として発現されるような SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体 をアミノ酸置換により作出することによって、本来可溶性であるために回収 '精製が困 難であった SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白を不溶性の封入体として大腸菌で発現させ、 それによつて蛋白の回収'精製を容易にすることを特徴とするものである。
[0016] 一つの態様において、本発明の方法は、下記 (A)ないし (D)：
(A)可溶性の豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝 子にアミノ酸置換が起こるように変異を導入する、
(B)前記の変異遺伝子を有する発現ベクターで大腸菌を形質転換する、
(C)前記形質転換した大腸菌から不溶性の封入体を形成する大腸菌を選択する、 ついで
(D)前記大腸菌を培養し、菌体内の封入体を回収する、
の工程からなる。
[0017] 本発明の方法により得られた組換え SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体は、豚丹 毒菌の感染に対する防御能 (免疫原性)を保持していることを確認するため、さらに 下記工程 (E)— (F) :
(E)前記封入体又は可溶化剤で処理した封入体を豚丹毒菌感受性動物に投与した 後、豚丹毒菌の強毒株で攻撃する、ついで
(F)前記豚丹毒菌感受性動物の生死により豚丹毒菌の感染に対する防御能 (免疫 原性)の有無を判定する
に供することができる。
[0018] 本発明の方法は、本来可溶性であった SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白を不溶性の封入 体として発現されるような変異体に変換することによってその回収 ·精製を容易にする ことを特徴とするものである。また、本発明の方法によれば、 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋 白を不溶性の封入体として発現させるため、 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする 遺伝子に変異を導入することにより SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列中にァ ミノ酸置換を起こさせる。このようなアミノ酸置換を生じた SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白 の変異体の中には封入体を形成して発現されるものがあるので、最終的にそのような 封入体を形成するものを選択するのである。したがって、 SpaA蛋白又は A SpaA蛋白 をコードする遺伝子に生じさせる変異、ある 、は SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白のァミノ 酸配列中に生じさせるアミノ酸置換は、その結果得られる SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白 の変異体が封入体を形成して発現されるようなものであれば 、かなる変異、アミノ酸 置換であってもよい。
[0019] そのようなアミノ酸置換の具体例としては、下記（1)ないし（7)：
(1)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(2)シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(3)シグナルペプチドを含む N末端より第 203番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(4)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(5)シグナルペプチドを含む N末端より第 253番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(6)シグナルペプチドを含む N末端より第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換;及び
(7)シグナルペプチドを含む N末端より第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換 よりなる群から選ばれた一つ又は二つ以上の組合せが挙げられる。
[0020] さらに、アミノ酸置換の他の具体例としては、シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目及び第 203番目のアミノ酸を各々グリシン及びトレォニンに置換;シグナルぺ プチドを含む N末端より第 214番目及び第 253番目のアミノ酸を各々グルタミン及びト レオニンに置換;及びシグナルペプチドを含む N末端より第 69番目、第 154番目及び 第 203番目のアミノ酸を各々グリシン、グリシン及びトレォニンに置換が挙げられる。
[0021] SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列は配列番号 2で示される配列又はその C 末側を除去した配列であってよぐ斯カるアミノ酸配列中に所望のアミノ酸置換、具体 的には上記アミノ酸置換を導入することができる。
[0022] 他の態様において、本発明は、免疫原性を有し且つ大腸菌において封入体として 発現される、豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体を提供す る。本発明の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体は、本発明による上記製造方法に より製造するのが好ましい。ここで、本発明でいう「豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白 又は Δ SpaA蛋白の変異体」とは、可溶性の豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白が、特定のアミノ酸を置換することにより不溶性の蛋白に変異したものを意 味する。また、「免疫原性を有する」とは、防御抗体を誘導する能力及び豚丹毒菌の 感染を阻止する能力を有することを意味する。
[0023] さらに他の態様において、本発明は、本発明の豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白 又は Δ SpaA蛋白の変異体を主成分とする組成物を提供する。当該組成物に含まれ る本発明の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体は、上記製造方法により製造するの が好ましい。
[0024] さらに他の態様において、本発明は、免疫原性を有し且つ大腸菌において封入体 として発現される、豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体をコ ードする遺伝子を提供する。本発明の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体をコード する遺伝子は、上記製造方法により製造するのが好ましい。本発明の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体をコードする遺伝子は、 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードす る遺伝子と比較して少なくとも 1の塩基置換を含むが、当該塩基置換はサイレント変 異であってはならず、 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白に少なくとも 1のアミノ酸置換 (ポイン トミユーテーシヨン)を引き起こすものでなければならない。
[0025] 本発明の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体をコードする遺伝子の具体例として は、例えば、配列番号 1において、下記（1)ないし (7)：
(1)配列番号 1記載の塩基配列において第 206番目の塩基が G ;
(2)配列番号 1記載の塩基配列において第 461番目の塩基が G ;
(3)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 608番目の塩基力C；
(4)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 642番目の塩基が G；
(5)配列番号 1記載の塩基配列において第 758番目の塩基が C ;
(6)配列番号 1記載の塩基配列において第 833番目の塩基が G ;及び
(7)配列番号 1記載の塩基配列において第 1591番目の塩基が G
よりなる群力 選ばれた一つ又は二つ以上の組合せの塩基置換を含む塩基配列又 はその 3 '側を除去した塩基配列を有するものが挙げられる。
[0026] 本発明の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体をコードする遺伝子の他の具体例と しては、例えば、配列番号 1において、下記（a)ないし (h)： (a)配列番号 1記載の塩基配列において第 206番目の塩基が G;
(b)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 608番目の塩基が C；
(c)配列番号 1記載の塩基配列において第 642番目の塩基が G;
(d)配列番号 1記載の塩基配列において第 833番目の塩基が G;
(e)配列番号 1記載の塩基配列において第 1591番目の塩基が G ;
(f)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 461番目及び第 608番目の塩基が各々 G 及び C ;
(g)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 642番目及び第 758番目の塩基が各々 G 及び C ;
(h)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 206番目、第 461番目及び第 608番目の 塩基が各々 G、 G及び C
の!、ずれか一つの塩基置換を含む塩基配列又はその 3 '側を除去した塩基配列を 有するものが挙げられる。
[0027] さらに他の態様において、本発明は、本発明の豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白 又は Δ SpaA蛋白の変異体を豚丹毒ワクチンとして使用する方法を提供する。当該方 法にぉ 、て使用する本発明の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体は、上記製造方 法により製造するのが好まし 、。
[0028] 本発明の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の変異体を製造するに際して使用する豚丹毒 菌としては、例えば、 1型菌として藤沢株、小金井株、 2型菌として多摩 96株、 SE-9株 及び静岡 63株などが例示できるが、何れの菌株由来の SpaA遺伝子も本発明に使用 できる。
発明の効果
[0029] 本発明の方法によれば、大腸菌に可溶性の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白を不溶性の 封入体として発現させる方法が提供される。大腸菌体内に封入体として発現させるこ とにより、遠心分離 ·洗浄操作を行うだけで SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白を容易に高純 度に精製できる。こうして得られる SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白封入体は、可溶化後、 希釈するだけでワクチンとして使用可能な純度及び免疫原性を有する。すなわち、 簡便且つ効果的な SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白ワクチンの製造方法が提供される。当 該方法により得られる SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白を用いれば、これまで行われてきた 豚丹毒菌を出発材料とする不活化ワクチンや成分ワクチンの製造方法に比べて、豚 丹毒菌のヒトへの感染機会を低減することができる。また、豚丹毒弱毒菌にみられる 病原性の復帰、抗体の低い豚や SPF豚に対する重篤な副作用などの問題が回避さ れる。
図面の簡単な説明
[0030] [図 l]SpaA蛋白及び A SpaA蛋白発現ベクターを示す。 a :豚丹毒菌 SE-9株由来の SpaA蛋白をコードする遺伝子が挿入されたプラスミド（pETlld/SpaA)、 b : Δ SpaA蛋 白をコードする遺伝子が挿入されたプラスミド (pETl Id/ Δ SpaA)。
[0031] [図 2A]豚丹毒菌 SE-9株由来の SpaA蛋白及び Δ SpaA蛋白の SDS-PAGEの結果を示 す。 M :マーカー、レーン 1 :外来蛋白非発現大腸菌培養菌液、レーン 2 : SpaA蛋白 発現大腸菌培養菌液、レーン 3 : Δ SpaA蛋白発現大腸菌培養菌液。
[0032] [図 2B]豚丹毒菌由来の Δ SpaA蛋白の SDS-PAGEの結果を示す。 M：マーカー、レー ン 1：外来蛋白非発現大腸菌培養菌液、レーン 2：藤沢株由来 Δ SpaA蛋白発現大腸 菌培養菌液、レーン 3 :多摩 96株由来 Δ SpaA蛋白発現大腸菌培養菌液、レーン 4 : 小金井株由来 Δ SpaA蛋白発現大腸菌培養菌液、レーン 5： SE-9株由来 Δ SpaA蛋白 発現大腸菌培養菌液。
[0033] [図 3]豚丹毒菌 SE-9株由来の可溶性及び不溶性 (封入体） Δ SpaA蛋白の
SDS-PAGEの結果を示す。 M :マーカー、レーン 1 :可溶性 Δ SpaA蛋白発現大腸菌 超音波処理液遠心上清、レーン 2：可溶性 Δ SpaA蛋白発現大腸菌超音波処理液遠 心沈渣、レーン 3 :不溶性 Δ SpaA蛋白発現大腸菌超音波処理液遠心上清、レーン 4 ：不溶性 Δ SpaA蛋白発現大腸菌超音波処理液遠心沈渣。
[0034] [図 4A]配列番号 7の塩基配列との比較により、不溶性 (封入体） A SpaA蛋白を発現 する大腸菌形質転換体 (3クローン: Nol、No2及び No3)より抽出したプラスミドの SpaA 遺伝子に認められた変異部位及び制限酵素切断部位を示す。
[0035] [図 4B]配列番号 7の塩基配列との比較により、不溶性 (封入体) SpaA蛋白を発現する 大腸菌形質転換体（1クローン: No4)より抽出したプラスミドの SpaA遺伝子に認められ た変異部位及び制限酵素切断部位を示す。 [0036] [図 5]豚丹毒菌 SE-9株由来の可溶性及び不溶性 (封入体) SpaA蛋白の SDS-PAGE の結果を示す。 M :マーカー、レーン 1 :可溶性 SpaA蛋白発現大腸菌超音波処理液 遠心上清、レーン 2 :可溶性 SpaA蛋白発現大腸菌超音波処理液遠心沈渣、レーン 3 ：不溶性 SpaA蛋白発現大腸菌超音波処理液遠心上清、レーン 4：不溶性 SpaA蛋白 発現大腸菌超音波処理液遠心沈渣。
[0037] [図 6]精製後の豚丹毒菌 SE-9株由来の不溶性 (封入体) SpaA蛋白及び Δ SpaA蛋白 の SDS-PAGEの結果を示す。 M :マーカー、レーン 1 : SpaA蛋白、レーン 2 : Δ SpaA蛋 白。
発明を実施するための最良の形態
[0038] 本発明の方法は、 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列の特定位置のアミノ酸 を特定のアミノ酸に置換することにより当該蛋白を大腸菌体内に封入体として発現さ せる方法、及び当該方法を組み入れた SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の製造方法によつ て特徴付けられる。
[0039] (1) SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子のクローニング
豚丹毒菌には、豚に病原性の強いものとして主に 2種類の血清型が存在し、 1型菌 と 2型菌に分類される。 1型菌として藤沢株、小金井株、 2型菌として多摩 96株、 SE-9 株、静岡 63株などが挙げられるが、何れの菌株由来の SpaA遺伝子も本発明に使用 できる。これらの菌体の増殖は、市販の培地を用いて、添付の方法に従って行われる 。例えば、一定量の菌体を 0.1%Tween80添カ卩ブレインハートインフュージョン培地に 懸濁し、 37°Cで、 16— 48時間培養する方法が取られる。
[0040] SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子は、 Imada,Y.et al.(1999) Infect.
Immun. 67 (9), p.4376_4382に記載の配列（配列番号 1)をもとに設計した PCRプライ マーを用い、上記の菌体力 抽出した DNAを铸型として PCRを行うことにより取得でき る。配列番号 1は、藤沢株由来 SpaA遺伝子の全塩基配列、配列番号 2は、藤沢株由 来のシグナルペプチドを含む全長 SpaA蛋白のアミノ酸配列を示す。また、配列番号 7 は、 SE-9株由来 SpaA遺伝子の全塩基配列の一部を示す。この配列は、配列番号 1 の配列の 107番目一 1854番目〖こ相当する。铸型 DNAの調製は、市販の DNA抽出キ ット、例えば、 Isoplant (株式会社-ツボンジーン）を用い、添付のプロトコールに従つ て行われる。 PCRプライマーは、 DNA合成受託機関 (例えば QIAGEN社)などに依頼 すれば容易に入手可能である。このとき、 5'側に適当な制限酵素切断部位の配列を 付加することが望ましい。より具体的には、配列番号 3に Ncolサイト、配列番号 4及び 5に BamHIサイトを付カ卩した合成 DNAが使用される。 SpaA蛋白をコードする DNA断片 の増幅には、配列番号 3及び 5記載のプライマー、 Δ SpaA蛋白をコードする DNA断 片の増幅には、配列番号 3及び 4記載のプライマーが使用される。得られる SpaA及び Δ SpaA蛋白をコードする DNA断片は、制限酵素 Ncolに由来する Metとシグナル配列 の C末側 3個のアミノ酸 (Ala-Phe-Ala)をコードする 12個の塩基が付カ卩されたものとな る。 Δ SpaA蛋白をコードする NDA断片は、 SpaA遺伝子の 1260番目までの塩基を有 する断片で、 C末側のアミノ酸 207個が除去された短縮形の SpaA蛋白をコードする。 SpaA蛋白の一部を除去した Δ SpaA蛋白の部位及びサイズは、プライマー配列の位 置を変えることにより、 目的に応じ任意に設定できる。 PCR反応は、市販の LA-Taqキ ット（宝酒造）、 Advantage HF- 2 PCR Kit(BC Bioscience)等を用い、添付のプロトコ一 ルに従って行えばよい。 PCRにより得られる DNA断片の塩基配列は、 TAクローユング キット（インビトロジェン社)等を用いてクロー-ングした後、 DNAシークェンサ一、例え ば、 ABI PRISM310 Genetic Analyzer (PEバイオシステムズ社）により決定される。 こうして得られる SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子のクローユングが行 われる。より具体的には、前記の PCR産物を、 Ncol及び BamHI制限酵素で消化した 後、予め同じ制限酵素で消化した適当なプラスミド、例えば、 pETlld (Novagen社）に 挿入し、大腸菌に導入する。大腸菌コロニーの中から目的の蛋白をコードする DNA を有するクローンを選択する。宿主大腸菌として、 HB101、 JM109、 LE392、 TBI及び BL21などが使用可能である力 好ましくは、 JM109である。遺伝子の導入方法として は、エレクト口ポレーシヨン法、プロトプラスト法、 PEG法などが挙げられるが何れの方 法を用いてもよい。 目的遺伝子の確認は、プラスミドを精製し、塩基配列を決定する こと〖こより行われる。このような一連の組換え操作は、 Sambrookらが述べている一般 的な逾 fc子糸且換 術 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989)に従って行うことができる。実際に は、市販のキットを用い、添付の方法に従って行えばよい。 [0042] (2)不溶性 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の発現及び精製
クロー-ングされた SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子の特定部位に、 ポイントミューテーシヨンを入れ、これを大腸菌に導入することにより、本来、可溶性で あった SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白を不溶性の封入体として発現させることができる。
[0043] ポイントミューテーシヨンは、サイトダイレクテイドミュータジエネシス法により行われる o実際【こ ii、 Takara千土の； te— Directed Mutagenesis System (Mutan— Super Express Km、 Mutan- Express Km、 Mutan- Kなど)、 Stratagene社の QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit、 QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit、 Invitrogen社の GeneTailor Site-Directed Mutagenesis Systemなどの巿販のキットを用 い、添付のプロトコールに従えばよい。既にポイントミューテーシヨンが入った適当サ ィズの核酸断片を置換することにより、ポイントミューテーシヨンを入れることもできる。
[0044] また、通常の PCRを行った場合、増幅遺伝子には、不特定の位置に不特定の数の 塩基置換が一定の割合で生じるので、この方法を利用することにより塩基置換を行う ことができる。置換された塩基がアミノ酸コドンに影響する場合、アミノ酸変異を起こす ことになり、その結果、封入体を形成するクローンが出現しうる。これらのクローンを選 択すること〖こより封人体を得ることができる。
[0045] 可溶性の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白は、例えば、当該蛋白のシグナルペプチドを 含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換、第 154番目のアミノ酸をグリシン に置換、第 203番目のアミノ酸をトレオニンに置換、第 214番目のアミノ酸をグルタミン に置換、第 253番目のアミノ酸をトレオニンに置換、第 278番目のアミノ酸をグリシンに 置換、及び Z又は第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換することにより、大腸菌体内 で不溶性の封入体として発現される。したがって、 SpaA遺伝子のポイントミューテーシ ヨンは、これらのアミノ酸が置換されるように行われる。上記の少なくとも一箇所にアミ ノ酸変異を入れることにより封入体は形成されるが、免疫原性を消失しない限り、これ ら全てに変異を入れてもよい。好ましくは、 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の第 69番目の アミノ酸がグリシンに置換、第 214番目のアミノ酸がグルタミンに置換、第 278番目のァ ミノ酸がグリシンに置換、第 531番目のアミノ酸がグリシンに置換、第 154番目及び第 203番目のアミノ酸が各々グリシン及びトレォニンに置換、第 214番目及び第 253番目 のアミノ酸が各々グルタミン及びトレォニンに置換、第 69番目、第 154番目及び第 203 番目のアミノ酸が各々グリシン、グリシン及びトレォニンに置換されるように SpaA遺伝 子のポイントミューテーシヨンが行われる。
[0046] SpaA蛋白の一部を除去して得られる Δ SpaA蛋白の領域及びサイズは、免疫原性 を保持し、且つアミノ酸置換をしたときに封入体を形成する範囲であれば特に制限さ れない。少なくとも C末側の約 1/3を除去した Δ SpaAは、本発明に使用することができ る。好ましくは、 C末側 207個のアミノ酸を除去した、シグナルペプチドを含む N末側よ り 420個のアミノ酸からなる Δ SpaA蛋白である。
[0047] また、上記とは逆のアミノ酸置換を行うことにより、不溶性の SpaA蛋白又は Δ SpaA 蛋白を可溶性の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白に変換することも可能であるから、本発明 の方法により、 目的に応じて可溶性又は不溶性のいずれの SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋 白をも自由に得ることができる。
[0048] ポイントミューテーシヨンが施された SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子 の発現は前記のクローユングに用いた方法に準じて行われる。発現ベクターは巿販 のものを使用し、これに合わせて適当な大腸菌が宿主として選択される。例えば、 T7 プロモーターを有するベクターの場合には BL21 (DE3)、 DH5 a (DE3)、トリプトファン プロモーターを有するベクターの場合には HB101, DH5 a、 JM109などが使用される 。好ましくは、クローユングと目的蛋白の発現を同時に行うことができる pETl Id ( Novagen社)ベクターと大腸菌 BL21株の組み合わせである。
[0049] SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白を発現している組換え大腸菌のスクリーニングは、以下 のように行われる。発現誘導剤 (本発明に使用した発現システムでは IPTGを使用）の 存在下に、培養'増殖した菌体を低速遠心分離により回収し、これに一定の蒸留水を 加え懸濁した後、超音波処理、又はフレンチプレス、マントンゴリン等のホモジナイザ 一により菌体を破砕し、高速遠心（15000 rpm、 15分間）により沈渣に封入体を回収 する。蒸留水に、適宜界面活性剤（例えば、 Triton X100)、キレート剤（例えば、 EDTA)、リゾチーム等を添加してもよい。再度、適当量の蒸留水に懸濁した後、一定 量を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、クマシ一ブリリアントブルーで染色 した後、分子サイズ及び染色像から SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の発現を確認する。 また、封入体の形成量は、上記の遠心分離後の上清と沈渣の SpaA蛋白又は A SpaA 蛋白量を比較することにより行われる。本発明においては、約 90%以上が沈渣に検 出される。 SpaA蛋白又は A SpaA蛋白の確認 (または検出）には、上記の分子サイズ に基づく方法以外に、 ELISA法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法などの抗原抗 体反応に基づく方法が取られることもある。いずれも大腸菌で発現させた外来蛋白を 検出する際の一般的な方法であり、目的に応じて適宜選択すればよい。
[0050] 斯カる SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白産生大腸菌力も SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白を精 製する際には、特開 2002-34568号公報に記載の方法、あるいは、一般的に、蛋 白質化学において使用される精製方法、例えば、遠心分離、塩析法、限外ろ過法、 等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法、ァフィ-テ ィークロマト法、疎水クロマト法、ハイドロキシアパタイトクロマト法などの方法を組み合 わせた方法が使用される。本発明の方法に従えば、 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白産生 大腸菌の培養菌液を酵素処理 (例えば、リゾチーム）、超音波処理 (例えば、音波照 射型細胞破砕機)又は両処理を行った後、遠心分離 (例えば、 15000 rpm、 15分間） と洗浄バッファー（例えば、 20mM Tris-HCl pH7.5、 10mM EDTA、 l%TritonX- 100) への懸濁を繰り返すことにより、 90%以上の精製が可能である。
[0051] (3) SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の免疫原性
こうして得られる SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の免疫原性は、これらの蛋白をマウス又 はその他の感染動物に免疫し、豚丹毒菌の強毒株で攻撃試験を行うことにより調べ ることができる。免疫方法 (例えば、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与部位、免疫期間 等）は、通常ワクチン等の免疫原性を調べるときに使用される一般的な手法に従い行 えばよい。より具体的には、抗原蛋白を 25%(vol/vol)水酸ィ匕アルミニウムゲルカ卩生理 食塩水で 5倍階段希釈した希釈列を調製し、 1希釈列あたり 5— 10匹のマウス (ddy、 5 週齢、雌)皮下投与して免疫する。免疫の 3週間後に豚丹毒菌の強毒株である藤沢 株の生菌をマウス皮内に注射し、 10日間、マウスの生死を観察する。抗原蛋白の免 疫効果は、その蛋白の半数防御量 (PD50)を以つて判定する。
[0052] 本発明の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白は、不溶性の状態で精製した後、尿素、塩酸 グァ-ジン、アルギニン塩酸塩等の可溶化剤で可溶化し、メンブランフィルタ一等で 無菌ろ過し、豚丹毒菌及びその他の感受性動物、例えば、イノシシ、鯨類、鶏、七面 鳥及びヒトへの感染を防御するためのワクチン原料として使用される。これに、水酸化 アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミネラルオイル及びノンミネラルオイル等の免疫賦 活剤、ポリソルベート 80、アミノ酸及びラタトースゃスクロース等の糖等の安定剤及び ホルマリン、チメロサール、 2—フエノキシエタノール、ベンジルアルコール、塩化ベン ゼトニゥム及び塩ィ匕ベンザルコ -ゥム等の保存剤を適宜選択して添加することにより 製剤化が行われる。また、賦形剤としての効果を有するラタトース、スクロース等の糖 を添加した場合、凍結乾燥製剤として製剤化することも可能である。
[0053] 以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明するが、この例示に限定 されるものではない。なお、以下に示す実施例では、特に断りのない限り、和光純薬 、宝酒造、 Difco社製の試薬を使用した。
実施例 1
[0054] (1) SpaA蛋白及び Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子のクローニング
豚丹毒菌血清型 1型の藤沢株及び小金井株、血清型 2型の多摩 96株及び SE-9株 を 0.1 %Tween80添カ卩ブレインハートインフュージョン培地（Difco)で 37°C、 16— 48時 間培養した。培養菌液 (約 1.5— 3.0mL)を遠心して得られた沈殿 (約 0.03g以上)より 、 DNA抽出キット（Isoplant、株式会社-ツボンジーン）を用いて全ゲノム DNAを抽出し た。
[0055] これを铸型として、配列番号 1記載の塩基配列に基づき作製した合成プライマー（ 配列番号 3と 4のペア一、配列番号 3と 5のペア一）と LAPCRキット（宝酒）を用いて PCRを行った。反応液を 94°Cに 3分間保持した後、 94°C-60秒、 56°C-30秒、 72°C-60 秒のサイクルを 30回繰り返した。配列番号 3のプライマーは、 SpaA遺伝子の第 79番目 の塩基より下流領域を増幅させるために設計したもので、その 5'末側に Ncolサイトが 付加されている。配列番号 4及び 5のプライマーは、それぞれ SpaA遺伝子の第 1260 番目及び第 1881番目の塩基 (SpaA遺伝子の終止コドン)までを増幅させるために設 計したもので、これらの 5，末側には BamHIサイトが付加されている。 PCRにより、第 79 一 1881番目の塩基配列を有する SpaA遺伝子及び第 79— 1260番目の塩基配列を有 する Δ SpaA遺伝子が得られる。 [0056] PCRにより増幅した DNA断片を Ncol及び BamHIで二重消化し、得られる消化物と予 め Ncol及び BamHIで二重消化したプラスミド pETl Id (Novagen社）とを T4DNAリガ一 ゼを用いて連結した。この反応液と大腸菌 JM109を混合し、氷中に数十秒間放置し た後、アンピシリン g/ml含有 LB寒天培地（1.0%Tryptone、 0.5%Yeast Extract, 1.0%NaCl、 1.5%寒天、 pH7.0)に塗布し、 37°Cでー晚放置した。シングルコロニーを アンピシリン g/ml含有 LB培地 1一 5mLに接種し、 30— 37°Cで振騰し、定法に従 V、菌体力も SpaA蛋白及び Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子を有するプラスミドを抽出 した（図 1 a、図 1 b)。
[0057] (2) SpaA蛋白及び Δ SpaA蛋白の発現
実施例 1— (1)と同様の方法に従って、各菌株由来のプラスミドを大腸 BL2KDE3)に 導入し、形質転換したシングルコロニーを得た。シングルコロニーをアンピシリン 50 g/ml含有 LB培地 1一 5mLに接種し、 30— 37°Cで振騰しながら、培養菌液の
OD600nm値が 0.6— 1.0に達するまで培養した。この菌液に 1/100容の IPTG(lOOmM) 溶液を加え、更に 37°Cで 2— 3時間振騰培養した。当該培養液と等量の 2 X SDSサン プルバッファーを混合し、 100°Cで 2分間加熱処理した後、 SDS-ポリアクリルアミドゲル 電気泳動（SDS-PAGE)にかけ、クマシ一ブリリアントブルー（ナカライテスタ社製)で 染色した。全ての菌株において 70及び 45kD付近のバンドが検出され、これらの染色 像から SpaA蛋白及び Δ SpaA蛋白の発現を確認した。図 2Aは SE-9株由来 SpaA蛋白 及び A SpaA蛋白の SDS-PAGEの結果を、図 2Bは藤沢株、多摩 96株、小金井株及び SE-9株由来 SpaA蛋白及び Δ SpaA蛋白の SDS-PAGEの結果をそれぞれ示す。
[0058] (3) SpaA蛋白及び Δ SpaA蛋白の形状
SpaA蛋白及び Δ SpaA蛋白の封入体形成の有無を以下の方法で調べた。実施例 1 一（2)の培養菌液を 10000rpm、 5分間遠心し、得られた沈渣に、もとの培養菌液量の 1/5— 1/10容の洗浄バッファー（20mM Tris- HC1 pH7.5, 10mM EDTA,
l%TritonX- 100)あるいは蒸留水をカ卩え、均一になるまで縣濁した。この縣濁液にリゾ チーム溶液 (lOmgZml)を 1/100容量添カ卩し、 30°C、 15分間感作した後、氷冷下、ハン ディーソ-ケ一ター（メーカー；トミー精ェ、モデル； UR- 20P、アウトプット； 5、時間； 15 秒、 2— 4回）で超音波処理し、 15000 rpmで 15分間遠心分離した。遠心上清を回収 した後、その沈渣に遠心前の超音波処理液と等量の洗浄バッファーをカ卩えて再び均 一になるまで縣濁した。回収した遠心上清及び沈渣縣濁液のそれぞれに等量の 2 X SDSサンプルバッファーをカ卩ぇカ卩熱後、 SDS- PAGEにかけ、クマシ一ブリリアントブル 一で染色した。 A SpaA蛋白が沈渣縣濁液に認められた場合、当該 A SpaA蛋白は封 入体を形成していると判定した（図 3)。その結果、 SE-9株の数クローンに封入体の形 成が認められた (表 1)。表 1は、調べたクローン数に対する封入体形成クローン数を 示す。なお、 NDは、未実施を意味する。
[0059] [表 1]
Figure imgf000018_0001
[0060] (4)封入体形成菌の塩基配列
次に、表 1の封入体を形成した SE-9株 4クローン（Nol、 No2、 No3及び No4)よりプラ スミドを抽出し、 Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子の塩基配列を解析した (タカラバイオ カスタムサービスセンターに依頼)。配列番号 7の配列と比較した結果、表 2に示した 塩基の変異によるアミノ酸置換が認められた。
[0061] [表 2]
Figure imgf000018_0002
実施例 2
( 1) Δ SpaA蛋白のアミノ酸置換による発現蛋白の封入体ィ匕
実施例 1 (4)の封入体形成菌由来のプラスミドを適当な制限酵素で切断して得ら れる表 2の塩基置換を含む DNA断片を、可溶性の Δ SpaA蛋白を発現する菌体（ SE-9株)より抽出したプラスミドの Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子の相当する領域に 置換挿入したプラスミドを構築した。
[0063] より具体的には、
a)クローン Nolのプラスミドを制限酵素 EcoRI及び Clalで二重消化し、ァガロース電気 泳動にかけ、 Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子の第 587番目から 1152番目を含む EcoRI— Clal断片（図 4A— a)を分離 '精製した。これを、予め EcoRI及び Clal処理した 可溶性の Δ SpaA蛋白を発現する菌体 (SE-9株）由来のプラスミドに挿入し、 A SpaA 蛋白をコードする遺伝子の第 642番目及び第 758番目の塩基が置換されたプラスミド を構築した。
[0064] 同様の手法により、
b)クローン No3由来の Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子の第 587番目から 1152番目を 含む EcoRI— Clal断片（図 4A— b)を挿入したプラスミド (第 833番目の塩基置換)、 c)クローン No2由来の Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子の第 266番目から 1152番目を 含む Kpnl— C 断片（図 4A— c)を挿入したプラスミド (第 461番目と第 608番目の塩基 置換)、及び
d)クローン No2由来の Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子の第 587番目から 1152番目を 含む EcoRI— Clal断片（図 4A— d)を挿入したプラスミド (第 608番目の塩基置換)を構 築した。
[0065] e) Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子の第 206番目の塩基が置換されたプラスミドは、 可溶性の Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子 (SE-9株由来）の第 266番目から 1152番目 を含む Kpnl— Clal断片（図 4A— e)を Kpnl及び Clal処理したクローン No2由来のプラス ミドに挿入することにより構築した。
[0066] また、 f ) Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子の第 642番目の塩基が置換されたプラスミ ドは、サイトダイレクテイドミュータジエネシス法（Takara、 Mutan- Super Express Km)に より構築した。より具体的には、可溶性の Δ SpaA蛋白を発現する菌体 (SE-9株）由来 のプラスミド（図 1 b)を、 EcoRI及び Hindlllで二重消化し、 Δ SpaA蛋白をコードする 遺伝子の第 587番目から 1260番目及びプラスミド（pETlld)の一部を含む EcoR卜 Hindlll断片（967bp)をベクタープラスミド pKF18k (Takara社）にクローユングした。これ を铸型として、配列番号 6の変異導入用合成オリゴヌクレオチド（ Δ SpaA蛋白をコード する遺伝子の第 642番目の塩基 Tを Gに置換した第 632番目から第 657番目の配列を 有する）、 Takara社の Mutan- Super Express Kmキットに添付のセレクションプライマー 5pmol、 10 X LAPCRバッファー（ + Mg2+) 5 1、 dNTP混合液 8 μ 1、 LA- Taqポリメラーゼ 溶液 0.5 1及び滅菌蒸留水をカ卩ぇ 50 1とし、実施例 1-(1)と同様に PCRを行った。 この PCR反応液をエタノール沈殿 Z洗浄した後に大腸菌 MV1184株 (Takara社）にク ローニングした。得られた変異導入プラスミドを EcoRI及び BamHIで二重消化し、 Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子の第 587番目から 1260番目を含む EcoRI— BamHI断片 を分離'精製した。この断片を出発材料である可溶性の A SpaA蛋白を発現する菌体 (SE-9株）由来のプラスミドの相同部分に置換挿入し、 目的のプラスミドを得た。藤沢 株、多摩 96株由来の A SpaA蛋白をコードする遺伝子についても、前記と同様の方法 に従い、第 642番目の塩基 Tが Gに置換されたプラスミドを構築した。
[0067] このようにして得られたプラスミドで大腸菌 BL2KDE3)を形質転換し、実施例ト（3) に従って Δ SpaA蛋白の形状を調べた結果、何れのプラスミドで形質転換した場合も Δ SpaA蛋白は封入体を形成して!/、た。
[0068] (2)全長 SpaA蛋白のアミノ酸置換による発現蛋白の封入体ィ匕
実施例 1 (4)の封入体形成菌由来のプラスミドを適当な制限酵素で切断して得ら れる表 2の塩基置換を含む DNA断片を、可溶性の SpaA蛋白を発現する菌体 (SE-9 株)より抽出したプラスミドの SpaA蛋白をコードする遺伝子の相当する領域に置換挿 入したプラスミドを構築した。
[0069] より具体的には、
a)クローン No4由来のプラスミドを制限酵素 Clal及び BamHIで二重消化し、ァガロー ス電気泳動にかけ、 SpaA蛋白をコードする遺伝子の第 1152番目力 第 1881番目の 塩基（SpaA遺伝子の終止コドン）までの配列を含む Clal— BamHI断片（図 4B— a)を分 離'精製した。これを、予め Clal及び BamHI処理した可溶性の全長 SpaA蛋白を発現 する菌体 (SE-9株）由来のプラスミドに挿入し、 SpaA蛋白をコードする遺伝子の 1591 番目の塩基が置換されたプラスミドを構築した。
[0070] b)実施例 2—（1) a)のプラスミドを Pstl及び Clalで二重消化し、ァガロース電気泳 動にかけ、 Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子の第 611番目から 1152番目の配列を含む Pstl— C 断片（図 4A— f)を分離 '精製した。これを、予め Pstl及び Clal処理した可溶 性の全長 SpaA蛋白を発現する菌体 (SE-9株）由来のプラスミドに挿入し、 SpaA蛋白 をコードする遺伝子の第 642番目及び第 758番目の塩基が置換されたプラスミドを構 築した。
[0071] このようにして得られたプラスミドで大腸菌 BL2KDE3)株を形質転換し、実施例 1 (3 )に従って発現蛋白の形状を調べた結果、 SpaA蛋白は封入体として発現された（図 5
) o
実施例 3
[0072] (1)封入体を形成する SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の精製
実施例 2— (1)で得た Δ SpaA蛋白を封入体として発現する大腸菌及び実施例 2—（ 2)で得た全長 SpaA蛋白を封入体として発現する大腸菌をそれぞれ培養し、各培養 菌液 100 mlを、 10000 rpm、 5分間遠心し、得られた沈渣に、もとの培養菌液量の 1/5 一 1/10容の洗浄バッファー（20mM Tris- HCl pH7.5, 10mM EDTA, 1% TritonX- 100 )を加え、均一になるまで縣濁した。この縣濁液にリゾチーム溶液 (lOmgZml)を 1/100 容量添加し、 30°C、 15分間静置した後、氷冷下、音波照射型細胞破砕機 (メーカー； Branson Sonic Power Co.、モデル； 350、アウトプット； 4、 Duty Cycle ;30%,時間 5— 15分)で超音波処理し、 15000 rpmで 15分間遠心分離した。遠心上清を除去した後、 その沈渣に遠心前の超音波処理液と等量の洗浄バッファー (又は滅菌蒸留水）をカロ えて再び均一になるまで縣濁した。この縣濁液を 15000 rpmで 15分間遠心分離し、遠 心上清を除去して洗浄バッファー (又は滅菌蒸留水)を加えた。この遠心'洗浄操作 を 3— 5回繰り返した。なお、洗浄の最終段階では遠心沈渣を滅菌蒸留水に縣濁した 。この縣濁液を再び 15000 rpmで 15分間遠心分離し、遠心上清を除去した後、沈渣 を 8M尿素溶液 10 mlに縣濁した。室温で 2時間、さらに 5°Cで 18時間穏やかに振騰を 加えながら、封入体蛋白を可溶ィ匕したものを精製 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白とした。 SDS-PAGE後のゲルをクマシ一ブルー染色し、デンシトメ一ターで測定した結果、こ の操作により得られる SpaA蛋白及び Δ SpaA蛋白は、 90%以上の純度を示した（図 6)
[0073] (2) SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の免疫原性 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の免疫原性を次のとおり確認した。実施例 3— (1)で精 製した SpaA蛋白又は ASpaA蛋白溶液 4 mlに、生理食塩水 11 mlと水酸ィ匕アルミ-ゥ ムゲルアジュバント（ALHYDROGEL"85，，、 Superfos Biosector社） 5 mlをカ卩え、室温で 2時間穏やかに振騰し、ワクチン液とした。このワクチン液を 25%(vol/vol)水酸ィ匕アル ミニゥムゲル加生理食塩水で 5倍階段希釈した希釈列を調製し、 1希釈列あたり 10匹 のマウス (ddy、 5週齢、雌)皮下に 0.5 ml注射して免疫した。免疫の 3週間後に豚丹毒 菌藤沢株の生菌約 1000個をマウス皮内に注射して攻撃した。 10日間マウスの生死を 観察し、精製した SpaA蛋白又は ASpaA蛋白の半数防御量 (PD50)を求めた。表 3に 示したとおり、精製した SpaA又は Δ SpaA蛋白の半数防御量（PD50)は、 0.0621— 0.1885 gと、きわめて高い免疫原性を有していた。マウス半数防御量 (50%有効量） 【ま、 Behrens— Karber法 (Karber u: Beitrag zur kollektiven Behandiung
pharmakologischer Reihenversuche. Arch. Exp. Path. Pharm., 162:480, 1931.、糸田菌 学実習提要改訂 5版医科学研究所学友会編 (丸善)、 p.564-565)により、次式のと おり計算した。
マウス半数防御量 g) =10m、 m=X-[(h +h)(X-X)Xl/2 + (h +h )(X— X )X
4 0 1 1 0 1 2 2 1 l/2+(h +h)(X-X)X l/2+(h +h)(X-X)X 1/2]
2 3 3 2 4 3 4 3
ここで、 X , X , Xは各接種量の対数であり、 h, h , hはそれに対する実
0 1 4 0 1 4
測効果率 (生存数 Z攻撃数)である。なお、各接種量の対数 (X)は、 X=Log
10〔試料の 蛋白濃度 g/ml) Xマウス注射量 (ml) ÷希釈倍数〕の式で与えられる。
[表 3]
精製蛋白 Δ SpaA SpaA
SpaA遺伝 第 642番目 第 206番目 第 833番目 第 1591番目 第 642番目 子の置換 第 758番目 第 461番目 第 758番目 部位 第 608番目
蛋白濃度 2.30 1.91 2.33 2.11 2.28
(mg/ral)
希釈倍数 生存数/攻 生存数/攻 生存数/攻 生存数/攻撃 生存数/攻
撃数 撃数 撃数 数 撃数
625 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10
3125 9/10 8/10 10/10 10/10 10/10
15625 5/10 0/10 4/10 4/10 6/10
78125 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
マウス半 0.0864 0.1885 0.0875 0.0793
数防御量
g) 産業上の利用可能性
本発明の方法は、大腸菌で可溶性の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白を不溶性の封入 体として生産する方法を提供するもので、本発明の方法を可溶性蛋白の製造工程に 取り入れることにより、実用的なレベルでの SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白の製造方法の 確立を可能にし、当該製造方法が確立されることによって SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白 の巿場への安定供給が確保される。本発明の方法により得られる組 o換 SpaA
Oえ 蛋白又 は Δ SpaA蛋白は、本来の可溶性蛋白と同等の免疫原性を保持しており一、単独で又 は種々の安定剤、保護剤、防腐剤等の添加物と共に用いることにより、豚丹毒ワクチ ンの材料として利用できる。また、モノクローナル Zポリクローナル抗体を作製する際 の抗原として、あるいは、抗 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白抗体と豚丹毒菌との結合に関 する研究材料として利用できる。このように、本発明の方法により得られる SpaA蛋白 又は Δ SpaA蛋白は、医療及び研究分野にお 、て多大なる貢献をするものである。

Claims

請求の範囲 [1] 免疫原性を有し且つ大腸菌において封入体として発現される、豚丹毒菌表層防御 抗原 SpaA蛋白又はその一部を除去した短縮型の Δ SpaA蛋白の変異体を製造する 方法であって、該 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子に該 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列にアミノ酸置換を導入するような変異を起こさせ、該変異 を有する遺伝子を大腸菌中で発現させ、ついで発現された変異体のうちから封入体 を形成したものを選択することを含む方法。 [2] 下記 (A)ないし (D) : (A)可溶性の豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝 子にアミノ酸置換が起こるように変異を導入する、 (B)前記の変異遺伝子を有する発現ベクターで大腸菌を形質転換する、 (C)前記形質転換した大腸菌から不溶性の封入体を形成する大腸菌を選択する、 ついで (D)前記大腸菌を培養し、菌体内の封入体を回収する の工程を含む、請求項 1に記載の方法。 [3] 工程 (D)の後にさらに下記 (E)—（F) : (E)前記封入体又は可溶化剤で処理した封入体を豚丹毒菌感受性動物に投与した 後、豚丹毒菌の強毒株で攻撃する、ついで (F)前記豚丹毒菌感受性動物の生死により豚丹毒菌の感染に対する防御能 (免疫 原性)の有無を判定する の工程を含む、請求項 2に記載の方法。 [4] 該アミノ酸置換が、下記（1)ないし (7)：
(1)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(2)シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(3)シグナルペプチドを含む N末端より第 203番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(4)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(5)シグナルペプチドを含む N末端より第 253番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(6)シグナルペプチドを含む N末端より第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換;及び (7)シグナルペプチドを含む N末端より第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換 よりなる群から選ばれた一つ又は二つ以上の組合せである、請求項 1ないし 3のいず れかに記載の方法。
[5] 該アミノ酸置換が、下記 (a)ないし (h)：
(a)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(b)シグナルペプチドを含む N末端より第 203番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(c)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(d)シグナルペプチドを含む N末端より第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(e)シグナルペプチドを含む N末端より第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(f)シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目及び第 203番目のアミノ酸を各々グ リシン及びトレォニンに置換；
(g)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目及び第 253番目のアミノ酸を各々グ ルタミン及びトレォニンに置換;又は
(h)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目、第 154番目及び第 203番目のァミノ 酸を各々グリシン、グリシン及びトレォニンに置換
の！、ずれか一つである、請求項 1な!、し 3の!、ずれかに記載の方法。
[6] 豚丹毒菌が、藤沢株、小金井株、多摩 96株、 SE-9株及び静岡 63株よりなる群から 選ばれる、請求項 1な 、し 5の 、ずれかに記載の方法。
[7] 該アミノ酸置換を導入する前の SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白が、それぞれ配列番号 2 に示す配列又はその C末側を除去した配列を有する、請求項 1な!、し 6の 、ずれか に記載の方法。
[8] 免疫原性を有し且つ大腸菌において封入体として発現される、豚丹毒菌表層防御 抗原 SpaA蛋白又はその一部を除去した短縮型の Δ SpaA蛋白の変異体。
[9] SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列中にアミノ酸置換が導入されたアミノ酸配 列を有する、請求項 8に記載の変異体。
[10] 該 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子に該 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白 のアミノ酸配列中にアミノ酸置換を導入するような変異を起こさせ、該変異を有する遺 伝子を大腸菌中で発現させ、ついで発現された変異体のうちから封入体を形成した ものを選択することによって得られる、請求項 8又は 9に記載の変異体。
[11] 下記 (A)ないし (D) :
(A)可溶性の豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝 子にアミノ酸置換が起こるように変異を導入する、
(B)前記の変異遺伝子を有する発現ベクターで大腸菌を形質転換する、
(C)前記形質転換した大腸菌から不溶性の封入体を形成する大腸菌を選択する、 ついで
(D)前記大腸菌を培養し、菌体内の封入体を回収する
の工程を行うことによって得られる、請求項 8ないし 10のいずれかに記載の変異体。
[12] 工程 (D)の後にさらに下記 (E)—（F) :
(E)前記封入体又は可溶化剤で処理した封入体を豚丹毒菌感受性動物に投与した 後、豚丹毒菌の強毒株で攻撃する、ついで
(F)前記豚丹毒菌感受性動物の生死により豚丹毒菌の感染に対する防御能 (免疫 原性)の有無を判定する
の工程を行うことによって得られる、請求項 11に記載の変異体。
[13] 該アミノ酸置換が、下記（1)ないし (7)：
(1)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(2)シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(3)シグナルペプチドを含む N末端より第 203番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(4)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(5)シグナルペプチドを含む N末端より第 253番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(6)シグナルペプチドを含む N末端より第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換;及び
(7)シグナルペプチドを含む N末端より第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換 よりなる群から選ばれた一つ又は二つ以上の組合せである、請求項 8ないし 12のい ずれかに記載の変異体。
[14] 該アミノ酸置換が、下記 (a)な 、し (h)：
(a)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(b)シグナルペプチドを含む N末端より第 203番目のアミノ酸をグルタミンに置換； (c)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(d)シグナルペプチドを含む N末端より第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(e)シグナルペプチドを含む N末端より第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(f)シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目及び第 203番目のアミノ酸を各々グ リシン及びトレォニンに置換；
(g)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目及び第 253番目のアミノ酸を各々グ ルタミン及びトレォニンに置換;又は
(h)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目、第 154番目及び第 203番目のァミノ 酸を各々グリシン、グリシン及びトレォニンに置換
の！、ずれか一つである、請求項 8な!、し 12の!、ずれかに記載の変異体。
[15] 配列番号 2で示される配列又はその C末側を除去した配列中にアミノ酸置換が導 入されたアミノ酸配列を有する、請求項 8な 、し 14の 、ずれかに記載の変異体。
[16] 該 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白力 藤沢株、小金井株、多摩 96株、 SE-9株及び静岡
63株よりなる群力 選ばれた豚丹毒菌に由来するものである、請求項 8ないし 15のい ずれかに記載の変異体。
[17] 免疫原性を有し且つ大腸菌において封入体として発現される、豚丹毒菌表層防御 抗原 SpaA蛋白又はその一部を除去した短縮型の Δ SpaA蛋白の変異体を主成分とし て含む組成物。
[18] 該変異体が、 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列中にアミノ酸置換が導入さ れたアミノ酸配列を有する、請求項 17に記載の組成物。
[19] 該変異体が、該 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子に該 SpaA蛋白又は
Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列中にアミノ酸置換を導入するような変異を起こさせ、該変 異を有する遺伝子を大腸菌中で発現させ、ついで発現された変異体のうちから封入 体を形成したものを選択することによって得られたものである、請求項 17又は 18に記 載の組成物。
[20] 該変異体が、下記 (A)な 、し (D)：
(A)可溶性の豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝 子にアミノ酸置換が起こるように変異を導入する、 (B)前記の変異遺伝子を有する発現ベクターで大腸菌を形質転換する、
(C)前記形質転換した大腸菌から不溶性の封入体を形成する大腸菌を選択する、 ついで
(D)前記大腸菌を培養し、菌体内の封入体を回収する
の工程を行うことによって得られたものである、請求項 17ないし 19のいずれかに記載 の組成物。
[21] 該変異体が、工程 (D)の後にさらに下記 (E)— (F)：
(E)前記封入体又は可溶化剤で処理した封入体を豚丹毒菌感受性動物に投与した 後、豚丹毒菌の強毒株で攻撃する、ついで
(F)前記豚丹毒菌感受性動物の生死により豚丹毒菌の感染に対する防御能 (免疫 原性)の有無を判定する
の工程を行うことによって得られたものである、請求項 20に記載の組成物。
[22] 該変異体における該アミノ酸置換が、下記（1)ないし (7)：
(1)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(2)シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(3)シグナルペプチドを含む N末端より第 203番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(4)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(5)シグナルペプチドを含む N末端より第 253番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(6)シグナルペプチドを含む N末端より第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換;及び
(7)シグナルペプチドを含む N末端より第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換 よりなる群から選ばれた一つ又は二つ以上の組合せである、請求項 17ないし 21のい ずれかに記載の組成物。
[23] 該変異体における該アミノ酸置換力 下記 (a)な 、し (h)：
(a)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(b)シグナルペプチドを含む N末端より第 203番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(c)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(d)シグナルペプチドを含む N末端より第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(e)シグナルペプチドを含む N末端より第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換； (f)シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目及び第 203番目のアミノ酸を各々グ リシン及びトレォニンに置換；
(g)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目及び第 253番目のアミノ酸を各々グ ルタミン及びトレォニンに置換;又は
(h)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目、第 154番目及び第 203番目のァミノ 酸を各々グリシン、グリシン及びトレォニンに置換
のいずれか一つである、請求項 17ないし 21のいずれかに記載の組成物。
[24] 該変異体が、配列番号 2で示される配列又はその C末側を除去した配列中にァミノ 酸置換が導入されたアミノ酸配列を有する、請求項 17ないし 23のいずれかに記載の 組成物。
[25] 該変異体が、藤沢株、小金井株、多摩 96株、 SE-9株及び静岡 63株よりなる群から 選ばれた豚丹毒菌に由来するものである、請求項 17ないし 24のいずれかに記載の 組成物。
[26] 免疫原性を有し且つ大腸菌において封入体として発現される、豚丹毒菌表層防御 抗原 SpaA蛋白又はその一部を除去した短縮型の Δ SpaA蛋白の変異体をコードする 遺伝子。
[27] SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列中にアミノ酸置換が導入されたアミノ酸配 列をコードする、請求項 26に記載の遺伝子。
[28] 該 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子に該 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白 のアミノ酸配列中にアミノ酸置換を導入するような変異を起こさせ、該変異を有する遺 伝子を大腸菌中で発現させ、ついで発現された変異体のうちから封入体を形成した ものを選択することによって得られたものである、請求項 26又は 27に記載の遺伝子。
[29] 下記 (A)ないし (D) :
(A)可溶性の豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝 子にアミノ酸置換が起こるように変異を導入する、
(B)前記の変異遺伝子を有する発現ベクターで大腸菌を形質転換する、
(C)前記形質転換した大腸菌から不溶性の封入体を形成する大腸菌を選択する、 ついで (D)前記大腸菌を培養し、菌体内の封入体を回収する
の工程を行うことによって得られたものである、請求項 26ないし 28のいずれかに記載 の遺伝子。
[30] 工程 (D)の後にさらに下記 (E)—（F) :
(E)前記封入体又は可溶化剤で処理した封入体を豚丹毒菌感受性動物に投与した 後、豚丹毒菌の強毒株で攻撃する、ついで
(F)前記豚丹毒菌感受性動物の生死により豚丹毒菌の感染に対する防御能 (免疫 原性)の有無を判定する
の工程を行うことによって得られたものである、請求項 29に記載の遺伝子。
[31] 該変異体における該アミノ酸置換が、下記（1)ないし (7)：
(1)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(2)シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(3)シグナルペプチドを含む N末端より第 203番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(4)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(5)シグナルペプチドを含む N末端より第 253番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(6)シグナルペプチドを含む N末端より第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換;及び
(7)シグナルペプチドを含む N末端より第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換 よりなる群から選ばれた一つ又は二つ以上の組合せである、請求項 26ないし 30のい ずれかに記載の遺伝子。
[32] 該変異体における該アミノ酸置換力 下記 (a)な 、し (h)：
(a)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(b)シグナルペプチドを含む N末端より第 203番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(c)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(d)シグナルペプチドを含む N末端より第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(e)シグナルペプチドを含む N末端より第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(f)シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目及び第 203番目のアミノ酸を各々グ リシン及びトレォニンに置換；
(g)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目及び第 253番目のアミノ酸を各々グ ルタミン及びトレォニンに置換;又は
(h)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目、第 154番目及び第 203番目のァミノ 酸を各々グリシン、グリシン及びトレォニンに置換
の！、ずれか一つである、請求項 26な!、し 30の!、ずれかに記載の遺伝子。
[33] 配列番号 2で示される配列又はその C末側を除去した配列中にアミノ酸置換が導 入されたアミノ酸配列をコードする、請求項 26ないし 32のいずれかに記載の遺伝子
[34] 藤沢株、小金井株、多摩 96株、 SE-9株及び静岡 63株よりなる群カゝら選ばれた豚丹 毒菌に由来するものである、請求項 26ないし 33のいずれかに記載の遺伝子。
[35] 配列番号 1において、下記（1)ないし（7)：
(1)配列番号 1記載の塩基配列において第 206番目の塩基が G ;
(2)配列番号 1記載の塩基配列において第 461番目の塩基が G ;
(3)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 608番目の塩基力 C；
(4)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 642番目の塩基が G；
(5)配列番号 1記載の塩基配列において第 758番目の塩基が C ;
(6)配列番号 1記載の塩基配列において第 833番目の塩基が G ;及び
(7)配列番号 1記載の塩基配列において第 1591番目の塩基が G
よりなる群力 選ばれた一つ又は二つ以上の組合せの塩基置換を含む塩基配列又 はその 3 '側を除去した塩基配列を有する、請求項 26な 、し 34の 、ずれかに記載の 遺伝子。
[36] 配列番号 1にお 、て、下記 (a)な 、し (h)：
(a)配列番号 1記載の塩基配列において第 206番目の塩基が G;
(b)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 608番目の塩基が C；
(c)配列番号 1記載の塩基配列において第 642番目の塩基が G;
(d)配列番号 1記載の塩基配列において第 833番目の塩基が G;
(e)配列番号 1記載の塩基配列において第 1591番目の塩基が G ;
(f)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 461番目及び第 608番目の塩基が各々 G 及び C ; (g)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 642番目及び第 758番目の塩基が各々 G 及び C ;又は
(h)配列番号 1記載の塩基配列にお!、て第 206番目、第 461番目及び第 608番目の 塩基が各々 G、 G及び C
の!、ずれか一つの塩基置換を含む塩基配列又はその 3 '側を除去した塩基配列を 有する、請求項 26ないし 34のいずれかに記載の遺伝子。
[37] 免疫原性を有し且つ大腸菌において封入体として発現される、豚丹毒菌表層防御 抗原 SpaA蛋白又はその一部を除去した短縮型の Δ SpaA蛋白の変異体の、豚丹毒ヮ クチンの製造における使用。
[38] 該変異体が、 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列中にアミノ酸置換が導入さ れたアミノ酸配列を有する、請求項 37に記載の使用。
[39] 該変異体が、該 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝子に該 SpaA蛋白又は
Δ SpaA蛋白のアミノ酸配列中にアミノ酸置換を導入するような変異を起こさせ、該変 異を有する遺伝子を大腸菌中で発現させ、ついで発現された変異体のうちから封入 体を形成したものを選択することによって得られる、請求項 37又は 38に記載の使用
[40] 該変異体が、下記 (A)な 、し (D)：
(A)可溶性の豚丹毒菌表層防御抗原 SpaA蛋白又は Δ SpaA蛋白をコードする遺伝 子にアミノ酸置換が起こるように変異を導入する、
(B)前記の変異遺伝子を有する発現ベクターで大腸菌を形質転換する、
(C)前記形質転換した大腸菌から不溶性の封入体を形成する大腸菌を選択する、 ついで
(D)前記大腸菌を培養し、菌体内の封入体を回収する
の工程を行うことによって得られたものである、請求項 37ないし 39のいずれかに記載 の使用。
[41] 該変異体が、工程 (D)の後にさらに下記 (E)— (F)：
(E)前記封入体又は可溶化剤で処理した封入体を豚丹毒菌感受性動物に投与した 後、豚丹毒菌の強毒株で攻撃する、ついで (F)前記豚丹毒菌感受性動物の生死により豚丹毒菌の感染に対する防御能 (免疫 原性)の有無を判定する
の工程を行うことによって得られたものである、請求項 40に記載の使用。
[42] 該変異体における該アミノ酸置換が、下記（1)ないし (7)：
(1)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(2)シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(3)シグナルペプチドを含む N末端より第 203番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(4)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(5)シグナルペプチドを含む N末端より第 253番目のアミノ酸をトレオニンに置換；
(6)シグナルペプチドを含む N末端より第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換;及び
(7)シグナルペプチドを含む N末端より第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換 よりなる群から選ばれた一つ又は二つ以上の組合せである、請求項 37ないし 41のい ずれかに記載の使用。
[43] 該変異体における該アミノ酸置換力 下記 (a)な 、し (h)：
(a)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(b)シグナルペプチドを含む N末端より第 203番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(c)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目のアミノ酸をグルタミンに置換；
(d)シグナルペプチドを含む N末端より第 278番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(e)シグナルペプチドを含む N末端より第 531番目のアミノ酸をグリシンに置換；
(f)シグナルペプチドを含む N末端より第 154番目及び第 203番目のアミノ酸を各々グ リシン及びトレォニンに置換；
(g)シグナルペプチドを含む N末端より第 214番目及び第 253番目のアミノ酸を各々グ ルタミン及びトレォニンに置換;又は
(h)シグナルペプチドを含む N末端より第 69番目、第 154番目及び第 203番目のァミノ 酸を各々グリシン、グリシン及びトレォニンに置換
のいずれか一つである、請求項 37ないし 41のいずれかに記載の使用。
[44] 該変異体が、配列番号 2で示される配列又はその C末側を除去した配列中にァミノ 酸置換が導入されたアミノ酸配列を有する、請求項 37な ヽし 43の ヽずれかに記載の 使用。
該変異体が、藤沢株、小金井株、多摩 96株、 SE-9株及び静岡 63株よりなる群から 選ばれた豚丹毒菌に由来するものである、請求項 37ないし 44のいずれかに記載の 使用。
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