JP2003528615A - 組換え鉄取り込みタンパク質 - Google Patents

組換え鉄取り込みタンパク質

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JP2003528615A JP2001570797A JP2001570797A JP2003528615A JP 2003528615 A JP2003528615 A JP 2003528615A JP 2001570797 A JP2001570797 A JP 2001570797A JP 2001570797 A JP2001570797 A JP 2001570797A JP 2003528615 A JP2003528615 A JP 2003528615A
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リチャード ゴリンジ，アンドリュー
ジョン ハドソン，マイケル
アン マセソン，マリー
ロビンソン，アンドリュー
マッキー ウエスト，デイヴィッド
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マイクロバイオロジカル リサーチ オーソリティ
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Abstract

(57)【要約】 トランスフェリン結合タンパク質Ａ（ＴｂｐＡ）およびＢ（ＴｂｐＢ）を両方とも全長形態でそして免疫原性フラグメントとして含むナイセリア鉄取り込みタンパク質が、組換え作成される。非ナイセリア細胞は、ＴｂｐＡを発現し、これは緩和条件下で該細胞から抽出され、そしてその表面上で天然のＴｂｐＡの抗原性を実質的に保持する。ＴｂｐＢも組換え作成され、そしてＴｂｐＡおよびＴｂｐＢは両方ともワクチン組成物に含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、組換え鉄取り込みタンパク質、特に、組換えトランスフェリン結合
タンパク質およびそれに基づくワクチンに関する。
【０００２】 髄膜炎菌性髄膜炎は、世界的な健康問題として特に重要であり、そして多くの
国で感染の発生が増加している。Neisseria meningitidis（髄膜炎菌）は、この
疾患を引き起こす生物であり、そして髄膜炎菌性敗血症の原因でもあり、これは
迅速な発現および高い死亡率に関連し、約２２％の症例が死亡している。
【０００３】 髄膜炎菌トランスフェリンレセプターは、適切なワクチン成分であり、そして
トランスフェリン結合タンパク質Ａ（ＴｂｐＡ）およびＴｂｐＢという２タイプ
の構成タンパク質鎖から作成される。レセプター複合体は、一本鎖ＴｂｐＢと会
合するＴｂｐＡのダイマーから形成されると提案されている。ＴｂｐＡに存在す
るエピトープは、タンパク質の内部に隠されることが知られている。１つの株の
みに由来するＴｂｐＢに基づく髄膜炎菌性疾患に対するワクチンは、いくつかの
交差反応性を示し、そしてＴｂｐＢのみで免疫したウサギにおいて、交差反応性
免疫応答の証拠がある。
【０００４】 天然の細菌ソースからＴｂｐを得ることは、安全な条件下で大量の髄膜炎菌を
培養することがほぼ不可能であると共に、工業的ワクチン製造に適切な量を得る
ことが困難であることを伴う。したがって、組換えによりＴｂｐを産生すること
が所望される。
【０００５】 ＴｂｐＢの組換え産生は公知であり、大量の組換えタンパク質が提供され、従
来の技法を用いて封入体から抽出される。
【０００６】 ＴｂｐＡは、ナイセリア菌の膜での物理的な位置およびＴｏｎＢとの機能的相
互作用のため、ＴｏｎＢ依存性外膜レセプターといわれるタンパク質のファミリ
ーの１つである。ＴｂｐＢは、ＴｏｎＢ依存性ではないが、トランスフェリンレ
セプターを形成する際のＴｂｐＡとの相互作用のため、本出願の目的においては
この群に加えられる。したがって、この群は、Ｔｂｐおよびラクトフェリン結合
タンパク質を含み、そして全体として鉄取り込みタンパク質という。
【０００７】 鉄取り込みタンパク質を組換え産生する公知の方法における困難性は、得られ
るタンパク質が、これに基づくワクチンに望ましくない非天然のコンホメーショ
ンで回収されることである。他の問題は、いくつかの鉄取り込みタンパク質が、
これまで組換え作成され得ないことであり、そしてこれは、特にＴｂｐＡについ
ての場合である。
【０００８】 大腸菌におけるＴｂｐＢの組換え産生は、Legrainら「Escherichia coliにお
ける脂肪化髄膜炎菌トランスフェリン結合タンパク質２の産生（Production of
lipidated meningococcal transferrin binding protein 2 in Escherichia col
i）」，Protein Expression and Purification 6, 570-578 (1995)から公知であ
る。これは、ＴｂｐＢの産生のための発現系および発酵培養を記載するが、Ｔｂ
ｐＢ精製を記載していない。ＴｂｐＢは、細胞抽出物の不溶性画分に位置すると
いわれ、これは、タンパク質が、不溶性の形態、すなわち、封入体中にあること
を示す。
【０００９】 Lissoloらは、Infection and Immunity, 63:884-90 (1995)で、変性条件を用
いる髄膜炎菌からのＴｂｐＢの精製を記載している。
【００１０】 Renauld-Mongenieらは、J Bacteriol., 179:6400-7 (1997)で、マルトース結
合タンパク質−ＴｂｐＢ融合体としてのＴｂｐＢの発現、次いでマルトース結合
タンパク質に対するアフィニティーシステムを用いる３Ｍ尿素緩衝液での精製を
記載している。
【００１１】 Gonzalezらは、Microbiology, 141:2405-16 (1995)で、胸膜肺炎菌（Actinoba
cillus pleuropneumoniae）のＴｂｐＡおよびＴｂｐＢが、SDSおよびメルカプト
エタノールを含む変性緩衝液でトランスフェリンSepharoseからどのように溶出
されるかを記載している。
【００１２】 Palmerらは、FEMS Microbiology Letters, 第110巻, pp 139-146, 1993で、大
腸菌においてＴｂｐＡが発現した旨を記載している。しかし、Palmerらは、機能
的な形態でＴｂｐＡを回収できなかった。
【００１３】 本発明は、鉄取り込みタンパク質、特にトランスフェリン結合タンパク質の産
生の改良された方法の提供を目的とし、そして特にこのようなタンパク質の代替
および／または改良された組換え産生を提供すること、ならびにＴｂｐＡの組換
え産生を提供することを目的とする。本発明のさらなる目的は、トランスフェリ
ン結合タンパク質を含むワクチンの改良された調製物を提供することである。
【００１４】 本発明の第１の局面は、トランスフェリン結合タンパク質の組換え発現が成功
したこと、ならびに発現されたトランスフェリン結合タンパク質が天然のトラン
スフェリン結合タンパク質の抗原性を保持するという確認に基づく。これは、組
換え産生されたタンパク質がヒトトランスフェリンに結合しそして髄膜炎菌によ
るチャレンジに対する防御免疫を与えるという能力によって証明された。
【００１５】 したがって、本発明は、ナイセリア鉄取り込みタンパク質を発現する非ナイセ
リア細胞を提供し、この鉄取り込みタンパク質は、緩和条件下で該細胞から抽出
され得、そして天然の鉄取り込みタンパク質の抗原性を実質的に保持する。
【００１６】 本発明はさらに、ナイセリア鉄取り込みタンパク質を発現する非ナイセリア細
胞を提供し、この鉄取り込みタンパク質は、該細胞の表面膜に位置する。
【００１７】 特定の実施態様では、本発明は、ナイセリア菌トランスフェリン結合タンパク
質（Ｔｂｐ）を発現する非ナイセリア細胞を提供し、該Ｔｂｐは、緩和条件下で
該細胞から抽出され得、そして天然のＴｂｐＡの抗原性を実質的に保持する。
【００１８】 本発明はさらに、ナイセリア鉄取り込みタンパク質を過剰発現する細胞を提供
する。
【００１９】 鉄取り込みタンパク質は、好ましくは、トランスフェリン結合タンパク質（Ｔ
ｂｐ）、ラクトフェリン結合タンパク質（Ｌｂｐ）、ヘモグロビン結合タンパク
質、エンテロバクチン結合タンパク質、ビブリオバクチン結合タンパク質、鉄シ
デロホア結合タンパク質、ヘム結合タンパク質、ヘミン結合タンパク質、クリソ
バクチン結合タンパク質、ヒドロキシメート結合タンパク質、およびシュードバ
クチン結合タンパク質からなる群より選択され、これらのタンパク質のうちのい
くつかはまた、「結合タンパク質」というよりもむしろ「レセプター」といわれ
る。
【００２０】 ナイセリアＴｂｐを発現する細胞も提供され、このＴｂｐの収量は、培養物１
リットル当り少なくとも４ｍｇ、好ましくは少なくとも７ｍｇ、およびより好ま
しくは少なくとも１０ｍｇである。本発明のこれらの実施態様では、細胞は、好
ましくは細菌であり、そしてＴｂｐはＡまたはＢであり得る。
【００２１】 ＴｂｐＡは、例えば、培養物１リットル当り約６ｍｇから約１２ｍｇの収量で
発現される。
【００２２】 さらに、本発明は、したがって、Ｔｂｐを発現することが知られている生物に
おけるＴｂｐの過剰発現に適用する。この意味で、「過剰発現」は、ある細胞で
天然には発現されないタンパク質のその細胞における発現、ならびにある細胞で
天然にはより低レベルで発現されるタンパク質のその細胞における発現を意味す
ることを意図し、後者の場合、本発明では、より高レベルでそのタンパク質が発
現する。例えば、共生ナイセリアにおける過剰発現は、Ｔｂｐに富むまたは異種
Ｔｂｐを含む外膜調製物をそれから得るために使用され、そしてワクチンにおい
て有利に使用される。特定の実施態様は、病原性ナイセリア菌由来の鉄取り込み
タンパク質を発現する共生ナイセリア菌、特にＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ
を発現する菌である。
【００２３】 本発明の使用の際に、ＴｂｐＡは、細胞表面に位置するかまたは細胞表面と会
合するように発現されることが見出されており、したがって、ＴｂｐＡ遺伝子産
物が表面上に一端が固定されるかまたは表面と会合するように任意の必要な転送
シグナルとともに発現される。さらに、発現されたＴｂｐＡは、例えば、従来の
界面活性剤抽出方法を用いて、緩和条件を用いて容易に抽出され得るが、抗原性
を保持し、したがって天然のタンパク質のワクチン接種の使用に関連する特性を
保持している。
【００２４】 緩和条件とは、組換えタンパク質を変性しその後復元する必要がないように組
換えタンパク質が抽出され得ることを意味する。タンパク質が封入体中に存在す
る場合、代表的にはタンパク質の変性工程を含む、より過酷な回収技法を用いる
必要がある。しかし、本発明の利点は、タンパク質が表面に結合または会合され
、そして封入体中に隔離されず、そのため抽出は、結果としてタンパク質のコン
ホメーションヘのダメージおよび重要なエピトープの損失の可能性を有する、こ
の変性工程を必要としない。
【００２５】 ＴｂｐＢを組換え産生することも１つの選択肢であり、したがって本発明はま
た、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢの両方を組換えにより発現する細胞を提供する。こ
れは、２つの重要なワクチン成分について単一細胞を使用するという利点を与え
る。
【００２６】 以下の例では、ＴｂｐＢは、培養物１リットル当り約７ｍｇから約３２ｍｇの
収量で発現されている。
【００２７】 例として、本発明の細胞から得られるＴｂｐＡおよびＴｂｐＢにおける所望の
抗原性は、ＴｂｐおよびＴｂｐを発現する生物に対する免疫応答を刺激する抗原
性である。本発明の例で得られるタンパク質は、動物モデルでテストされ、そし
て抽出されたＴｂｐが髄膜炎菌によるその後のチャレンジに対して防御を与える
ことが証明されており、これは実質的に天然のコンホメーションのＴｂｐが得ら
れたことを確証する。これは、その後の使用、例えば、さらなる構造−機能分析
および薬学的適用、特にワクチンの適用において、これらのタンパク質の組換え
産生の効率的なルートを提供するという利点がある。
【００２８】 本発明はまた、鉄取り込みタンパク質の産生方法に関し、そして第２の局面で
は、タンパク質が発現しそして宿主の表面膜にトランスロケートするように、非
ナイセリア細胞宿主において組換え鉄取り込みタンパク質遺伝子を発現させるこ
とによって、鉄取り込みタンパク質を産生する方法を提供する。次いで、タンパ
ク質は、緩和条件を用いて抽出され得る。
【００２９】 本発明はまた、特にＴｂｐ産生の方法に関し、そして以下の工程を含むナイセ
リアトランスフェリン結合タンパク質（Ｔｂｐ）の産生方法を提供する： ａ．Ｔｂｐタンパク質が発現されそして細胞膜にトランスロケートされるよう
に、非ナイセリア宿主において組換えナイセリアＴｂｐ遺伝子を発現させる工程
； ｂ．緩和条件下でＴｂｐタンパク質を抽出する工程。
【００３０】 この方法はまた、同じ培養物中におよび必要に応じて同じ細胞において、組換
えナイセリアＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ遺伝子を発現させる工程を含む。
【００３１】 本発明のさらなる実施態様は、病原性ナイセリア菌由来のトランスフェリン結
合タンパク質（Ｔｂｐ）の産生方法であり、この方法は、Ｔｂｐタンパク質が共
生宿主の外表面膜にトランスロケートされるように、共生ナイセリア菌宿主にお
いてＴｂｐをコードする遺伝子を発現させる工程、緩和条件下でＴｂｐを抽出す
る工程、および必要に応じて、このＴｂｐタンパク質を精製する工程を含む。外
膜小胞調製物は、例えば、ワクチン調製物に適切であり、そして N. lactamica
で発現される髄膜炎菌遺伝子が特に適切である。
【００３２】 Ｔｂｐは、非イオン性界面活性剤溶液で膜と会合したＴｂｐを可溶化すること
によって適切に抽出され、天然の形態で良好な量のＴｂｐを得、そしてこれは髄
膜炎菌チャレンジに対して機能的および防御的の両方であることが示されている
。多くの非イオン性界面活性剤が、この抽出に適切であり、アルキルグルコシド
；ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１０
０；ＥＬＵＧＥＮＴ（登録商標）；ドデシルマルトシド；およびｎ−オクチル−
β−Ｄ−マルトシドから選択されるものが挙げられる。この抽出は、好ましくは
、低エネルギーホモジナイズ工程を含み、簡便には、ビーズビーティング装置の
ような装置を用いて、細胞を破壊しそして細胞膜を単離することによるが、この
ような他の装置も利用可能である。
【００３３】 発現したタンパク質を所望の位置で得るために、好ましくは、鉄取り込みタン
パク質をコードするヌクレオチド配列と発現したタンパク質を宿主の表面膜に向
けさせるリーダー配列とを組み合わせる発現構築物が使用され、この構築物は、
本発明のさらなる態様を形成する。リーダー配列は、適切には、ナイセリアリー
ダー配列であり、そしてナイセリア鉄取り込みタンパク質がそれ自身のナイセリ
アリーダー配列を用いて発現されるという以下の特定の例において、良好な結果
が得られている。ＴｂｐＡは、ＴｂｐＡリーダーを用いて発現されている。他の
選択肢は、宿主の表面膜への組換え産物のトランスロケーションを指示する宿主
リーダー配列、例えば、タンパク質が大腸菌で作成される場合は大腸菌リーダー
、を使用することである。ＴｂｐＢは、宿主リーダーを用いて発現されている。
【００３４】 一旦タンパク質がそのタンパク質を発現する細胞から得られると、得られた粗
産物を１以上の精製プロセスに供することが好ましい。これらのプロセスは、宿
主細胞由来の他のタンパク質、非タンパク質性夾雑物、および細胞の他の成分の
ような夾雑物を除去し得る。粗産物は、アフィニティークロマトグラフィーによ
って、そして好ましくはＴｂｐの場合はトランスフェリン結合アフィニティーマ
トリクスを用いて、精製され得る。これに関して、トランスフェリンというとき
は、トランスフェリンのＴｂｐへの結合を保持するヒトトランスフェリンのフラ
グメント、改変体、および誘導体を含む。以下により詳細に記載される本発明の
さらなる局面は、組換えトランスフェリンに関し、そしてアフィニティーマトリ
クスは、好ましくは、組換えヒトトランスフェリンを含む。
【００３５】 本発明の第３の局面は、ワクチンの調製方法であり、これは、本発明に従って
ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、またはＴｂｐＡおよびＴｂｐＢを得る工程、および該Ｔｂ
ｐと薬学的に受容可能なキャリアを合わせる工程を含む。本発明はさらに、Ｔｂ
ｐの製造における本発明の細胞の使用、およびナイセリア性疾患および／または
髄膜炎菌性疾患に対する防御のためのワクチンの製造における本発明の細胞の使
用を提供する。
【００３６】 以下の例でより詳細に記載されるように、トランスフェリン結合タンパク質は
、大腸菌で組換え発現されている。それにもかかわらず、本発明は、原核生物お
よび真核生物の両方、例えば、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Pich
ia pastoris）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系）、グラム陽性細
菌発現系（例えば、Bacillus subtilis）、および哺乳動物細胞培養物などのあ
る範囲の宿主細胞タイプに適用される。本発明で使用される発現ベクターは、大
腸菌での使用のために設計されており、そして対応するベクターは、他の細菌宿
主での使用のために設計され得、選択された宿主細胞に従って適切なプロモータ
ーおよび複製起点の選択が行われる。適切なクローニング技法および他の宿主の
例は、例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning: A laboratory Manual」, 19
89に記載されている。
【００３７】 本発明に従って発現される鉄取り込みタンパク質は、ナイセリア菌由来である
。特定の実施態様では、病原性ナイセリア菌、特に髄膜炎菌、より詳細にはＫ４
５４株由来のトランスフェリン結合タンパク質が発現されている。毒性または非
毒性株のいずれかに由来するおよび共生株にも由来する他のナイセリアトランス
フェリン結合タンパク質が、本発明に従って適切に発現され得る。「鉄取り込み
タンパク質」および「トランスフェリン結合タンパク質」というときは、完全な
未処理のタンパク質を含むことを意図し、そして、該タンパク質のフラグメント
、誘導体、および改変体がワクチン接種組成物の形で投与された場合に、髄膜炎
菌および／または淋菌によるその後のチャレンジに対して防御を与えるならば、
そのフラグメントおよび誘導体および改変体も含むことを意図する。
【００３８】 本発明の組換え技法を用いて、ワクチンに適切なコンホメーションでおよび有
用な量で、鉄取り込みタンパク質および特にトランスフェリン結合タンパク質を
産生することが今や可能となることが、本発明の顕著な利点である。
【００３９】 本発明の第４の局面は、Ｔｂｐ含有調製物を精製する方法を提供し、これは、
固定化トランスフェリンを含むアフィニティーマトリクスを通して調製物を溶出
させる工程を含む。
【００４０】 この方法の利点は、機能的タンパク質のみが固定化トランスフェリンに結合す
るので、アフィニティーマトリクスが機能的トランスフェリン結合タンパク質の
みを結合することである。これに関して、トランスフェリンというときは、トラ
ンスフェリンのＴｂｐへの結合を保持する、トランスフェリンのフラグメント、
改変体、および誘導体を含む。したがって、溶出物は、トランスフェリン結合タ
ンパク質ではないタンパク質に関して精製され、そして、非機能的であるか、変
異されるか、あるいはトランスフェリンに結合しないトランスフェリン結合タン
パク質も、マトリクスを通過するため精製される。ヒトトランスフェリン結合タ
ンパク質、より好ましくは組換えヒトトランスフェリン結合タンパク質が固定化
されることが好ましく、これは、精製されたＴｂｐに特に利点を与え、そしてこ
れらの夾雑物の除去のための排除プロセスが避けられ得るので、ヒトへの使用の
ためのワクチンの調製が単純化される。
【００４１】 本発明のさらなる局面は、ヒト組換えトランスフェリンまたはＴｂｐに結合す
るそのフラグメントを含む、Ｔｂｐの精製のためのアフィニティーマトリクスを
提供する。このトランスフェリンは、以下に記載の本発明の方法に従って産生さ
れ得る。
【００４２】 代表的には、Ｔｂｐは、宿主細胞で発現され、そして例えば、上記の緩和抽出
条件を用いて、膜結合または膜会合Ｔｂｐの抽出物が得られる。この抽出物は、
粗Ｔｂｐ含有抽出物であり、マトリクスを通過させると、固定化したトランスフ
ェリンまたはそのフラグメントに結合し得るＴｂｐは保持されるが、非機能的Ｔ
ｂｐおよび他の夾雑物は通過する。精製されたＴｂｐは、次いで、低ｐＨのよう
な従来の技法を用いてマトリクスから分離され得る。
【００４３】 本発明のさらなる組成物はＴｂｐを含み、このＴｂｐの少なくとも９０重量パ
ーセントは活性Ｔｂｐである。Ｔｂｐは、ＡまたはＢであり得、そして活性であ
るとは、Ｔｂｐがトランスフェリンに結合することを意味する。この組成物は、
好ましくは、トランスフェリンを結合し得ないＴｂｐを含まない。
【００４４】 Ｔｂｐの精製のための、組換えヒトトランスフェリンは、以下の工程によって
得られ得る： Ａ．ヒトトランスフェリンのクローン、またはそのフラグメントもしくは誘導
体を得る工程； Ｂ．該クローン、またはそのフラグメントもしくは誘導体を、発現ベクターに
挿入する工程； Ｃ．該ベクターを適切な宿主生物で発現させる工程；および Ｄ．発現した遺伝子産物を該宿主生物から単離する工程。
【００４５】 クローンは、ＰＣＲに基づく方法によって単離され得、そして発現ベクターは
、pMTLおよびpETからなる群より選択され得る。宿主生物は、代表的には細菌、
適切には大腸菌であり、そして本発明の特定の実施態様では、Novablue DE3；HM
S 174 DE3；BL21 DE3；JM 109；RV 308；およびXL1 Blueからなる群より選択さ
れる宿主を使用する。
【００４６】 本発明は、本明細書において、特定の実施態様で記載され、添付の図面によっ
て説明される。
【００４７】 より詳細には、図１については、ｒＴｂｐの10％SDS-PAGEゲルを、Gelcode bl
ueで染色した。Ｍは、Pharmaciaの低範囲分子量マーカーであり、Ｈは、ゲル上
へのローディング前に100℃にて５分間煮沸したｒＴｂｐであり、ＵＨは、ゲル
へのローディング前に加熱していないｒＴｂｐである。図２については、ｒＴｂ
ｐを10％SDS-PAGEゲル上で流し、そしてニトロセルロース膜上にウエスタンブロ
ットした。Ｍは、Bioradプレ染色分子量マーカーである。天然のタンパク質に血
清でプローブした場合にｒＴｂｐＡおよびｒＴｂｐＢのバッチについて、変性産
物の一致するパターンが見られる。ｒＴｂｐＡについては、ヒトトランスフェリ
ンHRPが膜をプローブするために使用される場合に、同じパターンのバンドも見
られる。図３では、髄膜炎菌Ｋ４５４株による腹腔内チャレンジからの日数に対
して、20匹のマウスの群当りの生存数を示す。上のパネルのチャレンジ用量は、
５×１０６であり、そして下のパネルは５×１０７であった。図４では、HTf-FI
TCでの大腸菌ＪＭ１０９の表面標識が、FITCに対して示すカウントとして示され
る。
【００４８】 実施例１ ｔｂｐ遺伝子クローニングおよび発現 髄膜炎菌Ｋ４５４株（B15:P1.7,16）のｔｂｐを増幅するためのプライマーを
、Genbankデータベースにおける他の配列決定された髄膜炎菌ｔｂｐ遺伝子から
の情報を用いて設計した（そしてその後、各ｔｂｐ遺伝子のＮおよびＣ末端の配
列を決定した）。５’プライマーは、ＡＴＧ開始コドンにNdeI（CATATG）部位を
作り、そして３’プライマーは、停止コドンの後にBamHI（ｔｂｐＡ）またはEco
RI（ｔｂｐＢ）部位を含んでいた。
【００４９】 5' ｔｂｐＡ TTAGGGAAACCATATGCAACAGCAAC 3' ｔｂｐＡ GACGGATCCGCGTTTGGACGTTTAAAACTTC 5' ｔｂｐＢ GAATTGGATTTCATATGAACAATCC 3' ｔｂｐＢ GACGAATTCCGGCAGCCGTGCTTATCGC 制限部位に下線を付した。
【００５０】 天然のＴｂｐＢリーダーペプチドコード配列を大腸菌ＲｌｐＢリポタンパク質
の配列に置換することによって、ｔｂｐＢをさらに改変した。NdeI-BamHI（ｔｂ
ｐＡ）またはNdeI-EcoRI（ｒｌｐＢ：：ｔｂｐＢ）フラグメントにおいて、遺伝
子を、まずpET22b（Novagen）にクローニングし、そして各クローンの両方の鎖
を配列決定して、遺伝子の完全性を確認した。これらの同じフラグメントを、次
いで種々のpMTLベクターにサブクローニングし、その中からpMTL2010（発現を駆
動するlacUV5プロモーターおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を組み込んでいる
）が最適発現することを見出した。プラスミド構築物を用いて、種々のDE3溶原
菌（大腸菌Novablue DE3、HMS 174 DE3、およびBL21 DE3）を形質転換し、pET22
bにより発現させた。pMTL2010クローンを用いて、大腸菌JM 109およびRV308株を
発現用に形質転換した。
【００５１】 発明者らは、lacUV5プロモーターよりも強力なmdhプロモーターの制御下で、p
MTL1050および2015を除くすべてのベクターからＴｂｐＡを発現することに成功
した。これは、強力な遺伝子発現が毒性を引き起こすことを示唆する。しかし、
mdhプロモーター駆動発現を用いると、ｐＥＴ発現系における転写速度がより大
きいことが予測されるが、この問題を解決する研究は行われていない。ｔｂｐＡ
は、pETベクターにクローニングされた場合に、Novablue DE3よりもBL21 DE3に
おいてより良好に発現した。
【００５２】 天然のナイセリアＴｂｐＡリーダー配列をCPG2およびPelBリーダーに置換する
ことは、活性なタンパク質（hTf結合について）をさらに生じるが、天然のナイ
セリアリーダーを上回る改善はなかった。
【００５３】 髄膜炎菌Ｋ４５４株ｔｂｐＡについての配列データを以下に示す。
【００５４】 大腸菌における組換え髄膜炎菌Ｔｂｐの産生 １．組換え大腸菌株の増殖 組換え大腸菌株（ｔｂｐＡまたはｔｂｐＢ遺伝子のいずれかが挿入されたCAMR
pMTLベクターを有するJM 109）を、８リットルのファーメンター中で増殖させ
た。適切な抗生物質（1.25mg/lのテトラサイクリンまたは100mg/lのアンピシリ
ンのいずれか）を含むSoytoneベースの産生培地を使用した（表１を参照のこと
）。ファーメンターを、37℃の温度にて、１分当り0.5容器容量の空気流量で6.8
〜７のｐＨに維持した。溶存酸素圧を、撹拌によって＞40％に維持した。約10の
A600nmに達するまで培養物を増殖させ、その時点で1.0mMの最終濃度までIPTGを
添加して、Ｔｂｐ発現を誘導した。次いで、培養物をさらに６〜８時間増殖させ
た。細胞を遠心分離によって採取し、そして湿重量を測定した。
【００５５】
【表１】
【００５６】 ２．全細胞懸濁液の調製 ファーメンターから採取した組換え大腸菌細胞を、0.5M NaCl含有100mM Tris-
HCl緩衝液、pH8.0に再懸濁した。細胞を10％(w/v)で再懸濁し、そして手持ち型
のガラスのホモジナイザーを用いて、均等な懸濁液を得た。代表的な実験では、
40gの細胞を用い、そして400mlの緩衝液に再懸濁した。
【００５７】 ２つの方法を用いて、上記の細胞懸濁液からのアフィニティー精製のための可
溶性組換えトランスフェリン結合タンパク質（ｒＴｂｐ）を得た。
【００５８】 ３．Ｔｂｐの抽出 3.1 手順Ａ：全細胞からの直接抽出 0.5M NaClおよび４％(v/v)ElugentTM界面活性剤（Calbiochem）を含む100mM T
ris-HCL緩衝液、pH8.0の等容量を、全細胞に添加し、そして全体的に混合した。
【００５９】 懸濁液を、穏やかに撹拌しながら４℃にて16時間インキュベートし、次いで39
000gで40分間遠心分離して、細菌残渣を除去した。可溶性ｒＴｂｐを含む上清を
穏やかにデカントし、アフィニティークロマトグラフィー用の調製物とした。
【００６０】 3.2 手順Ｂ：膜調製物からの抽出 粗膜を、ビーズビーター（Biospec Products, OK, US）を用いて細胞を破砕す
ることによって調製した。細胞懸濁液を、0.25〜0.5mm直径のガラスビーズで半
分満たした容器に移した。容器をシールし、そしてビーズビーティング装置に置
いた。懸濁液を15秒間ビートして、細胞を破砕した。ビーズが沈殿した後、懸濁
液をデカントし、そして8000gで30分間遠心分離した。上清を捨て、そして粗膜
を含むペレットを、0.5M NaCl含有100mM Tris-HCl緩衝液、pH8.0の元の容量に再
懸濁した。均等な懸濁液が得られた後、0.5M NaClおよび４％(v/v)ElugentTM界
面活性剤を含むTris-HCl緩衝液、pH8.0の等容量を加えた。懸濁液を穏やかに撹
拌しながら４℃にて16時間インキュベートした。次いで、懸濁液を39000gで40分
間遠心分離し、そして可溶性ｒＴｂｐを含む上清をデカントし、アフィニティー
クロマトグラフィー用の調製物とした。
【００６１】 ４．トランスフェリン−Sepharoseアフィニティーマトリクスの調製 トランスフェリン−Sepharoseアフィニティーマトリクスを、臭化シアン（CNB
r）活性化したSepharose 4B（Pharmacia Biotech）およびヒトトランスフェリン
（Sigma）を用いて調製した。ヒト血液から精製したトランスフェリンは、最終
的には、大腸菌で産生される組換えトランスフェリンに置換される。15gのCNBR
活性化Sepharoseを、200mlの１mM HClに懸濁し、そして焼結ガラスフィルター上
で、さらに２Ｌの同じ溶液で15分間洗浄した。0.36gのヒトトランスフェリンを
、50mlのカップリング緩衝液（0.5M NaCl含有0.1M NaHCO3、pH8.3）に溶解し、
そして洗浄したSepharose 4Bと混合した。混合物を、穏やかに混合しながら４℃
にて一晩インキュベートした。次いで、過剰のカップリングしていないトランス
フェリンを、250mlのカップリング緩衝液で洗い流し、そして残っている活性群
を、0.1M Tris-HCl緩衝液、pH8.0と２時間インキュベートすることによってブロ
ックした。次いで、トランスフェリン−Sepharoseを、各洗浄について250mlの緩
衝液を用いて３サイクルの低および高ｐＨ緩衝液で洗浄した。低ｐＨ緩衝液は0.
1M酢酸、pH4.0であり、そして高ｐＨ緩衝液は、0.1M Tris-HCl、pH８であった。
両方とも0.5M NaClを含んでいた。トランスフェリン−Sepharoseを、使用するま
でTris-HCl中４℃にて保存した。
【００６２】 ５．アフィニティークロマトグラフィー ｒＴｂｐＡまたはｒＴｂｐＢを含む上清を、Sepharose 4Bに結合したヒトトラ
ンスフェリンの10mlカラム上に１ml/分の流速でロードした。ｒＴｂｐＢについ
ては、カラムに200mlの鉄飽和緩衝液（40mM Tris、２mM NaHCO3、25mMクエン酸N
a、および１mM FeSO4.7H2O）を通過させることによって、カラムを鉄で飽和させ
た。ｒＴｂｐＡについては、この工程は必要なかった。次いで、カラムを、20カ
ラム容量の0.5M NaCl含有100mM Tris-HCl緩衝液、pH8.0で洗浄して、結合してい
ない物質を除去した。ｒＴｂｐを、0.5M NaClおよび0.5〜２％(v/v)ElugentTM界
面活性剤を含む50mMグリシン緩衝液、pH2.0を用いてカラムから溶出した。ｒＴ
ｂｐを含む画分は、280nmでの吸光度をモニターすることによっておよその位置
を突き止めた。ElugentTMも280nmで吸収するので、選択された画分中のｒＴｂｐ
の存在は、ヒトトランスフェリン−ＨＲＰ（hTf-HRP）リガンドブロットおよびS
DS-PAGE分析によって確認した。ｒＴｂｐを含む画分をプールし、そしてHiPrep
Desaltingカラム（Sephadex G-25, Pharmacia）にアプライして、グリシンおよ
び遊離のElugentTMを部分的に除去した。次いで、タンパク質濃度を、ウシ血清
アルブミンを標準として用いるＢＣＡキット（Pierce）を用いて測定した。
【００６３】 ６．トランスフェリン−ＨＲＰリガンドブロット トランスフェリン−ＨＲＰリガンドブロットを、溶出した画分中のｒＴｂｐの
存在を正確に突き止めるために行い、そして活性タンパク質が回収されているこ
とを確認した。
【００６４】 一連の８つの２倍希釈物を、各選択された画分の50μl試料を用いて調製し、
そして各５μlを、ニトロセルロース膜上にスポットした。膜を、0.05％ Tween
20を含むPBS（PBST）および１％(w/v)乾燥スキムミルク粉末で１時間ブロックし
た。PBSTで３×10分間洗浄後、膜を、PBSTで１μg/mlに希釈したhTf-HRP結合体
（Jackson Immunoresearch Laboratories）中で２時間インキュベートした。上
記のようにさらに洗浄した後、膜を、4-クロロナフトール基質で発色させた。
【００６５】 ７．結果 7.1 Ｔｂｐの収量 界面活性剤の範囲を検討し、そしてｒＴｂｐを可溶化しそして安定化する能力
についてElugentと比較した。検討した９つのうち、オクチルグルコピラノシド
およびドデシルマルトシドは、使用に最も適切な代替物であった。
【００６６】 CAMR pMTL発現ベクターを含む大腸菌JM 109クローンからのｒＴｂｐの収量は
、以下のとおりであった。
【００６７】
【表２】
【００６８】 ＊ この細胞ペレットは、細胞溶解のため非常に水分が多く、したがって湿重
量値は大きめの値となっている。 ND−この値は、実際の湿重量がわからないので算出できなかった。
【００６９】
【表３】
【００７０】 ｔｂｐＡおよびｔｂｐＢをそれぞれ発現する大腸菌JM 109クローンの試料を、
それぞれ受託番号０００１２４０４号および０００１２４０５号として2000年１
月24日にECACCに寄託した。
【００７１】 収量は、８リットルファーメンターにおいて２×soytone培地中で増殖したペ
ーストから得た細胞の40ｇ試料から評価した。Ｔｂｐを、手順Ａを用いて４℃に
て抽出し、そしてトランスフェリン−Sepharoseカラムで精製した。タンパク質
濃度を、BCAアッセイを用いて評価した。ベクターpMTL2000およびpMTL2003は、
アンピシリン耐性マーカーを有し、そしてベクターpMTL2010はテトラサイクリン
耐性マーカーを有する。pMTL2010での各Ｔｂｐについての最下列の値は、培地中
に抗生物質が存在しないものについてである。
【００７２】 7.2 ｒＴｂｐの特徴づけ 7.2.1 精製ｒＴｂｐのSDS-PAGE分析 精製ｒＴｂｐを、種々の変性条件下でSDS-PAGE（10％）によって分析した（図
１）。全長ｒＴｂｐＡは、約100kDaの分子量を有し、そしてクーマシー染色した
ゲルのデンシトメトリーで測定した場合、総タンパク質の＞90％を構成していた
。SDS-PAGEの前に加熱しなかった場合、わずかに低い分子量の２つの主要なバン
ドが出現し、これはｒＴｂｐＡの膜挿入された形態およびプロセシングされてい
ない形態を表し得る。全長ｒＴｂｐＢは、約85kDaの分子量を有し、そしてデン
シトメトリーで測定した場合、総タンパク質の約80％を構成していた。加熱およ
び非加熱タンパク質のSDS-PAGEプロファイルに差はなかった。
【００７３】 7.2.2 ｒＴｂｐのウエスタンブロット SDS-PAGE後に、精製ｒＴｂｐを、電気泳動によりニトロセルロース膜にトラン
スファーし、そして天然のＴｂｐまたはhTf-HRP結合体に対して惹起した抗体で
プローブした（図２）。髄膜炎菌から精製した天然タンパク質と同様に、ｒＴｂ
ｐＢは、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット後にhTf-HRPに結合するが、ｒＴｂ
ｐＡは結合しなかった。低分子量バンドの一致したパターンが、ｒＴｂｐＡおよ
びｒＴｂｐＢの両方について見られる。これらは、誘導直後および株が低温で増
殖する場合に出現し、そして、おそらく全長ｒＴｂｐのインビボタンパク質溶解
変性の結果である。これらは、特徴付けられそして定量され得る場合、ワクチン
調製物から除去される必要はなくてもよく、そして実際、組換えタンパク質によ
って提供される防御に寄与し得る。
【００７４】 7.3 マウスにおける髄膜炎菌チャレンジに対する組換えＴｂｐによって提供さ
れる防御 Harlan-NIHマウスに、フロイントアジュバント中の10μgのｒＴｂｐＡ、ｒＴ
ｂｐＢ、またはｒＴｂｐＡ＋ｒＴｂｐＢを、０日目、21日目、および28日目に免
疫した。次いで、マウスに、35日目に10mgの鉄飽和ヒトトランスフェリンを含む
髄膜炎菌Ｋ４５４株の腹腔内チャレンジをした。ヒトトランスフェリンのさらな
る投与を、24時間後に腹腔内注射によって行った。次いで、生存しているマウス
の数を、４日間記録した。
【００７５】
【化１】
【００７６】
【化２】
【００７７】
【化３】
【００７８】 分子量102091.85ダルトン ９１５ アミノ酸 １２４ 強塩基性（＋）アミノ酸（Ｋ、Ｒ） ９３ 強酸性（−）アミノ酸（Ｄ、Ｅ） ２７４ 疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ） ２８２ 極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）。
【００７９】 9.472 等電点 33.723 pH7.0での電荷。
【００８０】 翻訳された塩基の総数は２７４８である ％Ａ＝26.35 ［724］ ％Ｇ＝26.67 ［733］ ％Ｔ＝20.23 ［556］ ％Ｃ＝26.75 ［735］ ％不明＝0.00 ［0］ ％Ａ＋Ｔ＝46.58 ［1280］ ％Ｃ＋Ｇ＝53.42 ［1468］。
【００８１】
【化４】
【００８２】
【化５】
【００８３】
【化６】
【００８４】 分子量77386.47ダルトン ７１２ アミノ酸 ８４ 強塩基性（＋）アミノ酸（Ｋ、Ｒ） ９０ 強酸性（−）アミノ酸（Ｄ、Ｅ） １８４ 疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ） ２４１ 極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ） 6.000 等電点 −4.964 pH7.0での電荷。
【００８５】 翻訳された塩基の総数は２１３９である ％Ａ＝32.54 ［696］ ％Ｇ＝24.26 ［519］ ％Ｔ＝20.20 ［432］ ％Ｃ＝23.00 ［492］ ％不明＝0.00 ［0］ ％Ａ＋Ｔ＝52.73 ［1128］ ％Ｃ＋Ｇ＝47.27 ［1011］。
【００８６】 実施例２ 大腸菌における組換えヒトトランスフェリン発現 ｒＴｂｐの精製のためにヒト血液由来トランスフェリンを用いる代わりに、発
明者らは、大腸菌でヒトトランスフェリンの組換え形態を発現させた。発明者ら
は、全長タンパク質に加えて、トランスフェリンタンパク質の個々のローブを発
現させた。
【００８７】 ヒトトランスフェリンを、現存する遺伝子クローン（cDNA配列、Funmei Yang
ら, (1984) PNAS 81: 2752-2756）のPCR増幅によってクローニングした。使用前
に、hTf遺伝子に存在する内部NdeI部位を、以下のように変異誘発PCRによって除
去した。
【００８８】 １．以下のオリゴマーを用いるトランスフェリンのＰＣＲ増幅により、アミノ酸
配列を変化させることなく、アミノ酸２５〜２６位で第１のNdeI部位を除去した
。NruI部位が5’プライマーに含まれ、これは、NdeI部位のすぐ上流にNruI部位
を含むhTfの既に遺伝子操作したバージョン（これもアミノ酸配列を変化させる
ことなく遺伝子操作されている）に産物をクローニングすることを可能にする。
【００８９】 5'（上流）NdeI部位を除去するためのプライマー 5' TTT CGC GAC CAC ATG AAA AGC GTC ATT CCA TCC 3'（5'プライマー） 5' GTT CTA GAG TGG CAG CCC TAC CTC TGA G 3'（3'プライマー）。
【００９０】 ２．第２のNdeI部位の除去は２工程のプロセスであった：まず、適切に配置され
たPvuI部位を含むhTfのバージョンを作成した（アミノ酸642〜645位）。以下の
オリゴマーを用いて、（上で詳述したように作成した）上流にNdeI部位を有さな
いhTfのＰＣＲ増幅によってPvuI部位を導入した。
【００９１】 hTfにPvuI部位を導入するためのプライマー 5' CAT ATG GTC CCT GAT AAA ACT GTG AG 3'（5'プライマー） 5' cga tcg tga agt ttg gcc aaa cat act g 3'（3'プライマー）。
【００９２】 次いで、hTfの3'末端を、以下のオリゴマーを用いて増幅した。
【００９３】 3'（下流）NdeI部位を除去するためのプライマー 5' CGA TCG AAA CAC GTA TGA AAA ATA CTT AG 3'（5'プライマー） 5' GTT CTA GAG TGG CAG CCC TAC CTC TGA G 3'（3'プライマー）。
【００９４】 ３．PvuI部位を、２つの産物を一緒に結合するために使用し、開始ATGコドンの
レベルで単一のNdeI部位を有する全長組換えhTf遺伝子を形成した。
【００９５】 Ｎ末端クローンを、以下のオリゴマーを用いるＰＣＲによって調製し、天然の
リーダー配列を含まないＮ末端クローンを作成し、これは成熟トランスフェリン
配列のアミノ酸１〜３３７位を含んでいた。
【００９６】 Ｎ末端クローンプライマー 5' CAT ATG GTC CCT GAT AAA ACT GTG AG 3'（5'プライマー） 5' TCT AGA TAA ATC TGT TGG GGC TTC TGG GCA TG 3'（3'プライマー）。
【００９７】 Ｃ末端ローブを、以下のオリゴマーを用いて増幅した。これによってまた、pE
TおよびpMTLベクターのNdeI部位へのクローニングが可能となり、そして成熟ト
ランスフェリン配列のアミノ酸３３８〜６７９位を含んでいた。
【００９８】 Ｃ末端クローンプライマー 5' CAT ATG GAA TGC AAG CCT GTG AAG TGG 3'（5'プライマー） 5' GTT CTA GAG TGG CAG CCC TAC CTC TGA G 3'（3'プライマー）。
【００９９】 全長およびhTfローブを、最初に、NdeI-XbaIフラグメントとして、pET22bおよ
びpET26bにクローニングした。
【０１００】 発現研究 発現研究を、hTf pET22bおよびpET26bクローンを有する大腸菌BL21 DE3をＯＤ６５０ 0.7〜1.0まで増殖させることによって行った。発現を１mM IPTGで誘導し
、そしてhTf産生を、ヤギ抗ヒトトランスフェリンポリクローナル抗体（Sigma）
を用いて、ドットブロットおよびウエスタンブロッティングによって２時間の過
程にわたりモニターした。全長およびＣ末端組換え体のサイズは、非グリコシル
化ヒトトランスフェリンおよびその個々のローブについて予測されたサイズに匹
敵した。顕微鏡検査では、hTfの発現により封入体が産生されることが明らかと
なった。この沈殿した物質は、機能的物質を生成するために可溶化およびリフォ
ールディングを必要とする。
【０１０１】 実施例３ 組換えトランスフェリンリフォールディングおよびアフィニティーカラムの調製 可溶化およびリフォールディングのプロトコルは、Hoefkins P.ら (1996) Int
. J. Biochem. Cell. Biol. 28, 975-982に記載されている。簡単にいえば、プ
ロトコルは、次のとおりである。 １．標準的な細胞溶解および遠心分離によって封入体物質を単離する。 ２．８Ｍ尿素、１mM DTT、40mM Tris/HCl、10％グリセロール(v/v) pH7.6に、ペ
レットにしたタンパク質を溶解する。 ３．再生緩衝液（0.1mM Na-EDTA、0.1mM Tris/HCl、1.0mM還元型グルタチオン（
GSH）、pH8.2）で、溶解したタンパク質を20μg/mlの濃度まで希釈する。 ４．６℃にて15分間インキュベートする。 ５．酸化型グルタチオン（GSSG）を0.5mMの最終濃度まで加える。 ６．６℃にてさらに22時間インキュベートする。 ７．濃縮し、そして10mM NaHCO3に対して透析する。 ８．鉄で飽和し、そして純度を評価する（必要であれば、サイズ排除クロマトグ
ラフィーまたは他のクロマトグラフィー技法を用いてクリーンアップする）。 ９．Sepharose 4B（Amersham Pharmacia）と結合させて、アフィニティーマトリ
クスを生成する。
【０１０２】 得られたトランスフェリンアフィニティーカラムは、実施例１からの組換えＴ
ｂｐを精製するために使用される。
【０１０３】 実施例４ 組換えＴｂｐの防御効果 20匹の群のマウスに、ｒＴｂｐＡ、ｒＴｂｐＢ、ｒＴｂｐＡとｒＴｂｐＢとの
両方、またはワクチンを含まないコントロールを接種した。その生存を、５×10６ および５×10７の髄膜炎菌Ｋ４５４株によるチャレンジ後にモニターし、そし
て結果を図３に示した。
【０１０４】 ｒＴｂｐＡおよびｒＴｂｐＢは、チャレンジに対する防御を与え、天然のＴｂ
ｐの抗原性が組換えタンパク質に保持されていることを確認した。より詳細には
、ｒＴｂｐＡおよびｒＴｂｐＢは両方とも、髄膜炎菌チャレンジに対する強力な
防御を与え、より高用量のチャレンジではＴｂｐＡによってより大きな防御が与
えられた。ＴｂｐＡによる防御は、これまでに報告されていなかった。ＴｂｐＡ
＋ＴｂｐＢの組み合わせも防御性であり、ある範囲のチャレンジ株に対して最も
効果的なワクチンを提供し得る。
【０１０５】 実施例５ 組換えＴｂｐの表面発現 組換えＴｂｐを発現する大腸菌を、蛍光標識したヒトトランスフェリンでプロ
ーブし、結果を図４に示す。
【０１０６】 親大腸菌株およびＴｂｐ遺伝子を有する非誘導株は、ほとんど蛍光を示さない
ことがわかる。誘導された大腸菌ピークは、Ｘ軸において右にシフトし、これは
、標識したヒトトランスフェリンの細菌への結合によって生じる蛍光が増加した
ことを示し、組換えＴｂｐが細菌の表面に位置することを示す。
【０１０７】 実施例６ ｒＴｂｐＡおよびｒＴｂｐＢに対して惹起した抗血清の交差反応性 全細胞ＥＬＩＳＡ研究を、ノルウェーで集めたある範囲の患者の分離株を用い
て行い、ｒＴｂｐＡおよびｒＴｂｐＢに対して惹起した抗血清と、これらの分離
株によって発現されたＴｂｐとの交差反応性を評価し、結果を表４に示した。
【０１０８】
【表４】
【０１０９】 種々の異なる血清群、血清型、および血清サブタイプの分離株に対する力価が
、ｒＴｂｐＢに対して惹起した抗血清よりもｒＴｂｐＡに対して惹起した抗血清
のほうが一貫して高かったことがわかる。
【０１１０】 低分子量ＴｂｐＢを発現する３つの分離株およびｒＴｂｐＢ抗血清は、これら
の細胞との反応を示した。これらのマウスからの免疫前血清は、髄膜炎菌分離株
との反応を示さなかった。
【０１１１】 したがって、本発明は、鉄取り込みタンパク質の組換え発現、ならびにそれに
基づく組成物、ワクチン、および使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 種々の変性条件下でのSDS-PAGE（10％）による精製ｒＴｂｐの分析を示す。
【図２】 ニトロセルロース膜に電気泳動でトランスファーしそして天然のＴｂｐおよび
hTf-HRP結合体に対して惹起した抗体でプローブした、精製ｒＴｂｐを示す。
【図３】 ｒＴｂｐＡおよびｒＴｂｐＢによって与えられた髄膜炎菌Ｋ４５４株での腹腔
内チャレンジに対する防御を示す。
【図４】 発現したＴｂｐの表面位置を示すフローサイトメトリー分析を示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゴリンジ，アンドリュー リチャード イギリス国 エスピー４ ０ジェイジー ウィルトシャー，ソールズベリー，ポート ン ダウン（番地なし），マイクロバイオ ロジカル リサーチ オーソリティ (72)発明者 ハドソン，マイケル ジョン イギリス国 エスピー４ ０ジェイジー ウィルトシャー，ソールズベリー，ポート ン ダウン（番地なし），シーエイエムア ール，マイクロバイオロジカル リサーチ オーソリティ (72)発明者 マセソン，マリー アン イギリス国 エスピー４ ０ジェイジー ウィルトシャー，ソールズベリー，ポート ン ダウン（番地なし），シーエイエムア ール，マイクロバイオロジカル リサーチ オーソリティ (72)発明者 ロビンソン，アンドリュー イギリス国 エスピー４ ０ジェイジー ウィルトシャー，ソールズベリー，ポート ン ダウン（番地なし），シーエイエムア ール，マイクロバイオロジカル リサーチ オーソリティ (72)発明者 ウエスト，デイヴィッド マッキー イギリス国 エスピー４ ０ジェイジー ウィルトシャー，ソールズベリー，ポート ン ダウン（番地なし），シーエイエムア ール，マイクロバイオロジカル リサーチ オーソリティ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 DA06 EA04 FA02 GA11 HA08 4B064 AG20 CA02 CA19 CB30 CC24 CE12 DA01 4B065 AA01X AA01Y AA26X AB01 BA01 BA02 CA24 CA44 CA45 4C085 AA03 BA16 BB11 CC01 CC07 DD23 DD33 DD40 DD42 DD62

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ナイセリアＴｂｐＡを発現する非ナイセリア細胞であって、
    該ＴｂｐＡが、緩和条件下で該細胞から抽出され得、そして天然のＴｂｐＡの抗
    原性を実質的に保持する、非ナイセリア細胞。
  2. 【請求項２】 前記ＴｂｐＡが、前記細胞の外表面膜に位置する、請求項１
    に記載の非ナイセリア細胞。
  3. 【請求項３】 髄膜炎菌トランスフェリン結合タンパク質Ａ（ＴｂｐＡ）を
    発現する、請求項１または２に記載の非ナイセリア細胞であって、該ＴｂｐＡが
    緩和条件下で該細胞から抽出され得、そして該抽出されたＴｂｐＡが天然のＴｂ
    ｐＡの抗原性を実質的に保持する、非ナイセリア細胞。
  4. 【請求項４】 請求項１から３のいずれかに記載の細菌細胞。
  5. 【請求項５】 ＴｂｐＢも発現する、請求項１から４のいずれかに記載の細
    菌細胞。
  6. 【請求項６】 非ナイセリア細胞宿主において組換えＴｂｐＡ遺伝子を発現
    することによってＴｂｐＡを産生する方法であって、該ＴｂｐＡが発現されそし
    て該宿主の表面膜にトランスロケートされ、そして該ＴｂｐＡが緩和条件下で該
    細胞から抽出され得、そして天然のＴｂｐＡの抗原性を実質的に保持する、方法
    。
  7. 【請求項７】 髄膜炎菌ＴｂｐＡを産生するための、請求項６に記載の方法
    。
  8. 【請求項８】 前記ＴｂｐＡを緩和条件下で抽出する工程；および必要に応
    じて該Ｔｂｐタンパク質を精製する工程を含む、請求項６または７に記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 非イオン性界面活性剤溶液中で、膜結合したＴｂｐＡを可溶
    化することによって前記ＴｂｐＡを抽出する工程を含む、請求項８に記載の方法
    。
  10. 【請求項１０】 前記非イオン性界面活性剤が、アルキルグルコシド、ｎ−
    オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、Ｅ
    ＬＵＧＥＮＴ（登録商標）、ドデシルマルトシド、およびｎ−オクチル−β−Ｄ
    −マルトシドからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 低エネルギーホモジナイズ工程を含む、請求項１０に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 細胞および細胞膜をビーズビーティング装置で破壊する工
    程を含む、請求項８から１１のいずれかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ＴｂｐＡタンパク質が、アフィニティークロマトグラ
    フィーによって精製される、請求項８から１２のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記アフィニティークロマトグラフィーが、トランスフェ
    リン結合アフィニティーマトリクスを用いることを含む、請求項１３に記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】 前記トランスフェリンがヒトトランスフェリンである、請
    求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１から５のいずれかに記載の細胞を培養する工程を
    含む、請求項８から１５のいずれかに記載の方法。
  17. 【請求項１７】 請求項８から１６のいずれかの方法に従ってＴｂｐＡを得
    る工程、および該タンパク質を薬学的に受容可能なキャリアと合わせる工程を含
    む、ワクチンの調製方法。
  18. 【請求項１８】 ＴｂｐＡの製造における、請求項１から５のいずれかに記
    載の細胞の使用。
  19. 【請求項１９】 ナイセリア性疾患および／または髄膜炎菌性疾患および／
    または淋菌性疾患に対する防御のためのワクチンの製造における、請求項１から
    ５のいずれかに記載の細胞の使用。
  20. 【請求項２０】 外膜小胞調製物（ＯＭＶ）を含む組成物であって、該ＯＭ
    ＶがＴｂｐＡを含み、そして請求項１から５のいずれかに記載の細胞から調製さ
    れる、組成物。
  21. 【請求項２１】 請求項１から５のいずれかに記載の細胞からＯＭＶを得る
    工程を含む、ワクチン接種用組成物の製造方法。
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